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Ações de pequenas concentrações de ouabaína sobre a pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina em ratos espontaneamente hipertensos: Papel do Sistema Renina – angiotensina e da Na+ K+
ATPase
Fabiana Dayse Magalhães Siman
Dissertação de Mestrado em Ciências Fisiológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, Maio de 2007
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Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, Maio de 2007
Siman, Fabiana Dayse Magalhães, 1981
Ações de pequenas concentrações de ouabaína sobre a pressão arterial e
reatividade pressórica à fenilefrina em ratos espontaneamente hipertensos:
Papel do Sistema Renina – angiotensina e da Na+ K+ ATPase . [ Vitória] 2007
xix, 117 p. 29;7 cm (UFES, M.S., Ciências Fisiológicas, 2007) Dissertação, Universidade Federal do Espírito Santo, PPGCF 1. Ouabaína 2. Hipertensão Arterial
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Ações de pequenas concentrações de ouabaína sobre a pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina em ratos espontaneamente hipertensos: Papel do Sistema Renina – angiotensina e da Na+ K+
ATPase
Fabiana Dayse Magalhães Siman
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em __________, por:
___________________________________________________
Prof. Dr. Dalton Valentim Vassallo – Orientador, UFES.
___________________________________________________
Profª. Drª. Maria José Campagnole-Santos – ICB – UFMG.
___________________________________________________
Profª. Drª. Ivanita Stefanon – PPGCF, UFES.
Coordenador do PPGCF:
____________________________________________
Prof. Dr. José Geraldo Mill
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, Maio de 2007
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“No fim tudo dá certo, se não deu certo é
porque ainda não chegou ao fim”
Fernando Sabino
5
Dedico esse trabalho aos meus
pais e ao Eduardo.
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Agradecimentos
A Deus, por sempre guiar meus passos e estar presente em todos os
momentos da minha vida.
Aos meus pais por todo amor, ensinamentos e educação com os quais vocês
me criaram. Se estou aqui hoje é por causa de vocês, e serei eternamente
grata por tudo. Obrigada pela paciência e compreensão nos meus momentos
de ausência. Aos meus irmãos, pelo incentivo e apoio, mesmo à distância.
Ao meu orientador Dalton Valentim Vassallo, nosso querido “Chefe”. Obrigada
por ter me acolhido no LEMC desde a iniciação científica e por ter acreditado
em meu trabalho. Agradeço por toda orientação, amizade, ensinamentos e
incentivos. Você é muito mais que um orientador, é um pai, um amigo que
sempre me tranqüiliza nas minhas horas de ansiedade e desespero. Obrigada
por esta grande oportunidade.
À minha amiga Alessandra, pela orientação, apoio e incentivo para a
realização desse trabalho. Obrigada por toda paciência nos meus momentos
de desespero, pelos conselhos científicos e pessoais. Se estou aqui hoje,
muito tenho que lhe agradecer, desde quando fazia iniciação científica. Você
é hoje pra mim, mais que uma colega de laboratório e co-orientadora, é minha
grande amiga. E sempre que tenho oportunidade, gosto de lhe falar o quanto
sou grata e feliz por sua amizade.
Ao Eduardo, por todo amor, compreensão, paciência e incentivo. Aquele que
sempre me apoiou e esteve presente em todos os momentos, principalmente
“naqueles momentos de desespero”. A você, o meu amor hoje e sempre.
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À Rosangela, José Carlos, Dona Vanda e Guilherme. Obrigada por me
acolherem em suas casas nesse momento da minha vida. Obrigada pelo
carinho e apoio. Serei eternamente grata por tudo que fizeram e ainda fazem
por mim aqui em Vitória.
À Ivanita, nossa querida “Chefa”, por também ter me acolhido no LEMC, por
toda amizade e ensinamentos.
Aos companheiros do LEMC, pela amizade e aprendizado científico.
Às amigas do LEMC, Luciana, Edna, Viviane e Juliana, pelos conselhos
científicos e pessoais, pelo incentivo e companheirismo.
Aos colegas da Pós-Graduação, em especial, minha amiga Ágata, pelo
incentivo e apoio em todos os momentos.
Aos professores e funcionários da Pós-graduação.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pelo apoio financeiro.
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Sumário
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Siglas e Abreviaturas
Resumo
Abstract
I. Introdução.................................................................................................23
1.1. Na+K+ ATPase .........................................................................28
1.2. Fator endógeno inibidor da Na+K+ ATPase..........................33
1.3. Ouabaína e a fisiopatogenia da hipertensão arterial ..........37
II. Objetivos ..................................................................................................46
2.1. Objetivo geral..............................................................................46
2.2. Objetivos específicos.................................................................46
III. Materiais e Métodos ...............................................................................48
3.1. Animais experimentais .........................................................48
3.2. Metodologia empregada para avaliação dos valores pressóricos
.................................................................................................48
3.3. Protocolos experimentais .....................................................49
3.3.1. Avaliação da pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade
pressórica à fenilefrina antes e após administração de ouabaína
.........................................................................................49
3.3.2. Efeito do tônus simpático nas ações da ouabaína sobre a
pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina
......................................................................................50
3.3.3. Influência da Na+K+ ATPase sobre os efeitos produzidos pela
ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à
fenilefrina. ......................................................................51
3.3.4. Envolvimento do Sistema Renina Angiotensina sobre o efeito da
ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à
fenilefrina .......................................................................52
9
3.4. Expressão dos dados e análise estatística..........................53
3.5. Fármacos e reagentes utilizados..........................................54
IV. Resultados..............................................................................................56
4.1. Avaliação da Pressão Arterial Basal, Freqüência Cardíaca e
Reatividade Pressórica à fenilefrina antes e após tratamento
agudo com ouabaína.·...........................................................56
4.1.1. Efeitos da ouabaína na Pressão Arterial e Freqüência Cardíaca
Basal ............................................................................56
4.1.2. Efeitos da ouabaína sobre a reatividade pressórica à fenilefrina
na Pressão Arterial Sistólica e Pressão Arterial Diastólica
.....................................................................................58
4.2. Efeito do tônus simpático nas ações da ouabaína sobre a pressão
arterial, freqüência cardíaca e reatividade pressórica a fenilefrina
................................................................................................60
4.2.1. Resultado do bloqueio ganglionar com hexametônio na pressão
arterial basal e freqüência cardíaca basal antes e após
tratamento com ouabaína.............................................60
4.2.2. Efeito do bloqueio autonômico com hexametônio sobre a
reatividade pressórica à fenilefrina antes e após tratamento com
ouabaína ......................................................................62
4.3. Influência da Na+K+ ATPase sobre os efeitos produzidos pela
ouabaína na pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade
pressórica à fenilefrina. .......................................................65
4.3.1. Efeito do bloqueio com canrenona na pressão arterial basal e
freqüência cardíaca basal antes e após tratamento com
ouabaína. .....................................................................65
4.3.2. Efeito do bloqueio com canrenona sobre a reatividade
pressórica à fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.
.....................................................................................67
10
4.4. Envolvimento do Sistema Renina Angiotensina sobre o efeito da
ouabaína na pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade
pressórica à fenilefrina .........................................................70
4.4.1. Efeito do losartan na pressão arterial basal e freqüência
cardíaca basal antes e após tratamento com ouabaína
.....................................................................................70
4.4.2. Efeito do bloqueio dos receptores para angiotensina II na
reatividade pressórica antes e após tratamento com ouabaína.
.....................................................................................72
V. Discussão ................................................................................................76
5.1. Efeitos da ouabaína na Pressão Arterial, Freqüência Cardíaca
Basal e Reatividade Pressórica à fenilefrina .......................77
5.2. Efeito do hexametônio na pressão arterial e reatividade pressórica
à fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína. ........80
5.3. Efeito da canrenona na pressão arterial e reatividade pressórica à
fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.............82
5.4. Efeito do losartan na pressão arterial e reatividade pressórica à
fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína..............86
VI. Conclusão...............................................................................................91
VII. Referências............................................................................................92
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Lista de Figuras
Página
Figura 1: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e
(B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=7) e após (Oua,
n=7) 1 hora de tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína.
57
Figura 2: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela
fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B)
Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=7) e após (Oua, n=7) 1
hora de tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína. 59
Figura 3: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e
(B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da
administração de hexametônio (Hexa) e após tratamento com 0,18
µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6).
61
Figura 4: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela
fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B)
Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da
administração de hexametônio (Hexa, n=6) e após tratamento com
0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa+Oua, n= 6).
63
Figura 5: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de
concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a Pressão
Arterial Diastólica após administração de hexametônio e após
tratamento com hexametônio+ouabaína.
64
Figura 6: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e
(B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da
administração de canrenona (Can) e após tratamento com 0,18
µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6).
66
12
Figura 7: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela
fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B)
Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da
administração de canrenona (Can, n=6) e após tratamento com 0,18
µg/Kg de ouabaína (Can+Oua, n= 6).
68
Figura 8: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de
concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a Pressão
Arterial Diastólica após administração de canrenona e após
tratamento com canrenona+ouabaína.
69
Figura 9: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e
(B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da
administração de losartan (Los) e após tratamento com 0,18 µg/Kg
de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).
71
Figura 10: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela
fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B)
Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da
administração de losartan (Los, n=6) e após tratamento com 0,18
µg/Kg de ouabaína (Los+Oua, n= 6).
73
Figura 11: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de
concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a (A) Pressão
Arterial Sistólica e (B) Pressão Arterial Diastólica após administração
de losartan e após tratamento com losartan+ouabaína.
74
13
Lista de Tabelas
Tabela 1: Parâmetro da Pressão Arterial Sistólica Basal (PAS),
Pressão Arterial Diastólica Basal (PAD) e Freqüência Cardíaca Basal
(FC) antes (Ct) e após (Oua) tratamento com 0,18 µg/Kg de
ouabaína; (n= 7)..
56
Tabela 2: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e
sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina
da PAS e PAD, antes (Ct) e após (Oua) tratamento com 0,18 µg/Kg
ouabaína,( n=7).
58
Tabela 3: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS),
Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes
(Ct), depois da administração de hexametônio (Hexa) e após
tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6).
60
Tabela 4: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e
sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina
da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de hexametônio
(Hexa) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa +
Oua); (n= 6).
62
Tabela 5: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS),
Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes
(Ct), depois da administração de canrenona (Can) e após tratamento
com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6).
65
14
Tabela 6: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e
sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina
da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de canrenona
(Can) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua);
(n= 6).
67
Tabela 7: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS),
Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes
(Ct), depois da administração de losartan (Los) e após tratamento
com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).
70
Tabela 8: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e
sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina
da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de losartan (Los)
e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).
72
15
Lista de Siglas e Abreviaturas AMPc – 3’5’-monofosfato cíclico de adenosina
ATP – 5’-trifosfato de adenosina
AV3V – região anteroventral do terceiro ventrículo
Can – canrenona
Ct – controle
dAAC – diferença da área abaixo da curva
ECA – enzima conversora de angiotensina
FC – freqüência cardíaca
FE – fenilefrina
GMPc – 3’5’- monofosfato cíclico de guanosina
Hexa – hexametônio
L-NAME – NG-nitro-L-arginina metil ester
Los – losartan
MnPO – núcleo pré-óptico mediano
Oua – ouabaína
PAD – pressão arterial diastólica
PAS – pressão arterial sistólica
PKA – proteína quinase dependente de AMPc
PKC – proteína quinase C
PKG – proteína quinase dependente de GMPc
SHR – rato espontaneamente hipertenso
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RESUMO
17
Resumo
A ouabaína (Oua) é um inibidor endógeno da Na+K+ATPase (NKA) e está presente
em concentrações nanomolares no plasma de diversos mamíferos, como ratos e
humanos. Seu papel na manutenção e/ou desenvolvimento da hipertensão tem sido
sugerido em diversos trabalhos, uma vez que demonstram a presença de níveis
elevados desse inibidor em diversas formas de hipertensão. Assim, este estudo
objetivou a investigação dos efeitos da administração aguda de concentrações
fisiológicas de Oua na pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica
(PAD), freqüência cardíaca (FC) e reatividade pressórica à fenilefrina (FE) em ratos
espontaneamente hipertensos (SHRs), bem como os possíveis mecanismos
hipertensores desse glicosídeo cardíaco. Para isso, foram utilizados machos SHR,
com 3 meses de idade. Todos os animais foram anestesiados com uretana e
submetidos à canulação da artéria carótida e veia jugular para a medida de pressão
arterial e administração de fármacos, respectivamente. A pressão arterial e
reatividade pressórica à FE (0,03 a 100 µg/Kg, in bolus) foi avaliada antes e após da
administração de Oua (0,18 µg/Kg). A influência do hexametônio (Hexa, 5mg/Kg),
canrenona (Can, 1mg/kg) e losartan (Los, 10mg/Kg) nas ações desse digitálico
sobre a PAS, PAD, FC e reatividade pressórica à FE também foi avaliada. Após a
administração de Oua houve aumento da PAS e PAD, sem alterar, entretanto, a FC
e reatividade pressórica à FE. O Hexa não bloqueou os efeitos da Oua sobre a PAS
e PAD, porém após o co-tratamento de Hexa mais Oua, houve aumento da
sensibilidade à FE na PAD, sem alterar, entretanto, a reatividade à FE na PAS. A
Can bloqueou os efeitos da Oua sobre a PAS, mas não foi capaz de bloquear esses
efeitos sobre a PAD. Após o co-tratamento de Can mais Oua houve aumento da
reatividade à FE na PAD sem alterar, entretanto, esse parâmetro na PAS. A
administração de Los bloqueou os efeitos pressóricos da Oua. O co-tratamento de
Los mais Oua reduziu acentuadamente a reatividade pressórica à FE na PAS e
PAD. Em conclusão, estes resultados sugerem que a Oua, em concentração
fisiológicas, aumenta a pressão arterial de SHRs. Seus efeitos sobre a PAS parecem
ser dependentes da inibição da Na+K+ATPase, bem como, do sistema renina-
angiotensina. Já os efeitos sobre a PAD parecem ser dependentes apenas, do
sistema renina-angiotensina. Apesar da Oua não ter alterado a reatividade
pressórica à FE, após as intervenções farmacológicas com Hexa, Can e Los
18
realizadas, observou-se que esse glicosídeo cardíaco pode estar ativando
mecanismos pressores e depressores que, em conjunto, se anulam e assim, não
alteram a reatividade pressórica à FE. Possivelmente, esses mecanismos envolvem
a participação do sistema nervoso central, da Na+K+ATPase e do sistema renina-
angiotensina.
19
ABSTRACT
20
Abstract
Ouabain (Oua) is an endogenous inhibitor of the Na+ pump and it is present in
nanomolar concentration in the plasma of several mammalians, such as rats and
humans. Its role in the maintenance and/ or development of hypertension has been
suggested in several studies that show the presence of high plasma levels this
inhibitor in several forms of hypertension. Therefore, this study investigated the
effects of acute administration of physiological concentrations of ouabain on the
systolic blood pressure (SBP), diastolic blood pressure (DBP), heart hate (HR) and
pressor reactivity to phenylephrine (PHE) in spontaneously hypertensive rats (SHR),
as well as the possible pressor mechanisms of action of this cardiac glycoside. For
this, hypertensive rats; with 3 months age, were used. All animals were anesthetized
with urethane and the jugular vein and the carotid artery were dissected and
cannulated for drug infusion and arterial blood pressure measurements, respectively.
The blood pressure and pressor reactivity to PHE (0,03-100 µg/Kg, in bolus) was
investigated before and 60 min after ouabain (0,18 µg/Kg) treatment. The influence of
hexamethonium (Hexa, 5mg/Kg), canrenone (Can, 1mg/kg) and losartan (Los,
10mg/Kg) in the actions of this cardiac glycoside on SBP, DBP, HR and pressor
reactivity to PHE was evaluated. The administration of Oua increased SBP and DBP,
and did not change the HR and pressor reactivity to PHE. Hexa administration did
not change the effects on blood pressure induced by Oua, but after the co-treatment
Hexa plus Oua, there was an increment of sensitivity (pD2) to PHE on DBP, without
altering the pressor reactivity to PHE on SBP. Can blocked the effects of Oua on
SBP, but did not block these effects on DBP. After the co-treatment Can plus Oua
there was an increment of pressor reactivity to PHE on DBP without altering this
parameter on SBP. The administration of Los blocked the pressor effects of Oua.
The co-treatment of Los plus Oua reduced the pressor reactivity to PHE on SBP and
DBP. In conclusion, these results suggest that Oua, in nanomolar concentrations,
increased the blood pressure of SHR. The effect on the SBP seems to be dependent
on the inhibition of Na+ pump, as well as, on the renin angiotensin system. The effect
on the DBP also seems to be dependent on the renin angiotensin system. Although
Oua did not alter the pressor reactivity to PHE, after the following pharmacologic
interventions of Hexa, Can and Los performed it was observed that this cardiac
glycoside, can be activating both pressor and depressor mechanisms that are
21
annulled without altering the pressor reactivity to PHE. It’s possible that these
mechanisms involve the participation of the Central Nervous System, Na+ pump and
the renin angiotensin system.
22
INTRODUÇÃO
23
1. INTRODUÇÃO
A perfusão tecidual adequada é garantida pela manutenção da força motriz da
circulação, a pressão sanguínea, em níveis adequados e razoavelmente constantes.
A manutenção dessa pressão dentro de uma faixa relativamente estreita de variação
se dá pela interação de complexos mecanismos, como a força propulsora cardíaca,
a capacidade de dilatação elástica da aorta e a resistência ao fluxo sanguíneo,
exercida, predominantemente, pelas arteríolas e artérias de pequeno calibre
(Irigoyen et al., 2003). A pressão sanguínea oscila entre um nível máximo e um nível
mínimo, sendo, portanto, de natureza pulsátil. O nível máximo de pressão é
alcançado durante a sístole, e o nível mínimo, durante a diástole. A geração da
pressão sistólica inicia-se durante o período que precede imediatamente a abertura
da válvula aórtica e início da fase de ejeção. Já a pressão diastólica é gerada
durante o relaxamento ventricular, e é dependente do volume de sangue que
permanece dentro do vaso arterial, volume esse que varia de acordo com a
resistência vascular (Michelini, 1999). Em indivíduos adultos, consideram-se valores
normais de pressão sistólica abaixo de 120 mmHg e a diastólica abaixo de 80
mmHg. Quando a pressão arterial atinge faixas de 120/80 a 139/89 mmHg,
considera-se um estágio de pré-hipertensão, e, se estes valores ultrapassam 140/90
mmHg, classifica-se como hipertensão arterial (Joint National Commitee on
Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood pressure, JNC 7).
A hipertensão arterial é um importante problema de saúde pública, por ser um
dos maiores fatores de risco de morbi-mortalidade cardiovascular e cerebrovascular,
apresentando custos médicos e socioeconômicos elevados, decorrentes
principalmente das suas complicações, tais como: doença cerebrovascular, doença
arterial coronariana, insuficiência cardíaca, insuficiência renal crônica e doença
vascular de extremidades. Estima-se que a hipertensão arterial afeta
aproximadamente 20% da população adulta em sociedades industrializadas e que,
em todo o mundo, pelo menos 500 milhões de pessoas têm ou terá pressão arterial
elevada. Inquéritos de base populacional, realizados em algumas cidades do Brasil,
mostram prevalência de hipertensão arterial de 22,3% a 43,9% (V Diretrizes
Brasileiras de Hipertensão Arterial, 2006).
Em uma pequena fração de casos, a hipertensão é originada de causas
específicas, como doença vascular renal ou excesso de produção de aldosterona ou
24
catecolaminas, sendo classificada, nesses casos, como hipertensão secundária.
Entretanto, a maioria dos pacientes, cerca de 95%, apresenta níveis elevados de
pressão arterial de causa desconhecida, sendo então classificada, como hipertensão
primária ou essencial (Kaplan, 1998).
Apesar de não ter uma causa definida, sabe-se que a hipertensão arterial
essencial é uma entidade clínica multifatorial. Sabendo que a pressão arterial é
resultante da combinação instantânea entre o débito cardíaco e resistência vascular
periférica, fatores que alteram esses determinantes primários da pressão arterial,
podem desencadear então, um processo hipertensivo. Entretanto, a resistência
vascular periférica elevada é uma das principais características da hipertensão
arterial (Folkow et al., 1982; Lund-Johansen, 1983).
Dentre os diversos fatores que contribuem para a gênese e/ou manutenção
da hipertensão arterial essencial, estão incluídos fatores neurogênicos, genéticos,
hormonais, estruturais e ambientais. Dentre os mecanismos neurogênicos,
evidências apontam o aumento da atividade simpática, modulada por diferentes
aferências e substâncias, na patogênese da hipertensão (Wyss, 1993). A atividade
simpática aumentada pode interagir também com outros fatores que contribuem
para o desenvolvimento da hipertensão arterial. Assim, as catecolaminas, além de
aumentarem o tônus dos vasos de resistência nas fases iniciais da hipertensão, são
também estimuladoras de mecanismos tróficos nos vasos, os quais manteriam a
hipertensão por indução de hipertrofia vascular (Yu, 1996).
Existem evidências também de fatores genéticos, que são determinantes para
a pressão arterial. Diversos estudos familiares demonstraram a agregação familiar
da hipertensão arterial, tanto entre irmãos, quanto entre pais e filhos (Havlik, 1979).
Além disso, outra evidência para a existência de fatores genéticos determinando os
níveis de pressão arterial de um indivíduo foi o desenvolvimento de uma série de
modelos animais para hipertensão arterial, como por exemplo, os ratos
espontaneamente hipertensos (SHR), onde as características ligadas à hipertensão
arterial são geneticamente determinadas (Warden, 1997). A questão racial também
influencia os níveis de pressão arterial. Níveis elevados de pressão arterial são mais
freqüentes entre adultos e crianças da raça negra, com uma razão de prevalência
negros/brancos entre 1,5 e 1,7 em estudos brasileiros (Lessa, 1998). Essa diferença
tem sido atribuída a diversos fatores como menor excreção renal de sódio e
potássio, menor supressão da atividade da renina plasmática após exposição à
25
sobrecarga de sódio e níveis mais elevados de insulina com valores de glicemia de
jejum mais baixos (Alpert, 1993; Berenson, 1995).
Em relação aos fatores ambientais, podemos citar a obesidade e resistência à
insulina, o tabagismo, o sedentarismo, o consumo de sal e outros (Folkow, 1982;
Irigoyen, 2003).
Como fator estrutural realça-se o remodelamento vascular, ou seja,
alterações da estrutura dos vasos de resistência. Este processo consiste na
capacidade da parede vascular reorganizar seus componentes celulares e
extracelulares em resposta a um estímulo crônico, como, por exemplo, aumento do
fluxo sanguíneo ou aumento da pressão intraluminar. Estudos mostram que a
hipertensão essencial está associada com a redução do lúmen e aumento da
relação parede: lúmen nos vasos de resistência (Mulvany, 2000; 2002).
Quanto aos mecanismos humorais causadores da hipertensão, são possíveis
citar a ativação do sistema renina-angiotensina e a disfunção endotelial. O endotélio
é um dos fatores mais importantes no controle do tônus vasomotor. Este tem a
capacidade de produzir substâncias vasodilatadoras e vasoconstritoras. É o
equilíbrio entre essas substâncias que contribui para a manutenção do tônus
vascular. A disfunção endotelial resulta do desequilíbrio na produção das
substâncias vasoativas, ou seja, aumento da produção de vasoconstritores
(endotelina, angiotensina II, tromboxano A2) e/ou menor produção de substâncias
vasodilatadoras (óxido nítrico, prostaciclina, fator hiperpolarizante derivado do
endotélio) (Rubanyi, 1993). Além disso, as espécies reativas derivadas do oxigênio
participam do processo de disfunção endotelial (Bouloumie et al., 1997). Os ânions
superóxidos, formados pelo metabolismo de diversos sistemas aeróbicos, se
combinam com o óxido nítrico, formando o composto denominado peroxinitrito. Este,
por sua vez, é altamente citotóxico, e reduz os efeitos vasodilatador, antiproliferativo,
antiinflamatório e antiaterogênico do óxido nítrico (Miller et al., 1998). Todos esses
fatores, em conjunto, acarretam aumento do tônus vasomotor e conseqüente
aumento da pressão arterial.
Além do endotélio, outro fator humoral importante na gênese da hipertensão,
é o sistema renina-angiotensina, considerado um sistema endócrino que apresenta
seus componentes da cascata enzimática produzidos em locais bem definidos (Kifor
& Dzau, 1987). Ele foi originalmente descrito como um sistema sistêmico, mas
recentemente, estudos indicam a existência de um sistema renina-angiotensina
26
tecidual ou local, já que a maioria dos seus componentes está localizada em vários
tecidos do organismo (Dzau, 1989; Danser, 1996; Paul et al., 2006). O substrato
desse sistema, o angiotensinogênio, é produzido no fígado e clivado na circulação
sanguínea pela renina, que é secretada no aparato justaglomerular dos rins, para
formar o decapeptídeo angiotensina I (Hackenthal et al., 1990; Hall, 2003; Persson
et al., 2004). A angiotensina I, sob ação da enzima conversora de angiotensina
(ECA), é clivada, formando o octapeptídeo angiotensina II (Corvol et al., 1995;
Costerousse et al., 1998). Além das angiotensinas I e II, outras angiotensinas são
produzidas como a angiotensina 1-7, angiotensina III e a angiotensina IV, e têm sido
associadas a respostas específicas, porém, a angiotensina II constitui o principal
peptídeo desse sistema e promove diversos efeitos hemodinâmicos que contribuem
para o aumento da pressão arterial (Ardaillou & Chansel, 1997; Santos et al., 2000).
As ações da angiotensina II são mediadas através da sua interação com
receptores específicos de membrana, principalmente o AT1 e AT2, sendo estas
ações distintas, em função do tipo de receptor (De Gasparo et al., 1995). A
existência de um receptor AT4 para angiotensina tem sido relatada, porém seus
efeitos ainda não foram caracterizados (Burns et al., 2004; Chai et al., 2004). A
angiotensina II, via interação com receptores AT1, promove vasoconstrição, aumento
da resistência vascular periférica e da pressão arterial. Além disso, estimula a
liberação de aldosterona, endotelina-1, vasopressina e aumenta a atividade do
sistema nervoso simpático. Ainda, a estimulação dos receptores AT1 é capaz de
promover aumento da produção de radicais livres, crescimento e migração celular,
produção de proteínas da matriz extracelular e inflamação (Weir & Dzau, 1999; Allen
et al., 2000; Touyz & Berry, 2002). Em contrapartida, através da interação com
receptores AT2, a angiotensina II promove relaxamento do músculo liso vascular,
inibição do crescimento e da proliferação celular e estimulação da apoptose (Dzau et
al., 1993; Weir & Dzau, 1999; Siragy, 2000). Tendo em vista que os efeitos da
angiotensina II via receptores AT1, promovem aumento da pressão arterial, fármacos
antihipertensivos, como os inibidores da ECA e/ou antagonistas de receptores AT1,
foram desenvolvidos e são amplamente utilizados na clínica (Weir & Dzau, 1999;
Ferrario, 2006).
Todos estes fatores citados acima, associados ou isoladamente, contribuem
para a gênese e/ou manutenção da hipertensão arterial. Além desses fatores, foi
sugerido na década de sessenta, a existência de um hormônio, inibidor da Na+K+
27
ATPase, que se encontrava elevado em algumas patologias como a hipertensão
arterial (de Wardener, 1961; Haddy & Overbeck, 1976, Hamlyn, 1982). Surge então,
mais um agente importante no processo hipertensivo.
Para melhor compreensão das ações desse agente, é necessário um
detalhamento da Na+K+ ATPase , o sítio de ligação desse hormônio chamado
ouabaína.
28
1.1. Na+K+ ATPase
A Na+K+ ATPase, também conhecida como bomba de sódio, descrita por
Skou em 1957, é uma proteína integral de membrana, presente na maioria das
células eucarióticas. Faz parte da família de ATPases tipo P, que são responsáveis
pelo transporte ativo de uma variedade de cátions através da membrana, como o
sódio, hidrogênio, magnésio, potássio, cálcio, cobre e cádmio (Scheiner-Bobis,
2002). Esse grupo de proteínas integrais de membrana colabora para processos
fundamentais na célula, como a geração de potencial de membrana e a contração
muscular, sendo caracterizado pela sua função de hidrólise do ATP. Assim, todas
estas enzimas usam a energia armazenada em ATP para o transporte desses
cátions contra um gradiente de concentração (Stekhoven & Bonting, 1981;
Horisberger, 2004).
A bomba de sódio é formada pelas subunidades α, β e γ (Blanco & Mercer,
1998). A subunidade α, com peso molecular aproximado de 113 kDa, é composta de
6-7 domínios transmembranais. É responsável pelas propriedades catalíticas e de
transporte da enzima, contendo sítios de ligação para cátions, trifosfato de
adenosina (ATP), e compostos digitálicos (Rose & Valdes, 1994). A subunidade β,
com aproximadamente 55 kDa, possui apenas um domínio transmembrana e é
altamente glicosilada. Esta subunidade é essencial para a maturação e atividade
normal da enzima, e parece estar envolvida na modulação da afinidade da enzima
ao K+ e Na+, além de facilitar o ancoramento e estabilização da subunidade α na
membrana (Blanco & Mercer, 1998). Quanto à terceira subunidade, γ, com peso
molecular aproximado de 14kDa, pouco se sabe. Estudos mostram que a presença
da subunidade γ modifica o sítio externo de ligação do cátion à bomba de sódio, por
um mecanismo direto ou alostérico, alterando assim, a sensibilidade da Na+K+
ATPase ao potássio (Béguin et al., 1997). Recentemente, um grupo de pequenas
proteínas, chamado de proteínas “FXYD”, foi identificado (Sweadner & Rael, 2000).
A subunidade γ faz parte desse grupo, sendo chamada de FXYD2. Os membros
desse grupo têm sido associados com a bomba de sódio, sendo caracterizados pela
capacidade de modular a função dessa enzima (Sweadner & Rael, 2000; Cornelius
& Mahmmoud, 2003; Horisberger, 2004; Lindzen, 2006). Entretanto, a significância
fisiológica da subunidade γ ainda é pouco conhecida, e são necessários então, mais
estudos para descobrir o seu exato papel.
29
Como as outras proteínas essenciais da célula, a bomba de sódio é expressa
como várias isoenzimas. Assim, existem múltiplas isoformas das subunidades α e β,
cuja expressão varia de acordo com cada tecido (Blanco & Mercer, 1998). A
subunidade α possui quatro isoformas: α1, α2, α3 e α4. A isoforma α1 está presente
em praticamente todos os tecidos, já a isoforma α2 está predominantemente nos
adipócitos, músculo esquelético, coração e cérebro. A isoforma α3 é abundante no
sistema nervoso central, estando também presente no coração, células sanguíneas
e ovários, enquanto a isoforma α4 foi descrita apenas em testículos de ratos
(Shamraj & Lingrel, 1994; Blanco & Mercer, 1998). As isoformas α1, α2 e α3 também
estão presentes no músculo liso vascular (Sahin-Erdemli et al., 1994). Em relação à
afinidade aos compostos digitálicos, estas isoformas se diferem. Destas, nos
roedores, a que apresenta maior sensibilidade à ouabaína é a α3, seguida pela α2 e
α1, sendo esta última, a menos sensível (Rose & Valdes, 1994; Blanco & Mercer,
1998). Já a subunidade β pode ser encontrada sob três isoformas: β1, β2 e β3. As
isoformas β1e β2 têm sido encontradas em diferentes tecidos de mamíferos enquanto
a β3 tem sido detectada em anfíbios, ratos e humanos (Martin-Vasallo et al., 1989).
Assim sendo, ambas isoformas da bomba de sódio exibem uma expressão tecido-
específica, sendo que a isoenzima α1β1 é encontrada em quase todos os tecidos
(Blanco & Mercer, 1998).
A Na+K+ ATPase funciona como um sistema de transporte ativo, responsável
pela manutenção dos gradientes de sódio e potássio através da membrana
plasmática. Esta enzima, usando a energia da hidrólise de uma molécula de ATP,
transporta 3 íons sódio do meio intracelular e 2 íons potássio do meio extracelular. O
gradiente eletroquímico gerado pela bomba de sódio é responsável pela
manutenção do balanço osmótico da célula, pela manutenção do potencial de
membrana da célula e pelas propriedades excitáveis das células musculares e
nervosas. Em adição, o gradiente eletroquímico do sódio, fornece energia para os
sistemas de transporte secundário, como o transporte de íons (cálcio, cloreto,
fosfato, hidrogênio), e de substratos como a glicose e aminoácidos. Nos rins, a
Na+K+ ATPase tem um papel importante na reabsorção de sódio e água, fator
essencial para a manutenção do volume extracelular e pressão sanguínea. Assim,
esta enzima é essencial, pois controla diversas funções vitais para a célula (Blanco
& Mercer, 1998; Scheiner-Bobis, 2002; Geering, 2006).
30
Além disso, a Na+K+ ATPase, através do controle da concentração
citoplasmática de sódio, influencia também as concentrações de cálcio, via trocador
Na+/Ca2+, participando então, da contração do músculo liso e cardíaco (Marin &
Redondo, 1999; Geering, 2006). Como o íon sódio tem um papel crítico na
manutenção do balanço de cálcio no músculo liso, existe então, uma relação entre o
íon sódio e a manutenção do tônus vascular, e consequentemente, uma relação
entre sódio e hipertensão. Assim, muitos estudos foram desenvolvidos associando
alterações da atividade da bomba de sódio e hipertensão essencial (Blaustein, 1986;
O’Donnell & Owen, 1994).
A atividade da bomba de sódio é regulada por diversos fatores. Estudos
demonstraram que esta enzima, em células de músculo liso vascular, pode ser
estimulada por tratamentos que aumentam a concentração intracelular de sódio e/ou
redução da concentração intracelular de potássio (O’Donnell & Owen, 1994;
Aydemir-Koksoy & Allen, 2001; Zhou et al., 2003). Agentes vasoativos e hormônios
também podem modular a atividade da bomba de sódio, seja pela alteração da
concentração de sódio intracelular ou por outros mecanismos, como a fosforilação
por proteínas quinases. Dependendo do tecido, a ativação de proteínas quinases
pode induzir a um aumento ou diminuição da atividade dessa enzima (Blanco &
Mercer, 1998). Agentes que aumentam os níveis intracelulares de 3’5’-monofosfato
cíclico de adenosina (AMPc) levam à ativação da proteína quinase dependente de
AMPc (PKA), que por sua vez, promove fosforilação da bomba de sódio, podendo
inibir ou estimular essa enzima. Estudos mostraram que a PKA inibe a atividade da
Na+K+ ATPase na alça de Henle e ducto coletor, e estimula no túbulo proximal, nos
rins (Horiuchi et al., 1993; Béguin et al., 1996; Feraille et al., 1995; Therien &
Blostein, 2000).
A ativação da proteína quinase C (PKC) também é um mecanismo de
regulação da Na+K+ ATPase, podendo também inibir ou estimular essa enzima, de
acordo com cada tecido. A ação da PKC se dá através da ativação da via da
fosfolipase A2 ou por fosforilação direta da subunidade α da Na+K+ ATPase, levando
à endocitose dessa enzima (Vasilets et al., 1990; 1997). Outra proteína quinase
envolvida na regulação da atividade da bomba de sódio é a proteína quinase
dependente de GMPc (PKG) (Vaandrager & Jonge, 1996; Therien & Blostein, 2000).
A PKG, que é ativada por 3’5’-monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), promove
inibição da Na+K+ ATPase no músculo esquelético, cérebro, entre outros, e ativação
31
dessa enzima em artérias, músculo liso pulmonar, entre outros. As tirosinas
quinases também estão sendo mencionadas como moduladoras da atividade da
Na+K+ ATPase. Especificamente, elas parecem ter um papel importante na
estimulação da bomba de sódio promovida pela insulina nas células do túbulo
proximal renal (Feraille et al., 1999; Therien & Blostein, 2000).
Por estas vias, hormônios, íons e fatores endoteliais podem regular a
atividade da bomba de sódio. Sua regulação se dá a curto ou a longo prazo. A
regulação a curto prazo envolve efeitos diretos na cinética enzimática ou
translocação da bomba de sódio de estoques intracelulares para a superfície celular.
Já a regulação a longo prazo, envolve mecanismos que afetam a síntese ou
degradação da enzima (Ewart & Klip, 1995; Therien & Blostein, 2000;). Estudos
mostram que a aldosterona é capaz de aumentar a expressão da bomba de sódio,
sendo que este aumento de síntese protéica é dependente de mudanças na
concentração citoplasmática de sódio (Bonvalet, 1998; Ikeda et al., 1991). As
catecolaminas também regulam a atividade da bomba de sódio. Trabalhos mostram
que a dopamina promove inibição da atividade dessa enzima, enquanto as
catecolaminas adrenérgicas, epinefrina e norepinefrina, estimulam sua atividade
(Aperia et al., 1992; Fryckstedt et al., 1993; Wang et al., 1998). Além disso, os
fatores derivados do endotélio, são capazes também de regular a atividade da Na+K+
ATPase. A angiotensina II, endotelina-1 e óxido nítrico agem estimulando, enquanto
que a prostaciclina e prostaglandina E2, inibem a atividade da bomba de sódio
(Gupta et al., 1994b; Marin & Redondo, 1999).
Em adição aos efeitos regulatórios mediados por íons, hormônios e fatores
endoteliais, recentes experimentos têm revelado um novo mecanismo regulatório
que envolve a interação da Na+K+ ATPase com pequenas proteínas da família
FXYD. Em contraste com a regulação hormonal, a interação das proteínas FXYD
não produz mudanças na expressão da bomba de sódio, mas modifica as
propriedades de transporte da Na+K+ ATPase via tecido-específico e isoforma-
específica (Geering, 2006).
Sabendo, então, da importância da bomba de sódio para as funções vitais da
célula, alterações na atividade da Na+K+ ATPase através de modificações na sua
expressão ou função, têm sido correlacionados com várias desordens, incluindo
doenças cardiovasculares, neurológicas, renal e metabólica (Rose & Valdes, 1994;
Laski & Kurtzman, 1996). Além disso, como a atividade da bomba de sódio está
32
relacionada com a homeostasia do sódio e controle do tônus vascular, alterações na
sua expressão e/ou atividade estão envolvidas então, com a gênese e/ou
manutenção da hipertensão arterial.
Vários estudos têm demonstrado a relação entre Na+K+ ATPase e
hipertensão. Magliola et al. (1986), mostraram um aumento do transporte ativo de
Na+ e K+ no músculo liso vascular, durante a hipertensão produzida por
mineralocorticóides e sal. Isto parece ser resultado do aumento no “turnover” dos
sítios iônicos da bomba de sódio, ou possivelmente, da incorporação de mais
bombas de sódio na membrana. Em SHR, foi demonstrado um aumento da atividade
da Na+K+ ATPase quando comparado aos animais controles (Wistar Kyoto) (David-
Dufilho et al., 1984). Por outro lado, há uma hipótese de que a atividade da bomba
de sódio está diminuída na hipertensão, seja por um defeito inerente da enzima, ou
por um inibidor endógeno da bomba (Hamlyn et al., 1982). Este inibidor provoca um
aumento dos níveis de sódio intracelular e consequentemente, um aumento do tônus
vascular, aumentando assim a pressão arterial. Assim, diversos trabalhos têm
demonstrado que o plasma de animais hipertensos possui um fator circulante capaz
de inibir a bomba de sódio estando, portanto relacionado com a gênese e/ou
manutenção da hipertensão arterial (Blaustein, 1977; Hamlyn et al., 1982; Magargal
& Overbeck, 1986).
33
1.2. Fator endógeno inibidor da Na+K+ ATPase
Os glicosídeos cardíacos foram descobertos por William Withering, em 1785,
quando investigava as ações das folhas de uma planta chamada foxglove, que
posteriormente, foi denominada Digitalis purpurea. Desde então, por mais de 200
anos, os esteróides cardiotônicos produzidos pelas plantas digitálicas têm sido
utilizados no tratamento da insuficiência cardíaca. Eles são divididos em dois
grupos: cardenolídeos e bufadienolídeos. A ouabaína, um cardenolídeo, foi
descoberta por um antropologista francês, quando analisava o veneno de flexas da
tribo Maasai, na África, a mais de cem anos atrás. Esta substância é originada da
semente de plantas africanas como a Strophantus gratus ou da árvore Ouabaio
(Acocanthera ouabaio) (Withering, 1785). A planta Strophantus e a árvore Ouabaio
são membros da família Apocynaceae, que inclui um variado número de espécies
que produzem substâncias cardioativas. Esteróides cardiotônicos hidrofóbicos como
a digoxina e digitoxina são rotineiramente utilizados na clínica já que podem ser
administrados oralmente, diferentes da ouabaína, que requer administração
parenteral (Blaustein, 1993).
Em 1953, Schatzmann descobriu que os esteróides cardiotônicos são
inibidores específicos da bomba de sódio e que o receptor para esses compostos é
a própria Na+K+ ATPase presente na membrana plasmática. Assim, os glicosídeos
cardíacos exercem sua ação farmacológica através da inibição da bomba de sódio.
Por causa da ação altamente seletiva dos digitálicos de se ligar na subunidade α da
bomba de sódio, têm surgido especulações sobre a possível existência de um
ligante endógeno, uma vez que a seqüência de aminoácidos e a conformação do
sítio de ligação dos digitálicos, presente na bomba de sódio, têm sido altamente
conservadas em todas as espécies (Hauptman & Kelly, 1999; Schoner, 2002).
A procura pelo ligante endógeno começou na década de 60 quando
de Wardener et al. (1961) demonstraram um hormônio circulante natriurético que
participava na regulação da excreção de sódio pelos rins, após administração
intravenosa de salina. Em 1969, pesquisas sugeriram que esse fator endógeno seria
um inibidor da Na+K+ ATPase (Kramer et al.,1969). Buckalew et al. (1970)
demonstraram também que cães com sobrecarga de salina apresentavam uma
substância plasmática que inibia o transporte de sódio através das membranas
34
epiteliais, sugerindo, mais uma vez, que o ligante endógeno era um inibidor da
bomba de sódio. Seis anos depois, Haddy & Overbeck (1976) demonstraram que
esse hormônio natriurético inibidor da Na+K+ ATPase participava na gênese de
hipertensões dependentes de volume, já que nessas situações, a atividade da
bomba de sódio se encontrava reduzida. Como a ação desse hormônio era similar
às ações da ouabaína nos vasos sanguíneos, o termo ouabain-like começou a ser
empregado na literatura (Haddy et al., 1978). E, em 1980, após Gruber et al.
demonstrar que esse fator endógeno possuía reação cruzada com anticorpos anti-
digoxina, ele passou a ser chamado, também, de fator digitalis-like.
A correlação entre o fator endógeno inibidor da Na+K+ ATPase e a pressão
sanguínea foi demonstrada apenas na década de 80. Pesquisadores mostraram que
o plasma de alguns pacientes com hipertensão essencial continha um inibidor da
Na+K+ ATPase que se correlacionava com a ingestão de sódio e com os níveis
pressóricos desses pacientes (Poston et al., 1981; Hamlyn et al., 1982; Hasegawa et
al., 1987). Por muitos anos, vários laboratórios tentaram realizar a caracterização
química desse hormônio. Em 1991, Hamlyn et al. purificaram o ligante endógeno do
plasma humano e constataram que este fator digitalis-like é estruturalmente,
biologicamente e imunologicamente semelhante à ouabaína. Várias evidências
surgiram então comprovando essa semelhança do fator digitalis-like com a
ouabaína: suas características físico-químicas como a massa do íon protonado e
sua composição elementar (C29H45O12), a alta afinidade pelo sítio de ligação dos
glicosídeos cardíacos na bomba de sódio, suas propriedades de inibição da Na+K+
ATPase, suas ações cardiotônicas e vasopressoras, a alta reatividade cruzada com
anticorpos policlonais para ouabaína, além das suas propriedades de eluição em
diversos sistemas de cromatografia (Hamlyn et al., 1991; Mathews et al., 1991;
Ludens et al., 1991; Bova et al., 1991). Todas essas características são semelhantes
ao composto digitálico ouabaína derivado da Strophantus gratus e Acocanthera
ouabaio.
Fortes evidências sugerem que as maiores fontes de produção de ouabaína
nos mamíferos são a glândula adrenal (Ludens et al., 1992; Laredo et al., 1994) e o
hipotálamo (de Wardener & Clarson, 1985). Estudos têm demonstrado que a síntese
desse digitálico ocorre na região do córtex da adrenal, mais especificamente na
zona glomerulosa, já que a remoção seletiva da medula adrenal não influencia nas
suas concentrações plasmáticas (Ludens et al., 1992; Laredo et al., 1995). Além
35
disso, Pamnani et al. (1981) mostraram que lesões na região anteroventral do
terceiro ventrículo (AV3V) abolia as respostas do fator endógeno após expansão
aguda de volume em ratos, sugerindo então que a região anteroventral do terceiro
ventrículo é mais um local de síntese da ouabaína. Estudos mais recentes têm
evidenciado outras fontes de produção da ouabaína. D’Urso et al. (2004)
observaram que o coração de ratos é capaz de produzir ouabaína e que sua
concentração aumenta durante a isquemia. Além disso, detectaram que a
concentração de ouabaína presente nesse tecido é aproximadamente duas vezes
maior que aquela presente no plasma.
A via de biossíntese desse composto em mamíferos foi demonstrada através
da administração de certos precursores e conseqüente aumento da síntese de
esteróides cardiotônicos. Assim, a progesterona e a pregnenolona têm sido
relatadas como precursoras da ouabaína (Perrin et al., 1997; Hamlyn et al., 1998).
Sua produção pode ser estimulada pelo aumento da concentração plasmática de
sódio e pela expansão de volume extracelular (de Wardener et al., 1961; Blaustein,
1993; Yamada et al., 1997). Além disso, tem sido demonstrado que cultura de
células adrenais bovinas libera ouabaína após exposição à adrenocorticotropina e
angiotensina II, sendo que a angiotensina II atua via receptor AT2 (Laredo et al.,
1997). Agonistas α1adrenérgicos também estimulam a liberação de ouabaína,
indicando que o sistema nervoso simpático está envolvido na regulação da liberação
desse hormônio na corrente sanguínea (Laredo et al., 2000). Em contrapartida,
Göõz et al. (2003) observaram que a secreção de ouabaína pela glândula adrenal de
ratos é modulada por mecanismos nicotínicos. Seus resultados mostraram que a
acetilcolina e nicotina exógena são potentes ativadores da secreção de ouabaína,
evidenciando a presença de receptores nicotínicos funcionais de acetilcolina nas
células do córtex da adrenal de ratos e uma conseqüente regulação colinérgica na
secreção desse hormônio. O exercício físico também estimula a liberação de
ouabaína. Concentrações plasmáticas de ouabaína aumentam rapidamente durante
o exercício físico em cachorros e humanos, diminuindo posteriormente com o
repouso, sob controle da norepinefrina e angiotensina II (Bauer et al., 2005).
Concentrações elevadas de ouabaína têm sido encontradas em algumas
condições como insuficiência renal crônica (Hamlyn et al., 1996),
hiperaldosteronismo (Rossi et al., 1995), insuficiência cardíaca congestiva (Gottlieb
et al., 1992), infarto agudo do miocárdio (Bagrov et al., 1994), hipertensão essencial
36
(Hamlyn et al., 1982), entre outras. Diante disso, sabendo que a hipertensão arterial
é um importante fator de risco para doenças cardiovasculares e, portanto, relevante
alvo de estudo, vários pesquisadores procuram mostrar a relação entre ouabaína e a
fisiopatogenia da hipertensão arterial.
37
1.3. Ouabaína e a fisiopatogenia da hipertensão arterial
Aproximadamente 50% dos caucasianos com hipertensão essencial
apresentam níveis circulantes de ouabaína elevados, redução da freqüência
cardíaca e aumento de massa ventricular e volume sistólico (Manunta et al., 2000),
sendo que os níveis de ouabaína correlacionam diretamente com pressão arterial
média, espessura da parede do ventrículo esquerdo e resistência periférica total
(Manunta et al., 1999; Pierdomenico et al., 2001). Além disso, estudos demonstram
que administração prolongada de ouabaína induz hipertensão em ratos (Yuan et al.,
1993; Manunta et al., 1994; Rossoni et al., 2002a).
Esse efeito pressor da ouabaína tem sido explicado pela sua propriedade de
inibir a bomba de sódio nas células musculares lisas. Como a bomba de sódio é
responsável pelo efluxo de 3 íons sódio e influxo de 2 íons potássio, quando o
glicosídeo se liga e inibe essa enzima, ocorre um aumento de sódio intracelular, e
com isso, despolarização celular. Consequentemente ocorre abertura dos canais de
cálcio dependentes de voltagem e aumento de cálcio intracelular (Vassalle, 1987;
Marin et al., 1988). O aumento de sódio intracelular também promove redução ou
inibição da atividade do trocador Na+/Ca2+, aumentando as concentrações de cálcio
intracelular. Com isso, o retículo sarcoplasmático é capaz de estocar uma
quantidade maior de cálcio (Blaustein, 1993; Wasserstrom & Aistrup, 2005). Assim,
através da amplificação nas concentrações intracelulares de cálcio, a ouabaína pode
aumentar a contração do músculo liso vascular. Todavia, os efeitos da ouabaína no
transiente de cálcio não são limitados ao músculo liso vascular, podem ser visto
também nos neurônios (Blaustein et al., 1991), plaquetas (Roevens et al., 1990) e
músculo cardíaco (Lee, 1985). Além disso, como a recaptação de noradrenalina nas
terminações perivasculares simpáticas envolve um sistema de co-transporte
dependente da concentração intracelular de sódio, a inibição da Na+K+ ATPase pela
ouabaína provoca um aumento da liberação de noradrenalina e uma redução na sua
captação, induzindo assim, contração do músculo liso vascular (Vanhoutte & Lorenz,
1984; Marin et al., 1988).
A ação vascular da ouabaína tem sido demonstrada em alguns trabalhos.
Ross Jr et al. (1960) mostraram que a administração de doses terapêuticas de
ouabaína provocou aumento da pressão arterial em cães anestesiados em
38
decorrência do aumento da resistência vascular periférica. Em humanos, doses
terapêuticas de ouabaína têm uma ação vasoconstritora direta no músculo liso
vascular do antebraço de pacientes normotensos (Mason & Braunwald, 1964). A
ação vascular direta da ouabaína também foi demonstrada por Marin et al. (1988),
quando a ouabaína foi capaz de induzir contração em artérias cerebrais de gatos.
Em artérias femorais, esses autores demonstraram que a ouabaína estimulava a
liberação de noradrenalina dos terminais adrenérgicos e, com isso, induzia
contração. Isso confirma a hipótese acima citada onde a ouabaína é capaz de
induzir contração do músculo liso vascular em decorrência do aumento de cálcio
intracelular e da liberação de noradrenalina nas terminações simpáticas. D’Amico et
al. (2003) também demonstraram que microinjeções de ouabaína são capazes de
aumentar a resistência vascular e com isso, aumentar a pressão arterial sem alterar,
entretanto, o débito cardíaco. O aumento de pressão arterial média observado neste
experimento estava associado ao aumento da resistência periférica total e redução
do fluxo para órgãos como rins, estômago, intestino e músculo esquelético. A
ouabaína é também capaz de aumentar a contração de músculos traqueais através
do aumento de cálcio intracelular decorrente da inibição da bomba de sódio e,
também, através da liberação de acetilcolina nas terminações nervosas, como
conseqüência do aumento cálcio (Espinosa-Tanguma et al., 2004).
Além da ação vascular direta da ouabaína, trabalhos mostram que esse
digitálico pode promover hipertensão por ação no sistema nervoso central. Huang et
al. (1994) mostraram que em ratos normotensos, com dieta alta ou regular de sódio,
a administração periférica e central de ouabaína, agudamente, era capaz de
aumentar a pressão arterial. Essa hipertensão era prevenida por administração
intracerebroventricular de anticorpos antiouabaína, sugerindo que a ouabaína teria
um efeito central de aumentar o tônus simpático e induzir hipertensão. Em ratos
hipertensos, como Dahl-Sal sensíveis e SHR, a alta ingestão de sódio pode causar
uma exacerbação da hipertensão por liberação de ouabaína no sistema nervoso
central e conseqüente aumento da atividade simpatoexcitatória (Leenen et al., 1993;
Leenen et al., 1994; Huang & Leenen, 1994; 1996a). Além disso, esse digitálico é
capaz de promover prejuízo do barorreflexo (Huang & Leenen, 1999). Esse
mecanismo pressor da ouabaína é mediado pelo sistema renina-angiotensina
cerebral, já que suas ações pressoras são inibidas pela administração de
antagonista de receptor AT1 para angiotensina II (Huang & Leenen 1996b;1999;
39
Zhang & Leenen, 2001). Além disso, ratos transgênicos deficientes de
angiotensinogênio central tiveram as respostas pressoras provocadas pela ouabaína
atenuadas, confirmando o importante papel do sistema renina-angiotensina central
nos efeitos simpatoexcitatórios desse digitálico (Huang et al., 2001).
A existência de um componente central no efeito hipertensor da ouabaína foi
mostrada também por Songu-Mize et al. (1982), que após lesão da região AV3V em
ratos Doca-sal, observaram uma redução da pressão arterial e melhora na atividade
da bomba de sódio. Assim, esses pesquisadores sugeriram a existência de uma
substância circulante que seria secretada na região AV3V, responsável pelo
desenvolvimento da hipertensão nesses animais. Estudos de Veerasingham &
Leenen (1999), demonstraram também que a região AV3V é essencial para a
hipertensão induzida por administração de salina e ouabaína, possivelmente por
aumento do tônus simpático. No entanto, a exata localização do sítio de ação da
ouabaína ainda não foi bem estabelecida. Estudos demonstram que uma das áreas
na qual a ouabaína é liberada e exerce suas ações é o núcleo pré-óptico mediano
(MnPO), e que a ouabaína e angiotensina II nesse núcleo tem um papel importante
nas respostas cardiovasculares decorrentes da alta ingestão de sal em SHR
(Budzikowski & Leenen, 1997; 2001).
Vários pesquisadores já demonstraram que a administração crônica de baixas
doses de ouabaína desenvolve hipertensão em ratos (Yuan et al., 1993; Manunta et
al., 1994). Yaun et al. (1993), mostraram que a administração crônica de ouabaína
produz elevação sustentada da pressão arterial por aumento da resistência vascular
tanto em animais normotensos como em hipertensos. Manunta et al. (1994) também
demonstraram que a administração crônica de ouabaína induzia hipertensão,
cursando com aumento dos níveis de ouabaína no plasma, rins, hipotálamo e
glândula pituitária anterior. Essa hipertensão parece ser dependente, pelo menos em
parte, de mecanismos centrais associados com aumento do tônus simpático,
subseqüente à ativação do sistema renina-angiotensina cerebral, como já
mencionado acima (Huang & Leenen, 1999; Zhang & Leenen, 2001; Cheung et al.,
2006). Além disso, uma outra via hipertensinogênica da ouabaína foi caracterizada
recentemente. Di Filippo et al. (2003) demonstraram que o tratamento crônico com
ouabaína aumenta o conteúdo cerebral de endotelina-1 e que esta contribui para as
ações periféricas da ouabaína, como o aumento da resistência vascular renal e
40
redução do fluxo sanguíneo renal. A administração de antagonistas de receptores
ETA para endotelina-1 bloqueia os efeitos hemodinâmicos desse digitálico, sugerindo
então, mais uma via hipertensora da ouabaína. Resultados de D’Amico et al. (2003),
também demonstraram que a administração aguda de ouabaína na área cinzenta
periaquedutal provoca aumento da resistência periférica total e pressão arterial,
provavelmente por ativação de endotelina-1 cerebral.
Desse modo, as ações vasculares da ouabaína modificando a resistência
vascular periférica associada aos seus efeitos sobre o sistema nervoso central, ou
seja, de aumento do tônus simpático, poderiam estar relacionados com a gênese
e/ou manutenção da hipertensão arterial.
Entretanto, a maior parte dos trabalhos de reatividade vascular desenvolvidos
utilizaram concentrações elevadas de ouabaína (da ordem de mM), maiores que
aquelas encontradas no plasma de pacientes ou animais hipertensos (cerca de
10nM, Hamlyn & Manunta, 1992). Sabendo que a concentração fisiológica de
ouabaína, encontrada no plasma de pacientes normotensos, é da ordem de 0,2 a
0,7nM (Blaustein, 1993), surgiu uma questão: Qual seria o mecanismo pelo qual a
inibição da bomba de sódio mediada pela ouabaína poderia modular a atividade
celular sob condições fisiológicas?
Esse mecanismo foi descrito pelo grupo do professor Blaustein com a
identificação de uma microrregião da célula denominada plasmerosome. Trabalhos
mostram que a isoforma α1 da bomba de sódio está distribuída uniformemente na
membrana plasmática, enquanto as isoformas α2 e α3 estão confinadas a
microdomínios da membrana plasmática justapostos ao retículo sarcoplasmático
(Juhaszova & Blaustein, 1997a; 1997b). Esse microdomínio foi, então, denominado
de plasmerosome, região onde estão localizados o trocador Na+/Ca2+ e as isoformas
α2 e α3 da Na+K+ ATPase, que possuem maior afinidade pela ouabaína. Essa
microrregião da membrana plasmática parece ser importante na regulação do
homeostase do cálcio e mediar as ações dos esteróides cardiotônicos, como a
ouabaína. Assim, a inibição das isoformas α2 e α3 da Na+K+ ATPase por esse
digitálico, aumenta a concentração de sódio intracelular, resultando na redução da
atividade do trocador Na+/Ca2+ e conseqüente aumento local de íons cálcio. Esse
cálcio é captado pela Ca2+ ATPase do retículo sarcoplasmático e estocado no
interior dessa organela (Blaustein et al., 1998). Desse modo, após estímulo de um
agonista vasoconstritor, a resposta contrátil resultante seria amplificada em
41
decorrência de uma maior liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático. Assim
sendo, esse mecanismo explica como baixas concentrações de ouabaína poderiam
modificar a resistência vascular e dessa forma, contribuir para o processo
hipertensivo.
Então, além da ação direta da ouabaína sobre o músculo liso vascular e sua
ação sobre o sistema nervoso central, a ouabaína é capaz de sensibilizar o leito
vascular aumentando a responsividade a agentes vasopressores (Songu-Mize et al.,
1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999; 2001). Isso representa um
mecanismo adicional através do qual esse digitálico endógeno, em baixas
concentrações, pode contribuir para a gênese e/ou manutenção da hipertensão.
No entanto, as ações agudas e crônicas da ouabaína sobre o sistema
vascular parecem ser distintas. Enquanto a ouabaína promove aumento da
reatividade vascular quando administrada agudamente (Songu-Mize et al., 1995;
Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999; 2001), de forma crônica, a reatividade
vascular se apresenta aumentada, reduzida ou sem alterações, dependendo do leito
vascular estudado (Cargnelli et al., 2000; Kimura et al., 2000; Rossoni et al., 2002a).
Trabalhos de Cargnelli et al. (2000) observaram que o tratamento crônico com
ouabaína era acompanhado por uma redução da resposta contrátil à fenilefrina em
anéis de aorta, enquanto em anéis de artéria renal, foi observado um aumento da
resposta contrátil à fenilefrina após tratamento com ouabaína (Kimura et al., 2000).
Rossoni et al. (2002a), demonstraram em aorta e artéria mesentérica superior de
ratos hipertensos pelo tratamento com ouabaína, uma redução da resposta
vasoconstritora à fenilefrina, enquanto na artéria caudal, nenhuma resposta foi
encontrada. Essas alterações estavam associadas com aumento da modulação
negativa do endotélio, provocada por uma maior liberação de óxido nítrico (Rossoni
et al., 2002b). Além disso, esses pesquisadores observaram alterações sobre a
atividade e expressão da Na+K+ ATPase, variando de acordo com o leito vascular
estudado. A aorta apresentou aumento da atividade e expressão da Na+K+ ATPase,
a artéria caudal apresentou redução enquanto na artéria mesentérica não houve
alteração (Rossoni et al., 2002a). Essas alterações na bomba de sódio podem
explicar, juntamente com a modulação endotelial, as diferenças nas respostas
contráteis à fenilefrina observada nesses vasos de ratos hipertensos por ouabaína.
O aumento da atividade da Na+K+ ATPase promove hiperpolarização, contribuindo
42
assim, para a redução das respostas contráteis à fenilefrina na aorta. Já a redução
da atividade da Na+K+ ATPase, ocorrida na artéria caudal, promove aumento de
sódio intracelular e conseqüente aumento de cálcio, aumentando assim as respostas
contráteis, que se contrapõe à modulação endotelial, resultando na inalteração da
reatividade vascular (Rossoni et al.,2002a).
Mais tarde, esse mesmo grupo de pesquisadores, demonstrou que o
tratamento crônico com ouabaína é acompanhado de uma maior liberação de óxido
nítrico das terminações nitrérgicas vasculares, justificando a redução da resposta
contrátil induzida por estímulos elétricos em artérias mesentéricas (Xavier et al.,
2004a). Esses resultados sugerem que a ouabaína, cronicamente, provoca
alterações da reatividade vascular de maneira distinta dependendo do leito arterial
estudado, e que a modulação endotelial negativa observada em alguns leitos
arteriais, constitui um mecanismo de contraposição ao quadro hipertensivo gerado
por esse digitálico. Entretanto, resultados recentes de Xavier et al. (2004b; c)
demonstraram que as alterações vasculares periféricas observadas após tratamento
crônico com ouabaína não são conseqüentes da elevação da pressão arterial ou
ativação do sistema renina-angiotensina, uma vez que o tratamento com losartan
não preveniu essas alterações. Assim, ainda são necessários mais estudos para
elucidar as alterações vasculares promovidas pela administração crônica de
ouabaína.
As ações agudas da ouabaína também cursam com alterações de reatividade
vascular e modulação endotelial, dependendo do animal e leito vascular estudado.
Ponte et al. (1996a; b), mostraram que o endotélio modula positivamente as ações
da ouabaína em aortas de ratos SHR, provavelmente pela liberação de um fator
vasoconstritor, uma vez que na ausência do endotélio, a resposta contrátil induzida
pela ouabaína foi reduzida. Padilha et al. (2004), também demonstraram que o
endotélio modula positivamente as ações da ouabaína no leito vascular caudal de
animais SHR, através da liberação de angiotensina II. No entanto, em animais com
hipertensão provocada por NG-nitro-L-arginina metil ester (L-NAME), o endotélio é
capaz de liberar um fator capaz de abrir canais para potássio, reduzindo assim, a
resposta contrátil à fenilefrina induzida por concentrações nanomolares de ouabaína
(Rossoni et al., 2003). Já em animais normotensos, o endotélio parece exercer uma
43
modulação negativa nas ações da ouabaína, através da liberação de um fator
vasodilatador (Ponte et al., 1996a; b; Rossoni et al., 1999).
Além disso, trabalhos do nosso laboratório demonstram que concentrações
nanomolares de ouabaína, de forma aguda, próximas àquelas encontradas no
plasma de animais e pacientes hipertensos, são capazes de aumentar a pressão
arterial de animais hipertensos anestesiados e sensibilizar o leito arterial caudal
desses animais à resposta pressora induzida pela fenilefrina (Vassallo et al., 1997;
Rossoni et al., 2001). Barker et al. (2001) mostraram que baixas concentrações de
ouabaína causam aumento da pressão diastólica em ratos normotensos
anestesiados, sendo que essa ação, não é modulada por reflexos autonômicos,
sugerindo que o efeito pressor da ouabaína é mediado indiretamente pela liberação
de norepinefrina dos terminais simpáticos, bem como por ação direta no músculo
liso vascular. Desse modo, esses resultados sugerem que concentrações
nanomolares de ouabaína, administradas agudamente, podem aumentar a
resistência vascular através da sensibilização do músculo liso vascular a agentes
vasopressores, contribuindo assim, para o processo hipertensivo.
No presente estudo foram utilizados ratos SHR uma vez que são mais
sensíveis às ações de baixas concentrações de ouabaína do que os normotensos
(Vassallo et al., 1997). Os ratos espontaneamente hipertensos mimetizam a
hipertensão arterial humana (Okamoto & Aoki, 1963). A similaridade desse modelo
com a hipertensão essencial se dá pela predisposição genética a altos níveis de
pressão arterial, sem etiologia específica, pelo aumento da resistência vascular
periférica sem alterações de volume, e respostas similares aos tratamentos com
fármacos (Frohlich, 1986). Estudos demonstram que os níveis de pressão arterial
nesses animais se elevam após a terceira (Lais et al., 1977) ou quarta semana de
idade (Lee, 1985). Tem sido observado que no estágio pré-hipertensivo, ocorre
aumento da atividade simpática (Judy et al., 1976; Tucker & Johnson, 1984; Brock et
al., 1996), alterações estruturais na parede dos vasos sanguíneos (Lee, 1985;
Rizzoni et al., 1994; van Gorp et al., 2000; Dickhout & Lee, 2000) e disfunção
endotelial (Mombouli & Vanhoutte, 1999; Safar et al., 2001). Todos esses fatores
contribuem para o aumento da pressão arterial observado nesses animais.
44
Trabalhos recentes do nosso laboratório (Padilha et al., 2004) demonstraram
que concentrações fisiológicas de ouabaína aumentam a pressão arterial e
reatividade vascular in vitro de ratos SHR, mas não alteram esses parâmetros em
ratos normotensos, mostrando mais uma vez que ratos hipertensos são mais
sensíveis à ação desse digitálico. No entanto, os mecanismos pelos quais a
ouabaína exerce seus efeitos sobre a pressão arterial e reatividade vascular in vivo
nesses animais, ainda não foram esclarecidos. Portanto, o presente estudo visa
elucidar esses possíveis efeitos e respectivos mecanismos hipertensinogênicos do
tratamento agudo com pequenas concentrações de ouabaína.
45
OBJETIVOS
46
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Estudar o efeito do tratamento agudo com pequenas concentrações de
ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina em ratos
espontaneamente hipertensos (SHR).
2.2. Objetivos Específicos
• Avaliar os efeitos da ouabaína sobre a pressão arterial sistólica e
diastólica basal, e freqüência cardíaca, em animais hipertensos anestesiados.
• Estudar o efeito da ouabaína sobre a resposta pressora à fenilefrina.
• Verificar se os reflexos autonômicos interferem nas ações da ouabaína
sobre a pressão arterial basal e reatividade pressórica à fenilefrina.
• Investigar, se os efeitos da ouabaína na pressão arterial basal e
reatividade pressórica à fenilefrina, estão diretamente ligados à sua ação sobre a
Na+K+ ATPase.
• Averiguar a participação do Sistema Renina Angiotensina sobre os
efeitos na pressão arterial basal e reatividade pressórica à fenilefrina produzidos
pela ouabaína.
47
MATERIAIS E MÉTODOS
48
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais experimentais
Foram utilizados ratos espontaneamente hipertensos (SHR), machos, com
idade aproximada de 12 semanas, pesando entre 250 a 300g. Esses animais foram
cedidos pelo Biotério do Programa de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas da
Universidade Federal do Espírito Santo. Os animais foram mantidos em gaiolas, sob
condições controle de temperatura e ciclo claro-escuro de 12 horas, tendo livre
acesso à água e alimentação. O uso e cuidado destes animais experimentais foram
realizados de acordo com os princípios éticos da pesquisa com animais,
estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
3.2. Metodologia empregada para avaliação dos valores pressóricos
Os animais foram anestesiados com uretana (1,2 g/ Kg, i.p.) e submetidos à
cateterização da artéria carótida direita e veia jugular direita, para medidas
hemodinâmicas e administração de drogas, respectivamente. O plano anestésico foi
acompanhado com testes como pinçar o rabo do animal, e o anestésico foi
suplementado quando necessário. As canulações foram realizadas com um cateter
de polietileno (PE 50, Clay-Adams) preenchido com salina heparinizada (100 UI/ml).
Após a cateterização, o cateter arterial foi conectado a um transdutor de pressão
(Stathan P23 AA) acoplado a um pré-amplificador, que por sua vez, estava
conectado a um sistema Biopac de aquisição de dados (MP100 Biopac Systems,
Inc; CA). Foram feitos registros contínuos da pressão arterial sistólica (PAS),
pressão arterial diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC), durante todos os
protocolos experimentais.
49
3.3. Protocolos experimentais
3.3.1. Avaliação da pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade
pressórica à fenilefrina antes e após administração de ouabaína.
Com a finalidade de avaliar o efeito de concentrações nanomolares de
ouabaína na pressão arterial e na reatividade pressórica à fenilefrina, após um
período de 30 minutos de estabilização dos níveis pressóricos, foram feitos os
registros controle de pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e freqüência
cardíaca basais. Em seguida, doses crescentes de fenilefrina (0,03 a 100 µg/Kg, in
bolus, em um volume de 5 µl/100g) foram administradas para a obtenção de uma
curva concentração-resposta. Após a realização da curva concentração-resposta à
fenilefrina e estabilização da pressão arterial, foi realizado o tratamento agudo de
ouabaína (0,18 µg/Kg, i.v. em um volume de 17µl/100g). Uma hora depois, os
valores de pressão arterial e freqüência cardíaca basais foram novamente
mensurados e uma segunda curva concentração-resposta à fenilefrina foi realizada.
A concentração de ouabaína utilizada neste protocolo segue estudos prévios
do nosso laboratório, onde Vassallo et. al. (1997) sugerem que o tratamento com
0,18 µg/kg de ouabaína leva a concentrações plasmáticas nanomolares deste
digitálico, caso se assuma que este fármaco foi diluído em 40ml de volume
extracelular por 100g de rato. Esta dose se refere a aproximadamente 0,3nmol/Kg,
uma concentração que aumenta a pressão arterial de animais hipertensos mas não
altera a pressão arterial de animais normotensos (Vassallo, 1997; Rossoni et al.,
2001; Rossoni et al., 2003 ).
Para verificar a estabilidade do protocolo experimental, em um outro grupo de
animais (controle temporal), o mesmo protocolo acima foi realizado. Porém, no
momento da administração de ouabaína, foi administrada uma solução veículo
(salina 0,9%, iv), sendo que, o volume de salina administrado era equivalente ao
volume de ouabaína utilizado nos animais do grupo tratado agudamente com
ouabaína.
50
3.3.2. Efeito do tônus simpático nas ações da ouabaína sobre a pressão
arterial e reatividade pressórica à fenilefrina.
Estudos mostram que em animais hipertensos, a ouabaína tem uma ação
central ativando via simpatoexcitatória e reduzindo o tônus da via simpatoinibitória,
exacerbando a hipertensão destes animais (Huang & Leenen, 1996a). Sabendo
disso, esse protocolo teve a finalidade de avaliar uma possível participação do
Sistema Nervoso Autônomo, nas ações de concentrações nanomolares de ouabaína
sobre a pressão arterial basal e reatividade pressórica à fenilefrina.
Para isso, foi utilizado hexametônio, um antagonista de receptores nicotínicos
ganglionares autonômicos. Foram realizados então, dois grupos: um grupo controle,
apenas com hexametônio (Hexa), e um com pré-tratamento de hexametônio,
seguido da administração de ouabaína (Hexa + Oua).
No grupo controle, foram realizados registros basais da pressão arterial e da
freqüência cardíaca após a estabilização desses parâmetros e, em seguida, uma
curva concentração-resposta a fenilefrina foi feita. Após a estabilização da pressão
arterial, foi administrado hexametônio e após 30 minutos, uma nova curva
concentração-resposta foi realizada e os valores basais de pressão arterial e
freqüência cardíaca foram novamente mensurados.
No grupo Hexa + Oua, após a estabilização da pressão arterial, foram
realizados registros basais da pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e
freqüência cardíaca e, em seguida, foi administrado lentamente hexametônio (5
mg/kg i.v. em um volume de 4µl/100g). Após 30 minutos da administração deste
bloqueador, foram realizadas, novamente, as mensurações hemodinâmicas basais
e, em seguida, ouabaína (0,18 µg/kg) foi administrada. Após 1 hora, os valores
basais de pressão arterial e freqüência cardíaca foram novamente registrados e foi
realizada uma curva concentração-resposta à fenilefrina.
A dose de hexametônio utilizada nesse protocolo foi baseada em estudos
prévios do nosso laboratório (Rossoni et al, 2003; Padilha et al, 2004).
51
3.3.3. Influência da Na+K+ ATPase sobre os efeitos produzidos pela
ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina.
Esse protocolo teve a finalidade de avaliar se o efeito da ouabaína sobre a
pressão arterial e reatividade pressórica a fenilefrina estão diretamente ligados à sua
propriedade de inibir a Na+K+ ATPase. Para isso, foi utilizado canrenona, um
metabólito da espironolactona que tem a propriedade de se ligar ao sítio receptor
dos digitálicos na bomba de sódio, antagonizando a ligação da ouabaína neste sítio.
Para a realização deste protocolo, foram feitos dois grupos, um grupo
controle, apenas com canrenona (Can), e um com pré-tratamento com canrenona
seguido da administração de ouabaína (Can + Oua).
No grupo controle, foram realizados registros basais após a estabilização da
pressão arterial e da freqüência cardíaca e, em seguida, uma curva concentração-
resposta à fenilefrina foi feita. Após a estabilização da pressão arterial, foi
administrado canrenona e após 30 minutos, uma nova curva concentração-resposta
foi realizada e os valores basais de pressão arterial e freqüência cardíaca foram
novamente aferidos.
No grupo Can + Oua, após a estabilização da pressão arterial, foram
realizados registros basais da pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e
freqüência cardíaca e, em seguida, foi administrado canrenona (1 mg/kg i.v. em um
volume de 4µl/100g). Após 30 minutos da administração de canrenona, foram
realizadas, novamente, as mensurações hemodinâmicas e, em seguida, ouabaína
foi administrada. Após 1 hora, os valores basais de pressão arterial e freqüência
cardíaca foram novamente registrados e foi realizada uma curva concentração-
resposta à fenilefrina.
A dose de canrenona utilizada nesse protocolo foi baseada em prévios
estudos do nosso laboratório (Vassallo et al, 1998). Esta concentração de
canrenona, de 1 mg/kg, é considerada uma baixa concentração, que não altera a
contratilidade miocárdica, o tônus vascular e a pressão arterial.
52
3.3.4. Envolvimento do Sistema Renina Angiotensina sobre o efeito da
ouabaína na pressão arterial e reatividade pressórica à fenilefrina.
Buscando averiguar uma possível participação do Sistema Renina
Angiotensina nas ações da ouabaína sobre a pressão arterial e reatividade
pressórica à fenilefrina, foi realizado o pré-tratamento com losartan, um inibidor de
receptores do tipo AT1 para angiotensina II.
Dois grupos foram feitos para a realização deste protocolo. Um grupo
controle, apenas com losartan (Los) e um com pré-tratamento com Losartan,
seguido da administração de ouabaína (Los + Oua).
No grupo controle, foram realizados registros basais da pressão arterial e
freqüência cardíaca após a estabilização desses parâmetros e, em seguida, uma
curva concentração-resposta à fenilefrina foi feita. Após a estabilização da pressão
arterial, foi administrado losartan e após 30 minutos, uma nova curva concentração-
resposta foi realizada e os valores basais de pressão arterial e freqüência cardíaca
foram novamente mensurados.
No grupo Los + Oua, após a estabilização dos níveis pressóricos e
mensurações basais da pressão arterial sistólica, pressão arterial diastólica e
freqüência cardíaca, foi administrado losartan (10 mg/kg i.v. em um volume de
4µl/100g). Após 30 minutos da administração deste inibidor de receptores para
angiotensina II, foram realizadas, novamente, as mensurações hemodinâmicas e,
em seguida, ouabaína foi administrada. Seguida 1 hora, os valores basais de
pressão arterial e freqüência cardíaca foram novamente registrados e foi realizada
uma curva concentração-resposta à fenilefrina.
A dose de losartan utilizada nesse protocolo foi baseada em prévios estudos
do nosso laboratório (Padilha et al, 2004).
53
3.4. Expressão dos dados e análise estatística
Os resultados foram expressos como média +/- erro padrão da média (EPM).
Os valores de n significam o número de animais utilizados em cada grupo
experimental.
As respostas vasopressoras induzidas pela fenilefrina sobre a pressão
arterial, foram expressas no momento do pico de pressão após administração de
cada dose desse fármaco.
Para a determinação dos valores de resposta máxima (Rmáx) e pD2 (-log
EC50, que corresponde ao valor da concentração de fenilefrina que produz 50% da
resposta máxima), foi realizada uma análise de regressão não-linear, obtida através
da análise das curvas concentração-resposta.
Com a finalidade de comparar a magnitude de efeito dos fármacos sobre a
resposta pressora à fenilefrina, alguns resultados foram expressos como diferença
da área abaixo da curva (dAAC) de concentração-resposta à fenilefrina. A AAC foi
calculada para cada curva concentração-resposta e a diferença está expressa como
porcentagem da diferença da AAC (%dAAC) da curva controle correspondente.
A análise estatística dos resultados foi realizada por teste t, pareado e/ou não-
pareado, e análise de variância (ANOVA) uma via para medidas repetidas ou
completamente randomizadas, seguida pelo teste post-hoc de Tukey. Os resultados
foram considerados estatisticamente significantes para valores de p< 0,05.
O programa estatístico GraphPad Prism Software (San Diego, CA, USA) foi
utilizado para análise e apresentação gráfica dos dados obtidos.
54
3.5. Fármacos utilizados
- Canrenona (Sigma)
- Cloreto de sódio (Merck)
- Heparina Sódica (Roche)
- Hexametônio, cloreto (Sigma)
- L-Fenilefrina (Sigma)
- Losartan (Sigma)
- Ouabaína, octahidrato (Sigma)
- Uretana (Sigma)
Todos os fármacos foram dissolvidos em solução salina (0,9%) e mantidos a
-20°C.
55
RESULTADOS
56
4. RESULTADOS
4.1. Avaliação da Pressão Arterial Basal, Freqüência Cardíaca e Reatividade
Pressórica à fenilefrina antes e após tratamento agudo com ouabaína.
4.1.1. Efeitos da ouabaína na Pressão Arterial e Freqüência Cardíaca Basal.
A anestesia com uretana foi responsável pela redução da pressão arterial nos
animais espontaneamente hipertensos. Entretanto os valores de pressão arterial
sistólica e pressão arterial diastólica foram mantidos elevados nestes animais
quando comparados a animais normotensos, confirmando estudos prévios do nosso
laboratório (Vassallo, 1997; Rossoni et al., 2001; Rossoni et al., 2003).
Uma hora após a administração endovenosa de 0,18 µg/Kg de ouabaína
ocorreu uma elevação significativa da pressão arterial sistólica e diastólica. Porém, a
ouabaína não produziu nenhuma alteração na freqüência cardíaca (Tabela 1; Figura
1).
Com a finalidade de verificar a estabilidade do protocolo experimental, foi
realizado o controle temporal, onde no momento da administração de ouabaína era
administrada uma solução veículo (salina 0,9%, iv). A solução veículo não modificou
a pressão arterial após uma hora da sua administração, comprovando então a
estabilidade desse protocolo (PAS: Ct: 142 ± 7,3; Salina: 144 ± 5,3; PAD: Ct: 96,2 ±
6,1; Salina: 105 ± 4,0; FC: Ct: 369 ± 9,0; Salina: 396 ± 17,2; Teste t pareado; p>0,05;
n=5).
Tabela 1: Parâmetro da Pressão Arterial Sistólica Basal (PAS), Pressão Arterial Diastólica Basal (PAD) e Freqüência Cardíaca Basal (FC) antes (Ct) e após (Oua) tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína; (n= 7).
Grupo PAS basal
(mmHg)
PAD basal
(mmHg)
FC basal
(bpm)
Ct 137 ± 5,1 93,7 ± 7,7 394 ± 10,2
Oua 150 ± 4,7 * 116 ± 3,5 * 381 ± 16,9
Os resultados estão expressos em média ± EPM. Teste t pareado; *p<0,05 vs Ct.
57
A)
B)
Figura 1: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=7) e após (Oua, n=7) 1 hora de tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína. Teste t pareado; *p<0,05 vs Ct.
0
100
200
*
Ct
Oua
PAS (mmHg)
0
50
100
150
*
Ct
Oua
PAD (mmHg)
58
4.1.2. Efeitos da Ouabaína sobre a reatividade pressórica à fenilefrina na
Pressão Arterial Sistólica e Pressão Arterial Diastólica.
A administração de fenilefrina aumentou, de maneira concentração-
dependente, a pressão arterial sistólica e diastólica dos animais espontaneamente
hipertensos. Contudo, o tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína não foi capaz de
modificar a resposta máxima nem a sensibilidade ao agonista alfa 1-adrenérgico na
pressão arterial sistólica e diastólica (Tabela 2; Figura 2).
A estabilidade desse protocolo experimental também foi verificada com a
realização de uma curva concentração-resposta à fenilefrina antes e uma hora após
da administração da solução veículo (salina 0,9%). Observou-se que a solução
veículo não foi capaz de modificar os parâmetros de sensibilidade na resposta
pressora à fenilefrina (pD2, PAS: Ct: -2,56 ± 0,08 vs Salina: -2,81 ± 0,02; p>0,05;
Teste t; PAD: Ct: -2,91 ± 0,09 vs Salina: -3,05 ± 0,13; p>0,05; Teste t), nem a
resposta máxima a esse agente vasoconstritor (Rmax, PAS: Ct: 309 ± 21,86 vs
Salina: 299 ± 24,87; p>0,05; Teste t; PAD: Ct: 210 ± 10,56 vs Salina: 199 ± 14,62
p>0,05; Teste t; n=5).
Tabela 2: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina da PAS e PAD, antes (Ct) e após (Oua) tratamento com 0,18 µg/Kg ouabaína,( n=7).
Os resultados estão expressos em média ± EPM. Teste t pareado para comparações de Rmax e pD2; p>0,05.
Grupo Rmax pD2
PAS
Ct
Oua
278 ± 17,3
273 ± 18,9
-2,20 ± 0,7
-2,95 ± 0,05
PAD
Ct
Oua
185 ± 4,4
179 ± 5,8
-2,78 ± 0,42
-3,09 ± 0,13
59
A)
B)
Figura 2: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=7) e após (Oua, n=7) 1 hora de tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína. Teste t pareado para comparações de Rmax e pD2; p>0,05.
-6 -5 -4 -3 -2 -1
100
200
300
Ct
Oua
FE log [M]
PAS (mmHg)
-6 -5 -4 -3 -2 -1
50
100
150
200Ct
Oua
FE log [M]
PAD (mmHg)
60
4.2. Efeito do tônus simpático nas ações da ouabaína sobre a pressão arterial,
freqüência cardíaca e reatividade pressórica à fenilefrina.
Considerando que mecanismos reflexos autonômicos poderiam estar
mascarando os efeitos da ouabaína sobre a pressão arterial, freqüência cardíaca e
reatividade pressórica, foi realizado o co-tratamento com hexametônio.
4.2.1. Resultado do bloqueio ganglionar com hexametônio na pressão arterial
basal e freqüência cardíaca basal antes e após tratamento com ouabaína.
A infusão de hexametônio diminuiu a pressão arterial sistólica e diastólica,
porém não provocou alteração na freqüência cardíaca. O tratamento com
concentrações nanomolares de ouabaína, mesmo na presença de hexametônio foi
capaz de aumentar a pressão arterial sistólica e diastólica, mas não provocou
alteração na freqüência cardíaca (Tabela 3; Figura 3).
Tabela 3: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS), Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes (Ct), depois da administração de hexametônio (Hexa) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6).
Grupo PAS basal
(mmHg)
PAD basal
(mmHg)
FC basal
(bpm)
Ct 149 ± 5,2 103 ± 5,9 359 ± 11
Hexa
Hexa+Oua
118± 4,9 *
145 ± 4,4 + 79 ± 7,4 *
103 ± 7,8+ 336 ± 12
348 ± 9,8
Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via; *p< 0,05 Hexa vs Ct, + p<0,05 Hexa+Oua vs Hexa.
61
A) B) Figura 3: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da administração de hexametônio (Hexa) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6). ANOVA 1 via; *p< 0,05 Hexa vs Ct, + p<0,05 Hexa+Oua vs Hexa.
0
50
100
150
+
*
Ct
Hexa
Hexa + Oua
PAD (mmHg)
0
100
200
+
*
Ct
Hexa
Hexa + OuaPAS (mmHg)
62
4.2.2. Efeito do bloqueio autonômico com hexametônio sobre a reatividade
pressórica à fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.
A administração de hexametônio não alterou a reatividade pressórica à
fenilefrina. O tratamento com ouabaína, na presença de hexametônio não modificou
a resposta máxima e sensibilidade ao agente vasoconstritor na pressão sistólica
(Tabela 4; Figura 4 A). Em relação à pressão diastólica, após a eliminação da
influência do Sistema Nervoso Autônomo com a administração de hexametônio, a
ouabaína aumentou a sensibilidade à fenilefrina, sem alterar, entretanto, a resposta
máxima (Tabela 4; Figura 4 B).
Este resultado também pode ser evidenciado através da análise da diferença
da área abaixo da curva (dAAC) da pressão arterial diastólica, onde o efeito
concentração-dependente da fenilefrina foi de maior magnitude após o co-
tratamento de hexametônio mais ouabaína (PAD: 17,2 ± 5,53 %) quando comparada
àquele obtido após administração apenas de hexametônio (PAD: 0,7 ± 4,59 %;
p<0,05) (Figura 5).
Tabela 4: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de hexametônio (Hexa) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa + Oua); (n= 6).
Grupo Rmax pD2
PAS
Ct
Hexa
Hexa+Oua
276 ± 18,0
285 ± 12,7
294 ± 10,8
-2,80 ± 0,09
-2,89 ± 0,07
-2,97 ± 0,14
PAD
Ct
Hexa
Hexa+Oua
179 ± 12,8
185 ± 8,7
192 ± 6,0
-2,95 ± 0,11
-3,06 ± 0,13
-3,34 ± 0,12*
Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; *p< 0,05 vs Ct.
63
A)
B)
Figura 4: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da administração de hexametônio (Hexa, n=6) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Hexa+Oua, n= 6). ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; *p<0,05 Hexa+Oua vs Ct.
-6 -5 -4 -3 -2 -1
100
200
300
Ct
Hexa
Hexa+Oua
FE log [M]
PAS (mmHg)
-6 -5 -4 -3 -2 -1
50
100
150
200
Ct
Hexa
Hexa+Oua
FE log [M]
PAD (mmHg)
*
64
Figura 5: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a Pressão Arterial Diastólica após administração de hexametônio e após tratamento com hexametônio+ouabaína. Teste t não-pareado; *p<0,05 vs Ct/Hexa.
0
25
50
Ct vs Hexa Ct vs Hexa+Oua
*% dAAC
65
4.3. Influência da Na+K+ ATPase sobre os efeitos produzidos pela
ouabaína na pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade pressórica à
fenilefrina.
Após análise da influência do Sistema Nervoso Autônomo sobre os efeitos
pressores da ouabaína, avaliou-se a influência da bomba de sódio sobre as ações
desse digitálico. Assim, com a finalidade de avaliar se os efeitos da ouabaína sobre
a pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade pressórica à fenilefrina estão
diretamente ligados à sua propriedade de inibir a Na+K+ ATPase, foi realizado o co-
tratamento com canrenona.
4.3.1. Efeito do bloqueio com canrenona na pressão arterial basal e
freqüência cardíaca basal antes e após tratamento com ouabaína.
A administração de canrenona per se, não modificou a pressão arterial
sistólica e diastólica basal, assim como a freqüência cardíaca. O tratamento com
ouabaína, na presença de canrenona, não produziu alteração na pressão arterial
sistólica e freqüência cardíaca, porém a ouabaína foi capaz de aumentar a pressão
arterial diastólica para valores acima da condição controle, mesmo após tratamento
com canrenona (Tabela 5; Figura 6).
Tabela 5: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS), Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes (Ct), depois da administração de canrenona (Can) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6).
Grupo PAS basal
(mmHg)
PAD basal
(mmHg)
FC basal
(bpm)
Ct 140 ± 4,2 94,8 ± 4,4 341 ± 13,7
Can
Can+Oua
146 ± 9,8
155 ± 2,7 96,8 ± 7,3
114,0 ± 4,2*
362 ± 6,6
362± 8,1
Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via; *p< 0,05 Can+Oua vs Ct e Can.
66
A)
B)
Figura 6: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da administração de canrenona (Can) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6). ANOVA 1 via; *p< 0,05 Can+Oua vs Ct e Can.
0
100
200
Ct
Can
Can + Oua
PAS (mmHg)
0
50
100
150
*
Ct
Can
Can + Oua
PAD (mmHg)
67
4.3.2. Efeito do bloqueio com canrenona sobre a reatividade pressórica à
fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.
A canrenona não alterou a reatividade pressórica à fenilefrina. O tratamento
com ouabaína, após a infusão de canrenona, também não modificou a resposta
máxima e sensibilidade ao agente vasoconstritor na pressão arterial sistólica e
diastólica (Tabela 6; Figura 7).
No entanto, a análise da diferença da área abaixo da curva da pressão arterial
diastólica, analisando as doses 0,03 a 1 µg/Kg, ou seja, as seis primeiras doses da
curva, mostrou que o aumento da reatividade pressórica à fenilefrina foi de maior
magnitude após a administração de canrenona e ouabaína (PAD: 37,5 ± 5,8 %)
quando comparada àquela obtida após administração apenas de canrenona (PAD:
19,8 ± 4,0 %, p<0,05) (Figura 8).
Tabela 6: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de canrenona (Can) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can + Oua); (n= 6).
Grupo Rmax pD2
PAS
Ct
Can
Can + Oua
305 ± 7
301 ± 8,2
269 ± 19
-2,7 ± 0,06
-2,9 ± 0,05
-2,8 ± 0,04
PAD
Ct
Can
Can + Oua
184 ± 7,3
197 ± 4,8
186 ± 6
-3,0 ± 0,28
-3,1 ± 0,06
-3,0 ± 0,07
Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; p>0,05.
68
A)
B)
Figura 7: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da administração de canrenona (Can, n=6) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Can+Oua, n= 6). ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; p>0,05.
-6 -5 -4 -3 -2 -1
100
150
200
250
300
350
Ct
Can
Can+Oua
FE log [M]
PAS (mmHg)
-6 -5 -4 -3 -2 -1
50
100
150
200
Ct
Can
Can+Oua
FE log [M]
PAD (mmHg)
69
Figura 8: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC), das doses de 0,03 a 1µg/Kg, sobre a Pressão Arterial Diastólica após administração de canrenona e após tratamento com canrenona+ouabaína. Teste t não-pareado; *p<0,05 vs Ct/Can.
0
25
50
*
Ct vs Can Ct vs Can+Oua
% dAAC
70
4.4. Envolvimento do Sistema Renina Angiotensina sobre o efeito da ouabaína
na pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade pressórica à fenilefrina.
Buscando averiguar uma possível influência do Sistema Renina Angiotensina
nas ações da ouabaína sobre a pressão arterial, freqüência cardíaca e reatividade
pressórica à fenilefrina, foi realizado o pré-tratamento com losartan.
4.4.1. Efeito do losartan na pressão arterial basal e freqüência cardíaca basal
antes e após tratamento com ouabaína.
A administração de losartan provocou uma diminuição da pressão arterial
sistólica e diastólica, mas não alterou a freqüência cardíaca. Na presença de
losartan, a ouabaína não foi capaz de promover alterações na pressão arterial
sistólica e diastólica basal, e nem na freqüência cardíaca (Tabela 7; Figura 9).
Tabela 7: Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS), Pressão Arterial Diastólica (PAD) e Freqüência Cardíaca (FC) antes (Ct), depois da administração de losartan (Los) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).
Grupo PAS basal
(mmHg)
PAD basal
(mmHg)
FC basal
(bpm)
Ct 128 ± 4,2 72,5 ± 4 332 ± 13,3
Los
Los+Oua
113 ± 2,9 *
110 ± 3,7 + 57,1 ± 5 *
53,6 ± 4,9 + 337 ± 18,6
334 ± 13,6
Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via; *p< 0,05 Los vs Ct; +p<0,05 Los+Oua
vs Ct.
71
A)
B)
Figura 9: (A) Alterações sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct), depois da administração de losartan (Los) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6). ANOVA 1 via; *p< 0,05 Los vs Ct; +p<0,05 Los+Oua vs Ct.
0
100
200
Ct
Los
Los + Oua
* +PAS (mmHg)
0
50
100
* +
Ct
Los
Los + Oua
PAD (mmHg)
72
4.4.2. Efeito do bloqueio dos receptores para angiotensina II na reatividade
pressórica antes e após tratamento com ouabaína.
O losartan per se, não alterou a reatividade pressórica à fenilefrina. Após o
tratamento com losartan, a ouabaína produziu uma diminuição da resposta máxima
à fenilefrina na pressão arterial sistólica, sem alterar, entretanto, a sensibilidade. Em
relação à pressão arterial diastólica, não houve mudanças de resposta máxima e
sensibilidade à fenilefrina após tratamento com losartan e ouabaína (Tabela 8;
Figura 10).
Contudo, a análise da diferença da área abaixo da curva das situações Ct,
Los e Los+Oua mostrou que a diminuição da reatividade pressórica à fenilefrina foi
de maior magnitude após a administração de losartan e ouabaína (PAS: -23,1 ± 2,13
%; PAD: -30,0 ± 4,89 %) quando comparada àquela obtida após administração
apenas de losartan (PAS: -10,0 ± 2,16 %; PAD: -15,1 ± 2,30 %, p<0,05) (Figura 11 A
e B).
Tabela 8: Parâmetro de resposta máxima (Rmax, mmHg) e sensibilidade (pD2) das curvas concentração-resposta à fenilefrina da PAS e PAD, antes (Ct), depois da administração de losartan (Los) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los + Oua); (n= 6).
Grupo Rmax pD2
PAS
Ct
Los
Los+Oua
281 ± 8,1
275 ± 7,7
246 ± 6,9 *
-2,7 ± 0,15
-2,5 ± 0,10
-2,7 ± 0,06
PAD
Ct
Los
Los+Oua
173 ± 7,5
162 ± 5,7
159 ± 9,9
-2,6 ± 0,52
-2,9 ± 0,09
-2,8 ± 0,11
Os resultados estão expressos em média ± EPM. ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; *p<0,05 Los+Oua vs Ct e Los.
73
A)
B) Figura 10: (A) Efeito concentração-dependente induzido pela fenilefrina (FE) sobre a Pressão Arterial Sistólica (PAS) e (B) Pressão Arterial Diastólica (PAD) antes (Ct, n=6), depois da administração de losartan (Los, n=6) e após tratamento com 0,18 µg/Kg de ouabaína (Los+Oua, n= 6). ANOVA 1 via para comparações de Rmax e pD2; *p<0,05 Los+Oua vs Ct e Los .
-6 -5 -4 -3 -2 -1
100
200
300 Los+Oua
Los
Ct
*
FE log [M]
PAS (mmHg)
-6 -5 -4 -3 -2 -1
50
100
150
200
Ct
Los
Los+Oua
FE log [M]
PAD (mmHg)
74
A) B) Figura 11: Diferenças percentuais da área abaixo da curva de concentração-resposta à fenilefrina (%dAAC) sobre a (A) Pressão Arterial Sistólica e (B) Pressão Arterial Diastólica após administração de losartan e após tratamento com losartan+ouabaína. Teste t não-pareado; *p<0,05 vs Ct/Los.
Ct x Los Ct x Los+Oua
-30
-20
-10
0
10
20
30
*
% d AAC
Ct x Los Ct x Los+Oua
-40
-20
0
20
40
*
% d AAC
75
DISCUSSÃO
76
5. DISCUSSÃO
Os dados obtidos nesse estudo demonstram que pequenas concentrações
de ouabaína são capazes de aumentar a pressão arterial de ratos espontaneamente
hipertensos, exacerbando o quadro hipertensivo desses animais. Esse mecanismo
hipertensor parece ser dependente da sua ação sobre a bomba de sódio e do
sistema renina-angiotensina. Já em relação às possíveis alterações na reatividade
pressórica à fenilefrina, considerando que, no experimento in vivo, todos os
mecanismos de controle cardiovascular estão em funcionamento, essa concentração
de ouabaína, per se, não modificou os parâmetros de reatividade pressórica.
Contudo, após as intervenções farmacológicas realizadas, sugerimos que a
ouabaína ativa mecanismos pressores e depressores que em conjunto, se anulam, e
assim, não alteram a reatividade pressórica à fenilefrina.
Os presentes achados mostram que os efeitos da fenilefrina sobre a pressão
arterial diastólica, na presença de ouabaína, encontram-se aumentados após
bloqueio com hexametônio e canrenona, e diminuídos após bloqueio com losartan.
Já a reatividade à fenilefrina na pressão arterial sistólica, na presença de ouabaína,
encontra-se inalterada após bloqueio com hexametônio e canrenona, e diminuída
após bloqueio dos receptores AT1. Em conjunto, esses resultados de reatividade
vascular indicam que a ouabaína atua através de mecanismos periféricos,
dependentes do sistema renina-angiotensina e da sua ação sobre a bomba de
sódio, além de sofrer modulação do sistema nervoso central.
Estudos do nosso grupo demonstraram que concentrações nanomolares de
ouabaína aumentam a pressão arterial de ratos com hipertensão renovascular e
hipertensão L-NAME, e não promovem alterações na pressão arterial dos animais
normotensos (Rossoni et al., 2001; 2003). Em ratos SHR, o tratamento com baixas
concentrações de ouabaína também eleva a pressão arterial e reatividade
pressórica à fenilefrina, mas não modifica esses parâmetros nos animais controles
(Vassallo et al., 1997). Entretanto, os mecanismos hipertensinogênicos do
tratamento agudo com pequenas concentrações de ouabaína nos ratos
espontaneamente hipertensos ainda não foram esclarecidos. Sendo assim, foram
desenvolvidos alguns protocolos experimentais para investigar esses possíveis
mecanismos.
77
5.1. Efeitos da ouabaína na Pressão Arterial, Freqüência Cardíaca Basal
e Reatividade Pressórica à fenilefrina.
Estudos demonstram que os níveis de ouabaína endógena se encontram
elevados em uma grande parte dos pacientes com hipertensão essencial, e são
correlacionados com a pressão arterial (Goto et al., 1990; Rossi et al., 1995;
Manunta et al., 1999; 2001). Em animais, a administração prolongada desse
digitálico é capaz de induzir hipertensão (Yuan et al., 1993; Manunta et al., 1994;
Rossoni et al.,2002a; Dostanic et al., 2005). Sendo assim, esse hormônio tem sido
amplamente relacionado com o desenvolvimento e/ou manutenção do processo
hipertensivo.
Os efeitos da ouabaína são usualmente explicados por sua propriedade de
inibir a bomba de sódio em diversos tecidos, incluindo o músculo liso vascular,
levando ao acúmulo de sódio intracelular e conseqüente aumento de cálcio
mioplasmático, através da abertura de canais de cálcio dependentes de voltagem e
redução da atividade do trocador Na+/Ca2+ (Vassalle, 1987; Marin et al., 1988;
Blaustein, 1993). Além disso, a inibição da bomba presente nos nervos simpáticos
aumenta a liberação de noradrenalina e reduz sua captação (Vanhoutte & Lorenz,
1984; Barker et al., 2001). Desse modo, o resultado final da inibição da bomba de
sódio é a contração do músculo liso vascular e assim, aumento da resistência
vascular periférica, mecanismo importante na gênese e/ou manutenção da
hipertensão arterial. A hipertensão desenvolvida pela ouabaína tem sido relacionada
também aos seus efeitos sobre o sistema nervoso central. Trabalhos mostram que
esse digitálico promove hiperatividade simpática através da ativação dos sistemas
renina-angiotensina (Huang & Leenen, 1994; Zhang & Leenen, 2001) e endotelina
(Di Filippo et al., 2003), além de causar prejuízo da atividade barorreflexa (Huang &
Leenen, 1999).
É importante ressaltar que o efeito vasoconstritor direto da ouabaína ocorre
em altas concentrações desse composto (Ross Jr et al.,1960; Mason & Braunwald,
1964; Marin et al., 1988). Como a ouabaína plasmática se encontra em baixas
concentrações, um outro mecanismo tem sido proposto para explicar sua ação
pressora. Esse mecanismo se baseia na sensibilização do músculo liso a agentes
vasopressores (Songu-Mize et al., 1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999;
2001). Recentemente, foi identificada uma microrregião da célula, onde estão
78
localizados o trocador Na+/Ca2+ e as isoformas α2 e α3 da Na+K+ ATPase, que
possuem maior afinidade pela ouabaína (Juhaszova & Blaustein, 1997a; 1997b). A
inibição da bomba de sódio nessa região promove aumento local de cálcio
mioplasmático, que é captado pela Ca2+ ATPase do retículo sarcoplasmático e
estocado no interior dessa organela (Blaustein et al., 1998). Assim, após estímulo de
um agonista vasoconstritor, a resposta contrátil resultante é amplificada em
decorrência de uma maior liberação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático. Dessa
forma, a ouabaína é capaz de aumentar a resistência vascular através da
sensibilização do músculo liso a agentes vasopressores, contribuindo para o
processo hipertensivo.
Buscando averiguar as ações pressoras e os mecanismos
hipertensinogênicos de baixas concentrações de ouabaína nos ratos SHR, o
presente trabalho mostrou que a administração aguda de concentrações fisiológicas
desse digitálico promove aumento da pressão arterial sistólica e diastólica. Esses
achados corroboram estudos prévios do nosso grupo onde a ouabaína promoveu
aumento da pressão arterial de animais hipertensos anestesiados e sensibilizou o
leito arterial caudal desses animais à resposta pressora induzida pela fenilefrina,
sugerindo que os animais hipertensos são mais sensíveis ao efeito pressórico
induzido pela ouabaína (Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 2001; Padilha et al.,
2004). Em relação à freqüência cardíaca, não houve alterações após administração
desse digitálico, corroborando dados já demonstrados no nosso laboratório (Rossoni
et al., 2001). O aumento na pressão arterial sistólica pode estar relacionado com o
efeito clássico desse digitálico de inotropismo positivo através da inibição da bomba
de sódio (Cattel & Gold, 1938; Blaustein, 1993; Wasserstrom & Aistrup, 2005;
Altamirano et al., 2006). Já o aumento da pressão arterial diastólica indica que a
ouabaína promove aumento da resistência vascular periférica (Blaustein, 1993).
Como já evidenciado em estudos prévios, concentrações nanomolares de
ouabaína são capazes de promover sensibilização do músculo liso vascular a
agentes vasopressores, em animais espontaneamente hipertensos (Vassallo et al.,
1997) e com hipertensão renovascular (Rossoni et al., 2001), nas condições
experimentais in vivo. Entretanto, a reatividade pressórica testada nesses estudos
foi realizada apenas com 3 concentrações de fenilefrina, dificultando a análise da
sensibilidade e resposta máxima ao agente vasoconstritor. No presente estudo, foi
79
realizada uma curva concentração-resposta à fenilefrina completa, com 11
concentrações desse vasoconstritor. Nessa situação, o tratamento com ouabaína,
per se, não alterou os parâmetros de reatividade pressórica à fenilefrina. Contudo,
essa mesma concentração de ouabaína in vitro, foi capaz de aumentar a resposta à
fenilefrina em leito arterial caudal de ratos SHR (Padilha et al., 2004). Como o
presente experimento foi realizado em condições in vivo, podem estar ocorrendo
respostas compensatórias do organismo que justifiquem a ausência de alterações
na reatividade pressórica após tratamento com ouabaína.
Conforme já descrito acima, a habilidade da ouabaína de aumentar a pressão
arterial de ratos anestesiados pode ser resultado de mecanismos centrais e/ou
periféricos. Esses mecanismos se baseiam no aumento da atividade simpática, na
ação direta da ouabaína sobre o músculo liso vascular, e na sensibilização da
musculatura vascular a agentes vasopressores (Blaustein, 1993; Huang & Leenen,
1994; Songu-Mize et al., 1995; Vassallo et al., 1997; Rossoni et al., 1999; 2001).
Assim, objetivando investigar qual seria o mecanismo hipertensinogênico da
concentração de ouabaína utilizada no presente estudo, foram realizadas algumas
intervenções farmacológicas que serão discutidas a seguir.
80
5.2. Efeito do hexametônio na pressão arterial e reatividade pressórica à
fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.
Tem sido demonstrado que, tanto em animais normotensos quanto
hipertensos, a ouabaína, cronicamente, induz hipertensão através de mecanismos
centrais. Esses mecanismos se baseiam no aumento da atividade simpática e
prejuízo da atividade barorreflexa, uma vez que o bloqueio ganglionar com
hexametônio normaliza a pressão arterial e freqüência cardíaca dos ratos tratados
cronicamente com ouabaína (Huang et al., 1994).
No presente estudo, diferente dos estudos crônicos acima citados, os efeitos
pressores da administração aguda de concentrações fisiológicas de ouabaína nos
animais espontaneamente hipertensos não foram bloqueados pelo hexametônio.
Esses resultados corroboram estudos prévios do nosso grupo, onde a ouabaína nas
concentrações de 6 e 18µg/Kg, de forma aguda, aumenta a pressão arterial de ratos
normotensos através de mecanismos periféricos, uma vez que o bloqueio dos
reflexos cardiovasculares não abole seu efeito pressor (Barker et al., 2001). Ross Jr.
et al. (1960), também evidenciaram que os efeitos pressores agudos da ouabaína
em cães anestesiados não são bloqueados após infusão de hexametônio, sugerindo
uma ação periférica desse digitálico diretamente sobre a musculatura lisa vascular.
Diferentemente, dados de Rossoni et al. (2003), mostram que em animais
hipertensos L-NAME, o efeito pressor provocado por 0,18 µg/Kg de ouabaína é
abolido após bloqueio com hexametônio. Isso indica que os mecanismos
hipertensores da ouabaína diferem em relação ao tipo de tratamento e modelo
animal estudado.
Assim sendo, os presentes resultados indicam que concentrações
nanomolares desse digitálico, de forma aguda, não têm ações nos neurônios pré-
ganglionares e/ou sistema nervoso central dos ratos espontaneamente hipertensos.
Portanto, parece que a ouabaína, em condições fisiológicas, age através de
mecanismos periféricos, que resultam em aumento da pressão arterial.
Quando a reatividade pressórica à fenilefrina foi testada após co-tratamento
de hexametônio e ouabaína, não foram observadas alterações de sensibilidade e
resposta máxima do agente vasoconstritor na pressão arterial sistólica. Entretanto,
após a remoção da influência do Sistema Nervoso Autônomo, a ouabaína aumentou
81
a sensibilidade da fenilefrina na pressão arterial diastólica. Isto pode ser evidenciado
através da análise da pD2 e da diferença da área abaixo da curva. Esses efeitos
sobre a reatividade pressórica foram, em parte, diferentes dos efeitos da ouabaína
em condições basais. Esses resultados indicam que os reflexos autonômicos, na
presença de ouabaína, modulam a reatividade pressórica à fenilefrina na pressão
arterial diastólica. Desse modo, após eliminação da influência do Sistema Nervoso
Autônomo, a ouabaína pode estar agindo diretamente no músculo liso vascular ou
mediando a liberação de catecolaminas nos terminais simpáticos, e assim,
aumentando a reatividade pressórica à fenilefrina na pressão arterial diastólica.
Esses achados corroboram estudos do nosso grupo onde, em ratos normotensos,
baixas concentrações de ouabaína produzem respostas pressoras por ações nos
terminais simpáticos e no músculo liso vascular (Barker et al., 2001).
Após avaliação da influência dos efeitos centrais da ouabaína, o próximo
objetivo desse estudo foi avaliar se a ação hipertensora desse digitálico está
relacionada com sua propriedade de inibir a bomba de sódio.
82
5.3. Efeito da canrenona na pressão arterial e reatividade pressórica à
fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.
Classicamente, os efeitos da ouabaína são explicados por sua capacidade de
se ligar à subunidade α da Na+K+ATPase e, assim, inibir a atividade da bomba de
sódio (Skou & Esmann, 1992; Lingrel, 1992). Essa inibição, por sua vez, resulta no
acúmulo de sódio intracelular e conseqüente aumento de cálcio mioplasmático,
através da abertura de canais de cálcio dependentes de voltagem e redução da
atividade do trocador Na+/Ca2+ (Vassalle, 1987; Marin et al., 1988; Blaustein,
1993ALE). Além disso, a inibição da bomba presente nos nervos simpáticos
aumenta a liberação de noradrenalina e reduz sua captação (Vanhoutte & Lorenz,
1984; Barker et al., 2001). O resultado final dessa inibição é a contração do músculo
liso vascular e assim, aumento da resistência vascular periférica, mecanismo
importante na gênese e/ou manutenção da hipertensão arterial.
Diante disso, objetivando avaliar se o efeito hipertensor agudo de
concentrações fisiológicas de ouabaína é dependente da inibição da bomba de
sódio, foi utilizada canrenona, que tem sido descrita como um bloqueador dos
efeitos da ouabaína, principalmente nos estados hipertensivos dependentes de
volume (Grichois et al., 1986; Pamnani et al., 1990). A canrenona é um metabólito
do fármaco anti-hipertensivo espironolactona, um inibidor competitivo da aldosterona
(Sadée et al., 1973; Marver & Kocco, 1983). Em adição a esses efeitos anti-
hipertensivos da canrenona, trabalhos sugerem que sua ação inibitória sobre os
efeitos da ouabaína, contribui para seus efeitos hipotensores e, assim, sua utilização
pode ser recomendada nas condições hipertensivas que são acompanhadas de
aumento dos níveis plasmáticos de ouabaína (De Mendonça et al., 1985; 1988;
Semplicini et al., 1995). O efeito da canrenona de antagonizar as ações da ouabaína
se deve ao fato de que esse metabólito também se liga na bomba de sódio e assim,
bloqueia o sítio de ligação para os digitálicos (Finotti & Palatini, 1981; Balzan et al.,
2003). Sua ação sobre a bomba de sódio é dependente da concentração utilizada.
Assim, baixas concentrações de canrenona são capazes de inibir a bomba de sódio
(Finotti & Palatini, 1981) ao contrário de altas concentrações, que estimulam (Garay
et al., 1985). Portanto, baseado em estudos anteriores do nosso grupo (Vassallo et
al., 1998), o presente estudo utilizou baixas concentrações de canrenona,
83
conhecidas por não alterar a contratilidade miocárdica, o tônus vascular e a pressão
arterial.
Os presentes resultados mostram que a canrenona foi capaz de abolir o efeito
hipertensor da ouabaína sobre a pressão arterial sistólica. Isso indica que o efeito
inotrópico positivo da ouabaína, se deve à sua ação inibitória sobre a bomba de
sódio. A expressão das isoformas da Na+K+ATPase no coração varia dependendo
das espécies. As isoformas α1 e α2 estão presentes no coração de roedores,
enquanto α1, α2 e α3 são expressas no coração humano (Orlowski & Lingrel, 1988;
Shamraj et al., 1991; Jewell et al., 1992). Embora a isoforma α1 apresente baixa
afinidade pela ouabaína, estudos em camundongos geneticamente modificados têm
demonstrado que esta, juntamente com a isoforma α2, de alta afinidade pela
ouabaína, são inibidas por concentrações nanomolares desse digitálico, produzindo
assim, efeito inotrópico positivo, corroborando os presentes resultados (Dostanic et
al. 2004; Larson et al., 2006). Esses autores demonstraram também que essas
isoformas estão funcionalmente e fisicamente acopladas ao trocador Na+/Ca2+, e,
quando a atividade desse trocador é inibida, o efeito cardiotônico da ouabaína é
abolido. Isso confirma a hipótese de que a inibição da Na+K+ATPase leva a uma
redução ou inibição da atividade do trocador, e conseqüente aumento de cálcio
intracelular, promovendo assim, efeito inotrópico positivo.
O bloqueio dos efeitos desse digitálico sobre a pressão arterial sistólica
produzido pela canrenona confirma dados do nosso laboratório, onde em ratos
normotensos, a canrenona foi capaz de bloquear os efeitos pressóricos de
1,8 mg/Kg e 18 µg/Kg de ouabaína (Vassallo et al, 1998). Desse modo, esses dados
indicam a importância da inibição da Na+K+ ATPase nas ações da ouabaína sobre a
pressão arterial sistólica.
Entretanto, a canrenona não bloqueou os efeitos da ouabaína sobre a
pressão arterial diastólica. Isso indica que esse digitálico pode estar atuando através
de outros mecanismos hipertensinogênicos, que são independentes da inibição da
Na+K+ATPase. Evidências na literatura mostram que a ação hipertensora da
ouabaína parece ser independente da sua propriedade de inibir a bomba de sódio
(Manunta et al., 2001). Isso é baseado em trabalhos que observaram que o
tratamento com glicosídeos cardíacos como a digoxina e digitoxina, não são
capazes de induzir hipertensão arterial em ratos, ao contrário da ouabaína (Guthrie,
1984; Manunta et al., 2000; Kimura et al., 2000). Além disso, Manunta et al. (2001),
84
comparando o efeito hipertensivo da ouabaína e de alguns dos seus isômeros, como
a iso-ouabaína e a dihidro-ouabaína, com seu efeito sobre a atividade da
Na+K+ATPase, demonstraram que o efeito hipertensor da ouabaína e seus isômeros
é independente da sua potência inibitória sobre a bomba de sódio. A análise da
estrutura-atividade dessas substâncias mostrou que a ouabaína é o inibidor mais
potente da atividade da Na+K+ATPase comparada à iso-ouabaína e à dihidro-
ouabaína, porém estes últimos possuem uma atividade hipertensora mais
pronunciada. Isso levanta a possibilidade de que a bomba de sódio parece não ser o
alvo inicial ou principal do mecanismo pelo qual a ouabaína induz aumento
sustentando da pressão arterial. Diante dessas evidências, novos sítios de ligação
para a ouabaína, distintos da Na+K+ATPase, em células adrenocorticais têm sido
descritos, os quais podem estar relacionados com os efeitos hipertensores desse
digitálico (Ward et al., 2002). Além disso, a localização desses receptores no córtex
da adrenal e sua especificidade pela ouabaína, sugerem que esses novos sítios
podem estar envolvidos na regulação e/ou secreção da ouabaína endógena.
Assim, os presentes achados sobre a pressão arterial diastólica corroboram a
idéia de que a ação hipertensora da ouabaína parece ser independente da sua
propriedade de inibir a bomba de sódio (Manunta et al., 2001). Além disso, baseado
nos estudos de Ward et al. (2002), os efeitos hipertensores da ouabaína podem ser
mediados por novos sítios de ligação para esse digitálico. Isto explicaria o presente
resultado, sugerindo que a ouabaína atuando por outro sítio de ligação, distinto da
Na+K+ ATPase, pode aumentar a resistência vascular periférica, aumentando assim,
a pressão arterial diastólica.
Os resultados da diferença da AUC da curva concentração resposta à
fenilefrina, na pressão arterial diastólica, mostram uma maior magnitude da
reatividade pressórica após co-tratamento de canrenona e ouabaína. Esse aumento
da reatividade está sendo produzido, provavelmente, por outros efeitos pressores da
ouabaína, independentes da sua ação sobre a Na+K+ATPase. Essa sugestão é
baseada em estudos prévios do nosso laboratório onde foi demonstrado que a
ouabaína, em concentrações fisiológicas, é capaz aumentar a produção local de
angiotensina II, contribuindo assim para o aumento de reatividade pressórica à
fenilefrina observado no leito arterial caudal após infusão aguda de ouabaína
85
(Padilha et al., 2004). Assim, mesmo tendo seu sítio ativo principal bloqueado pela
canrenona, a ouabaína estaria atuando através de outros mecanismos pressores, e
provocando o aumento da reatividade pressórica à fenilefrina na pressão arterial
diastólica. Em relação à pressão arterial sistólica, o co-tratamento com canrenona e
ouabaína não altera a reatividade pressórica à fenilefrina. Provavelmente os efeitos
pressores desse digitálico, independentes da sua ação sobre a Na+K+ATPase, não
foram suficientes para alterar a pressão arterial sistólica, diferente do que aconteceu
na pressão arterial diastólica.
Conforme já descrito acima, estudos do nosso laboratório mostraram que in
vitro, concentrações fisiológicas de ouabaína sensibilizam o músculo liso vascular de
ratos SHR, sendo essa ação mediada pela liberação de angiotensina II local
(Padilha et al., 2004). Baseado nessas evidências, o presente estudo buscou
averiguar se as ações pressoras da ouabaína e seu efeito sobre a reatividade
pressórica à fenilefrina observados, in vivo, podem ser mediados pelo sistema
renina-angiotensina.
86
5.4. Efeito do losartan na pressão arterial e reatividade pressórica à
fenilefrina antes e após tratamento com ouabaína.
Diversos trabalhos têm evidenciado o envolvimento do sistema renina-
angiotensina central nas ações pressoras da ouabaína (Takahashi et al., 1984;
Doursout et al., 1992). Recentemente, o grupo do Professor Leenen tem
demonstrado que as respostas simpatoexcitatórias e pressoras observadas em ratos
tratados cronicamente com ouabaína são mediadas pela estimulação de receptores
AT1 no sistema nervoso central, uma vez que a administração de antagonistas
desses receptores abole o efeito pressor da ouabaína (Huang & Leenen 1996b;
1999; Zhang & Leenen, 2001). Isso indica que a ouabaína ativa especificamente o
sistema renina-angiotensina cerebral (Cheung et al., 2006). Entretanto, trabalhos do
nosso grupo mostraram que a ouabaína, perifericamente, é capaz de estimular a
atividade da ECA endotelial e promover aumento da liberação de angiotenina II,
indicando assim, o envolvimento do sistema renina-angiotensina local nas ações da
ouabaína sobre o músculo liso vascular (Padilha et al., 2004). Os presentes
resultados mostram que o tratamento com losartan aboliu os efeitos pressores
agudos da ouabaína. Isso corrobora os trabalhos acima citados evidenciando a
participação do sistema renina-angiotensina nas ações agudas de concentrações
fisiológicas de ouabaína.
Conforme descrito anteriormente, o aumento da pressão arterial sistólica após
administração de concentrações fisiológicas de ouabaína parece ser dependente da
ação inibitória desse digitálico sobre a bomba de sódio, já que esse efeito foi
bloqueado pela canrenona. Em adição a esses achados, o aumento da pressão
arterial sistólica provocado pela ouabaína também foi abolido após administração de
losartan. Isso indica que além do efeito sobre a bomba de sódio, há a participação
do sistema renina-angiotensina nas ações desse digitálico. Baseado nas
informações de que a ouabaína é capaz de estimular o sistema renina-angiotensina
(Huang & Leenen 1996b; 1999; Padilha et al., 2004), a angiotensina II formada pode
estar estimulando a liberação de catecolaminas dos terminais simpáticos, o que irá
promover aumento da contratilidade cardíaca, aumentando assim a pressão arterial
sistólica (Weir & Dzau, 1999; Paul et al., 2006). Em relação à pressão arterial
diastólica, como a canrenona não bloqueou os efeitos pressores da ouabaína,
sugerimos que esses efeitos são mediados, neste caso, pelo sistema renina-
87
angiotensina, já que o losartan aboliu o aumento da pressão arterial diastólica
provocado pela ouabaína. Assim, a ouabaína estaria estimulando o sistema renina-
angiotensina (Huang & Leenen 1996b; 1999; Padilha et al., 2004), sendo que, a
angiotensina II formada, atuando na musculatura lisa vascular, promove
vasoconstrição e conseqüente aumento da resistência vascular periférica,
aumentando a pressão arterial diastólica (Weir & Dzau, 1999; Paul et al., 2006).
Esse efeito pressor da ouabaína mediado pelo sistema renina-angiotensina e
independente da sua ação sobre a bomba de sódio, poderia estar ocorrendo através
da sua ligação aos seus novos receptores, recentemente descobertos (Ward et al.,
2002). Desse modo, esses dados mostram a importância do sistema renina-
angiotensina nos efeitos pressores agudos de concentrações fisiológicas de
ouabaína, sugerindo então, um mecanismo adicional de atuação deste digitálico.
Os resultados de reatividade pressórica à fenilefrina demonstraram que após
co-tratamento de losartan e ouabaína, ocorreu uma acentuada diminuição da
reatividade pressórica à fenilefrina na pressão arterial sistólica e diastólica, além da
redução da resposta máxima à fenilefrina da pressão arterial sistólica. Isso indica
que, após a retirada da influência do sistema renina-angiotensina, a ouabaína
produziu ações opostas aos protocolos anteriores, ou seja, reduziu significantemente
a reatividade pressórica à fenilefrina. Esses dados sugerem que a ouabaína está
promovendo um efeito adicional de estimular uma via vasodilatadora ou depressora,
ou então, inibir uma via vasoconstritora ou pressora do sistema cardiovascular.
Trabalhos in vitro do nosso grupo, demonstraram que essa concentração de
ouabaína utilizada no presente estudo, promove liberação de angiotensina II no
endotélio do leito vascular caudal de ratos SHR, aumentando assim a sensibilidade
desse leito a agentes vasoconstritores, como a fenilefrina. Por outro lado, essa
mesma concentração de ouabaína é capaz de aumentar a atividade funcional da
Na+K+ATPase (Padilha et al., 2004). A estimulação da bomba de sódio por
concentrações nanomolares de ouabaína também já foi evidenciada por Gao et al.
(2002) em miócitos ventriculares de cobaias. Baseado nessas informações, a
ouabaína, em concentrações fisiológicas, pode estar atuando através da
estimulação da bomba de sódio. Isto explicaria os resultados de reatividade
pressórica encontrados, onde, na ausência do sistema renina-angiotensina, a
ouabaína poderia estimular a Na+K+ATPase, promovendo inotropismo negativo e
88
redução da reatividade pressórica à fenilefrina. Além disso, vale ressaltar também
que a angiotensina II é capaz de estimular a bomba de sódio (Brock et al., 1982;
Garvin, 1991; Yingst et al., 2004). Assim, a angiotensina II liberada pela ação da
ouabaína, poderia, além das suas ações clássicas sobre o sistema cardiovascular,
estimular a bomba de sódio, contribuindo para o efeito inotrópico negativo e redução
da reatividade pressórica à fenilefrina observados.
Uma outra explicação para essa redução acentuada da reatividade pressórica
à fenilefrina após administração de losartan e ouabaína, seria uma possível
estimulação de receptores AT2. Já é conhecido que as ações da angiotensina II são
mediadas via receptores de membrana AT1 e AT2, e que a estimulação desses
receptores produz efeitos distintos (Bumpus et al., 1991; Weir & Dzau, 1999).
Enquanto a estimulação dos receptores AT1 desencadeia ações como
vasoconstrição, ativação de processos inflamatórios e proliferação celular (Weir &
Dzau, 1999; Allen et al., 2000; Touyz & Berry, 2002), a estimulação de AT2 promove
efeitos de vasodilatação e inibição da proliferação celular (Dzau et al., 1993; Weir &
Dzau, 1999; Siragy, 2000). Tendo em vista que a estimulação de receptores AT2
ativa cascatas de sinalização celular via fosfatases enquanto a estimulação de
receptores AT1 ativa kinases, não é surpresa que as ações desses receptores sejam
antagonistas (Weir & Dzau, 1999; Touyz & Berry, 2002; Booz, 2004). Trabalhos
demonstram que o bloqueio de receptores AT1 é acompanhado pelo aumento dos
níveis plasmáticos de angiotensina II. Quando esses receptores são efetivamente
bloqueados, a angiotensina II se liga seletivamente aos receptores AT2,
desencadeando efeitos opostos (Masaki et al., 1998; Carson et al., 2001). Sendo
assim, a estimulação dos receptores AT2 contribui significantemente para os efeitos
hemodinâmicos benéficos dos bloqueadores de receptores AT1 (Cosentino et al.,
2005). Portanto, como a ouabaína pode ativar o sistema renina-angiotensina através
da estimulação da ECA endotelial (Padilha et al., 2004), a angiotensina II formada,
poderia estar atuando via receptores AT2, já que os receptores AT1 estão bloqueados
pelo losartan. Isto antagoniza os efeitos inotrópicos positivos e vasoconstritores da
estimulação de receptores AT1, o que justificaria a redução da reatividade pressórica
à fenilefrina da pressão arterial sistólica e diastólica observada no presente estudo.
Além disso, vale ressaltar também, uma possível ação de outros peptídeos do
sistema renina-angiotensina, como por exemplo, a angiotensina - (1-7). Trabalhos
demonstram que esse peptídeo realiza efeitos opostos aos da angiotensina II no
89
sistema cardiovascular (Santos & Ferreira, 2007), diminuindo a hipertrofia e fibrose
(Tallant et al., 2005; Grobe et al., 2006; 2007), exercendo efeitos antitrombótico
(Kucharewicz et al., 2000), antiangiogênico (Machado et al., 2000) e antiarrítmico
(Ferreira et al., 2001; Santos et al., 2004), além do seu efeito vasodilatador
dependente do endotélio através da estimulação da produção de óxido nítrico,
prostaglandinas e fator de relaxamento dependente do endotélio (Santos et al.,
2005; Ferreira & Santos, 2005; Ferrario, 2006; Santos & Ferreira, 2007; Sampaio et
al., 2007). Esses efeitos podem ser resultantes da interação da angiotensina – (1-7)
com seu próprio receptor, denominado Mas, ou também através da interação
indireta desse peptídeo com os receptores AT1 e AT2 via receptor Mas (Santos et al.,
2000; Ferreira & Santos, 2005; Santos & Ferreira, 2007). Assim, a ativação do
sistema renina-angiotensina pela ouabaína, poderia resultar em formação de
angiotensina – (1-7), via ECA-2, o que também poderia justificar a redução da
reatividade pressórica à fenilefrina observada nesse estudo.
90
CONCLUSÃO
91
6. CONCLUSÃO
- O tratamento agudo com pequenas concentrações de ouabaína foi capaz de
aumentar a pressão arterial de animais espontaneamente hipertensos anestesiados.
- Os efeitos pressores da ouabaína sobre a pressão arterial sistólica basal são
dependentes da inibição da Na+K+ATPase, bem como, do sistema renina-
angiotensina. Já os efeitos sobre a pressão arterial diastólica são dependentes
apenas, do sistema renina-angiotensina.
- Apesar da ouabaína não ter alterado a reatividade pressórica à fenilefrina,
após as intervenções farmacológicas realizadas, observou-se que esse digitálico
pode estar ativando mecanismos pressores e depressores que, em conjunto, se
anulam e assim, não alteram a reatividade pressórica à fenilefrina. Possivelmente,
esses mecanismos envolvem a participação do sistema nervoso central, da
Na+K+ATPase e do sistema renina-angiotensina.
Em conclusão, os resultados obtidos no presente estudo demonstram que
pequenas concentrações de ouabaína, em ratos hipertensos, promovem efeitos
pressores através de sua ação sobre a bomba de sódio, mas também, através do
sistema renina-angiotensina, sugerindo assim, um mecanismo de ação adicional
desse digitálico para o desenvolvimento e/ou manutenção da hipertensão.
92
REFERÊNCIAS
93
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