Ana Carolina ZakirDjanira Rodrigues Negrão

João Paulo Apolari 

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOCENA – CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA

AGRICULTURA

Ecologia Experimental de Micro-organismosResponsável: Pr0fª Drª Siu Mui Tsai

Introdução

A estrutura e a atividade das comunidades microbianas do solo

podem ser influenciadas por diversos fatores como:

Composição e características físico-químicas;

Formas de manejo e tipo de cultura empregada;

Condições climáticas, geografia;

Contaminações de natureza diversa: herbicidas, fungicidas,

fertilizantes, metais pesados, poluentes orgânicos, etc;

Introdução

Introdução

A microbiota do solo apresenta elevada diversidade genética e

funcional, que pode ser caracterizada com base em estudos que

empregam paralelamente:

Dependentes de cultivo

Independentes de cultivo

Introdução

Técnicas independentes de cultivo:

T-RFLP;

Construção de biblioteca do gene 16S rRNA;

Clonagem e sequenciamento de genes, como o nifH;

Análise filogenética;

q-PCR.

RT-RFLP.

Estudo de caso 1Estudo de caso 1

Objetivos

Análise da biodiversidade microbiana do solo da rizosfera

de cana-de-açúcar com adubação de fertilizante nitrogenado.

Cana-de-açúcar: RB72454

Tratamentos: com e sem adubação.

Controle: mesmo local, ano anterior com adubação.

Dois diferentes regimes de fertilização:

Sem fertilizante nitrogenado.

120 kg/ha de fertilizante nitrogenado.

O controle utilizado foi uma amostra do solo de rizosfera de cana-

de-açúcar crescida no mesmo local no ano anterior, que também

recebeu adubação nitrogenada.  

O solo aderido às raízes foi coletado por agitação manual em tubos

e imediatamente armazenado a -70 °C para análise.

Um total de 1 g de solo de cada amostra foi utilizado para a

extração de ácido nucleico.

O kit UltraClean soil DNA isolation

(Mobio Laboratories, inc., USA).

O gene 16S rRNA foi amplificado por PCR.

Os primers: 27F (5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’) e 1492r

(5’GGYTACCTTGTTACGACTT3’) foram usados para amplificar

fragmentos de aproximadamente 1500 pb.

Amplificação 16S rRNA

Clonagem PCR2.1-TOPO (Invitrogen, USA)

Seleção de 12 clones por placa (96 poços)

Digestão EcoRI

Sequenciamento dos fragmentos

Construção de biblioteca de 16S rRNA e sequenciamento

Sequências e análise de diversidade

Remoção das sequências de baixa qualidade (Phred base caller)

Taxonomia (Ribossomal

Database Project)

Alinhamento de sequências

(Mothur v.1.9.0)

MEGA-BLAST(Busca de Sequências depositadas no NCBI)

Depósito de Sequência no banco de dados (≥ 50 pb)

(GenBank database)

RESULTADOSRESULTADOS

Construção de biblioteca de 16S rRNA e sequenciamento

Foram obtidas um total de 541 sequências com mais de 50 pb390 (72,1 %) dessas sequências tiveram mais de 250 pb

• S0N*= solo de rizosfera de plantas com 12 meses (1 ano antes)

• S13N*= solo de rizosfera de plantas com 13 meses (1 ano depois)

• S13n= solo de rizosfera de plantas com 13 meses (1 ano depois)

86 % das sequências

poderiam ser atribuídas

em 15 filos.

127 (23,6 %) foram

atribuídas a nível de

gênero com confiança

média de 95,5% nas 3

bibliotecas.

Distribuição taxonômica dos clones das biblioteca de 16S rRNA

vc

vc

vc

vc

Para investigar a

classificação destes

clones, as sequências

foram recuperadas e

submetidas a uma

pesquisa MEGA-BLAST

na base de dados NCBI.

Identidades elevadas (98 a

100%) com bactérias não

cultivadas e / ou Bacillus

isolados a partir de solo

agrícola contaminado.

Riqueza de comunidade pelo índice de Chao:

1º - S13N (298), 2º - S0N (220), 3º - S13n (217)

Diversidade das bibliotecas pelo índice de Shannon:

1º - S13N (4,25), 2º - S0N (4,19), 3º - S13n (4,09).

No entanto, as três amostras apresentaram riqueza e diversidade semelhante,

sem diferença significativa no intervalo de confiança de 95%.

CONCLUSÃOCONCLUSÃO

Esperava-se que nas amostras S0N e S13N que receberam

adubação nitrogenada as populações bacterianas compartilhariam

grupos comuns. O que de fato não aconteceu, sugerindo que a

adubação nitrogenada pode não ser o principal fator que influencia a

biodiversidade do solo.

CONCLUSÃOCONCLUSÃO

O número de sequências de Verrucomicrobia recuperados à partir

de ambas amostras com fertilizantes foram significativamente

menores em relação às amostras sem fertilizantes (S13n),

sugerindo que este grupo pode ser um indicador de solos ricos em

nitrogênio.

Estudo de caso 2Estudo de caso 2

OBJETIVOSOBJETIVOS

Estudar a diversidade e abundância de bactérias

fixadoras de N2, através do gene nifH, em resíduos de

mina de cobre.

Explorar o papel determinante na distribuição das

comunidades diazotróficas na sucessão primária.

Local dos resíduos de cobre em

Yangshanchong

Mais importante fonte de cobre na China.

Precipitação anual: 1300 mm.

Temperatura média anual: 16 ºC.

Operações durante 30 anos, abandonada em 1990.

Área aproximada de 20 ha.

Monitoramento da área durante sete anos.

1. Resíduos sem cobertura.

2. Agregados biológicos de algas.

3. Agregados biológicos de algas e musgo.

4. Agregados biológicos de musgo.

5. Comunidade de plantas vasculares.

6. Sítio de referência – local distante dos resíduos.

Coleta: 0 – 10 cm, com sonda (3 cm x 20 cm).

Três replicatas (compostas de 5 sondas cada).

Mantidas sob refrigeração.

Homogeneizadas e peneiradas (2 mm).

Para as análises moleculares: - 40ºC.

pH.

Condutividade elétrica.

NO3- e NO4

-

Carbono orgânico total (TOC-VCPH).

Nitrogênio total (Kjeltec TM 2300).

Concentrações de Cu e Zn (Page et al., 1982).

Metais pesados (IVP-OES; OPTIMA 2100).

Lipídios totais: 5 g de solo.

Frações polares de ácidos graxos de fosfolipídios: separadas,

quantificadas, identificadas por cromatografia gasosa.

Análise da biomassa microbiana

Atividade da nitrogenase

Realizada in situ.

Valores médios obtidos foram convertidos em input de

fixação biológica de N2.

ANÁLISESANÁLISES

DNA total da comunidade microbiana: 0,5 g de solo/amostra.

Amplificação da região do gene nifH (365 pb) com os primers:

PolF e PolR (Poly et al., 2001).

Primer PolF foi rotulado em 5’ com FAM (6-carboxifluoresceina).

Extração do DNA Extração do DNA Análises de T-RFLPAnálises de T-RFLPTriplicata de PCR

por amostra

Os tamanhos dos fragmentos e a

intensidade de fluorescência foram

analisados pelo software GENESCAN.

Perfil de RFLP

Purificação

Digestão: 37 ºC/6 h Enzima HaeIII.

EletroforeseABI 3730xl

A abundância relativa dos fragmentos de restrição terminal

individual (T-RFs) foi calculada pela % do perfil da altura dos

picos.

Apenas os T-RFs com abundância relativa > 1% foram analisados.

As bibliotecas de clones foram construídas das amostras:

Resíduos SC, alga+musgo, musgo, sítio de referência.

Os fragmentos de nifH foram amplificados (igual à extração), com

primers sem fluoróforos.

Purificação das triplicatas de PCR.

Clonagem de nifH, com o kit TOPO TA.

Clonagem do gene Clonagem do gene nifHnifH

Os clones representantes de cada padrão único de RFLP foram sequenciados (ABI 3730xl)

Comparação manual do resultado do perfil de RFLP

Amplificação das inserções dos clones de nifH recombinantes

Digestão enzimática dos clones com endonucleases HhaI e HaeIII

Determinação em eletroforese (gel de agarose, 2%)

As UTOs foram definidas com pelo menos 95 % de sequências de nucleotídeos similares (sotware DOTUR)

Comparação das sequências de nifH no GenBank, BLAST.

Tradução das sequências em aminoácidos (MEGA 3.1).

Construção da árvore filogenética, usando distâncias de correção

Poisson.

A abundância do gene nifH foi quantificada.

Primers idênticos ao RFLP.

Reações padrão (LightCycler 480).

Confirmação em gel de agarose.

Controles negativos sem DNA.

Análises estatísticas: correlação entre densidade de nifH e

propriedades físico-químicas do solo.

As sequências nifH foram depositadas:

EMBL/GenBank/DDBJ

Número de acesso: FN985167-FN985220.

RESULTADOSRESULTADOS

Total de T-RFs em todos os perfis: 45 (3 comuns, 9 únicas), média = 13.

Diversidade de nifH indicado pelos três índices calculados: não mostrou

grande significância (+/-) nos locais com resíduos.

Índices de Diversidade das Comunidades Diazotróficas

Riqueza e Diversidade das sequências de nifH

* Análises comparativas de

sequências de 204 clones nifH

das 4 bibliotecas revelaram

54 filotipos únicos.

* A maioria distribuída em

Proteobacteria, Cyanobacteria

e Firmicutes.

* 44% das UTOs foram

relacionados à bactérias

desconhecidas, representando

novos filotipos.

Sequências de nifH filiadas a

Cyanobacteria foram detectadas

somente nos solos com ABio,

constituindo 23-39% das

bibliotecas de clones.

A abundância relativa de

nifH pode ser correlacionada

com o progresso da sucessão

microbiana e da atividade da

nitrogenase.

5.06

x 1

05

ResultadosResultados

Houve correlação positiva entre TOC, TN, NO3- com o número de

cópias de nifH.

A relação C/N teve correlação negativa com a abundância de nifH.

O pH e os metais pesados mostraram efeitos negativos sobre a

abundância de nifH.

CONCLUSÕESCONCLUSÕES

Análises de T-RFLP revelaram diversidade crescente:

resíduos nus agregados biológicos

Nenhuma UTO encontrada foi comum para todas as amostras,

indicando que o progresso da sucessão pode abrir novos nichos.

A sucessão da colonização nos resíduos de minas de cobre

geralmente é acompanhada por mudanças nas suas características

físico-químicas.

CONCLUSÕESCONCLUSÕES

A natureza heterogênea dos resíduos pode ser afetada pela idade e

presença de plantas pioneiras.

Variações nas condições ambientais podem influenciar a

diversidade e abundância de microrganismos indígenas, inclusive

os envolvidos no Ciclo do nitrogênio.

Esses fatores podem afetar positivamente a sucessão primária de

comunidades diazotróficas em locais altamente perturbados.

Estudo de caso 3Estudo de caso 3

ObjetivosObjetivos

Identificar relações importantes entre a comunidade bacteriana do

solo e seu meio ambiente.

Comparar a dinâmica da estrutura da comunidade bacteriana e da

atividade ao longo três épocas diferentes em dois locais

geograficamente distintos, alpes sem vegetação e local de geleira.

Destacar mudanças nos parâmetros climáticos, concentrações

nutricionais, e as respostas da comunidade bacterianas (estrutura e

atividade), que podem ocorrer durante sucessão sazonal.

Local da coleta

Solo coletado em duas áreas geologicamente, química e biologicamente diferentes: duas geleiras alpinas, Suíça.

Damma Tsanfleuron

Invernonão coletou

CLIMAPhttp://meteoswiss.ch

10 subamostrasde 0 - 5cm

Peneiradas (2 mm)coletados em sacos

plásticos

Alíquotas de 2 ml (tubos eppendorf)em gelo seco

Alíquotas foram armazenadas a -20°C para extração de DNA, e a -80°C para extração de RNA.

AMOSTRAGEM

Coletas emmaio – out/2008

Três estações:primavera (I), verão (II) e outono

(III)

- Umidade: secagem em estufa por 3 dias, 60 °C.

- Nutrientes: cromatógrafo de íons (IC DIONEX 2300).

- NH4+ e PO4

3-: colorimetricamente (Mulvaney, 1996).

- pH: através de CaCl2 (Mettler Toledo XMP225).

- DOC: analisado por Shimadzu SSI TOC-5000.

- TC e TN: determinados por combustão (Leco 932CHNS).

FDA (Fluorescein diacetate assay, Rosswall, 1982).

Atividades potenciais de enzimas por meio do ensaio de MUB

(Classen et al., 2006) com modificações:

Fosfatase alcalina.

Quitinase (N-acetil-glucosaminidase).

Sulfatase.

β-glucosidase.

Número de células: Coloração DAPI (Bennett et al., 2006).

Concentração de DNA: utilizada como substituto para biomassa

microbiana (Marstorp e Witter, 1999).

Extração do DNA: por kit Zymo microbial DNA.

Quantificação do DNA: de acordo com Sandaa et al. (1998),

através de curvas de valores de fluorescência (0 a 100 ng µl-1).

T-RFLPExtração do DNAPCR com primers marcadosSequenciamento

RT-T-RFLPExtração RNASíntese de cDNATranscrição reversa: SSII transcriptase reversa, com iniciador UNI-b-rev (Bundt et al., 2001).PCRSequenciamento

Três bibliotecas: um ponto por estação

Purificação de cDNA Qiagen PCR Purification

Reação pGEM T-Easy vector

Eletroforese

Sequenciamento

Biblioteca de clones de cDNA e sequenciamento

Transformação em células JM109 (Promega)

Purificação das reações positivas ( Qiagen 96)

Definição dos filotipos

GenBank

Número de acesso: HM623710-HM623763

ResultadosResultados

Grupo mais abundante: α-Proteobacteria.

Gêneros Methylobacterium sp. (AB252210) e Methylobacterium

aquaticum (AB252197), com sequências > 97 %.

Actinobacteria: 39,2 % - outono de Damma.

Actinobacteria: 39,1 % - verão de Tsanfleuron.

Corynebacterium tuscaniensis (AY677186) foi o mais comum

filotipo de Actinobacterium encontrado.

Firmicutes: frequente em ambos os locais (> 28 % do verão

Damma, do outono Tsanfleuron).

Gênero Paenibacillus (amostras Damma).

Gêneros Bacillus e Paenibacillus (amostras Tsanfleuron).

Interessantemente, as bibliotecas de clones da primavera

apresentou uma variedade maior de filotipos em comparação

com estações seguintes:

Primavera Damma biblioteca, Rhodospirillales (e.g. DQ094180)

estavam entre os mais abundantes filotipos de α-Proteobacteria

detectados.

Poucos estudos são realizados considerando-se as relações

entre variações físico-químicas do solo e das comunidades

bacterianas em ambientes áridos/estéreis.

A estrutura das comunidades bacterianas no verão

apareceram relacionadas principalmente às variáveis

climáticas.

Comunidades de amostras nas estações da primavera e do

outono foram relacionadas à variações na composição de

nutrientes.

α-Proteobacteria foi a linhagem dominante ao longo de

todo o período de amostragem, sugerindo que populações

bacterianas viáveis em ambientes extremos são geralmente

capazes de sustentar fortes oscilações ambientais.

Obrigado!!!