Post on 15-Dec-2015
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Controle Microbiológico Controle Microbiológico de Produtos não de Produtos não
estéreisestéreis
“Produtos não estéreis são aqueles nos quais se admite conceitualmente a presença de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as características de sua utilização”.
Cosméticos, produtos farmacêuticos tópicos e orais
Contato com áreas portadoras de flora microbiana natural!!!
Atenção no CQ destes produtos deve assegurar que a carga microbiana presente (quali e quantitativo) não comprometa a sua qualidade final ou mesmo a segurança do paciente.
Altas cargas microbianas presentes no produto farmacêutico não estéril podem comprometer:
A segurança do paciente e/ou usuário que não esteja saudável, dependendo ainda das características de utilização de cada produto.
A estabilidade do mesmo, interferindo diretamente na sua qualidade intrínseca.
A qualidade microbiológica de um produto não estéril é proporcionada pela adoção e respeito às Boas Práticas de Fabricação, sendo necessário e complementar às BPF a adição de conservantes.
CQ tem como objetivo imediato – comprovar a ausência de microorganismos patogênicos e determinar o número de microorganismos viáveis, em função dos tipos de utilização do produto.
Risco ao consumidor: Risco ao consumidor:
Saprófitas – agentes infectantes oportunistas (deterioração de produtos) – TOLERA-SE CARGA MICROBIANA!!! Patogênicos (Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus) – risco de quadro clínico infeccioso – PROIBITIVO A PRESENÇA!!!
Ex. consumidor ser debilitado ou imunodeprimido; Cosméticos em pele sensível – bebê.
Cuidados quanto ao limite microbiano!!!
Estabilidade do produto: Estabilidade do produto:
Perda da eficácia terapêutica Perda da eficácia terapêutica – por degradação do PA:ou por alteração de parâmetro físico fundamental para sua atividade – ex. pH, ou alteração de propriedades físico-químicas – entre elas: produção de gases – odor desagradável, ação enzimática levando a degradação de tensoativos – quebra da emulsão ou alteração na viscosidade.
PREOCUPAÇÃO COM AS POSSÍVEIS FONTES DE CONTAMINAÇÃOPREOCUPAÇÃO COM AS POSSÍVEIS FONTES DE CONTAMINAÇÃO:
- DIRETAS: Fluidos gasosos, água e demais matérias-primas (principalmente origem natural).
- INDIRETAS: procedimentos de limpezas, instalações inadequadas, pessoal não paramentado, processos não validados...
Lembrar que a carga microbiana (CM) pode ser alterada durante o processo de fabricação ou mesmo durante o tempo de prateleira do produto, por diversos fatores:
Fórmula:Fórmula: presença de proteínas e carboidratos (cosméticos) se a concentração não for hiperosmótica – favorece a elevação de CM. em contrapartida, presença de etanol, sorbitol, sacarose, propilenoglicol tendem a favorecer CM mais baixas, nas concentrações normalmente utilizadas em líquidos. Conservantes: usados com critério – podem interagir com componentes da fórmula e ter sua atividade reduzida.
pH: pH: microorganismos crescem em pH neutro, com efeitos inibitórios em faixas extremas (ácidas ou alcalinas).
Atividade da água: Atividade da água: fundamental para sobrevivência de microorganismos. Portanto os produtos em água dependem de incorporação de conservantes. Recorrer quando possível às fórmulas extemporâneas!!!
Processo:Processo: altas temperaturas reduzem CM, já temperaturas próximas a 40ºC tem efeito oposto. Água de condensação nas paredes de reatores, ou mesmo vapor de água na tampa de frascos durante o resfriamento podem ocasionar a proliferação de microorganismos
Padrões Microbianos
As primeiras inclusões de limites microbianos aplicados a produtos farmacêuticos e seus insumos ocorreram de forma vaga, como a recomendação de “ausência de emboloramento”;
11ª e 12ª edições da USP:1936 e 1942, respectivamente;
No formulário Nacional de 1970 e na 18ª Edição da Farmacopéia, do mesmo ano, a expressão foi modificada para:
Padrões Microbianos
“Drogas vegetais e animais deverão estar, o máximo possível, isentas de microrganismos, sendo que os patogênicos não deverão estar presentes”;
Padrões Microbianos
Apesar do reconhecimento, há muitos anos, da importância do controle microbiano de produtos não estéreis, a implantação e aceitação dos padrões sanitários tem ocorrido lentamente;
Produtos cosméticos
Métodos de análises:Métodos de análises:
- Amostragem (coleta, transporte e preparação da amostra).
- Determinação numérica ou contagem de formas viáveis.
- Isolamento e identificação dos microorganismos indesejáveis para serem pesquisados.
Medicamentos não estéreis e cosméticos!!!
AmostragemAmostragem
A amostragem a ser efetuada para investigação quanto aos atendimentos aos padrões microbianos deve ser representativa.
-Barricas ou sacos de matéria-prima (pó) não estéril: coletar amostras na região inferior, mediana e superior na quantidade de √n + 1. Efetuar assepsia na área próxima à coleta de amostras, vedar em recipiente hermético a amostra.
- Em processos contínuos, a segmentação do processo deve estar contemplada na amostragem.
- Produto acabado – duplicata de amostra representando início, meio e fim do processo de enchimento e que após fechado a embalagem não existirá a introdução de contaminantes.
Coleta e Transporte das amostrasColeta e Transporte das amostras
- Fazer as amostragens em local limpo;
- Operador treinado;
- Recipientes, dispositivos auxiliares (espátulas, pipetas) estéreis;
- Temperatura adequada para trasnporte.
Preparação da amostraPreparação da amostra
- Verificar a presença de conservantes na fórmula.
- Os conservantes devem ser inativados – substâncias adequadas de acordo com natureza química.Ex. Sais de amônio quaternário 3% de polissorbato + 0,3% de lecitina.
-Ajuste do pH do produto diluído para a faixa de neutralidade.
- Homogeneização.
- Tratamento da amostra para permitir contato íntimo daamostra com o meio diluente.
- Produtos oleosos – adição de agente tensoativo.
Durante o preparo de amostras de produtos não estéreis para a contagem de microrganismos viáveis não patogênicos, é necessário o contato dessas amostras com diluentes biocompatíveis com as células microbianas.
Alguns possíveis diluentes:
- solução de NaCl à 0,9% estéril.- solução de NaCl à 0,9% e peptonada a 0,1% estéril.- solução tampão pH 7,0 estéril.- caldo lactosado estéril.
Exemplo de preparo de amostra para análise microbiológico de um cosmético em diluição decimal seriada:
A diluição 1:10 de uma amostra de cosmético pode ser obtida homogeneizando:
1 g de cosmético + 9 mL de diluente, ou10 g de cosmético + 90 mL de diluente, ou20 g de cosmético + 180 mL de diluente, ou25 g de cosmético + 225 mL de diluente, e assim por diante.
Em todos os exemplos acima, a amostra resultante é diluída a 1:10 (10-1), e consequentemente, em cada mL da diluição teremos uma quantidade de amostra correspondente a um décimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.
Métodos de Contagem de MicrorganismosMétodos de Contagem de Microrganismos
Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)
- Análise quantitativa.
- Alíquota de 1 a 2 mL da diluição da amostra para réplicas (triplicata) de placas de Petri estéreis.
- Meio de cultura não seletivo líquido, estéril, fundido e resfriado a temperatura (45-48°C), cerca de 20 mL é vertido sobre a placa contendo a amostra e homogeneização com movimento em 8 ou S.
- Incubação na posição invertida após solidificação.
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Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate)
Pour Plate:
Segue-se incubação das placas, em estufa, na posição invertida;
Após 2 a 5 dias de incubação a 30 – 35°C, para bactérias e 5 a 7 dias para bolores e leveduras, a 20 – 25°C, as colônias são contadas;
Pour Plate:
Para contagem total de bactérias os meios oficialmente recomendados são principalmente ágar caseína-soja e ágar nutriente;
Para fungos, ágar Sabouraud-dextrose e ágar batata;
- Análise quantitativa.
- Meio de cultura não seletivo ou seletivo sólido, líquido ou semi-sólido preparado e distribuído previamente em placas de Petri ou tubos.
- As diluições são distribuídas por pipetas estéreis, com volumes de 0,1 a 0,5 mL na superfície do gel já solidificado, e espalha com movimentos cuidadosos com bastão de vidro em L ou alça de Drigalski.
-Incubar as placas invertidas.
- Esta metodologia não se aplica a amostras com cargamicrobiana inferior a 2 UFC/g (mL).
Semeadura da amostra em superfícieSemeadura da amostra em superfície
Semeadura da amostra em superfícieSemeadura da amostra em superfície
Meio líquido
Meio semi-sólido
Meio sólido inclinado
Meio sólido placa de Petri
Membrana FiltranteMembrana Filtrante
- Análise quantitativa.
- Alíquotas do produto ou suas diluições – filtradas em membranas apropriadas. - Membranas de 0,45μm ou 0,20 μm de poro e 47 mm de diâmetro.
- Coloca-se a membrana sobre placa contendo meio de cultura solidificado.
- Permite amostragem de volumes elevados.
Membrana FiltranteMembrana Filtrante
Stericup Unidade filtrante STERICUP com membrana express 0,22mm e PVDF 0,45 um, funil e frasco coletor.
Sterifil aseptic Suporte de
filtração a vácuo Sterifil em
polissulfona, composto de funil,
base e copo coletor.
Trasnferir a membrana para placa de Petri e incubar
INCUBAÇÃO DAS AMOSTRASINCUBAÇÃO DAS AMOSTRAS
- Colocar placas em estufa a 30-35° C por 2 a 5 dias na posição invertida, ou estante com tubos, paraverificar a presença de bactérias.
- Colocar placas em estufa a 20-25° C por 5 a 7 dias na posição invertida, ou estante com tubos, paraverificar a presença de fungos e leveduras.
- Contagem: à vista desarmada ou com auxílio de contadores.Transcorrido o tempo de incubação, considerar a contagem, somente das placas da mesma diluição que apresentarem de 30-300 colônias. Multiplica-se a média das mesmas pelorespectivo fator de diluição e se expressa o resultado em UFC/g de amostra.
Número Mais Provável (NMP)Número Mais Provável (NMP)
- Análise estimativa fundamentada em probabilidade.
- Indica o valor dentro de uma faixa que reflete o número de organismos presentes.
- Embora apresentando imprecisão maior – é oficilamente recomendado.
- Melhor revitalização de microrganismos estressados –perfeito contato com o meio de cultura.
-Recomendado para amostras pouco solúveis e translúcidas.
- Permite amostras com níveis elevados de concentração, mas éindicado para quando se espera valores baixos de contagem- caldo de dupla concentração
Número Mais Provável (NMP)Número Mais Provável (NMP)
- Emprega meios líquidos – diluições seriadas das amostras inoculadas nos mesmos.
- Uso de tabelas estatísticas.
- Número de réplicas de cada diluição pode variar - o mais comum : 3 ou 5 réplicas.
-As tabelas oferecem o número mais provável de microrganismos por mL ou g e os limites inferior e superior (limite de confiança de 95%)
- Leitura e obtenção dos resultados se dá por comparação com padrão de turvação de meios de cultura não seletivos.
Para a escolha da tabela na qual se verificará o NMP correspondente à combinação de tubos positivos, atentar para a quantidade (g ou mL) de amostra que foi realmente inoculada em cada tubo das diferentes séries e não o volume inoculado.
Inoculação de
1,0 mL da diluição 10-1 na 1ª série 0,1 g ou mL1,0 mL da diluição 10-2 na 2ª série 0,01 g ou mL1,0 mL da diluição 10-3 na 3ª série 0,001 g ou mL
Quantidade de amostra inoculada em cada série
Quando inoculamos mais de 3 diluições seriadas, selecionar a maior diluição na qual todos os tubos inoculados são positivos e considerar as 2 diluições seguintes maiores que a selecionada.
Exemplo 1: Amostra de medicamento líquido que foi inoculada nas diluições abaixo e apresentaram os seguintes resultados:
10-2 3 tubos positivos10-3 2 tubos positivos10-4 0 tubos positivos
O valor de NMP a ser lido na tabela correspondente seria 3/2/0, que corresponde ao valor 93 NMP/g ou mL. Como, neste caso a amostra estava diluída a 10-2, o resultado obtido na tabela deve ser multiplicado por 100 para a obtenção do valor do NMP real por grama ou mL do alimento em análise. Assim, o resultado final será: 9300 NMP/g ou mL.
Pesquisa de patogênicos específicos
Os microrganismos a serem pesquisados devido à sua presença indesejável nas formulações são:
Pseudomonas aeruginosa: formulações tópicas (próximas aos olhos)
Staphylococcus aureus: formulações tópicas em geral.
Escherichia coli: preparações orais.
Salmonela sp.: preparações orais.