Post on 20-Nov-2018
Assimilação de nitrogênio:N2, NO3
- e NH4+
Objetivos:
• Identificação das formas de N que efetivamente entram no sistema vegetal.
• Reconhecimento das enzimas chaves dos processos de fixação e assimilação de N nas plantas.
• Formas de mobilização de N entre os tecidos.
• Mecanismos de controle do processo.
N2
NO2-NO3
-
NH3/NH4+
KEGG PATHWAY DatabaseKEGG PATHWAY Databasehttp://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.htmlhttp://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html
NO2-
nitriteNO3
-nitrate
N2
NO2-
nitriteNO3
-nitrate
NH3/NH4+
KEGG PATHWAY DatabaseKEGG PATHWAY Databasehttp://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.htmlhttp://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html
Anabaena
Shinorhizobium
Arabidopsis
Oryza
Demaisorganismos?
Bacteria Planta
Formas de entrada no metabolismo de plantas
N2
NH3/NH4+
NO2-
nitriteNO3
-nitrate
Formas de entrada no metabolismo de animais
Homo sapiens
trigo
trigo
trigo
gramado
phere
Crust
Nitrogênio; formas e estados de oxidaçãoÚTEIS?????
+5Ácido nítrico, íon nitratoHNO3, NO3-
+4Dióxido de nitrogênioNO2
+3Ácido nitroso, íon nitritoHNO2, NO2-
+2Óxido nítricoNO
+1Óxido nitrosoN2O0Nitrogênio molecularN2
-1HidroxilaminaNH2OH
-2HidrazinaN2H4
-3Ammonia, ion amônioNH3, NH4+
Nível de Oxidação
NomeEspécies
Tamanho dos reservatórios globais de NitrogênioÚTEIS?????
95.61.6 x 1017Mantle and Core 0.21-2.4 0.35 - 4.0 x 1015Solos e Sedimentos 0.78-8.4 0.13 - 1.4 x 1016Crosta
97.71.636 x 1017Geosfera2.33.86 x 1015Atmosfera 0.0142.3 x 1013Hidrosfera 0.00022.8 x 1011Biosfera
% do TotalMetric TonsReservatório/Tipo de
Ciclo do nitrogênio
nitrificação
nitrificação
8%
90% fixaçãobiológica:LIVRES E SIMBIONTES
2% reações fotoquímicas%: fixação natural
Interaçõesessenciais…
Azolla : Anabaena (ciano)
Patógenos Simbiontes vs nutrição
videira : Xylella
feijão : Rhizobium
soja : Bradirhizobium
raíz : micorriza
tomate : nemátodo
tomate : Cladosporium
tomate : Pseudomonas
FIXAÇÂOBIOLÓGICA DE NITROGÊNIO!
Azolla : Anabaena (ciano)
-bact + bact
Gunnera : Nostoc
cana : Acetobacter
Anabaena(arroz)Anaerobiose
NostocAnaerobiose
soja : BradirhizobiumAnaerobiose
Organismos fixadores de N2
• Fixadores de vida livre – Eubacteria
(cianobactérias)– Archaebacteria
• Fixadores em associação com plantas (ou livre)– cooperação metabólica
• N e C
– Eubacteria • cianobactérias• alfa-proteobactérias dos
grupos Rhizobiales e Rhodospirillales
Distribuição filogenética das bactériasfixadoras de N2 (Buchanan, 2000).
Fixadores em associação com plantas
Azolla : Anabaena Glicine : Bradyrhizobium
Simbiose extracelular Simbiose intracelular
Nódulos em Sesbania
Glicine : Bradyrhizobium
Nosso objeto de estudo
Simbiose intracelularRhizobium
Ciclo do Nitrogênio
[N2 + 16 ATP + 8e- + 8H+→2NH3 + 16 ADP + 16 Pi + H2]NITROGENASE
Ex: moléculas com N em plantas
nitrificaçãodesnitrificação
Fixação do N2 atmosférico
• O N disponível para plantas > 90% provém da fixação biológica > ~80% gerado por associações simbióticas.
• A forma atmosférica N≡N não está disponível para a maioria dos organismos.
• Quebra da tripla ligação envolve alto gasto energético. [16 ATP ]
• Atividade da nitrogenase é inibida pela presença de oxigênio.
• Evolução de processos simbióticos (interação eucarioto-procarioto).
N≡N
• Fertilização química• Processo de Haber-Bosch
– 1913, os trabalhos de Fritz Haber e Carl Bosch na Alemanha permitiram a síntese química de amônia (NH3).
– Produção anual de 80x1012g/ano
- quebra da tripla ligação
Fixação industrial
N≡N
Um grupo singular... Alpha-proteobacteria
Mesorhizobium
Sinorhizobium
Rhizobium
Árvore filogenética dasalfa-proteobactériasestimada pela comparaçãoda seqüência do 16S RNA
patógenos
RhizobiumSinorhizobiumMesorhizobiumBradyrhizobium
Bradyrhizobium
Associaçãosimbióticaformadorade nódulos
Simbiose intracelular:formação de nódulos
• Como se inicia o processo?• Que respostas são
produzidas nas plantas?• Quais são os genes
envolvidos?• Onde estão os genes de
fixação de nitrogênio?• Quais são os sinalizadores?
Nódulo > Medicago : Sinorhizobium
Como se inicia o processo?1. Raízes liberam substâncias: flavonóides, betaína que são reconhecidos pelo produto do gene NodD na bactériaque induz a expressão dosgenes Nod que irão sintetizar fatores Nod.
2. Bactérias liberam os“fatores” Nod: oligossacarídeos de lipoquitina(particularidades entre diferentes interações)
3. As raízes receptam os fatores Nod, com lectinas e apresentam alteraçãono fluxo iônico, expressam asnodulinas, são infectadas, e seguemo programa para a morfogênesedo nódulo.
Fatores Nod
1
2enzimas
3 Receptor?
oligossacarídeos de lipoquitina
Flutuações de Cálcio nos pelos radicularesquando expostos aos Fatores Nod.
Alterações provavelmente devidasa influência sobre
os canais ou bombas de Ca2+...
...inicia-se a curvatura do pêlo radicular.?
simbiossomo
Nódulo meristemático (crescimentoindeterminado)•região meristemática (1)•região madura, bacteriódes (4)•região de senescência (5)•barreira para oxigênio
Nódulo cilíndrico (crescimentodeterminado)•região madura, bacteriódes (cinza)•região de senescência (preto)•barreira para oxigênio
Que respostas são induzidas na planta? Expressão de nodulinas.
Tecidos afetados pela formação do nódulo:
epiderme, cortex e periciclo Fatores Nod•ativação gênica na planta (nodulinas)•indução de divisão celular
•(18-30 hrs)
Local de formaçãodo nódulo (regiãocortical na frente
dos polosxilemáticos
Quais são os genes envolvidos?
Na planta:
Nodulinas•precoces• ENOD11• ENOD12•ENOD40•genes dim •genes sym
•tardias• leghemoglobina (Lb)•Transportadores do simbiossomo
Fator Nod induz a curvaturaNodulinas auxiliam a invasão
Nódulo ativo• Simbiossomos• Leghemoglobina• Citocromo oxidase de alta afinidade: gerador
do ATP necessário para fixação.• Células “vazias” formam barreira para o
oxigênio.
• Respiração bacteriana usa O2, e o ATP produzido é utilizado na fixação de N2 (citocromo oxidase de alta afinidade).
• A nitrogenase sempre está funcionando emcondições subótimas.
• Se ↑ O2, aumenta a respiração, e consequentemente o ATP, a fixação tambémpode aumentar (consome o ATP) .
• Se ↑ ↑ ↑ O2, a inativação da nitrogenase fazaumentar muito o ATP, a respiração é inibida, menos O2 e consumido e a nitrogenase é maisinibida…..colapso do metabolismo.
Quais são os genesenvolvidos?
Na bactéria:Expressão precoce•Genes nod, nol, noe(síntese e secreção de fatoresnod)•especificidade hospeiro
Expressão tardia•Genes nif(nitrogenase)•Genes fix(regulatórios)
Complexo enzimático da nitrogenase(Heterohexámero)
Polipeptídeo MoFe 4 subunidades (2α e 2β) totalizando 200kDaPolipeptídeo Fe 2 subunidades idênticas totalizando 68 kDa
Notrogenase: Controle da expressão gênica
nif: nitrogenase fixN: ambientemicroaeróbico (?)
↓O2
Fatores de transcrição
Via NOD
Assimilação doNH4+
Assimilação de NO3 - e NH4
+
• Absorção do solo– transportador do tipo
simporte (alta afinidade, induzida e baixa afinidade, constitutivo)
• Que vias enzimáticas são utilizadas?– NR/NiR– GS/GOGAT– GDH
• Localização nos tecidosArabidospsis mutante para transportador de nitrato.
Cofatores:FeS, siroheme
Cofatores:Mo, HemoFe, FAD
NO3- a NH4
+: duas reaçõesReações dependentes de NR e NiR ocorrem em folhas e raíze
6e-/NH4
2e-/NO2
Citoplasma de folhas e raízes•Dependendo da espécie: folha ou raíz•Dependendo da disponibilidade de NO3: extensão da expressão
↑NR ↑↑↑NiRNR regulaNiR impede aúmulo de NO2
NO2
Platídios de folhas e raízes
nia mRNA (tomate)Plântulas de cevada (exp. NO3)
– Transcricional:nitrato ↑, ritmo circadianosacarose ↑glutamina ↓luz (fitocromo) ↑
Regulação da atividade da Nitrato redutase
Fosfatase
cinase
Regulação da atividade da Nitrato redutase
– Pós-transcricional (rápida e reversível)
• fosfoliração: inativa• defosforilação: ativa
EscuroBaixo CO2
Citocinina
ABA
Gene nr
mRNAda NR
NR inativa
degradação
NR ativa
NiR ativa
Gene nir
mRNANiR
NO3- NO2- NH4+
Resumindo...
Baixo CO2escuro
-
luz
sacarose
tran
scri
cion
alpó
s-tr
ansc
rici
onal
Assimilação de NH4+
GS GOGATFolha: (cp e cit) (cp)Raiz: (cit) (plastos)
transaminação
CarbohidratosLuz
+ trans
Luz+ trans
+ atividade
CarbohidratosLuz
-Trans- atividade
Alfa-cetoglutarato
Assimilação de NH4+
GS GOGATFolha: (cp e cit) (cp)Raiz: (cit) (plastos)
X X
X
X
Interação NO3- e
metabolismo de C:
1-↑ NO3- desvia C de amido →aa
↓
↑
2- ↑luz e carbohidratos:Ativa GC-GOGAT e inibe AS para acumular N em compostos ricos em carbono: glutamina (1/4) e glutamato (a partir dos quais muitas outras rotas surgem)Baixa Energia:Acumulo de N em compostos com alta relação N/C e estável para o transporte: asparagina(2/4)
1
1
2
Translocação de esqueletos contendo N a partir das raízes pode variar entre diferentes
plantas:
Amidas: gln, asp, purinas (nódulos de alfafa, ervilha e outras espécies)
Ureídas: derivados de ácido úrico como ác. Alantóico e alantoina (feijão, soja e
vigna)Nitrato
Aminoácidos
RAÍZ
Comparação dos processos de incorporação de N ao metabolismo
Planta não nodulada Planta nodulada(feijão, soja)
Assimilação Nem raiz e folha
N translocadopreferencialmentecomo nitrato
Altos teores denitrato no solo
Assimilação Nem raiz.
N translocadoGln, Asn ou ureídes
Baixos teores deNitrato no solo
Referências bibliográficas e sítios
• Buchanan, Gruismen and Jones (2000) Capítulo 16 pg: 786-824.
• Kerbauy (2004) Capítulos 3 e 4.• Taiz (2002) Capítulos 12 pg: 260-272.• Forde (2002) Annu. Rev. Plant Biol. 53: 203-224.• Geurts and Bisseling (2002) The plant Cell, Supplement:
S239-S249.• Kistner and Parniske (2002) Trends in Plant Science, 7: 511-
518. • http://academic.reed.edu/biology/Nitrogen/• http://www.genome.ad.jp/kegg/metabolism.html