Post on 24-Mar-2021
c m Ecircoen
AUTARQUIA ASSOCIADA Agrave UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO
ESTUDOS DOS EFEITOS DA RADIACcedilAtildeO GAMA E DE
ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO DE GRAtildeOS DE
MILHO (Zeamays) GENETICAMENTE MODIFICADO
RICARDO GANDARA CREDE
Dissertaccedilatildeo apresentada como parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do Grau de Mestre em Ciecircncias na Aacuterea de Tecnologia Nuclear-Aplicaccedilotildees
Orientadora Dra Anna Luacutecia C H Villavicencio
Satildeo Paulo 2005
I N S T I T U T O D E P E S Q U I S A S E N E R G Eacute T I C A S E N U C L E A R E S
A u t a r q u i a assoc iada agrave Un ive r s idade de Satildeo P a u l o
E S T U D O S D O S E F E I T O S DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E D E
A C E L E R A D O R E S D E E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O D E G R Atilde O S DE
M I L H O Zea mays) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O
R I C A R D O G A N D A R A C R E D E
Disse r t accedilatildeo a p r e s e n t a d a como
p a r t e dos requ is i tos p a r a
ob tenccedilatildeo do G r a u de M e s t r e em
Ciecircnc ias n a Aacute r e a de Tecnologia
N u c l e a r - Apl icaccedilotildees
O r i e n t a d o r a
D r a A n n a L C H Vil lavicencio
Satildeo Pau lo
2005
(CASAtildeO K poundCIacuteAl DC CfERSAcirc NuumlCLEAaSP-H^i
II
Este trabalho eacute dedicado a todos aqueles
que fazem ou acreditam na ciecircncia brasileira
III
Agrave Dra Anna Lucia C H Villavicencio pela amizade carinho estiacutemulo paciencia determinaccedilatildeo e orientaccedilatildeo natildeo soacute neste trabalho como tambeacutem em outros momentos que passamos juntos
Aos colegas de laboratoacuterio Deacutebora Gustavo Ingrid Juliana Mariana Michel Priscila Reginaldo Rosamariacutea e Simone pelo alegre conviacutevio diaacuterio
Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira pela ajuda na irradiaccedilatildeo das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees
Aos ntildeincionaacuterios poacutes-graduandos e estagiaacuterios do Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees que fazem deste departamento um oacutetimo local de trabalho
Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares na pessoa do Dr Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra Maria Helena de Oliveira Sampa chefe de pesquisa do CTR pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho juntamente com a Fapesp
Aos meus pais e meu irmatildeo Rafael que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadecircmico
Ao professor Crodowaldo Pavan pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo
Aos professores e amigos Osmir Nunes e Gloacuteria Kreinz pelo incentivo na aacuterea acadecircmica
Ao meu amigo e divulgador cientiacutefico Mauro Celso Destaacutecio pelo apoio e companheirismo
Ao meu amigo Marcello Bittencourt diretor da Raacutedio USP pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadecircmico
Aos meus amigos e colegas do Nuacutecleo Joseacute Reis de Diulgaccedilatildeo Cientiacutefica e da Raacutedio USP com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho
A todos aqueles que me deram forccedilas e acreditaram em minha capacidade e persistecircncia
Muito Obrigado
A G R A D E C I M E N T O S
IV
Segundo Albert Einstein
A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa
desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela
pode ser
mas sou brasileiro
e natildeo desisto nunca
E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE
M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O
Ricardo Gaacutendara Crede
R E S U M O
A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado
VI
A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF
G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)
Ricardo Gandara Crede
A B S T R A C T
The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze
VII
S U M A R I O
Paacutegina
1- Introduccedilatildeo 1
2- Objetivos 10
3- Revisatildeo da Literarura 11
-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11
-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15
33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17
34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20
bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23
-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31
38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34
39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36
4- Materiais e Meacutetodos 40
41- Amostras 40
42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41
-43- Controles positivos 43
44- Adequaccedilatildeo das amostras 43
45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43
46- Primers 46
47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47
48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47
49- Programaccedilatildeo do termociclador 48
410- A eletroforese dos produtos da PCR 49
5- Delineamento Experimental 51
6- Resultados 52
7- Discussatildeo 62
8- Conclusotildees 69
9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70
VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
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3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
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Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
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A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
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MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
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Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
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proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
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permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
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mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
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forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
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escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
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35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
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Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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E S T U D O S D O S E F E I T O S DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E D E
A C E L E R A D O R E S D E E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O D E G R Atilde O S DE
M I L H O Zea mays) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O
R I C A R D O G A N D A R A C R E D E
Disse r t accedilatildeo a p r e s e n t a d a como
p a r t e dos requ is i tos p a r a
ob tenccedilatildeo do G r a u de M e s t r e em
Ciecircnc ias n a Aacute r e a de Tecnologia
N u c l e a r - Apl icaccedilotildees
O r i e n t a d o r a
D r a A n n a L C H Vil lavicencio
Satildeo Pau lo
2005
(CASAtildeO K poundCIacuteAl DC CfERSAcirc NuumlCLEAaSP-H^i
II
Este trabalho eacute dedicado a todos aqueles
que fazem ou acreditam na ciecircncia brasileira
III
Agrave Dra Anna Lucia C H Villavicencio pela amizade carinho estiacutemulo paciencia determinaccedilatildeo e orientaccedilatildeo natildeo soacute neste trabalho como tambeacutem em outros momentos que passamos juntos
Aos colegas de laboratoacuterio Deacutebora Gustavo Ingrid Juliana Mariana Michel Priscila Reginaldo Rosamariacutea e Simone pelo alegre conviacutevio diaacuterio
Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira pela ajuda na irradiaccedilatildeo das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees
Aos ntildeincionaacuterios poacutes-graduandos e estagiaacuterios do Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees que fazem deste departamento um oacutetimo local de trabalho
Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares na pessoa do Dr Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra Maria Helena de Oliveira Sampa chefe de pesquisa do CTR pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho juntamente com a Fapesp
Aos meus pais e meu irmatildeo Rafael que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadecircmico
Ao professor Crodowaldo Pavan pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo
Aos professores e amigos Osmir Nunes e Gloacuteria Kreinz pelo incentivo na aacuterea acadecircmica
Ao meu amigo e divulgador cientiacutefico Mauro Celso Destaacutecio pelo apoio e companheirismo
Ao meu amigo Marcello Bittencourt diretor da Raacutedio USP pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadecircmico
Aos meus amigos e colegas do Nuacutecleo Joseacute Reis de Diulgaccedilatildeo Cientiacutefica e da Raacutedio USP com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho
A todos aqueles que me deram forccedilas e acreditaram em minha capacidade e persistecircncia
Muito Obrigado
A G R A D E C I M E N T O S
IV
Segundo Albert Einstein
A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa
desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela
pode ser
mas sou brasileiro
e natildeo desisto nunca
E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE
M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O
Ricardo Gaacutendara Crede
R E S U M O
A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado
VI
A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF
G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)
Ricardo Gandara Crede
A B S T R A C T
The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze
VII
S U M A R I O
Paacutegina
1- Introduccedilatildeo 1
2- Objetivos 10
3- Revisatildeo da Literarura 11
-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11
-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15
33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17
34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20
bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23
-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31
38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34
39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36
4- Materiais e Meacutetodos 40
41- Amostras 40
42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41
-43- Controles positivos 43
44- Adequaccedilatildeo das amostras 43
45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43
46- Primers 46
47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47
48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47
49- Programaccedilatildeo do termociclador 48
410- A eletroforese dos produtos da PCR 49
5- Delineamento Experimental 51
6- Resultados 52
7- Discussatildeo 62
8- Conclusotildees 69
9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70
VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
15
Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
70
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II
Este trabalho eacute dedicado a todos aqueles
que fazem ou acreditam na ciecircncia brasileira
III
Agrave Dra Anna Lucia C H Villavicencio pela amizade carinho estiacutemulo paciencia determinaccedilatildeo e orientaccedilatildeo natildeo soacute neste trabalho como tambeacutem em outros momentos que passamos juntos
Aos colegas de laboratoacuterio Deacutebora Gustavo Ingrid Juliana Mariana Michel Priscila Reginaldo Rosamariacutea e Simone pelo alegre conviacutevio diaacuterio
Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira pela ajuda na irradiaccedilatildeo das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees
Aos ntildeincionaacuterios poacutes-graduandos e estagiaacuterios do Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees que fazem deste departamento um oacutetimo local de trabalho
Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares na pessoa do Dr Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra Maria Helena de Oliveira Sampa chefe de pesquisa do CTR pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho juntamente com a Fapesp
Aos meus pais e meu irmatildeo Rafael que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadecircmico
Ao professor Crodowaldo Pavan pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo
Aos professores e amigos Osmir Nunes e Gloacuteria Kreinz pelo incentivo na aacuterea acadecircmica
Ao meu amigo e divulgador cientiacutefico Mauro Celso Destaacutecio pelo apoio e companheirismo
Ao meu amigo Marcello Bittencourt diretor da Raacutedio USP pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadecircmico
Aos meus amigos e colegas do Nuacutecleo Joseacute Reis de Diulgaccedilatildeo Cientiacutefica e da Raacutedio USP com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho
A todos aqueles que me deram forccedilas e acreditaram em minha capacidade e persistecircncia
Muito Obrigado
A G R A D E C I M E N T O S
IV
Segundo Albert Einstein
A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa
desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela
pode ser
mas sou brasileiro
e natildeo desisto nunca
E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE
M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O
Ricardo Gaacutendara Crede
R E S U M O
A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado
VI
A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF
G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)
Ricardo Gandara Crede
A B S T R A C T
The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze
VII
S U M A R I O
Paacutegina
1- Introduccedilatildeo 1
2- Objetivos 10
3- Revisatildeo da Literarura 11
-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11
-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15
33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17
34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20
bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23
-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31
38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34
39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36
4- Materiais e Meacutetodos 40
41- Amostras 40
42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41
-43- Controles positivos 43
44- Adequaccedilatildeo das amostras 43
45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43
46- Primers 46
47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47
48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47
49- Programaccedilatildeo do termociclador 48
410- A eletroforese dos produtos da PCR 49
5- Delineamento Experimental 51
6- Resultados 52
7- Discussatildeo 62
8- Conclusotildees 69
9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70
VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
15
Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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III
Agrave Dra Anna Lucia C H Villavicencio pela amizade carinho estiacutemulo paciencia determinaccedilatildeo e orientaccedilatildeo natildeo soacute neste trabalho como tambeacutem em outros momentos que passamos juntos
Aos colegas de laboratoacuterio Deacutebora Gustavo Ingrid Juliana Mariana Michel Priscila Reginaldo Rosamariacutea e Simone pelo alegre conviacutevio diaacuterio
Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira pela ajuda na irradiaccedilatildeo das amostras no Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees
Aos ntildeincionaacuterios poacutes-graduandos e estagiaacuterios do Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees que fazem deste departamento um oacutetimo local de trabalho
Ao IPEN - Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares na pessoa do Dr Wilson Aparecido Parejo Calvo gerente do CTR e da Dra Maria Helena de Oliveira Sampa chefe de pesquisa do CTR pelo constante apoio financeiro do departamento que ajudou e colaborou no desenvolvimento deste trabalho juntamente com a Fapesp
Aos meus pais e meu irmatildeo Rafael que sempre me incentivaram ao desenvolvimento acadecircmico
Ao professor Crodowaldo Pavan pelo excelente exemplo de vida e profissionalismo
Aos professores e amigos Osmir Nunes e Gloacuteria Kreinz pelo incentivo na aacuterea acadecircmica
Ao meu amigo e divulgador cientiacutefico Mauro Celso Destaacutecio pelo apoio e companheirismo
Ao meu amigo Marcello Bittencourt diretor da Raacutedio USP pelos conselhos e dicas referentes ao mundo acadecircmico
Aos meus amigos e colegas do Nuacutecleo Joseacute Reis de Diulgaccedilatildeo Cientiacutefica e da Raacutedio USP com quem dividia meu tempo nos intervalos deste trabalho
A todos aqueles que me deram forccedilas e acreditaram em minha capacidade e persistecircncia
Muito Obrigado
A G R A D E C I M E N T O S
IV
Segundo Albert Einstein
A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa
desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela
pode ser
mas sou brasileiro
e natildeo desisto nunca
E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE
M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O
Ricardo Gaacutendara Crede
R E S U M O
A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado
VI
A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF
G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)
Ricardo Gandara Crede
A B S T R A C T
The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze
VII
S U M A R I O
Paacutegina
1- Introduccedilatildeo 1
2- Objetivos 10
3- Revisatildeo da Literarura 11
-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11
-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15
33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17
34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20
bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23
-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31
38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34
39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36
4- Materiais e Meacutetodos 40
41- Amostras 40
42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41
-43- Controles positivos 43
44- Adequaccedilatildeo das amostras 43
45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43
46- Primers 46
47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47
48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47
49- Programaccedilatildeo do termociclador 48
410- A eletroforese dos produtos da PCR 49
5- Delineamento Experimental 51
6- Resultados 52
7- Discussatildeo 62
8- Conclusotildees 69
9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70
VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
15
Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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IV
Segundo Albert Einstein
A ciecircncia eacute uma coisa maravilhosa
desde que vocecirc natildeo tenha que ganhar a vida com ela
pode ser
mas sou brasileiro
e natildeo desisto nunca
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Ricardo Gaacutendara Crede
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A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado
VI
A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF
G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)
Ricardo Gandara Crede
A B S T R A C T
The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze
VII
S U M A R I O
Paacutegina
1- Introduccedilatildeo 1
2- Objetivos 10
3- Revisatildeo da Literarura 11
-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11
-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15
33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17
34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20
bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23
-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31
38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34
39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36
4- Materiais e Meacutetodos 40
41- Amostras 40
42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41
-43- Controles positivos 43
44- Adequaccedilatildeo das amostras 43
45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43
46- Primers 46
47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47
48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47
49- Programaccedilatildeo do termociclador 48
410- A eletroforese dos produtos da PCR 49
5- Delineamento Experimental 51
6- Resultados 52
7- Discussatildeo 62
8- Conclusotildees 69
9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70
VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
15
Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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i ouml
ZIMMERMANN A LUTHY J PAULI U Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples Z Lebensm Unters Forsch v207 p 81-90 1998
E S T U D O S D O S EFEITOS DA R A D I A Ccedil Atilde O G A M A E DE A C E L E R A D O R E S DE E L Eacute T R O N S NA D E T E C Ccedil Atilde O DE GRAtildeOS DE
M I L H O ZEA MAYS) G E N E T I C A M E N T E M O D I F I C A D O
Ricardo Gaacutendara Crede
R E S U M O
A principal teacutecnica para detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados -OGMs eacute a reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase ou polymerase chain reaction - PCR A PCR eacute um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnamrado (92-96degC) os primers satildeo hibridizados (30deg a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedeos (dNTPs) (72 C) por vaacuterios ciclos repetitivos O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR tem sido muito utilizada para a identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos Na detecccedilatildeo de gratildeos geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se altamente sensiacuteel ela permite identificar um gratildeo geneticamente modificado dentre um milhatildeo de gratildeos normais Hoje a anaacutelise pelo meacutetodo de PCR eacute a uacutenica em muitos casos capaz de discriminar um organismo geneticamente modificado de um natildeo transgeacutenico A identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado do teste eacute mais confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequumlecircncia de DNA eacute preciso que este esteja minimamente preservado Entretanto o que muitas vezes acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o DNA pode ser degradado (por exemplo por calor ou radiaccedilatildeo) e com isso natildeo ser mais detectaacutevel Este trabalho visa como objetivo principal o estudo da viabilidade do uso da PCR na detecccedilatildeo de OGMs em alimentos irradiados contendo milho Para a irradiaccedilatildeo do material foi utilizada uma fonte de ^degCo Irradiador Gamma Cell-220 (Atomic Energy of Canada LTD) e um acelerador de eleacutetrons (radiation Dynamics Inc USA) aplicando-se doses de 1 25 e 50 kGy Apoacutes a irradiaccedilatildeo das amostras os resultados da detecccedilatildeo foram comparados com amostras natildeo irradiadas mostrando que quando utilizada a teacutecnica da PCR a irradiaccedilatildeo natildeo afeta a detecccedilatildeo de milho geneticamente modificado
VI
A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF
G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)
Ricardo Gandara Crede
A B S T R A C T
The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze
VII
S U M A R I O
Paacutegina
1- Introduccedilatildeo 1
2- Objetivos 10
3- Revisatildeo da Literarura 11
-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11
-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15
33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17
34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20
bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23
-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31
38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34
39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36
4- Materiais e Meacutetodos 40
41- Amostras 40
42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41
-43- Controles positivos 43
44- Adequaccedilatildeo das amostras 43
45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43
46- Primers 46
47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47
48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47
49- Programaccedilatildeo do termociclador 48
410- A eletroforese dos produtos da PCR 49
5- Delineamento Experimental 51
6- Resultados 52
7- Discussatildeo 62
8- Conclusotildees 69
9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70
VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
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Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
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proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
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permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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VI
A S T U D Y A B O U T T H E EFFECTS O F G A M A R A D I A T I O N AND E L E C T R O N B E A M IRRADIATION IN T H E D E T E C T I O N OF
G E N E T I C A L L Y MODIFIED M A I Z E (ZEA MAYS)
Ricardo Gandara Crede
A B S T R A C T
The major technique to detect genetically modified organism - GMO is the polymerase chain reaction - PCR The PCR is a method that allows the enlargement in vitro of DNA segments using two starters (primers) that hybridize with the opposing ribbons in regions that match the segment to be amplified For that the DNA is disnatured (92-96degC) the primers are hybridized (30deg a 6 0 ^ ) and after that the DNA synthesis is made with a DNA-polymerase and nucleotides (dNTPs) (72 degC) for some repetitive cycles The development of the PCR allowed great advances in Molecular Biology mainly for analysis of genes diagnosis of ilbiesses and pathogens among some other examples Currently the PCR has been very much used for the identification of transgenic constituents in foods In the detection of genetically modified grains the PCR technique showed to be highly sensitive because it allows identifying one genetically modified grain amongst a million of normal grains Nowadays the analysis through the PCR method is the only capable to discriminate an organism genetically modified from a not transgenic one The identification of foods that were made of transgenic grains as soy and maize through the PCR technique is still controversial Therefore the result of the test is more trustworthy when it is positive Or either the detection absence does not mean that the product does not have in fact transgenic ingredients It happens because to detect a DNA sequence is necessargt to preserve a minimum portion of the DNA However what happens many times in the industrialization process is that in the manipulation of the ingredients the DNA can be degraded (for example for heat or radiation) and consenquently is not detectable any longer This work has as a main objective the study of the viabilit in the use of the PCR in the detection of GMOs in radiated foods containing maize For the irradiation of the material a source of ^Co Irradiator Gamma Cell-220 and electron beam irradiation (Radiation Dynamics Inc USA) were used (Atomic Energy of Canada LTD) applying doses of 1 25 and 50 kGy After irradiating the samples the detection results were compared with non-irradiated samples showing that when the PCR technique was used the irradiation does not affect the perception of the genetically modified mayze
VII
S U M A R I O
Paacutegina
1- Introduccedilatildeo 1
2- Objetivos 10
3- Revisatildeo da Literarura 11
-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11
-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15
33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17
34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20
bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23
-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31
38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34
39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36
4- Materiais e Meacutetodos 40
41- Amostras 40
42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41
-43- Controles positivos 43
44- Adequaccedilatildeo das amostras 43
45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43
46- Primers 46
47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47
48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47
49- Programaccedilatildeo do termociclador 48
410- A eletroforese dos produtos da PCR 49
5- Delineamento Experimental 51
6- Resultados 52
7- Discussatildeo 62
8- Conclusotildees 69
9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70
VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
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Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
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proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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VII
S U M A R I O
Paacutegina
1- Introduccedilatildeo 1
2- Objetivos 10
3- Revisatildeo da Literarura 11
-31- Uso e accedilatildeo dos milhos geneticamente modificados 11
-32- Detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados em alimentos 15
33- Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de DNA 17
34- A rotulagem dos geneticamente modificados 20
bull35- O desenvolvimento da irradiaccedilatildeo de alimentos 23
-36- Uso da irradiaccedilatildeo de alimentos 29
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos 31
38- Perdas na armazenagem de gratildeos 34
39- Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de milho 36
4- Materiais e Meacutetodos 40
41- Amostras 40
42- Irradiaccedilatildeo das amostras 41
-43- Controles positivos 43
44- Adequaccedilatildeo das amostras 43
45- Extraccedilatildeo do DNA das amostras 43
46- Primers 46
47- Visualizaccedilatildeo do DNA obtido 47
48- A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) 47
49- Programaccedilatildeo do termociclador 48
410- A eletroforese dos produtos da PCR 49
5- Delineamento Experimental 51
6- Resultados 52
7- Discussatildeo 62
8- Conclusotildees 69
9- Referecircncias Bibliograacuteficas 70
VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
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Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
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proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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VIII
LISTA DE Q U A D R O S
Paacutegina
Quadro 1 Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros 34
Quadro 2 Primers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncias e segmento amplificado 47
Quadro 3 Resultado final das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas 61
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
15
Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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i ouml
ZIMMERMANN A LUTHY J PAULI U Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples Z Lebensm Unters Forsch v207 p 81-90 1998
IX
L I S T A D E F I G U R A S
Paacutegina
Figura 1 Instalaccedilotildees de urna multinacional produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP 2
Figura 2 Foto do acelerador de eleacutetrons Radiation Dynamics
pertencente ao IPEN 7
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao
IPEN 8
Figura 4 A esquerda lagarta e direita forma adulta de
Spodotera frugiperda 12
Figura 5 forma adulta e uma lagarta de Ostrinia nubialis no
colmo do milho 12
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea
grandiosella a direita uma lagarta de Heliothis zea
alimentando-se em urna espiga de milho 12
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees - CTR do
IPENCNEN em Satildeo Paulo 28
Figura 8 Diisatildeo do consumo de milho no Brasil 37
X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
15
Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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X
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais
estados produtores - 1998 a 2000 e 2001 a 2003 38
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho
utilizadas no experimento 41
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para
irradiaccedilatildeo na Gammacell 42
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons 42
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de
extraccedilatildeo de DNA 46
Figura 14 termociclador utilizado modelo
Mastercycler (Eppendoriacute) 49
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para
o registro dos resultados 50
Figura 16 Gel determinando insucesso (12) e
sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA 52
Figura 17 Armazenagem das amostras de DNA 54
Figura 18 PCR com primer IVRl mostrando
a presenccedila ou ausecircncia de milho 55
ssfto wmm DE EHEIacute^A NUOEARSP-I
XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
15
Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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XI
Figura 19 Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl
mesmo com doses de 50kGy 56
Figura 20 PCR com primer IVRl utilizando-se
amostras irradiadas em diferentes doses 56
Figura 21 Resultado de uma PCR para Bt l76
natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo 57
Figura 22 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 23 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho B t l l 58
Figura 24 Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras
de milho MON810 59
Figura 25 esultado da PCR de amostras contendo
milho Btl I depois de irradiadas 60
Figura 26 Resltado da PCR de amostras contendo
milho MON8I0 depois de irradiadas 60
1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
12
Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
15
Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
70
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1- Introduccedilatildeo
A produccedilatildeo de alimentos transgecircnicos surgiu com o intuito de minimizar
perdas e aumentar a produtividade dos cultivares As culturas de variedades
geneticamente modificadas autorizadas satildeo inuacutemeras na Argentina a soja em 1996
o milho e o algodatildeo em 1998 no Canadaacute o milho e o algodatildeo em 1996 a canola em
1997 a soja e o melatildeo em 1998 a batata e o trigo em 1999 nos Estados Unidos o
melatildeo a soja o tomate o algodatildeo e a batata em 1994 a canola e o milho em 1995
no Japatildeo a soja a canola a batata e o milho em 1996 o algodatildeo e o tomate em
1997 na Uniatildeo Europeacuteia o tomate e a canola em 1995 a soja em 1996 o milho em
1997 a batata e o algodatildeo em 1998 O mundo se encontra na era do supermercado
transgecircnico alimentos com os genes modificados chegam agrave mesa dos consumidores
como a cenoura mais doce e contendo doses extras de beta-caroteno o arroz com
mais proteiacutenas a batata com retardo de escurecimento o melatildeo com maior
resistecircncia a doenccedilas o milho resistente a pragas a soja com genes de castanha-do-
paraacute que aumenta o seu valor nutritivo o tomate longa vida que foi o primeiro
alimento transgecircnico a ser comercializado e a ervilha com genes que permitem sua
conseraccedilatildeo por mais tempo (GREINER 1999) O desenvolvimento de novos
produtos transgecircnicos e o crescimento da biotecnologia na produccedilatildeo de novos
cultivares eacute inevitaacutevel Para o Brasil a legislaccedilatildeo adotada em relaccedilatildeo a tecnologia
dos organismos geneticamente modificados - OGMs seraacute de grande importacircncia
influenciando diretamente no futuro da produccedilatildeo agriacutecola nacional (Folha de Satildeo
Paulo 2004) O ato de proibir os transgecircnicos eacute impedir o progresso cientiacutefico
econocircmico e social do paiacutes (PAVAN 2005)
A biotecnologia e engenharia geneacutetica como novas tecnologias para a cadeia
produtia em particular para as companhias oligopoacutelicas desse mercado satildeo
propagadas sob o argumento de natildeo agredirem o ambiente e contribuiacuterem para a
sauacutede inclusive por contribuiacuterem para o fim do uso de pesticidas e da fome no
mundo (CAVALLI 2001) Os alimentos geneticamente modificados bem como a
biotecnologia sustentam-se sobre tais argumentos e pela disputa entre corporaccedilotildees
do mercado mtemacional pelos produtos oriundos destas tecnologias modificando o
comeacutercio e o controle especifico das cadeias agro-alimentares do cenaacuteno mimdial
As maiores discordacircncias sobre transgecircnicos ocorrem entre os Estados Unidos que eacute
o maior exportador de produtos desenvolvidos por engenharia geneacutetica atraveacutes de
multinacionais (figura I) e a Europa que juntamente com a maioria dos paiacuteses do
terceiro mundo temem que as lavouras de OGMs - organismos geneticamente
modificados tenham efeitos devastadores sobre a biodiversidade e as tradiccedilotildees
culturais de suas populaccedilotildees (HOFFMAN 1999)
Figura 1 Instalaccedilotildees de uma multinacional americana produtora de sementes
geneticamente modificadas em Satildeo Joseacute dos Campos - SP
Gremer (1999) destaca os prmcipais argumentos da rejeiccedilatildeo dos alimentos
transgecircnicos na Europa inexistecircncia da necessidade de produzir alimentos a partir
de engenliana geneacutetica riscos mesmo se considerados hipoteacuteticos aspecto cultural
efeitos de longo prazo que devem ser estudados e risco ambiental Uma seacuterie de
riscos dos alimentos transgecircnicos para a sauacutede estaacute sendo levantada e questionada
por grupos contraacuterios aos OGMs que questionam o aumento das alergias
resistecircncia aos antibioacuteticos aumento das substacircncias toacutexicas e dos resiacuteduos nos
alimentos Com relaccedilatildeo agrave seguranccedila alimentar em prol do bem estar da populaccedilatildeo eacute
necessaacuterio um aprofundamento nas pesquisas para que se possa consumir esses
alimentos sem riscos a sauacutede (SPERS e KASSOUF 1 9 9 6 ) Questiona-se a garantia da
seguranccedila e qualidade alimentar nutricional dos produtos bem como da soluccedilatildeo da
fome isto eacute como chegar a superaccedilatildeo do problema alimentar no mundo A
seguranccedila alimentar pressupotildee o direito fundamental de acesso quantitativo e
qualitativo de alimentos Alguns grupos julgam que natildeo estaacute nos alimentos
transgecircnicos a soluccedilatildeo para a erradicaccedilatildeo da fome bem como do oferecimento de
seguranccedila alimentar para a populaccedilatildeo (SILVA 2000)
Amalmente satildeo muitas as variedades geneticamente modificadas de milho
(Comissatildeo Teacutecnica Nacional de Biosseguranccedila 2004) Entre elas pode-se destacar
- Milho B t l 7 6 produzido pela Syngenta (ex-Novartis) eacute geneticamente
alterado de forma a produzir o seu proacuteprio pesticida tomando-se assim resistente a
alguns insetos
- Milho B t l l linhagem resistente a insetos e tolerante a herbicidas
produzido pela empresa Syngenta Possui a proteiacutena inseticida CrylAb isolada da
bacteacuteria Bacillus thurigiensis subsp Kustaki cepa H D l e a proteiacutena herbicida acetil
transferase (PAT) isolada da bacteacuteria Streptomyces viridrochromogenes
- Milho MON810 desenvolvido pela empresa Monsanto este cultivar possui
resistecircncia a insetos atraveacutes da presenccedila da proteiacutena inseticida CrylAb
- Milho T25 linhagem tolerante a herbicida Liberty Link T25 contendo a
proteiacutena herbicida PAT e produzido pela empresa AventisBayer
A identificaccedilatildeo destes cultivares geneficamente modificados pode ser
realizada pela teacutecnica da PCR - reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (ROMANO 1999)
A invenccedilatildeo desta teacutecnica deu a Kary Mullius o Nobel de Quiacutemica de 1993 A PCR eacute
um meacutetodo que permite a amplificaccedilatildeo in vitro de segmentos de DNA utilizando-se
dois iniciadores (primers) que hibridizam com as fitas opostas em regiotildees que
flanqueiam o segmento a ser amplificado Para isso o DNA eacute desnaturado (92-
96degC) os primers satildeo hibridizados (30 a 60degC) e posteriormente a siacutentese de DNA
eacute feita com uma DNA-polimerase e nucleotiacutedes (dNTPs) (72degC) por vaacuterios ciclos
repetitivos (IKUNO 2000)
Quando foi inicialmente concebida a PCR era uma tarefa tediosa uma vez
que as mudanccedilas sucessivas de temperatura requeriam a transferecircncia manual dos
tubos de reaccedilatildeo entre os banhos-maria com temperamras diferentes Aleacutem disso a
DNA polimerase devia ser acrescentada a cada ciclo pois a temperatura elevada
para a desnaturaccedilatildeo do DNA molde desnaturava tambeacutem esta enzima Duas
inovaccedilotildees fizeram com que a PCR se tomasse tatildeo simples faacutecil e eficiente de modo
que se utilizasse em laboratoacuterios do mundo todo A primeira foi a purificaccedilatildeo de
uma DNA-polimerase obtida de uma bacteacuteria termoacutefila (Thermus aquaticus) que
habita fontes de aacutegua quente A Ta^DNA polimerase permanece ativa mesmo apoacutes
sucessivos ciclos de amplificaccedilatildeo Aleacutem disso foram desenvolvidos termocicladores
automaacuteticos que controlam os sucessivos ciclos de aumento e diminuiccedilatildeo de
temperatura requeridos para a PCR (IKUNO 2000)
O desenvolvimento da PCR permitiu enormes avanccedilos na Biologia
Molecular principalmente para anaacutelise de genes diagnoacutestico de doenccedilas e
patoacutegenos entre outros exemplos Atualmente a PCR eacute muito uuumllizada para a
identificaccedilatildeo de constituintes transgecircnicos em alimentos (HIRATA 1999) Na
detecccedilatildeo de gratildeos de soja geneticamente modificados a teacutecnica de PCR mostrou-se
altamente sensiacutevel ela permite identificar um gratildeo de soja geneticamente
5
cmsm mxmL Uumliquest [laquoB^AtildeA NUumlCLEARSP-PEW
modificada dentre um milhatildeo de gratildeos normais O tempo necessaacuterio para a anaacutelise
pela teacutecnica da PCR gira em torno de 15 dias Hoje em muitos casos a anaacutelise
pelo meacutetodo da PCR eacute a uacutenica teacutecnica capaz de discriminar um organismo
geneticamente modificado de um gratildeo natildeo transgecircnico (GACHET 1999)
Recentemente pesquisas realizadas na Europa utilizando-se a teacutecnica PCR
demonstraram a existecircncia de alimentos contendo gratildeos transgecircnicos no Brasil Tais
pesquisas encomendadas por entidades brasileiras como o IDEC - Instituto de
Defesa do Consumidor foram realizadas na Europa pelo fato de natildeo existir ainda no
Brasil laboratoacuterios conceituados na Tecnologia da PCR para a identificaccedilatildeo de
alimentos transgecircnicos ou produzidos com mateacuteria prima oriunda de organismos
geneticamente modificados (Folha SPaulo 21062000) Apesar da grande polecircmica
ocasionada pela chegada ao mercado brasileiro da soja transgecircnica Roundup Ready
produzida pela multinacional Monsanto contendo o transgene CP4 EPSPS ainda
natildeo possuiacutemos maiores estudos referentes a gratildeos transgecircnicos e seus produtos
industrializados (SiLVA 2000)
Aleacutem disso a identificaccedilatildeo de alimentos originaacuterios de gratildeos transgecircnicos
como soja e milho atraveacutes da teacutecnica PCR ainda eacute polecircmica Sendo que o resultado
do teste somente eacute confiaacutevel quando este eacute positivo Ou seja a ausecircncia de detecccedilatildeo
natildeo significa que o produto natildeo contenha de fato ingredientes transgecircnicos
(DICKINSON 1995) Isso ocorre pelo fato de que para detectar uma sequecircncia de
DNA eacute preciso que este D N A esteja minimamente preservado O que muitas vezes
acontece no processo de industrializaccedilatildeo eacute que na manipulaccedilatildeo dos ingredientes o
DNA pode ser degradado e com isso natildeo ser mais detectaacutevel por teacutecnicas de
biologiacutea-molecular como a PCR (GREINER 1998)
Os consumidores tecircm que saber se o alimento que consomem eacute seguro
independentemente de como ele eacute produzido ou desenvolvido Por ser uma
tecnologia recente ainda natildeo houve tempo para a realizaccedilatildeo de um bom nuacutemero de
trabalhos cientiacuteficos envolvendo os organismos geneticamente modificados em
relaccedilatildeo as mais diversas aacutereas do conhecimento humano (CAVALLI 2001) Faltam
estudos que avaliem a sua atividade na economia mundial sua importacircncia
nutricional seus possiacuteveis impactos ambientais e sua relaccedilatildeo com outras tecnologias
utilizadas na induacutestria alimentiacutecia (BINSFELD 2000)
A relaccedilatildeo do uso de radiaccedilatildeo ionizante em alimentos que contem em sua
composiccedilatildeo os organismos geneticamente modificados eacute um destes pontos obscuros
Ainda natildeo existem linhas de pesquisa ou trabalhos publicados sobre a interaccedilatildeo
destas duas tecnologias que satildeo capazes de atuar sobre a constituiccedilatildeo do DNA de
produtos alimentiacutecios O termo radiaccedilatildeo refere-se aos processos fiacutesicos de emissatildeo e
propagaccedilatildeo de energia seja por intermeacutedio de fenocircmenos ondulatorios seja por
meio de partiacuteculas dotadas de energia cineacutetica A irradiaccedilatildeo eacute o processo de
aplicaccedilatildeo desta energia a um material tal como os alimentos com a finalidade de
esterilizaacute-los ou preservaacute-los pela destruiccedilatildeo de parasitas insetos e outras pragas
reduccedilatildeo da carga microbiana inibiccedilatildeo de brotamento e prolongamento da vida uacutetil
(FDA 1997) O tipo de radiaccedilatildeo usada eacute a denominada radiaccedilatildeo ionizante pois ela
produz partiacuteculas eletricamente modificadas (iacuteons) O emprego das radiaccedilotildees
ionizantes gama e feixe de eleacutetrons na preservaccedilatildeo de alimentos estaacute crescendo
mundialmente A grande diferenccedila entre os raios gama provenientes de uma fonte de
Co^deg e os eleacutetrons oriundos de um acelerador industrial eacute o seu poder de penetraccedilatildeo
(DlEHL 1995) Enquanto os feixes de eleacutetrons atingem poucos centiacutemetros de
profiindidade a capacidade de penetraccedilatildeo dos raios gama eacute maior (URBAIN 1986)
Isso faz com que os aceleradores de eleacutetrons (figura 2) soacute possam ser usados em
produtos com pouca espessura garantindo assim a adequada irradiaccedilatildeo do material
Figura 2 Foto do acelerador do eleacutetrons Radiation Dynamics pertencente ao IPEN
Nem todos os tipos de radiaccedilatildeo satildeo apropriados para o processamento de
alimentos assim sendo a FAOOIEAOMS publicou as normas gerais do Codex
para alimentos irradiados (Codex Uunentarius 1983 USFood 1986 DiEHL 1995
ICGF 1995) A irradiaccedilatildeo dos alimentos constituiacute importante meacutetodo capaz de
diminuir as perdas econocircmicas provenientes da deterioraccedilatildeo e a eliminaccedilatildeo de
patoacutegenos aumentando o nivel de seguranccedila dos alimentos e favorecendo a
aceitaccedilatildeo dos produtos exportados pelos paiacuteses em desenvolvimento (LOAHARANU
1994) Nos diacuteas atuais a uradiaccedilatildeo de alimentos contribuiacute imensamente no controle
dos perigos microbioloacutegicos ( A N - H U N G FU et al 1995) Apesar do alto nivel de
seguranccedila dos produtos alimenticios fornecidos para consumo os perigos e riscos
microbioloacutegicos contmuam existmdo resultando em nuacutemeros expressivos nas
estatiacutesticas de incidecircncia de enfermidades transmitidas por alimentos (DiEHL 1995)
As perdas de alimentos em grandes quantidades devido agrave deterioraccedilatildeo
constituem importante problema que atinge principalmente paiacuteses em
desenvolvimento Estuna-se que cerca de 5 0 dos produtos pereciacuteveis como carne
peixes frutas e vegetais sejam perdidos antes de atmgirem o consumo final
(VILLAVICENCIO 1998) Grande parte das perdas amda se deve agrave mfestaccedilatildeo de
msetos deterioraccedilatildeo amadurecimento natural e por alteraccedilotildees fisioloacutegicas como o
brotamento de tubeacuterculos contribuindo drretamente para agravar os problemas de
fome e desnutriccedilatildeo da populaccedilatildeo gerando em consequumlecircncia a diminuiccedilatildeo da
produtividade e aumentando a predisposiccedilatildeo a enfermidades Na esfera do comeacutercio
mtemacional satildeo mterpostas barreiras fitossanitaacuteria dificultando a exportaccedilatildeo de
alimentos (DiEHL 1995) Pesquisas envolvendo o tratamento com uradiaccedilatildeo
prmcipalmente a oriunda do Cobalto 6 0 (figura 3 ) estatildeo sendo desenvolvidas a fim
de sanar diversos destes problemas
Figura 3 Fonte de Cobalto 60 - Gammacell 220 pertencente ao EPEN
COItSSAtilde0 EfiEntildeSA NUCLEAfi5P-IPEIIacute
o uso de radiaccedilatildeo ionizante no processamento de alimentos eacute possiacutevel graccedilas
a existecircncia de algumas caracteriacutesticas relacionadas a moleacutecula de DNA
(DELINCEacuteE 2002) A irradiaccedilatildeo em doses incapazes de modificar as caracteriacutesticas
naturais dos alimentos e afetar as demais moleacuteculas celulares jaacute satildeo suficientes para
alterar o DNA provocando sua quebra e destruiccedilatildeo (POLLARD 1966) Os efeitos da
quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo mostrados por diversos
autores sendo inclusive urna das formas de detectar se um alimento foi irradiado ou
natildeo (VILLAVICENCIO 2000) Neste trabalho ESTUDOS DOS EFEITOS D A
RADIACcedilAtildeO GAMA E DE ACELERADORES DE ELEacuteTRONS NA DETECCcedilAtildeO
DE GRAtildeOS DE MILHO (Zea mays) GENETICAMENTE MODIFICADO foram
estudadas as possiacuteveis consequumlecircncias da radiaccedilatildeo na moleacutecula de DNA o que
poderia interferir na detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados atraveacutes da
teacutecnica da PCR
2- Objetivos
Este trabalho teve como principaacuteis objetivos
- Avaliar os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^degCo e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificado ou de alimentos que o
possuam como ingrediente
- Desenvolver urna rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados
- Avaliar as atuais teacutecnicas de PCR na identificaccedilatildeo de gratildeos geneticamente
modificados e suas possiacuteveis falhas a partir de alimentos processados
11
3 - Revisatildeo da Literatura
3 1 - Uso e accedilatildeo dos milhos genet icamente modificados
Com o advento da biotecnologia genes que codificam proteiacutenas com
propriedades inseticidas foram isolados de Bacillus thiringiemis Et) Estes genes
foram modificados para expressarem adequadamente em plantas para o controle de
pragas alvo em culturas como o tomateiro Lycopersicon esculentum (Fishhoff et al
1 9 8 7 ) algodoeiro Gossypium hirsutum (PERLAK et ai 1990) batata Solanum
tuberosum (Perlak et aiacute 1993) e milho Zea mays (KoziEL et al 1993 e
ARMSTRONG et al 1995) O milho geneticamente modificado resistente a
insetos foi originalmente desenvolvido para o controle de Ostrinia nubialis
(Lepidoptera) uma importante praga do colmo do milho nos Estados Unidos As
proteiacutenas Bt satildeo eficientes principalmente no controle de espeacutecies de ordens
Lepidoptera e Coleoacuteptera Em plantas geneticamente modificadas as lagartas se
alimentam de tecido foliar e ingerem a proteiacutena Bt que aUia nas ceacutelulas epiteliais do
tubo digestivo das mesmas (MEYERS et al 1997) A proteiacutena Bt promove a ruptura
osmoacutetica irreversiacutevel das ceacutelulas e causa a morte dos insetos antes que os mesmos
consigam causar danos econocircmicos agrave cultura (PETRANTONIO et ai 1993)
Koziel et ai (1993) obtiveram sucesso na inserccedilatildeo do gene CrylAb em
milho sendo a proteiacutena CrylAb expressa em altas concentraccedilotildees nos tecidos da
planta Os autores em teste de campo observaram eficiecircncia no controle de
Ostrinia nubialis tanto em relaccedilatildeo aos consumo de folhas quanto agrave perniraccedilatildeo do
colmo da planta Armstrong et al (1995) avaliando o potencial de vaacuterias linhagens
de milhos geneticamente modificados no controle de Ostrinia nubialis (fig5)
verificaram excelentes resultados quanto aacute resistecircncia das plantas testadas a esta
praga levando agrave conclusatildeo de que plantas geneticamente modificadas devem ser
mais um componente de manejo integrado de pragas (MIP)
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Figura 4 A esquerda lagarta e a direita forma adulta de Spodotera fnigiperda
Figura 5 Forma adulta e urna lagarta de Osirinia nubialis no colmo do milho
Figura 6 A esquerda lagarta e forma adulta de Diatraea gi-andiosella a direita uma lagarta
de Heliothis zea alimentando-se em urna espiga de milho
13
A resistecircncia de diversos hiacutebridos de milho geneticamente modificado
contendo a proteiacutena CrylAb agraves lagartas de Spodotera frugiperda (figura 3) e
Diatraea grandiosella (figura 4) foi avaliada em bioensaios de laboratorio e testes
de campo por Williams et al (1997) Em laboratorio utilizou-se o tecido vegetal
liofilizado adicionado agrave dieta artificial para avaliar o efeito da proteiacutena Bt nos
lepidoacutepteros Observaram baixa sobrevivecircncia das duas espeacutecies em dieta com
tecido liofilizado dos hiacutebridos de milhos modificados Em campo os hiacutebridos
geneticamente modificados apresentaram menores danos Os estudos demonstraram
a accedilatildeo toacutexica da proteiacutena CrylAb para Spodotera frugiperda e Diatraea
grandiosella Lunch et al (1999) em teste de campo com milho doce Btl 1 (proteiacutena
CrylAb) confirmaram os efeitos adversos da proteiacutena presente nas folhas e espigas
no desenvolvimento bioloacutegico de Spodotera frugiperda e de Heliothis zea Os dados
de campo indicaram adequada proteccedilatildeo de folhas e espigas aos danos destas pragas
no milho Btl 1
Barry et al (2000) efetuaram testes de campo com milhos resistentes que
expressavam as proteiacutenas CrylAb e CrylAc com o objetivo de avaliar os efeitos dos
mesmos em populaccedilotildees de Ostrinia nubialis e Diatraea grandiosella As plantas
resistentes apresentaram significativa reduccedilatildeo de danos nas folhas e nos colmos em
relaccedilatildeo ao milho convencional Buntin et al (2001) avaliaram a eficaacutecia dos milhos
MON810 e B t l l que expressam a proteiacutena CrylAb no controle de Spodotera
frugiperda e Heliothis zea na safra de 1998 Ambos os milhos consistentemente
reduziram as infestaccedilotildees e danos nos cartuchos e nas espigas das plantas
respectivamente para Spodotera frugiperda e Heliothis zea Os autores observaram
no entanto que apesar de significativa reduccedilatildeo na infestaccedilatildeo dos lepidoacutepteros
lagartas de ambas as espeacutecies se estabeleceram em vaacuterias espigas do milho
modificado embora tenham se desenvolvido mais lentamente e causando menor
dano em relaccedilatildeo ao milho convencional Os autores concluiacuteram que os milhos
14
MON810 e B t l l foram efetivos em evitar significativas perdas na produtividade
devido ao ataque de ambas as pragas
No Brasil Martinelli (2001) avaliou o padratildeo de resistecircncia dos milhos
geneticamente modificados Btl 1 e ICP4 que expressam proteiacutenas Bt para
Spodotera frugiperda e Heliothis zea em condiccedilotildees de campo De acordo com os
dados obtidos foi possiacutevel obsenar danos em folhas de milho modificado poreacutem em
niacutevel reduzido comparativamente ao milho convencional Os danos nas folhas
ocorreram mais precocemente no milho convencional do que nos milhos B t l l e
ICP4 sendo que nestes a progressatildeo da intensidade de dano foi acentuadamente
menor que nos hiacutebridos convencionais O autor concluiu que ambos os milhos Btl 1
e ICP4 foram eficientes na proteccedilatildeo da planta em relaccedilatildeo ao dano de Spodotera
frugiperda e de Heliothis zea
Huang et al (2002) avaliaram a performance de diversos milhos
geneticamente modifiacutecados que expressam proteiacutenas Bt no controle de Ostrinia
nubialis em condiccedilotildees de telado Os autores avaliaram o padratildeo de resistecircncia dos
milhos geneticamente modificados DBT418 que expressa a proteiacutena Cry-lAc e
MON8I0 B t l l e Bt l76 que expressam a proteiacutena CrylAb no controle deste
crambiacutedeo utilizando populaccedilotildees selecionadas em laboratorio para a resistecircncia agrave
formulaccedilatildeo comercial Bt Os tratamentos foram compostos dos milhos modificados
e respectivos hiacutebridos convencionais A infestaccedilatildeo artificial de Ostrinia nubialis foi
efetuada nos estaacutedios de 8 a 11 folhas colocando-se 30 lagartas receacutem-eclodidas no
cartucho das plantas Os resultados indicaram que os milhos geneticamente
modificados apresentaram diferentes padrotildees de resistecircncia quanto ao dano nas
folhas e colmo bem como na sobrevivecircncia das lagartas Os milhos MON810 e
B t l l mostraram-se mais consistentes quanto ao padratildeo de resistecircncia protegendo as
folhas e colmos das plantas e determinando baixiacutessima sobrevivecircncia dos insetos
inclusive da populaccedilatildeo mais resistente
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Ensaios de campo foram conduzidos em 1997 e 1998 para avaliar a eficiecircncia
dos milhos MON810 MON802 B t l l e Btl76 (proteiacutena OylAb) DBT418
(proteiacutena CRylAc) e CHB351 (proteiacutena CRy9c) no controle de lagartas de Ostrinia
nubialis no terceiro quarto e quinto instares em diferentes estaacutedios fenoloacutegicos do
milho (WALKER et al 2000) Infestaccedilotildees artificiais foram efetuadas colocando-se
manualmente duas lagartas dos diferentes instares em distintos estaacutedios fenoloacutegicos
da planta Os resultados indicaram que os distintos milhos apresentaram diferentes
padrotildees de proteccedilatildeo da planta aacutes infestaccedilotildees e danos da praga Os milhos MON810
MON802 B t l l e CHB351 foram eficientes no controle das lagartas em todos os
instares O milho CHB351 natildeo apresentou eficiecircncia no controle das lagartas tanto
na fase vegetativa quanto reprodutiva da cultura Os autores concluiacuteram que a
expressatildeo da proteiacutena ao longo do desenvolvimento fonoloacutegico da planta pode
determinar maior ou menor controle da praga
Hiacutebridos de milhos doce geneticamente modifiacutecados como milho B t l l
(proteiacutena CrylAb) foram testados em campo para a avaliaccedilatildeo da eficiecircncia no
controle de Ostrinia nubialis Heliothis zea e Spodotera frugiperda Os dados
obtidos indicaram que o milho BTl 1 proporcionou consistente padratildeo de resistecircncia
independente do complexo de pragas densidade da praga e localizaccedilatildeo geograacutefica
(BURKNESS et al 2002)
32- Detecccedilatildeo de organismos genet icamente modificados em
alimentos
A detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pode ser baseada na
presenccedila de proteiacutenas especiacuteficas As novas proteiacutenas que as plantas geneticamente
modificadas expressam podem ser detectadas por meacutetodos quiacutemicos ou
imunoloacutegicos quer qualitativa quer quantitativamente A detecccedilatildeo quiacutemica de
16
proteiacutenas transgecircnicas pode ser realizada utilizando cromatografiacutea gasosa com
detecccedilatildeo por espectrometria de massa (GC-MS) cromatografia liacutequida de alta
resoluccedilatildeo (HPLC) ou eletroforese capilar (CE) (PlETSCH amp WAIBLINGER 2001)
Os organismos geneticamente modificados tambeacutem podem ser detectados
imunologicamente Neste caso as proteiacutenas expressas podem ser detectadas nas
mateacuterias primas e em alguns alimentos processados usando imunoensaios Western
Blot ou ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) No caso do Western Blot a
proteiacutena eacute extraiacuteda da amostra eacute imobilizada numa membrana As proteiacutenas ligadas agrave
membrana satildeo imersas numa soluccedilatildeo contendo um anticorpo que reconhece a
proteiacutena alvo O anticorpo liga-se a uma enzima que catalisa a formaccedilatildeo de um
composto corado cuja intensidade de cor eacute proporcional agrave quantidade de proteiacutena
Por exemplo a proteiacutena CP4 EPSPS expressa pela soja Roundup-Ready que confere
toleracircncia ao herbicida Roundup (ROGAN et al 1999)
Nos ensaios de ELISA utiliza-se o mesmo princiacutepio mas o anticorpo estaacute
ligado ao plaacutestico dos poccedilos das microplacas em vez de se ligar a membranas Um
meacutetodo para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de soja geneticamente modificada em
alimentos e fraccedilotildees alimentares usando materiais de referecircncia foi validado atraveacutes
de um ensaio inter-laboratorial agrave escala europeacuteia coordenado pela AACC
(American Association of Cereal Chemists Inc) para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de
milho MON8I0 que expressa a proteiacutena insecticida CrylAb de Bacillus
thuringiensis (Bt) por um kit ELISA (LiPP et ai 2000)
Em relaccedilatildeo aos testes imunoloacutegicos aleacutem dos jaacute mencionados existe ainda a
possibilidade de se utilizar testes raacutepidos em tira strip tests que jaacute estatildeo sendo
comercializados e que podem ser realizados por exemplo no local da colheita do
cereal ou num silo Estes testes satildeo faacuteceis de utilizar natildeo satildeo dispendiosos e
17
permitindo assim tomar decisotildees raacutepidas (STAVE amp DURANDEUA 2 0 0 0
ILSIAACC 2 0 0 2 )
Em qualquer dos casos o niacutevel de expressatildeo das proteiacutenas eacute o fator limitante
para a utilizaccedilatildeo destes meacutetodos mas segundo Stave as proteiacutenas transgecircnicas estatildeo
dentro do limite de detecccedilatildeo dos imunoensaios (STAVE 1 9 9 9 ) Nas anaacutelises
baseadas na detecccedilatildeo de proteiacutenas haacute ainda que ter em conta que uma proteiacutena
transgecircnica pode natildeo ser expressa ou ainda ser expressa em niacuteveis muito baixos
pelas partes da planta que satildeo utilizadas em produtos alimentiacutecios Aleacutem disso
algumas sequumlecircncias de DNA introduzidas em cultivares natildeo expressam proteiacutenas
como nos casos jaacute descritos na literatura de uma variedade de batata e uma
variedade de tomate (MEYER 1 9 9 5 )
33 - Detecccedilatildeo baseada na presenccedila de D N A
Nas amostras em que existe DNA geneticamente modificado todo o DNA
exoacutegeno eacute em princiacutepio suscetiacutevel de ser detectado ou seja sequumlecircncias de
promotores genes de interesse introduzidos sinais de terminaccedilatildeo e genes
marcadores usados para seleccedilatildeo das plantas modificadas em laboratoacuterio Na Uniatildeo
Europeacuteia apesar da legislaccedilatildeo permitir que a detecccedilatildeo seja baseada na presenccedila de
proteiacutenas ou DNA o DNA foi a moleacutecula eleita para a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modificados A teacutecnica utilizada nos laboratoacuterios para a detecccedilatildeo do
DNA eacute a PCR (WlTTWER 2 0 0 1 )
A extraccedilatildeo de DNA para anaacutelise de gecircneros alimentiacutecios e ingredientes
alimentares geneticamente modificados eacute um ponto criacutetico para todos os passos
analiacuteticos subsequentes tanto para a detecccedilatildeo qualitativa como para a anaacutelise
quantitativa Numerosos meacutetodos de extraccedilatildeo jaacute foram testados Estes meacutetodos vatildeo
desde kits de extraccedilatildeo comercializados a meacutetodos claacutessicos com maiores ou
[g
menores alteraccedilotildees conforme o grau de processamento das amostras (ZIMMERMANN
et a 1998) Tendo em conta que a reaccedilatildeo da PCR pode ser inibida por substacircncias
contidas num alimento como lipiacutedios aacutecidos graxos polissacariacutedeos entre outros a
escolha de controles de qualidade eacute determinante para se evitarem falsos negativos
este controle pode ser realizado por amplificaccedilatildeo com primers universais para
plastos vegetais ou especiacuteficos para o gene da invertase (IVR) no milho ou o gene da
lecitina na soja (TABERLET et ai 1991)
Existem diferentes protocolos aprovados na Europa para diferentes cultivares
de acordo com a Diretiva 90220CEE Assim a possibilidade de implementaccedilatildeo de
um meacutetodo de rastreio que permita a detecccedilatildeo destas plantas independentemente da
variedade utilizada eacute muito importante para as autoridades de controle Em 1997 foi
publicado um meacutetodo baseado na detecccedilatildeo de duas sequumlecircncias reguladoras
existentes em 26 plantas transgecircnicas (LlPP et ai 1999) Estas sequumlecircncias contecircm
fragmentos do promotor 35S CaMV (retirado do viacuterus do mosaico da couve flor) e
do terminador NOS proveniente do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium
tumefaciens Na Europa meacutetodos de detecccedilatildeo qualitativos para rastreio jaacute foram
validados por cinco ensaios inter-laboratoriais dois organizados pelo Joint Research
Centre - JRC Commission of the European Union Institute for Health and
Consumer Protection dois sob a coordenaccedilatildeo do projeto Europeu DMIF-GEN -
^Development of methods to indentify foods e um sob a coordenaccedilatildeo
Bundesinstitut fuumlr gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinaumlrmedizin -
BgVV(LlPP et al 2000)
Devido aacute necessidade de identificar variedades especiacuteficas de plantas
geneticamente modificadas foram desenvolvidos meacutetodos que permitem aos
laboratoacuterios de controle realizar reaccedilotildees da PCR com primers especiacuteficos para
diferentes organismos geneticamente modifiacutecados A anaacutelise qualitativa daacute uma
indicaccedilatildeo sobre a presenccedila de um organismo geneticamente modificado autorizado
19
mas para responder agrave necessidade de romlagem eacute necessaacuterio um teste quantitativo
subsequente A rotulagem eacute necessaacuteria se for possiacutevel demonstrar ao niacutevel do
ingrediente que estaacute presente mais do que 1 de OGM autorizado (PlETSCH amp
WAIBLINGER 2001)
Um meacutetodo da PCR quantitativa competitiva (QC-PCR) jaacute foi testado para
anaacutelise de alimentos e mateacuterias primas Este meacutetodo baseia-se na co-amplifiacutecaccedilatildeo
no mesmo tubo de reaccedilatildeo do DNA padratildeo e do DNA alvo O DNA padratildeo consiste
num plasmiacutedio linearizado contendo fragmentos da PCR de um produto
geneticamente modificado Depois da reaccedilatildeo da PCR os produtos satildeo separados em
um gel de agarose sendo o DNA padratildeo diferenciaacutevel do DNA alvo pelo tamanho do
fragmento obtido Se os criteacuterios de validaccedilatildeo forem atingidos no ponto de
equivalecircncia as concentraccedilotildees do padratildeo interno e do DNA alvo seratildeo iguais Com
este meacutetodo natildeo se obtecircm correlaccedilotildees lineares entre amostras de concentraccedilotildees
conhecidas mas um conjunto de pontos de calibraccedilatildeo com os quais as amostras
desconhecidas satildeo comparadas daiacute que seja muitas vezes considerado um meacutetodo
semi-quantitativo (LAUTER 2000)
Aleacutem de muito trabalhoso este meacutetodo eacute baseado na comparaccedilatildeo visual ou
instrumental de bandas as quais satildeo por vezes difiacuteceis de avaliar (VAN D E N EDEC et
al 2000) Convencionalmente a anaacutelise de produtos da PCR eacute um passo separado
que ocorre depois da reaccedilatildeo da PCR estar concluiacuteda A eletroforese em gel de
agarose eacute nesse caso utilizada para verificar o tamanho e pureza dos produtos
obtidos A teacutecnica de anaacutelise dos produtos de PCR durante a amplificaccedilatildeo tomou-se
conhecida como PCR em tempo real (PCR Real Time) A forma mais simples de
monitorar a PCR durante a amplificaccedilatildeo eacute utilizando fluorescecircncia Se
representando a fluorescecircncia versus o nuacutemero de ciclos a acumulaccedilatildeo de produtos
de PCR pode ser visualizada numa curva de crescimento semelhante a uma curva
de crescimento de urna bacteacuteria Monitorar a fluorescecircncia durante cada ciclo eacute uma
20
forma muito adequada de quamificar o nuacutemero de coacutepias obtidas Muitas coacutepias do
DNA molde deslocam a curva para a zona com nuacutemero baixo de ciclos poucas
coacutepias deslocam a curva para o outro lado A quantificaccedilatildeo do DNA alvo eacute realizada
medindo a fluorescecircncia na fase linear logariacutetmica A maioria das aplicaccedilotildees da
PCR em tempo real requerem unicamente um corante para cadeia dupla de DNA
Contudo algumas aplicaccedilotildees requerem uma maior especificidade podendo nesses
casos ser utilizadas sondas marcadas com fluorescecircncia para monitorizar a PCR
Essas sondas podem ser de hidroacutelise TaqMan ou de hibridizaccedilatildeo Foram
publicados recentemente meacutetodos para quantificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados em alimentos e ingredientes alimentares com soja Roundup Ready e
milho Btl 76 utilizando a PCR em tempo real (WITTWER 2001)
Jaacute foram realizados na Europa ensaios inter laboratoriais para PCR
competitivo relacionada a soja e amostras comerciais contendo soja sob a
coordenaccedilatildeo do projeto JRC e sob a coordenaccedilatildeo do BgVV Da anaacutelise dos
resultados destes meacutetodos quantitativos verifica-se que satildeo necessaacuterios mais dados
para desenvolver e validar os meacutetodos com niacuteveis elevados de precisatildeo e exatidatildeo
Nesta aacuterea as duacutevidas estatildeo ainda nas diferenccedilas existentes ou natildeo entre os
diferentes equipamentos disponiacuteveis no mercado nos paracircmetros de validaccedilatildeo
controle de qualidade analiacutetico para certificaccedilatildeo dos meacutetodos assim como no tipo de
material de referecircncia utilizado para realizar as curvas de calibraccedilatildeo (LAUTER
2000)
34 - A rotulagem dos geneticamente modificados
A rotulagem dos alimentos estaacute prevista no Coacutedigo de Defesa do Consumidor
(Lei ndeg 8078 de 110990 _ an 6deg Ill e art 8deg) Trata-se de uma norma para
garantir ao cidadatildeo a informaccedilatildeo sobre um produto permitindo-lhe o direito de
21
escolha Aleacutem disso ela possibilita a rastfeabilidade pois em casos de efeitos na
sauacutede humana os produtos rotulados seriam facilmente identificados e recolhidos
No Brasil a fiscalizaccedilatildeo sobre a romlagem estaacute a cargo da Vigilacircncia Sanitaacuteria
Contudo a decisatildeo e mesmo o conteuacutedo e outras caracteriacutesticas do roacutemlo estatildeo no
acircmbito do Ministeacuterio da Justiccedila O IDEC estaacute representando os consumidores nesta
rodada de negociaccedilotildees e fez sugestotildees para aparecer no roacutetulo natildeo soacute a expressatildeo
produto transgecircnico mas tambeacutem a caracteriacutestica e o nome do organismo doador
do gene Eacute esperado ainda que o paiacutes normatize em breve a rotulagem dos produtos
transgecircnicos ou que contenham ingredientes derivados de organismos geneticamente
modificados ( M O M M A 1999)
Internacionalmente existe um Grupo de Trabalho de Rotulagem que foi
encarregado de preparar uma versatildeo preliminar a ser discutida na reuniatildeo do Codex
Alimentarius Levando-se em consideraccedilatildeo o ocorrido na Conferecircncia de Partes da
CDB - Convenccedilatildeo sobre Diversidade Bioloacutegica pode ser que as normas
internacionais de rotulagem dos alimentos transgecircnicos ou com ingredientes de
OGM sejam aprovadas em uma das proacuteximas reuniotildees do Codex As plantas
transgecircnicas aprovadas para o cultivo comercial nos EUA tiveram sua liberaccedilatildeo
baseada no princiacutepio da equivalecircncia substancial Assim a soja RR foi considerada
equivalente agrave sua antecedente namral a soja convencional porque natildeo difere desta
nos aspectos cor textura teor de oacuteleo composiccedilatildeo e teor de aminoaacutecidos essenciais
e em nenhuma outra qualidade bioquiacutemica Desta forma natildeo foram submetidas agrave
rotulagem pela agecircncia americana Food and Drug Administration (FDA)
encarregada de sua liberaccedilatildeo (NODARi amp GUERRA 2003)
Este conceito de equivalecircncia substancial tem sido alvo de criacuteticas porque
entre outras razotildees a falta de criteacuterios mais rigorosos pode ser uacutetil agrave induacutestria mas eacute
inaceitaacutevel do ponto de vista do consumidor e da sauacutede puacuteblica (MILLSTONE et ai
1999) Equivalecircncia significa dispor de igual valor ou outro atributo normalmente
expresso em unidades ou paracircmetros um grama do produto Y equivale a X energia
77
Ela se refere sempre agrave quantidade ou algo mensuraacutevel a que corresponde um sentido
tecnicamente comparaacutevel (MOMMA 1999) Haacute portanto dificuldades praacuteticas no
conceito de equivalecircncia entre plantas engenheiradas e naturais ou obtidas por
teacutecnicas convencionais de melhoramento geneacutetico pois a rigor genomicamente
elas natildeo satildeo equivalentes nem iguais Soacute seriam iguais se uma fosse originaacuteria da
outra por multiplicaccedilatildeo vegetativa ou micropropagaccedilatildeo A construccedilatildeo geneacutetica
inserida na planta conteacutem elementos bastante distintos daqueles naturais encontrados
nela proporcionando novos produtos gecircnicos e podendo desencadear efeitos
pleiotroacutepicos substanciais e natildeo podem por isso ser considerados despreziacuteveis
(GACHET 1999)
Esta estrateacutegia (equivalecircncia substancial) foi introduzida na deacutecada passada
para evitar que as induacutestrias tivessem custos maiores com testes de longa duraccedilatildeo
como ocorreu na aacuterea farmacoloacutegica Quando se utiliza a equivalecircncia substancial
nenhum teste eacute requerido para excluir a presenccedila de toxinas prejudiciais
carcinogecircnicas e ou mutagecircnicas Este princiacutepio eacute equivocado e deveria ser
abandonado em favor de testes bioloacutegicos toxicoloacutegicos e imunoloacutegicos mais
aprofundados e eficazes (GUERRA amp NODARi 2 0 0 1 ) O procedimento em si natildeo tem
base cientiacutefica
Desta forma o FDA exige apenas testes de curta duraccedilatildeo com animais e
testes bioquiacutemicos para avaliar entre outros aspectos a alergenicidade Esta
insuficiecircncia de dados que natildeo consegue subsidiar cientificamente a anaacutelise da
seguranccedila alimentar estaacute sendo questionada por vaacuterias organizaccedilotildees civis
americanas (WILLIAMS 1 9 9 7 )
23
35 - O desenvolv imento da irradiaccedilatildeo de a l imentos
O primeiro documento na aacuterea sobre essa tecnologia data de 1905 quando
no Reino Unido J Aplleby e A J Banks patentearam-na sob n- 1609 Na aacuterea
alimenticia o emprego da irradiaccedilatildeo ionizante foi proposto considerando aspectos
da conservaccedilatildeo dos alimentos principalmente cereais e seus produtos com raios
alfa beta e gama provenientes de raacutedio ou outras substacircncias radioativas O fato de
seu emprego tomar desnecessaacuterio o uso de substacircncias quiacutemicas na conservaccedilatildeo de
alimentos foi considerado marcante na nova tecnologia Entretanto as preparaccedilotildees
com raacutedio sugeridas como fonte de radiaccedilatildeo natildeo existiam em quantidade suficiente
para a irradiaccedilatildeo comercial de alimentos Em 1920 quinze anos apoacutes essa primeira
investida Scwartz do United State Department of Egiculture (USDA) Bureau of
Animal Industry sugeriu o uso de raio-X para inativar o parasita Trichinella
trichinae em came de porco Entretanto persistia o problema de insuficiecircncia de
material para ser usado como fonte na irradiaccedilatildeo comercial de alimento (DiEHL
1990)
Somente nos anos 40 apoacutes a Segunda Guerra Mundial essas fontes
tomaram-se viaacuteveis sendo possiacutevel reduzir os custos do processo Mas a ideacuteia de se
utilizar a radiaccedilatildeo para o tratamento de alimentos jaacute natildeo era nova Jaacute em 1930 na
Franccedila Wuumlrst patenteou uma invenccedilatildeo assim descrita por ele Todos os alimentos
acondicionados em embalagens metaacutelicas satildeo submetidos agrave accedilatildeo de raios X (alta
voltagem) para destmir bacteacuterias Entretanto a patente nunca foi colocada em
praacutetica provavelmente devido agrave indisponibilidade de grandes fontes de radiaccedilatildeo que
viabilizassem comercialmente o processo Em 1947 o interesse pelo assunto voltou
agrave tona graccedilas agrave uma publicaccedilatildeo sobre o tema de Brasch e Huber (1947) coshy
inventores de um acelerador de eleacutetrons pulsante o Capacitron Para eles as cames
e outros produtos alimentiacutecios poderiam ser esterilizados por pulsos de eleacutetrons de
alta energia enquanto em outros produtos como leite e seus derivados o
2 4
desenvolvimento de sabores e aromas estranhos impedia o seu uso Jaacute nessa eacutepoca
foi sugerida a retirada do oxigecircnio da embalagem para minimizar o problema Esses
pesquisadores foram mais aleacutem ao considerarem o paracircmetro custo - benefiacutecio a
irradiaccedilatildeo natildeo elevaraacute o preccedilo fiacutenal do produto (BRASCH e HUBER 1947)
Enquanto isso outros estudos foram desenvolvidos nos Estados Unidos pelo
Massachusens Instimte of Technology (MIT) Estas pesquisas serviram como base
para a revisatildeo sobre o tema realizado por Proctor e Goldblith (1951) que concluiacuteram
que a irradiaccedilatildeo com neutrons produz radioatividade no alimento O uso de raios
ultravioleta (UV) e partiacuteculas alfa foi descartado devido ao baixo poder de
penetraccedilatildeo e os raios X em consequumlecircncia da baixa efiacuteciecircncia das maacutequinas
geradoras Portanto sobraram apenas os aceleradores de eleacutetrons entatildeo
denominados raios catoacutedicos Os raios gama de isoacutetopos radioativos natildeo chegaram a
ser mencionados provavelmente porque natildeo havia isoacutetopos adequados como ^^Co e
bull^Cs em quantidade comercial Foi nessa eacutepoca que nos Estados Unidos o
Programa Atomns for Peace sob a coordenaccedilatildeo da United States Atomic Energy
Commission (USAEC) atual Atomic Energy Department fiacutenanciou diversas
pesquisas com raios gama nas universidades americanas Primeiramente esses raios
eram fornecidos por combustiacutevel exaurido de reatores nucleares Mas por
problemas relacionados com a dosimetriacutea as instituiccedilotildees acadecircmicas passaram a ser
supridas com fontes de ^degCo Entre elas na deacutecada de 50 podem ser citados o MIT
University of California Davis University of Washington Seattle e mais
recentemente nos anos 60 a University of Florida Gainesville (DiEHL 1990)
No Reino Unido jaacute no iniacutecio da deacutecada de 50 pesquisas eram iniciadas e
incentivadas a partir do sucesso dos experimentos nos Estados Unidos e outros
paiacuteses que tambeacutem comeccedilaram a estudar o tema Neste periacuteodo as pesquisas
estavam sendo realizadas no Low Temperature Research Station em Cambridge e no
Wantage Research Laboratory do Atomic Energy Research Establishment
25
Concomitantemente programas de acircmbito nacional sobre a irradiaccedilatildeo de alimentos
estavam em andamento na Beacutelgica Canadaacute Franccedila e Holanda O primeiro relato do
uso comercial da irradiaccedilatildeo de alimentos data de 1957 Na antiga Repuacuteblica Federal
da Alemanha o processo foi utilizado durante dois anos para melhorar a qualidade
higiecircnica de especiarias com o emprego de um gerador de eleacutetrons Van der Graaf
No entanto uma nova legislaccedilatildeo proibiu o tratamento de alimentos por esta
tecnologia Em 1960 no Canadaacute a irradiaccedilatildeo de batatas foi permitida para impedir a
germinaccedilatildeo Utilizava-se uma fonte de ^degCo desenhada para processar
aproximadamente 15000 toneladasmecircs A faacutebrica funcionou durante uma safra
fechando por motivos econocircmicos em seguida (MASEFELD e DIETZ 1983)
Em 1966 do esforccedilo e dedicaccedilatildeo de um grupo de professores da Escola
Superior Luiz de Queiroz da Universidade de Satildeo Paulo surge o CENA - Centro de
Energia Nuclear na Agricultura uma instituiccedilatildeo pioneira na Ameacuterica Latina Ainda
em 1966 realizou-se em Karlsruhe Alemanha o Primeiro Simpoacutesio Internacional
sobre Irradiaccedilatildeo de Alimentos organizado pela International Atomic Energy
Agency (AIEA) no qual representantes de 28 paiacuteses revisaram as pesquisas
realizadas Poreacutem mesmo nos paiacuteses com pesquisas mais avanccediladas as autoridades
responsaacuteveis pela sauacutede puacuteblica ainda hesitavam na liberaccedilatildeo da comercializaccedilatildeo
dos alimentos irradiados Nessa eacutepoca apesar de Canadaacute Estados Unidos e a antiga
Uniatildeo Sovieacutetica terem liberado cinco produtos alimentiacutecios tratados com radiaccedilatildeo
nenhum deles era comercializado (GOLDBLITH 1966)
No Brasil a irradiaccedilatildeo de alimentos comeccedila a se intensificar durante a
deacutecada de 70 Em 1974 o Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares instala no
Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees um acelerador de eleacutetrons de 15 MeV para
aplicaccedilotildees industriais E em 1975 cria-se um convecircnio com a Universidade de Satildeo
Paulo para implantaccedilatildeo de cursos de poacutes-graduaccedilatildeo no instituto Com o passar dos
anos o CENA cresce e desenvolve divisotildees cientiacuteficas voltadas a irradiaccedilatildeo de
26
alimentos e radioentomologia (IPEN 2004 CENA 2004) As deacutecadas de 70 e 80
foram dedicadas agraves pesquisas toxicoloacutegicas para comprovar a inocuidade dos
alimentos irradiados uma vez que esse era o aspecto mais questionado Os projetos
foram desenvolvidos em 24 paiacuteses sob a coordenaccedilatildeo de um Comiteacute formado pela
International Atomic Energv Agency (lAEAViena) Food Agriculture Organization
(FAORoma) e Organization for Economic Cooperation (OECParis) e teve como
oacutergatildeo consultivo a Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede (OMS) Apoacutes intensivos estudos
que envolveram aleacutem de testes quiacutemicos experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados o Comitecirc concluiu em novembro de 1980 que a
exposiccedilatildeo de qualquer produto alimentiacutecio a doses de ateacute 10 kGgt natildeo apresenta
perigo toxicoloacutegico portanto testes toxicoloacutegicos com alimentos assim tratados natildeo
satildeo mais necessaacuterios (WHO 1981)
Nos Estados Unidos esse processo eacute considerado um aditivo alimentiacutecio o
seu uso em qualquer produto soacute eacute aprovado pela Food and Drug Administration
(FDA) apoacutes exaustivos estudos quanto a seguranccedila radioloacutegica toxicoloacutegica e
microbioloacutegica aleacutem dos aspectos nutricional e legal (Pauli e Tarantino 1995)
Atualmente o FDA jaacute considera aprovada a irradiaccedilatildeo de condimentos e especiarias
secas de came suiacutena para controle de Trichinella trichinae de frutas e vegetais para
controle de insetos e amadurecimento de fmtas e em aves para eliminar bacteacuterias
principalmente Salmonella (PAULI e TARANTINO 1995 DERR 1996)
Desde a aprovaccedilatildeo em 1980 pelo Comitecirc formado pela FAOIAEAOMS o
nuacutemero de paiacuteses com regulamentaccedilatildeo sobre o emprego desse processo tem
aumentado e dos mais de 40 que jaacute o aprovaram 30 o utilizam para fms comerciais
(IAEA 2001)
Um impulso foi dado ao emprego da irradiaccedilatildeo de alimentos na deacutecada de 90
nos Estados Unidos devido a surtos de doenccedilas transmitidas por alimentos - DTAs
causados por Escherichia coli 0157H7 considerados desastrosos para a induacutestria
de came Com a aprovaccedilatildeo da irradiaccedilatildeo de cames vermelhas pelo FDA em 1997 e
pelo USDA em 1999 o interesse por essa tecnologia aumentou ainda mais (FDA
1997 USDA 1999) Jaacute em 1996 foi solicitado junto ao FDA a regulamentaccedilatildeo do
uso em ovos e fmtos do mar principalmente ostras (DERR 1996) mas ainda natildeo
aprovada
No Brasil a primeira legislaccedilatildeo sobre o emprego da radiaccedilatildeo ionizante como
processo de conservaccedilatildeo foi estabelecida atraveacutes de Decreto-Lei nuacutemero 72718 de
29 de agosto de 1973 As portarias nuacutemero 9 de marccedilo de 1985 e nuacutemero 30 de 25
de setembro de 1989 aprovadas posteriormente pela Divisatildeo de Vigilacircncia Sanitaacuteria
de Alimentos foram revogadas pela Resoluccedilatildeo RDC nuacutemero 21 de 26 de janeiro de
2001 da Agecircncia Nacional de Vigilacircncia Sanitaacuteria (ANVISA 2001)
Essa legislaccedilatildeo eacute considerada a mais avanccedilada na aacuterea intemacionalmente
Tendo como base as conclusotildees a que chegou o gmpo de estudo formado pela
FAOIAEAWHO (WHO 2001) a legislaccedilatildeo brasileira aprova o uso da radiaccedilatildeo em
qualquer alimento com qualquer dose desde que sejam observadas as seguintes
condiccedilotildees
a- A dose miacutenima absorvida deve ser suficiente para alcanccedilar a finalidade
pretendida
b- A dose miacutenima absorvida deve ser inferior agravequela que comprometa as
propriedades funcionais eou atributos sensoriais dos alimentos
c- A embalagem deve ter condiccedilotildees higiecircnicas aceitaacuteveis para o processo de
irradiaccedilatildeo e
d- O roacutetulo do produto deve conter os dizeres bullAlimento Tratado por
Radiaccedilatildeo
Atualmente no Brasil existem apenas duas companhias responsaacuteveis em
irradiar produtos em escala industrial a EMBRRAD - Empresa Brasileira de
Radiaccedilotildees e a CBE - Companhia Brasileira de Esterilizaccedilatildeo que utilizam o cobalto-
60 como fonte de energia Localizada em Cotia a EMBRARAD tem atualmente 50
ntildemcionaacutenos e cerca de 400 clientes no Pais Desse nuacutemero 58 da receita eacute gerada
na irradiaccedilatildeo de material meacutedico-ciruacutergico 12 de fitoteraacutepico e ervas e 10 de
cosmeacutetico Em 2002 a Embrarad faturou cerca de R$ 48 milhotildees o que representa
uma receita seis vezes maior se comparada agrave de 1980 ano de sua inauguraccedilatildeo Jaacute a
CBE foi fundada em 1999 e deteacutem tecnologia 100 nacional Localizada em Jarmu
mterior paulista a empresa tem 40 funcionaacuterios e um parque industrial mais
moderno (Clippmg IPEN 2005) Em 2004 o Centro de Tecnologia das Radiaccedilotildees -
CTR do Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares - IPEN inaugurou o terceiro
uradiador comercial em funcionamento no pais (figura 7) O equipamento do IPEN
com tecnologia 100 nacional tambeacutem utiliza como fonte o Co entretanto possui
dimensotildees menores sendo considerado um equipamento multipropoacutesito de caraacuteter
semi-mdustnal (RELA ei al 2005)
Figura 7 Irradiador semi-industrial multipropoacutesito do Centro de Tecnologia das
Radiaccedilotildees -CTR do IPENCNEN em Satildeo Paulo
29
36 - Uso da irradiaccedilatildeo de aumentos
Ficou estabelecido em um dos relatoacuterios do Comitecirc Conjunto de Peritos da
FAOWHO (Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede) que a proliferaccedilatildeo de doenccedilas
provocadas por alimentos contaminados eacute talvez o problema de sauacutede mais
difundido no mundo contemporacircneo e uma importante causa de produtividade
econocircmica baixa Aleacutem disso um grande nuacutemero de alimentos tais como came
bovina e de peixe frutos do mar pemas de ratilde e especiarias satildeo frequumlentemente
rejeitados por paiacuteses importadores sob alegaccedilatildeo de qualidade higiecircnica deficiente
incluindo contaminaccedilatildeo com microorganismos patogecircnicos A magnitude da perda
econocircmica devida a doenccedilas transmitidas por alimentos contaminados com
organismos patogecircnicos e sua rejeiccedilatildeo pode ser grande e muito embaraccedilosa para o
comeacutercio intemacional (lAEA 1 9 8 6 )
Uma das mais recentes soluccedilotildees para este problema eacute o tratamento com
radiaccedilotildees ionizantes A exposiccedilatildeo dos alimentos agrave radiaccedilatildeo dependendo do produto
e da dose empregada inibe o brotamento retarda o amadurecimento e destroacutei ou
reduz para niacuteveis aceitaacuteveis bacteacuterias parasitas fungos viacutems e insetos que
deterioram o produto e podem provocar doenccedilas O processo eacute raacutepido e seguro Se
utilizado dentro dos limites permitidos pela legislaccedilatildeo natildeo aumenta a temperamra
natildeo deixa resiacuteduos toacutexicos natildeo altera significativamente o aspecto o sabor e as
qualidades nutritivas dos alimentos deixando-os o mais perto possiacutevel do seu estado
natural Os custos tambeacutem satildeo comparaacuteveis aos processos tradicionais de tratamento
(URBAIN 1 9 8 6 VILLAVICENCIO et ai 2 0 0 0 )
Em doses e condiccedilotildees adequadas da radiaccedilatildeo quase todos os alimentos
podem ser irradiados desde gratildeos ateacute aqueles com alto teor proteico tais como
derivados do leite e carnes frutas e verduras frescas Apoacutes a irradiaccedilatildeo os alimentos
3 0
dispensam maiores cuidados sendo eficientemente embalados para evitar uma
reinfestaccedilatildeo (AQUINO 2003)
O tratamento com radiaccedilotildees ionizantes pode ser usado de forma independente
ou combinado agraves teacutecnicas jaacute existentes tais como secagem fermentaccedilatildeo tratamento
quiacutemico tratamento pelo calor conservaccedilatildeo a baixas temperaturas ou em atmosferas
modificadas (ROSSI amp JESUS 1994) Uma grande vantagem do processo de
irradiaccedilatildeo eacute que ele permite a diminuiccedilatildeo do uso de produtos quiacutemicos usados como
conservantes e antibioacuteticos em alimentos Existem pelo menos 35 mil marcas de
pesticidas comercializados sob 15 mil formas diferentes que levam para a industria
quiacutemica mais de 20 milhotildees de doacutelaresano Essas substacircncias provocam anualmente
500 mil intoxicaccedilotildees e matam cerca de 15 mil pessoas nos paiacuteses do terceiro mundo
aleacutem de provocar crises aleacutergicas destruir a camada de ozocircnio e possuir em alguns
casos propriedades canceriacutegenas (lAEA 2001)
Baseadas em estudos de especialistas sobre efeitos das radiaccedilotildees ionizantes
em alimentos a Comissatildeo de Especialistas em Irradiaccedilatildeo de Alimentos da
FAOIAEAAVHO (lAEA - Agecircncia Internacional de Energia Atocircmica) definiu os
tipos de radiaccedilatildeo e energias a serem utilizadas no tratamento de alimentos raios
gama dos radionucliacutedeos Co ou ^^Cs com energias meacutedias de l25MeV e
066MeV respectivamente raios-X com energia maacutexima de 5MeV e feixe de
eleacutetrons com energia maacutexima de lOMeV Estes valores de energias estatildeo muito
abaixo daqueles capazes de induzir radioatividade mensuraacutevel em qualquer material
incluindo os alimentos Para cada tipo de alimento e de tratamento eacute definida uma
dose meacutedia ou maacutexima apropriada de radiaccedilatildeo (Villavicencio 1998) As radiaccedilotildees
gama de grande penetrabilidade satildeo utilizadas na irradiaccedilatildeo de produtos de grande
espessura Os eleacutetrons que possuem pequena penetraccedilatildeo (apenas alguns miliacutemetros)
satildeo usados para a irradiaccedilatildeo superficial de alimentos ou para produtos a granel de
31
37- Aplicaccedilatildeo das irradiaccedilotildees em gratildeos
Tendo em vista os elevados danos causados aos gratildeos e produtos
armazenados pelos insetos toma-se necessaacuterio por em praacutetica meios de controle a
fim de se evitar os prejuiacutezos Um dos meacutetodos mais utilizados eacute a aplicaccedilatildeo de
produtos quiacutemicos que apresenta vaacuterios inconvenientes entre eles a possibilidade
de causar intoxicaccedilatildeo ao consumidor por deixar resiacuteduos nos alimentos tratados Por
ser um meacutetodo livre de resiacuteduos para o controle de pragas o tratamento com
radiaccedilatildeo eacute um substituto viaacutevel agrave fumigaccedilatildeo para satisfazer os regulamentos
quarentenaacuterios de vaacuterios paiacuteses (DUARTE e ARTHUR 1994)
O principal interesse na irradiaccedilatildeo de gratildeos e derivados eacute o de controlar a
infestaccedilatildeo Insetos ou fragmentos de insetos presentes em alimentos comprometem a
qualidade constituindo um fator de rejeiccedilatildeo pelos consumidores A proacutepria
atividade metaboacutelica dos insetos auxilia na formaccedilatildeo de substratos adequados agrave
contaminaccedilatildeo com microorganismos o que acarreta mais perdas e reduccedilatildeo no valor
nutritivo dos alimentos O termo usado para designar a irradiaccedilatildeo de alimentos para
controlar insetos eacute desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo (BRIGIacuteDE 2002)
fina espessura Irradiadores com fontes de ^Co satildeo os mais utilizados atualmente
para o processamento de alimentos (lAEA 2001)
Cabe obserar que a legislaccedilatildeo intemacional afirma que a irradiaccedilatildeo deve ser
usada em alimentos de boa qualidade visando reduzir a deterioraccedilatildeo posterior dos
produtos e controlar a infestaccedilatildeo e a contaminaccedilatildeo por microorganismos mas nem a
irradiaccedilatildeo nem outros meacutetodos podem tomar um alimentos deteriorado apto para o
consumo (VILLAVICENCIO 1 9 9 8 )
32
Para que a desinfestaccedilatildeo por irradiaccedilatildeo possa proocar completa letalidade
dos insetos num periacuteodo de 24 horas como eacute possiacutevel atraveacutes do uso de pesticidas
tradicionais doses de 3 a 5 kGy seriam necessaacuterias Entretanto este niacutevel de dose
produz alteraccedilotildees na cor aroma e sabor e provoca modificaccedilotildees nos seus nutrientes
Farinha de milho por exemplo quando utilizadas para a fabricaccedilatildeo alimentos
devem possuir certas caracteriacutesticas reoloacutegicas miacutenimas para permitir o adequado
desenvolvimento da receita que dependem muitas vezes de componentes
especiacuteficos do amido e das proteiacutenas Altas doses podem afetar essas propriedades
funcionais e natildeo devem portanto ser usadas em alguns gratildeos e seus derivados
(URBAIN 1 9 8 6 ) Aleacutem da farinha outras partes isoladas dos gratildeos como farelo e
geacutermen tambeacutem tem sido irradiadas para uso comercial (AQUINO 2003)
O maior problema na desinfestaccedilatildeo de commodities (como milho ou trigo) eacute o
grande nuacutemero de espeacutecies de insetos que podem estar presentes Assim no
tratamento por irradiaccedilatildeo deve-se escolher a dose mais baixa possiacutevel por motivos
econocircmicos e para natildeo alterar a qualidade dos produtos Ao mesmo tempo a dose
deve ser tal que esterilize ou destrua a espeacutecie mais resistente (VILLAVICENCIO
1 9 9 8 )
Foi estabelecido que para desinfestar gratildeos e derivados sem causar efeitos
indesejaacuteveis aos alimentos uma dose de irradiaccedilatildeo entre 02 a lOkGy deve ser
utilizada dependendo da contaminaccedilatildeo inicial composiccedilatildeo quiacutemica e umidade
espeacutecie sexo e estaacutegio de vida do inseto temperatura tipo de radiaccedilatildeo e mesmo
taxa de dose O emprego dessas doses natildeo necessariamente causa a morte imediata
de todos os insetos mas eacute suficiente para esterilizar os sobreviventes e causar a
completa letalidade destes em poucos dias ou semanas (POTENZA 2004)
A radiossensibilidade de 30 espeacutecies de insetos que infestam produtos
estocados foi testada no Laboratoacuterio do Departamento de Agricultura dos Estados
33
Unidos California usando teacutecnicas e criteacuterios semelhantes de avaliaccedilatildeo Em gratildeos o
uso de baixas doses de irradiaccedilatildeo para a desinfestaccedilatildeo de insetos pode eliminar o uso
de tratamentos quiacutemicos muitos dos quais produzem danos toxicoloacutegicos (KiLCAST
1994) O aumento da vida de prateleira inibindo o brotamento e eliminando os
insetos e parasitas assim como o incremento das propriedades tecnoloacutegicas eacute uma
constante nessa metodologia (AHMED 1993) Aleacutem disso a irradiaccedilatildeo eacute uma
teacutecnica que pode ser usada como tratamento quarentenaacuterio sendo uma alternativa
muito mais promissora quando comparada a fumigantes quiacutemicos utilizados para
desinfestaccedilatildeo de insetos (KAtildeFERSTEIN 1993) A fumigaccedilatildeo com fosfma usada para
a desinfestaccedilatildeo de insetos em uma grande variedade de gratildeos armazenados e que
possui accedilatildeo lenta eacute uma das teacutecnicas que podem ser substituiacutedas pelo uso da
irradiaccedilatildeo (SPALDING 1977 POTENZA 2004)
Em combinaccedilatildeo com outros processos como por exemplo baixa atividade
de aacutegua atmosfera modificada e embalagens o uso da irradiaccedilatildeo pode oferecer
produtos mais estaacuteveis em condiccedilotildees tropicais (lAEA TECDOC - 871 1996)
Processos tecnoloacutegicos altematios de conservaccedilatildeo destes produtos surgem com o
uso de tratamentos combinados da irradiaccedilatildeo e outros processos minimizando os
custos e promovendo uma vida de prateleira maior e mais segura dos produtos
irradiados Estando os gratildeos apropriadamente embalados apoacutes seguir uma boa
qualidade de processamento o tratamento por radiaccedilatildeo iraacute preservar a boa qualidade
por estar agindo no processo de esterilizaccedilatildeo e desinfestaccedilatildeo de insetos conforme o
caso requerido Numa irradiaccedilatildeo onde natildeo houver uma correta embalagem do
produto haveraacute uma reincidecircncia de infestaccedilatildeo e o processo se tomaraacute inuacutetil
(DiEHL 1995)
3 4
38 - Perdas na armazenagem de gratildeos
As perdas de gratildeos ocasionadas por pragas em armazeacutens presenccedila de
fragmentos de insetos nos subprodutos alimentares deterioraccedilatildeo da massa de gratildeos
germinaccedilatildeo contaminaccedilatildeo fuacutengica presenccedila de micotoxinas efeitos na sauacutede
humana e animal dificuldades para exportaccedilatildeo de produtos e subprodutos
brasileiros devido ao potencial de risco satildeo alguns dos problemas que a maacute
armazenagem de gratildeos produz na sociedade brasileira As perdas quantitativas
meacutedias brasileiras de gratildeos estimadas pela FAO e pelo Ministeacuterio da Agriculmra
Pecuaacuteria e Abastecimento (MAPA) satildeo de aproximadamente 10 do total
produzido a cada ano (Quadro 1) Isto representa cerca de 98 milhotildees de tonelada
por ano (LORINl 2004)
Quadro 1 - Perdas por pragas em gratildeos armazenados nos principais commodities brasileiros
Tipo de gratildeo Produccedilatildeo Anual (t) Perda Anual (t) Valor da Perda
Anual (RS)
Milho 41536000 4154000 465 milhotildees
Soja 37216000 3722000 587 milhotildees
Arroz 10366000 1037000 216 milhotildees
Trigo 2967000 296000 44 milhotildees
Feijatildeo 2591000 259000 109 milhotildees
Cevada 338000 33000 58 milhotildees
Outros 3103300 310000 -
Total 98117000 9811000 14268 milhotildees
bullSafra 20002001 - Fonte Lorini 2004
35
Aleacutem dessas existem as perdas qualitativas que satildeo de maior importacircncia
uma vez que comprometem o uso de todo o gratildeo produzido ou o classificam para
outro uso de menor valor agregado No caso de trigo os moinhos natildeo aceitam lotes
de trigo com insetos pois isso fatalmente comprometeria a qualidade da farinha jaacute
que esta teraacute fragmentos de insetos indesejaacuteeis na induacutestria de panificaccedilatildeo e em
outros subprodutos de trigo Essas satildeo as razotildees principais do porque se deve fazer o
manejo integrado de pragas na unidade armazenadora pois isso permite zerar as
pragas nos gratildeos armazenados Para o sucesso do manejo integrado exige-se a
realizaccedilatildeo de vaacuterios procedimentos como mudanccedila de comportamento dos
armazenadores conhecimento da unidade armazenadora de gratildeos medidas de
limpeza e higienizaccedilatildeo da unidade armazenadora correta identificaccedilatildeo de pragas
conhecimento da resistecircncia de pragas aos inseticidas quiacutemicos potencial de
destruiccedilatildeo de cada espeacutecie-praga proteccedilatildeo do gratildeo com inseticidas tratamento
curativo monitoramento da massa de gratildeos e gerenciamento da unidade
armazenadora (LORlNI 2 0 0 4 )
Dentre todos estes procedimentos oltados ao manejo da estocagem a
armazenamento de gratildeos existe tambeacutem a possibilidade de uso da radiaccedilatildeo
ionizante Sendo que esta teacutecnica proporciona vantagens quanto ao aspecto
fmanceiro e a questatildeo da contaminaccedilatildeo de gratildeos (AQUINO 2 0 0 3 )
No aspecto financeiro a utilizaccedilatildeo da radiaccedilatildeo toma-se economicamente
viaacutevel tanto no que se refere ao custo da operaccedilatildeo quanto agrave durabilidade de
produtos pereciacuteveis pois aumenta agrave vida uacutetil de gratildeos armazenados dando ao
produtor a opccedilatildeo de comercializaacute-los apoacutes o periacuteodo de pico da safra conseguindo
assim preccedilos melhores ( I C G F I 1 9 9 9 RELA et al 2 0 0 5 )
Quanto agrave contaminaccedilatildeo de gratildeos armazenados causada por produtos
quiacutemicos utilizados nas lavouras e nas induacutestrias seja para o manejo de pragas ou
controle bioloacutegico de vegetais a irradiaccedilatildeo surge como altemativa aos amais
3 6
meacutetodos A irradiaccedilatildeo eacute isenta de resiacuteduos natildeo altera as qualidades organoleacutepticas
do produto e natildeo afeta sua aparecircncia tomando-se um meacutetodo seguro (WHO 1999)
39 - Importacircncia econocircmica da produccedilatildeo de mi lho
A produccedilatildeo mundial de milho compete com a de trigo pelo tiacutemlo de gratildeo
mais produzido no mundo Esse fato relativamente recente deve-se ao forte
crescimento da demanda mundial Nas safras de 9293 e 9394 o consumo estava na
faixa de 510 milhotildees de toneladasano jaacute para a safra 9697 o USDA indicou o
consumo de 550 milhotildees de toneladas um salto de 78 em apenas trecircs anos (Atlas
Soacutecio-Econocircmico 2005)
A maior parte desse crescimento de demanda deve-se ao aumento de renda e
portanto de padratildeo de consumo (maior consumo de proteiacutenas) dos paiacuteses asiaacuteticos
em especial dos Tigres e da China A taxa de crescimento do consumo mundial foi
de 23 ao ano nos uacuteltimos dez anos Nos Estados Unidos essa taxa foi de 31
enquanto na China o consumo cresceu a uma taxa de 45) puxado principalmente
por cames de frango e suiacutenos grandes consumidores de milho na sua produccedilatildeo A
demanda mundial soacute natildeo foi maior nesse periacuteodo porque a ex-Uniatildeo Sovieacutetica estaacute
consumindo hoje quase dez vezes menos que a meacutedia de consumo da deacutecada de 80
passando de 30 milhotildees de toneladas para pouco menos de 4 milhotildees em 1995
(PESSOA 2004)
A produccedilatildeo mundial apesar de crescente natildeo estaacute conseguindo acompanhar
o ritmo de crescimento do consumo em parte devido agrave irregularidade nas uacuteltimas
safras dos Estados Unidos maior produtor mundial respondendo por metade do
milho anualmente produzido Em 2004 a produccedilatildeo mundial de milho chegou agrave
cerca de 705 milhotildees de toneladas (Atlas Soacutecio-Econogravemico 2005)
37
Consumo
Humano
3
Autoconsumo
2 5
Avicultura
2 5
Sementes lt^ Moagem Pecuaacuteria
1 3
Suinocultura
1 6
Fonte MB Assoc iados
Figura 8 Divisatildeo do consumo de milho no Brasil
Como no caso da soja a produccedilatildeo brasileira de frangos e suiacutena vem
crescendo fortemente nos uacuteltimos anos fazendo com que seja crescente a
necessidade de produzir milho Nos uacuteltimos dez anos o Brasil passou a ser
importador de milho em especial para atender agraves necessidades da regiatildeo Nordeste
Os principais fornecedores do Brasil satildeo a Argentina e os Estados Unidos
(EMBRAPA 2005)
A sensiacutevel reduccedilatildeo nos estoques mundiais promoveu a disparada do preccedilo
internacional com as cotaccedilotildees na Bolsa de Chicago batendo 13 recordes histoacutericos
apenas em abril de 1996 Portanto o cenaacuterio de preccedilos para um pais como o Brasil
que eacute grande produtor mas tambeacutem importador marginal requer cuidados extras
com a produccedilatildeo (PESSOA 2004)
O Brasil eacute o terceiro maior produtor mundial com uma safra correspondente
a 59 da produccedilatildeo mundial perdendo o segundo lugar para a Chma que produz
187 deste cultivar Entretanto sua importante induacutestria de aves e suiacutenos toma o
Brasil um dos maiores consumidores de milho do mundo impedindo inclusive a
participaccedilatildeo nas exportaccedilotildees mundiais (MB Associados 2005) O graacutefico (figura 8)
mostra como estaacute dividido o consumo de milho no Brasil
38
mil toneladas
Paranaacute Rio (kande Minas Gs^ais Satildeo Paulo Santa do Sul Catarina
Goiaacutes
ISgt7oduccedilatildeo neacuteampB 199atilde a 2000 Mpiacuteoduccedilatildeo meacutedia2001 a 2003
Fonte IBGE - Produccedilatildeo Agr iacuteco la Munic ipa l
Figura 9 Produccedilatildeo meacutedia de milho do Brasil e dos principais estados produtores - 1998 a
2000 e 2001 a 2003
A cultura do milho estaacute se transformando em lavoura de ponta com vaacuterias
regiotildees produtoras alcanccedilando produtividade altiacutessima e com expansatildeo de aacuterea em
regiotildees que podem ser intensivamente mecanizaacuteveis como o Cerrado O uso
crescente de sementes melhoradas contmuara sendo um dos grandes impulsos do
aumento de produccedilatildeo (EMBRAPA 2005)
Vale ressaltar que a cultura do milho ao contraacuterio da soja amda conta com
grandes possibilidades de aumento de produccedilatildeo viacutea crescimento de produtividade
Caracterizada por muitos anos como urna cultura de subsistecircncia o milho tem uma
produtividade muito baixa no Brasil (figura 9) e ainda tem boa parte de seu plantio
realizado em pequenas propriedades com baixo uso de tecnologia em especial no
Sul e no Nordeste (IBGE 2005)
39
Seguindo os passos da soja o milho do Centro-oeste vem crescendo de
importacircncia no cenaacuterio nacional mas padece dos mesmos males oriundos do custo
Brasil Se a soja do Cerrado perde competitividade na exportaccedilatildeo devido aos
elevados custos de transporte ateacute os portos o milho dessa regiatildeo enfrenta custos
proporcionalmente mais elevados para chegar ateacute as grandes induacutestrias de aves e
suiacutenos concentradas na regiatildeo Sul Enquanto uma tonelada de soja custa US$ 25000
a de milho custa apenas US$ 10000 (Atlas Soacutecio-Econocircmico 2005)
A tendecircncia eacute que os grandes consumidores orientem seus investimentos
futuros para as regiotildees onde haacute excedente de gratildeos A praacutetica de adicionar valor ao
produto possibilita menores custos de transporte e maior rentabilidade por tonelada
transportada ateacute os grandes centros consumidores Os melhoramentos em logiacutestica
tomam-se fundamentais para o ecircxito de tais investimentos (VIEIRA 2004)
A eliminaccedilatildeo da incidecircncia de ICMS sobre as exportaccedilotildees de gratildeos e a
regulamentaccedilatildeo da quebra do monopoacutelio nacional na navegaccedilatildeo de cabotagem
podem trazer grande impulso agrave produccedilatildeo de milho em especial na regiatildeo Sul A
exportaccedilatildeo pode em meacutedio prazo se constituir numa nova opccedilatildeo tendo em vista a
expectativa de deacuteficit crescente de produccedilatildeo em niacutevel mundial As atuais
importaccedilotildees nordestinas da Argentina e dos Estados Unidos que ocorrem em boa
medida devido aos elevados custos do transporte mariacutetimo interno podem ser
substituiacutedas por milho do Centro-Sul do Pais (MB Associados 2005)
Assume-se para traccedilar um cenaacuterio para a produccedilatildeo brasileira de milho que o
custo Brasil sofreraacute consideraacutevel reduccedilatildeo nos proacuteximos anos que os investimentos
previstos pelas grandes integraccedilotildees do Sul com a regiatildeo Centro-oeste sejam
efetivados e que a produtividade seguiraacute crescendo no periacuteodo Com isso pode-se
esperar que o milho seja ao lado da soja um grande impulsionador do crescimento
da produccedilatildeo brasileira de gratildeos nos proacuteximos anos com uma colheita de mais de 45
milhotildees de toneladas ao ano (IBGE 2005)
40
4 - Materiais e Meacutetodos
41 - Amostras As sementes de milho (figurai0) e seus derivados utilizados
no experimento foram adquiridas no comeacutercio local e em diferentes pontos de
distribuiccedilatildeo Foram utilizadas trinta amostras diferentes listadas a seguir
1- Nutriton - Mococa - Lote 005002 produzido em 150204
2- Bolinho de Chuva - Yoki - Lote 22J4 H validade 220405
3- Mucilon 5 Cereais - Nestle - Lote 1IT C5B produzido em 04082004
4- Bolo de Milho - Maizena - Lote 1014 valido ateacute 150405
5- Bolo de Milho - Dr Oetker - Lote 056 validade agosto de 2005
6- Mistura para bolo (fubaacute) - Dona Benta - Lote 1 3 1 validade 130805
7- Doritos Queijo Nacho - Elma Chips
8- Tortilla Chips Chili - Casa Fiesta - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
9- Mistura para Bolo Sabor Milho - Margarett - Lote 032C de 171104
10- Flocos de Milho - Matildee Terra - Lote fabricado em 13082004
11- Com Flakes - Kelloggs - Lote produzido em 0059 de 091004
12- Com Flakes - Nestle - Lote A4 produzido em 02 de dezembro de 2004
13- Farinha de Milho Amarela - Cortesia - Lote 172 valido ateacute 030405
14- Kimilho Flocatildeo - Yoki - Lote 28J04T validade 280705
15- Kimilho (preacute-cozida) - Yoki - Lote 06 J 04 valido ateacute 060705
16- Milharina (preacute-cozida) - Quaker - Lote com validade ateacute julho de 2005
17- Milanesa - Kodilar - Lote 09 validade fevereiro de 2005
18- Meu Instante Galinha com Vegetais - Maagi - Lote Hi0846JB
19- Express 10 Vegetais - Qualimax - Lote 016 5495 09
20- Viver Bem Galinha e Cereais - Qualimax - LOl 1 811 27 T4
21- Sopa de Milho - Lote 012 642 21 T4
22- Fajita - Lote L58223 AI valido ateacute 21052005
23- Milho Cusco (Peru) - Vermelho
41
24- Milho Cusco (Pem) - Amarelo
25- Milho Cusco (Pem) - Cinza
26- Milho Nacional agrave Granel (comercial)
27- Pipoca Meacutexico - La Merced - Lote HC3
28- Pipoca USA - Lote 2162426401
29- Curau Yoki - Lote 01F4 Q vaacutelido ateacute 011005
30- Milho enlatado em conserva - CompreBem - Lote L20DT0913M1
1 i^ 1^
1^
Figura 10 Exemplos de algumas amostras de milho utilizadas no experimento
42 - Irradiaccedilatildeo das amostras Foi realizada em temperatura ambiente
(25degC) sob condiccedilotildees aeroacutebicas no Centro de Tecnologiacutea das Radiaccedilotildees (CTR) do
Instituto de Pesquisas Energeacuteticas e Nucleares (IPEN) em fonte de Co
Gammacell 220 (AECLtda) nas doses de 1 25 e 50 kGy com taxa de dose de 415
kGyh e acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Lnc USA 15MeV-25mA)
tambeacutem com doses de 1 25 e 50 kGy Tais equipamentos foram calibrados
42
Figura 11 Amostras devidamente embaladas para irradiaccedilatildeo na Gammacell
Para a irradiaccedilatildeo na Gammacell as amostras foram acondicionadas em
microtubos de 2 ml (Eppendorf) e separadas em lotes de acordo com a dose a ser
recebida (figura 11 )
Figura 12 Amostras nas embalagens para irradiaccedilatildeo no acelerador de eleacutetrons
utilizando-se o sistema dosimeacutetrico de Fricke sendo o experimento acompanhado
por dosiacutemetros Harwell Acircmbar 3042 utilizados para garantia e controle de dose das
amostras
43
Para a irradiaccedilatildeo do material no acelerador de eleacutetrons pequenas quantidades
de cada amostra cerca de 20 a 30g foram embaladas em sacos plaacutesticos
devidamente lacrados Este tipo de embalagem mostrou-se adequado para irradiaccedilatildeo
no acelerador de eleacutetrons podendo ser manipulado deitado o que proporcionava
uma pequena espessura ao material irradiado (figura 12)
43 - Controles positivos Os controles positivos para B t l l Btl76 e
MON810 foram fornecidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional do IPEN com o
Centre of Molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de
Karlsmhe na Alemanha Estes materiais eram constituintes de kits comerciais
existentes na Europa para a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modificados
44 - Adequaccedilatildeo das amostras A metodologia utilizada para a extraccedilatildeo do
DNA estava adaptada para amostras secas na forma de poacute geralmente farelo ou
farinha oriunda de sementes moiacutedas Para que esta metodologia pudesse ser
realizada sem prejuiacutezo em uma maior variedade de alimentos foram desenvolvidas
teacutecnicas de adequaccedilatildeo com a finalidade de se obter todas as amostras utilizadas
neste experimento na forma de poacute Neste caso foram utilizados um moedor eleacutetrico
para triturar os alimentos e uma estufa para a sua secagem Em alguns casos a
adequaccedilatildeo das amostras tambeacutem envolvia um processo de homogeneizaccedilatildeo pois na
maioria das vezes a presenccedila de milho na amostra estava concentrada em alguma
porccedilatildeo do alimento o que aumentava as chances de identificaccedilatildeo do material
geneticamente modificado
45 - Extraccedilatildeo do DNA das amostras Na extraccedilatildeo do DNA das amostras
foi utilizada uma teacutecnica in house baseada na ufilizaccedilatildeo de trecircs (1 2 e 3) tampotildees
44
de lavagem e extraccedilatildeo Para o preparo de um volume de 50 mi destes tampotildees foram
utilizados os seguintes protocolos
Tampatildeo 1
100 mM Tris 060 g
20mMNa2-EDTA 037 g
14MNaCl 41 g
20g lCTAB I g
pH 80
Tampatildeo 2
40 mM NaCl (Mr=5844 gmol) 011688 g
5 g1 CTAB 025 g
pH 80
Tampatildeo 3
12 M NaCl (Mr-5844 gmol) 3509 g
pH 80
Os tampotildees apoacutes seu preparo eram autoclavados e estocados a temperamra
ambiente a fim de serem utilizados no protocolo a seguir
Para cada extraccedilatildeo de DNA 200 mg da amostra seca na forma de poacute foram
transferidas para um tubo (Eppendorf) de 2 mi contendo lOOOp do tampatildeo 1 Os
tubos foram cuidadosamente fechados e agitados no vortex Apoacutes sua homogenizaccedilatildeo
este material foi incubado a 65 degC em sistema de banho-maria com agitaccedilatildeo leve Apoacutes
trinta minutos de incubaccedilatildeo os tubos foram centrintildeigados por 10 minutos a lOOOOG e
25degC Com este procedimento as partiacuteculas soacutelidas das amostras depositaram-se no
4 5
fundo dos tubos Com auxiacutelio da pipeta 500 pL do sobrenadante foram retirados e
colocados em novos tubos de 2 mi
Ao sobrenadante nos novos tubos foram adicionados 200pL de clorofoacutermio
hidrofoacutebico Estas misturas foram agitadas por trinta segundos e depois
centrifugadas por 10 min a lOOOOG e 25degC Deste centrifugado foram transferidos
para novos tubos de 2ml a fase superior (aacutegua) com um volume equivalente a 300
pL Aos novos tubos com 300 pL do material foram adicionados 600pL
(equivalente a dois volumes) do tampatildeo nuacutemero dois Depois de homogenizados
este material foi incubado por sessenta minutos a uma temperatura de 25degC
(temperatura ambiente)
Concluiacuteda a incubaccedilatildeo os tubos foram centrifugados durante 5 minutos a
lOOOOG a 25degC o que proporcionou que os tubos fossem virados de uma uacutenica vez
sobre um recipiente para o descarte do sobrenadante mantendo-se o DNA
acumulado no fundo dos tubos Apoacutes este descarte os tubos seguiam invertidos
(ponta-cabeccedila) para um processo de secagem em estufa a ateacute 45degC Secos os tubos
recebiam 350pL do tampatildeo trecircs e eram levemente agitados para dissoluccedilatildeo do DNA
Logo apoacutes foram adicionados 350pL de clorofoacutermio (figura 13) misturado com
cuidado por aproximadamente 30 segundos Mais uma vez o material era
centrifugado por 10 minutos a lOOOOG e sua fase superior (aquosa) 250pL
transferida a novos tubos agora coacutenicos de 15ml
46
Figura 13 Laboratoacuterio destinado ao processo de extraccedilatildeo de DNA
Aos tubos coacutenicos foram adicionados 150pL (06 volumes) de isopropanol
que foi misturado suavemente por inversatildeo e em seguida centrifugado por 10
mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a centrifugaccedilatildeo os tubos eram virados de uma
uacutenica vez sobre um recipiente para descarte e voltavam ao processo de secagem na
estufa a ateacute 45 degC Depois de secos foram adicionados 500pL de etanol a 70
misturados e novamente centrifugados por 10 mmutos a lOOOOG a 25degC Apoacutes a
centrifugaccedilatildeo os tubos passaram por uma uacuteltima secagem na estufa na qual sairam
prontos para receber 50 pL de aacutegua bidestilada para dissoluccedilatildeo do DNA e sua
armazenagem em geladeira (4 degC por um curto periacuteodo) ou freezer (-20 degC para
longa duraccedilatildeo)
46 - Primers Os primers utilizados nos experimentos foram sintetizados
pela Invitrogen do Brasil LTDA segundo Gremer eiacute al (2004) e estatildeo
representados no quadro 2
47
Quadro 2 Pimers utilizados nomes funccedilotildees sequumlecircncia e segmento amplificado
Identificaccedilatildeo p PRIMER Sequumlecircncia
Milho (controle)
Amplifica226pb
IVRI-F 5 CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC3 Milho (controle)
Amplifica226pb IVRl-R 5 GGAGCCCGTGTAGAGC ATGACGATC3
Milho B t l l
Amplifica 189pb
IVS2-2 5 CTGGGAGGCCAAGGTATCTAAT3 Milho B t l l
Amplifica 189pb PAT-B 5 GCTGCTGTAGCTGGCCTAATCT3
Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb
Cry03 5 CTCTCGCCGTTCATGTCCGT3 Milho Bt l76
Amplifiacuteca21 Ipb Cry04 5 GGTC AGGCTC AGGCTGATGT3
Milho MON810
Amplifica 178pb
VWOI 5 TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 Milho MON810
Amplifica 178pb VW03 5 TCCATCTTTGGGACC ACTGTCG3
Milho T25
Amplifica209pb
T25-F7 5 ATGGTGGATGGCATGATGTTG3 Milho T25
Amplifica209pb T25-R3 5 TGAGCGAAACCCTATAAGAACCC3
47 - A visualizaccedilatildeo do DNA obtido Foi realizada atraveacutes de uma
eletroforese em gel de agarose A agarose foi pesada conforme a concentraccedilatildeo
desejada para o gel (12) E foi adicionada a um erleimieyer contendo TBE
(0045M) no volume equivalente ao da cuba a ser utilizada A agarose foi dissolvida
em um forno de microondas O material foi aquecido ateacute a total dissoluccedilatildeo da
agarose Sendo que o forno era mantido ligado ateacute o iniacutecio da fervura Daiacute por diante
era ligado por periacuteodos curtos a fim de evitar a fervura e borbulham ento A soluccedilatildeo
era esfriada ateacute cerca de 55degC para a adiccedilatildeo o corante brometo de etiacutedio na
concentraccedilatildeo final de 05gml no gel e tambeacutem no tampatildeo quando necessaacuterio
48 - A reaccedilatildeo em cadeia pela polimerase (PCR) Foi realizada em um
volume total de 25pL (24pL de mastermix + 1 pL da amostra) Juntamente com a PCR
das amostras foi realizado um controle de contaminaccedilatildeo (controle negativo (CN) da
PCR com aacutegua em lugar da soluccedilatildeo de DNA) O mastermix era sempre preparado em
48
banho de gelo seguindo o seguinte protocolo
Mastermix - Buffer sem cloreto de magneacutesio
Soluccedilatildeo de DNA 10 pl
ddHjO 159 pl
lOxPCR-buffer (tampatildeo) 25 pl
Primer 1 (5 pM) 10 pl
Primer 2 (5 pM) 10 pl
dNTP(25 mM) 20 pl
polimerase termoestaacutevel (5 Upl) 01 pl
Cloreto de magneacutesio 15 pl
Antes da colocaccedilatildeo dos tubos contendo amostras e mastermix no termociclador
este material era centrifugado a 5degC durante cinco segundos (tecla pulsar) Para a PCR
foi utilizado um termociclador modelo Mastercycler Eppendorf (figtua 14)
programado de acordo com os primers utilizados no mastermix
49 - Programaccedilatildeo do termociclador Neste experimento independente do
tipo de primer utilizado na PCR a programaccedilatildeo do termociclador manteve-se sempre a
mesma Dez minutos a 95degC para desnaturaccedilatildeo inicial quarenta ciclos de um minuto e
meio cada sendo trinta segundos a 95degC para desnaturaccedilatildeo trinta segundos a 64degC
para andamento e trinta segundos a 72degC para extensatildeo Ao final dos ciclos a
temperatura de 72degC era mantida por sete minutos para finalizar a PCR
49
Figura 14 Termocilcador utilizado modelo Mastercycler (Eppendorf)
410 - A eletroforese dos produtos da PCR A eletroforese dos produtos da
PCR foi realizada em gel de agarose o que permite a separaccedilatildeo de moleacuteculas de
DNA em funccedilatildeo de seu tamanho Dependendo da faixa de separaccedilatildeo requerida
utilizam-se diferentes concentraccedilotildees de agarose todos os geacuteis utilizados neste
expenmento foram realizados numa concentraccedilatildeo de agarose de 2 Para manter o
pH inalterado ao longo da comda eletroforeacutetica e garantir a formaccedilatildeo de um campo
eleacutetrico era utilizada uma soluccedilatildeo de TBE (TrisBoratoEDTA) equivalente ao
TAE (TnsAcetatoEDTA) em pH alcalmo Essas soluccedilotildees foram preparadas em
concentraccedilotildees de 045M para estoque sendo diluidas para 0045M no momento do
uso A tensatildeo constante (medida em Volts) empregada para a comda da eletroforese
em gel de agarose eacute um valor que variava em funccedilatildeo do comprimento do gel e a
distacircncia entre os eletrodos da cuba De modo geral os fabricantes da cuba sugerem
os valores ideais que variavam na faLxa de 50 a 150 V dependendo do tamanho da
cuba (8-10 V por cm) Apoacutes a eletroforese os geacuteis obtidos foram levados a um foto-
50
documentador digital Vilber Lourmat Imager System (figura 15) para o devido
registro dos resultados
Figura 15 Trabalho de foto-documentaccedilatildeo para o registro dos resultados
51
5- Del ineamento Experimental
iacuteiitos
Identificaccedilatildeo da presenccedila do DNA de milho
Obtenccedilatildeo de 30 amostras
Extraccedilatildeo dos DNAs
PCRs para d^ecccedilatildeo de miacuteos seneticamente
Aviaccedilatildeo e cornpaiaccedilatildeo dos resultados
if
52
Figura 16 - Gel determinando insucesso (12) e sucesso (3-8) de uma extraccedilatildeo de DNA
Esta anaacutelise confirmou a obtenccedilatildeo do DNA da maiona das amostras poreacutem a
metodologia de extraccedilatildeo teve de ser repetida ateacute cmco vezes para se obter
corretamente o DNA de determmados alimentos Em alguns casos a metodologia de
extraccedilatildeo do DNA envolvendo a lavagem do material produzia um espessamento da
amostra dificultando sua manipulaccedilatildeo Esta dificuldade foi enconp-ada
prmcipalmente na amostra de nuacutemero 21 uma sopa de milho em que a quantidade
de material para a obtenccedilatildeo do DNA teve de ser dimmuiacuteda de 200 para 100 mg
Apesar desta dificuldade foi possiacutevel extrau- o DNA de todas as amostras utilizadas
A etapa de extraccedilatildeo das amostras de DNA tambeacutem conhecida como preacute-
PCR mostrou-se a mais suscetiacutevel a evoluccedilotildees durante o desenvolvimento deste
trabalho Foi desenvolvida com sucesso uma rotina laboratorial para a identificaccedilatildeo
de organismos geneticamente modificados Tal rotina teve como base protocolos
desenvolvidos atraveacutes de uma cooperaccedilatildeo intemacional entre o IPEN e o Centre of
molecular Biology of Federal Research Centre for Nutrition de Karlsruhe na
Alemanha Alguns aspectos do protocolo onginal foram melhorados o que
propiciou a realizaccedilatildeo do trabalho laboratorial em menos tempo Um exemplo disso
foi o uso de uma estufa para a secagem dos tubos a 45C durante a extraccedilatildeo de
6- Resultados
A anaacutelise dos produtos obtidos na extraccedilatildeo do DNA das amostras foi efetuada
atraveacutes de seu teste em gel de agarose como o da figura 16 apresentada a seguir
53
DNA procedimento anteriormente realizado sob a bancada em temperatura
ambiente e o uso de um forno de hibridaccedilatildeo no lugar do tradicional banho-maria
tambeacutem foi usado garantindo precisatildeo nos processos de incubaccedilatildeo
Os resultados deste trabalho mostraram que a teacutecnica utilizada apesar de mais
trabalhosa possui vantagens em relaccedilatildeo ao uso de kits comerciais Aleacutem de ser mais
barata alguns dos seus procedimentos podem ser ajustados de acordo com o tipo de
amostra a ser utilizada Por exemplo em alguns alimentos que contem muita
gordura algumas etapas do procedimento de extraccedilatildeo podem ser repetidos e fim de
se obter uma melhor separaccedilatildeo do DNA
A adequaccedilatildeo das amostras para esta metodologia tambeacutem foi melhorada neste
experimento Algumas amostras como a de nuacutemero 30 (milho enlatado) natildeo
encontrava-se pronta para o protocolo original que previa amostras de alimentos na
forma de poacute Neste caso foi desenvolvida uma teacutecnica para a obtenccedilatildeo de um farelo
atraveacutes da secagem das amostras utilizando-se uma estufa a 45degC Em alguns casos
esta adequaccedilatildeo envolveu tambeacutem uma triagem da parte do produto que continha o
DNA desejado No caso de sementes isso foi feito separando-se o cotileacutedone da
parte embrionaacuteria (germe) que contem maiores concentraccedilotildees de DNA
Uma possiacutevel falha verificada na teacutecnica estudada para a identificaccedilatildeo de
gratildeos geneticamente modificados que foram tratados por irradiaccedilatildeo estaacute relacionada
ao armazenamento do DNA destas amostras Em alguns casos foi possiacutevel observar
que o DNA de amostras irradiadas sabidamente positivas apoacutes nove meses de
estocagem em freezer a -18degC resultaram em falsos negativos utilizando-se a
amplificaccedilatildeo pela teacutecnica da PCR Este efeito foi observado apenas em um pequeno
nuacutemero de amostras como por exemplo nas de nuacutemero 10 21 22 e 26 todas
irradiadas em doses de 25 ou 50 kGy O resultado desta observaccedilatildeo leva a crer que a
irradiaccedilatildeo provocou a uma degradaccedilatildeo do DNA armazenado (figura 17)
54
Figura 17 Amiazenagem das amostras de DNA
A reaccedilatildeo da PCR propriamente dita (mastermix) natildeo sofreu nenhuma
modificaccedilatildeo durante a execuccedilatildeo do trabalho Entretanto etapas do poacutes-PCR tambeacutem
foram modificadas visando melhorias no trabalho laboratorial A mais significativa
destas mudanccedilas estaacute relacionada agrave montagem dos geacuteis de agarose para eletroforese
Inicialmente o protocolo previa adiccedilatildeo no gel de brometo de etiacutedio na concentraccedilatildeo
final de 05gml Com a evoluccedilatildeo do trabalho a adiccedilatildeo de brometo de etiacutedio na
confecccedilatildeo do gel foi suprida por uma teacutecnica de coloraccedilatildeo do gel apoacutes a
eletroforese
As primeiras PCRs deste trabalho foram realizadas para a identificar a
presenccedila de milho nas amostras pois para a realizaccedilatildeo do experimento foi
necessaacuteria a identificaccedilatildeo de pelo menos trinta amostras (listadas no item amostras)
55
A B C D E F G H
4
200 f
m
bull
J L
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milhoj E- Flocos de milho F- Farinha de milho G- Amido de milho H- Fajita
^ I-Sopa de milho verde fm
i-- tvlissoshiiacuteo
Figura 18 - PCR com primer IVRl mostrando a presenccedila ou ausecircncia de milho
J- Bolinho de chuva
com resultados comprovados para a presenccedila do DNA de milho Durante esta
seleccedilatildeo alguns alimentos mesmo possuindo milho em sua composiccedilatildeo natildeo tiveram
o DNA do milho identificado atraveacutes da PCR Um destes alimentos foi uma marca
de amido de milho que por algum processo mdustrial acabou provavelmente tendo
seu gene fVRl totahnente destruido Outro alimento um poacute para o preparo de
missoshiro (sopa japonesa) tambeacutem natildeo pode ter a confirmaccedilatildeo da presenccedila do
ingrediente milho atraveacutes da PCR Estes produtos foram excluidos do trabalho natildeo
constando da lista de amostras utilizadas
Apoacutes a irradiaccedilatildeo nas doses de 1 25 e 50 kGy com cobalto 60 das trinta
amostras comprovadamente possuidoras de milho foram realizadas novas PCRs
utilizando-se os pirmers IVRl O resultado desta avaliaccedilatildeo mostrou que mesmo a
altas doses de irradiaccedilatildeo a sequumlecircncia alvo para os pnmers IVRl mantinham-se
intactas preservando a detecccedilatildeo dos alimentos possuidores de milho como
ingrediente (figura 18 19 e 20)
56
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle Negat ivo da PCR D- Contole posit ivo (milho) E- P ipoca Meacutexico (amostra 27) F- P ipoca USA (amostra28) G- Curau (amostra 29) H- Milho enlatado (amostra 30)
Figura 19 - Amplificaccedilatildeo atraveacutes do primer IVRl mesmo com doses de 50kGy
A B C D E F G H I J L
200pto
lOu pb 4
A B C D E F G H I J L
2iiii|jb
1(
B C D t F G H I I L
A- Marcador B- Controle negat ivo da ex t raccedilatildeo C-Cont ro le negat ivo P C R D-Contro le posi t ivo (milho) E-Nutnton (amostra 1) F- Bol inho de chuva (annostra 2) G-Muci lon 5 cerea is (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4 ) I- Mistura p bolo de fubaacute (amost ra 6)
J_ FTNROS de milho (amostra 10) L- Mi lhar ina (amost ra 16)
Figura 20 - PCR com primer IVRl utilizando-se amostras irradiadas em diferentes doses
57
Figura 2 1 - Resultado de urna PCR para Btl76 natildeo amplificaccedilatildeo do controle positivo
Os testes para a identificaccedilatildeo dos milhos BTl 1 e MON810 foram realizados
com todas as amostras antes de serem irradiadas Os resultados destas PCRs
mostraram que poucas eram as amostras que possuiacuteam algum mgrediente
geneticamente modificado Mostraram-se positivas para BTl 1 as amostras 1 321 e
22 e para MON810 as amostras 5 13 e 22 (figuras 22 23 e 24)
Todas as trinta amostras foram testadas para os diferentes primers
providenciados para o experunento Entretanto os resultados relacionados com a
identificaccedilatildeo dos milhos Bt) 76 e T25 natildeo foram considerados Os testes para a
identificaccedilatildeo do milho Btl 76 resultaram da natildeo amplificaccedilatildeo do DNA do controle
positivo existente Mesmo sem a presenccedila de um controle positivo adequado foram
reahzadas PCRs com as amostras utilizadas no experimento apresentando-se em
todos os casos resultados negativos (figura 2])
Quanto ao T25 natildeo foi conseguido um controle positivo para esta amostra
Mas da mesma forma que o Btl 76 foram realizadas PCRs com as amostras
utilizadas no experimento Entretanto todos os resultados apresentaram-se negativos
58
IA B C D E F H I J
oopb
lOOpb
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho B t l 1 ] E- Nutriton (amostra nuacutemero 1) F- Bolinho de chuva (amostra nuacutemero 2) G-Mucilon (amostra nuacutemero 3) H- Bolo de milho (amostra numera 4) I- Bolo de milho (amostra nuacutemero 5) J- Mistura p bolo de fubaacute (amostra nuacutemero 6) L- Dontos (amostra nuacutemero 7)
Figura 22 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
A- Marcador iacute iacute B- Controle negativo da edraccedilatildeo
C- Controle negativo da PCR D- Coriacuterde positivo (milho Bt11) E- Kimilho preacute-cozido (amostra 15)
F- Milharina (amostra 16) G-Milanesa (amostra 17)
H- Meu instante galinha com vegetais (amostra 18) I- Express 10 vegetais (amostra 19) J- Viacutever bem galinha e cereais (amostra 20) L- Sopa de milho verde (amostra 21) M- Marcador N- Controle negativo da extraccedilatildeo O-Contrtfe negativo da PCR P- Controle positivo (milho Bt11) Q-Fajita (amostra nijmero 22)
IR- Milho vermelho Cusco - Peruacute (amostra 23) S- Milho amarelo Cusco - Peruacute [amostra 24) T- Mlho cinia Cusco bull Peruacute (amostra 25) U- Milhos comercial nacional (amostra 26) V- Milho de pipoca hteacuteiaacuteco (amostra 27) X- Milho de pipoca USA (amostra 28)
Figura 23 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho Btl 1
59
200pbL
100pl
A B C D E F G H I J
A-Marcador B- Controle neg^ivo da extraccedilatildeo C-Controle negativo da PCR
V D- Controle positivo (milho M0N810) E-Nulrion(aiTiosira1) F - Bolinho de chuva (amostra 2)
G- Mucilon 5 cereais (amostra 3) H- Bolo de milho (amostra 4)
M I - Bolo de milho (amostra 5) ^ J- Mistura para bolo de fubaacute (amostra 6)
L- Doritos (amostra 7) M- Marcador
m N- Controle negativo da ejiacuteraccedilacirco I O- Controle negativo da PCR
P- Controle posiacuteivo (milho MON810) Q- Tortilla chips (amosiacutera 8) R- Mistura para bolo sabor milho (amostra 9) S- Flocos de milho (amostra 10) T- Com Flakes (amostra 11) U- Corn Flakes (amostra 12) V- Farinha de milho amarela (amostra 13) X- Kimilho flocacirco (amostra 14)
Figura 24 - Identificaccedilatildeo de amostras possuidoras de milho MON810
De acordo com estes resultados o trabalho de detecccedilatildeo de milhos
geneticamente modificados focou o estudo das amostras 1 3 5 13 21 e 22 Tais
amostras foram entatildeo analisadas atraveacutes da teacutecnica da PCR apoacutes serem irradiadas
nas doses de 1 25 e 50 kGy em fonte de ^VO Gammacell 220 (AECLtda)
originando resultados idecircnticos as amostras que NAtildeO receberam tratamento por
radiaccedilatildeo Ou seja mesmo apoacutes a irradiaccedilatildeo a teacutecnica da PCR contmuava
apresentando resultados positivos para a identificaccedilatildeo de transgecircnicos nestas
amostras (figuras 25 e 26)
60
A-Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (rnilho B t l l ) E- Amostra 21 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 22 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 21 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 22 (irradiada com 25 kGy) I - Amostra 21 (irradiada com 50 kGy) bullJ- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 25 - Resultado da PCR de amostras contendo milho Btl 1 depois de irradiadas
A- Marcador B- Controle negativo da extraccedilatildeo C- Controle negativo da PCR D- Controle positivo (milho M0N810) E- Amostra 5 (irradiada com 1 kGy) F- Amostra 13 (irradiada com 1 kGy) G- Amostra 5 (irradiada com 25 kGy) H- Amostra 13 (irradiada com 25 kGy) I- Amostra 5 (irradiada com 50 kGy) J- Amostra 13 (irradiada com 50 kGy) L- Amostra 22 (irradiada com 50 kGy)
Figura 26- Resultado da PCR d amostras contendo milho MON810 depois de irradiadas
Os resultados das amostras irradiadas em Gammacell mostraram-se iguais a
aqueles obtidos pela PCR das amostras 1 3 5 13 21 e 22 apoacutes serem irradiadas nas
doses de 1 25 e 50 kGy pelo acelerador de eleacutetrons (Radiation Dynamics Inc USA
15MeV-25mA) Como resultado fiacutenal do experimento o quadro 3 foi montado com
a relaccedilatildeo de todas as PCRs realizadas durante o estudo seus resultados positivo (+)
ou negativo (-) para cada um dos tipos pesquisados e sua equivalecircncia (ok) apoacutes a
irradiaccedilatildeo do material Natildeo existem diferenccedilas na detecccedilatildeo de milhos geneticamente
modifiacutecados Bt l 1 e MON8I0 em produtos alimentiacutecios tratados por irradiaccedilatildeo
61
Quadro 3 Resultado fiacutenal das PCRs e sua equivalecircncia com as amostras irradiadas
Alimentos IVRl Btll MON810 IRRADIACcedilOtildeES
IkGy
gama
25kGy
gama
50kGy
gama
IkGy
eleacutetrons
25kGy
eleacutetrons
50kGy
eleacutetrons
Amostra 1 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 2
Amostra 3 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 4
Amostra 5 ok ok Ok ok ok ok
Amostra 6
Amostra 7
Amostra 8
Amostra 9
Amoacutestralo
Amostrai 1
Amostra 12
Amostrais
Amostra 14
Amostrais
Amoacutestralo
Amostrai
Amostrais
Amostra 19
Amostra20
Amostra21
Amostra22
Amostra23
Amostra24
Amostra25
Amostra26
Amostra27
Amostra28
Amostra29
Amostra30
ok ok Ok ok
ok ok Ok
otildeiT
ok
ok
ok
OtildeiT
ok
ok
otildek
62
7- Discussatildeo
As expectativas quanto aos resultados deste experimento estavam
diretamente relacionadas a possiacutevel quebra do DNA exoacutegeno (transgenicidade)
dos milhos estudados perante o tratamento por radiaccedilatildeo ionizante Ou seja a
irradiaccedilatildeo poderia afetar o resultados da PCR quebrando moleacuteculas de DNA e
mascarando a presenccedila do milho geneticamente modificado Neste caso o
processamento de alimentos por radiaccedilatildeo ionizante poderia ser utilizado
comercialmente a fim de destruir moleacuteculas de DNA transgecircnico fazendo com que
alimentos possuidores de organismos geneticamente modificados fossem
confiindidos com alimentos convencionais Em certos casos tal teacutecnica poderia ser
utilizada somente para diminuir a quantidade aparente de organismos geneticamete
modificados em uma amostra adequando o produto final agraves normas de rotulagem
Entretanto os resultados observados mostraram que a quebra da
transgenicidade natildeo pode ser obtida mesmo utilizando-se doses bastante elevadas
de radiaccedilatildeo O uso de altas doses referentes a iiradiaccedilatildeo de gratildeos em ateacute 50 kGy
foram aplicadas neste trabalho apenas como forma de estudar a interaccedilatildeo desta
tecnologia com a teacutecnica da PCR natildeo sendo este procedimento um protocolo
comercialmente viaacutevel para gratildeos
Os efeitos da quebra do DNA em alimentos processados por radiaccedilatildeo satildeo
mostrados por diversos autores como Villavicencio (2000) e Delinceacutee (2002) O
DNA tem uma propriedade particular diferenciada de todos os outros constituintes
da ceacutelula que o transforma em um excelente alvo Eacute uma moleacutecula enorme em
comparaccedilatildeo com as demais moleacuteculas celulares e sua nmccedilatildeo depende diretamente
de stia estrutura podendo assim ser facilmente danificado pela radiaccedilatildeo Estima-se
que uma dose de 01 kGy danificaria 28 do DNA de uma ceacutelula bacteriana
enquanto que a mesma dose danificaria 014 das enzimas e somente 00005 dos
amino aacutecidos deste mesmo organismo
Pollard (1966) considera que a sensibilidade agrave radiaccedilatildeo de macromoleacuteculas eacute
aproximadamente proporcional ao seu peso molecular Neste caso poderiacuteamos dizer
que a probabilidade de se destruir os fragmentos caracteriacutesticos de cada um dos
cultivares geneticamente modificados de milho eacute realmente muito pequena Cada
um destes alvos amplificados pela teacutecnica da PCR possui em meacutedia 200 pares de
base e podem aparecer em grande quantidade dependendo do tipo da amostra
utilizada Segundo James et al (2003) a teacutecnica da PCR eacute a mais adequada para a
detecccedilatildeo de organismos geneticamente modificados pelo fato de ser altamente
sensiacutevel A presenccedila de um uacutenico fragmento do DNA transgecircnico na amostra pode
ser amplificada varias vezes pela PCR indicando assim a sua presenccedila
Quanto a detecccedilatildeo de milhos geneticamente modifiacutecados os resultados
encontrados neste trabalho satildeo compatiacuteveis com outros experimentos relacionados agrave
identificaccedilatildeo destes cultivares em nosso paiacutes Greiner et al (2004) constatou a
presenccedila de variedades geneticamente modificadas em alimentos fabricados no
Brasil Trecircs das amostras utilizadas neste trabalho as de nuacutemero 13 21 e 22
tambeacutem foram utilizadas e identificadas pelo pesquisador alematildeo A amostra de
nuacutemero 21 uma sopa de milho tambeacutem foi identificada como possuidora de milho
geneticamente modificado atraveacutes de uma pesquisa realizada pelo IDEC - Instituto
de Defesa do Consumidor e veiculada na miacutedia pela Folha de SPaulo - 21062000
As teacutecnicas utilizadas nesta pesquisa passaram por um processo evolutivo
proporcionando sua utilizaccedilatildeo na rotina laboratorial ou seja em um trabalho
laboratorial em larga escala Poreacutem algumas modificaccedilotildees cogitadas no iniacutecio das
atividades laboratoriais natildeo foram implementadas Por exemplo no iniacutecio cogitou-se
a criaccedilatildeo de uma PCR-multiplex para a identificaccedilatildeo dos milhos geneticamente
64
modificados Trabalhos como o de James et al (2003) relatam o uso da PCR-
multiplex sendo possiacutevel atraveacutes de uma uacutenica sequumlecircncia de reaccedilotildees de
amplificaccedilatildeo detectar muacuteltiplas sequecircncias alvo em uma mesma amostra
Entretanto o desenvolvimento deste protocolo mostrou-se pouco interessante
pois apenas uma das amostras estudadas a de nuacutemero 22 continha duas variedades
de milho geneticamente modifiacutecados Aleacutem disso o tamanho das sequumlecircncias alvo
para estas duas variedades de OGMs o milho B t l l e o MON810 era muito
parecido com uma diferenccedila de apenas 10 pares de base o que poderia confimdir a
leitura resultante do gel de agarose a 2 O desenvolvimento de uma PCR-
mulfiacuteplex poderia ser desenvolvida portanto unindo-se a detecccedilatildeo do DNA de
milho atraveacutes do primer IVRl com uma variedade de milho geneticamente
modifiacutecado B t l l ou MON810 Isso pelo fato de que a sequumlecircncia alvo do primer
rVRl eacute bem maior que a dos milhos Btl 1 e MON8I0 contendo cerca de 226 pares
de base Ainda segundo James et al 2003 a criaccedilatildeo de uma PCR-muhiplex para
milhos Btl 1 e MON810 eacute possiacutevel aumentando-se a concentraccedilatildeo de agarose o que
poderia ser realizado em nosso caso montando-se um gel a 3
Durante a realizaccedilatildeo deste trabalho outros protocolos oriundos de kits
comerciais foram utilizados no mesmo laboratoacuterio Uma avaliaccedilatildeo entre estas
teacutecnicas mostrou que o protocolo utilizado neste trabalho possui grandes vantagens
quando utilizado por laboratoacuterios que fazem a detecccedilatildeo de organismos
geneticamente modifiacutecados como rotina Apesar de ser mais trabalhoso o protocolo
utilizado neste experimento possui um preccedilo bem mais acessiacutevel que os kits
comerciais utilizados para este fim Outra vantagem da utilizaccedilatildeo deste protocolo in
house estaacute na possiacutevel utilizaccedilatildeo dos reagentes usados neste experimento em
protocolos voltados a outras pesquisas fato que natildeo acontece em alguns kits
comerciais que inculam os reagente do processo de extraccedilatildeo de DNA a um kit
especiacutefico para a reaccedilatildeo da PCR
65
Entre as diversas amostras utilizadas a uacutenica modificaccedilatildeo observada em
relaccedilatildeo ao resultado da detecccedilatildeo pela PCR de milhos geneticamente modificados foi
o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas refrigeradas Os protocolos
atualmente utilizados descritos em Crede et al (2005) prevecircem o estoque de DNA
Apoacutes a realizaccedilatildeo da extraccedilatildeo do DNA das amostras este material eacute mantido
estocado a uma temperatura de -18degC (freezer) No presente trabalho apoacutes nove
meses de estocagem algumas destas amostras foram utilizadas para a realizaccedilatildeo de
um artigo cientiacutefico chamando a atenccedilatildeo por natildeo apresentarem mais os resultados
positivos obtidos
Tais amostras haviam sido irradiadas com altas doses e foram testadas
tambeacutem com o primer IVRl gerando resultados negativos para a amplificaccedilatildeo das
sequumlecircncias alvo Entretanto mais da metade do material estocado irradiado a altas
doses aiacutenda apresentava a presenccedila das sequumlecircncias alvo referentes a PCR Por este
motivo natildeo eacute possiacutevel afirmar qual a relaccedilatildeo entre a irradiaccedilatildeo das amostras e a
diminuiccedilatildeo do tempo de estocagem dos DNAs provenientes de extraccedilatildeo Natildeo foi
encontrado na literamra informaccedilotildees referentes a estocagem de DNA proveniente de
material irradiado e este fato foi observado uma uacutenica vez durante o experimento
carecendo assim de maiores estudos
Sabe-se que algumas alteraccedilotildees provocadas pela irradiaccedilatildeo favorecem o
aparecimento de radicais livres Muntildeoz (1985) relaciona o aparecimento destes
radicais livres a possiacutevel danificaccedilatildeo da moleacutecula de DNA O aumento do nuacutemero
de radicais livres nestas amostras que receberam maiores doses de irradiaccedilatildeo
poderiam estar afetando o DNA armazenado diminuindo assim a sua validade
mesmo depois de estocado a baixas temperaturas
66
Outra ocorrecircncia que chamou a atenccedilatildeo durante o experimento foi a triagem
dos alimentos a serem utilizados nesta pesquisa O teste inicial para identificaccedilatildeo da
presenccedila de DNA de milho nas amostras mostrou-se negativo para alguns alimentos
que segundo o roacutetulo possuiam milho como ingrediente Alimentos oriundos de
milho como amido de milho apresentaram resultados negativos para a presenccedila de
DNA de milho natildeo podendo assim entrar para a lista das trinta amostras de
alimentos avaliados Pietsch e Waiblinger (2001) jaacute mostraram que nestes casos
toma-se importante o uso de outras teacutecnicas laboratoriais que poderiam identificar a
existecircncia de ingredientes geneticamente modificados independentemente da
presenccedila do DNA
Segundo Stave (1999) a identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados atraveacutes da existecircncia de proteiacutenas nos alimentos ainda se faz
importante justamente por este motivo Muitas vezes a identificaccedilatildeo da existecircncia
de organismos geneticamente modifiacutecados em alimentos industrializados atraveacutes da
extraccedilatildeo e amplifiacutecaccedilatildeo do DNA pode ser prejudicada pelo tipo de processamento
do alimento Sabemos que altas temperaturas degradam a moleacutecula de DNA o que
poderia afetar a pesquisa pela PCR Ainda segundo Stave (1999) eacute o produto da
siacutentese as proteiacutenas especiacutefiacutecas que podem ser responsaacuteveis por mudanccedilas nas
caracteriacutesticas do alimento e possiacuteveis modifiacutecaccedilotildees no produto que chega ao
consumidor
Apenas dois alimentos cujo roacutetulo indicavam millho como ingrediente natildeo
foram utilizados na detecccedilatildeo pela PCR por falta de DNA O amido de milho
provavelmente pelo fato de ter passado por um processo de refiacuteno bastante eficiente
e o missoshiro provavelmente por aleacutem de passar por um processo industrial
rigoroso possuir uma baixiacutessima quantidade de milho na amostra Mesmo assim foi
possiacutevel mostrar neste experimento que a teacutecnica da PCR eacute bastante sensiacutevel
67
Testes com alimemos cozidos a alta temperatura e pressatildeo como o cereal
matinal Com Flakes e o milho enlatado (cozido) mostraram que a teacutecnica da PCR eacute
sensiacutevel o bastante para identificar a existecircncia de milhos geneticamente
modificados nestas amostras Nestes casos em especial foram desenvolvidos
durante o experimento processos para aumentar a quantidade de DNA durante o
processo de extraccedilatildeo De grande importacircncia para a teacutecnica da PCR a correta e
eficiente extraccedilatildeo do DNA eacute relatada por Romano (1999) e Dickinson (1995) como
um protocolo a parte designada por muitos autores como preacute-PCR
No caso do milho que se apresenta em conserva foi desenvolvida uma
teacutecnica de secagem e moagem do material para tomaacute-lo compatiacutevel ao protocolo
original que prevecirc as amostras na forma de poacute Tal teacutecnica utiliza-se de uma estufa
para a secagem da amostra a temperatura de 45degC depois de seca a amostra eacute moiacuteda
transformando-se em farelo Estas pequenas modificaccedilotildees a fim de adequar as
amostras ao protocolo utilizado satildeo necessaacuterias segundo Gachet 1999 devido a
grande diversidade de tipos de amostras a serem analisadas
Quanto agraves amostras de Cora Flakes (cereal matinal) durante o processo de
moagem do alimento e homogeneizaccedilatildeo dos flocos foi possiacutevel notar que o farelo
resultante do processo continha dois tipos distintos de material Um poacute mais claro e
fmo formado pelo accediliicar constituinte no alimento e outro mais grosseiro amarelado
proveniente do milho Neste caso foi possiacutevel separar este material utilizando-se
para a extraccedilatildeo o material amarelado onde teoricamente a concentraccedilatildeo de DNA era
maior
Este processo de seleccedilatildeo de partes da amostra para a realizaccedilatildeo da teacutecnica da
PCR foi tambeacutem utilizada em outros alimentos o que provavelmente ajudou na
obtenccedilatildeo de uma maior concentraccedilatildeo de DNA apoacutes o processo de extraccedilatildeo realizado
nas amostras Alguns alimentos necessitaram de ajustes no protocolo de extraccedilatildeo do
m
DNA Entre eles a amostra 21 uma sopa de milho transformava-se em uma
substacircncia espessa dificultando seu manuseio Tal caracteriacutestica deve-se a presenccedila
de um espessante na amostra a goma guar Eacute interessante notar que esta
caracteriacutestica apareceu diminuiacuteda nos tubos contendo material irradiado da mesma
amostra Nestes tubos eacute possiacutevel afumar que o uso da irradiaccedilatildeo afetou os
constituintes do alimento modificando suas caracteriacutesticas
Uma importante contribuiccedilatildeo do melhoramento da teacutecnica envolvida neste
estudo estaacute relacionada a obtenccedilatildeo dos resultados finais proveniente da coloraccedilatildeo
dos geacuteis de agarose Foram implementadas e analisadas durante o experimento duas
teacutecnicas de montagem do gel de agarose Uma com a coloraccedilatildeo antes e outra depois
da eletroforese usando brometo de etiacutedio uma praacutetica comum nos laboratoacuterios de
biologia molecular Lunn e Sansone (1987) indicam uma seacuterie de precauccedilotildees no uso
desta substacircncia que possui grande afinidade pela moleacutecula de DNA sendo
classificada como de accedilatildeo mutagecircnica por Douthard (1973) As alteraccedilotildees
executadas propiciaram uma menor contaminaccedilatildeo pelo brometo de etiacutedio durante a
rotina laboratorial executando-se a coloraccedilatildeo do gel apoacutes a eletroforese Processos
de inativaccedilatildeo dos resiacuteduos contendo brometo de etiacutedio tambeacutem foram utilizados um
passo importante para o desenvolvimento de novas teacutecnicas como a sugerida por
Reiniger et al (2004) que implementa uma reciclagem da agarose em laboratoacuterios
de biologia molecular
De maneira geral este trabalho contribui para o estudo da detecccedilatildeo de
organismos geneticamente modificados demonstrando a grande sensibilidade das
atuais teacutecnicas de biologia molecular A divulgaccedilatildeo destes protocolos segundo
Cavalli (2001) toma-se necessaacuteria a fim de gerar um maior controle sobre a
produccedilatildeo e o consumo dos alimentos transgecircnicos
69
9- Conclusotildees
- Os efeitos da radiaccedilatildeo gama de ^Co e de aceleradores de eleacutetrons na
detecccedilatildeo de variedades de milho geneticamente modificados ou de alimentos que o
possuam como ingrediente eacute inexistente utilizando-se a PCR logo apoacutes a extraccedilatildeo
do DNA
- Uma rotina laboratorial na identificaccedilatildeo de organismos geneticamente
modificados foi desenvolvida com sucesso utilizando-se uma tecnologia proacutepria gt
house que apesar de mais trabalhosa mostrou-se mais acessiacutevel do que a utilizaccedilatildeo
de kits comerciais
- A uacutenica modificaccedilatildeo observada entre a detecccedilatildeo dos alimentos irradiados
para os natildeo irradiados foi o tempo de duraccedilatildeo das amostras de DNA mantidas em
geladeira Esta modificaccedilatildeo poderia ocasionar falhas na detecccedilatildeo de amostras
geneticamente modificadas originando falsos negafivos
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