Post on 06-Jan-2017
Universidade de So Paulo
Instituto de Fsica
Bioestimulao da protena de membrana Na,K-ATPase por laser
de baixa intensidade: atividade e propriedades estruturais
Gustavo Scanavachi Moreira Campos
Dissertao de mestrado apresentada ao
Instituto de Fsica para a obteno do ttulo
de Mestre em Cincias
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Rosangela Itri (Orientadora) (IFUSP)
Prof. Dr. Leandro Ramos Souza Barbosa (IFUSP)
Prof. Dr. Pietro Ciancaglini (FFCLRP/USP)
So Paulo, So Paulo - 2014
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FICHA CATALOGRFICA Preparada pelo Servio de Biblioteca e Informao do Instituto de Fsica da Universidade de So Paulo
Campos, Gustavo Scanavachi Moreira Bioestimulao da protena de membrana Na,K-ATPase por laser de baixa intensidade: atividade e propriedades estruturais. So Paulo, 2014. Dissertao (Mestrado) Universidade de So Paulo. Instituto de Fsica. Departamento de Fsica Aplicada Orientador: Profa. Dra. Rosangela Itri rea de Concentrao: Estrutura dos Lquidos e Slidos; Cristalografia Unitermos: 1.Biofisica; 2. Fsica da matria condensada; 3. Protenas da membrana; 4. Laser de estado slido; 5. Fsica. USP/IF/SBI-082/2014
Dedicatria
Aos meus pais Jefferson e Ana Maria,
Que so meus exemplos de dedicao, amor e que jamais mediram esforos
para prover o melhor possvel. Obrigado pelo incansvel incentivo, por eu ter um corpo
nesta nova experincia e lembrem-se que sem vocs eu no chegaria a lugar algum,
logo, minhas conquistas so suas tambm! Minha eterna gratido!
Aos meus irmos Carol e Filipe,
Companheiros de jornada que sempre cuidaram de mim por eu ser o mais novo!
Obrigado pelos exemplos de conduta, pela amizade, pelo amor imensurvel e
certamente pelos bons exemplos de bons estudantes que foram e continuam sendo!
Ao Luis Gabriel,
Sobrinho maravilhoso que ainda no completou o seu segundo ano de vida!
Nenm, hoje voc ainda no sabe ler (nem falar) e j se tornou o ser mais amado de
toda a famlia! Bem vindo!
Agradecimentos Especiais
Primeiramente agradeo a Deus pela oportunidade bendita e aos espritos
amigos pelas inspiraes e por sempre estarem presentes! Que os irmos possam sempre
me auxiliar a trilhar o melhor caminho.
s minhas avs que sempre me encheram de orgulho pelos admirveis exemplos
de dedicao e fora! Aos meus avs que j se encontram no plano espiritual,
especialmente, ao v Lus que nos deixou muita saudade, sempre lembrado por todos
por sua alegria, felicidade e amor!
s minhas tias, tios, primas e primos!
Ao meu cunhado Gean e minha cunhada Rachel!
Aos meus amigos Alessandro e Victor, que conviveram comigo por 5 anos na
mesma repblica! Aos atuais amigos de repblica Artur e Claudio!
Aos amigos de infncia de Mucuri!
Aos amigos de Resende Bella, Fred, Gui, Joo, Marcio, Pereira, Pelife, Nath,
Silvana... j estamos a 6 anos distantes mas continuamos com a mais nobre amizade!
Aos amigos que longe se encontram Carol, Duda, Haidar, Valentina, Ze...!
Aos amigos de So Paulo que fazem desta cidade minha casa: Arthur S., Babi,
Chris, Gerson, Lari, Tamara...! Aos amigos da Fsica e dos times de esportes!
Aos colegas de Laboratrio de So Paulo Andreza, Pradeep, Raffa e Robert pelas
inmeras horas de conversas, risadas e por tornarem o local de trabalho muito
agradvel. s funcionrias Ellen e Lia pela disposio em ajudar.
Aos amigos de Ribeiro Preto que me acolheram em sua repblica Bruno, Gil,
Lucas, Vitor S. e Victor F.! E Elisa e famlia pelos almoos deliciosos!
Aos colegas de Laboratrio de Ribeiro Preto Amanda, Ana, Bruno, Camila, Cris,
Dani, Heitor, Juliana, Larissa, Mayt, Simone e Thuanny que me acolheram no
laboratrio com muita amizade, companheirismo e sempre estiveram dispostos em
ajudar. Obrigado!
E por fim, mas no menos importante, orientadora Rosangela Itri! Muito
obrigado pela oportunidade de aprendizado e trabalho, por dividir os conhecimentos
cientficos, por estar sempre disposio em ajudar e pelas inmeras horas dispensadas
para que este projeto fosse concludo!
Agradecimentos
Ao professor Pietro Ciancaglini pela oportunidade de utilizar a infraestrutura do
seu laboratrio e pelo auxilio na preparao e execuo dos experimentos.
Ao professor Leandro Ramos Souza Barbosa pelas inmeras discusses sobre os
resultados e auxilio nas anlises de SAXS.
Ao pesquisador Mateus Borba Cardoso pela preparao da linha de SAXS 1 do
Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron.
Aos professores e funcionrios do Instituto de Fsica USP e da Faculdade de
Filosofia Cincias e Letras de Ribeiro Preto USP.
Ao CNPq, CAPES e FAPESP pela bolsa e auxlios concedidos ao laboratrio,
Nascer, morrer, renascer ainda e
progredir sempre, tal a lei.
Allan Kardec.
ndice
NDICE DE GRFICOS .................................................................................................... II
NDICE DE EQUAES ................................................................................................... V
NDICE DE TABELAS .................................................................................................... VII
LISTA DE ABREVIAES ................................................................................................ IX
RESUMO ................................................................................................................... X
ABSTRACT ............................................................................................................... XII
1. INTRODUO .................................................................................................... 1
1.1. NA, K-ATPASE ................................................................................................. 1
1.2. BIOESTIMULAO DE NA,K-ATPASE POR IRRADIAO DE LASER DE BAIXA POTNCIA ......... 6
2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 10
2.1. GERAL: .......................................................................................................... 10
2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS: ................................................................................... 10
3. MATERIAIS E MTODOS ................................................................................... 11
3.1. FRAO DE MEMBRANA RICA EM NA,K-ATPASE ..................................................... 12
3.2. SOLUBILIZAO E PURIFICAO DE NA,K-ATPASE EM C12E8 ...................................... 13
3.3. NA,K-ATPASE RECONSTITUDA EM PROTEOLIPOSSOMO ............................................ 14
3.4. ESPECTROSCOPIA DE ABSORO UV/VISVEL ......................................................... 15
3.5. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENA: MTODO DE HARTREE .................... 17
3.6. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE FOSFATO: MTODO DE HEINONEM E LAHTI ........ 20
3.7. MEDIDA DE ATIVIDADE ENZIMTICA: CINTICA DESCONTNUA .................................... 22
3.8. ESPALHAMENTO DE LUZ DINMICO (DLS) ............................................................. 25
3.9. ESPALHAMENTO DE RAIO-X A BAIXOS NGULOS (SAXS) .......................................... 31
3.10. BIOESTIMULAO DA NA,K-ATPASE POR LASER DE BAIXA POTNCIA ........................ 40
4. RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................. 43
4.1. NA,K-ATPASE SOLUBILIZADA E PURIFICADA EM C12E8: ESTUDO INICIAL POR SAXS E DLS .. 43
4.2. CARACTERIZAO DE NA,K-ATPASE EM C12E8 APS UTILIZAO DE FILTRO DE 220 NM .... 47
ESPECTROSCOPIA DE ABSORO UV-VIS ................................................................. 47
ESPALHAMENTO DE LUZ DINMICO ........................................................................ 50
ATIVIDADE ENZIMTICA E CONCENTRAO .............................................................. 53
CONCLUSES PARCIAIS: NA,K-ATPASE SOLUBILIZADA E PURIFICADA EM C12E8 .............. 54
4.3. EFEITO DA ADIO DE DODECIL SULFATO DE SDIO NOS ESTADOS AGREGADOS/OLIGOMRICOS
DA NA,K-ATPASE SOLUBILIZADA E PURIFICADA EM C12E8: ANLISE DE SAXS ....................................... 59
4.4. BIOESTIMULAO DA NA,K-ATPASE .................................................................... 73
FRAO DE MEMBRANA RICA EM NA,K-ATPASE ....................................................... 73
NA, K-ATPASE RECONSTITUDA EM PROTEOLIPOSSOMO ............................................. 76
COMPARAO DA IRRADIAO ENTRE NA,K-ATPASE EM FRAO DE MEMBRANA E
RECONSTITUDA EM PROTEOLIPOSSOMO .............................................................................................. 78
CONCLUSES SOBRE A BIOESTIMULAO DA NA,K-ATPASE ........................................ 84
5. CONCLUSO .................................................................................................... 91
7. REFERNCIAS .................................................................................................. 93
I
ndice de Figuras
Figura 1 - Esquema da Na,K-ATPase adaptado de Morth e col (2007). O esquema
apresenta as trs subunidades (,,) e os trs domnios intracelulares de (A, N, P). A
subunidade est em vermelho, a est amarelo e a est em verde claro. O domnio A
est em roxo, o N est em marrom e o P est em laranja. Em azul est o C-terminal. .... 2
Figura 2 Esquematizao do Ciclo de Albers-Post (adaptado de Gadsby e col (2012)).
.......................................................................................................................................... 4
Figura 3 Efeitos da irradiao com laser tipo diodo (InGaAIP, 685 nm, 25 mW) na
atividade da Na,K-ATPase (0,1 mg/mL) presente em: () frao de membrana, ()
solubilizada em C12E8 e () vesculas de DPPC:DPPE. (Extrado de Santos e col (2007)).
.......................................................................................................................................... 8
Figura 4 - Rim ao ser extrado (esquerda), rim cortado ao meio (direita), pedao maior
ainda no sofreu incises e pedao menor j est preparado para ser triturado. ............ 12
Figura 5- Espectroscopia de Absoro. .......................................................................... 15
Figura 6- Esquema de Espalhamento de Luz Dinmico (extrado de Giacomelli (2009)).
........................................................................................................................................ 26
Figura 7 - Arranjo experimental esquemtico utilizado na tcnica de SAXS (adaptado de
Barbosa e col. (2012)). ................................................................................................... 32
Figura 8 - Representao de Kratky para trs conformaes da BSA (extraido de Barbosa
e col (2012)).................................................................................................................... 35
Figura 9 Estrutura cristalogrfica do dmero ()2 da Na,K-ATPase (Kanai et al., 2013)
esquerda. direita est a estrutura cristalogrfica do monmero (). A cor muda
gradualmente do N-terminal (azul) at o C-terminal (vermelho) para as subunidades e
(Kanai et al., 2013). ..................................................................................................... 39
II
Figura 10 Esquema do procedimento de irradiao. ................................................... 40
Figura 11 Membrana porosa de 220 nm. ..................................................................... 47
Figura 12 - Grfico de AUC para amostra de Na,K-ATPase solubilizada em C12E8 e
filtrada obtido por Yoneda (2014). Distribuio do coeficiente de sedimentao c(S) vs.
Coeficiente (S) das amostras de Na,K-ATPase solubilizada aps a filtrao (100 nm) nas
concentraes de 60 g/mL (preto) e 100 g/mL (vermelho). A corrida foi de 14 h com
uma velocidade de 12000 rpm, a 13 C (Extrado de Yoneda (2014)). ......................... 55
Figura 13 - Propriedades das espcies observadas nos experimentos a 12000 rpm
(Extrado de Yoneda (2014)). ......................................................................................... 56
ndice de Grficos
Grfico 1 - Calibrao da concentrao de protena pelo mtodo de Hartree, utilizando
BSA. ............................................................................................................................... 19
Grfico 2 - Absoro x Comprimento de onda para soluo padro de Fosfato. ........... 21
Grfico 3 - Absoro em 355nm para soluo padro de Fosfato.................................. 22
Grfico 4 Medida de Atividade pelo mtodo descontinuo em funo da soluo de
protena. .......................................................................................................................... 24
Grfico 5 Curvas de SAXS de Na, K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8,
concentrao da protena de 0,8 mg/mL, submetida a diferentes doses de irradiao (A).
(B) curvas tericas de SAXS do monmero e dmero (PDB 3WGV Kanai et al., 2013),
obtidas pelo programa CRYSOL (Svergun et al., 1995). (C) funo de distribuio de
distncias p(r) correspondentes s intensidades de espalhamento das amostras de Na,K-
ATPase submetidas a diferentes doses de irradiao e do monmero e do dmero. ...... 44
III
Grfico 6 - Medidas de DLS identificando a existncia de diferentes populaes na
amostra de Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8, concentrao da protena
era de 0,55 mg/mL, atividade especfica de 415 U/mg. ................................................ 46
Grfico 7 Espectro de Absoro para Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8
antes e aps filtrao com poro de 220 nm. ................................................................... 48
Grfico 8 - Absoro em 280 nm da enzima Na,K-ATPase solubilizada e purificada em
C12E8 em funo do tempo. ............................................................................................ 49
Grfico 9 - DLS para analisar a influncia do filtro na amostra de Na,K-ATPase
solubilizada e purificada em C12E8. A concentrao era de 0,68 mg/mL e 0,55 mg/mL,
antes e aps a filtrao, respectivamente. ....................................................................... 51
Grfico 10 - DLS da amostra de Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 em
funo do tempo. A concentrao da protena era de 0,54 mg/mL. ............................... 52
Grfico 11 - Atividade Especfica em funo da concentrao da Na, K-ATPase
solubilizada e purificada em C12E8 em relao ao filtro de 220nm. ............................... 53
Grfico 12 - Aumento da atividade especfica da Na,K-ATPase solubilizada e purificada
em C12E8 e perda de concentrao aps utilizar o filtro de 220 nm. .............................. 54
Grfico 13 Funo de distribuio de distncias, p(r), para a Na,K-ATPase solubilizada
e purificada em C12E8 antes e aps a utilizao do filtro com poro de 100 nm. ............ 60
Grfico 14 - SAXS para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 ausncia de
SDS e na presena de 0,5 mM e 1 mM de SDS (A), a concentrao da protena era de
0,46 mg/mL. (B) SAXS para o monmero e o dmero tericos (PDB 3WGV). Os mesmos
dados so apresentados com a intensidade de espalhamento em escala logartmica nos
grficos inseridos em (A) e (B). ..................................................................................... 61
IV
Grfico 15 - (A) Representao de Kratky para o monmero e o dmero tericos (PDB
3WGV) e para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na ausncia de SDS e
adicionando 0,5 mM e 1 mM de SDS amostra purificada. (B) comparao entre a
amostra de protena na ausncia de SDS e as curvas tericas; (C) comparao entre a
amostra de protena com adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS; e (D) comparao entre as
curvas experimentais. A concentrao da protena era de 0,46 mg/mL. ........................ 62
Grfico 16 - (A) Representao de Guinier para o monmero e o dmero tericos (PDB
3WGV) e para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na ausncia de SDS e
aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS amostra purificada. As setas indicam o maior
valor de utilizado no ajuste de uma equao linear: amostras experimentais (seta azul),
monmero e o dmero tericos (seta preta). (B) curvas tericas (smbolos abertos) com os
respectivos ajustes de uma equao linear (linha slida); (C) curvas experimentais
(smbolos abertos) com os respectivos ajustes de uma equao linear (linha slida). A
concentrao da protena era de 0,46 mg/mL. ................................................................ 64
Grfico 17 (A) Funo de distribuio de distncias para o monmero e o dmero
tericos (PDB 3WGV) e para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na
ausncia de SDS e aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS. (B) comparao entre a
amostra de protena na ausncia de SDS e aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS; (C)
comparao entre a amostra de protena aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS e o
dmero terico. A concentrao da protena era de 0,46 mg/mL. .................................. 66
Grfico 18 - Atividade especfica da Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8
seguida de adio de SDS. A concentrao da protena era de 0,46 mg/mL ................. 70
Grfico 19 - Biomodulao da Na,K-ATPase presente na frao de membrana. A
concentrao da protena era de 1,53 mg/mL. Para cada ponto experimental foram
V
irradiados 100 L de amostra para realizar medidas de atividade em triplicata (3 medidas
de 30 L de amostra). ..................................................................................................... 74
Grfico 20 - Monitoramento da variao da atividade da Na,K-ATPase em frao de
membrana em funo do tempo ps irradiao. A concentrao da protena era de 1,53
mg/mL. Cada ponto experimental corresponde as medidas de irradiao de 100 L de
amostra para realizar medidas de atividade em triplicata (3 medidas de 30 L de amostra).
........................................................................................................................................ 75
Grfico 21 - Biomodulao da Na,K-ATPase reconstituda em proteolipossomo. A
concentrao da protena era de 1,68 mg/mL. Para cada ponto experimental foram
irradiados 35 L de amostra para realizar medidas de atividade em triplicata (3 medidas
de 10 L de amostra). ..................................................................................................... 76
Grfico 22 - Variao da atividade da Na,K-ATPase reconstituda em proteolipossomo
em funo do tempo ps irradiao. A concentrao da protena era de 1,68 mg/mL. Cada
ponto experimental corresponde as medidas de irradiao de 35 L de amostra para
realizar medidas de atividade em triplicata (3 medidas de 10 L de amostra)............... 77
Grfico 23 Irradiao com o laser de = 532 nm: Proteolipossomo x Frao de
membrana. ...................................................................................................................... 79
Grfico 24 Irradiao com o laser = 650 nm: Proteolipossomo x Frao de membrana.
........................................................................................................................................ 80
Grfico 25 Irradiao com o laser = 780 nm: Proteolipossomo x Frao de membrana.
........................................................................................................................................ 82
ndice de Equaes
Equao 1 - Lei de Beer Lambert ................................................................................... 15
VI
Equao 2 Atividade Enzimtica. ................................................................................ 24
Equao 3 - Atividade Enzimtica Especfica. ............................................................... 25
Equao 4 - Exemplo de Atividade Especfica. ............................................................. 25
Equao 5 Mdulo do Vetor de Espalhamento de Luz. .............................................. 26
Equao 6 - Intensidade mdia do campo eltrico associado ao feixe de luz espalhado.
........................................................................................................................................ 27
Equao 7 Funo de auto correlao. ........................................................................ 27
Equao 8 - Equao de Siegert para sistemas dluidos. ................................................ 28
Equao 9 - Relao entre funo de auto correlao do campo eltrico e a taxa de
decaimento da funo de auto correlao do campo eltrico. ........................................ 28
Equao 10 - Taxa de decaimento e coeficiente de difuso translacional das partculas
espalhadoras.................................................................................................................... 28
Equao 11 - Equao de Stokes-Einstein. .................................................................... 29
Equao 12 - Relao entre auto correlao do campo eltrico, taxa de decaimento da
funo de auto correlao do campo eltrico e coeficiente de difuso para uma
distribuio polidispersa de tamanhos de partculas....................................................... 29
Equao 13 - Equao do Z average. ............................................................................. 30
Equao 14 - ndice de polisperso. ............................................................................... 30
Equao 15 Mdulo do vetor de espalhamento utilizado para anlise dos dados de
SAXS. ............................................................................................................................. 32
Equao 16 - Intensidade de Espalhamento de SAXS. .................................................. 33
Equao 17 - Intensidade de Espalhamento de SAXS para sistema isotrpico. ............ 33
Equao 18 - Intensidade de SAXS para sistema isotrpico e no interagente. ............ 34
Equao 19 - Lei de Guinier. .......................................................................................... 35
VII
Equao 20 - Equao Linear para representao de Guinier. ....................................... 36
Equao 21 - Raio de giro de Guinier obtido a partir do contraste de densidade eletrnica
. ................................................................................................................................. 36
Equao 22 - Transformada de Fourier para obter . .................................................. 37
Equao 23 - Raio de Giro obtido a partir da funo de distribuio de distncias . . 37
Equao 24 - Raio de giro para soluo com diferentes estados oligomricos. ............. 38
Equao 25 - Definio de Potncia. .............................................................................. 41
Equao 26 - Definio de Dose. ................................................................................... 41
ndice de Tabelas
Tabela 1 - Patologias relacionadas Na,K-ATPase (Tabela extrada de Rose e Valdes,
1994). ................................................................................................................................ 5
Tabela 2 - Comparao do raio de giro e distncia mxima obtidos pela funo de
distribuio de distncias para o monmero e o dmero e para a Na,K-ATPase
solubilizada e purificada em C12E8 aps irradiaes. Como os valores de e Dmax so
os mesmos para todas amostras medidas, estes valores esto apresentados uma nica vez
na coluna Amostras experimentais. ................................................................................ 45
Tabela 3 - Coeficientes do ajuste linear obtidos para o monmero e o dmero tericos e
para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na ausncia de SDS e aps adio
de 0,5 mM e 1 mM de SDS amostra purificada........................................................... 65
Tabela 4 - Valores de e (0) obtidos atravs da lei de Guinier para o monmero e o
dmero e para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na ausncia de SDS e
aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS amostra purificada. ...................................... 65
VIII
Tabela 5 - Comparao do raio de giro obtido pela lei de Guinier e pela funo de
distribuio de distncias para o monmero e o dmero tericos e para a Na,K-ATPase
solubilizada em C12E8 e purificada na ausncia de SDS e aps adio de 0,5 mM e 1 mM
de SDS amostra de protena purificada........................................................................ 67
IX
Lista de Abreviaes
ADP Adenosina Difosfato
ATP Adenosina trifosfato
AUC Ultracentrifugao Analtica
BSA Albumina de Soro Bovino
C12E8 Octaetileno Glicol Monododecil ter
Cys Cistena
DLS Espalhamento de luz dinmico
DPPC Dipalmitoilfosfatidilcolina
DPPE Dipalmitoilfosfatidiletanolamina
EDTA cido Etilenodiamino Tetra-Actico
KCl Cloreto de Potssio
HEPES cido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfnico)
PDB Protein Data Bank (Banco de dados de protenas)
Phe Fenilalanina
RPM Rotaes Por Minuto
SAXS Espalhamento de raios-X a baixos ngulos
SDS Dodecil Sulfato de Sdio
TCA cido Tricloroactico
TDS - Tris dodecil sulfato;
Tris Tris-(hidroximetil)-aminoetano
Trp Triptofano
Tyr Tirosina
X
Resumo
A Na, K-ATPase uma protena que realiza o transporte ativo de ctions, se
encontra na membrana plasmtica de praticamente todas clulas animais e formada por
trs subunidades: (110 kDa), (50 kDa) e (10 kDa).
Neste trabalho, realizou-se a extrao da protena Na,K-ATPase de rim de coelho
que foi preparada em 3 diferentes condies (i) frao de membrana rica em Na,K-
ATPase; (ii) solubilizada e purificada em C12E8 e (iii) reconstituda em DPPC: DPPE
lipossomo (1:1 lipdio:lipdio, 1:3 lipdio:protena).
Atravs de medidas de Espalhamento de Luz Dinmico (DLS), Espectroscopia de
Absoro (ABS) e Espalhamento de Raio-X a Baixos ngulos (SAXS), associadas
medidas de atividade enzimtica, constatou-se que a amostra de Na,K-ATPase
solubilizada e purificada em C12E8 constituida por diferentes agregados/oligmeros em
soluo. Com o intuito de eliminar os grandes agregados/oligmeros da amostra realizou-
se a filtrao (poro de 220 nm) e a adio do surfactante dodecil sulfato de sdio (SDS)
e ambos procedimentos foram capazes de eliminar as populaes de grandes agregados
e/ou grandes oligmeros. A retirada destas populaes pelo filtro promoveu um aumento
de atividade especfica da enzima. J o SDS deve promover alteraes conformacionais
na estrutura da protena que causam a inativao da mesma.
Investigou-se variaes de atividade da Na, K-ATPase atravs da irradiao da
protena presente em frao de membrana e reconstituda em lipossomo por meio de trs
lasers de baixa intensidade com comprimentos de onda diferentes: = 532 nm (5 mW),
= 650 nm (50 mW) e = 780 nm (50 mW). Demonstrou-se que a variao da atividade
XI
enzimtica depende do valor de dose de energia depositada, independe do comprimento
de onda estudado neste intervalo e retorna para o nvel basal aps 6 horas.
XII
Abstract
The Na, K-ATPase is an active cation transporter protein, which is found in the
plasma membrane of virtually all animal cells and it is comprised of three subunits:
(110 kDa), (50 kDa) and (10 kDa).
In this work, we performed the extraction of protein Na, K-ATPase from the
kidney of adult rabbit for three different enzyme preparations (i) membrane-bound
fraction; (ii) C12E8 solubilized and purified and (iii) reconstituted in DPPC: DPPE
liposome (1: 1 - lipid: lipid, 1:3 - lipid:protein).
Dynamic Light Scattering (DLS), Absorption Spectroscopy (ABS) and Small
Angle X-ray Scattering (SAXS) were employed, associated with enzyme activity
measurements. The results revealed that Na, K-ATPase C12E8-solubilized and purified is
composed by different aggregates/oligomers. With the aim of eliminating large
aggregates/oligomers from the protein sample, filtration (pore size 220 nm) and surfactant
sodium dodecyl sulfate (SDS) addition were used. Both procedures were able to eliminate
populations composed of large aggregates and/or large oligomers. The removal of these
populations by the filter promoted an increase in the specific activity of the enzyme. On
the other hand, SDS must promote conformational changes in the protein structure that
inactivate thereof.
Finally, here we also investigated variations of Na, K-ATPase activity present in
the membrane-bound fraction and reconstituted in liposome under irradiation of three
low-intensity lasers with different wavelengths: = 532 nm (5mW), = 650 nm (50 mW)
and = 780 nm (50 mW). The results give support to the conclusion that the change in
the enzymatic activity depends upon the amount of energy dose deposited, it is
II
independent of the wavelength in the studied range and returns to the basal level after 6
hours.
1
1. Introduo
1.1. Na, K-ATPase
A protena Na,K-ATPase uma protena de membrana celular que est presente
em quase todas as clulas eucariotas e controla direta ou indiretamente muitas funes
celulares essenciais (Rose e Valdes, 1994).
Esta protena faz parte da famlia das ATPases tipo P, que representam uma famlia
de transportadores ativos de ons caracterizados pela formao de um estado intermedirio
fosforilado (Kaplan, 2002; Apell, 2004). A Na,K-ATPase utiliza a energia livre de Gibbs
originada na hidrlise do ATP para transportar os ons de Na+ para fora e K+ para dentro
da clula (Apell, 2004). Este transporte ativo, pois ocorre contra o gradiente de
concentrao de cada um dos ons e para cada molcula de ATP hidrolisada so
transportados 3 ons de Na+ e 2 ons de K+ (Skou e Esmann, 1992). Em um animal em
repouso, cerca de 25% do ATP celular consumido pela Na,K-ATPase (Martin, 2005).
O transporte ativo realizado pela Na,K-ATPase gera o potencial eletroqumico ao
longo da membrana citoplasmtica que fornece energia para o transporte secundrio
intracelular de metablitos e nutrientes como a glicose e os aminocidos, e ons como o
clcio, cloretos e fosfatos. Alm disso, este potencial eletroqumico essencial para a
regulao do volume celular e para o potencial de ao dos msculos e transmisso do
impulso nervoso (Rose e Valdes, 1994; Apell, 2004; Skou e Esmann, 1992).
A Na,K-ATPase pode ser formada por diferentes associaes entre duas
subunidades principais e (Rose e Valdes, 1994). Uma estrutura cristalizada foi obtida
por Morth e col (2007), e est esquematizada na Figura 1. A subunidade (Figura 1)
possui massa molecular de aproximadamente 110 kDa e contm aproximadamente 1000
2
resduos de aminocidos (Jorgensen et al., 2003). Possui 10 segmentos do tipo
transmembrana 5 alas extracelulares e 4 intracelulares em sua estrutura (Jorgensen et al.,
2003; Kaplan, 2002; Khlbrandt, 2004; Yoneda, 2014). A parte extracelular compreende
os domnios A (atuador), N (ligao do nucleotdeo) e P (fosforilao) (Figura 1). O
domnio N o de ligao do ATP e o domnio P catalisa a transferncia do grupo -fosforil
para a enzima (Figura 1). Durante o ciclo cataltico, o domnio P interage com o domnio
N levando a auto fosforilao. Alm disso, o domnio P interage com o domnio A
levando a desfosforilao (Kaplan, 2002; Reinhard et al., 2012; Yoneda, 2014).
Figura 1 - Esquema da Na,K-ATPase adaptado de Morth e col (2007). O esquema apresenta as trs
subunidades (,,) e os trs domnios intracelulares de (A, N, P). A subunidade est em vermelho, a
est amarelo e a est em verde claro. O domnio A est em roxo, o N est em marrom e o P est em
laranja. Em azul est o C-terminal.
A subunidade (Figura 1) composta por cerca de 370 aminocidos e possui
massa molecular aparente de cerca de 50 kDa. Esta subunidade apresenta um nico
3
segmento transmembrana, aproximadamente 30 resduos so expostos no citosol e 300
formam a poro extracelular (Skou e Esmann, 1992; Hasler et al., 1998; Kaplan, 2002;
Jorgensen et al., 2003). Funes esto sendo atribudas subunidade : processos
relacionados polaridade da clula, como a adeso e mobilidade celular, transio de clula
epitelial a mesenquimal e transformao oncognica; afinidade aparente da enzima pelo K+;
alm de ser essencial para a translao, estabilidade e correta insero da subunidade
na membrana (Hasler et al. 1998; Barwe et al., 2007).
Alm das subunidades e , a Na,K-ATPase, em alguns tecidos, pode apresentar
outra subunidade que modula a atividade da enzima pela mudana da afinidade aparente
pelo sdio, potssio e ATP (Gerring, 2008). Esta subunidade chamada de (Figura 1),
possui um nico segmento transmembrana e uma massa molecular de cerca de 10 kDa
(Gerring, 2006).
A menor unidade funcional da Na,K-ATPase ligada membrana ainda no
conhecida. Alguns autores defendem que um monmero (Ward e Cavieres, 1993;
Martin et al., 2000; Takeda e Kawamura, 2001) suficiente para a enzima ser ativa e
manter a estrutura, mas outros defendem que necessrio um oligmero de ordem maior,
podendo ser um dmero ()2 (Thoenges e Schoner, 1997; Antolovic et al., 1999; Santos
e Ciancaglini, 2003; Laughery et al., 2004; Pilotelle-Bunner et al., 2008) ou at mesmo
um tetrmero ()4 (Mahaney et al., 1990; Taniguchi et al., 2001; Donnet et al., 2001).
Apesar de no haver um consenso nesta questo, sabe-se que as seguintes isoformas so
capazes de realizar a atividade cataltica: , 2, 3, 2, 22, 23, 3, 32, 33, 4 e
43 (Blanco, 2005).
Alm destes oligmeros formados entre e , existem as estruturas formadas por
apenas uma das subunidades. Em animais muitas isoformas de e esto presentes, como
4
por exemplo a 1 e 1 presentes praticamente em todos os tecidos; 2 e 2 so encontradas
predominantemente no crebro; 3 localizada principalmente no corao e no crebro; 4
e 3 encontradas nos testculos (Matin-Vassalo et al., 1989; Rose e Valdes, 1994; Malik
et al., 1996; Khlbrandt, 2004; Blanco, 2005; Madan et al., 2007; Morth et al., 2007).
Em humanos as subunidades so encontradas na forma no crebro, olho,
corao, rim, pulmo, msculo liso, tireoide e no tero; 2 no crebro, olho, corao,
msculo liso e tireoide; e 3 no crebro, corao e olho e 4 no corao (Matin-Vassalo et
al., 1989; Rose e Valdes, 1994; Malik et al., 1996; Blanco, 2005; Madan et al., 2007;
Morth et al., 2007).
A hidrlise do ATP realizada pela Na,K-ATPase descrita pelo modelo de
Albers-Post esquematizado na Figura 2 (Gadsby et al., 2012).
Figura 2 Esquematizao do Ciclo de Albers-Post (adaptado de Gadsby e col (2012)).
5
Neste ciclo a Na,K-ATPase apresenta dois estados conformacionais distintos: uma
forma E1 que tem alta afinidade pelos ons sdio e os stios de ligao so acessados pelo
meio intracelular. Nesta conformao a enzima libera 2 K+ (indicado na Figura 2 com
uma seta, as bolas laranjas representam os ons potssio) no interior da clula e 3 Na+
(bolas verdes Figura 2) se ligam, so ocludas e a protena fosforilada. Na forma E2 a
protena apresenta alta afinidade pelo on potssio e os stios de ligao ficam disponveis
para o meio extracelular. Os ons de sdio so liberados no meio externo, os ons de
potssio so ligados e a ligao do K+ estimula a desfosforilao do estado P-E2.K2,
liberando um fosfato livre (Pi, indicado pela estrela na Figura 2), resultando no estado
ocludo E2.K2. Aps isto os ons de potssio so liberados no meio intracelular e outra
molcula de ATP se liga enzima para recomear o ciclo de Albers-Post (Skou e Esmann,
1992; Gadsby et al., 2012).
Como j foi mencionado a Na,K-ATPase est presente em quase todos os animais
e possui vrias funes fisiolgicas. A regulao desta enzima, bem como das isoformas,
pode ter um papel importante na etiologia de muitos processos patolgicos (Rose e
Valdes, 1994). A Tabela 1 abaixo relaciona algumas doenas originadas pela no
regulao, por alterao na expresso e/ou mau funcionamento da Na,K-ATPase em
humanos.
Patologia Nmero de Referncias
Doenas Cardacas 4
Hipertenso 10
Doenas Renais 4
Diabetes e doenas metablicas 8
Anormalidades Fetais 3
Alzheimer 4
Doenas no Pulmo 3
Tabela 1 - Patologias relacionadas Na,K-ATPase (Tabela extrada de Rose e Valdes, 1994).
6
A lista completa com as subdivises das doenas e com as referncias encontra-
se no artigo de reviso Understanding the Sodium Pump and Its Relevance to Disease
escrito por Rose e Valdes, 1994.
Outro papel fisiolgico da Na,K-ATPase contribuir para a manuteno da
temperatura corporal. Isto ocorre, pois parte da energia liberada pela hidrlise do ATP
convertida em forma de calor (Noske et al., 2010).
Alm disso, a Na,K-ATPase pode ser utilizada como alvo de drogas, por exemplo
a subunidade o nico receptor conhecido de glicosdeos cardacos e, por isso,
utilizada como alvo de drogas para o tratamento clnico de insuficincia cardaca e
arritmias (MacGregor e Walker, 1993; Schwinger et al., 2003).
1.2. Bioestimulao de Na,K-ATPase por irradiao de laser de baixa potncia
Bioestimulao ou Biomodulao so processos pelos quais uma enzima ou
protena tem sua atividade aumentada (ou estimulada) devido a sua interao com a luz
(geralmente na regio do visvel). Existem diversos grupos de pesquisa que centram seus
estudos na interao da luz em sistemas biolgicos (Letokhov, 1983; Wilson, 1989; Yu
et al., 1994; Marra et al., 1997; Walsh, 1997; Kilanczyk et al., 2002; Vinck et al., 2003;
Kujawa et al., 2004; Kassak et al., 2006; Hamblin e Demidova-Rice, 2007; Hu et al.,
2007; Santos et al., 2007).
De maneira interessante, existem alguns trabalhos na literatura que reportam
variao de atividade da Na,K-ATPase aps irradiao com laser de baixa potncia.
Kilanczyk e col (2002) fizeram o estudo da influncia de um laser vermelho (670 nm, 7
7
mW de potncia) na atividade enzimtica da Na,K-ATPase presente na membrana de
clulas ghosts obtidas a partir de eritrcitos humanos.
Cabe acrescentar que as clulas ghosts so resduos da reao ps-hemoltica de
clulas vermelhas do sangue. Assume-se que estes resduos so desprovidos de estrutura
intracelular e consistem, principalmente, de protenas transmembranas fixadas
membrana celular (Schwoch e Passow, 1973).
Os autores variaram a dose de energia entre 19 95 J/cm2 e constataram o aumento
da atividade em todos os casos, sendo a maior delas de 400% para a dose de 57 J/cm2.
Kujawa e col (2004) utilizaram um laser infravermelho (810 nm, com diferentes
potncias de sada: 10 mW, 200 mW e 400 mW) para irradiar clulas ghosts obtidas a
partir de eritrcitos humanos que continham as protenas Mg-ATPase e Na,K-ATPase na
membrana celular. Neste estudo, os autores demonstraram que as mesmas doses de
energia estimulam a atividade enzimtica quando entregues em pequenas taxas de dose
de energia e inibem a enzima para altas taxas de dose.
Assim como Kilanczyk e col (2002), Kassak e col (2006) realizaram a irradiao
de Na,K-ATPase presente em clulas ghosts obtidas a partir de eritrcitos humanos,
utilizando um laser verde (532 nm, 30 mW de potncia) para este estudo. Os autores
reportaram um acrscimo na atividade da Na,K-ATPase de 52% para a dose de 19 J/cm2
e que este aumento foi linear em funo da dose de energia chegando a 120% para a dose
de 63,3 J/cm2.
O grupo do Prof. Pietro Ciancaglini (Departamento de Qumica da USP, Ribeiro
Preto) tambm estudou a influncia da interao de luz na atividade da protena (Santos
8
et al., 2007). No referido trabalho os autores estudaram a influncia da dose de energia
depositada (com laser de InGaAIP, 685 nm, 35 mW de potncia) na atividade da enzima,
sendo que esta foi extrada de membrana de rim de coelho e os estudos forma realizados
com diferentes preparaes da enzima: i) frao de membrana; ii) solubilizada e
purificada na presena do surfactante no inico C12E8 e iii) reconstituda em lipossomos
(com um sistema de membrana modelo, constitudo por DPPC:DPPE (1:1) proporo
molar).
A Figura 3 reproduz os resultados obtidos (com permisso dos autores) por Santos
e col. (2007).
Figura 3 Efeitos da irradiao com laser tipo diodo (InGaAIP, 685 nm, 25 mW) na atividade da Na,K-
ATPase (0,1 mg/mL) presente em: () frao de membrana, () solubilizada em C12E8 e () vesculas de
DPPC:DPPE. (Extrado de Santos e col. (2007)).
Para o sistema da Na,K-ATPase na frao de membrana, foi evidenciado que
doses entre 4 24 J/cm2 no alteram de forma significativa a atividade da protena.
Entretanto, doses de 32 a 40 J/cm2 aumentam em cerca de 28 % a atividade ATPase da
9
protena, enquanto que doses acima de 40 J/cm2 no produzem um efeito maior (Figura
3). Por outro lado, para o sistema da enzima reconstituda em lipossomo de DPPC:DPPE
(1:1), uma dose de 4 8 J/cm2 levou a um aumento de atividade ATPase da enzima de 36
a 40 %, em relao protena no irradiada nas mesmas condies. Os autores tambm
evidenciaram que o aumento da dose aps cerca de 8 J/cm2 no altera de forma
significativa a atividade da protena (Figura 3). O efeito da irradiao na Na,K-ATPase
isolada e purificada na presena do surfactante C12E8 mostrou ser muito similar ao efeito
evidenciado na enzima reconstituda em vesculas de DPPC:DPPE (Figura 3).
Embora o aumento da atividade da Na,K-ATPase seja incontestvel (Kilanczyket
al., 2002; Kujawa et al., 2004; Kassak et al., 2006; Santos et al., 2007) - Figura 3), o
mecanismo de atuao pelo qual a Na,K-ATPase tem sua atividade estimulada; a
influncia do meio em que est inserida; a dependncia do comprimento de onda bem
como potncia do laser, ainda no foram bem compreendidos.
Assim, nesta dissertao de mestrado temos como objetivo estender o trabalho de
Santos e col. (2007), buscando definir se e como a bioestimulao da Na,K-ATPAse
depende do comprimento de onda dos ftons incidentes, da potncia do laser (ou da
energia depositada) e da importncia do mimtico de membrana natural (ou seja, o
microambiente onde a enzima est associada: frao de membrana, solubilizada ou
reconstituda)
10
2. Objetivos
2.1. Geral:
O objetivo desta dissertao investigar as variaes de atividade enzimtica da
Na,K-ATPase, em 3 preparaes diferentes: (frao de membrana, solubilizada e
purificada C12E8, ou reconstituda em lipossomos), sob irradiao de ftons de baixa
intensidade (potncia de laser menor que 50 mW), em trs comprimentos de onda
diferentes (532 nm - verde, 650 nm - vermelho e 780 nm - infra-vermelho) em funo da
dose de energia depositada.
2.2. Objetivos Especficos:
1) Preparar a protena nos 3 diferentes preparaes (i) frao de membrana rica
em Na,K-ATPase; (ii) solubilizada e purificada em C12E8 e (iii) reconstituda
em lipossomo.
2) Investigar por SAXS, DLS e Espectroscopia de Absoro possveis estados de
agregao/oligomerizao e estabilidade temporal da protena solubilizada e
purificada em C12E8.
3) Determinar as variaes da atividade enzimtica da Na,K-ATPase nos 3
diferentes meios ao de lasers (dose de energia depositada e comprimento
de onda).
11
3. Materiais e Mtodos
Nesta dissertao de mestrado, todas as preparaes da protena Na,K-ATPase
extrada de rim de coelhos (Oryctolagus cuniculus), conforme descrio a seguir, foram
realizadas no Laboratrio de Nanobiotecnologia Aplicada: Sistemas Mimticos de
Biomembranas do Departamento de Qumica da FFCLRP/USP de Ribeiro Preto, sob a
superviso do Professor Pietro Ciancaglini e da Doutora Juliana Sakamoto Yoneda. Os
procedimentos para obteno da protena em membrana natural e purificada em C12E8
seguiram os protocolos descritos por Santos e col. (2002), enquanto que os procedimentos
para a preparao da protena reconstituda em proteolipossomo esto descritos por
Santos e col. (2005).
Os reagentes utilizados neste projeto foram obtidos na melhor pureza disponvel
no mercado. Adenosina trifosfato (ATP), albumina de soro bovino (BSA), cido N-(2-
hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfnico (HEPES), octaetileno glicol monododecil
ter (C12E8), cido tricloroactico (TCA), tris(hidroximetil)-aminoetano (Tris), dodecil
sulfato de sdio (SDS) e o cloreto de potssio (KCl) foram adquiridos na empresa Sigma.
cido etilenodiamino tetra-actico (EDTA), Folin Ciocalteau, imidazol, sulfato de cobre
pentahidratado foram comprados na empresa Merck. Acetona, cido ctrico, carbonato de
sdio, hidrxido de sdio, molibdato de amnio, tartarato de sdio e potssio e sacarose
foram adquiridas na empresa Mallinckrodt AR. Fosfato de Potssio Monobsico na
empresa J.T Baker. Os lipdios dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e
dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) foram comprados na Sigma. Todas as solues
foram preparadas usando gua Milli-Q (Millipore Direct-Q, resistncia de 18.2 M).
12
3.1. Frao de membrana rica em Na,K-ATPase
Os rins extrados dos coelhos foram recebidos como na Figura 4 (esquerda).
Utilizando uma tesoura e um bisturi realizaram-se cortes e incises para remoo das
partes indesejadas que foram descartadas. A regio de interesse a parte escura do rim
que rica em Na, K-ATPase (Figura 4).
Figura 4 - Rim ao ser extrado (esquerda), rim cortado ao meio (direita), pedao maior ainda no sofreu
incises e pedao menor j est preparado para ser triturado.
As partes de interesse foram colocadas em uma soluo tampo (preparao) de
Imidazol 20 mM em pH 6.8 contendo sacarose 250 mM, EDTA 6 mM e Tris 6 mM, onde
foram trituradas utilizando um homogeneizador (SuperOhm) por 30 segundos (Santos et
al., 2002).
A soluo homognea foi centrifugada (Sorvall RC-5B Superspeed Centrifuge) a
10 000 g por 35 min a 4 C. O pellet foi descartado (gorduras e impurezas) enquanto que
o sobrenadante foi ultracentrifugado (Hitachi - Himac CP 70MX) a 180 000 g por 1 hora
a 4 C (Santos et al., 2002).
Tecido escuro
rico em Na, K-ATPase.
http://www.gmi-inc.com/sorvall-rc-5b-superspeed-centrifuge.html
13
Aps a ultracentrifugao, o pellet constitudo de frao de membrana rica em
Na,K-ATPase foi ressuspenso utilizando a soluo tampo de preparao mencionada
anteriormente. Aps estes procedimentos, as amostras foram estocadas na geladeira a 4
C.
3.2. Solubilizao e Purificao de Na,K-ATPase em C12E8
A partir da preparao de membrana natural contendo Na,K-ATPase descrita
acima, quantifica-se a concentrao da protena total conforme metodologia que ser
descrita no item 3.4. Sabendo-se a concentrao da protena na membrana natural,
preparou-se uma soluo de C12E8 (98% de pureza, Sigma) com esta mesma
concentrao. A solubilizao em detergente foi feita misturando a soluo de C12E8 com
a soluo da frao de membrana numa relao protena:detergente de 1:1 (p/p), a 4C, e
os resduos no solubilizados foram retirados por centrifugao a 100 000 g por 1 hora a
4 C (Santos et al., 2002).
A Na,K-ATPase solubilizada foi purificada em sistema HPLC kta (Amersham
Biosciences) empregando-se col.una de Sepharose 6FF (2,6 x 200 cm), equilibrada e
eluda com tampo Tris.HCl 5 mM, pH 7,0, contendo EDTA 1 mM, KCl 150 mM e C12E8
0,005 mg/mL, a 4C. O eluato foi monitorado continuamente a 280 nm (banda de
absoro do Triptofano, conforme ser descrito no item 3.6.1) e as fraes coletadas
foram acompanhadas por atividade PNFFase (Santos et al., 2002). As fraes que
apresentaram atividade foram reunidas e concentradas em sistema Amicon (Santos et al.,
2002). Aps este procedimento as amostras que correspondem a Na,K-ATPase
solubilizada e purificada em C12E8 foram estocadas na geladeira a 4 C.
14
3.3. Na,K-ATPase reconstituda em proteolipossomo
A mistura de fosfolipdios DPPC e DPPE na razo molar 1:1 (Santos et al., 2005)
foi dissolvida em clorofrmio e espalhada nas paredes internas de tubos de ensaio,
seguido de evaporao do solvente atravs da passagem de uma corrente de nitrognio.
Para garantir a completa remoo do solvente, os filmes lipdicos foram mantidos a vcuo
por 1 hora. Em seguida os filmes foram ressuspensos em tampo Tris.HCl 5 mM, pH 7,0,
contendo EDTA 1 mM, KCl 150 mM e C12E8 10 mg/mL e deixados em banho
temperatura de 60C durante uma hora com agitaes a cada 10 minutos em Vortex.
Posteriormente a mistura lipdio-detergente foi sonicada por 1 minuto, utilizando-se um
sonicador de ponta (VibraCell VC-600) e deixada por 1 hora temperatura ambiente
(Santos et al., 2005, Yoneda, 2014).
mistura de lipdio-detergente foi adicionada a amostra de protena solubilizada
e purificada em C12E8 numa razo lipdio-protena de 1:3, por 10 minutos em banho de
gelo. O detergente foi ento removido pela adio da resina Bio-Beads (200 mg/mL), em
intervalos de 5, 10 e 45 minutos. A resina foi centrifugada em centrfuga clnica (FANEM
Excelsa Baby I, dimetro = 15 cm) a 3.000 rpm por 10 minutos e, finalmente, a
suspenso de vesculas foi ultracentrifugada por 1 hora, a 100.000 g a 4C, obtendo-se
assim os proteolipossomo (Santos et al., 2005; Yoneda, 2014). Este procedimento de
preparao de proteolipossomo chamado de co-solubilizao (Santos et al., 2005). As
amostras foram estocadas na geladeira a 4 C.
Para se determinar o tamanho do proteolipossomo foram realizadas medidas por
espalhamento de luz dinmico (DLS) utilizando um N5 Submicron Particle Size Analyser
(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) equipado com um laser de hlio-nenio (
15
= 632.8 nm). As medidas foram feitas em um ngulo de 90 e os valores obtidos so
resultado da mdia de 5 repeties (5 minutos com intervalos de 1 min entre as medidas).
Desta maneira, determinou-se que os proteolipossomo possuam o dimetro mdio de 700
nm.
3.4. Espectroscopia de Absoro UV/Visvel
A espectroscopia de absoro no ultravioleta e visvel a tcnica experimental na
qual se incide radiao eletromagntica de comprimentos de onda entre 200 e 800 nm em
uma amostra e mede-se a razo da intensidade de luz antes (I0) e aps (I) a amostra
(Bernath, 2005), como esquematizado na Figura 5:
Figura 5- Espectroscopia de Absoro.
A equao que descreve a absoro em um meio homogneo, pouco denso e
transparente dada pela Lei de Beer-Lambert (Goldemberg, 1972):
= 010 : = log
0 = , =
Equao 1 - Lei de Beer Lambert
onde o coeficiente de extino molar dos centros absorvedores (M-1cm-1), L
o caminho tico (cm) e c a concentrao dos centros absorvedores (M). Em casos onde
h espalhamento de luz, o valor de dado pela contribuio dos centros absorvedores e
dos centros espalhadores, ou seja: = + .
16
O espectro de absoro de protenas apresenta apenas 2 bandas de absoro (Leach
e Schera, 1960; Noble et al, 2007) na regio entre 200 e 300nm, uma centrada em 220 nm
devido s ligaes peptdicas e outra dada pelas cadeias laterais da Cisteina Cys (250
nm), Fenilalanina - Phe (257 nm), Tirosina Tyr (274 nm) e Triptofano Trp (280 nm)
sendo o pico mximo de absoro em 280 nm, pelo fato do coeficiente de extino molar
do Triptofano ser o maior (=5600 M-1cm-1) (Coulter et al, 1935; Wetlaufer et al, 1958;
Vajdos et al, 1995).
O espectro de absoro para protenas, que no possuem grupos metlicos, deve
ser zero para os comprimentos de onda maiores que 320 nm (Grimsley e Pace, 2004).
Caso no seja, valores significativos de absoro devem ser analisados como
espalhamento de luz causado pela existncia de diferentes estados oligomricos da
protena na soluo. Do ponto de vista experimental, isto ocorre pois o espalhamento de
luz reduz a intensidade de ftons aps a amostra e o espectrofotmetro identifica absoro
como sendo a razo entre a intensidade de luz antes e aps a amostra.
Do ponto de vista fenomenolgico, este efeito explicado pelo espalhamento de
Rayleigh (Leach e Schera, 1960), que demonstrou que a intensidade do espalhamento de
luz depende do inverso do comprimento de onda elevado quarta potncia ( -4) e
proporcional ao tamanho do centro espalhador elevado a sexta potncia ( d6) (Leach e
Schera, 1960; Bernath, 2005). Desta maneira, possvel perceber que o espectro de
absoro possui contribuio do espalhamento de luz em todos os comprimentos de onda,
mas esta contribuio maior para comprimentos de onda na regio dos 200 nm e diminui
para maiores comprimentos de onda.
17
A concentrao da protena pode ento ser calculada medindo-se a absoro ()
em 280 nm (proporcional absoro do Trp) e utilizando-se a equao de Beer-Lambert
(Equao 4) (Vajdos et al, 1995; Noble et al, 2007). Entretanto, no foi possvel utilizar
este mtodo para determinar a concentrao da Na,K-ATPase, pois a amostra possua
espalhamento de luz (item 4.1). Sendo assim, a intensidade de absoro no era
diretamente proporcional concentrao (Leach e Schera, 1960; Grimsley e Pace, 2004).
Por outro lado, a presena de estados oligomricos da protena pode ser
evidenciada no espectro de absoro para comprimentos de onda maiores de 320 nm.
Desta maneira, utilizamos a tcnica de absoro UV-Vis para investigar variaes da
concentrao (em = 280 nm) e as mudanas no estado oligomrico (em = 350 nm) da
Na,K-ATPase ao ser filtrada com um filtro com 220 nm de poro (item 4.2). Alm disso,
o monitoramento do espectro de absoro da Na,K-ATPase foi realizado para investigar
a estabilidade da amostra aps a filtrao (item 4.2).
As medidas do espectro de absoro foram realizadas utilizando-se o
espectrofotmetro UV-Vis Ultrospec 5300 Pro da Amersham Biosciences (Amersham
Biosciences, Corp, NJ, USA) com uma cubeta de quartzo com caminho timo de 1 cm.
O espectro foi medido de 200 a 750 nm com passo e velocidade de varredura de 1 nm e
1856 nm/min, respectivamente
3.5. Determinao da concentrao de protena: Mtodo de Hartree
A determinao da concentrao de protena foi realizada pelo mtodo descrito
por Hartree (1972), com algumas adaptaes. Este mtodo consiste em adicionar 20 L
de dodecil sulfato de sdio (SDS) 20% (p/v) e 170 L de H2O a 10 L de protena. Na
sequncia, adiciona-se 180 L do Reagente A (2g de tartarato de sdio e potssio, 100g
http://pt.wikipedia.org/wiki/Dodecil_sulfato_de_s%C3%B3dio
18
de carbonato de sdio e 20g de hidrxido de sdio dissolvidos em 1 L de gua)
aguardando 10 minutos em banho trmico a 50 C; 20 L do Reagente B (2g de tartarato
de sdio e potssio, 1g de sulfato de cobre pentahidratado e 0,4g de hidrxido de sdio
dissolvidos em 1 L de gua) esperando 10 minutos temperatura ambiente. Por fim,
adiciona-se 600 L de Folin Ciocalteau, diludo 15 vezes, aguardando 10 minutos em
banho trmico a 50 C. Aps esfriar, l-se a absorbncia da mistura em 650nm (Hartree,
1972) e obtm-se o valor da absoro em funo do volume da protena: L .
O mtodo de Hartree (1972) modificou o mtodo de biureto de Lowry e col.
(1951) tornando-o mais sensvel pela adio do reagente de Folin Ciocalteus. Do ponto
de vista bioqumico, o mtodo de Hartree (1972) pode ser explicado da seguinte maneira:
a protena reage com sulfato de cobre alcalino na presena do tartarato de sdio e potssio
resultando em um complexo de cobre tetradentado. Este complexo formado pela ligao
de quatro ligaes peptdicas com um tomo de cobre (conhecida como reao de biureto)
que confere uma colorao violeta de pouca intensidade para amostra. Para deixar o
mtodo mais sensvel (Hartree, 1972), adiciona-se o reagente de Folin Ciocalteus, que
reduzido ao complexar com os grupos aromticos da protena, resultando em um
complexo de cor azulada muito intensa que possui absoro entre 650nm e 750nm
(Lowry, et al. 1951; Hartree, 1972; Legler, et al. 1985).
O mtodo descrito acima foi utilizado para determinar a concentrao da protena
total presente na frao de membrana e da Na,K-ATPase solubilizada e purificada em
C12E8 e tambm da enzima reconstituda em proteolipossomo.
Para utilizar este mtodo necessrio fazer uma curva de calibrao com uma
protena padro. No nosso caso, utilizamos albumina de soro bovino (BSA) na
19
concentrao de 1 g/L e medimos a absoro em 650 nm para diferentes volumes de
protena, como mostra o Grfico 1.
0 2 4 6 8 10 12
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Pontos Experimentais
Auste Linear
Absor
o d
a B
SA
padr
o e
m 6
50 n
m (
un.a
rb.)
Massa (g)
Curva de Calibrao: Mtodo de Hartree
Coeficiente angular: 0.0171 (1)
Grfico 1 - Calibrao da concentrao de protena pelo mtodo de Hartree, utilizando BSA.
Conforme podemos observar, existe uma relao linear entre o valor de absoro
e a quantidade de protena em soluo. Portanto, ao fazer o ajuste linear obtm-se o
coeficiente angular, que possui a unidade de medida de g . O fator padro definido
como o inverso deste valor, ou seja, em g
.
Para determinar a concentrao de uma protena multiplica-se o valor medido
L pelo fator padro determinado
g , resultando na unidade de medida
gL ,
que a concentrao da protena.
20
3.6. Determinao da concentrao de fosfato: Mtodo de Heinonem e Lahti
A quantificao de fosfato inorgnico proveniente da hidrlise do ATP pela Na,K-
ATPase foi determinado pelo mtodo descrito por Heinomen e Lahti (1981).
Inicialmente uma soluo padro de fosfato, foi obtida dissolvendo-se 0,272g de
KH2PO4 (fosfato de potssio monobsico) em 800 mL de H2O, na presena de 10 mL de
H2SO4 (cido sulfrico) e completando com H2O para 1L, resultando numa concentrao
de 1 mol Pi/mL. Para se obter a curva de calibrao, diferentes volumes da soluo
padro de fosfato foram usadas e completado o volume com gua para 0,5 mL. A esta
soluo foi adicionado o volume de 0,5 mL de molibdato de amnio (10mM) agitando
por 10 segundos, 1 mL de acetona P.A. agitando por 10 segundos e 0,5 mL de cido
ctrico (0,4M) agitando por 10 segundos.
O Grfico 2, abaixo, mostra os respectivos espectros de absoro para
concentraes crescentes de fosfato, que complexaram com o molibdato e foram
estabilizadas pelos outros reagentes.
21
320 340 360 380 400 420 440
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Ab
so
r
o (
un
.arb
.)
(nm)
Volume de Fosfato (L):
25
50
75
100
125
150
175
200
Espectro de Absoro do Complexo
Grfico 2 - Absoro x Comprimento de onda para o complexo formado na reao da soluo de
fosfato padro com os reagentes descritos no mtodo de Heinonem e Lahti.
Conforme percebemos do Grfico 2, o mximo de absoro ocorre para
comprimento de onda da ordem de 355 nm. Assim, para este comprimento de onda
construiu-se o Grfico 3 de valor de absoro em funo da quantidade de fosfato, que
resultou numa relao linear. O inverso do coeficiente angular o fator padro
(nmol ) de proporcionalidade entre volume de fosfato e o valor de absoro.
22
0 50 100 150 200
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Pontos Experimentais
Ajuste Linear
Ab
so
r
o fo
sfa
to p
ad
ro
em
35
5 n
m (
un
.arb
.)
Quantidade de fosfato (nmol)
Curva Padro - Mtodo de Heinonem e Lahti
Coeficiente Angular: 0,0036 (1)
Grfico 3 - Absoro em 355nm do complexo formado na reao da soluo de fosfato padro
com os reagentes descritos no mtodo de Heinonem e Lahti.
Como o fator padro o inverso do coeficiente angular, obtm-se neste caso o
valor de 277 (7) nmol .
3.7. Medida de Atividade Enzimtica: cintica descontnua
Como j mencionado anteriormente (item 1.1) a Na,K-ATPase hidrolisa uma
molcula de ATP formando uma molcula de adenosina difosfato (ADP) e um fosfato
inorgnico (Pi). Pode-se ento quantificar a atividade enzimtica da protena medindo-se
o Pi utilizando o mtodo descrito por Heinonen e Lathi (1981).
Para medir ento a atividade da Na,K-ATPase, o meio reacional foi HEPES 50
mM contendo ATP 3 mM, pH 7,5 em presena de KCl 10 mM, MgCl2 5 mM e NaCl 50
mM em volume final de 1,0 mL (Santos et al., 2005). A reao foi iniciada pela adio
de enzima ao meio reacional, deixada por um perodo de tempo pr-estabelecido e cessada
pela adio de 0,5 mL de soluo gelada de cido tricloroactico (TCA ) 30% (p/v). As
23
amostras foram centrifugadas a 10 000 rpm, a 10 C por 10 minutos. Na sequncia,
adicionou-se molibdato de amnio (10mM), acetona P.A. e cido ctrico (0,4M) seguindo
o mesmo protocolo descrito anteriormente (item 3.6). Aps este procedimento, a amostra
possuia uma cor amarelada e mediu-se a absoro em 355 nm (Heinonen e Lahti, 1981).
As determinaes da concentrao de fosfato inorgnico (Heinonem e Lahti,
1981) e de concentrao da protena (Hartree, 1972) foram realizadas em triplicata e os
correspondentes erros experimentais foram determinados como sendo a diferena entre a
mdia de cada valor e o ponto experimental de maior valor. Isto feito pois seria invivel
realizar a propagao dos erros da atividade, que est ligado com os erros de todo o
processo, que por sua vez muito extenso (se inicia na extrao de protena e segue
acumulando incerteza at a medida de absoro).
Para melhor explicar o mtodo de anlise da atividade enzimtica apresentamos
um exemplo no Grfico 4. Obteve-se os valores da absoro em 355 nm de fosfato
inorgnico em funo do volume de protena (mantendo o mesmo tempo de reao, no
caso de 20 minutos).
24
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Pontos Experimentais
Ajuste Linear
Absor
o e
m 3
55 n
nm
(un.a
rb.)
Volume (mL)
Curva para o clculo de atividade enzimtica
Coeficiente angular: 5,3 (3)
Grfico 4 Medida de Atividade pelo mtodo descontinuo em funo da quantidade de protena.
A equao para obter a atividade enzimtica descrita como (Santos et al., 2005):
= 3
() (min)
Equao 2 Atividade Enzimtica.
onde o valor da absoro medido pelo espectrofotmetro, F o fator padro
determinado pela dosagem do fosfato, V o volume da enzima em mL, t o tempo de
reao em minutos. A medida de absoro utiliza apenas um tero da amostra, portanto a
atividade enzimtica precisa ser multiplicada pelo fator de correo: 3.
A unidade de medida da atividade enzimtica, K, , onde adota-se =
(min)
.
25
Outra grandeza obtida a atividade enzimtica especfica, chamada de Kesp,, que
a atividade enzimtica normalizada pela concentrao da protena. Esta dada pela
seguinte equao (Santos et al, 2005):
=
Equao 3 - Atividade Enzimtica Especfica.
onde C a concentrao da protena, dada em , obtida atravs do mtodo
de Hartree (Hartree, 1972). A unidade de medida para a atividade enzimtica especfica
.
Para o exemplo dado no Grfico 4, a concentrao da protena de 0,26 g
L .
Portanto a atividade enzimtica e a atividade enzimtica especfica so:
= 5,3.
= 5,3 3 277
20= 220 =
220
0,26 = 846
Equao 4 - Exemplo de Atividade Especfica.
3.8. Espalhamento de Luz Dinmico (DLS)
Para compreender a teoria do DLS necessrio utilizar a teoria ondulatria da luz.
Uma fonte emite luz monocromtica que incide sobre uma soluo contendo centros
espalhadores. O feixe de luz espalhado segundo um ngulo em relao direo do
feixe de luz incidente na amostra (Berne e Pecora, 2000), como esquematizado na Figura
6.
26
Figura 6- Esquema de Espalhamento de Luz Dinmico (extrado de Giacomelli (2009)).
onde o vetor do feixe incidente, o vetor do feixe espalhado e o vetor
de espalhamento, cujo mdulo dado pela seguinte Equao 5 (Berne e Pecora, 2000):
| | =40
sin
2
Equao 5 Mdulo do Vetor de Espalhamento de Luz.
0 o ndice de refrao do meio e o comprimento de onda do feixe incidente.
Quando as molculas da soluo so iluminadas pelo feixe de luz incidente, as
cargas eltricas constituintes da amostra experimentam uma fora devida ao campo
eltrico associado radiao eletromagntica (Maxwell, 1865; Griffiths, 1981) e, por isso,
so aceleradas. Estas cargas eltricas aceleradas emitem radiao e a superposio de
todos estes campos eltricos emitidos resulta no campo eltrico espalhado, que depende
da posio instantnea de cada um destes centros (emissores) espalhadores (Berne e
Pecora, 2000; Arzenek, 2010; Enoki, 2010).
27
A posio dos centros espalhadores muda devido s flutuaes trmicas
acarretando uma variao da intensidade () do campo eltrico espalhado a cada
instante de tempo t e esta flutuao na intensidade dada por (Berne e Pecora, 2000):
(0, ) = 1
()
0+
0
Equao 6 - Intensidade mdia do campo eltrico associado ao feixe de luz espalhado.
onde 0, , so o tempo inicial e total da medida, respectivamente.
O sistema em questo possui a propriedade estacionria, o que significa que no
depende do tempo inicial 0. Estas so hipteses assumindo que o sistema pode ser
representado pela mecnica estatstica, supondo que as partculas no interagem entre si,
o movimento dos centros espalhadores browniano e que e o tempo de experimento tende
ao infinito (Berne e Pecora, 2000).
Por outro lado, seja t um tempo qualquer, o valor de ( + ) to prximo de
() quanto menor for o valor de , pois as partculas tm pouco tempo para mudar de
posio. Essa dependncia de () com ( + ) pode ser introduzida na Equao 6
resultando na funo de auto correlao de intensidade de luz (Berne e Pecora, 2000;
Arzenek, 2010):
(0) () = lim
1
() ( + )
0
, que pode ser reescrita na forma:
(2)() = lim
1
() ( + )
0
Equao 7 Funo de auto correlao.
28
Pela equao de Siegert possvel obter a funo de auto correlao (1)() do
campo eltrico a partir da funo (2)() (Berne e Pecora, 2000):
(2)() = (1 + |(1)()|2)
Equao 8 - Equao de Siegert para sistemas dluidos.
onde um parmetro que depende do equipamento.
A taxa de decaimento da funo (1), definida como , est relacionada a
frequncia de relaxao do movimento da partcula e obtida a partir do ajuste da funo
de auto correlao (1). Os parmetros (1) e possuem a seguinte relao de
proporcionalidade (Berne e Pecora, 2000; Enoki, 2010):
(1)() ~
Equao 9 - Relao entre funo de auto correlao do campo eltrico e a taxa de decaimento
da funo de auto correlao do campo eltrico.
Existem alguns algoritmos para obter o valor de atravs do ajuste da funo de
auto correlao do campo eltrico. Os dois principais so os Mtodos dos Cumulantes
(Koppell, 1972) e o Mtodo de Contin (Provencher, 1982).
Uma vez obtida a taxa de decaimento pode-se calcular o valor da difuso
translacional D das partculas espalhadoras como (Enoki, 2010):
= D x 2
Equao 10 - Taxa de decaimento e coeficiente de difuso translacional das partculas
espalhadoras.
29
Por outro lado, Stokes e Einstein derivaram uma equao para a disperso de
partculas esfricas imersas em um fluido que seguem o regime de movimento browniano
tal que:
= 6
Equao 11 - Equao de Stokes-Einstein.
onde a constante de Boltzmann, a temperatura absoluta, a viscosidade
do fluido e r o raio da partcula esfrica. Desta maneira possvel obter o raio
hidrodinmico mdio a partir do coeficiente de difuso D.
importante acrescentar que o sentido fsico do raio hidrodinmico mdio obtido
pelo DLS o valor do raio de uma esfera rgida que possui o mesmo coeficiente de difuso
translacional das partculas espalhadoras da amostra.
Geralmente a amostra apresenta partculas de tamanhos distintos o que significa
que a funo (1)() deve ser dada pela soma de exponenciais n, que implicam em
valores de D diferentes (Arzenek, 2010):
(1)() ~ = 2
Equao 12 - Relao entre auto correlao do campo eltrico, taxa de decaimento da funo de
auto correlao do campo eltrico e coeficiente de difuso para uma distribuio polidispersa de
tamanhos de partculas.
Para uma distribuio de tamanhos de raio podemos obter um valor do tamanho
efetivo do raio hidrodinmico fazendo-se a mdia das distribuies de tamanho
encontradas ponderada pela porcentagem de cada uma das populaes. Este o chamado
Mdia Z ou Z average (Z) (Berne e Pecora, 2000; Arzenek, 2010):
30
=
Equao 13 - Equao do Z average.
Onde o nmero de partculas com tamanho .
Outro parmetro importante em medidas de Espalhamento de Luz Dinmico o
ndice de polidisperso PI, que uma estimativa do nmero de populaes de diferentes
tamanhos de raios hidrodinmicos presentes na amostra. Este ndice calculado pela
frmula (Arzenek, 2010):
= 2
2
Equao 14 - ndice de polisperso.
onde o desvio padro da distribuio de tamanhos caso ela fosse uma
distribuio gaussiana. O PI pode ser visto como a varincia relativa das distribuies de
tamanho e para valores < 0.2 a amostra considerada monodispersa (Arzenek, 2010).
As medidas de DLS foram realizadas utilizando um N5 Submicron Particle Size
Analyser (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) equipado com um laser de hlio-
nenio ( = 632.8 nm). As medidas foram feitas em um ngulo de 90 e os pontos
experimentais so resultado da mdia de 5 repeties. Cada repetio dura 5 minutos com
intervalos de 1 min entre elas.
A configurao do experimento e o processamento dos dados foram realizados
pelo programa PCS Control (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA). Este software
utiliza o Mtodo dos Cumulantes (Koppell, 1972) para obter os valores de e substitui o
31
raio pelo dimetro na Equao 11. Desta maneira os valores obtidos so os dimetros
hidrodinmicos.
No caso da amostra de Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8, foram
realizadas medidas de DLS antes e aps a utilizao do filtro com poro de 220 nm e
realizou-se o monitoramento a cada 3 horas (at 12 horas) aps a filtrao. O clculo do
Z average foi feito para obter o valor do dimetro mdio e a variao dos mesmos em
relao ao filtro e ao tempo.
Os grficos de distribuio de tamanhos possuem o eixo das ordenadas expressos
em porcentagem de intensidade de luz espalhada. Sendo assim, possvel analisar apenas
o tamanho das populaes presentes na amostra e no a quantidade delas, pois partculas
grandes espalham mais luz, geram um pico de intensidade grande, mas no indicam que
esto em grande quantidade. Como visto anteriormente, isto ocorre pois o espalhamento
de luz depende do raio da partcula elevado sexta potncia (aproximao de Rayleigh)
(Arzenek, 2010).
3.9. Espalhamento de Raio-X a Baixos ngulos (SAXS)
A tcnica do Espalhamento de Raio-X a Baixos ngulos (SAXS) possibilita a
obteno de informaes estruturais de macromolculas em soluo atravs da anlise do
espalhamento de Raios-X causado por esta amostra (Guinier e Fourmet, 1955; Glatter e
Kratky, 1982; Barbosa et al., 2012).
O arranjo experimental de SAXS est apresentado na Figura 7. Um feixe
proveniente de uma fonte de Raios-X de alta intensidade passa por um monocromador
(ou filtro), se torna monocromtico e colimado para atingir a amostra. O feixe
32
transmitido ( ) absorvido no Beam Stopper e o feixe espalhado ( ) medido pelo
detector (Barbosa et al., 2012).
O dado obtido a partir do SAXS a variao da intensidade do raio-x espalhado,
(), em funo do vetor de espalhamento , que se correlaciona com o ngulo de
espalhamento 2 e com o comprimento de onda pela Equao 15 (Barbosa et al., 2012):
Figura 7 - Arranjo experimental esquemtico utilizado na tcnica de SAXS (adaptado de Barbosa e col..
(2012)).
| | =4
sin
Equao 15 Mdulo do vetor de espalhamento utilizado para anlise dos dados de SAXS.
A intensidade de espalhamento () o resultado da interao do feixe de raio-x
com os eltrons da amostra, sendo proporcional Transformada de Fourier do contraste
de densidade eletrnica ( )entre os centros espalhadores e o meio considerado
continuo, tal que (Glatter e Kratky, 1982):
33
() = 1 |( ) |2
Equao 16 - Intensidade de Espalhamento de SAXS.
onde V o volume total do objeto espalhador, o vetor de posio dos centros
espalhadores dentro do objeto espalhador e a integral calculada em todo o volume V.
As chaves indicam a mdia de todos as posies e orientaes possveis de todos os
objetos espalhadores no sistema. Por fim, ( ) a densidade de espalhamento local
definido como a multiplicao da densidade eletrnica pelo raio do eltron (Barbosa et
al., 2012).
Para um sistema isotrpico, a intensidade de espalhamento () pode ser reescrita
(Santos et al 2003; Barbosa et al., 2010) como o produto de uma funo (), chamada
fator de forma, com uma funo (), chamada funo de interferncia, como na Equao
17:
() = () ()
Equao 17 - Intensidade de Espalhamento de SAXS para sistema isotrpico.
um parmetro que depende do arranjo experimental e da densidade numrica
dos objetos espalhadores (no nosso caso, protenas) .
O fator de forma () diretamente correlacionado estrutura do objeto
espalhador em soluo (Barbosa et al., 2012), ou seja, permite obter informaes sobre a
conformao, tamanho e forma da protena (Glatter e Kratky, 1982; Barbosa et al., 2012).
A funo () derivada da interao entre os centros espalhadores (Barbosa et
al., 2012). Para um sistema suficientemente diludo os objetos espalhadores no
34
interagem entre si e funo de interferncia aproximadamente 1 (Santos et al., 2003).
Desta maneira a intensidade () proporcional () (Santos et al., 2003; Barbosa et
al., 2010):
() = (), ()~1
Equao 18 - Intensidade de SAXS para sistema isotrpico e no interagente.
Uma informao sobre o estado oligomrico da protena pode ser obtida
diretamente da Equao 18, pois a intensidade de espalhamento para o ngulo = 0 ( =
0) diretamente proporcional massa molecular do objeto espalhador e, portanto,
quantidade de monmeros que forma um agregado proteico responsvel pelo
espalhamento de raio-x (Barbosa et al., 2012).
Uma anlise preliminar do estado conformacional da protena pode ser realizada
utilizando-se a representao de Kratky (Glatter e Kratky, 1982; Barbosa et al., 2012).
Esta consiste em graficar a intensidade de espalhamento multiplicada pelo quadrado do
vetor de espalhamento, ()2, em funo do vetor de espalhamento, .
A Figura 8 mostra a representao de Kratky para trs estados conformacionais
da protena albumina de soro bovino (BSA). So curvas simuladas por Barbosa e col.
(2012):
35
Figura 8 - Representao de Kratky para trs conformaes da BSA (extraido de Barbosa e col.
(2012)).
Atravs da representao de Kratky da Figura 8 pode-se identificar a protena na
forma nativa por uma curva em forma de sino com um pico bem definido e sua posio
depende do tamanho mdio da protena (quanto mais para esquerda maior o tamanho).
Estados conformacionais intermedirios (semi flexvel) apresentam um pico menos
intenso, mais alargado e os valores de ()2 aumentam com o crescimento de . J a
protena desenovelada no possui pico e a curva cresce em funo do vetor de
espalhamento (Barbosa et al., 2012).
Outra representao que auxilia na anlise dos dados de SAXS a representao
de Guinier (Guinier e Fourmet, 1955). Segundo a Lei de Guinier a curva de espalhamento
para 0 pode ser aproximada por:
( 0) (0)
22
3
Equao 19 - Lei de Guinier.
Calculando o logaritmo natural da Equao 19 chega-se a uma equao linear:
36
ln ( 0) = ln (0) + ln
22
3 ln ( 0) = ln (0)
22
3
ln ( 0) = ln (0)
2
32
=
Equao 20 - Equao Linear para representao de Guinier.
A Equao 20 mostra a relao linear entre ln ( 0) e 2. Portanto possvel
realizar um ajuste linear da curva experimental e obter o raio de giro de Guinier e
(0) a partir dos coeficientes da reta ajustada.
O raio de giro de Guinier corresponde ao valor quadrtico mdio da
distncia da flutuao de densidade eletrnica do objeto espalhador, ( ), em relao
ao seu centro de gravidade e pode ser definido pela Equao 21 (Guinier e Fourmet, 1955;
Barbosa et al., 2012):
2 =
2 ( )
( )
Equao 21 - Raio de giro de Guinier obtido a partir do contraste de densidade eletrnica ( ).
O (0) a intensidade de espalhamento extrapolada para 0. Esta medida no
possvel de ser realizada, pois para = 0 o espalhamento muito intenso e h o Beam
Stopper antes do detector para impedir que o feixe atinja e danifique o detector.
Podemos ainda obter informaes sobre a protena estudada atravs da funo de
distribuio de pares de eltrons () (Guinier e Fourmet, 1955; Glatter e Kratky, 1982).
Esta obtida atravs da transformada de Fourier do fator de forma (),
37
consequentemente da (), pois estas duas s diferem pela constante . A transformada
dada por (Barbosa et al, 2010):
() = (1
22) ()()2
0
sin()
Equao 22 - Transformada de Fourier para obter ().
A () chamada de funo de distribuio de distncias quando o sistema
homogneo (Barbosa et al., 2012). Neste caso ela representa a probabilidade de encontrar
dois elementos espalhadores separados por uma distncia dentro do volume da partcula
espalhadora (Barbosa et al., 2010).
A partir da funo de distribuio de distncias possvel determinar a dimenso
mxima (Dmax) da protena, que o valor de quando () = 0 (Barbosa et al., 2012).
Do ponto de vista fsico este parmetro representa a maior distncia entre dois centros
espalhadores dentro do volume do objeto espalhador.Com a funo () pode-se obter
raio de giro da protena (Barbosa et al., 2012). A Equao 23 apresenta a relao entre
o e a funo () (Guinier e Fourmet, 1955; Glatter e Kratky, 1982; Barbosa et al.,
2012):
2 =
2()
0
2 ()
0
Equao 23 - Raio de Giro obtido a partir da funo de distribuio de distncias ().
Para solues de protena que apresentam diferentes estados oligomricos o
resultado do raio de giro deve ser interpretado como a mdia ponderada do raio de giro
de todas as espcies presentes na amostra (Barbosa et al., 2012):
38
=
Equao 24 - Raio de giro para soluo com diferentes estados oligomricos.
onde o raio de giro de uma dada espcie e a quantidade de cada espcie.
Para se obter a () a partir da () utiliza-se softwares que realizam a integral
da Equao 22 por iteraes numricas. Dois exemplos de softwares com esta funo so
os o GNOM (Svergun, 1992) e o GIFT (Bergmann et al., 2000; Popovski, 2009). Neste
projeto as () foram obtidas utilizando o GIFT (Bergmann et al., 2000; Popovski, 2009).
O GIFT (Bergmann et al., 2000; Popovski, 2009) converte a transformada de
Fourier (Equao 22) em um problema de mnimo dos mltiplos quadrados que depende
de um parmetro de estabilizao para avaliar o erro entre a soluo obtida e a curva
experimental. Este parmetro chamado de Multiplicador de Lagrange (Popovski,
2009). Como a estabilidade da soluo depende das especificaes utilizadas para iniciar
a iterao numrica, o GIFT varia os valores de inicializao e obtm diferentes solues.
Para identificar qual soluo mais se aproxima dos dados experimentais analisa-se o valor
do Multiplicador de Lagrange de cada soluo obtida (Bergmann et al., 2000; Popovski,
2009).
Para anlise da funo P(q), pode-se iniciar a mesma atravs da simulao de
curvas toricas de SAXS a partir da estrutura cristalogrfica da protena, se conhecida, e
compar-las aos dados experimentais. As semelhanas e diferenas entre as curvas podem
auxiliar na compreenso da conformao da amostra de protena.
39
A estrutura cristalogrfica do dmero ()2 da Na,K-ATPase obtida por Kanai e
col. (2013) foi utilizada neste trabalho para construir a curva terica do dmero ()2
(PDB 3WGV - Figura 9 esquerda). O monmero () foi obtido ao retirar uma unidade
do dmero (Figura 9 direita) atravs do software CRYSOL (Svergun et al., 1995).
Figura 9 Estrutura cristalogrfica do dmero ()2 da Na,K-ATPase (Kanai et al., 2013)
esquerda. direita est a estrutura cristalogrfica do monmero (). A cor muda gradualmente do N-
terminal (azul) at o C-terminal (vermelho) para as subunidades e (Kanai et al., 2013).
Todos os experimentos de SAXS de amostras de Na, K-ATPase solubilizadas e
purificadas em C12E8 pr e ps irradiao foram realizados no Centro Nacional de
Pesquisa em Energia e Materiais, Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron Linha de
SAXS 1, em Campinas. O comprimento de onda do feixe de raio-x foi de 1.488 ,
temperatura ambiente com distncia da amostra ao detector de aproximadamente 1300
mm. As amostras foram colocadas no porta amostra entre duas janelas de mica com 1 mm
de espaamento e este arranjo estava perpendicular ao feixe incidente.
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Os dados foram obtidos com 5 minutos de exposio ao feixe, o sinal foi recebido
por um detector bidimensional. O sinal foi normalizado levando em considerao a
variao da intensidade do feixe de raio-x durante o tempo do experimento e o sinal de
fundo foi retirado aps medir o espalhamento da soluo tampo.
Com o objetivo de desagregar a Na,K-ATPase purificada em C12E8, filtrou-se a
amostra com um filtro de 100 nm de poro, adicionou-se o surfactante dodecil sulfato de
sdio (SDS) soluo e a concentrao do surfactante na amostra foi de 0,5 mM e 1 mM.
Mediu-se a curva de SAXS imediatamente aps a adio do SDS.
3.10. Bioestimulao da Na,K-ATPase por laser de baixa potncia
A medida foi realizada utilizando 3 lasers: = 532 nm com potncia ajustvel
entre 0 e 5 mW; = 650 nm com potncia fixa de 50 mW e =780 nm com potncia
ajustvel entre 0 e 50 mW. Utilizou-se a potncia mxima de cada um dos lasers que
foram posicionados a uma distncia de 25 cm perpendicularmente ao plano da soluo de
protena, como esquematizado na Figura 10.
Figura 10 Esquema do procedimento de irradiao.
Aps a irradiao, uma alquota de Na,K-ATPase era adicionada ao meio
reacional e realizava-se o procedimento de medida de atividade como descrito no item
3.7. No caso da frao de membrana foram irradiados 100 L de amostra para realizar
Laser
Irradiao
Amostra
Altura: 25 cm
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medidas de atividade em triplicata (3 medidas de 30 L de amostra). No caso
proteolipossomos foram irradiados 35 L de amostra (3 medidas de 10 L de amostra).
Alm disso, realizaram-se medidas de atividade para verificar a estabilidade da
bioestimulao. Para isto irradiaram-se amostras de Na,K-ATPase (proteolipossomo e
frao de membrana), mantidas fora do gelo aps a irradiao e mediu-se a atividade
enzimtica de 2 em 2 horas at 6 horas. Para cada uma dessas medidas de atividade
manteve-se um controle que foi a amostra de protena sem irradiao mantida fora do
gelo pelo mesmo perodo de tempo que as amostras irradiadas.
O padro internacional adota a dose, J/cm2, como a unidade de medida de
irradiao por laser. Portanto, para padronizar os valores de irradiao do experimento,
medimos o tamanho do spot dos laser (cm2).
Por outro lado, sabemos que a potncia se relaciona com a energia tal que:
=
Equao 25 - Definio de Potncia.
Onde a potncia, energia e o tempo de irradiao. Com o valor da potncia
do laser, do tempo de irradiao cronometrado durante o experimento e do tamanho do
spot (A), o valor da dose foi calculado como mostra a Equao 26:
= : = ()
(2) =
()
(2)
Equao 26 - Definio de Dose.
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Para obter o tamanho do spot mediu-se o raio do fei