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3/9/2017
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BMC 0132BMH5769
EMBRIOLOGIA MOLECULAR
https://embriomol.wordpress.com/
www.biocel.icb.usp.br https://embriomol.wordpress.com/
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Material da Prática
• 1 pinça de relojoeiro tamanho 5• 1 tesoura de manicure• ROTEIRO de aulas práticas
REGRAS A SEREM CUMPRIDAS NAS AULAS PRÁTICAS
O CUMPRIMENTO DESTAS REGRAS É OBRIGATÓRIO PARA AS AULAS !!!!
1. MELECA E MALOCA NÃO!!! Vocês terão a sua disposição, baldes forrados com saco plástico e papel higiênico. Eles estão aí para que VOCÊ MANTENHA A SUA BANCADA, CHÃO, TETO ETC LIMPOS!! É imprenscidível que a sala esteja limpa no final das aulas,caso contrário o curso perde o direito a aulas práticas.
2. LAVE AS MÃOS. Ovos podem ter Salmonella. Lavem as mãos depois das aulas.
3. LUPAS e MICROSCÓPIOS. Cada dupla é responsável por retirar e guardar as lupas no armário. Use apenas a lupa designada para sua dupla.
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Avaliação Teórica
• As provas teóricas terão duração de 120 minutos e serão dissertativas.
• Prova substitutiva: substitui provas perdidas pelo aluno, para situações comprovadamente emergenciais (saúde, acidente etc).
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Prova em grupo:Aluno Nota
sozinhoNota em grupo
Nota final
A 5,5 5,5 5,5
B 7 5,5 7
C 4 5,5 4
Aluno Nota sozinho
Nota em grupo
Nota final
A 5,5 7 5,5
B 7 7 7
C 4 7 4
Aluno Nota sozinho
Nota em grupo
Nota final
A 5,5 7,5 6
B 7 7,5 7,5
C 4 7,5 4,5
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A avaliação do projeto experimental será feita pela proposta escrita
A proposta escrita do projeto experimental (maximo 3 pag, fonte 11pt espaço de linha 1,5) deve incluir:
Introdução , onde serão descritos os objetivos do projeto, a hipótese a ser comprovada,
Metodologia , onde deve ser descrito em linhas gerais os procedimento sexperimentais JUSTIFICANDO a escolha dos mesmos.
Resultados esperados e discussão .
A apresentação oral do projeto deverá incluir breve introdução da problemática, hipótese formulada e os experimentos propostos para comprovação da hipótese .
A proposta experimental será discutida em sala com a banca e os demais alunos. AS SUGESTÕES DEVEM SER CONSIDERADAS PARA REDAÇÃO DA PARTE ESCRITA.
Média Final
Média final = (soma das notas das 3 provas teóricas) + (média do projeto experimental)
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Média final = (soma das notas das 3 provas teóricas) + (média do projeto experimental)
4
(soma das notas das 3 provas teóricas ) + (projeto experimental )4
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https://embriomol.wordpress.com/ Eu descanso, VOCÊS pensam
• Cada aluno terá um cartão único com o código visual
• O código tem 4 lados: A, B, C e D
• Apresente a SUA OPÇÃO PARA CIMA
As alternativas nos cartões são em letras pequenas, protegendo a privacidade do aluno
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A DCB
Cada aluno tem um cartão (este cartão é único)
Aluno 1
Aluno 2
Eu faço o scan dos cartões
A estatística pode ficar só no celular do professorOU pode ser projetada na tela em ambientes wi-fi
O que é Biologia do Desenvolvimento? EMBRIOLOGIA CLÁSSICA
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Div
isão
Cel
ular
Mor
fogê
nese
Dife
renc
iaçã
o
1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão?
2. O que estas células PODEM ser?
3. QUANDO elas decidem o que vão ser?
4. COMO ocorre esta decisão?
EMBRIOLOGIA CLÁSSICA + MECANISMOS= Biologia do Desenvolvimento
Evolução (Evo-Devo)
Ambiente e Especiação (ECO-Devo)
QUAL O IMPACTO DA BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO?
Como que células tronco diferenciam?
QUAL O IMPACTO DA BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO?
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QUAL O IMPACTO DA BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO? QUAL O IMPACTO DA BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO?
Existe alguma conservação evolutiva dos processos embrionários?
QUAL O IMPACTO DA BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO?
Existe uma homologia de sinalização que gera homologia anatômica
QUAL O IMPACTO DA BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO?
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Drosophila m. ULTRABITHORAX
Gallus g. Com Tbx5 ectópico
Por outro lado, como é que são geradas as diferenças entre segmentos do corpo?
QUAL O IMPACTO DA BIOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO? A Biologia do Desenvolvimento explica os bicos dos tentilhões de Galápagos (hellloooo, Darwin?!)
Evolução (Evo-Devo)
Ambiente e Especiação (ECO-Devo)
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Fertilização
Desenvolvimento
Externa Interna Interna
Externo InternoExterno
Externa
Externo
Externa
Externo 1. Fertilização2. Clivagem = aumento de número de células3. Movimentos morfogenéticos = definição da forma4. Organogênese=Diferenciação celular= Identidade tecidual5. Crescimento= definição do tamanho
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Objetivo:
•Multicelular•Três folhetos•Forma de “faríngula”
Aumento do número de células
Espaço para manobra
Rearranjo celular
CLIVAGEMEXISTEM VÁRIAS FORMAS DE DIVIDIR O OVO
As clivagens geram blastômeros (BLÁSTULA)
CLIVAGEM: o mesmo processo em espécies diferentes1. Ouriço-do-mar
Oikopleura dioicaScripps
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CLIVAGEM
OuriçoHoloblástico radial
AnfíbioHoloblástico radial
PeixeMeroblástico
CaramujoHoloblástico espiral
TIPOS DE CLIVAGENS
As clivagens são classificadas quanto a direção do plano de clivagem;
e quanto a totalidade da divisão
Tipos de Clivagem
•TOTALIDADE•DIREÇÃO do plano de clivagem•VITELO
•Isolécito•HOLOblástico
Tipos de Clivagem
•TOTALIDADE•DIREÇÃO do plano de clivagem•VITELO
•Mesolécito•HOLOblástico
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A presença do vitelo diminui a velocidade da progressão da citocinese Tipos de Clivagem
•TOTALIDADE•DIREÇÃO do plano de clivagem•VITELO
•Telolécito•Meroblástico
Tipos de Clivagem
•TOTALIDADE •DIREÇÃO do plano de clivagem
•VITELO
•Isolécito (Iso=igual)•Mesolécito (Meso=meio/moderado)
•Telolécito (Telo=extremidade)•Centrolécito (Centro=central)
•HOLOblástico (holo=completo)
MEROblástico (mero=incompleto)
Tipos de Clivagem
•TOTALIDADE •DIREÇÃO do plano de clivagem
•VITELO
•Radial•Rotacional•Bilateral•Espiral•Desigual•Discoidal•Superficial
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Ou seja…Na clivagem RADIAL,os 3 primeiros planos de clivagem são ortogonais ;enquanto que na clivagem ROTACIONAL, há um deslocamento dos plano de clivagens, que resulta na intercalação dos blastômeros.
Holoblástico rotacional
COMO É GERADA ESTA VARIABILIDADE?
•Cariocinese ( Microtúbulos)•Citocinese (Microfilamentos)
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A posição do plano de clivagem é perpendicular ao fuso mitótico. E sua posição pode ser determinada por proteínas de membrana e elementos citoplasmáticos (ponto preto)
Tipos de Clivagem
•TOTALIDADE•DIREÇÃO do plano de clivagem•VITELO
•HOLOblástico (holo=completo)
•MEROblástico (mero=incompleto)
Tipos de Clivagem
•TOTALIDADE•DIREÇÃO do plano de clivagem•VITELO
•Isolécito (Iso=igual)
•Mesolécito (Meso=meio/moderado)
•Telolécito (Telo=extremidade)
•Centrolécito (Centro=central)
Tipos de Clivagem
•TOTALIDADE•DIREÇÃO do plano de clivagem•VITELO
•Isolécito (Iso=igual)
•Mesolécito (Meso=meio/moderado)
•Telolécito (Telo=extremidade)
•Centrolécito (Centro=central)
•HOLOblástico (holo=completo)
MEROblástico (mero=incompleto)
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EXISTE ALGUMA RAZÃO PARA ESTA VARIEBILIDADE?
1)Possivelmente para acomodar os diferentes tipos de ovos (distribuição de vitelo) ;
H. Driesch (1891)
Ablação/extirpação em ouriços
H. Driesch (1891)
Este experimento prova que:a) Os blastômeros são equivalentesb) Os blastômeros dependem das células
vizinhas para desenvolverc) O ouriço pode ser reproduzir de forma
assexuadad) O núcleo é importante para o
desenvolvimento
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Spemann, 1938
Experimento de separação em anfíbios:
O ovo recém-fertilizado foi dividido por um fio de cabelo em duas partes de duas formas:
(A)Todos contém o elemento Crescente Cinza
(B)Só um contém o elemento Crescente Cinza
Este experimento prova que:a)Os blastômeros resultantes são equivalentesb)Os blastômeros dependem das células vizinhas para desenvolverc)Os blastômeros não são equivalentesd)O procedimento experimental foi mutagênico
Os blastômeros são ou não iguais? Não perca! Nos próximos capítulos de:
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A direção da clivagem em alguns caramujos pode variar, formando indivíduos de carapaça destrógera ou sinistra.
EXISTE ALGUMA RAZÃO PARA ESTA VARIEBILIDADE?
1)Possivelmente para acomodar os diferentes tipos de ovos (distribuição de vitelo) ;
2)O posicionamente relativo dos blastômeros é importante para:
a) divisão assimétrica de elementos citoplasmáticos e
b) eventos de indução.
CLIVAGEM
1.Frequência
2. Sincronia
3. Padrão de clivagem
As clivagens ocorrem de SINCRONIZADA (BLÁSTULA)
CLIVAGEM
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CLIVAGEM: o mesmo processo em espécies diferentes3. Peixe
O período até a gástrula é o de maior divisão celular.Mas.. Quanto tempo tem uma blástula?
Anfíbio: 1-37.000 células/43 horas=15 células/min
Drosophila:1- 50.000/12 horas=70 células/min
Na clivagem embrionária, NÃO ocorre G1 e G2, ou seja, há aumento do número celular sem ocorrer crescimento celular
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Nos animais de desenvolvimento externo:
1) O período imediatamente após a fertilização é seguido de divisões celulares com ciclo celular abreviado
ciclo celular abreviado
2) Não há tempo para transcrição
3) Dependem de estoques maternos, i.e. presentes no citoplasma do ovo
O período até a gástrula é o de maior divisão celular
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Transição meso-blástula de anfíbios.
1. Início da transcrição Zigótica
2. Incorporação dos estágios G1 e G2
3. Perda da sincronicidade de divisão celular
Velocidade de divisão celular diminui
Ex.: em Xenopus passa de 30min/ciclo para 4h/ciclo
CLIVAGEM
1.Frequência
2. Sincronia
3. Padrão de clivagem
Velocidade= ciclo celular abreviado
Até a trancrição zigótica (mãe é mãe)
E OS MAMÍFEROS?
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Fertilização
Desenvolvimento
Externa Interna Interna
Externo InternoExterno
Externa
Externo
Externa
Externo
1.5 DIAS PARA 2 CÉLULASMÉDIA DE 12h-24h/CICLO CELULAR
2,2 h/ciclo no embrião de 6,5 dias
Farrell et al., Current Biology 2004
Holoblástico rotacional
E OS MAMÍFEROS?
As primeiras clivagens são assincrônicas.Como é o ciclo celular?
Tem G1 e G2
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MIO Y., MAEDA K., 2008 American journal of obstetrics and gynecology 199: 660.e1–5.
E OS MAMÍFEROS?
As primeiras clivagens são assincrônicas.Como é o ciclo celular?
Tem G1 e G2Transcrição zigótica a partir de 2-células
Anexos embrionários
ausentes ausentes ausentes
Âmnio, saco vitelínico, alantóide,
córion
Âmnio, saco vitelínico, alantóide,
córion
Interface materno-fetal
Não Não Não Não SIM
Fertilização
Desenvolvimento
Externa Interna Interna
Externo InternoExterno
Externa
Externo
Externa
Externo
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E OS MAMÍFEROS?
FOCO na segregação de células embrionárias e extraembrionárias. E não no aumento acelerado de n. de células.
CLIVAGEM
1.Frequência
2. Sincronia
3. Padrão de clivagem
Velocidade= ciclo celular abreviado
Até a trancrição zigótica (mãe é mãe)
?
Você trata um embrião de Xenopus logo após a fertilização com um fármaco que inibe a RNA polimerase II. O que é esperado da clivagem e da gastrulação?
a)Normal
b)Clivagem anormal e gastrulação normal
c)Clivagem anormal e gastrulação anormal
d)Clivagem normal e gastrulação anormal.
Objetivo:
•Multicelular•Três folhetos•Forma de “faríngula”
Aumento do número de células
Espaço para manobra
Rearranjo celular
CLIVAGEM
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A Blastocele: espaço para manobra* Blastocele= Cavidade interna da Blástula
1. Permite migração celular2. Compartimentaliza regiões diferentes
* *
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Holoblástico rotacional
O blastocisto de mamífero contêm MASSA CELULAR INTERNA que formará o embrião propriamente dito
e o TROFOECTODERMA, que formará o córion da placenta
Anexos embrionários
ausentes ausentes ausentes
Âmnio, saco vitelínico, alantóide,
córion
Âmnio, saco vitelínico, alantóide,
córion
Interface materno-fetal
Não Não Não Não SIM
Fertilização
Desenvolvimento
Externa Interna Interna
Externo InternoExterno
Externa
Externo
Externa
Externo
Massa Celular Interna
Blastocele
Trofoectoderma
Zona Pelúcida
Ao final de várias mitoses, distinguem-se duas populações de células:•Massa Celular Interna•Trofoectoderma
Embrião Propriamente Dito
Porção Embrionária da Placenta
Porção Embrionária da Placenta
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1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão?
2. O que estas células PODEM ser?
3. QUANDO elas decidem o que vão ser?
4. COMO ocorre esta decisão?
5. Como é determinada a MORFOLOGIA tecidual?
Descrição ExpressãoCirurgia Descrição
•Embriologia Clássica•Mapa do Destino•Imunohistoquímica •Hibridização in situ•RT-PCR
Cirurgia
•Cultura•Transplantação•Ablação
Expressão
•SUPERexpressão
•SUBexpressão•RNA antisenso•RNAi•Knockout ou mutação
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Desenvolvimento do Olho
Descrição Cirurgia Expressão
1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão?
2. O que estas células PODEM ser?
3. QUANDO elas decidem o que vão ser?
4. COMO ocorre esta decisão?
5. Como é determinada a morfologia tecidual?
Descrição Cirurgia Expressão
•Embriologia Clássica•Mapa do Destino•Imunohistoquímica •Hibridização in situ•RT-PCR
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VANTAGENS DESVANTAGENS
Desenvolvimento quase todo externo
Estádios iniciais similares ao mamífero Estádios posteriores diferentes do mamífero
Ferramentas de interferência gênica rápidas
Ausência de ferramentas genômicas
Não há problemas éticos com parental Dificuldade em analisar efeitos maternais
Gallus gallusEmbriogênese: 21 dias
Gilbert 8th Edition
Dobras neurais
O olho se desenvolve a partir da vesícula óptica e do ectoderme sobrejacente
Tubo neural
Vesículaóptica
30h26h 33h(7 somitos)
36h(10 somitos)
ectoderme
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E1.5-E2.5Hamburger V Hamilton HL, 1951
Desenvolvimento do olho em Vertebrados
Descrição Cirurgia Expressão
•Embriologia Clássica•Mapa do Destino•Imunohistoquímica •Hibridização in situ•RT-PCR
Pergunta: Daonde vêm as células que irão formar o olho?
Como seguir uma célula entre várias?Método: MAPA DO DESTINO
Gilbert 8th Edition
A injeção de corante flourescente permite acompanhar o destino celular
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A região que originará o olho (campo óptico) fica gradativamente mais distinta da região nasal
Descrição Cirurgia Expressão
•Mapa do Destino•Imunohistoquímica •Hibridização in situ•RT-PCR
Pergunta: Que tipo de proteínas as células oculares expressam durante a sua diferenciação?
3/9/2017
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O anticorpo anti-delta-cristalina marca especificamente o cristalino,i.e. delta cristalina é um bom marcador para cristalino
MyoD
Tor70, Keratan Sulphate (MZ15)
GATA-2/4
xPax-2
Hoxb-9 N-CAMNeural
Marcadores Moleculares (molecular markers) são genes/proteínas característicos para cada tecido
A região que originará o olho (campo óptico) fica gradativamente mais distinta da região nasal
PODE-SE CONCLUIR DESTE EXPERIMENTO QUE:
a)As células mudam de expressão gênica com o tempob)As células migraramc)a) e b)d)Nenhuma das acima
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Pergunta: A segregação espacial de precursores nasais e ópticos é acompanhada da segregação de marcadores moleculares?Método: Hibridação in situ para detecção de RNAm
A expressão de Pax6 (marcador de campo óptico) progressivamente segrega da expressão de Dlx5 (marcador de campo nasal)
Pax
6D
lx5
O fator de transcrição Pax6 fica com expressão restrita aos tecidos ópticos em desenvolvimento
Hibridização in situ
1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão?
2. O que estas células PODEM ser?
3. QUANDO elas decidem o que vão ser?
4. COMO ocorre esta decisão?
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O fator de transcrição Pax6 fica com expressão restrita aos tecidos ópticos em desenvolvimento
Hibridização in situ
Hipótese: A presença do fator de transcrição Pax6 é necessária para formação de olho
COIMO PROVAR ISTO??
a)Não preicsa, o padrão de expressão já prova istob)Fazer imunohistoquímica/fluorescência para Pax6c)Remover PAx6d)Aumentar a expressão de Pax6
Descrição Cirurgia Expressão
•SUPERexpressão
•SUBexpressão•RNA antisenso•RNAi•Knockout ou mutação
Hipótese: A presença do fator de transcrição Pax6 é necessária para formação de olho
RNA antisenso
RNA mensageiro
DNA
Inibição da Tradução
RNA antisenso inibe a tradução
3/9/2017
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A eletroporação de antisenso para Pax6 em galinha altera o desenvolvimento ocular
CONTROLE antisenso para Pax6
O que acontece com mamíferos? KNOCKOUT de PAX-6
A mutação do gene Pax6 é deletéria para o desenvolvimento ocular em camudongos“A Ontogenia recapitula a Filogenia”
(Ernst Haeckel , 1891)
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Astyanax fasciatus mexicanus
O peixe-cego das cavernas mexicanas Os peixes de cavernas são anoftálmicos porque não expressam Pax6 por tempo suficiente
Descrição Cirurgia Expressão
•SUPERexpressão
•SUBexpressão
Hipótese: A presença do fator de transcrição Pax6 é suficiente para formação de olho
uper Expressão Gênica!!!!
•Microinjeção de RNA
•Eletroporação
•Infecção
•Transgênese
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VANTAGENS DESVANTAGENS
Modelo genético tradicional
Ferramentas genéticas
Velocidade de desenvolvimento
Conservação Evolutiva de Mecanismos Não é vertebrado
Drosophila MelanogasterEmbriogênese: 9 dias
Pax6 comanda o desenvolvimento ocular:A expressão de Pax6 em patas cria olhos ectópicos
Drosophila melanogaster
Superexpressão de Pax6 forma de olhos extras
Xenopus laevis
NormalVisão dorsal
Mutante com mais Pax6
Visão dorsal
A superexpressão de Pax6 no tronco de anfíbios forma olhos ectópicos (identificação por imuno para delta cristalina).
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Conclusão: Pax 6 é necessário e suficiente para induzir formação de olho
Embriões de Cefalópodos expressam Pax6 no olho
Promotor sensível a Pax6
EGFP
Planárias transgênicas demonstram a presença de Pax6 nos olhos
http://cas.bellarmine.edu/tietjen/images/platyhelminthes.htm
O olho da planária é constituído apenas de células pigmentares associadas a fotorreceptores
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Conclusão: Pax 6 tem a função evolutivamente conservada de coordenar o desenvolvimento embrionário de órgãos fotossensíveis
Descrição
•Embriologia Clássica•Mapa do Destino•Imunohistoquímica •Hibridização in situ•RT-PCR
Cirurgia
•Cultura•Transplantação•Ablação
Expressão
•SUPERexpressão
•SUBexpressão•RNA antisenso•RNAi•Knockout ou mutação
O gene FACEBOOK é expresso no desenvolvimento apenas no aparelho reprodutor.
O Knockout de FACEBOOK gera camudongos sem aparelho reprodutor.
O transgênico constitutivo do FACEBOOK não gera fenótipo.
Você diria que FACEBOOK é:
a)Necessário e suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
b)Necessário mas não suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
c)Não é necessário mas é suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor;
d)Não é necessário nem suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor.
O gene FACEBOOK é expresso no desenvolvimento apenas no aparelho reprodutor.
O Knockout de FACEBOOK gera camudongos sem aparelho reprodutor.
O transgênico constitutivo do FACEBOOK não gera fenótipo.
Você diria que FACEBOOK é:
a)Necessário e suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
b)Necessário mas não suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
c)Não é necessário mas é suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor;
d)Não é necessário nem suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor.
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O gene FACEBOOK é expresso no desenvolvimento apenas no aparelho reprodutor.
O Knockout de FACEBOOK não tem fenótipo.
O transgênico constitutivo do FACEBOOK gera um camudongo com aparelho reprodutor extra e dígitos fusionados.
Você diria que FACEBOOK é:
a)Necessário e suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
b)Necessário mas não suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
c)Não é necessário mas é suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor;
d)Não é necessário nem suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor.
O gene FACEBOOK é expresso no desenvolvimento apenas no aparelho reprodutor.
O Knockout de FACEBOOK não tem fenótipo.
O transgênico constitutivo do FACEBOOK gera um camudongo com aparelho reprodutor extra e dígitos fusionados.
Você diria que FACEBOOK é:
a)Necessário e suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
b)Necessário mas não suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
c)Não é necessário mas é suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor;
d)Não é necessário nem suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor.
O gene FACEBOOK é expresso no desenvolvimento apenas no aparelho reprodutor.
O Knockout de FACEBOOK não tem fenótipo.
O transgênico constitutivo do FACEBOOK gera um camudongo com aparelho reprodutor extra e dígitos fusionados.
Você diria que FACEBOOK é:
a)Necessário e suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
b)Necessário mas não suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
c)Não é necessário mas é suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor;
d)Não é necessário nem suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor.
O gene FACEBOOK é expresso no desenvolvimento apenas no aparelho reprodutor.
O Knockout de FACEBOOK não tem fenótipo.
O transgênico constitutivo do FACEBOOK gera um camudongo com aparelho reprodutor extra e dígitos fusionados.
Você diria que FACEBOOK é:
a)Necessário e suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
b)Necessário mas não suficiente para induzir formação do aparelho reprodutor;
c)Não é necessário mas é suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor;
d)Não é necessário nem suficiente para induzir a formação do aparelho reprodutor.