Controle do Ciclo Controle do Ciclo CelularCelular

Profa Dra Enilza Maria Espreafico

Fases Fases do do

Ciclo Ciclo CelulaCelula

rr

Fases do ciclo Fases do ciclo celular – Pontos celular – Pontos

de controlede controle

A maquinaria de replicação é ativada após a passagem pelo

ponto de restrição

Ponto de restrição

Disparo da mitose

TransiçãoMetáfase –

anáfase

Pontos de monitoramento Pontos de monitoramento (checagem) do ciclo celular(checagem) do ciclo celular

Peculiaridades do Ciclo Peculiaridades do Ciclo CelulaCelularr

Quantificação de células em diferentes Quantificação de células em diferentes fases do ciclo celularfases do ciclo celular

G2 e M

S

G1

Quantidade relativa de DNA por célula(unidade arbitrária)

Modelos experimentais que revelam os fatores

regulatórios do ciclo celular

Fusão Fusão de de

célulascélulas

Identificação dos genes cujos produtos agem em diferentes pontos do ciclo celular – A levedura como organismo modelo.

Experimentos de complementação Experimentos de complementação em leveduraem levedura

Maturação de ovócitos Maturação de ovócitos de Xenopusde Xenopus

Identificação do MPF em XenopusIdentificação do MPF em Xenopus

Os níveis de ciclina mitótica variam ciclicamente no decorrer do ciclo celular, atingindo seu pico em metáfase

e decaindo abruptamente ao final de mitose

Demonstração experimental de que a síntese Demonstração experimental de que a síntese e degradação de ciclina B são necessárias e degradação de ciclina B são necessárias

para a atividade cíclica de MPFpara a atividade cíclica de MPF

Conclusão:

A ciclina B dispara a mitose e sua degradação é necessária para o término da mitose, em outras palavras, a célula necessita de ciclina para entrar em mitose e precisa degradá-la para sair de mitose.

Como a ciclina é reconhecida para degradação? Como a ciclina é reconhecida para degradação? Como ela é marcada para degradação?Como ela é marcada para degradação?

Domínio de reconhecimento: caixa de degradação das ciclinas

Poliubiquitinação das ciclinas mitóticas

A degradação de ciclina é dependente de APC (ciclossomo), A degradação de ciclina é dependente de APC (ciclossomo), sendo que a ativação de APC é dependente de Cdk-ciclina. sendo que a ativação de APC é dependente de Cdk-ciclina.

Ativação do MPFAtivação do MPF

MPF ativa mais MPFMPF ativa mais MPF

Regulação da Regulação da atividade quinase de atividade quinase de MPF por: MPF por:

Cdc13 Cdc13 (ciclina B)(ciclina B)

Wee1Wee1 (tirosina quinase-(tirosina quinase-inibitória)inibitória)

CAK CAK (quinase ativadora de (quinase ativadora de Cdc2)Cdc2)

Cdc25 Cdc25 (fosfatase ativadora)(fosfatase ativadora), , remove fosfato inibitório Y15remove fosfato inibitório Y15

Efeito de mutações em cdc25 e Efeito de mutações em cdc25 e wee1wee1

Cdc 25 = fosfatase ativadora de CDK

Wee1 = Tirosina quinase inibitória

A mitose pode ser estudada em núcleos A mitose pode ser estudada em núcleos adicionados a extratos de ovócitosadicionados a extratos de ovócitos in vitroin vitro

Nesse extrato, mRNA, proteínas, peptídeos ou outras Nesse extrato, mRNA, proteínas, peptídeos ou outras substâncias podem ser adicionados para observação substâncias podem ser adicionados para observação

dos seus efeitos sobre a progressão mitóticados seus efeitos sobre a progressão mitótica

Observem os resultados experimentais Observem os resultados experimentais mostrados a seguir e respondam às mostrados a seguir e respondam às

perguntas:perguntas:

Condição controleCondição controle

Veja a progressão mitótica - da metáfase ao final da Veja a progressão mitótica - da metáfase ao final da telófasetelófase

1- O que ocorre quando a ciclina B é substituída 1- O que ocorre quando a ciclina B é substituída por uma forma mutante não-degradável?por uma forma mutante não-degradável?

2- O que ocorre quando se adiciona ao extrato excesso 2- O que ocorre quando se adiciona ao extrato excesso do peptídeo do peptídeo caixa de destruição caixa de destruição da ciclina B?da ciclina B?

3- Por que o excesso do peptídeo 3- Por que o excesso do peptídeo causa efeito causa efeito diferentediferente do causado pela ciclina B mutante? do causado pela ciclina B mutante?

2- A ciclina B precisa ser degradada para que 2- A ciclina B precisa ser degradada para que a célula deixe a mitose (caso contrário a célula a célula deixe a mitose (caso contrário a célula fica detida em anáfase). fica detida em anáfase).

Conclusões1- O disparo da anáfase não requer a 1- O disparo da anáfase não requer a degradação da ciclina mitótica (sabemos que degradação da ciclina mitótica (sabemos que a ativação da maquinaria mitótica até este a ativação da maquinaria mitótica até este ponto é dependente da ciclina B)ponto é dependente da ciclina B)

3- O peptídeo que contém o domínio de destruição 3- O peptídeo que contém o domínio de destruição detém o núcleo em metáfase, portanto, conclui-se detém o núcleo em metáfase, portanto, conclui-se que outra proteína além da ciclina B precisa ser que outra proteína além da ciclina B precisa ser degradada para que ocorra a anáfase (segregação degradada para que ocorra a anáfase (segregação dos cromossomos).dos cromossomos).

A ativação de APC leva a degradação coesinas e o A ativação de APC leva a degradação coesinas e o conseqüente disparo da anáfaseconseqüente disparo da anáfase

1- O bloqueio farmacológico de APC retém a célula em metáfase

2- A presença de ciclina B não degradável retém a célula em anáfase

Controle da entrada em anáfase e Controle da entrada em anáfase e saída da mitose por APCsaída da mitose por APC

SECURINA

Separase inativa

Separase ativaCoesinas

Coesinas clivadas e dissociadas

Securina ubiqüitilada e degradada

O que a Cdk-ciclina M faz para disparar a mitose?O que a Cdk-ciclina M faz para disparar a mitose?Por que a sua degradação é requerida para a saída? Por que a sua degradação é requerida para a saída?

Ex: Atividade coordenada de MPF e fosfatases sobre o envelope nuclearEx: Atividade coordenada de MPF e fosfatases sobre o envelope nuclear

MPF e fosfatases – inibição e ativação MPF e fosfatases – inibição e ativação de miosina -- Citocinesede miosina -- Citocinese

Controle do Ciclo Celular -G1...S...G2-Pontos de checagem

Atividade Atividade de Cdk-de Cdk-ciclinas ciclinas

de de mamíferomamífero D1, D2, D3

M-Cdk inativadaHct1-APC ativadaCKI acumula-seBaixa produção de ciclina= Supressão de toda atividade Cdk

As principais ciclinas e Cdks em vertebrados:Complexo Ciclina CdkG1-Cdk ciclina D (D1, D2 e D3 em mamíferos) Cdk4/Cdk6G1/S-Cdk ciclina E Cdk2S-Cdk ciclina A Cdk2M-Cdk ciclina B Cdk1

Como a célula escapa da estável FASE G1 para iniciar a FASE S???

Sinais extracelulares estimulam a proliferação celular

Acúmulo de ciclinas de G1

Os mecanismos que controlam a entrada em FASE S em células animais – A proteína RETINOBLASTOMA (Rb) atua como um freio em células de mamíferos

Demonstração de que a ciclina D é necessária para desencadear a fase S em células de mamífero

Síntese de DNA visualizada por incorporação de BrdU

Demonstração Demonstração de que as de que as

ciclinas de G1 ciclinas de G1 e G1/S (Cln1, e G1/S (Cln1, Cln2 e Cln3) Cln2 e Cln3)

regulam regulam entrada em S entrada em S em leveduraem levedura

+Cln3

-Cln3

+Cln3

-Cln3

Queda de Cln3 >

+/-Cln3

Como o sistema de controle do ciclo celular desencadeia o Como o sistema de controle do ciclo celular desencadeia o processo de replicação e ao mesmo tempo previne sua processo de replicação e ao mesmo tempo previne sua

ocorrência mais de uma vez por ciclo?ocorrência mais de uma vez por ciclo?

A re-replicação do DNA é bloqueada

Pontos de checagem

p53, CIPs e INKs

Como p53 Como p53 bloqueia o bloqueia o

Ciclo Ciclo Celular Celular em G1em G1

p53

p53

P

Entrada em mitose é bloqueada por replicação incompleta do DNA: O ponto de checagem da Replicação do DNA (FASE S)

Ponto de Checagem do Fuso Mitótico

Mad2 no cinetocoro livre Não-disjunção

Falha

Ver vídeo

Como é que um único, minúsculo, cinetocoro livre consegue inibir toda a APC da célula?

As células de mamífero dependem de estímulo por fatores As células de mamífero dependem de estímulo por fatores extracelulares para romperem a barreira de G1 e poderem proliferarextracelulares para romperem a barreira de G1 e poderem proliferar

Sistema geral de controle Sistema geral de controle do Ciclo Celulardo Ciclo Celular