Diagnóstico laboratorial de micoplasmas animales

José B. PovedaJosé B. Poveda

UNIDAD DE EPIDEMIOLOGÍA Y MEDICINA PREVENTIVAFACULTAD DE VETERINARIA. ULPGC

Mollicutes

Los micoplasmas o más correctamente Mollicutes constituyen un grupo de bacterias de pequeño tamaño

que carecen de pared celular

micoplasmas mesoplasmas

ureaplasmasespiroplasmas

fitoplasmas

entomoplasmasacholeplasmas

eperythrozoon haemobartonellas

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mbp

Clostridia

Mollicutes

Bacilli

Spirochaetes

Bacteroidetes

Chlamydiae

delta proteobacteria

epsilon proteobacteria

beta proteobacteria

gamma proteobacteria

Firmicutes con bajo contenido G+C

Se caracterizan por su pequeño genoma(0.58 a 1.38 Mbps )

Poseen un bajo contenido en G+C (23 a 40 mol%).

M. capricolum subsp. capricolum (Mcc)

M. capricolum subsp. capripneumoniae (Mccp)M. sp. bovine group 7 (Mbg7)

M. mycoides subsp. mycoides LC (MmmLC) M. mycoides subsp. capri (Mmc)

M. cottewii M. yeatsii

M. gallisepticum

M. genitalium

M. pneumoniaeM. penetrans

U. parvum

M. pulmonisM. hyopneumoniae

M. conjunctivae

M. adleri

M. primatum

M. agalactiae

M. bovisM. hominis

M. alkalescensM. arginini

M. auris

An. bactoclasticumA. laidlawii

Ca. Phytoplama aurantifolia

As. anaerobium

S. citri

M. putrefaciens

M. species serogroup 11

M. mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC)

100

100

100

100

100

100

50

93

100

89

0.1

Spiroplasma

Pneumoniae

Hominis

Phytoplasma Acholeplasma

Haemoplasmas

Mollicutes

Los Mollicutes, son bacterias mínimas que poseen un amplio espectro de hospedadores

rumiantes aves

humanospeces

artrópodos

reptilesplantas

Muchos hospedadores para tan pequeña cantidad de genes

LOS MYCOPLASMAS SON COMENSALES Y PATÓGENOS DE DIFERENTES ESPECIES DE ANIMALES INCLUYENDO

PECES, REPTILES, AVES Y MAMÍFEROS

LOS MYCOPLASMAS SON COMENSALES Y PATÓGENOS DE DIFERENTES ESPECIES DE ANIMALES INCLUYENDO

PECES, REPTILES, AVES Y MAMÍFEROS

PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA (CBPP)

Mycoplasma mycoides subsp. mycoides

8

1847

1860

1841

1846

1864

PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA

PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA

9

1853

Exístía previamente en Africa?

1880

1858

1843

1868

En el siglo 19 el comercio de ganado conduce a la rápida expansión de la enfermedad

América del Surnunca fue contaminada

PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA

PERSPECTIVA HISTÓRICA DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA

LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA SIGUE SIENDO UNO DE LOS MAYORES IMPEDIMENTOS PARA LA CRÍA DEL

GANADO VACUNO EN EL AFRICA SUBSAHARIANA

LA PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA BOVINA SIGUE SIENDO UNO DE LOS MAYORES IMPEDIMENTOS PARA LA CRÍA DEL

GANADO VACUNO EN EL AFRICA SUBSAHARIANA

Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae

PLEURONEUMONÍA CONTAGIOSA CAPRINA

AGALAXIA CONTAGIOSA DE LOS PEQUEÑOS RUMIANTESMycoplasma agalactiae

PLEURONEUMONÍAS CAPRINAS

Mycoplasma mycoides subsp. capri

ARTRITIS MAMITIS Y NEUMONÍAS CAPRINAS

Mycoplasma capricolum subsp. capricolum

ARTRITIS Y MAMITIS CAPRINAS

Mycoplasma putrefaciens

NEUMONÍA ENZOÓTICA PORCINA

Mycoplasma hyopneumoniae

AFECCIONES POR MYCOPLASMA BOVIS

Mycoplasma bovis

ENFERMEDAD CRÓNICA RESPIRATORIA DE LAS AVES

Mycoplasma gallisepticum

SINUSITIS DEL PAVO

Mycoplasma meleagridis

SINOVITIS INFECCIOSA AVIAR

Mycoplasma synoviae

ANEMIA INFECCIOSA FELINA

Mycoplasma haemofelis Candidatus Mycoplasma haemominutum

Candidatus Mycoplasma turicensis

ANEMIAS POR HEMOPLASMAS EN CÁNIDOSMycoplasma haemocanis

ANEMIAS POR HEMOPLASMAS EN PORCINOS

Mycoplasma suis

ANEMIAS POR HEMOPLASMAS EN OVINOS

Mycoplasma ovis

LAS DIFICULTADES DE CULTIVO DE ESTOS MICROORGANISMOS ES UN GRAN OBSTÁCULO

PARA LA INVESTIGACIÓN Y PARA EL DIGNÓSTICO

LAS DIFICULTADES DE CULTIVO DE ESTOS MICROORGANISMOS ES UN GRAN OBSTÁCULO

PARA LA INVESTIGACIÓN Y PARA EL DIGNÓSTICO

Mycoplasma bovis

MUCHAS ESPECIES CONTINÚAN SIENDO INCULTIVABLES A PESAR DE LOS GRANDES

ESFUERZOS QUE SE HAN REALIZADO EN LOS ÚLTIMOS AÑOS

MUCHAS ESPECIES CONTINÚAN SIENDO INCULTIVABLES A PESAR DE LOS GRANDES

ESFUERZOS QUE SE HAN REALIZADO EN LOS ÚLTIMOS AÑOS

Mycoplasma haemofelis

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mbp

Clostridia

Mollicutes

Bacilli

Spirochaetes

Bacteroidetes

Chlamydiae

delta proteobacteria

epsilon proteobacteria

beta proteobacteria

gamma proteobacteria

Firmicutes con

bajo contenidoG+C

(0.58 a 1.38 Mbps )

LOS MICOPLASMAS TIENEN UNA LIMITADA CAPACIDAD PARA SINTETIZAR MACROMOLÉCULAS ESENCIALES PARA SU CRECIMIENTO POR SU PEQUEÑO GENOMA

LOS MICOPLASMAS TIENEN UNA LIMITADA CAPACIDAD PARA SINTETIZAR MACROMOLÉCULAS ESENCIALES PARA SU CRECIMIENTO POR SU PEQUEÑO GENOMA

INFUSIÓN CEREBRO-CORAZÓN PEPTONAS

EXTRACTO DE LEVADURA

SUERO

SUPLEMENTOS

PARA SUPERAR ESTAS DEFICIENCIAS SE EMPLEAN PARA SU CULTIVO MEDIOS MUY RICOS.

PARA SUPERAR ESTAS DEFICIENCIAS SE EMPLEAN PARA SU CULTIVO MEDIOS MUY RICOS.

LOS MICOPLASMAS SON COMPLETAMENTE DEPENDIENTES DE LOS ÁCIDOS GRASOS QUE OBTIENEN DE LOS HOSPEDADORES. LOS MICOPLASMAS SON COMPLETAMENTE DEPENDIENTES DE LOS ÁCIDOS GRASOS QUE OBTIENEN DE LOS HOSPEDADORES.

AMINOÁCIDOSPRECURSORES DE LOS ÁCIDOS NUCLEIDOS

PRECURSORES DE LOS LÍPIDOS VITAMINAS

MEDIO HAYFLICK (HAYFLICK 1965)MEDIO HAYFLICK (HAYFLICK 1965)

Extracto de levadura 19.6 gInfusión de cerebro 17.7 gSuero de caballo 157.0 mlRojo fenol 24.0 mg Penicilina 40.0 IkUDNA 19.0 mg

pH 7.8

Mycoplasma spp

MEDIO PH (KIRCHHOFF Y ROSENGARTEN 1984)MEDIO PH (KIRCHHOFF Y ROSENGARTEN 1984)

Extracto fresco de levadura 16.8 gAgua bidestilada 700.0 ml

Extracto fresco de levadura 18.0 mlPenicilina G (100.000 UI/ml) 6.0 mlDNA (0.4%) 4.4 mlB-NAD 0.10 gL-cisteína hcl 0.10 gAgua bidestilada 91.0 ml

Suero de caballo 178.0 mlpH 7.4

Mycoplasma mycoides capri

MEDIO SP4 (WHITCOMB 1983)MEDIO SP4 (WHITCOMB 1983)

Bacto PPLO broth 4.2 gBacto peptona 6.4 gBacto triptona 12.0 g Agua bidestilada 535.0 ml

pH 7.8RPMI 1640 60.0 mlExtracto fresco de levadura 42.0 mlYeastolate (5g/250 ml) 120.0 mlGlucosa (solución al 50%) 12.0 mlPenicilina G (1.000.000 UI/ml) 6.0 mlRojo fenol (0.1%) 24.0 mlAgua bidestilada 200.0 ml

pH 7.2Suero de caballo 251.0 ml

Mycoplasma fermentans

MEDIO SP4II (RAMIREZ Y COLS 1997)MEDIO SP4II (RAMIREZ Y COLS 1997)

Bacto PPLO broth 4.2 gBacto peptona 6.4 gBacto triptona 12.0 g Agua bidestilada 535.0 ml

pH 7.8Extracto fresco de levadura 42.0 mlAmpicilina (100 mg/ml) 2.5 mlExtracto de levadura (5g/250 ml)120.0 mlDNA (0.4%) 5.5 mlPiruvato sódico 2.5 mlB-NAD 0.125 gL-cisteína hcl 0.125 g CMRL 1066 (10X) 60.0 mlRojo fenol (0.1%) 24.0 mlAgua bidestilada 207.5 ml

pH 7.2Suero de caballo 251.0 ml

Mycoplasma hyorhinis

MEDIO DE FRIIS (FRIIS 1975)MEDIO DE FRIIS (FRIIS 1975)

Mycoplasma hyopneumoniae

Solución balanceada de Hanks 500.0 ml Brain Heart Infusion (BHI) 8.2 gBacto PPLO Broth 8.7 gAgua bidestilada 650.0 ml

pH 7.4Extracto fresco de levadura (25%) 34.0 mlRojo Fenol solución al 1% 100.0 mlPenicilina G solución (200.000 UI/ml) 3.5 ml

pH 7.4Suero de caballo 220 .0 mlSuero de cerdo 220 .0 ml

MEDIO DE FRIIS MEDIO DE FRIIS

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

Mycoplasma hyopneumoniae

Mycoplasma flocculare

Mycoplasma hyorhinis

Mycoplasma hyosynoviae

10T3

13 CL

34 CL

11 CL2

15 CL2

39 CL

10 T4

72 CL

51 CL

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

98 CL1

18 CL

20 CL

54 CL

98 CL2

98 CL3 13 CL3

20CL2

13 T2

TECNICAS DE AISLAMIENTOTECNICAS DE AISLAMIENTO

J.B. PovedaBIOCHEMICAL CHARACTERISTICS IN

MYCOPLASMA IDENTIFICATIONMYCOPLASMA PROTOCOLS

Editores R. Nicholas and R.J. MilesHumana Press. Totowa New York. 1998

Glucose Mannose Arginine Tetrazolium Urea Films&Spot

10T3 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK

34CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK

18CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK

72CL NEGARIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK

98CL1 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK

98CL3 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE WEAK

10T4 POSITIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE

98CL2 POSITIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE

11CL2 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE

13T2 NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE

51CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE

54CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE

58CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE

13CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE

15CL NEGATIVE NEGATIVE POSITIVE POSITIVE NEGATIVE WEAK

39CL POSITIVE NEGATIVE POSITIVE NEGATIVE NEGATIVE NEGATIVE

MYCOPLASMAS FERMENTATIVOSMYCOPLASMAS FERMENTATIVOS

MYCOPLASMAS QUE HIDROLIZAN LA ARGININA

MYCOPLASMAS QUE HIDROLIZAN LA ARGININA

MYCOPLASMAS QUE NO FERMENTAN LA GLUCOSA NI HIDROLIZAN LA ARGININA

MYCOPLASMAS QUE NO FERMENTAN LA GLUCOSA NI HIDROLIZAN LA ARGININA

MYCOPLASMAS QUE PRODUCEN PELÍCULAS Y CRISTALES EN EL MEDIO

MYCOPLASMAS QUE PRODUCEN PELÍCULAS Y CRISTALES EN EL MEDIO

J.B. Poveda and R. NicholasSEROLOGICAL IDENTIFICATION OF

MYCOPLASMAS BY GROWTH AND METABOLISM INHIBITION TEST .MYCOPLASMA PROTOCOLS

Editores R. Nicholas and R.J. MilesHumana Press. Totowa New York. 1998

LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTOLA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO

LA INHIBICIÓN DEL METABOLISMOLA INHIBICIÓN DEL METABOLISMO

ELISAELISA

Mycoplasma bovis Mycoplasma gallisepticum

Mycoplasma hyopneumoniae

Mycoplasma synoviaeMycoplasma agalactiae

Mycoplasma mycoides

Estudiamos la distribución de la agalaxiacontagiosa caprina en las Islas Canarias

mediante un ELISA indirecto

Serological study of contagious agalactia in herds of goa ts in theCanary Islands.Assunção P, De la Fe C, Ramirez AS, Andrada M, Poveda JB.Unit of Epidemiology and Preventive Medicine, Veterinary Faculty, University of Las Palmas, Transmontaña s/n 35416 Arucas, Las Palmas de Gran Canaria, Spain.

Estudiamos 3890 muestras deun total de 204 explotaciones

Los resultados indican que la seroprevalencia es alt a

Mycoplasma agalactiae55%

Mycoplasma mycoides LC67%

PCR PARA DETECTAR MOLLICUTESPCR PARA DETECTAR MOLLICUTES

van Kuppeveld et al.1992

5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT- 3’

5’ -TGCACCATCTGTCACTCTGTT AACCTC- 3’

GPO-3

MGS-O

PRODUCTO: 270 pb

16S rRNA

PCR PARA DETECTAR Mycoplasma agalactiaePCR PARA DETECTAR Mycoplasma agalactiae

5´-AAAGGTGCTTGAGAAATGGC-3´

5´-GTTGCAGAAGAAAGTCCAATCA-3´

Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo

1 1 94ºC 300 seg

2 35

94ºC 60 seg.

55ºC 60 seg.

72ºC 60 seg.

3 1 72ºC 600 seg.

4 1 4ºC Hold

Tola et al.1997

FS1

FS2

PRODUCTO 375 pb

16S rRNA

PCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDESPCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDES

Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo

1 1 94ºC 120 seg

2 30

94ºC 15 seg.

50ºC 15 seg.

72ºC 15 seg.

3 1 72ºC 300 seg.

4 1 4ºC Hold

5´-TGCACTTGGTGAATATARAAAAGG-3´

5´-GGATCTAAAGCRTGTATTARTAATG-3´

glk-myc-2F

glk-myc-2R

Woubit et al. 2007

PRODUCTO 428 pb

Mycoplasma mycoides mycoidesMycoplasma mycoides capriMycoplasma capricolum capricolumMycoplasma capricolum capripneumoniae

PCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDESPCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDES

Manso-Silvan et al. 2007

PRODUCTO 781 pb

FusA-F 5´-TGAAATTTTTAGATGGTGGAGAA-3´

5´-GGTAATTTAATAGTTTCACGATATGAA -3´FusA-R

fusA

PCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDESPCR PARA DETECTAR GRUPO MYCOIDES

Manso-Silvan et al. 2007

PRODUCTO 695 pb

GlpQ-L-F 5´-GTGAATATAATGATCTTAGTAGC-3´

5´-TCAGGATAATCTGAAATATAACC -3´GlpQ-L-R

glpQ

PCR PARA DETECTAR GRUPO CAPRICOLUMPCR PARA DETECTAR GRUPO CAPRICOLUM

Laure Maigre et al. 2007

ShA51-F 5´-TAATAATAAAAGCGAAGAAAC -3´

ShA51-R 5´-CAGAAATCTGCTTAGTTAAAC -3´

Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo

1 1 94ºC 120 seg

2 35

94ºC 30 seg.

48ºC 15 seg.

72ºC 15 seg.

3 1 72ºC 300 seg.

4 1 4ºC Hold

PRODUCTO 560 pb

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA CAPRICOLUM CAPRIPNEUMONIAE

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA CAPRICOLUM CAPRIPNEUMONIAE

Woubit et al. 2004

Mccp-spe-F 5´-ATCATTTTTAATCCCTTCAAG -3´

Mccp-spe-R 5´-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA -3´

Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo

1 1 94ºC 120 seg

2 35

94ºC 30 seg.

47ºC 15 seg.

72ºC 15 seg.

3 1 72ºC 300 seg.

4 1 4ºC Hold

PRODUCTO 316 pb

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA PUTREFACIENS

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA PUTREFACIENS

Peyraud et al. 2003

Mput1 5´-AAATTGTTGAAAAATTAGCGCGAC -3´

Mput2 5´-CATATCATCAACTAGATTAATAGTAGCACC -3´

Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo

1 1 95ºC 600 seg

2 35

94ºC 15 seg.

52ºC 15 seg.

72ºC 15 seg.

3 1 72ºC 60 seg.

4 1 4ºC Hold

PRODUCTO 316 pb

Cooperamos con otros laboratorios parala puesta a punto de técnicas de diagnóstico de biología molecular

A specific PCR for the detection of Mycoplasma putrefacie ns, one of the agents of the contagious agalactia syndrome ofgoats.Peyraud A, Woubit S, Poveda JB, De la Fe C, Mercier P, Thiaucourt F.CIRAD EMVT Sante Animale, Animal Health Program, TA30/G Campus International de Baillarguet, 34398 Montpellier, France.

Mol Cell Probes. 2003 Dec;17(6):289-94 .

NESTED PCR

Calsamiglia y cols., 1999

PRIMERS DESCRITOS PORMattson y cols., 1995

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYORHINIS

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYORHINIS

PCR

Caron y cols., 2000

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA FLOCCULARE

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA FLOCCULARE

PCR

Stenke y cols., 1994

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYOSYNOVIAE

PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMA HYOSYNOVIAE

PCRArehns y cols., 1996

PCR

Kokotovic y cols., 2002

Cebador Especificidad Secuencia (5́ -3´)Tamaño del fragmento

amplificado

Mhyo 1M. hyopneumoniae

GAC CCT TCA AGC TTC ACC AAG A649 pb

Mhyo 2 TGT GTT AGT GAC TTT TGC CAC C

Mfloc 1M. flocculare

ACG GGA TAG TAT TTT AGT TTT ACT A400 pb

Mfloc 2 TCT TCC CTT ACA ACA GCA GTT TAC A

Mhyos 1M. hyosynoviae

CAG TTG AGG AAA TGC AAC TG398 pb

Mhyos 2TAG CTG CGT CAG TGA TTG G

Sp37M. hyorhinis

GTA GTC AAG CAA GAG GAT GT346 pb

Asp37 GCT GGA GTT ATT ATA CCA GGA

PRIMERS PARA LA PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMAS PORCINOS

PRIMERS PARA LA PCR PARA DETECTAR MYCOPLASMAS PORCINOS

PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL PARA DETECTAR MYCOPLASMAS PORCINOS

PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL PARA DETECTAR MYCOPLASMAS PORCINOS

Ciclo Repeticiones Temperatura Tiempo

1 1 95ºC 120 seg.

2 35

95ºC 45 seg.

60ºC 45 seg.

72ºC 60 seg.

3 1 95ºC 60 seg.

4 1 55ºC 60 seg.

5 66 65ºC 10 seg.

6 1 4ºC Hold

Especies/cepa Temperatura de “melting”

Cepa J (M. hyopneumoniae) 86 ºC

Cepa MS42 (M. flocculare) 87ºC

Cepa S16 (M. hyosinoviae) 87ºC

Cepa BTS-7 (M. hyorhinis) 80ºC

TEMPERATURAS DE MELTING PARA CADA UNA DE LAS ESPECIES DE REFERENCIA DE LAS ESPECIES

ANALIZADAS

TEMPERATURAS DE MELTING PARA CADA UNA DE LAS ESPECIES DE REFERENCIA DE LAS ESPECIES

ANALIZADAS

PRODUCTOS AMPLIFICADOS DE LAS CEPAS DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE AISLADAS EN

NUESTRO LABORATORIO

PRODUCTOS AMPLIFICADOS DE LAS CEPAS DE MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE AISLADAS EN

NUESTRO LABORATORIO

ANALISIS MOLECULAR DEL GEN ARNr 16SANALISIS MOLECULAR DEL GEN ARNr 16S

LA UTILIDAD DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S COMO HERRAMIENTA TAXONÓMICA HA SIDO

AMPLIAMENTE DEMOSTRADA EN PROCARIOTAS

LA UTILIDAD DE LA SECUENCIA DEL GEN ARNr 16S COMO HERRAMIENTA TAXONÓMICA HA SIDO

AMPLIAMENTE DEMOSTRADA EN PROCARIOTAS

16 S - start pos 5´-GAGAGTTTG ATCCTGCGTCAGG -3´16 S - 550 neg 5´-CCCAATAAATCCGGATAACGCTTGC-3´

16 S - 510 pos 5´-CTGACGCGTAACTATGTCCCAGCAG-3´

16 S - 1050 5´-GCTGACGACAACCATGCAGC-3´16 S - 980 pos 5´-CGAAGAACCTTACCC ACT CTTGACATC-3´

16 S – end neg 5´-GGT AAT CCA TCC CCA CGT TCT CG -3´

SECUENCIACION DEL PRODUCTO AMPLIFICADO DEL GEN ARNr 16S

SECUENCIACION DEL PRODUCTO AMPLIFICADO DEL GEN ARNr 16S

SERVICIO DE GENÉTICA FORENSE DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN

CANARIA

SERVICIO DE GENÉTICA FORENSE DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN

CANARIA

ANALISIS DE LA SECUENCIA Y COMPARACIÓN CON LAS SECUENCIAS DEPOSITADAS EN EL GENE BANK

Mycoplasma neophronis sp. nov., isolated from upper resp iratorytract of Canarian Egyptian Vulture (Neophron percnopterusmajorensis).Suárez-Pérez A, Ramírez AS, Rosales RS, Calabuig P, Poveda C, Rosselló-Móra R, Nicholas RA, Poveda JB.SourceInstituto Universitario de Sanidad Animal de la Universidad de Las Palmas de Gran CanariaInt J Syst Evol Microbiol. 2011 Aug 5. [Epub ahead of print]

ANALISIS MOLECULAR DE LA REGIÓN INTERGÉNICA ARNr 16S - 23S (ISR)

ANALISIS MOLECULAR DE LA REGIÓN INTERGÉNICA ARNr 16S - 23S (ISR)

LA REGIÓN INTERGÉNICA rrs-rrl (ITS) ES LA MÁS VARIABLE, AL MENOS DOS VECES QUE LA DEL GEN

rrl (23S) Y CUATRO VECES QUE LA DEL GEN rrs(16S)

LA REGIÓN INTERGÉNICA rrs-rrl (ITS) ES LA MÁS VARIABLE, AL MENOS DOS VECES QUE LA DEL GEN

rrl (23S) Y CUATRO VECES QUE LA DEL GEN rrs(16S)

Secuencia objetivo

Cebadores Secuencia de los Cebadores

Región Intergénica 16S-23S

16S+C 5’-CGT TCT CGG GTC TTG TAC AC-3’

23S-B 5’-CGC AGG TTT GCA CGT CCT TCA TCG-3’

RAMIREZ Y COLS. 2008

ANALISIS MOLECULAR DE LA REGIÓN INTERGÉNICA ARNr 16S - 23S (ISR)

ANALISIS MOLECULAR DE LA REGIÓN INTERGÉNICA ARNr 16S - 23S (ISR)

ARBOL FILOGENÉTICO BASADO EN EL ESTUDIO DE LA REGIÓN INTERGÉNICA (ISR) DE TODOS LOS

MICOPLASMAS AVIARES

ARBOL FILOGENÉTICO BASADO EN EL ESTUDIO DE LA REGIÓN INTERGÉNICA (ISR) DE TODOS LOS

MICOPLASMAS AVIARES

RAMIREZ Y COLS. 2008

MATRIZ DE PORCENTAJES DE SIMILITUDES DE LAS REGIONES INTERGÉNICAS (ISR) DE MICOPLASMAS

AISLADOS DE AVES RAPACES

MATRIZ DE PORCENTAJES DE SIMILITUDES DE LAS REGIONES INTERGÉNICAS (ISR) DE MICOPLASMAS

AISLADOS DE AVES RAPACES

ELECTROFORESIS DE DOS GELES DE AGAROSA YUXTAPUESTOS CON LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS DE LA REGION

INTERGÉNICA (ISR) DE CEPAS DE CAMPO DE M. HYOPNEUMO NIAE

ELECTROFORESIS DE DOS GELES DE AGAROSA YUXTAPUESTOS CON LOS PRODUCTOS AMPLIFICADOS DE LA REGION

INTERGÉNICA (ISR) DE CEPAS DE CAMPO DE M. HYOPNEUMO NIAE

-Huella genética-No previa información genética-Cebadores 10 nucleótidos-Baja temperatura de “annealing”

RAPD RANDOM AMPLIFICATION OF POLYMORPHIC DNA

RAPD RANDOM AMPLIFICATION OF POLYMORPHIC DNA

Strain Origin Year of isolation Strain Origin Year of isolation

Rmr 3 Spain 2005 8 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 7 Spain 2005 22 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 8 Spain 2005 25 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 9 Spain 2005 36 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 12 Spain 2005 46 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 14 Spain 2005 54 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 15 Spain 2005 62 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 16 Spain 2006 65 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 17 Spain 2006 76 Spain (Canary Islands) 2002

Rmr 19 Spain 2006 90p03 United Kingdom 2003

Rmr 21 Spain 2006 112p03 United Kingdom 2003

Ove 1 Spain (Canary Islands) 2007 10p04 United Kingdom 2004

GC 37 Spain (Canary Islands) 2007 58p04 United Kingdom 2004

GC 91 Spain (Canary Islands) 2007 64p04 United Kingdom 2004

D Spain (Canary Islands) 2002 80p04 United Kingdom 2004

P Spain (Canary Islands) 2002 57p05 United Kingdom 2005

U Spain (Canary Islands) 2002 35p06 United Kingdom 2006

Z Spain (Canary Islands) 2002 35p07 United Kingdom 2007

8B1 Spain (Canary Islands) 2002 61p07 United Kingdom 2007

4 Spain (Canary Islands) 2002 67p07 United Kingdom 2007

APLICACION DE LA TÉCNICA DE RAPD EN EL ESTUDIO DE CEPAS DE CAMPO DE MYCOPLASMA HYORHINIS

APLICACION DE LA TÉCNICA DE RAPD EN EL ESTUDIO DE CEPAS DE CAMPO DE MYCOPLASMA HYORHINIS

5´- GTCCACACGG- 3´OPB-10

(Artiushin et al. 1996)

- Se observó una alta variabilidad

- Las cepas se agruparon de acuerdo al origen del aislamiento

- No se observó influencia en el año del aislamiento

RESULTADOSRESULTADOS

DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS

DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS

LA ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DE DESNATURALIZACIÓN SE DESARROLLÓ EN PRINCIPIO PARA

DETECTAR MUTACIONES PUNTUALES EN LAS SECUENCIAS EN EL ADN

LA ELECTROFORESIS EN GEL CON GRADIENTE DE DESNATURALIZACIÓN SE DESARROLLÓ EN PRINCIPIO PARA

DETECTAR MUTACIONES PUNTUALES EN LAS SECUENCIAS EN EL ADN

MAS TARDE SE UTILIZÓ PARA ANALIZAR POBLACIONES MICROBIANAS BASADAS EN AMPLIFICACIONES DE FRAGMENTO S DEL

GEN ARNR 16S

MAS TARDE SE UTILIZÓ PARA ANALIZAR POBLACIONES MICROBIANAS BASADAS EN AMPLIFICACIONES DE FRAGMENTO S DEL

GEN ARNR 16S

DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS

DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS

LA APLICACIÓN DE ESTA TÉCNICA EN LA IDENTIFICACIÓN DE MICOPLASMAS FUE LLEVADA A CABO POR MCAULIFFE Y COLS . 2003,2005

LA APLICACIÓN DE ESTA TÉCNICA EN LA IDENTIFICACIÓN DE MICOPLASMAS FUE LLEVADA A CABO POR MCAULIFFE Y COLS . 2003,2005

DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS

DGGE DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS

GC-341 5´-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGCCCACGGGGCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3´

LA AMPLIFICACION DE LA REGION V3 DEL GEN ARNr 16S S E REALIZA CONEL PRIMER UNIVERSAL PARA BACTERIAS GC-341 Y EL PRIM ER

ESPECÍFICO PARA MOLLICUTES R543

LA AMPLIFICACION DE LA REGION V3 DEL GEN ARNr 16S S E REALIZA CONEL PRIMER UNIVERSAL PARA BACTERIAS GC-341 Y EL PRIM ER

ESPECÍFICO PARA MOLLICUTES R543

R543 5´-ACCTATGTATTACCGCG-3´

DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LAS ESPECIES BUSARD O RATONERO, ALIMOCHE CANARIO, BUITRE LEONADO, ALCARAV ÁN COMÚN

Y MYCOPLASMA GYPIS (POVEDA Y COLS. 1994 Y MYCOPLASM A NEOPHRONIS

DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LAS ESPECIES BUSARD O RATONERO, ALIMOCHE CANARIO, BUITRE LEONADO, ALCARAV ÁN COMÚN

Y MYCOPLASMA GYPIS (POVEDA Y COLS. 1994 Y MYCOPLASM A NEOPHRONIS

DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LA PALOMA TURQUÉ, P ALOMA RABICHE, TÓRTOLA TURCA Y GAVILÁN COMÚN

DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LA PALOMA TURQUÉ, P ALOMA RABICHE, TÓRTOLA TURCA Y GAVILÁN COMÚN

DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN EL AGUILA IMPERIAL, AGUILUCHO LAGUNERO, AGUILA REAL, AGUILA CULEBRERA ) + control Mycoplasma sp.

1449 (Höfle et al., 2002)

DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN EL AGUILA IMPERIAL, AGUILUCHO LAGUNERO, AGUILA REAL, AGUILA CULEBRERA ) + control Mycoplasma sp.

1449 (Höfle et al., 2002)

DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LA ESPECIE ALIMOCHE CANARIO (Neophron pernocterus majorensis) Y CONTROLES POSITIVOS

DGGE DE MICOPLASMAS AISLADOS EN LA ESPECIE ALIMOCHE CANARIO (Neophron pernocterus majorensis) Y CONTROLES POSITIVOS

Mycoplasma neophronis

AGRADECIMIENTOS

Alejandro Suarez Carlos Poveda

Dr. María del Mar Tavio Dr. Ana Ramírez

Unidad de Epidemiología y Medicina Preventiva, Veterinary Fac., ULPGC, Spain