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A potência (atividade) de um agente antimicrobiano é determinada comparando-se
a dose que inibe o crescimento do microrganismo sensível com a dose da
preparação padrão do agente que produz inibição similar.
INTRODUÇÃO
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MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA DOSAGEM DE ANTIBIÓTICOS
o Método da diluição em sérieo Macrodiluiçãoo Microdiluição
o Método turbidimétrico
o Método de difusão em ágar
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DILUIÇÃO EM SÉRIE - MACRODILUIÇÃO
Resposta: “tudo ou nada”
MIC
MIC
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DILUIÇÃO EM SÉRIE - MICRODILUIÇÃO
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PotênciaTesta-se concomitantemente padrão e amostra:
P = CIMA
CIMP
Para maior precisão, ensaia-se concentrações intermediárias entre o tubo com concentração inibitória mínima e o imediatamente anterior.
DILUIÇÃO EM SÉRIE
X 100
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DILUIÇÃO EM SÉRIE
Vantagenso Mais sensível a baixas concentrações que outros métodoso Fornece a CIM ativa da substância analisada
Desvantagenso A precisão está relacionada ao intervalo de concentração utilizadao Há interferência de soluções turvas ou coradaso Há necessidade do padrão e amostra serem estéreis
NÃO É MUITO UTILIZADO
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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
o Baseia-se na inibição do crescimento microbiano medido através da turbidez (transmitância ou absorvância) da suspensão de microrganismos adequados/sensíveis ao composto contido em um meio com o antibiótico.
o A resposta do microrganismo é função direta da concentração da substância.
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MÉTODO TURBIDIMÉTRICOPadronização do microrganismo para utilização no doseamento
35 ± 2 ºC20-24 h
Sol. fisiológica35 ± 2 ºC20-24 h
+
25% transmitância
530 nm
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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Triplicata
Progressão geométrica
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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO35 ± 2 ºC3 a 4 horas
Λ = 530 nm
0,5 mL de formaldeído 12%
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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
P
Potência
Calcula-se a potência através de métodos estatísticos
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MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Vantagens
Mais rápido
Desvantagens
o O pH pode influenciar o crescimento do microrganismoo Há interferência de soluções turvas ou coradas (padrão e amostra não
devem precipitar em contato com o meio)o Padrão e amostra devem ser solúveis em água ou em solventes miscíveis
em concentração tal que não interfira no crescimentoo Há necessidade do padrão e amostra serem estéreis (substâncias
termolábeis não podem ser ensaiadas por esta técnica)
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DIFUSÃO EM ÁGARConsiderações gerais
Relaciona o tamanho da zona de inibição com a dose da substância ensaiada.O método emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído em placas, em sistema de bicamada, através do qual a substância teste se difunde. É fundamentalmente um método físico, no qual o microrganismo é usado como revelador.
Mas está sujeito a muitos outros fatores físicos e químicos além da simples interação entre o fármaco e o microrganismo:
Natureza do meioCapacidade de difusãoTamanho da moléculaEstabilidade da amostra
É essencial que se trabalhe com réplicas, de forma a compensar os desvios, inerentes ao ensaio ou acidentais.
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DIFUSÃO EM ÁGARMétodo- Testes preliminares
A partir de parâmetros especificados em ensaios anteriores e referentes a determinação da potência de antibióticos descritos pela Farm. Bras. IV, USP e FDA, são realizados testes preliminares para padronizar as condições a serem utilizadas verificando parâmetros como:
MicrorganismoMeio de culturaSolução diluente
Concentração do inóculoConcentração do fármaco
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DIFUSÃO EM ÁGAREnsaio do tipo quantitativo:
P1 P2
A1 A2
P
A1
P1
P3 P2
A1
A2
A3
A5
A2 A4
A3
5 X 1
3 X 3
2 X 2
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DIFUSÃO EM ÁGAR
Cultura de manutenção
Repique deve ser feito a cada 7 dias
Conservação: refrigerador a 4 ºC
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DIFUSÃO EM ÁGARRepique do microrganismo para utilização no doseamento
35 ± 2 ºC20-24 h
Sol. fisiológica35 ± 2 ºC20-24 h
+
25% transmitância
580 nm
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DIFUSÃO EM ÁGARPreparo das placas
Ágar
Papel de filtro
21 mL
Ágar inoculado (47 ºC)
Camada base
4 mL
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DIFUSÃO EM ÁGAREnsaio
Utilizando placas de Petri, em capela de fluxo laminar, transfere-se 21,0 mL de meio para cada placa (camada base).
Após a solidificação desta camada, adiciona-se 4,0 mL de meio inoculado. Assim que esta camada se solidificar, distribuir os cilindros ou templates de aço inoxidável.
Com auxílio de pipetador automático transfere-se as alíquotas de padrões e amostras, 200 µL, para cada orifício.
P1
P3 P2
A1
A2
A3 As placas devem ser incubadas a 35ºC ± 2ºC e após 18-20 horas medem-se os diâmetros dos halos de inibição com auxílio de um paquímetro.
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DIFUSÃO EM ÁGARPreparo das placas
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DIFUSÃO EM ÁGAR
Preparo das soluções padrão e amostra10mg do padrão primário ou o
equivalente em relação ao peso médio
BV 100mL
[100µg/mL]
BV 10mL BV 10mL BV 10mL[32µg/mL][8µg/mL] [16µg/mL]
0,8mL 1,6mL 3,2mL
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DIFUSÃO EM ÁGAR
E. coli
S. luteus
Diâmetro do halo é função da concentração do antibiótico• Relação linear: diâmetro do halo
(mm) X log da concentração
B. subtilis
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DIFUSÃO EM ÁGAR
A maneira como o antibiótico é colocado em contato com o meio de cultura define as seguintes técnicas utilizadas para difusão em ágar:
técnica de cilindros em placastécnica de orifícios ou poçinhostécnica de disco ou papeltécnica de gotas ou depósito em superfície
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DIFUSÃO EM ÁGAR – CILINDROS EM PLACA
Cilindros de vidro, porcelana, aço inoxidável, alumínio etc
Diâmetro interno: 6,0 mm ± 0,1 mmDiâmetro externo: 8,0 mm ± 0,1 mmAltura: 10,0 mm ± 0,1 mm
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DIFUSÃO EM ÁGAR – TEMPLATE OU MOLDES DE AÇO
o São moldes de aço inoxidável com orifícios nos quais são colocados as soluções padrão e amostra
o É o mesmo princípio da técnica cilindros em placa, porém o manuseio é mais prático
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DIFUSÃO EM ÁGAR – ORIFÍCIOS OU POÇINHOS
o São perfurados pequenos poços no meio de cultura através de instrumento adequado de maneira que forme um cilindro embutido no meio sólido
o Os halos podem ser irregulares se o instrumento que servirá para a construção dos orifícios não for padronizado
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DIFUSÃO EM ÁGAR – DISCO DE PAPEL
o Discos de papel com 13 mm de diâmetroo 60 µLo Solução P e A com pipeta ou imersão por tempo pré definidoo Os discos podem ser colocados manualmente com auxílio de pinça estéril
sobre a superfície do meio ou através de equipamento apropriado sobre o meio inoculado
o Amostra com alta concentração de solvente orgânico
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DIFUSÃO EM ÁGAR – GOTAS OU DEPÓSITO EM SUPERFÍCIE
o Adiciona-se 2 a 3 µL da solução P e A na superfície do ágar com microsseringa
o Permite automaçãoo Pouco utilizadoo A superfície do gel deve estar seca
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DIFUSÃO EM ÁGAR
Vantagenso Em todas as técnicas deste método as amostras não precisam estar
estéreiso As técnicas de cilindro e de orifício mostram-se mais sensíveis à
pequenas concentrações que a de discoo Técnica de disco é mais simples, rápida e de melhor precisão, além de
permitir o ensaio com altas concentrações de solvente orgânicoDesvantagenso As técnicas de cilindro e de orifício são mais trabalhosas e necessitam de
cuidados extremos no manuseio das placaso Suspensões interferem nas técnicas de cilindro e de disco
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DIFUSÃO EM ÁGARFatores que interferem no ensaio:
Conteúdo de água presente no meioQualidade do ágarDensidade do inóculopH do meio e das soluções utilizadasTempo e temperatura de incubaçãoForma ativa da substânciaCoeficiente de difusão da substância e velocidade de crescimento do microrganismo
Halos pequenos: deixar a substância difundir antes de incubarHalos grandes: incubar as placas antes de colocar as amostras
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DIFUSÃO EM ÁGAR
Cálculo dos resultados
Pot = Antilog M x 100
M = F/b b = E/I I = log R
E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)]
F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)]
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P1 P2 P3 A1 A2 A3
I 14,0 15,5 16,4 13,2 15,2 17,0
II 13,0 15,3 16,6 13,3 15,0 16,3
III 13,0 15,2 16,4 13,2 15,0 16,0
IV 13,2 15,4 16,6 13,1 15,3 16,4
V 13,0 15,0 16,6 13,2 15,2 16,2
VI 13,2 15,4 16,2 13,2 15,1 16,6
Soma 79,4 91,8 98,8 79,2 90,8 98,5
Média 13,23 15,30 16,47 13,20 15,13 16,42
DIFUSÃO EM ÁGARCálculo dos resultados
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DIFUSÃO EM ÁGARCálculo dos resultados - exemplo
I = log R (R=2)
I = log 2
I = 0,301
E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)]
E = ¼[(32,88-26,43)]
E = 1,6125
F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)]
F = 1/3[(44,75-45,00)]
F = -0,0833
b = E/I
b = 1,6125/0,301
b = 5,3571
M = F/b
M = -0,0833/5,3571
M = -0,01556
Pot = Antilog M x 100
Pot = Antilog -0,01556 x 100
Pot = 96,49%
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CONCLUSÃO
o A necessidade de confirmação da eficácia terapêutica dos produtos medicamentosos constitui-se em aspecto de preocupação. E ainda há que se considerar o aspecto econômico, assim como o de falsificação com moléculas estruturalmente similares.
o Os bioensaios são extremamente necessários para que se tenha um controle de qualidade eficaz destes antimicrobianos de uso tão difundido.
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