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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE MATERIAIS
Raimundo Rômulo Martins Júnior
Eletroquímica Acoplada à Ressonância de Plásmons de Superfície
no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino
Recife 2007
Raimundo Rômulo Martins Júnior
Eletroquímica Acoplada à Ressonância de Plásmons de
Superfície no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino
Recife 2007
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciência de Materiais da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciência de Materiais, com ênfase em Físico-Química. Orientador: Prof. Flamarion Borges Diniz.
Martins Júnior, Raimundo Rômulo Eletroquímica acoplada à ressonância de plásmons de superfície no estudo de adsorção de proteína em filme fino / Raimundo Rômulo Martins Júnior. - Recife: O Autor, 2007. 156 folhas: il., fig., tab.. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Pernambuco. CCEN. Ciência de Materiais, 2007. Inclui bibliografia, apêndice. 1. Físico-química. 2. Plásmons de superfície 3. Adsorção de proteína 4. Impedância eletroquímica I. Título. 541.3 CDD (22.ed.) FQ2008-033
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho ao Dr. Fernando Monteiro de Paula, professor aposentado do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Ceará (UFC).
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Conselho Nacional de Pesquisa Brasileiro (CNPq) pela concessão da bolsa de Mestrado, aos grupos de Eletroquímica e Fotônica e à UFPE (Universidade Federal de Pernambuco) por disponibilizar o uso de suas instalações propiciando o desenvolvimento deste trabalho. Agradeço ao Prof. Flamarion Borges Diniz pela oportunidade acadêmica, confiança e desafios durante estes anos. Agradeço também pela disponibilidade e dedicação despendidas e principalmente pela amizade e por acreditar na minha capacidade. Prof. Cid Bartolomeu de Araújo pela co-orientação, por sua confiança em meu trabalho e pelas recepções sempre calorosas. Ao Dr. Fernando Monteiro de Paula, meu orientador durante a graduação, por me ensinar a ser um pesquisador. Dele aprendi que um professor não é só quem dá aulas, mas também quem sabe ser amigo e ter as palavras certas para incentivar o aluno a ampliar seus horizontes. À Sra. Ângela Farias, secretária do curso de pós-graduação em Ciência de Materiais, pelo estímulo recebido para prosseguir e realizar esse trabalho. Ao Físico Blênio José da Silva por seu apoio no uso do equipamento de evaporação de filmes finos. Ao Mestre Maxwell Aragão Marques pela ajuda inicial no processo de montagem do aparato experimental de SPR. Aos membros do grupo de Eletroquímica e Fotônica da UFPE. A todos aqueles que colaboraram direta ou indiretamente com este trabalho.
“Sem a convicção de uma harmonia íntima do Universo, não poderia haver ciência. Esta convicção é, e continuará a ser, a base de toda criação científica. Em toda extensão de nossos esforços, nas lutas dramáticas entre as velhas e as novas concepções, entrevemos a ânsia eterna de compreensão, a intuição inabalável da harmonia universal, que se robustece na própria multiplicidade dos obstáculos que se oferecem ao nosso entendimento”.
Albert Einstein
RESUMO
Biosensor é um dispositivo no qual o material de origem biológica, tais como enzima,
organela, tecido animal ou vegetal, microrganismo, antígeno ou anticorpo, ácidos nucléicos,
lectina, entre outros, é imobilizado junto a um transdutor adequado. Portanto, o estudo da
interface eletrodo/biomolécula/solução consiste em uma das principais etapas para o
desenvolvimento de biosensores. O objetivo deste trabalho foi estudar a interface
ouro/lectina utilizando as técnicas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS) e
Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR), como meios de transdução para a confecção
de um futuro biosensor. Contudo, as lectinas pertencem a um grupo de proteínas com
especificidade a carboidratos, característica que ampliou o foco da dissertação para a
interação entre a lectina Concanavalina A e os carboidratos glicogênio e galactose. Neste
trabalho foi montado um sistema de SPR acoplado ou não a um sistema eletroquímico, com
o intuito de monitorar e caracterizar a adsorção da proteína em diferentes potenciais e sua
interação com carboidratos. Com base nos resultados obtidos, a proteína na configuração
desativada adsorveu mais que a forma ativada na superfície do eletrodo de filme fino de
ouro, porém, foi a configuração ativada que melhor reconheceu o glicogênio e ambas não se
ligaram à galactose. Além disso, foi verificado que a proteína, em ambas as configurações,
não reconheceu a galactose e adsorveu mais facilmente em potenciais mais positivos, devido
a um maior contraste de cargas entre o eletrodo e a proteína.
Palavras-Chave: Concanavalina A; adsorção de proteína; impedância eletroquímica; Plásmons de superfície
ABSTRACT
Biosensor is a device in which the biological source material, such as enzyme, organelle,
animal or vegetable tissue, microorganism, antigen or antibody, nucleic acids, lectina,
among others is immobilized close to an adequate transducer. Therefore, the electrode/bio-
molecule/solution interface characterization consists in one of the main stages for biosensors
development. The goal of this work was to study the gold/lectina interface using the
Electrochemistry Impedance Spectroscopy (EIS) and Surface Plásmons Resonance (SPR)
techniques as transduction means for the confection of a future biosensor. Lectinas belong to
a proteins group with specificity to carbohydrates. This characteristic enlarged the
dissertation focus for the Concanavalina A protein and the glycogen carbohydrate
interaction. In this work it was set up a SPR's system coupled or not to an electrochemistry
system, with the intention of monitoring and characterizing the protein adsorption in
different potentials and its interaction with carbohydrates. With base in the obtained results,
the protein in the disabled configuration adsorbed more than the activated form, however,
the activated configuration better recognized the carbohydrate. Besides, it was verified that
the protein, both configurations, adsorbs more easily in more positive potentials, due to a
larger charges contrast between electrode and the protein.
Key Words: Concavalina A, protein adsorption, electrochemistry impedance, surface
Plásmons
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura tridimensional do monômero da Concanavalina A na conformação cis. O sítio 1 (S1) está representado pela pequena esfera cinza claro, e o sítio 2 (S2) pela esfera preta. A estrutura β é representada por setas. As posições dos resíduos Thr-11(treonina), Ser-96 (serina), e Glu-102 (glutamato) em cada um dos lados escuros das setas estão destacadas.................................................. 28
Figura 2: Esquema ilustrativo do funcionamento geral de um biosensor............................................... 35
Figura 3: Representação de uma onda senoidal de período tp e a amplitude Ip e sua relação entre a representação do correspondente vetor de comprimento Ip girando em sentido anti-horário a uma velocidade angular constante de ω = 2πƒ radianos/segundo ou uma freqüência de ƒ Hz. .................... 40
Figura 4: Ondas senoidais com diferentes amplitudes (Vp ou Ip) e com diferença de fase de 90 graus
ou 2π
radianos. A diferença de fase é chamada ângulo de fase (φ), que aparece pelo fato de um vetor se atrasar ou adiantar-se em relação ao outro, similar a um circuito de corrente alternada.......... 41
Figura 5: Circuito elétrico puramente resistivo...................................................................................... 44
Figura 6: Circuito elétrico puramente capacitivo................................................................................... 45
Figura 7: Circuito elétrico capacitivo em série com a resistência.......................................................... 48
Figura 8: Circuito elétrico com uma capacitância em paralelo com uma resistência ou RC em paralelo................................................................................................................................................... 49
Figura 9: Circuito elétrico tipo R(RC)................................................................................................... 51
Figura 10: Circuito de Randles............................................................................................................... 54
Figura 11: Analogia entre um capacitor de um circuito elétrico e a interface eletrodo/solução de um sistema eletroquímico com o modelo proposto por Helmholtz, onde uma das placas representa o eletrodo e a outra placa do capacitor, a solução..................................................................................... 55
Figura 12: Circuito de Randles e os respectivos gráficos Nyquist e Bode............................................ 56
Figura 13: Uma representação usando raios mostrando a reflexão e a refração de um feixe de luz incidente numa superfície plana de vidro. Estão assinalados os ângulos de incidência (θ1), de reflexão (θ1`), e de refração (θ2) ............................................................................................................ 61
Figura 14: Geometria utilizada na análise de reflexão e refração em uma interface simples................. 65
Figura 15: Ilustração das oscilações na densidade da carga de superfície, junto com as linhas do campo..................................................................................................................................................... 70
Figura 16: Plásmons de superfície não irradiados em um metal, porque a curva da dispersão para os plásmons se encontra abaixo “da linha tracejada”.................................................................................. 71
Figura 17: Configuração de Otto para excitação de SPR....................................................................... 72
Figura 18: Configuração de Kretschmann para excitação de plásmons superficiais.............................. 73
Figura 19: Eletrodo de referência de Ag/AgCl, KCl saturado................................................................ 79
Figura 20: Eletrodo auxiliar de platina (Pt)............................................................................................ 79
Figura 21: Desenho técnico da célula EIS-SPR...................................................................................... 81
Figura 22: Ilustração da montagem do conjunto prisma/ eletrodo de filme fino de ouro/célula EIS-SPR......................................................................................................................................................... 82
Figura 23: Foto do processo de acoplamento das partes integrantes da célula EIS-SPR. a) peça em aço para fixar o prisma na célula com o eletrodo; b) célula EIS-SPR em teflon; c) conjunto peça em aço, célula e prisma e d) eletrodo de filme fino de ouro......................................................................... 83
Figura 24: Ilustração do método de Evaporação térmica a baixa pressão.............................................. 85
Figura 25: Foto do equipamento Evaporador (Modelo 980-2462 da Varian) utilizado na confecção de filmes finos de ouro............................................................................................................................ 86
Figura 26: Esquema simplificado do sistema de evaporação utilizado na fabricação de eletrodos de filmes finos de ouro. 1) bomba difusora. 2) bomba mecânica. 3) válvula dianteira “foreline valve”. 4) válvula de vácuo-intermediário “rough valve”. 5) válvula de alto-vácuo “HiVac”. 6) entrada de ar ou nitrogênio. 7) campânula. 8) cadinho. 9) Shutter (auxilia no controle da espessura do filme depositado).............................................................................................................................................. 87
Figura 27: Diagrama esquemático do sistema de evacuação da evaporadora utilizada na fabricação de eletrodos de filmes finos de ouro....................................................................................................... 88
Figura 28: Fotos da segunda etapa do processo de confecção do eletrodo de trabalho de filme fino de ouro por evaporação a baixa pressão. a) posicionamento do material no cadinho da campânula. b) posicionamento das lâminas de vidro no porta-substrato, na parte superior da campânula; c - d) processo de evaporação do ouro; d) filmes finos de ouro após o processo de crescimento e acomodados em porta-filmes de PVC .................................................................................................... 90
Figura 29: Foto ilustrando o processo de construção do contato elétrico no eletrodo de filme fino de ouro. a-1) fio comum colado com auxílio de cola de prata na superfície do filme de ouro e a-2) em um substrato de vidro sem filme. b) fio comum colado com auxílio de cola de prata na superfície do filme de ouro, cuja junção foi revestida com fita de teflon................................................................... 91
Figura 30: Amostras do eletrodo de filme fino de ouro utilizada na caracterização da morfologia superficial por AFM.............................................................................................................................. 92
Figura 31: Célula EIS-SPR com os eletrodos fixados. Sistema utilizado na caracterização da adsorção da Con A e da reação Con A e glicogênio na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por EIS................................................................................................................................................... 95
Figura 32: Sistema óptico utilizado na caracterização da adsorção de biomoléculas na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por SPR................................................................................................. 96
Figura 33: Sistema óptico utilizado na caracterização da adsorção da Con A e da reação Con A e glicogênio na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por SPR. a) foto do suporte ajustável com a célula EIS-SPR fixada; b) foto do sistema óptico completo............................................................... 98
Figura 34: Espectro de absorção no UV-visível, numa região de 190 a 900 nm para a Concanavalina A ativada 200 µg/mL em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC, preparada após 24 horas (linha contínua) e 7 dias (linha pontilhada)..................................................................... 106
Figura 35: Solução de Concanavalina ativada 200 µg/mL (a) e glicogênio 60 µg/mL(b) em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC; (c) reação entre ambas as soluções............... 106
Figura 36: Resultados da absorção no visível a um comprimento de onda de 460 nm, um dia após a confecção () e 7 dias após a confecção da solução (+). Solução de Concanavalina ativada 200 µg/mL e glicogênio 60 µg/mL em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC........................................................................................................................................................ 107
Figura 37: Imagem topográfica em 3D obtida por AFM do filme fino de ouro (50 nm) depositado em substrato de vidro comum................................................................................................................ 108
Figura 38: Voltamograma cíclico do eletrodo de filme fino de ouro (50 nm) em solução de NaCl 0,15M, v = 50 mV s-1, 25° C................................................................................................................... 109
Figura 39: Voltamograma cíclico do eletrodo de filme fino de ouro (50 nm) em H2SO4 0,1M, v = 50 mV s-1, 25° C........................................................................................................................................... 110
Figura 40: Gráfico de Nyquist, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5...................................................................... 111
Figura 41: (a) Gráfico de Bode e de (b) admitância, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.................................. 112
Figura 42: Gráfico de admitância, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5..................................................................................................... 113
Figura 43: Gráfico de Bode, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5................................................................................................................... 114
Figura 44: Curvas teórica (linha contínua) e experimental (pontilhada) da intensidade de refletividade na interface Au/ar, com n(ar) = 1, ε (Au) = -10,333-j1,685 e d(Au) = 50nm e λ = 670 nm............................................................................................................................................................ 115
Figura 45: Função refletividade, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. d(Au) = 50nm e λ = 670 nm (laser). Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5............................................ 116
Figura 46: Circuito equivalente à interface eletrodo/proteína/solução................................................... 118
Figura 47: Ajuste utilizando o modelo apresentado na Figura 48, sendo () a interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl, () interface Au/ConA-ativada/NaCl e (____) são os ajustes, nas respectivas cores das interfaces. Experimento realizado em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C e pH 5,5. Gráfico registrado na região de 9 a 3000 Hz para uma melhor visualização................ 119
Figura 48: Gráficos de admitância, para a interface (a) Au/ConA-desativada/NaCl, (b) Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5............................................ 119
Figura 49: Gráficos de Bode, para a interface (a) Au/ConA-desativada/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5............................................ 120
Figura 50: Parâmetros (a) Rct e (b) Q, versus potencial (E) aplicado durante a etapa de adsorção, para as interfaces () Au/ConA-desativada/NaCl, () Au/ConA-ativada/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5........................................................................................................ 121
Figura 51: Gráfico de admitância, onde () é a interface Au/NaCl 0,15 M, () Au/ConA-desativada/NaCl e () Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.............................................................................................................................. 122
Figura 52: Parâmetros (a) Rct, (b) Q e (c) n, versus potencial de circuito aberto (ECA) aplicado durante a medida de impedância, para as interfaces () Au/ConA-desativada/NaCl, () Au/ConA-ativada/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5......................................................... 123
Figura 53: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para () interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl e () interface Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto, 25° C e pH 5,5.................................................................... 125
Figura 54: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para (a) interface Au/ConA-desativada/NaCl e (b) interface Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5....................................................................................................................... 127
Figura 55: Ângulo de plásmons em função da variação do potencial (∆E), para () interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl e () interface Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto, 25° C e pH 5,5................................................................... 128
Figura 56: Gráfico de admitância, onde () é a interface Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl 0,15 M, () Au/ConA-ativada/galactose/NaCl e () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.......................................................... 130
Figura 57: Gráfico de admitância, para a interface (a) Au/ConA-desativada/Glicogênio/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/Glicogênio/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5........................................................................................................................................................... 132
Figura 58: Parâmetro Rct (a) e Q (b) versus potencial (E) aplicado, para as interfaces () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5....................................................................................................................... 133
Figura 59: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para a interface () Au/ConA-desativada/galactose/NaCl, ()Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl, () Au/ConA-ativada/galactose/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas em ECA, a 25° C e pH 5,5......................................................................................................................................... 134
Figura 60: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para (a) interface Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E =
+0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.........................................................................................
135
Figura 61: Ângulo de plásmons em função da variação do potencial (∆E), para interface () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5..................................................................................................... 136
Figura 62: Cinética da reação lectina-carboidrato para uma solução com concentração final de 200mg/mL. Interfaces: () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5............................................................ 137
Figura 63: Estabilidade do sensor EIS-SPR. (a) variação do ângulo de plásmons em função do tempo e (b) ângulo relativo em função do tempo. Interfaces: () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5...................................................................................................................................................... 138
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Técnicas usadas na investigação da adsorção de proteína............................................. 34
Tabela 2: Associação de impedâncias em série e em paralelo...................................................... 53
Tabela 3: Gráficos Nyquist e Bode para circuitos R em série, C em série. RC em série, RC em paralelo e R em série com RC em paralelo............,...................................................................... 57
Tabela 4: Relação dos componentes utilizados na montagem experimental do sistema óptico............................................................................................................................................. 97
Tabela 5: Resultados experimentais obtidos com ajuste de curva teórica/experimental para a interface Au/ar.............................................................................................................................. 116
Tabela 6: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 45..................... 117
Tabela 7: Parâmetros extraídos da modelagem de circuitos equivalentes dos resultados da Espectroscopia de Impedância Eletroquímica............................................................................... 121
Tabela 8: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 53...................... 126
Tabela 9: Parâmetros extraídos da modelagem de circuitos equivalentes dos resultados da interação entrem a Concanavalina a adsorvida e açúcares por EIS............................................... 130
Tabela 10: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 59................................................................................................................................................... 134
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍGLAS
ConA Concanavalina A, lectina isolada de extratos da Canavalia ensiformis
EIS Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS)
SPR Ressonância de Plásmons de Superfície
Thr Treonina
Ser Serina
Glu Glutamato
ECA Potencial de circuito aberto
ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
pH Potencial hidrogeniônico
pI Ponto isoelétrico
D Debye
QCM Microbalança de Cristal de Quartzo
FTIR Infravermelho com Transformada de Fourier
CV Voltametria Cíclica
TIRF Fluorescência de Reflexão Interna Total
AFM Microscopia de Força Atômica
SP plásmons de superfície
ATR reflexão interna total atenuada
IgG Imunoglobuilina G
ET Eletrodo de trabalho
ER Eletrodo de referência
EA Eletrodo auxiliar
PVC poli cloreto de vinila
PAR Princenton Applied Research
F1 Fotodetector 1 ou de referência
F2 Fotodetector 2
LISTA DE SÍMBOLOS
φ Ângulo de fase
º
ω Freqüência angular, sendo igual a 2πf
Rad.s-1
εο Permissividade no vácuo
φ(t) Ângulo de fase em função do tempo
º
εp Permissividade dielétrica da proteína
Z Modulo da impedância
Ω
C Capacitância
µF
C(t) Capacitância em função do tempo
µF
Cdc Capacitância de dupla camada
µF
E Potencial de um eletrodo versos uma referência
V
Ep Potencial de pico
V
f Freqüência
Hz
I Corrente
A
Ip Corrente de pico
A
j 1−
n Natureza da dispersão na capacitância, sendo resistivo para n=0, capacitivo para n=1, Warburg para n=1/2
Q Constante que contem informações simultâneas da superfície e das espécies eletroativas
µF.cm-2
R Resistência elétrica
Ω
RΩ Resistência da solução
Ω
Rct Resistência transferência de elétrons
Ω
t Tempo
s
Y Admitância S
Yim Parte imaginária da admitância
S
Zre Parte real da admitância
S
ZCPE Impedância referente ao elemento de fase constante
F.cm-2.sn-1
Zim Parte imaginária da impedância no plano complexo
Ω
Zre Parte real da impedância no plano complexo
Ω
ZW Impedância de Warburg
Ω
W Constante que contem informações do processo de transporte das espécies eletroativas
Ω-1.s1/2
-∆Gi-sΦ Variação da energia de solvatação íon-solução KJmol-1
SUMÁRIO
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Lista de Abreviaturas e Símbolos
Resumo
Abstract
CAPÍTULO I - INTRODUÇÃO E OBJETIVOS 21
1.1. Introdução......................................................................................................................... 21
1.2. Objetivos específicos........................................................................................................ 22
CAPÍTULO II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 23
2.1. Lectinas............................................................................................................................ 23
2.1.1. Lectinas leguminosas............................................................................................ 25
2.1.1.1. Concanavalina A..................................................................................... 27
2.2. Adsorção de biomoléculas em superfícies sólidas........................................................... 29
2.3. Biosensores....................................................................................................................... 35
2.4. Técnicas empregadas na detecção de interações bioespecíficas....................................... 38
2.4.1. Espectroscopia Impedância Eletroquímica............................................................ 39
2.4.1.1. Conceitos fundamentais.......................................................................... 39
2.4.1.2. Circuito equivalente de um sistema eletroquímico................................. 54
2.4.1.3. Gráficos de impedância........................................................................... 56
2.4.2.Ressonância de Plásmons de Superfície................................................................. 58
2.4.2.1. Plásmons de Superfície........................................................................... 60
2.4.2.2. Conceitos fundamentais.......................................................................... 61
2.4.2.3. Condições de existência de oscilações de plásmons de superfície.......... 67
2.4.2.5. Modelos práticos de observação de plásmons de superfície................... 70
2.4.3.5.1. Configuração de Otto............................................................. 72
2.4.3.5.2. Configuração Kretschmann.................................................... 73
2.4.3. Eletroquímica acoplada a Ressonância de Plásmons de Superfície...................... 74
CAPÍTULO III – MATERIAIS E MÉTODOS 76
3.1. Reagentes e limpeza de vidrarias...................................................................................... 76
3.2. Proteína............................................................................................................................. 76
3.2.1. Teste de atividade biológica da Concanavalina A................................................ 77
3.3. Células e eletrodos........................................................................................................... 78
3.3.1. Eletrodos .............................................................................................................. 78
3.3.1.1. Eletrodo de referência............................................................................. 78
3.3.1.2. Eletrodo Auxiliar..................................................................................... 79
3.3.1.3. Eletrodo de trabalho................................................................................ 80
3.3.2. Célula eletrolítica EIS-SPR................................................................................... 80
3.3.2.1. Conjunto integrado prisma-célula ......................................................... 82
3.3.3. Eletrólito suporte e solvente.................................................................................. 83
3.4. Confecção de eletrodos de filme fino............................................................................... 83
3.5. Análise topográfica por Microscopia de Força Atômica................................................. 91
3.6. Voltametria cíclica........................................................................................................... 92
3.7. Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS)........................................................ 93
3.7.1. EIS aplicada na caracterização da adsorção de biomoléculas.............................. 93
3.8. Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR)................................................................ 96
3.8.1. Sistema óptico....................................................................................................... 96
3.8.2. SPR aplicada na caracterização da adsorção de biomoléculas.............................. 99
3.8.2.1. Evolução temporal da refletividade......................................................... 102
3.9. Eletroquímica acoplada a SPR......................................................................................... 103
3.9.1. Técnicas eletroquímicas acopladas a SPR na caracterização da adsorção de
biomoléculas.................................................................................................................................. 104
3.9.1.1. Estabilidade do Sistema EIS-SPR....................................................................... 104
CAPÍTULO IV – RESULTADOS E DISCUSSÃO 105
4.1. Caracterização da Concanavalina A................................................................................. 105
4.2. Caracterização topográfica do eletrodo de filme fino de ouro......................................... 107
4.3. Caracterização eletroquímica e SPR do eletrólito de suporte.......................................... 108
4.3.1. Técnicas eletroquímicas........................................................................................ 108
4.3.2. Resultados utilizando a técnica de SPR................................................................. 114
4.4. Caracterização da adsorção da Concanavalina A............................................................ 117
4.4.1. Resultados de impedâncias.................................................................................... 117
4.4.2. Resultados utilizando a técnica de SPR................................................................. 125
4.4.2.1. Análise em potencial de circuito aberto.................................................. 125
4.4.2.2. Análise em diferentes potenciais............................................................. 127
4.5. Caracterização da interação entre a Concanavalina A adsorvida e açúcares................... 129
4.5.1. Resultados de impedâncias.................................................................................... 129
4.5.1.1. Análise em potencial de circuito aberto.................................................. 129
4.5.1.2. Análise em diferentes potenciais............................................................. 131
4.5.2. Resultados utilizando a técnica de SPR................................................................. 133
4.5.2.1. Análise em potencial de circuito aberto................................................. 133
4.5.2.2. Análise em diferentes potenciais............................................................. 135
4.6. Evolução temporal da refletividade.................................................................................. 136
4.7. Estabilidade do sistema EIS-SPR..................................................................................... 138
CAPÍTULO V – CONCLUSÕES & PERSPECTIVAS 140
5.1. Conclusões........................................................................................................................ 140
5.2. Perspectivas futuras.......................................................................................................... 142
REFERÊNCIAS........................................................................................................................... 143
APÊNDICE A............................................................................................................................... 156
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo I
Raimundo Rômulo Martins Júnior 21
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
INTRODUÇÃO
Recentes avanços em bio-eletroquímica têm permitido o uso de um grande número
de procedimentos para a construção de dispositivos sensores, nos quais interações
eletrônicas entre a superfície do eletrodo e o sistema biológico representam um papel
fundamental. Biomoléculas, especialmente lectinas capazes de se ligarem especificamente a
carboidratos, são utilizadas na fabricação de dispositivos bio-eletrônicos, tais como
biosensores eletroquímicos e ópticos [1-7]. Como resultado, essas informações têm
proporcionado um desenvolvimento analítico bem como sua incorporação a outras áreas
científicas e técnicas, de forma a resultar cada vez mais na automação, miniaturização e
simplificação desses sistemas.
Há de se ressaltar a relevante importância das técnicas capazes de avaliar fenômenos
em superfícies e interfaces, em especial métodos como Espectroscopia de Impedância
Eletroquímica (EIS – Electrochemical Impedance Spectroscopy) e a Ressonância de
Plásmons de Superfície (SPR – Surface Plasmon Resonance). A espectroscopia de
impedância eletroquímica tem-se destacado pois possibilita a obtenção de grande número de
informações a partir de um único experimento, bem como pela obtenção de informações
complementares às obtidas por SPR. Assim sendo, o trabalho apresentado nesta dissertação
de mestrado discute os princípios básicos e aplicações individuais e combinadas das técnicas
EIS e SPR, destacando suas complementaridades com o propósito de demonstrar a
importância destes como transdutores em biosensores, através da investigação de processos
superficiais e interfaciais.
O presente trabalho está organizado em cinco capítulos e um apêndice, cuja
formatação está de acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT)*. No
Capítulo II foi feita uma revisão referente à proteína Concanavalina A, utilizada nesta
pesquisa, uma breve revisão sobre biosensores e uma descrição teórica das técnicas de
Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e Ressonância de Plásmons de Superfície, e os
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo I
Raimundo Rômulo Martins Júnior 22
seus princípios de utilização na caracterização de processos de adsorção de biomoléculas.
No Capítulo III é feita a descrição de todo o material utilizado e a montagem e
desenvolvimento do sistema de detecção eletroquímico/óptico (EIS-SPR) para aplicações
biológicas. No Capítulo IV são descritos os resultados experimentais obtidos, demonstrando
a grande aplicabilidade do sistema de detecção no desenvolvimento de biosensores.
Finalmente, no Capítulo V são apresentadas as conclusões e propostas para futuros
trabalhos.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Verificar o processo de adsorção da proteína Concanavalina A em eletrodos de
filmes fino de ouro e sua interação com carboidratos em diferentes potenciais aplicados,
utilizando as técnicas EIS e SPR.
* ABNT NBR 15287:2005; A Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Fórum Nacional de Normalização. As Normas Brasileiras, cujo conteúdo é de responsabilidade dos Comitês Brasileiros (ABNT/CB), dos Organismos de Normalização Setorial (ABNT/ONS) e das Comissões de Estudo Especiais Temporárias (ABNT/CEET), são elaboradas por Comissões de Estudo (CE), formadas por representantes dos setores envolvidos, delas fazendo parte: produtores, consumidores e neutros (universidades, laboratórios e outros).
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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23
CAPÍTULO II
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Lectinas
As lectinas foram descobertas em 1888 por Hermann Stilmark, ao observar que
extratos tóxicos de mamona (Ricinus communis) aglutinavam hemácias. O autor
também observou que o extrato, o qual denominou de ricina, reagiu diferentemente com
hemácias de diferentes animais, evidenciando assim a capacidade desses extratos de
expressar seletividade e/ou especificidade [8].
Em 1908, Landsteiner e colaboradores [9] verificaram que extratos de plantas
não tóxicas, como a lentilha (Lens culinaris), o feijão (Phaseolus vulgaris) e a ervilha
(Pisum sativum), também causavam aglutinação de hemácias.
Posteriormente, em 1936, verificou-se que a hemaglutinação produzida pela
Concanavalina A ou ConA, uma lectina isolada de extratos da Canavalia ensiforms
(feijão-de-porco), poderia ser bloqueada ou inibida pelo açúcar da cana (sacarose) [10].
Este estudo foi importante no estudo de lectinas, pois os autores sugeriram que a
aglutinação observada para a ConA seria devido a uma interação entre a lectina e os
carboidratos presentes na superfície das hemácias, identificando pela primeira vez a
principal característica das lectinas, ou seja, a afinidade por açúcares.
Até então se acreditava que lectinas não apresentavam especificidade para
eritrócitos humanos, e que o mesmo grau de aglutinação seria observado para os
diferentes grupos sanguíneos (sistema ABO). Entretanto, em 1948, Renkonen [11]
observou que a aglutinina da enguia japonesa, Asnguilla japonica, aglutinava
preferencialmente eritrócitos do grupo O e que extratos de sementes de Vicia cracca
(ervilhaca), mostraram seletividade para hemácias do grupo sanguíneo A.
Boyd e Reguera em 1949 [12] observaram especificidade para o grupo
sanguíneo A em lectinas do feijão lima, Phaseolus limensis e, mais tarde, Boyd e
Shapleigh [13] utilizaram pela primeira vez o termo lectina, para descrever a atividade
destas aglutininas.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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24
Goldstein [14] definiu as lectinas como proteínas de origem não imune, capazes
de se ligar reversivelmente a carboidratos e de aglutinar células ou precipitar
polissacarídeos e glicoconjugados.
Mais recentemente, as lectinas foram definidas como proteínas que possuem,
pelo menos, um domínio não catalítico que se liga de maneira reversível a mono ou
oligossacarídeos específicos [15].
Em 1997, Cummings [16], seguindo a mesma idéia empregada por Peumans e
Van Damme [15], inseriu um caráter restritivo ao mencionar que anticorpos ou
proteínas com atividade enzimática voltada a carboidratos não podem ser considerados
como lectinas.
Dessa forma, as lectinas (do latim lectus, particípio de legere, selecionar,
escolher) são proteínas ou glicoproteínas de origem não imunológica que podem
aglutinar hemácias, devido à sua propriedade de se ligar especifica e reversivelmente a
mono ou oligossacarídeos (carboidratos), mas são destituídas de atividade catalítica
[17].
As lectinas foram reunidas em grupos pelos quais apresentam afinidade [15, 18]:
•Merolectinas – proteínas que possuem um único domínio ligante a carboidrato
sendo, portanto, incapazes de aglutinar hemácias e precipitar glicoconjugados;
•Hololectinas – proteínas que possuem dois ou mais domínios ligantes a
carboidrato, podendo aglutinar hemácias e/ou precipitar glicogonjugados, e, atualmente,
representam um dos grupos mais estudados de lectinas;
•Quimerolectinas – Possuem pelo menos um domínio ligante a carboidrato, e
um outro domínio com uma atividade catalítica ou uma outra atividade biológica. Como
exemplos desse grupo podem ser citadas as quitinases e as proteínas inativadoras de
ribossomos (RIPs).
•Superlectinas - Proteínas de natureza quimérica que consistem de, no mínimo,
dois domínios ligantes a carboidratos, domínios esses com especificidade para açúcares
diferentes (não relacionados).
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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25
•Multilectinas - Lectinas possuindo dois ou mais domínios ligantes a
carboidratos, idênticos, mas que podem se ligar a açúcares diferentes. É o caso da
frutalina, lectina de sementes de Artocarpus altilis (fruta-pão), que ligam tanto D-
galactose como D-manose [19, 20].
Assim, de acordo com as diferentes especificidades por açúcares apresentadas
pelas lectinas, foi sugerido por Makela [21], em 1957, que elas fossem classificadas em
quatro grupos, conforme a configuração relativa dos átomos de carbono C3 e C4 no anel
piranosídico do açúcar responsável pela ligação especifica. Assim, ao grupo I pertencem
as lectinas especificas por L-fucose; ao grupo II aquelas que se ligam especificamente a
D-galactose e N-acetil-galactosamina; ao grupo III incluem-se as específicas por D-
glicose e D-manose e ao grupo IV aquelas capazes de se ligar a D-idose, D-gulose, L-
glicose e L-xilose.
Embora tenham sido inicialmente detectadas em plantas, as lectinas são
encontradas em muitos organismos, desde vírus e bactérias até animais vertebrados e
invertebrados [22]. Apesar de possuírem muitas propriedades em comum, representam
um grupo bastante diversificado de proteínas com respeito ao tamanho, composição e
estrutura. Neste sentido, apresenta-se na seção 2.1.1 um estudo referente às lectinas
provenientes das leguminosas, com atenção direcionada à Concanavalina A, lectina
utilizada nesta dissertação.
2.1.1 Lectinas Leguminosas
Os estudos envolvendo lectinas leguminosas têm se intensificado ao longo dos
últimos anos. A forte interação entre lectinas e açúcares pode ser uma poderosa
ferramentas para o reconhecimento e isolamento de glicoproteínas solúveis e de
membranas, tais como: proteínas do plasma, antígenos, anticorpos, hormônios ou
mesmo organelas e células como um todo [22]. Estudos in vitro da aplicação de lectinas
na estimulação de linfócitos têm possibilitado diagnosticar imunodeficiências
congênitas ou adquiridas, bem como monitorar o efeito de drogas imunoterapêuticas
[23]. A Concanavalina A é um exemplo de lectina que pode ser usada como padrão de
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
_________________________________________________________________________ Raimundo Rômulo Martins Júnior
26
referência imunológica na indução da proliferação de linfócitos no sangue periférico
humano.
A família das lectinas leguminosas compreende aproximadamente 650 gêneros
e 18.000 espécies, e é a maior família das lectinas. Esta família é uma das mais
importantes do ponto de vista econômico, oriundas de alimentos, principalmente de
sementes [24].
A nomenclatura das lectinas é originada da denominação científica das
espécies em que são purificadas, de acordo com o protocolo de purificação, pela
designação dos monossacarídeos aos quais têm especificidade ou ainda pela designação
do tecido do qual foram extraídas. Assim, a lectina da Vicia faba é conhecida como
favina, a Concanavalina A é uma lectina obtida da Canavalia ensiformis, e D-galactose-
N-acetil-D-galactosamina é uma lectina específica da Erythrina cristagalli [25].
A maioria das lectinas leguminosas já estudadas é de natureza glicoprotéica,
sendo que algumas delas podem apresentar, em sua constituição, até 50% de açúcar,
como é o caso da lectina da batata Solanum tuberosum [26] e da aglutinina isolada do
feijão de inhame Sphenostyles stenocarpa. Entretanto, a lectina Concanavalina A e a
lectina da ervilha são exemplos de aglutininas que não possuem carboidratos em suas
estruturas.
As lectinas da família das leguminosas possuem elevados teores de
aminoácidos básicos e hidroxilados [27]. De modo geral, as lectinas de plantas
apresentam grande heterogeneidade, sendo normalmente ricas em aminoácidos
hidrofóbicos e ácidos, perfazendo até mais de 30% do conteúdo de aminoácidos, e são
pobres em aminoácidos sulfurados [22].
Dentre as lectinas leguminosas, a Concanavalina A é a que possui a estrutura
tridimensional mais estudada e tem sua interação por moléculas de carboidratos bem
conhecida [27-32]. Tal interação justifica seu uso nas áreas tecnológicas e nas áreas de
pesquisas de adsorção. Portanto, a Concanavalina A será apresentada em maiores
detalhes na seção 2.1.1.1, a seguir.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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27
2.1.1.1 Concanavalina A
A proteína Concanavalina A é uma lectina isolada de extratos da Canavalia
ensiformis (feijão-de-porco) que foi estudada sistematicamente pela primeira vez por
Jones e Johns em 1916 [33]. Sumner em 1919 [34] conseguiu cristalizar duas frações,
Concanavalina A e B. A fração de A, ConA, é solúvel em água e apresenta uma
afinidade por glicose e manose [35].
A ConA foi a primeira lectina de leguminosa a ser seqüenciada e analisada
quanto à estrutura tridimensional. A proteína consiste de quatro subunidades idênticas,
ligadas por interações polares, ligações de hidrogênio e por interações eletrostáticas [36,
37]. A estrutura do monômero da Concanavalina A (Figura 1) é globular e com
dimensões de 42 Å X 40 Å x 39 Å. Ela é constituída apenas de duas folhas β
antiparalelas pregueadas, uma com seis fitas de forma quase plana e a outra com sete
fitas de forma côncava apresentando um total de 237 aminoácidos, pesando 27kDa. Os
sítios específicos aos carboidratos localizam-se em uma depressão no topo da superfície
de cada subunidade. Contudo, para estes sítios formarem ligações com carboidratos é
necessária a presença de íons metálicos divalentes (Ca 2+, Mg 2+, Mn 2+), que além de
favorecer as ligações com carboidratos, conferem um alto grau de estabilidade estrutural
na proteína, protegendo-a contra a inativação pelo calor e aumentando a resistência à
hidrólise enzimática [38]. Portanto, quando a Concanavalina A é dita ativada ou na
forma ativa, ela contém os íons em sua estrutura, apresentando uma melhor ordenação
estrutural, pois estes formam ligações com aminoácidos da proteína.
A ConA foi agrupada e classificada como uma proteína hololectina de classe III,
devido à sua especificidade a D-glicose e D-manose [26] e também pela sua resistência
a concentrações elevadas de ácidos [39]. Entre o pH 2,0 e 5,5, a ConA existe como
dímero de duas subunidades ligadas covalentemente, com um peso molecular de 55kDa
visto que, em valores de pH acima de 5,5, encontra-se na forma tetramérica com um
peso molecular de 110kDa e com dimensões de 60 Å X 70 Å x 70 Å, sendo esta forma a
que apresenta o sítio específico a carboidrato [40-45]. Os dímeros da estrutura
tetramérica são estabilizados por ligações de hidrogênio e por seis pontes em seu
interior.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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28
Figura 1: Estrutura tridimensional do monômero da Concanavalina A na conformação cis. O sítio 1 (S1) está representado pela pequena esfera cinza claro, e o sítio 2 (S2) pela esfera preta. A estrutura β é representada por setas. As posições dos resíduos Thr-11(treonina), Ser-96 (serina), e Glu-102 (glutamato) em cada um dos lados escuros das setas estão destacadas [36].
A interação entre os carboidratos que possuem sítios de ligação com a ConA
ocorre pela formação da ligação de hidrogênio, essencialmente em três resíduos de
aminoácidos lectínicos: um aspartato (Asp-208), uma asparagina (Asn-14) e uma
arginina (Arg-228). Tal ligação é também complementada por uma interação de Van der
Waals entre resíduos aromáticos da lectina (tirosinas, leucinas e cisteínas) e as porções
cíclicas dos açúcares. Todas essas interações são dependentes direta ou indiretamente da
presença de íons ativadores [46].
A Concanavalina A tem sido freqüentemente utilizada como ferramenta no
isolamento de glicoconjugados. Entretanto, poucos estudos foram conduzidos até o
momento, relacionando sua especificidade com relação a vários carboidratos,
possibilitando a sua utilização em pesquisas na área biológica e médica tais como:
investigação da superfície de células, caracterização de eritrócitos, como agentes
mitogênicos, caracterização de estádios de desenvolvimentos de microorganismos
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
_________________________________________________________________________ Raimundo Rômulo Martins Júnior
29
diversos, purificação de glicoproteínas, morfologia de neurônios e identificação de
conexões neurais no sistema nervoso central [28-32, 47-49].
Neste sentido, a compreensão do processo de adsorção de lectinas em
superfícies sólidas e de sua interação frente a carboidratos pode ser uma ferramenta
importante na área de desenvolvimento de biosensores bioquímicos; além disso, as
lectinas são excelentes modelos para examinar reações específicas que ocorrem entre
proteínas e outros tipos de moléculas, como por exemplo, as ligações antígeno-
anticorpo e substrato-enzima.
2.2 Adsorção de biomoléculas em superfícies sólidas
A compreensão da adsorção e dos mecanismos de ligação das proteínas em
superfícies é de grande importância na pesquisa de biomateriais e adesão celular [50]. É
interessante reconhecer que a maioria das proteínas são anfóteras e grandes,
característica que, intrinsecamente, permitem qualificá-las como moléculas ativas em
superfícies. Assim, o conhecimento das interações proteína/proteína, proteína/solução e
proteína/superfície é essencial para o controle do processo de adsorção da proteína,
como, por exemplo, o uso de biosensores no monitoramento do nível de glicose no
sangue de pacientes diabéticos in situ, onde a especificidade, sensibilidade e
durabilidade do sensor dependem da adsorção da proteína em sua superfície. Não
obstante, em alguns casos, é necessário minimizar ao máximo uma possível adsorção,
como em materiais utilizados em próteses, substratos para exames ELISA (enzyme-
linked immunosorbent assays), na fabricação de lentes de contato, sistemas para cultura
de células modeladas, engenharia de tecido, sistemas analíticos e em dispositivos usados
na liberação controlada de fármacos [51, 52].
As interações proteína/proteína em solução são controladas pela atração entre
seus resíduos de aminoácidos encontrados na superfície. Este tipo de interação favorece
a formação de oligômeros por meio de ligações não-covalentes, formando um complexo
protéico [53, 54]. Portanto, um aumento na concentração da proteína provoca o aumento
na quantidade de oligômeros na solução, mas a existência de sítios específicos na
proteína também pode influenciar a formação de oligômeros. Quando os oligômeros se
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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30
formam, ocorre a liberação de moléculas de água e contra-íons para o meio, logo, essas
interações entre proteínas são favorecidas pela entropia, uma vez que modificam a
ordenação global do sistema.
As principais interações proteína/solução podem ser resumidas em função da
solubilidade da proteína na solução, ou seja, dependem do número e do arranjo de
cargas na molécula, que, por sua vez, depende da composição em aminoácidos. Partes
não protéicas da molécula, como lipídeos, carboidratos, fosfatos, etc., também afetam a
solubilidade. Portanto, a solubilidade das proteínas em meio aquoso deve-se, em grande
parte, à distribuição das cargas elétricas ao longo da molécula. Nesse sentido, se a
interação proteína-proteína é grande e a interação proteína - água é pequena, a proteína
tenderá a ser insolúvel.
A solubilidade da proteína pode ser modificada por fatores como [51, 55]:
pH - O pH da solução pode controlar as repulsões laterais entre as proteínas
e/ou provocar a desnaturação das mesmas [54]. As proteínas tendem a formar
oligômeros em pH próximo ao ponto isoelétrico (pI). Por outro lado, nos casos em que o
pH está distante do pI, ocorre a desnaturação da proteína, logo:
pH ≈ pI : aumenta a solubilidade da proteína;
pH = pI: diminui a solubilidade da proteína tendendo à precipitação.
O ponto isoelétrico (pI) é o valor de pH onde uma molécula (aminoácido ou
proteína) apresenta carga elétrica líquida igual a zero, pois há equivalência entre as
cargas negativas e positivas dos grupamentos iônicos de um aminoácido ou de uma
proteína. A diferença entre os valores de pI de proteínas pode ser utilizada para separá-
las, submetendo-as à migração eletroforética em um gradiente de pH.
Força iônica - Altas concentrações de sais precipitam proteínas de suas
soluções. Este fenômeno é denominado de “salting out” ou precipitação por sais. Os
sais desidratam as proteínas, atraindo as moléculas de água do meio, de modo a ficar
menos água disponível para as moléculas protéicas. A solubilidade de uma proteína
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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31
depende do grau de hidratação de seus grupos iônicos (quanto menor for o número de
moléculas de água, menor será a solubilidade). Por outro lado, baixas concentrações de
sais podem aumentar a solubilidade de muitas proteínas. É o fenômeno conhecido como
“salting in”, ou solubilização por sais. Isso pode ser explicado através da interação entre
os íons salinos e as cargas iônicas das proteínas, aumentando assim o número efetivo de
cargas (a tendência de ionização dos grupos dissociáveis das proteínas) e a quantidade
de moléculas de água fixadas à superfície protéica.
Constante dielétrica do solvente - A miscibilidade de uma proteína em uma
determinada solução pode ser alterada por fatores como a constante dielétrica da
solução.
Constantes dielétricas elevadas da solução aumentam a solubilidade das
proteínas [55]. Mas, para que se possa definir e entender, o significado do valor da
constante dielétrica no processo de miscibilidade é necessário entender a Lei de
Coulomb, determinada pelo físico francês Charles Augustin de Coulomb (1736 - 1806),
que investigou a força que existe entre duas partículas com carga. Sua Lei diz que tal
força é diretamente proporcional ao produto das cargas, e inversamente proporcional ao
quadrado da distância que as separa, ou seja, F = q1 q2/r2, onde F é a força de atração
entre duas cargas q1 e q2 separadas por uma distância r. Contudo, a força depende ainda
do meio no qual as partículas estão imersas: tais forças são muito maiores se as
partículas estiverem no ar do que se elas estiverem na água. De fato, a força coulombica
é inversamente proporcional à constante dielétrica (ε) do meio, ou seja, F = q1 q2/εr2.
Com ε sendo o valor da constante dielétrica do meio. Se q1 e q2 forem de sinais
opostos, a força F é de atração, e será negativa. Caso q1 e q2 forem de mesmo sinal, F
será positiva, e será de repulsão. Portanto, quanto maior a ε do meio, menor a força de
atração entre as cargas, o que em outras palavras significa que, um líquido com alta
constante dielétrica é capaz de solvatar íons, eficazmente, mantendo-os dissociados em
solução.
Temperatura - A maioria das proteínas é solúvel a temperatura ambiente e a
solubilidade tende a aumentar à medida que se eleva a temperatura até 40, 50oC. Porém,
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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32
acima dessas temperaturas, a proteína começa a desnaturar provocando mudanças
irreversíveis em suas estruturas e conseqüentemente diminuindo a sua solubilidade [50].
As interações proteína/superfície ocorrem devido à hidrofobicidade e à carga
superficial tanto da proteína como da superfície. Haynes e Norde [50] pesquisaram os
vários tipos de interações que contribuem para a adsorção da proteína e verificaram que
a adsorção deste tipo de molécula é um resultado da afinidade de um grupo funcional do
adsorvente, que apresenta certa especificidade para interagir com a superfície do
substrato. A força motriz para a organização origina-se a partir de interações do tipo
Van der Waals, forças coulombianas e pelas forças ácido/base de Lewis, provenientes
das cadeias longas ligadas ao grupo funcional. A importância dessas interações durante
a adsorção consiste na conformação e orientação finais da proteína adsorvida.
Portanto, as propriedades da proteína, em particular aquelas relacionadas à
flexibilidade de sua conformação e o papel das moléculas de água presentes entre a
proteína e a interface, quando em meio aquoso, devem ser considerados no estudo de
sua adsorção. O principal fator que influencia o processo de adsorção de proteínas é a
energia de superfície, sendo que, superfícies hidrofóbicas adsorvem mais facilmente
proteínas quando comparadas com superfícies hidrofílicas [56, 57]. Susanne e
colaboradores [58] verificaram que a isoterma de adsorção estabelecida para a adsorção
de insulina humana em partículas de Teflon indicou que a insulina adsorveu com
elevada afinidade ao material hidrofóbico, pois a adsorção prossegue também em
condições de repulsão eletrostática, onde o processo é provavelmente governado pela
desidratação da superfície hidrofóbica do Teflon e também pelos aminoácidos
hidrofóbicos no exterior da insulina.
Proteínas adsorvidas em superfícies hidrofóbicas mudam significativamente sua
conformação, pois os aminoácidos não polares interagem preferencialmente com a
superfície. Isto causa interações superficiais fortes e adsorção irreversível. Já em
superfícies hidrofílicas ou carregadas, as interações eletrostáticas dominam as interações
interfaciais e a adsorção é mais reversível [51, 56-58]. Portanto, a tendência da proteína
reter sua conformação nativa depende fortemente da estabilidade estrutural da proteína
na solução. Um rearranjo estrutural é possível quando há disponibilidade de cadeias
laterais de aminoácidos que são eletrostaticamente complementares à superfície.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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33
O tamanho da molécula protéica também pode afetar a quantidade a ser
adsorvida, ou seja, proteínas consideradas pequenas (ácidos graxos, por exemplo)
podem adsorver em maior quantidade quando comparadas com proteínas mais
complexas, ou seja, maiores [59]. Para as interações eletrostáticas, quanto maior o
contraste entre a carga da superfície e da proteína, maior será a quantidade de proteína
na superfície, mas isto não se aplica a proteínas que apresentam uma grande perda
conformacional [60].
A caracterização da quantidade de proteínas adsorvidas requer elevada exatidão,
caso a quantidade adsorvida por área de unidade seja extremamente baixa. Na Tabela 1,
as técnicas experimentais são sumariadas, incluindo-se uma descrição breve de seus
princípios e a informação obtenível à exceção da quantidade de proteínas adsorvidas.
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34
Tabela 1: Técnicas usadas na investigação da adsorção de proteína.
Técnica Principio Informação obtida Referência
Microbalança de Cristal de
Quartzo (QCM)
Mudança da freqüência de oscilação de um sensor
de massa piezelétrico.
Curso da adsorção e desorção. 61-64
Infravermelho com
Transformada de Fourier (FTIR)
Mudança do espectro de adsorção infravermelho
para a proteína adsorvida
Conformação da proteína adsorvida sobre a superfície
65-67
Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
(EIS)
Envolve a aplicação de uma perturbação de
potencial ou de corrente no sistema sob investigação.
Quantidade e conformação da molécula adsorvida;
Irreversibilidade do adsorbato; Interações bioespecificas.
68-74
Voltametria Cíclica (CV)
O analito é submetido a uma diferença de
potencial entre eletrodos.
Detecção de intermediários
ou/e da existência de reações acopladas a processos
eletroquímicos.
74-77
Ressonância de Plásmons de
Superfície (SPR)
Reflexão atenuada da luz devido à excitação por uma onda evanescente.
Quantidade da molécula adsorvida; Formação de
monocamadas; Interações bioespecificas.
78-83
Radiotraço Diminuição na concentração do
radioisótopo, ligado a molécula na solução.
Quantidade de moléculas adsorvidas irreversivelmente.
84-87
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Reação enzimática com anticorpos.
Quantidade de moléculas adsorvidas irreversivelmente.
88-90
Elipsometria Muda o estado da luz polarizada acima da
reflexão
Quantidade e espessura do adsorbato sobre a superfície.
91-94
Fluorescência de Reflexão Interna
Total (TIRF)
Fluorescência da camada adsorvida é obtida a partir
da excitação por uma onda evanescente.
Quantidade de fluoróforos adsorvidos sobre a superfície.
95-99
Microscopia de Força Atômica
(AFM)
Interação atômica entre a superfície e a ponta de
prova.
Imagem em 3 dimensões da superfície.
100-104
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35
2.3 Biosensores
Um biosensor pode ser definido como um dispositivo compacto de análise que
incorpora um elemento de reconhecimento biológico (enzima, anticorpo, ácido nucléico,
tecido, células e suas organelas) ou biomimético (polímero de impressão molecular ou
PIM, peptídeos de ácidos nucléicos), associado a um sistema transdutor (ex., elétrico ou
óptico) que permite processar o sinal produzido pela interação entre o elemento de
reconhecimento e o analito.
O princípio de detecção do biosensor se baseia na interação específica entre o
composto ou proteína de interesse com o elemento de reconhecimento. Como resultado
dessa interação específica podem-se observar variações das propriedades físico-
químicas do sistema (pH, reações de transferência de elétrons, variação das
propriedades ópticas, de massa, de potencial, etc.) que são convertidas em um sinal
eletrônico mensurável pelo transdutor, em poucos minutos, como ilustrado na Figura 2
[105].
elemento de
reconhecimento
transdutor
amplificador
ANALITO
SINAL
MostradorMostrador
elemento de
reconhecimento
transdutor
amplificador
ANALITO
SINAL
elemento de
reconhecimento
transdutor
amplificador
ANALITO
SINAL
MostradorMostrador
Figura 2: Esquema ilustrativo do funcionamento geral de um biosensor.
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36
O termo biosensor aparece na literatura científica no final dos anos 70, embora o
conceito básico e a comercialização terem começado antes. O primeiro biosensor
construído foi um detector de glicose desenvolvido por Clark e Lyons em 1962 e
comercializado somente a partir de 1972 por Yellow Springs Instrument Company [105].
Este biosensor foi denominado como “enzyme electrode”, composto de um eletrodo
para oxigênio com a enzima glicose oxidase adsorvida em sua superfície. A enzima
catalisa a oxidação da D-glicose em D-Glucono-δ-lactona (ácido glutâmico) e a redução
do oxigênio em meio aquoso (ver Equação 2.1). O consumo do oxigênio ou a oxidação
anódica do peróxido de hidrogênio é detectado pelo eletrodo e pode ser utilizado na
quantificação da glicose. Nos anos seguintes foram desenvolvidos eletrodos enzimáticos
para substâncias de interesse médico, mediante a interação de enzimas apropriadas em
sensores eletroquímicos.
D-glicose + O2 + H2O → oxidaseglico. ácido glutâmico + H2O2 (2.1)
Em 1977, foi desenvolvido o primeiro dispositivo que utilizava
microorganismos vivos imobilizados na superfície de um elétrodo sensível à amônia.
Esse dispositivo era utilizado na detecção do aminoácido arginina e seus criadores o
denominaram “sensor bio-seletivo”, posteriormente denominado como “biosensor”,
termo que vem sendo utilizado até o momento para designar a união entre um material
biológico e um transdutor físico. Desde então, a área de biosensores tem evoluído muito
devido a sua potencial aplicabilidade [77, 83, 106-109].
As aplicações vão desde o emprego na agricultura [105] e no monitoramento e
controle ambientais [106], até diferentes segmentos industriais, especialmente nos
ramos alimentício e farmacêutico [96, 97, 107]. Porém, o desenvolvimento de
biosensores está centrado principalmente no campo de diagnóstico clínico (com grande
êxito para os biosensores de glicose). As vantagens de se trabalhar com biosensores
residem na simplicidade, rapidez e baixo custo da análise que os mesmos oferecem,
quando comparados com métodos químicos ou bioquímicos, como, por exemplo, as
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técnicas ELISA (Enzyme-Linked-Immunosobent Assay) e RIA (Radioimunoensaio), que
são muito utilizadas no estudo das reações imunológicas e têm sido as responsáveis pela
maioria dos diagnósticos fornecidos pelos laboratórios nesses últimos anos [107, 108].
Os sensores químicos se diferenciam dos biosensores pelo fato de não utilizarem
componentes biológicos na transdução do sinal físico emitido, apesar dos esforços no
desenvolvimento de compostos que mimetizem as principais características de bio-
componentes.
Os biosensores podem ser classificados em função de: tipo de interação que se
estabelece entre o elemento de reconhecimento e o analito; método utilizado para a
detecção da reação bioespecífica; natureza do elemento de reconhecimento; sistema de
transdução utilizado .
Vários sensores e, conseqüentemente, diferentes sistemas de transdução estão
disponíveis. A escolha de um transdutor está condicionada ao tipo de elemento de
reconhecimento selecionado, já que este determina que variações das propriedades
físico-químicas ocorreriam em função da interação.
Os principais sistemas de transdução utilizam métodos eletroquímicos
(amperométricos e potenciométricos têm sido os mais investigados) ou métodos ópticos
de detecção (empregam, por exemplo, a Ressonância de Plásmons de Superfície). Os
eletroquímicos, em geral, requerem a participação de sistemas eletroquimicamente
ativos (reações de transferência de elétrons ou mudança de potencial via transporte
iônico), o que muitas vezes limita sua aplicação. Porém, métodos baseados em medidas
de impedância, apesar de serem classificados como métodos eletroquímicos, não
requerem atividade eletroquímica, uma vez que os mesmos medem propriedades da
interface eletrodo/solução, independente de reações de transferência de elétrons ou da
presença de transporte iônico.
A propriedade de transdução dos biosensores impedanciométricos é a detecção
de capacitância da interface eletrodo/biomolécula/solução que depende de fatores
geométricos, em particular das dimensões das moléculas adsorvidas, e da constante
dielétrica das mesmas (juntamente com a solução). Essa detecção baseia-se no fato de
que a interface possui uma capacitância na ausência do analito e outra capacitância na
presença do analito, resultante da interação biomolécula/analito. Este sensor de
afinidade é adequado para a investigação de interações bioespecíficas do tipo
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38
antígeno/anticorpo, proteína/DNA, proteína/carboidrato, etc [108-110]. Como a
sensibilidade é fortemente dependente das modificações ocorridas na interface, o
mínimo de moléculas estranhas deve estar presente e, em princípio, agentes de
imobilização são dispensáveis, já que a maioria das proteínas adsorve fortemente sobre
superfícies metálicas [108-116].
Os biosensores ópticos correlacionam mudanças na concentração, na massa ou
no número de moléculas com as mudanças nas características da luz captadas por um
fotodetector. Os biosensores ópticos podem ser subdivididos em duas modalidades, de
acordo com a configuração óptica: óptico extrínseco e óptico intrínseco. No modo
óptico extrínseco, a onda incidente não é dirigida através da amostra, mas se propaga ao
longo de uma guia de onda e interage com a amostra na superfície do filme metálico,
dentro do campo evanescente, como por exemplo, a técnica de Ressonância de
Plásmons de Superfície. No modo óptico intrínseco, a luz incidente passa através da
amostra e interage diretamente com a amostra adsorvida.
Na seção 2.4 serão abordados detalhes teóricos das técnicas de transdução
eletroquímica e óptica, em particular, a Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e a
Ressonância de Plásmons de Superfície e a combinação de ambas. A grande
importância desses estudos é o desenvolvimento de novos suportes para materiais
biológicos, que podem ser utilizados para o desenvolvimento de biosensores.
2.4 Técnicas empregadas na detecção de interações bioespecíficas
Esta seção trata de alguns princípios teóricos das técnicas comumente usadas
para caracterizar a adsorção e/ou reações de macromoléculas biológicas em superfícies
metálicas. Na última seção (2.4.4), serão discutidos os princípios básicos e aplicações
individuais e combinadas das técnicas EIS e SPR, com o propósito de apresentar a
importância destas na investigação de processos superficiais e interfaciais, ressaltando
suas complementaridades.
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39
2.4.1 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
A técnica de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica é uma técnica de
caracterização elétrica, que fornece um aspecto completo e detalhado das características
elétricas da interface eletrodo/solução [72-74]. Portanto, é bastante sensível a
modificações que podem ocorrer na interface, como por exemplo, a adsorção de
proteínas, com a vantagem de não perturbar as propriedades da interface permitindo,
dessa forma, estudar o comportamento geral de um sistema quando um número grande
de processos intercorrelacionados ocorre em diferentes velocidades, mas que não se
alteram no tempo, pelo menos naquele necessário para que a medida seja realizada.
Atualmente, a EIS é utilizada em ampla gama de estudos, abrangendo desde o
transporte eletrônico em dispositivos semicondutores até o estudo de processos cinéticos
eletroquímicos das mais diferentes naturezas, ou seja, processos que ocorrem em células
fotovoltaicas [117-118], baterias de íons lítio [119], sistemas de corrosão e/ou processos
eletrocatalíticos [120-122].
Portanto, devido às características descritas acima, a EIS foi uma das técnicas
utilizadas no processo de caracterização da adsorção da Concanacavalina A e de suas
interações de afinidade com carboidratos, sobre eletrodos de filme fino de ouro.
2.4.1.1 Conceitos fundamentais
As correntes e tensões na maioria dos circuitos não são estacionárias, possuindo
uma variação com o tempo. A forma mais simples de variação de tensão (ou corrente)
com o tempo é a forma senoidal, a qual é representada convenientemente por um vetor
comprimento Vp (ou Ip), também chamado de valor máximo de tensão (ou corrente), que
gira em sentido anti-horário com velocidade angular constante ω. A correspondência
entre a representação do vetor e o gráfico da onda senoidal é mostrada na Figura 3.
É importante lembrar que uma onda senoidal pode ser medida em uma base
temporal ou angular. Como o tempo para concluir um ciclo completo depende da
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40
freqüência da onda, em geral é comum especificar os valores em uma onda senoidal em
termos de medida angular, expresso em graus ou em radianos [123].
A corrente instantânea (i) em um instante t é dada por:
,senpI
it =ω (2.2)
( ) ( ),2sensen ftItIi pp π=ω= (2.3)
onde, i é a corrente instantânea (Volt); Ip é a amplitude máxima da onda senoidal ou
corrente máxima (Volt); ω é a freqüência angular (rad. s-1) ou igual a 2πƒ, sendo ƒ a
freqüência com que a corrente alternada oscila (Hz).
π 2π
3π/2
π/2 tp
π/2
3π/2
2π
00
Vp π
ω
Vp
Vetor rotatório Onda senoidal
ω
Vp ωt v v
t
00
Figura 3: Representação de uma onda senoidal de período tp e a amplitude Ip e sua relação entre a representação do correspondente vetor de comprimento Ip girando em sentido anti-horário a uma velocidade angular constante de ω = 2πƒ radianos/segundo ou uma freqüência de ƒ Hz.
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41
Duas ondas senoidais que têm amplitudes diferentes também podem estar em
fases diferentes. Isto significa que os valores máximos de picos e zeros das ondas não
ocorrem necessariamente ao mesmo tempo. Na Figura 4, a onda de tensão ou de
corrente estão deslocadas ou defasadas uma em relação à outra. A onda de tensão está
deslocada para a direita em 90 graus ou 2π radianos. Assim, há uma defasagem de 90º
entre v e i, ou seja, as duas ondas estão fora de fase. A diferença de fase é chamada
ângulo de fase, que surge pelo fato de um vetor se adiantar ou se atrasar em relação ao
segundo por esta quantidade. Para este exemplo podemos escrever
( ) ( ),2sensen φπφω +=+= ftVtVv pp (2.4)
ou, alternativamente
( ) ( ),2sensen φπφω +=+= ftItIi pp (2.5)
onde, φ é o ângulo de fase, que corresponde à defasagem do potencial em relação à
corrente.
Figura 4: Ondas senoidais com diferentes amplitudes (Vp ou Ip) e com diferença de fase de 90 graus ou π/2 radianos. A diferença de fase é chamada ângulo de fase (φ), que aparece pelo fato de um vetor se atrasar ou adiantar em relação ao outro, similar a um circuito de corrente alternada.
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42
Nos circuitos de corrente alternada a relação entre o potencial e a corrente pode
ser definida por uma expressão semelhante à Lei de Ohm (v = Ri, onde R é a resistência
à passagem de corrente elétrica, quando existe uma diferença de potencial aplicada):
,i
vZ = (2.6)
onde Z é chamado de impedância.
Substituindo “v” e “i” pelas Equações (2.4) e (2.5), obtemos
( )( ) .
sen
sen
φ+ωω
=tI
tVZ
p
p (2.7)
Portanto, a razão entre o potencial e a corrente é a impedância Z [124-128].
Porém, se o potencial e a corrente estão em fases diferentes, então podemos dividir a
impedância numa parte resistiva, onde o potencial e a corrente estão em fase (φ = 0), e
numa parte capacitiva, onde a diferença de fase entre a corrente e o potencial é 90º (φ =
2π ).
Sendo a impedância uma grandeza vetorial ou complexa, as coordenadas
retangular ou polar podem ser utilizadas para indicar o vetor. No primeiro formato, o
vetor Z é um número complexo, onde a parte resistiva é representada pelo componente
real Zre (eixo X) e a parte capacitiva pelo componente imaginário (Zim) no eixo Y, que
é multiplicada por j, logo:
,imre jZZZ += (2.8)
onde, j é o número complexo, isto é, j2 = -1.
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43
A magnitude de Z é dada por
( ) .21
22imre ZZZ += (2.9)
Da Equação (2.9), é possível identificar três relações e construir o gráfico, logo, abaixo:
φcosZZ re = (2.10)
φsenZZ im = (2.11)
=⇔= −
re
im
re
im
Z
Z
Z
Zarctg 1tanφφ (2.12)
A recíproca da impedância Z é chamada de admitância e é denotada com o
símbolo Y:
,1
jBGZ
Y +== (2.13)
onde, B é a parte imaginária, chamada susceptância, e G a parte real ou condutância. A
unidade de admitância, condutância e susceptância é o Siemen (1 S = 1 Ω-1). Portanto, a
condutância é a parte real do inverso da impedância.
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44
- Impedância de circuitos elétricos resistivos e capacitivos:
A impedância de um circuito puramente resistivo (Figura 5), ou seja, contendo
somente um elemento resistivo (R), é dada pela Equação (2.7).
R
Figura 5: Circuito elétrico puramente resistivo
Porém, como o circuito é puramente resistivo, a corrente e a tensão estão em fase, logo,
φ = 0. Então,
p
p
I
VZ = (2.14)
Portanto, a impedância num resistor será real e é dada por:
RZ = (2.15)
logo,
ZZre = (2.16)
Entretanto, nem sempre a relação entre a corrente e a tensão, em circuitos de
corrente alternada, são determinadas pela resistência (R) do circuito. Elas podem
também sofrer influência de elementos que tendem a se opor a qualquer variação da
intensidade de corrente ou de tensão. Esta oposição reativa deve-se a elementos
capacitivos (C) e/ou indutivos (L) que podem alterar as relações entre tensão e corrente,
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45
quando presentes. Mas serão excluídos os casos em que os circuitos exibam elementos
indutivos.
Um capacitor é um elemento de circuito que armazena energia num campo
elétrico, acumulando um desequilíbrio interno de carga elétrica (Figura 6). É composto
por dois eletrodos ou placas condutoras, que armazenam cargas opostas, separadas por
um dielétrico (isolante). Devido ao fato de cada placa armazenar cargas iguais, porém
opostas, a carga total no dispositivo é sempre zero. Portanto, a capacitância (C) de um
capacitor de placas paralelas, constituído de dois eletrodos planos idênticos, contendo
um dielétrico, é dada por:
d
AC
r .. 0εε= (2.17)
Onde C é capacitância em Faraday, 0ε é a permissividade eletrostática do vácuo
(8,85 x 10-12 F-1 m-1), rε é a constante dielétrica ou permissividade relativa do isolante
utilizado entre as placas e A é a área de cada eletrodo ou placa, separados a uma
distância constante d.
C
Figura 6: Circuito elétrico puramente capacitivo
A quantidade de eletricidade q requerida para carregar um capacitor dependerá
essencialmente da área das placas, de sua forma, do espaçamento entre elas e da
constante dielétrica do material que as separa. Além disso, a carga q é diretamente
proporcional à voltagem aplicada. Isto é,
V
qCCVq =⇔= (2.18)
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46
Onde V é a diferença de potencial entre os condutores em volts, q é a quantidade
de carga em coulombs e C é a constante de proporcionalidade, chamada de capacitância
do capacitor. A unidade de capacitância é o farad. Um capacitor que tem a capacitância
de 1 farad armazena, então, um coulomb de carga por volt aplicado. Porém, são
utilizados valores de capacitâncias expressos em microfaraday (µF), nanofaraday (nF)
ou picofaraday (pF), já que o Faraday é considerado uma unidade de medida muito
grande para circuitos práticos.
Quando uma tensão é aplicada a um capacitor através de um circuito externo, a
corrente flui para uma das placas carregando-a, e flui da outra placa, descarrengando-a
(ou carregando inversamente). Este comportamento é observado quando diferenciamos
a Equação (2.18), obtendo,
.dt
dVC
dt
dq= (2.19)
Por definição, a corrente i é a taxa de variação da carga em relação ao tempo; isto é,
dq/dt = i. Então,
dt
dVCi = (2.20)
No caso de uma corrente contínua (DC) estabelece-se um equilíbrio
rapidamente, onde a carga das placas corresponde à tensão aplicada pela relação
CVq = , e nenhuma corrente poderá fluir pelo circuito. Logo, a corrente contínua não
poderá passar, o que não ocorre para correntes alternadas (AC), pois cada mudança de
tensão ocasiona carga ou descarga do capacitor, permitindo dessa forma que a corrente
flua. A quantidade de resistência de um capacitor sob regime AC é conhecida como
reatância capacitiva (XC), e a mesma varia conforme varia a freqüência do sinal AC.
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A reatância capacitiva é uma propriedade do capacitor que é análoga à
resistência de um resistor, sendo considerada um tipo de resistência pois tem unidade
em ohm, mas que difere das resistências comuns por variar com a freqüência do sinal
AC, ou seja, é igual à recíproca do produto de 2π pela freqüência em hertz e pela
capacitância em faradays, onde X < 0:
CfCXC ω
=π
=1
2
1 (2.21)
Pode-se reescrever a Equação (2.11) como sendo:
Cim XZ −= (2.22)
Enfim, a corrente em um circuito puramente capacitivo, ou seja, contendo
somente um elemento capacitivo (Figura 6), é dada pela substituição da tensão na
Equação (2.20) e com i na forma da Equação (2.4), obtém-se:
.2
sen
π+ωω= tCIi p (2.23)
Combinando-se a Equação (2.23) com a Equação (2.21), obtém-se:
.2
sen
π+ω= t
X
Ii
C
p (2.24)
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48
Mas, como o circuito não possui elemento resistivo, a impedância será:
Cp
p XI
VZ == (2.25)
ou, alternativamente
C
jZ
ω−= (2.26)
logo,
ZZim = (2.27)
e
2
π=φ (2.28)
Em um circuito elétrico em que se combina um resistor e um capacitor em série
(Figura 7), a impedância Z é dada pela Equação (2.29).
.C
jRZ
ω−= (2.29)
R C
Figura 7: Circuito elétrico capacitivo em série com a resistência.
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49
Logo, é possível identificar relações semelhantes às obtidas nas Equações (2.10)
à (2.12) e na Equação (2.29):
RZZre == φcos (2.30)
CsenZZ im ω
φ 1−== (2.31)
RCZ
Z
Z
Zarctg
re
im
re
im
ωφφ 1
tantan 11 −− =
=⇔= (2.32)
A impedância Z do circuito do tipo RC em paralelo (Figura 8) é dada pela
Equação (2.33).
C
R
C
Figura 8: Circuito elétrico com uma capacitância em paralelo com uma resistência ou RC em paralelo.
.11
CjRZ
ω+= (2.33)
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50
Multiplicando a Equação (2.29) pelo complexo conjugado ( )CRjω−1 , obtém-se:
( )( )( ) ,
11
1
CRjCRj
CRjRZ
ω−ω+ω−
= (2.34)
( )( ) .11 222
2222
RC
CRjRC
RZ
ω+ω
−
ω+= (2.35)
Na Equação (2.31), é possível identificar as relações:
( ) ,1 222 RC
RZre ω+
= (2.36)
( ) ( ) .11 222
2
222
2
RC
CRZ
RC
CRZ imim ω+
ω=−⇔
ω+ω−
= (2.37)
Combinando-se essas relações com a Equação (2.12) obtém-se o ângulo de fase
para este circuito:
,
1
1arctg
222
222
2
ω+
ω+ω−
=φ
RC
R
RC
CR
(2.38)
,arctg2
ω=φ
R
CR (2.39)
( ) .arctg CRω=φ (2.40)
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51
A impedância Z do circuito R(RC), mostrado na Figura 9, é dada pela Equação
(2.41).
R2
C R1
Figura 9: Circuito elétrico tipo R(RC).
( ) .1 2
21 CRj
RRZ
ω++= (2.41)
A Equação (2.41) pode ser reescrita como
ω+ω
−
ω++=
22
22
22
22
222
1 11 RC
CRj
RC
RRZ (2.42)
Na Equação (2.42), é possível identificar as relações:
ω++= 2
222
21 1 RC
RRZre (2.43)
ω+ω−
= 22
22
22
1 RC
CRZim (2.44)
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52
Combinando-se essas relações com a Equação (2.12) obtemos o ângulo de fase
desse circuito:
ω++
ω+ω
=φ
22
222
1
22
22
22
1
1arctg
RC
RR
RC
CR
(2.45)
+ω=φ
21
22
1
RRCR (2.46)
+ω
=φ21
22
RR
CR (2.47)
Verifica-se que para associações em série e em paralelo de impedâncias, valem
as mesmas relações para resistências, embora na forma complexa, ou seja:
Circuito em série: nZZZZZ ++++= L321
Circuito em paralelo: nZZZZZ
11111
321
++++= L
Portanto, a impedância (Z) equivalente de duas associadas em série é
simplesmente a soma das impedâncias. Assim, a admitância (Y), equivalente a duas
impedâncias associadas em paralelo é a soma das admitâncias (Tabela 2). A
demonstração destas afirmações é idêntica ao caso de resistores e corrente contínua.
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53
Tabela 2: Associação de impedâncias em série e em paralelo
Associação em série Associação em paralelo
21 ZZZ +=
2121
111YYY
ZZZ+=⇔+=
Pode-se, agora, melhor definir o método de impedância eletroquímica ou método
de impedância AC como sendo a aplicação de uma perturbação de potencial ou de
corrente no sistema de investigação, onde a perturbação do sistema é feita mediante a
aplicação de um potencial contínuo (potencial aplicado) sobre a qual é imposta uma
variação senoidal de potencial com pequena amplitude, tendo sido proposto por
Mansfeld em 1988 [127] o nome de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica.
Este método de aplicação do potencial possibilita a utilização de sinais muito
pequenos que não perturbam as propriedades do eletrodo, de forma a tornar possível a
investigação de fenômenos eletroquímicos próximos ao estado de equilíbrio e, numa
mesma medida, podem ser determinadas a resistência de polarização e a capacitância da
dupla camada. Além disso, é possível perturbar o sistema usando-se diferentes valores
de freqüência, pois a onda de potencial é senoidal, ou seja, a resposta da aplicação de
um pequeno sinal AC, feita em uma ampla faixa de freqüências e em vários potenciais,
possibilita diferenciar processos com tempos característicos distintos, que na maioria
das técnicas tradicionais eletroquímicas seriam vistos como contribuições simultâneas à
resposta total.
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54
2.4.1.2 Circuito equivalente de um sistema eletroquímico
O conceito de impedância, inicialmente introduzido para descrever a resposta de
sistemas compostos por resistências, capacitâncias e indutâncias, estendeu-se aos
sistemas eletroquímicos, uma vez que diversos processos podem contribuir para a
relação entre a corrente e o potencial do sistema. A representação de uma interface
polarizada simples, isto é, quando a interface se comporta até certo ponto analogamente
a uma combinação em paralelo de um resistor e um capacitor, pode ser feita por um
modelo de circuito equivalente.
A aplicação de circuitos equivalentes tem como fundamento as similaridades
entre o comportamento da célula eletroquímica e um circuito elétrico composto por
resistores, capacitores e indutores. O circuito equivalente típico que melhor apresenta
equivalência com um sistema eletroquímico (interface eletrodo/solução) é o circuito de
Randles, ilustrado na Figura 10.
Rct W
Cd
RΩ
Figura 10: Circuito de Randles.
Este circuito possui componentes que representam os processos que ocorrem nos
eletrodos e na solução, tais como: a dupla camada elétrica (Cd), que possui um
comportamento similar a de um capacitor de placas paralelas (modelo de Helmholtz
[125], ver Figura 11); a resistência ôhmica da solução (RΩ) ao transporte de íons entre
os eletrodos, uma vez que a corrente que passa na interface eletrodo/solução é
conduzida pelos íons em solução; e a impedância faradaica (Zf), a qual está subdividida
em uma resistência (Rct), que mede a resistência à transferência de carga na interface
eletrodo/solução, e a impedância de Warburg (W), que corresponde à resistência no
transporte de massa.
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55
Potenciostato/ Galvanostato
Capacitor
Equivalente El
Eletrodo Solução
Equivalente elétrico
Figura 11: Analogia entre um capacitor de um circuito elétrico e a interface eletrodo/solução de um sistema eletroquímico com o modelo proposto por Helmholtz, onde uma das placas representa o eletrodo e a outra placa do capacitor, a solução.
Portanto, uma vez escolhido o circuito elétrico que melhor descreve os processos
interfaciais, obtidos com auxílio da avaliação de curvas de Bode e diagramas de
Nyquist, também conhecido como representação de Argand ou Cole-Cole (ambas as
representações são as mais utilizadas, logo serão descritas com maiores detalhes na
seção 2.4.1.3 deste capítulo.), pode-se relacionar as propriedades físicas ou químicas
com elementos do circuito e extrair valores numéricos de todos os elementos, através de
simulações dos dados experimentais, geralmente utilizando-se o método de mínimos
quadrados não-lineares, com o auxílio de um programa de computador adequado.
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56
2.4.1.3 Gráficos de impedância
Os resultados dos parâmetros experimentais de impedância Z podem ser
analisados pelo gráfico Nyquist, no qual são observados os valores da parte imaginária
(Zim) em função dos valores da parte real (Zre) e pelo gráfico Bode, que mostra a
dependência direta do ângulo de fase com a freqüência. A vantagem desse gráfico é que
a dependência com a freqüência é visualizada claramente, além do espaçamento
logarítmico permitir uma observação melhor dos processos. A Figura 12 ilustra os
aspectos dos gráficos Nyquist e Bode para o circuito de Randles e a Tabela 3 exibe a
representação dos gráficos Nyquist e Bode para os circuitos teóricos resistivo e
capacitivos puros, RC seriado e em paralelo, circuito R(RC).
Figura 12: Circuito de Randles e os respectivos gráficos Nyquist e Bode.
No gráfico Nyquist, para o circuito de Randles, os componentes do circuito e as
diferentes regiões de resposta em freqüência representam o processo eletroquímico
global.
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57
Tabela 3: Gráficos Nyquist e Bode para circuitos R em série, C em série. RC em série, RC em paralelo e R em série com RC em paralelo.
Circuito Gráfico Nyquist Gráfico Bode
0,0 2,0x101 4,0x101 6,0x101 8,0x101 1,0x102
0,0
2,0x104
4,0x104
6,0x104
8,0x104
1,0x105
1,2x105
Grلfico Nyquist
Zim
(ohm
)
Zre (ohm)
***
0,0 2,0x101 4,0x101 6,0x101 8,0x101 1,0x102
0,0
2,0x104
4,0x104
6,0x104
8,0x104
1,0x105
1,2x105
Zim
(ohm
)
Zre (ohm)
***
9,0x101 9,5x101 1,0x102 1,1x102 1,1x102
0,0
2,0x104
4,0x104
6,0x104
8,0x104
1,0x105
1,2x105
Zim
(ohm
)
Zre (ohm)
10 100 1000 10000 100000
0
15
30
45
60
75
90
ângu
lo d
e fa
se (
grau
s)
frequência (Hz)
0,0 2,0x101 4,0x101 6,0x101 8,0x101 1,0x102
0
1x101
2x101
3x101
4x101
5x101
6x101
µ
Zim
(ohm
)
Zre (ohm)
10 100 1000 10000 100000
0
15
30
45
60
75
90
ângu
lo d
e fa
se (
grau
s)
frequência (Hz)
0,0 2,0x102 4,0x102 6,0x102 8,0x102 1,0x103 1,2x103
0,0
2,0x102
4,0x102
6,0x102
8,0x102
Zim
(ohm
)
Zre (ohm)
0,1 1 10 100 1000 10000 100000
0
15
30
45
60
75
90
ângu
lo d
e fa
se (
grau
s)
frequência (Hz)
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58
A região de alta freqüência está associada à resistência da solução eletrolítica,
RΩ. A região de freqüências intermediárias está associada com a transferência de carga
na interface, Rct. O efeito de relaxação correspondente é apresentado no plano complexo
com um semicírculo, cuja constante de tempo é dada pelo produto RctCd. Em baixas
freqüências, a impedância é caracterizada por processos de transporte de massa por
difusão. Duas regiões podem ser identificadas no plano de impedância complexa: uma
região linear com ângulo de fase π/4, correspondendo à difusão semi-infinita e
representada pela impedância de Warburg, W; e a segunda região linear ainda em baixas
freqüências com um ângulo de fase igual a π/2, associada a uma resposta puramente
capacitiva. Considerando uma reação de eletrodo onde a etapa mais lenta está
relacionada ao transporte iônico em direção a interface, é razoável considerar que a
cinética da reação é limitada por difusão.
O circuito de Randles descreve adequadamente os processos que ocorrem na
região de altas freqüências. Contudo, na região de baixa freqüência, para eletrodos
porosos (grande área superficial), a análise é complexa e a interpretação física da C não
pode ser descrita como uma capacitância pura, sendo representada por um elemento de
fase constante (CPE) [129].
2.4.2 Ressonância de Plásmons de Superfície
Sensores baseados em dispositivos ópticos do tipo multicamadas (vidro/filme
metálico/solução, por exemplo), geralmente, utilizam campo evanescente na
caracterização, isto é, componente do campo eletromagnético da luz que não se propaga
para longe das camadas, chegando apenas até a parte externa próxima à interface. Este
campo evanescente decai exponencialmente com o aumento da espessura das camadas.
As mudanças nas propriedades ópticas de algumas das camadas podem influenciar os
modos a serem guiados. Tais mudanças são observadas devido a variações da
intensidade, obtidas em medições ópticas apropriadas. Diversos fatores físicos podem
modificar as características de uma ou mais camadas, como por exemplo, a mudança do
índice de refração (n) ocasionado pela ligação de uma camada orgânica com a superfície
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59
do filme metálico [130]. Portanto, é possível guiar a luz, através de espelhos planos,
para a área interfacial de interesse e efetuar a análise óptica, com a vantagem do
tamanho reduzido do dispositivo e um baixo custo de implementação.
Quando se incide luz em uma superfície metálica, esta luz pode ser acoplada aos
plásmons de superfície (SP – oscilação coletiva longitudinal dos elétrons de condução
da camada metálica, restrita a uma fina camada na superfície; um modo ou quanta dessa
oscilação é chamado de plásmon), satisfazendo as condições de energia.
Os primeiros pesquisadores do efeito da excitação óptica de plásmons de
superfície, Otto [131] e Kretschmann [132], propuseram técnicas para investigá-lo,
considerando que o mesmo não poderia ser observado pela iluminação direta da
superfície. As propostas de ambos fazem uso de campos evanescentes, que são
acoplados aos modos de oscilação (plásmons), com auxílio de um prisma de vidro, cuja
função é criar ângulos de incidência superior ao da reflexão interna total, logo,
contornando a restrição de incidir luz diretamente sobre a superfície. Esta é a razão pela
qual muitos autores posteriores referem-se à técnica como reflexão interna total
atenuada ou ATR (attenuated total reflection). Neste método, faz-se incidir uma luz
sobre um filme fino metálico, utilizando-se um prisma de alto índice de refração como
acoplador óptico, e observa-se a luz, atenuada, refletida pelo filme. Embora a luz
incidente seja totalmente refletida internamente, uma componente desta radiação, onda
ou campo evanescente, penetra na interface do meio menos denso, até a distância de um
comprimento de onda (1λ). Atingidas as condições críticas de acoplamento de luz aos
modos ópticos do filme, parte da radiação se acopla aos elétrons livres oscilantes do
filme metálico, ocorrendo a Ressonância de Plásmons de Superfície.
Conseqüentemente, uma atenuação no sinal refletido é observada, podendo também ser
detectada.
A Ressonância de Plásmons de Superfície é um fenômeno que se tem mostrado
como uma das ferramentas mais eficientes na obtenção de constantes ópticas de filmes
finos metálicos ou dielétricos, bem como parâmetros termodinâmicos e cinéticos de
processos superficiais. O potencial da SPR pode ser utilizado em uma série de estudos,
envolvendo cinéticas de adsorção-desorção, interações proteína/ligante, receptor/ligante,
proteína/DNA, DNA/DNA, antígeno/anticorpo, etc [130, 133-139]. O método de SPR
acoplado a métodos eletroquímicos (como por exemplo, medidas de impedância),
mostra um grande potencial para o desenvolvimento de biosensores de afinidade,
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60
permitindo análises em tempo real de interações bio-específicas sem uso de marcadores
químicos. A quantificação da espécie em interesse pode ser realizada monitorando as
modificações estáveis nas superfícies dos eletrodos que podem exibir mudanças no
índice de refração, concomitantemente com reações redox ou modificações elétricas
[136, 140-142]. Algumas aplicações comerciais de emprego dessa oscilação na área de
biotecnologia já foram disponibilizadas no mercado por grandes empresas, como a
BIACORE [143, 144] e a Texas Instruments [145].
Nesta Dissertação de Mestrado foi desenvolvido um arranjo experimental
baseado no fenômeno de plásmons superficiais, tendo como objetivo melhorar
substancialmente a sensibilidade de detecção da SPR, com benefícios diretos para o
desenvolvimento de novas gerações e equipamentos de análise de reações biológicas e
também verificar a extensão, SPR associada a técnicas eletroquímicas na caracterização
da adsorção induzida (ou não) eletroquimicamente de proteínas. Portanto, na próxima
seção serão discutidos os princípios físicos associados às oscilações de plásmons de
superfície em interfaces e as técnicas experimentais de observação.
2.4.2.1 Plásmons de Superfície
Plásmons de superfície são oscilações localizadas da densidade eletrônica em
metais. Os elétrons da banda de condução do metal são cargas móveis negativas,
formando um gás denso de elétrons, imersos entre os núcleos fixos dos átomos do
metal. Como as cargas positivas são bem mais pesadas que os elétrons do gás, logo, são
consideradas fixas. O bombardeio desse gás por um laser, por exemplo, pode causar
uma mudança transiente na sua distribuição, levando a que certas regiões se tornem
ligeiramente mais densas que outras. A repulsão coulombiana nas regiões de alta
densidade leva os elétrons a se afastarem uns dos outros, diminuindo, assim, a
densidade. A dinâmica deste sistema é similar à de um oscilador harmônico. A força
restauradora, nesse caso as interações coulombianas, que tendem a levar o sistema de
volta ao equilíbrio dá origem às oscilações, neste caso, os plásmons, com freqüências
bem definidas [147].
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61
Os plásmons também podem ser visualizados como ondas eletromagnéticas
propagando-se através do sólido (descrição clássica). Uma onda gerada pelos plásmons
superficiais podem se propagar para fora da superfície. A amplitude dessa onda,
também chamada de onda evanescente, diminui exponencialmente com o aumento da
distância em relação à superfície. Utilizando a descrição clássica, a maioria de suas
propriedades pode ser derivada diretamente das equações de Maxwell.
2.4.2.2 Conceitos fundamentais
A Figura 13 exemplifica um feixe de luz interceptado por uma superfície plana
de vidro onde, parte da luz incidente é refletida, isto é, propaga-se, em feixe, para fora
da superfície. A outra parte do feixe é refratada, isto é, propaga-se através da superfície
para dentro do vidro. A luz sempre muda a direção de sua trajetória quando atravessa
uma interface, a menos que o feixe incidente seja perpendicular ao vidro, ou que,
ambos, tenham o mesmo índice de refração.
aarr
vviiddrroo
Figura 13: Uma representação usando raios que mostram a reflexão e a refração de um feixe de luz incidente numa superfície plana de vidro. Estão assinalados os ângulos de incidência (θ1), de reflexão (θ1`), e de refração (θ2).
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62
Portanto, observa-se experimentalmente que a reflexão e a refração obedecem às
seguintes leis:
Lei da Reflexão – O raio refletido está contido no plano de incidência, e
1´1 θ=θ (2.48)
Lei da Refração – O raio refratado está contido no plano de incidência, e
2211 sennsenn θ=θ (2.49)
onde n1 é uma constante adimensional chamada índice de refração do meio 1, e n2 é o
índice de refração do meio 2.
A Equação (2.49) é chamada de lei de Snell-Descartes. O índice de refração de
uma substância é igual a c/v, onde c é a velocidade da luz no vácuo e v é a sua
velocidade na substância considerada. No vácuo, por definição, n é exatamente igual a 1
e, no ar, muito próximo de 1.
Uma onda eletromagnética em um meio pode ser descrita por um vetor campo
elétrico E e um vetor campo magnético B . As equações mais fundamentais que
descrevem esses campos são as equações de Maxwell, fornecendo uma descrição das
intensidades com que os fenômenos em questão ocorrem, bem como importantes
conseqüências, para eles, do caráter vetorial das ondas eletromagnéticas, ou seja, da
polarização da luz. No tratamento clássico da refração, por exemplo, determina-se a
direção do raio refratado (pela lei de Snell), mas não se dá qualquer informação sobre a
intensidade da luz refratada em relação à intensidade da luz incidente.
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63
As equações de Maxwell em um meio simples (homogêneo, linear, isotrópico e
estacionário), no sistema CGS de unidade são dadas por:
,0=•∇ E (2.50)
,0=•∇ H (2.51)
,01
=∂
∂+×∇
t
H
cE (2.52)
,0=∂∂µε
−×∇t
E
cH (2.53)
onde o meio é caracterizado pela permeabilidade magnética µ, e sua função dielétrica
ε(ω). E é o campo elétrico e H é o vetor indução magnética. Das equações de
Maxwell se obtêm equações de onda. Tomando o rot da Equação (2.52), tem-se:
Bc
E .1
.. ∇−=∇∇ (2.54)
t
H
c ∂∂µ
−= (2.55)
∂∂
+π
∂∂µ
−=t
D
cj
ctc
14 (2.56)
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64
Supondo que ε e µ sejam constantes, e que 0=j . Então, como ,0. =∇ E
tem-se
2
2
2
2
t
D
cE
∂
∂µ=∇ (2.57)
ou, usando ,ED ε=
02
2
2
2=
∂
∂µε=∇
t
D
cD (2.58)
Verifica-se na Equação (2.58) que a onda possui uma velocidade de propagação
dada por:
εµ=
cv (2.59)
Um cálculo análogo para o campo magnético obtém-se,
01
2
2
2
2=
∂
∂−∇
t
HH
v (2.60)
Nos meios transparentes e não magnéticos, tem-se, em geral, 1≈µ . Portanto,
será omitido µ , a seguir.
As soluções das equações para E e H são:
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65
−ε
ωε
=t
e
rk
ieea
E
.
(2.61)
−ε
ω=
te
rk
iehaH
.
(2.62)
onde a é uma constante (amplitude da onda), e e h são os vetores (unitários) de
polarização dos campos elétrico e magnético, respectivamente. k é um vetor unitário na
direção e sentido da propagação da onda. Logo, k , e e h , nessa ordem, formam um
triedro ortogonal dextrógiro. E e H estão exemplificados na Figura 14.
ε1
ε2
x meio 1
meio 2
→
Ht
z
→
Hr →
ki
→
kr
→
Hi
→
Ei →
Er
→
Et
→
kt
θθ1´
θ2
Figura 14: Geometria utilizada na análise de reflexão e refração em uma interface simples.
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66
As soluções apresentadas nas Equações (2.61) e (2.62) são ondas planas e
monocromáticas que se propagam na matéria. Os campos incidentes são:
−εω
ε=
te
rki
i eea
E
.
1
11
11
(2.63)
−ε
ωε
ω=
te
rk
ie
ii ehaH
.11
1
11 (2.64)
onde a1 é a amplitude da onda incidente, 1e e 1h são os vetores unitários de
polarização dos campos elétrico e magnético incidentes, respectivamente. 1k é um
vetor unitário na direção e sentido da propagação da onda incidente.
Os campos refletidos podem ser escritos como:
−εω
ε=
te
rki
r eea
E
.´
1
11
11´´
(2.65)
−ε
ωε
ω=
te
rk
ie
ir ehaH
.11
1
11 ´´ (2.66)
onde a´1 é a amplitude da onda refletida, 1e e 1h são os vetores unitários de
polarização dos campos elétrico e magnético refletidos, respectivamente. 1k é um
vetor unitário na direção e sentido da propagação da onda incidente.
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67
Finalmente, os campos refratados:
−εω
ε=
te
rki
t eea
E
.
2
22
22
(2.67)
−
ε
ω=
trke
it ehaH
22
22 (2.68)
onde a2 é a amplitude da onda refratada, 2e e 2h são os vetores unitários de
polarização dos campos elétrico e magnético refratados, respectivamente. 2k é um
vetor unitário na direção e sentido da propagação da onda refratada.
A conexão entre as soluções para o meio 1 e 2 é feita através das fórmulas
conhecidas do eletromagnetismo, que devem ser satisfeitas nos pontos da superfície de
separação dos meios. Nos meios 1 e 2, os campos elétricos e magnéticos totais são:
ri EEE +=1 (2.69)
tEE =2 (2.70)
21 HH = (2.71)
2.4.2.3. Condições de existência de oscilações de plásmons de superfície
Uma vez que os plásmons de superfície ocorrem na direção perpendicular à
interface, o acoplamento de energia eletromagnética com essas oscilações requer que o
campo elétrico de excitação tenha uma componente normal à interface. Para demonstrar
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68
a existência dos plásmons de superfície, bem como determinar as suas características,
pode-se considerar a interface entre dois meios semi-infinitos e uma onda incidente na
interface como mostrado na Figura 14. Admite-se que a onda incidente esteja polarizada
no plano de incidência. Conforme indicado na Figura 14, há interesse em determinar
sob que condições é possível obter apenas uma onda de saída do meio 2.
Das Equações (2.69) à (2.71) pode-se extrair uma simples relação entre a
permissividade relativa e a componente normal do vetor de onda, admitindo-se z = 0:
2
2
1
12112 ..
kkkk
ε=
ε⇔ε=ε (2.72)
Tem-se que o vetor de onda associado à onda plana no meio 1 ou 2 e com as
componentes nas direções x e z, pode ser expresso na forma [148]:
,2
121
2
=+c
kk zx
ωε (2.73a)
e, para o meio 2:
2
222
2
ωε=+
ckk zx (2.73b)
onde ( )2cω é o número de onda no vácuo na freqüência angular .ω
Substituindo a Equação (2.72) em (2.73) tem-se,
21
21ε+ε
εε= kkx (2.74)
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69
A Equação (2.74) é a equação de dispersão das ondas de superfície, ou seja, do
plásmon. Pode-se observar que o vetor de onda de um SP depende das constantes
dielétricas dos dois meios. Esta propriedade leva ao uso dos plásmons de superfície em
sensores. A utilização da Equação (2.74) nas equações (2.73a) e (2.73b) permite obter
valores específicos para a componente z do vetor de onda em cada meio, ou seja,
21
21
1 ε+ε
ε= kk (2.75)
21
22
2 ε+ε
ε= kk (2.76)
Para um metal, ε é menor que zero nas freqüências dadas na Equação (2.74) e,
portanto, k é imaginário puro para xk real. Como xk é real a onda se propaga na
direção x. O fato de k1 e k2 serem imaginários puros leva à conclusão de que a
intensidade da onda cresce ou decresce exponencialmente na medida em que se aumenta
a distância da interface z = 0. A situação em que a intensidade da onda cresce
infinitamente levaria à condição de energia infinita, o que é fisicamente impossível.
Portanto, a escolha fisicamente realizável é aquela na qual a intensidade de campo decai
exponencialmente em ambos os sentidos da direção z [149].
Portanto, nas Equações (2.75) e (2.76), para assegurar a propagação da onda
eletromagnética é necessário impor que o vetor xk seja real, a 2ε negativa, tal que
12 ε⟩ε ou 02 ⟨ε . Onde, ir i 222 ε+ε=ε . Esta é a uma condição necessária para
a existência de um modo de superfície, ou seja, temos que ter um meio com ε positivo
(dielétrico), e um meio com ε negativo (metal ou semicondutor), conforme ilustrado na
Figura 15.
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70
Paralelamente, a Equação (2.74) pode ser assim re-escrita:
( ) 21
221
221
ε+ε+εε+εε
=ir
irx i
ikk (2.77)
- + - + - + - + - + - Metal
εar
ε2
Figura 15: Ilustração das oscilações na densidade da carga de superfície, junto com as linhas do campo.
2.4.2.5. Modelos práticos de observação de plásmons de superfície
Como foi visto anteriormente, são necessárias algumas condições para excitar
plásmons de superfície. Primeiramente é necessário trabalhar em uma faixa de
comprimentos de onda em que o meio metálico tenha permissividade negativa, e que a
soma das permissividades dos dois meios seja negativa, ou equivalentemente e que o
módulo da permissividade do dielétrico seja menor que aquela do metal. Obedecendo a
essas condições, os campos, em ambos os lados da interface, tornam-se evanescentes.
Porém, não é possível acoplar luz a um modo de superfície incidindo luz diretamente
sobre a interface entre os dois meios, pois a componente x do vetor de onda do plásmon
de superfície satisfaz a condição:
(2.78)
,21
21 kkkk SPx ⟩ε+ε
εε==
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71
Uma vez que o número de onda do campo incidente pela interface externa da
estrutura é sempre inferior ao parâmetro kSP, ou seja, kx será sempre maior que o valor
máximo do vetor de onda k no meio iin ε= de uma onda incidindo diretamente na
interface. Pode-se observar na Figura 16 que a linha de luz, que representa a relação de
dispersão linear da onda eletromagnética, incide no meio positivo (dielétrico) e não
corta a curva de dispersão do plásmon. Logo, estes modos de superfície são não
radiativos, ou seja, eles não podem ser irradiados como fótons e a luz incidindo
diretamente na interface não pode ser acoplada ao plásmon de superfície.
Conseqüentemente, deve-se utilizar algum tipo de acoplador óptico que nos possibilite
excitar os plásmons de superfície.
De acordo com a Figura 16, a linha de luz deve ser mais inclinada de forma a
cruzar a curva de dispersão do plásmon. Faz-se então necessário aumentar o valor do
vetor de onda da luz incidente de um valor ∆kx. Este aumento é possível utilizando
geometrias com prismas como acopladores ópticos. Os primeiros investigadores do
efeito de SPR, Otto [131] e Kretschmann [132], propuseram técnicas que utilizavam
prismas.
Ene
rgia
fóton
Plásmons de superfície (SP)
λ
Ene
rgia
fóton
Plásmons de superfície (SP)
λ
Figura 16: Plásmons de superfície em um metal. Curva da dispersão dos plásmons se encontra abaixo da linha tracejada.
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72
2.4.3.5.1. Configuração de Otto
A configuração proposta por Otto [131] para excitação de plásmons de
superfície está ilustrada na Figura 17. Como é possível observar na figura, Otto utilizou
uma fina camada de ar com espessura típica de um comprimento de onda entre o prisma
de vidro e o filme fino metálico. Nesta configuração, é necessário que o meio
transparente entre o filme e o prisma tenha índice de refração menor que o do prisma,
permitindo que a onda incidente, na face superior do prisma, possa sofrer reflexão
interna total, o que produz um campo evanescente através do qual a radiação se acopla.
Prisma
Filme metálico Meio dielétrico
Meio externo
Figura 17: Configuração de Otto para excitação de SPR.
Portanto, ajustando o ângulo de incidência em um valor acima do ângulo critico
(kx = n1k sen θ) obtém-se acoplamento máximo entre o feixe incidente e o plásmon de
superfície na condição de ressonância kx = kSP , podendo ser observada uma forte
absorção de luz pela oscilação.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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73
2.4.3.5.2. Configuração de Kretschmann
A configuração de Kretschmann [132], Figura 18, também se baseia no
fenômeno de reflexão interna total. A diferença entre esta configuração e a proposta por
Otto é que o filme metálico está em contato direto com a superfície do prisma e, nesta
condição, uma onda evanescente é naturalmente criada quando a luz polarizada
atravessa o meio óptico denso (prisma) e alcança a interface entre o metal e o meio de
densidade óptica menor (ar), sendo refletida de volta para o meio mais denso.
θθ
Prisma
Filme metálico
Meio externo
Figura 18: Configuração de Kretschmann para excitação de plásmons superficiais.
No instante em que o vetor de onda do plasma é igual ao vetor de onda do
campo evanescente (kSP = kev), (Equações 2.74 e 2.79) deve ser verificada uma queda
na refletividade, devido à formação da onda evanescente, que se propaga através da
superfície metálica e se acopla com os plásmons, como pode ser verificado através das
Equações (2.80) e (2.81):
θεω
= senc
k px (2.79)
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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74
( )arm
armp cc ε+ε
εεω=θε
ωsen (2.80)
( )
εε+εεε
=θparm
arm 1xarcsen (2.81)
onde θ é o ângulo de incidência da luz com a superfície do metal, εp, εm, εar é a constante
dielétrica do prisma, do filme metálico e do ar, respectivamente, ω é a freqüência
angular da luz incidente e c, a velocidade da luz.
2.4.3. Eletroquímica acoplada à Ressonância de Plásmons de Superfície
A combinação de métodos eletroquímicos com o fenômeno de SPR no processo
de caracterização de superfícies suscita informações muito úteis para o desenvolvimento
de biosensores, eletrodos modificados, processos de eletropolimerização, etc [142, 150-
153]. Há um número razoável de modificações estáveis nas superfícies de eletrodos que
podem exibir mudanças no índice de refração, concomitantemente com eventos redox
e/ou capacitivo [154-156].
Como foi visto na seção 2.4.2, o ângulo de ressonância depende da constante
dielétrica do filme metálico e das propriedades dielétricas dos meios adjacentes às
interfaces do filme. Conseqüentemente, a aplicação de um potencial elétrico muda as
propriedades dielétricas, resultando na variação do sinal de SPR. Kotz e colaboradores
[157] mediram o deslocamento do ângulo de SPR quando o potencial no filme fino de
ouro variou, por um ciclo, com valores abaixo e acima do potencial de oxidação do
metal, mostrando que a formação da dupla camada de Helmholtz influencia
significativamente na resposta da SPR. As variações no ângulo de SPR com a mudança
do potencial elétrico são importantes não somente porque podem afetar as medidas com
sensores de SPR: A possibilidade de medir localmente o campo elétrico com a técnica
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo II
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75
de SPR pode definir o arranjo espacial e temporal, podendo ser utilizado em várias
aplicações em biociência. Como por exemplo, na elucidação de estruturas de proteínas
[158] e/ou na determinação da orientação da proteína adsorvida.
Schlereth e colaboradores [159], caracterizaram por voltametria cíclica acoplada
à SPR a obtenção de monocamadas de hemoproteínas em superfícies modificadas de
ouro, com uma orientação que permite uma reação direta de transferência do elétron
entre o centro redox da proteína e a superfície do eletrodo.
Offennhausser e colaboradores [160] investigaram propriedades de
monocamadas auto-organizadas de alcanotiois e tiolipídeos sobre ouro. Empregando
SPR e Espectroscopia de Impedância Eletroquímica, foram avaliadas as espessuras
médias da monocamada e a cinética de transferência de elétrons e de adsorção.
Suzuki e colaboradores [161] combinaram sensores eletroquímicos com a SPR e
quantificaram IgG, por ressonância de plásmons e, glicose, juntamente com lactato, por
medidas eletroquímicas. Portanto, dois tipos de detectores foram utilizados para analitos
diferentes. Semelhantemente, Kei Toda [162] e colaboradores, elaboraram um sistema
imunoensaio que foi conduzido sobre um filme fino de ouro e analisado por ambas as técnicas,
SPR e eletroquímica. A imobilização do anticorpo, as reações antígeno-anticorpo e a
seletividade do anticorpo adsorvido foram monitoradas utilizando SPR, e o filme de ouro, com
os produtos finais no interior da célula do equipamento de SPR, foi conectado a uma célula
eletroquímica, e assim, determinado. Como neste trabalho foi utilizado um filme fino de ouro
como uma sustentação para a imobilização, o sistema não requereu longo tempo de incubação,
quando comparado com métodos convencionais que utilizam diversas horas de incubação [163].
As potencialidades analíticas da EIS e SPR, bem como a importância de suas aplicações
às investigações e caracterizações de processos superficiais e interfaciais, estão intimamente
ligadas ao desenvolvimento de métodos confiáveis. Neste contexto, o emprego combinado
dessas técnicas tem sido explorado com o propósito de disponibilizar informações
complementares que possibilitem interpretações seguras sobre o sistema avaliado.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 76
CAPÍTULO III
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Reagentes e limpeza de vidrarias
Os reagentes NaCl (VETEC), CaCl2.H2O (Merck), MnCl2.4H2O (Carlo Erba),
KCl (Merck), HNO3 (Synth), Nujol (Aldrich), H2SO4 (Synth) e sílica (Aldrich) eram de
grau analítico e foram utilizados como recebidos e os que foram empregados na sala
limpa (acetona, metanol e tricloroetileno) eram isentos de íons metálicos (MIF – “metal
íon free”).
Em todas as etapas experimentais como: lavagem dos eletrodos e materiais,
preparação e caracterização da amostra, foi utilizada água purificada obtida pelo sistema
de purificação MilliQ-Plus (Millipore Inc.), com resistividade de 18 MΩ.cm. A
temperatura do meio em que foram realizados os experimentos era de 23 ± 2 ºC.
Todas as vidrarias utilizadas nas análises passaram por um processo prévio de
descontaminação química. A vidraria foi lavada com água MilliQ-plus e detergente
neutro. Em seguida, enxaguada e imersa em ácido sulfúrico concentrado até a sua
utilização, momento em que foi lavada com água MilliQ-plus e seca em estufa.
3.2 Proteína
A proteína Concanavalina A, ou ConA, (Canavalia ensiformis; Sigma – tipo IV)
foi utilizada no processo de adsorção sobre o filme fino de ouro, na concentração de 200
µg.mL-1 em NaCl 0,15 M (configuração desativada), em NaCl 0,15 M, CaCl2.H2O 3
mM e MnCl2.4H2O 3 mM (configuração ativada). Ambas as soluções apresentaram
índice de refração (n) de 1,5 (medida realizada através de refratômetro de Abbe).
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 77
Para testar a sensibilidade e a seletividade das proteínas adsorvidas (desativada e
ativada) foram utilizados os carboidratos galactose (Merck) e glicogênio (Sigma – tipo
II), nas concentrações de 120 µg. mL-1 em NaCl 0,15 M.
As concentrações utilizadas na imobilização e na observação da reação
proteína/carboidrato foram selecionadas com base em valores publicados [111-113,
163].
3.2.1 Teste de Atividade Biológica da Concanavalina A
A atividade biológica da Concanavalina A foi verificada pela presença de
turbidez da solução, causada pela ligação de glicogênio a um sítio específico da proteína
[164-165]. A reação foi monitorada pelo espectrofotômetro de UV-visível de marca
Perkin Elmer e modelo Lambda 6, onde o caminho óptico foi de 1 cm e a temperatura
de 25 ºC.
Inicialmente, foi realizado um espectro de absorção numa faixa de comprimento
de onda de 190 a 900 nm para a solução de Concanavalina A 200 µg.mL-1 em NaCl 0,3
M, MnCl2 3 mM e CaCl2 3mM. Da análise do espectro gerado, foi selecionado o
comprimento de onda 460 nm por não ter apresentado banda de absorção, portanto, não
mascarando a absorção relacionada à reação entre a proteína e o glicogênio na próxima
etapa.
Realizou-se uma medida da variação da absorção em função do tempo, no
comprimento de onda de 460 nm, da reação entre 1,5 mL da solução ativada de ConA
200 µg.mL-1 a 1,5 mL de 120 µg.mL-1 da solução de glicogênio, em uma cubeta de
quartzo. Este experimento foi realizado 24 horas após a confecção das soluções e
repetido após sete dias.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 78
3.3 Células e Eletrodos
3.3.1 Eletrodos
Durante o desenvolvimento de todos os experimentos eletroquímicos, foi
utilizado um sistema convencional de três eletrodos: eletrodo de referência (ER),
eletrodo auxiliar (EA) e eletrodo de trabalho (ET).
3.3.1.1 Eletrodo de referência
Como eletrodo de referência, foi utilizado o eletrodo de Ag/AgCl em KCl
saturado, fabricado no Laboratório de Eletroquímica da UFPE (Figura 19).
O eletrodo consiste em um fio de prata (Ag) de 40 mm de comprimento e 1 mm
de diâmetro, envolvido em uma camada de cloreto de prata (AgCl) (obtida por
eletrodeposição), imerso em uma solução de KCl (Merck) saturado, no interior de um
corpo de vidro de 60 mm de comprimento, com 6 mm de diâmetro na extremidade
superior e 4 mm de diâmetro na inferior. Na extremidade superior, o fio de prata foi
fundido a um fio de cobre de mesmas dimensões e essa conexão foi revestida por uma
resina epóxi (Polipox – CMR029-N) que tem a dupla função de isolar o eletrodo e
proteger a união entre os dois fios metálicos. Na extremidade inferior do corpo de
vidro, utilizou-se uma junção porosa Vycor (Bioanalytical Systems), afixada com auxílio
de um tubo termoretrátil de teflon. Após a confecção, o eletrodo foi armazenado em
uma solução de KCl saturada, garantindo-lhe uma maior vida útil.
A limpeza do eletrodo foi efetuada somente com enxágüe em água para eliminar
qualquer resíduo da solução de cloreto de potássio utilizado no armazenamento,
permitindo assim sua posterior utilização experimental.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 79
Fio de Cu
Fio de Ag recoberto com
Vycor
Solução de KCl, sat.
Figura 19: Eletrodo de referência de Ag/AgCl, KCl saturado.
3.3.1.2 Eletrodo auxiliar
Utilizou-se como eletrodo auxiliar um fio de platina (Pt) com 40 mm de
comprimento e 1 mm de diâmetro, conectado a um fio de cobre (30 mm de
comprimento e 1 mm de diâmetro), cujo ponto de conexão foi revestido com resina
epóxi, como ilustra esquematicamente a Figura 20.
O eletrodo então confeccionado foi armazenado em uma caixa de acrílico,
depositada no interior de um dessecador com sílica ativada, e, antes da utilização foi
imerso durante 5 minutos em ácido nítrico concentrado, seguido de enxágüe em água
MilliQ-plus.
Figura 20: Eletrodo auxiliar de platina (Pt).
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 80
3.3.1.3 Eletrodo de trabalho
Lâminas de vidro comum (n = 1,515 em λ = 632,8 nm) [166], tendo
aproximadamente 1 mm de espessura e medindo 25 mm x 75 mm, foram utilizadas
como substratos para crescimento do filme de 50 nm de ouro (99,99% de pureza), para
posterior utilização como eletrodo de trabalho e como interface para obtenção dos
plásmons superficiais na detecção da proteína adsorvida. O processo de confecção do
eletrodo de trabalho de filme fino de ouro é descrito na seção 3.4 deste capítulo.
3.3.2 Célula eletrolítica EIS-SPR
Foi necessária a construção de uma célula, especialmente projetada para
realização das medidas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS), que
pudesse ser aplicada simultaneamente ao sistema óptico de Ressonância de Plásmons de
Superfície (SPR) na caracterização da adsorção de biomoléculas. A Figura 21 mostra o
desenho técnico da célula EIS-SPR.
A célula foi confeccionada em teflon, com dimensões de 50 mm x 45 mm x 25
mm (C x L x A). A parte superior possui uma abertura circular de 30 mm de diâmetro.
Para garantir a vedação da célula no sistema montado foi confeccionada na borda de
cada orifício uma ranhura, onde é encaixado o anel de vedação (o-ring). A abertura
superior da célula foi vedada com uma tampa em teflon (36 mm x 40 mm x 17 mm)
parafusada no corpo da célula. Na região central da tampa, foram abertos dois orifícios
de 5 mm de diâmetro e mais dois orifícios de 4 mm de diâmetro. O centro da lateral de
menor comprimento da célula possui uma abertura circular com 10 mm de diâmetro,
que é vedado com um anel de borracha ao substrato metalizado, e a superfície do filme
fino de ouro forma a tampa lateral da célula em conjunto com o prisma de BK7
(SCHOTT).
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 81
Figura 21: Desenho técnico da célula EIS-SPR.
Antes do uso, a célula EIS-SPR foi enxaguada com água MilliQ-plus e, após sua
utilização, lavada novamente em água MilliQ-plus, em seguida, foi imersa em acetona e
submetida a agitação de ultra-som por 10 minutos. Finalmente, a célula foi lavada
novamente com água MilliQ-plus por mais cinco minutos e guardada imersa em ácido
sulfúrico concentrado até a utilização seguinte.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 82
3.3.2.1 Conjunto integrado prisma-célula
A Figura 22 ilustra como foi realizada a fixação do conjunto prisma/eletrodo de
filme fino de Au/célula EIS-SPR. O anel de borracha (o-ring) da cavidade superior é
pressionado pela tampa de teflon, que é parafusada ao corpo da célula. O anel de
borracha da cavidade lateral da célula pressiona e faz contato físico com a superfície do
filme fino de ouro (eletrodo). A face do substrato de vidro, sem filme metálico, faz
contato óptico com a face de maior comprimento (hipotenusa) do prisma de vidro de
BK7 (SCHOTT), com cada face medindo 25 mm x 25 mm x 35 mm (n = 1,516 em λ =
670 nm), através de um óleo casador de índice de refração (Nujol, n = 1,48; medido
experimentalmente através de um refratômetro de Abbe, t = 22 ± 2 ºC). O prisma é
fixado no centro da abertura lateral da célula com auxilio de uma peça em aço, cujo
formato é semelhante a uma prensa (Figura 23).
Figura 22: Ilustração da montagem do conjunto prisma/ eletrodo de filme fino de ouro/célula EIS-SPR.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 83
a b
c d
Figura 23: Foto do processo de acoplamento das partes integrantes da célula EIS-SPR. a) peça em aço para fixar o prisma na célula com o eletrodo; b) célula EIS-SPR em teflon; c) conjunto peça em aço, célula e prisma e d) eletrodo de filme fino de ouro.
3.3.3 Eletrólito Suporte e Solvente
Foi utilizada uma solução de cloreto de sódio (n = 1,333 em λ = 670 nm) como
eletrólito suporte numa concentração de 0,15 M. Esta concentração é a mesma de uma
solução fisiológica adequada para testes com lectinas. No entanto, em função de sua
estabilidade eletroquímica, o potencial de trabalho ficou limitado à faixa de -100 mV à
400 mV vs. Ag/AgCl, KCl saturado.
3.4 Confecção de Eletrodos de Filme Fino
O processo de confecção do eletrodo de trabalho de filme fino de ouro foi
dividido em três etapas distintas:
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 84
1ª Etapa: Limpeza do substrato
Um dos procedimentos mais importantes na obtenção de filmes finos metálicos
pelo método de evaporação metálica a baixa pressão é a limpeza do substrato. A
importância desta etapa se deve ao fato de que a presença de dopantes (impurezas),
como óxidos, gorduras, pós, etc, na superfície do substrato diminui a aderência do filme
evaporado, e, conseqüentemente, acarreta um comportamento falho no dispositivo e/ou
diminui o seu tempo de vida útil.
Os procedimentos de limpeza descritos a seguir foram realizados em uma sala
limpa classe 1000, sala na qual iluminação, filtragem e distribuição do ar, materiais de
construção e procedimentos operacionais correspondem a exigências de controle na
concentração de partículas aerotransportadas. A classe deste tipo de laboratório se refere
à quantidade de partículas em suspensão no ambiente, isto significa que esta sala possui,
em suspensão em sua atmosfera, em média 1000 partículas de até 0,3 µm por pé cúbico.
1. As lâminas foram inicialmente lavadas com água MilliQ-plus e deixadas
por 24 horas em ácido sulfúrico concentrado. Em seguida, foram
enxaguadas novamente com água MilliQ-plus e secadas com um jato de
nitrogênio (White Martins);
2. Na seqüência, foram imersas em um béquer contendo tricloroetileno por
cinco minutos e sob agitação de um ultra-som;
3. Em seguida, foram transferidas para um outro béquer contendo água
MilliQ-plus e submetidas à agitação de um ultra-som por 3 minutos;
4. Após a lavagem com água, foram deslocadas para um outro béquer,
contendo acetona, por mais cinco minutos e sob agitação de um ultra-som;
5. Posteriormente, repetiu-se a etapa da lavagem com água MilliQ-plus (item
3);
6. As lâminas foram transferidas para um novo béquer contendo álcool
metílico, por mais cinco minutos e sob agitação de um ultra-som;
7. A limpeza foi finalizada com a repetição do item “3” pela terceira vez e
pela secagem das lâminas utilizando um jato de nitrogênio.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 85
Após a secagem, os substratos foram acondicionados em um suporte
apropriado para lâminas de microscópio, armazenado no interior de uma dessecador
com sílica ativada, até o dia da evaporação.
2ª Etapa: Evaporação
A deposição do filme fino por evaporação foi realizada pelo aquecimento do
material (ouro), fonte dos filmes, em um ambiente de vácuo elevado (∼ 10-6 torr). Como
ilustrado na Figura 24, o ouro foi aquecido próximo a sua temperatura de pressão de
vapor, em ambiente de alto vácuo, provocando a irradiação de seus átomos da fonte a se
condensarem na superfície do substrato e nas paredes da câmara, formando, deste modo,
o filme fino desejado. Os átomos de Au em alto vácuo viajam em linhas retas porque há
poucas moléculas de gás para colidir em seu trajeto.
Figura 24: Ilustração do método de Evaporação térmica a baixa pressão.
O equipamento utilizado para atingir as pressões necessárias ao experimento,
foi uma Evaporadora modelo 980 da Varian (Figura 25). Para atingir um ambiente de
alto vácuo, a evaporadora possui um sistema de bombas e válvulas que diminuem a
pressão no interior de sua câmara, na ordem de décimos de “microtorr”.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 86
Figura 25: Foto do equipamento Evaporador (Modelo 980 da Varian) utilizado na confecção de filmes finos de ouro.
A Figura 26 ilustra esquematicamente o sistema de bombeamento responsável
por este efeito. Na parte inferior do equipamento, localizam-se duas bombas e três
válvulas: a bomba difusora, que gera o alto-vácuo no interior da campânula; a bomba
mecânica, responsável pelo vácuo na ordem de 10-2 torr, produzido no interior da
campânula e na base da bomba difusora; a válvula dianteira (foreline valve),
responsável pelo controle do vácuo produzido na base da bomba difusora pela bomba
mecânica; a válvula de vácuo-intermediário (rough valve), que controla o vácuo gerado
no interior da campânula pela bomba mecânica; e a válvula de alto-vácuo (high-vacuum
ou HiVac), responsável pelo controle do alto-vácuo produzido pela bomba difusora.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 87
Figura 26: Esquema simplificado do sistema de evaporação utilizado na fabricação de eletrodos de filmes finos de ouro. 1) bomba difusora. 2) bomba mecânica. 3) válvula dianteira “foreline valve”. 4) válvula de vácuo-intermediário “rough valve”. 5) válvula de alto-vácuo “HiVac”. 6) entrada de ar ou nitrogênio. 7) campânula. 8) cadinho. 9) Shutter (auxilia no controle da espessura do filme depositado).
O processo foi iniciado primeiramente com a ligação da bomba mecânica, com a
finalidade de baixar suficientemente a pressão no interior da campânula, a qual não
poderia ser operada sob pressão atmosférica no momento em que a bomba de alto-vácuo
fosse ligada. Conseqüentemente, foi necessário atingir a pressão de ∼10-2 torr antes que
a bomba difusora entrasse em ação.
Em seguida, as válvulas iniciaram a evacuação, alternando entre o interior da
campânula e a base da bomba difusora. Após quinze minutos dessa operação, ligou-se a
bomba difusora, porém, sem que a mesma evacuasse a campânula. Após trinta minutos,
quando a pressão na base da difusora atingiu ~10-2 torr, a válvula “HiVac” foi aberta,
dando início à evacuação da campânula, enquanto a bomba mecânica procedeu com a
evacuação na base da difusora. Após alguns minutos, foi obtida uma pressão na ordem
de ~10-6 torr no interior da campânula. Com isso, o processo de evacuação se
completou, esquematicamente como ilustra a Figura 27, e foi repetido por dois dias
consecutivos antes da evaporação do material (ouro), ficando as bombas ligadas por
cerca de 6 horas em cada dia, com o intuito de limpar todo o sistema interno de
evaporação de contaminantes que põem em riso o substrato e a fonte metálica.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 88
ATMOSFERA
Figura 27: Diagrama esquemático do sistema de evacuação da evaporadora utilizada na fabricação de eletrodos de filmes finos de ouro.
No dia previsto para evaporação do material, a campânula foi aberta e lá foi
colocada 1 moeda de ouro pesando 0,78 gramas, com pureza de 99,99% (material a ser
evaporado). Este procedimento ocorreu durante o processo de evacuação da
evaporadora descrito anteriormente:
1. Após o acionamento das bombas mecânica e difusora e o bombeamento
com a bomba mecânica na base da difusora, o dispositivo mecânico
destinado a controlar a entrada de nitrogênio gasoso para o interior da
campânula foi aberto, ocasionando o aumento da pressão interna até ter
atingido a pressão ambiente;
2. A campânula foi aberta e, rapidamente, o cadinho de tungstênio (W) com o
material (1 moeda de ouro) foi posicionado e conectado com os eletrodos
(Figura 28a);
3. Na seqüência, posicionaram-se 16 (dezesseis) lâminas de vidro no porta-
substrato de alumínio (confeccionado especialmente para este
experimento), e o conjunto, acomodado na parte superior da campânula
(Figura 28b);
4. A campânula foi fechada e, em seguida, o dispositivo mecânico destinado a
controlar a entrada de nitrogênio;
5. Voltou-se a evacuar a campânula até atingir a pressão da ordem de 8 x 10-6
torr;
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 89
6. Foi aplicada uma tensão nos eletrodos conectados ao cadinho, a uma taxa
de 5 Volts/minuto até 60 V, com uma corrente de 300 A, dando início à
evaporação do ouro (Figuras 28c e 28d);
7. Após o filme ter atingido a espessura de 50 nm, reduziu-se até zero a
tensão e foram desligadas as bombas. Trabalhando tipicamente com estes
valores, a uma pressão de 8 x 10-6 torr, foi obtida uma taxa de evaporação
de 0,5 nm/s. O crescimento da espessura do filme de ouro foi monitorado
por um medidor de espessura que utiliza um sensor de cristal piezelétrico
de quartzo;
8. Após trinta minutos, o dispositivo mecânico destinado a controlar a entrada
de nitrogênio gasoso e a campânula foram abertos para retirada dos filmes
do porta-substratos, os quais foram acondicionados em um porta-filmes
(Figura 28e) e guardados no interior de um dessecador com sílica ativada,
até o início da terceira etapa da confecção do eletrodo de filme fino de
ouro.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 90
a) b)
c) d)
e)
Figura 28: Fotos da segunda etapa do processo de confecção do eletrodo de trabalho de filme fino de ouro por evaporação a baixa pressão. a) posicionamento do material no cadinho da campânula. b) posicionamento das lâminas de vidro no porta-substrato, na parte superior da campânula; c - d) processo de evaporação do ouro; d) filmes finos de ouro após o processo de crescimento e acomodados em porta-filmes de PVC.
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3ª Etapa: Contato elétrico do eletrodo de filme fino de ouro
O contato elétrico foi realizado pela simples colagem de uma das extremidades
desencapadas de um fio de cobre (40 mm) revestido com PVC (0,8 mm2) na superfície
do filme fino de ouro, com auxílio de 1 gota de cola de prata (Delta Technologies) e,
após a secagem, a junção foi revestida por uma fita de teflon sob pressão, conferindo
resistência mecânica ao conjunto (Figura 29).
O processo de limpeza, que foi aplicado antes das medidas, consistiu em aplicar
um jato de nitrogênio ou argônio a ∼ 2 cm da superfície do filme, por três minutos.
a) b)
Figura 29: Foto ilustrando o processo de construção do contato elétrico no eletrodo de filme fino de ouro. a-1) fio comum colado com auxílio de cola de prata na superfície do filme de ouro e a-2) em um substrato de vidro sem filme. b) fio comum colado com auxílio de cola de prata na superfície do filme de ouro, cuja junção foi revestida com fita de teflon.
3.5 Análise Topográfica por Microscopia de Força Atômica (AFM)
A morfologia superficial do eletrodo de filme fino de ouro foi verificada por
Microscopia de Força Atômica (AFM) utilizando um microscópio da Molecular
Imaging Corporation, modelo PicoScan 2500. As micrografias superficiais foram feitas
sem que as amostras (15 mm x 15 mm) sofressem quaisquer tipos de tratamentos
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 92
químicos anteriores, mas com apenas um jato de nitrogênio por 1 (um) minuto em
direção a sua superfície (Figura 30). Na análise, escolheu-se uma pequena área de 1 µm2
que não apresentava qualquer particularidade em sua superfície. Este experimento foi
realizado em três regiões distintas de cada uma das 3 amostras obtidas.
Figura 30: Amostras do eletrodo de filme fino de ouro utilizadas na caracterização da morfologia superficial por AFM.
3.6 Voltametria Cíclica
Os experimentos de voltametria cíclica foram realizados para verificar a limpeza
do sistema (soluções, eletrodo de filme fino de ouro, etc). Esses dados, quando
analisados concomitantemente com os resultados de AFM, fornecem um estudo
detalhado da interface.
As análises foram realizadas através de um potenciostato/galvanostato de
modelo 263A da PAR (Princenton Applied Research). A faixa de potencial se estendeu
de – 300 a 700 mV vs Ag/AgCl, saturado, para o filme fino de ouro em solução de NaCl
0,15 M e de –300 a 1500 mV para o eletrodo em solução de ácido sulfúrico 0,1 M. A
velocidade de varredura foi de 50 mV.s-1.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 93
3.7 Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS)
As medidas de impedância eletroquímica foram realizadas através do
potenciostato/galvanostato ligado a um Lock-in (modelo 5210 da PAR), numa faixa de
freqüência de 100 KHz a 10 Hz, sendo a amplitude de perturbação de 10 mVrms.
O potenciostato aplica um potencial dc entre o eletrodo de trabalho e o de
referência, além de gerar a onda senoidal. O Lock-in compara dois sinais senoidais e
gera uma resposta que é usada para se obter a diferença de fase entre os sinais e a razão
entre as amplitudes dos picos. Portanto, o Lock-in envia através do potenciostato um
sinal senoidal de pequena amplitude e mantém um sinal interno como referência. A
resposta da célula eletroquímica à excitação é comparada com o sinal de referência do
Lock-in.
Os resultados da Espectroscopia de Impedância foram modelados através do
programa Equivalent Circuit (Equivcrt.Pas), escrito por Bernard A. Boukamp [167].
Essa modelagem permitiu a extração dos valores dos elementos do circuito equivalente
para cada interface, que são comparáveis às grandezas físico-químicas dessas interfaces.
3.7.1 EIS Aplicada na Caracterização da Adsorção de Biomoléculas
Com o sistema descrito anteriormente (seção 3.7.), foram realizadas medidas de
Espectroscopia de Impedância Eletroquímica no processo de caracterização da adsorção
da Concanavalina A na superfície do eletrodo de filme fino de ouro, utilizando a célula
EIS-SPR. O protocolo utilizado neste experimento pode ser assim descrito:
1. Após a limpeza dos eletrodos, inicia-se o procedimento de limpeza da
célula EIS-SPR com solução de NaCl 0,15 M. O processo é repetido cinco
vezes;
2. Após a lavagem, a célula é preenchida com 10 mL da solução de NaCl 0,15
M;
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 94
3. Em seguida, acopla-se o sistema de desoxigenação à célula, o qual efetuou
o borbulhamento com nitrogênio durante 5 minutos, mantendo-se a
atmosfera inerte durante o restante do experimento;
4. Os eletrodos de referência e auxiliar são fixados na célula e conectados ao
potenciostato/galvanostato (Figura 31);
5. Realiza-se a medida de impedância eletroquímica para a interface
ouro/NaCl 0,15 M, com potencial de circuito aberto;
6. Após a medida de impedância da interface ouro/NaCl, adiciona-se 1 mL da
solução de ConA desativada (2200 µg.mL-1), alcançando, dessa forma,
uma concentração final no interior da célula de 200 µg.mL-1 de ConA em
NaCl 0,15 M;
7. Agita-se por 1 minuto a solução no interior da célula, com a mesma
micropipeta utilizada na adição da ConA. Em seguida, o sistema é mantido
em repouso por 30 minutos;
8. Após o tempo de repouso, a solução do interior da célula é retirada e
descartada, com auxílio de uma seringa. Efetua-se novamente a lavagem e,
em seguida, a célula é preenchida com 10 mL da solução de NaCl 0,15 M;
9. Realiza-se a medida de impedância eletroquímica para a interface
ouro/ConA/NaCl 0,15 M, com potencial de circuito aberto;
10. Após a medida de impedância da interface ouro/ConA/NaCl, adiciona-se 1
mL da solução de glicogênio (1320 µg.mL-1), atingindo, dessa forma, uma
concentração final no interior da célula de 120 µg.mL-1 de glicogênio em
NaCl 0,15 M;
11. Agita-se por 1 minuto a solução no interior da célula, com a mesma
micropipeta utilizada na adição do glicogênio. Em seguida, o sistema é
mantido em repouso por 30 minutos;
12. Repete-se o item 8;
13. Realiza-se a medida de impedância eletroquímica para a interface
ouro/ConA/glicogênio/NaCl 0,15 M, com potencial de circuito aberto.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 95
O protocolo foi repetido, porém, com a aplicação de um potencial fixo durante
os 30 minutos de repouso do sistema, após a adição da ConA ativada e desativada na
célula EIS-SPR. O procedimento também foi testado com a utilização da galactose em
substituição ao glicogênio, com o intuito de verificar a especificidade e seletividade da
Concanavalina A em ambas as formas. Para cada interface (ouro/NaCl;
ouro/ConA/NaCl; ouro/ConA/glicogênio/NaCl, ouro/ConA/galactose/NaCl), foram
aplicados potenciais na faixa de -100 mV à 400 mV vs. Ag/AgCl, KCl saturado em
intervalos de 50 mV, faixa esta determinada previamente por voltametria cíclica.
Figura 31: Célula EIS-SPR com os eletrodos fixados. Sistema utilizado na caracterização da adsorção da ConA e da reação ConA e glicogênio na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por EIS.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 96
3.8 Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR)
Para a excitação dos plásmons de superfície nos eletrodos de filme fino de ouro,
foi utilizada a configuração de refletividade total atenuada (ATR), desenvolvida por
Kretschmann-Raether [132], que é normalmente usada na maior parte dos instrumentos
de SPR [133-143].
3.8.1 Sistema Óptico
A Figura 32 ilustra a montagem utilizada na investigação da Ressonância de
Plásmons de Superfície acoplado ao sistema eletroquímico (potenciostato) e, na Tabela
4 encontra-se uma descrição dos componentes ópticos utilizados.
Chopper
Osciloscópio
E2 Filtro
Polarizador
Íris
Lente Estágio de rotação
Fotodetector 1 (F1)
Lente
Espelho
Espelho
E1
Feixe E
E1
E3
Fotodetector 2 (F2)
Laser
Argônio
Potenciostato
Figura 32: Sistema óptico utilizado na caracterização da adsorção de biomoléculas na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por SPR.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 97
Tabela 4: Relação dos componentes utilizados na montagem experimental do sistema óptico.
Componentes ópticos
Função e/ou descrição
Laser de diodo Utilizado como fonte de luz para a excitação dos plásmons superficiais no filme metálico; λ = 670 nm; potência de saída de 3,8 mW;
Polarizador Fixa o plano de vibração do vetor elétrico do feixe de luz no plano de incidência; Peça com 20 mm de diâmetro e giro de 360º.
Obturador eletromecânico
(chopper)
Tem a finalidade de alternar a passagem da radiação, gerando ondas quadradas e pulsadas do feixe luminoso; foi operado com uma freqüência fixa de 46 Hz.
Espelhos Utilizado para guiar a trajetória do laser até o prisma, por reflexão regular.
Filtro Utilizado para atenuar o feixe de luz, evitando a saturação dos fotodetectores. O filtro utilizado, NG4, atenua ∼30% do sinal.
Divisor de feixe Espelho parcialmente transmissivo utilizado para refletir uma amostra do feixe incidente para o fotodetector de referência (F1).
Fotodetector 1 (F1)
Utilizado para monitorar a intensidade de radiação laser de forma a eliminar efeitos decorrentes de flutuações.
Fotodetector 2 (F2)
Mede a intensidade do feixe de luz (E3) que é refletida pelo prisma.
Íris É um diafragma circular com abertura variável que impede a passagem de ruído espacial do feixe de luz.
Lentes Lente do tipo convergente com distância focal de 5 cm.
Estágio de rotação
Elemento de suporte da célula EIS-SPR, utilizado para ajustar o ângulo de incidência do feixe de luz em relação à direção normal da superfície do prisma.
Prisma Prisma BK7 (SCHOTT) na forma de um triângulo retângulo isóscele (45º, 45º, 90º) com cada face medindo (25 mm x 25mm x 35 mm). Utilizado para permitir o acoplamento do feixe de luz incidente com os plásmons superficiais.
Osciloscópio Filtra o sinal elétrico enviado pelos fotodetectores em sincronismo com o chopper. O valor absoluto da refletividade pode ser medido pela razão entre os sinais gerados nos fotodetectores.
Um laser de diodo (λ = 670 nm) com potência de 3,8 mW foi fixado ao suporte
ajustável, com translado na horizontal e vertical, possibilitando um fácil ajuste da
direção do feixe incidente (E). O polarizador definiu a direção de polarização paralela
ao plano de incidência. O feixe foi então modulado mecanicamente em uma freqüência
fixa de 46 Hz, com a utilização de um obturador eletromecânico (chopper) modelo
SR540 (Stanford Research Systems) e, em seguida, dividido em duas componentes E1 e
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 98
E2 através do divisor de feixe. O feixe E1 incide sobre o prisma fixado na célula EIS-
SPR que, por sua vez, está fixada a um suporte com translado X-Y-Z, montado em uma
base horizontal que pode girar nos sentidos horário e anti-horário, através de um
parafuso micrométrico (Figura 33a). Nessa configuração, o sistema opera com a face
superior do prisma posicionada horizontalmente, facilitando assim a inserção e
aspiração de soluções e sua desoxigenação com argônio, garantindo a ausência de
bolhas de ar no interior da célula. Dois fotodetectores de silício, F1 e F2, foram
utilizados para medir as potências ópticas dos feixes E2 e E3. Os sinais gerados pelos
fotodetectores foram coletados pelo osciloscópio modelo 54601da HP (Hewlett
Packard), a partir do qual obtêm-se os dados necessários para a caracterização de
plásmons superficiais. A Figura 33b ilustra a visão do sistema óptico montado.
Antes do início das análises experimentais os componentes ópticos foram limpos
com uma gaze embebida em álcool iso-propílico, sem excesso, para remover mancha
e/ou poeira eventualmente grudadas.
a) b)
Figura 33: Sistema óptico utilizado na caracterização da adsorção da ConA e da reação ConA e glicogênio na superfície do eletrodo de filme fino de ouro por SPR. a) foto do suporte ajustável com a célula EIS-SPR fixada; b) foto do sistema óptico completo.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 99
3.8.2 SPR Aplicada na Caracterização da Adsorção de Biomoléculas
O procedimento experimental para realização de medidas de SPR das interfaces
ouro/ar, ouro/NaCl, ouro/ConA/NaCl e ouro/ConA/glicogênio/NaCl foi iniciado com a
criação de um protocolo sistemático visando estabelecer uma seqüência de etapas a
serem adotadas durante o experimento. Essas etapas incluíram a realização de medidas
de refletividade para definir as condições de operação do sistema, o processo de
imobilização das moléculas de concanavalina A ao filme de ouro, as concentrações das
soluções de glicogênio e galactose, o tempo de incubação em cada fase da reação, etc.
O protocolo adotado nos experimentos, que segue basicamente alguns passos do
protocolo do método de Imunoabsorção por Ligação Enzimática (ELISA – “Enzyme
Linked Immunosorbent Assay”), pode ser assim descrito:
Etapa 1: Curva de SPR da interface ouro/ar
1. Montagem e limpeza do aparato (componentes ópticos, célula, eletrodo de
filme fino, etc.);
2. O feixe foi ajustado para incidir a 90º com o filme de ouro;
3. Foi medida a curva de SPR, através de uma varredura da interface e
comparada com a curva teórica (ver apêndice A).
Etapa 2: Curva de SPR da interface ouro/NaCl 0,15 M
1. Lavagem da célula EIS-SPR com solução de NaCl 0,15 M. O processo é
repetido cinco vezes. Após a lavagem, a célula é preenchida com 10 mL da
mesma solução de NaCl;
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 100
2. Em seguida, o sistema de desoxigenação foi acoplado a célula, o qual
efetuou o borbulhamento com argônio ou nitrogênio durante 5 minutos,
mantendo-se a atmosfera inerte durante o restante do experimento;
3. Foi medida a curva de SPR, através de uma varredura da interface e
comparada com a curva obtida da interface ouro/ar.
Etapa 3: Curva de SPR da interface ouro/ConA/NaCl 0,15 M
1. Após a varredura da interface ouro/NaCl, foi adicionado 1 mL da solução
de ConA desativada (2200 µg.mL-1), fornecendo, dessa forma, uma
concentração final no interior da célula de 200 µg.mL-1 de ConA em NaCl
0,15 M;
2. A solução no interior da célula foi agitada por 1 minuto, com a mesma
micropipeta utilizada na adição da ConA. Em seguida, o sistema foi
mantido em repouso por 30 minutos;
3. Após o tempo de repouso, a solução do interior da célula foi retirada e
descartada, com auxílio de uma seringa;
4. Foram repetidos os itens “1” e “2” da etapa 2, respectivamente;
5. Foi medida a curva de SPR, através de uma varredura da interface e
comparada com a curva obtida da interface ouro/NaCl.
Etapa 4: Curva de SPR da interface ouro/ConA/glicogênio/NaCl 0,15 M
1. Após a varredura da interface ouro/ConA/NaCl, foi adicionado 1 mL da
solução de glicogênio (1320 µg.mL-1), atingindo, dessa forma, uma
concentração final no interior da célula de 120 µg.mL-1 de glicogênio em
NaCl 0,15 M;
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 101
2. A solução no interior da célula foi agitada por 1 minuto, com a mesma
micropipeta utilizada na adição do glicogênio. Em seguida, o sistema foi
mantido em repouso por 30 minutos;
3. Foi repetido o item “3” da etapa 3 e os itens “1” e “2” da etapa 2,
respectivamente;
4. A curva de SPR foi medida, através de uma varredura da interface e
comparada com a curva obtida da interface ouro/ConA/NaCl.
O protocolo descrito na seção 3.7.2 foi repetido, com a adição de 1 mL de
galactose (1320 µg.mL-1 ) em substituição ao glicogênio (etapa 4), com o intuito de
testar a especificidade e seletividade da Concanavalina A na forma desativada. O
protocolo foi também repetido para a proteína Concanavalina A na forma ativada e para
a Concanavalina A ativada junto ao glicogênio. Também foram verificadas as interfaces
ouro/glicogênio/NaCl e ouro/galactose/NaCl.
Cada medida de refletividade foi obtida da média de 3 amostras da razão entre
o sinal E3 e a referência E2. Para obter a curva de SPR, que corresponde à razão E3/E1,
antes de cada experimento, mediu-se a razão E1/E2, que é invariável,
independentemente de flutuações no nível de potência do laser. A partir dessa medida, a
refletividade (R) (relação entre a luz refletida e a luz incidente) da face hipotenusa do
prisma foi dada pela razão:
13
21
23
E
ER
EE
EE
=
= (3.1)
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 102
3.8.2.1 Evolução Temporal da Refletividade
Com a obtenção das curvas de ressonância das interfaces ouro/ar, ouro/NaCl,
ouro/Com A/NaCl, ouro/ConA/glicogênio/NaCl, ouro/ConA/galactose/NaCl, foi
possível criar um protocolo para observações em tempo real da reação Concanavalina A
(ativada e desativada) com o glicogênio, utilizando a Ressonância de Plásmons de
Superfície. Neste protocolo, o fotodetector permanece fixo no ângulo de plásmons
característico de cada interface, obtendo-se um gráfico da variação da refletividade (R)
versus tempo (h):
1. Montagem e limpeza do aparato (componentes ópticos, célula, eletrodo de
filme fino, etc.) e o feixe foi ajustado para incidir a 90º com o filme de
ouro;
2. Foram repetidos os itens “1” e “2” da etapa 2 da seção 3.7.2,
respectivamente;
3. Foi determinado o ângulo de máxima declividade (θp) para a interface
ouro/NaCl. Este ponto passa a ser tempo zero (h);
4. (FASE I) - Com o ângulo de incidência fixado no ponto de máxima
declividade para o sistema ouro/ConA desativada (determinado a partir da
execução do protocolo do item 3.7.2), foi adicionado a solução de ConA
desativada, alcançando uma concentração final de 200 µg. mL-1. Em
seguida, iniciou-se o processo de monitoramento da refletividade no ângulo
de plásmons da interface;
5. (FASE II) – Depois de atingido um regime permanente (sem variação), foi
iniciado novamente o processo de lavagem da célula (por cinco vezes),
usando-se a solução NaCl 0,15 M. Em seguida, a célula é novamente
preenchida com 10 mL dessa solução;
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 103
6. (FASE III) – Foi acrescentado à solução de glicogênio e continuado o
processo de monitoramento da refletividade em função do tempo;
7. (FASE IV) - Ao final da fase (momento em que a variação da refletividade
se estabilizou), repetiu-se o procedimento de lavagem e preenchimento da
célula com NaCl 0,15 M e continuado o processo de monitoramento até a
estabilização da refletividade.
O protocolo descrito foi repetido, com a utilização da galactose, em substituição
ao glicogênio, com o intuito de testar a especificidade e seletividade da Concanavalina
A na forma desativada. O protocolo foi também repetido para a proteína Concanavalina
A na forma ativada e para a Concanavalina A ativada junto ao glicogênio.
3.9 Eletroquímica Acoplada a SPR
Nas análises de caracterização da adsorção da Concanavalina A na superfície do
eletrodo de filme fino de ouro, sob efeito da aplicação de um potencial fixo, foi
utilizado o potenciostato modelo CV-27 da BAS (Bioanalytical Systems), acoplado ao
sistema óptico descrito anteriormente (Figura 14). Os eletrodos de referência (Ag/AgCl,
KCl sat), auxiliar (Pt) e o de trabalho (filme fino de ouro) foram inseridos
separadamente nos compartimentos da célula EIS-SPR, montada no sistema óptico e,
em seguida, conectados ao potenciostato. Foi realizada à desoxigenação da solução com
o uso de argônio, para eliminar tanto as bolhas no interior da célula, como também, o
oxigênio dissolvido na solução.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo III
Raimundo Rômulo Martins Júnior 104
3.9.1 Técnicas Eletroquímicas Acopladas a SPR na Caracterização da Adsorção de
Biomoléculas
Foi analisado o comportamento da adsorção da Concanavalina A ativada e
desativada e de sua reação com glicogênio e galactose, em função do potencial aplicado,
através do sistema descrito na seção 3.8. O protocolo desenvolvido para este
experimento é similar ao protocolo descrito da seção 3.7.2, onde a única diferença é
que, após a adição da Concanavalina A na célula EIS-SPR, foi aplicado um potencial
fixo durante os 30 minutos de repouso do sistema.
O protocolo foi repetido para cada potencial aplicado em cada interface (ouro/
NaCl; ouro/ConA/NaCl; ouro/ConA/glicogênio/NaCl; ouro/ConA/galactose/NaCl).
Foram aplicados potenciais na faixa de -100 mV à +400 mV vs. Ag/AgCl, KCl
(saturado) a intervalos de 50 mV.
3.9.1.1 Estabilidade do sistema EIS-SPR
Foi verificada a estabilidade do sistema EIS-SPR, com base na variação do
ângulo de plásmons das interfaces: ouro/NaCl, ouro/ConA-desativada/glicogênio e
ouro/ConA-ativada/glicogênio. Foram realizadas, para cada interface, quatro medidas
diárias de SPR (iniciando às 08h e finalizando às 17h do mesmo dia, com intervalos,
entre as medidas, de 3 horas), durante sete dias consecutivos.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 105
CAPÍTULO IV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No estudo do processo de adsorção da Concanavalina A ativada e desativada e
de sua reação com glicogênio e galactose na superfície do eletrodo de filme fino de ouro
foram utilizadas duas técnicas: a Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS) e a
Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR), como já mencionado. Inicialmente,
serão apresentados estudos sobre a atividade biológica da proteína e, em seguida, os de
limpeza da superfície do eletrodo, do processo de adsorção da Concanavalina A e de sua
reação com carboidratos. Por fim, será apresentado o estudo que verifica a estabilidade
do sistema EIS-SPR.
4.1 Caracterização da Concanavalina A
A Figura 34 ilustra o espectro de absorção da solução de Concanavalina A
ativada 200 µg. mL-1, após 24 horas e 7 dias do preparo da solução. Nesses resultados
observa-se que a região de comprimento de onda com aproximadamente 280 nm
corresponde à banda de absorção característica da proteína [28-30, 165]. Essa banda é
uma superposição de transições vibracionais com transições eletrônicas dos vários
cromóforos (grupos funcionais que contêm elétrons de valência com energias de
excitação baixas), presentes na proteína, como por exemplo, o grupo carbonila ⟩C=O,
que absorve luz visível no comprimento ~ 280 nm. A transição responsável por essa
absorção é a excitação eletrônica de um par isolado do átomo de oxigênio (um elétron
não-ligante, n) a um orbital vazio antiligante π* da ligação dupla C=O. Esta transição é
do tipo n→π* (n-pi estrela).
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 106
200 300 400 500 600 700 800 9000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Abs
orbâ
ncia
λ (nm)
Figura 34: Espectro de absorção no UV-visível, numa região de 190 a 900 nm para a Concanavalina A ativada 200 µg/mL em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC, preparada após 24 horas (linha contínua) e 7 dias (linha pontilhada).
A região de comprimento de onda entre 305 e 900 nm corresponde à faixa em
que a Concanavalina A não apresenta absorção. Deste modo, no comprimento de onda
de 460 nm, não há influência da proteína no experimento de variação da absorção em
função do tempo, (Figura 35), da reação entre 1,5 mL da solução de ConA 200 µg. mL-1
ativada e 1,5 mL de glicogênio 120 µg. mL-1 (Figura 36).
a b c
Figura 35: Solução de Concanavalina A ativada 200 µg/mL (a) e glicogênio 60 µg/mL(b) em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC; (c) reação as soluções a e b.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 107
0 2 4 6 8 10 12
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
Abs
orbâ
ncia
(46
0nm
)
Tempo (min) Figura 36: Solução de Concanavalina ativada 200 µg/mL e glicogênio 60 µg/mL em NaCl 0,15M, MnCl2 3mM e CaCl2 3mM, com pH 5,5 a 25ºC. Resultados da absorção no visível a um comprimento de onda de 460 nm, um dia após a confecção () e 7 dias após a confecção da solução (+).
A partir dos resultados da Figura 36, pode-se verificar um aumento da absorção
em ambas as soluções. Este aumento é resultado da turvação gerada pela reação entre a
proteína e o açúcar (Figura 35c), o que provoca uma maior perda de radiação devido à
reflexão e espalhamento de luz nas várias interfaces. Além disso, observa-se que a
proteína mantém sua atividade biológica por, no mínimo, uma semana, pois existe uma
sobreposição entre os resultados de um dia e de sete dias, após a confecção da solução.
Portanto, pode-se garantir que, no período de investigação do processo de adsorção, a
proteína manteve sua estrutura inalterada.
4.2 Caracterização topográfica do eletrodo de filme fino de ouro
Um conhecimento prévio da superfície do eletrodo é importante para a
determinação de grandezas, tal como a concentração de espécies adsorvidas no filme,
pois a corrente detectada pelo sensor, referente às análises de impedância eletroquímica,
é função da área efetiva exposta à solução. Portanto, a superfície do eletrodo de filme
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 108
fino foi caracterizada por Microscopia de Força Atômica (AFM), para que qualquer
alteração na corrente fosse provocada por uma alteração da espessura da camada
protéica adsorvida e não por alterações da área exposta à solução, como por exemplo,
alta rugosidade no filme.
A micrografia em 3D da superfície da área de 1 µm2 do filme fino de ouro
(Figura 37), obtida por AFM com resolução de 512 x 512 pixels , revelou alto grau de
limpeza do filme, baixa rugosidade e boa continuidade, devido principalmente à
presença de pequena quantidade de protusões (hillocks) na sua superfície e pela grande
área dessas protusões, o que reduz a rugosidade do mesmo.
Figura 37: Imagem topográfica em 3D obtida por AFM do filme fino de ouro (50 nm) depositado em substrato de vidro comum.
4.3 Caracterização eletroquímica e SPR do eletrólito de suporte
4.3.1 Técnicas eletroquímicas
O estudo eletroquímico da solução de NaCl 0,15 M foi realizado com o objetivo
de verificar a presença de espécies eletroativas na solução e a influência da aplicação do
potencial. A princípio, este estudo foi efetuado no eletrodo de filme fino de ouro através
da técnica de voltametria cíclica. No voltamograma cíclico, gerado no intervalo de
varredura de – 0,3 V a 0,7 V vs Ag/AgCl saturado (Figura 38), foi possível verificar que
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 109
entre os potenciais 0,0 V a -0,2 V ocorre a redução de oxigênio dissolvido na solução,
caracterizada pela formação do pico de redução. Além desta análise, entre os potenciais
de ~ 0,6 V a 0,1 V, não se observam picos de correntes que indiquem a ausência de
possíveis contaminantes, tanto na solução como na superfície do filme.
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
-3,0x10-6
-2,5x10-6
-2,0x10-6
-1,5x10-6
-1,0x10-6
-5,0x10-7
0,0
5,0x10-7
1,0x10-6
1,5x10-6
2,0x10-6
I (A
)
E (V) vs. Ag/AgCl, KCl saturado
Figura 38: Voltamograma cíclico do eletrodo de filme fino de ouro (50 nm) em solução de NaCl 0,15M, v = 50 mV s-1, 25° C.
Com o intuito de verificar adicionalmente a limpeza da superfície do filme, um
típico voltamograma cíclico foi obtido para o eletrodo de ouro em ácido sulfúrico 0,1 M
(Figura 39). O voltamograma gerado no intervalo de varredura de -0,2 V a 1,5 V vs.
Ag/AgCl saturado apresenta um pico (A1) referente à primeira transferência de elétrons
do processo de formação de uma monocamada de óxido [168, 169]. A formação do
óxido prossegue em duas etapas, cada uma relacionada à transferência de um elétron
(Equação 4.1). O segundo pico, A2, é referente à transferência do segundo elétron.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 110
Au + nH2O Au(OH)n + nH+ + ne- (4.1a)
Au(OH)n AuO + nH+ + ne- (4.1b)
Au + nH2O AuO + nH+ + ne- (4.1c)
A1
A2
B1 B2
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
-1,0x10-3
-5,0x10-4
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
I (A
)
E (V) vs. Ag/AgCl, KCl saturado
Figura 39: Voltamograma cíclico do eletrodo de filme fino de ouro (50 nm) em H2SO4 0,1M, velocidade de varredura de 50 mV s-1, 25° C.
A redução da camada de óxido foi caracterizada pelos picos B1 e B2,
relacionados à transferência de dois elétrons, convertendo a camada de óxido em ouro
metálico. A região desses picos é de 0,7 a 1,0 V, onde se observa uma concordância
entre este intervalo e o da literatura [168]. Em função dos resultados apresentados até o
momento, pode-se descartar a presença de qualquer impureza no sistema eletroquímico
estudado.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 111
A Figura 40 apresenta os resultados da EIS para o eletrodo de filme fino de ouro
em NaCl 0,15 M, na forma de gráfico de Nyquist, que ilustra os valores da parte real da
impedância, Zre, no eixo x e os valores da parte imaginária, Zim, no eixo y. Este
resultado irá servir para comparação com os dados obtidos no processo de adsorção da
Concanavalina A. Pode-se observar, ainda na Figura 40, a existência de uma pequena
curvatura, estendida por toda a região de trabalho, que representa o indício da formação
de um semicírculo e está além da região de investigação. Como já foi visto no Capítulo
II, a formação de tais semicírculos nos gráficos de Nyquist está associada à presença de
componentes resistivos e capacitivos na interface [124-126]. Deste modo, esta curvatura
associa-se à existência de um componente de alta resistência. O valor do potencial de
circuito aberto (ECA) registrado para este experimento pelo equipamento foi de -0,143
V.
0,0 5,0x103 1,0x104 1,5x104 2,0x104 2,5x104 3,0x104 3,5x104 4,0x104
0,0
5,0x103
1,0x104
1,5x104
2,0x104
2,5x104
Z im
(oh
m)
Z re (ohm)
Figura 40: Gráfico de Nyquist, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.
A Figura 41 apresenta o gráfico do ângulo de fase, φ, em função da freqüência e
o gráfico de admitância. Como visto também no Capítulo II, o gráfico de Bode é uma
outra maneira para apresentação dos mesmos dados da Figura 40. As vantagens desta
forma de apresentação residem no fato do ângulo de fase não depender da área do
eletrodo, como ocorre com os valores no gráfico de Nyquist e que através deste gráfico
pode-se estudar a contribuição de cada componente da interface, como as alterações na
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 112
capacitância da dupla camada, que são visualizadas a partir das variações do ângulo de
fase, de maneira mais clara. Já os gráficos de admitância Y auxiliam na interpretação
dos gráficos de impedância, pois podem ser especialmente úteis na análise de circuitos
paralelos, visto que admitâncias para elementos em paralelo podem ser somadas
diretamente, ou seja, da mesma maneira que as impedâncias para elementos em série e
vice–versa [126, 128].
Observa-se no gráfico de Bode (Figura 41a) que na região de baixa freqüência o
ângulo de fase se aproxima de 90°, logo ele possui um caráter capacitivo e, nas regiões
de alta freqüência o ângulo se aproxima de 0°, semelhante a um resistor.
Portanto, verifica-se que os gráficos que melhor permitem uma possível análise
são os gráficos de Bode e admitância. Portanto, os próximos resultados de EIS serão
apresentados sob a forma do gráfico de Bode e/ou admitância.
101 102 103
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
φ (
grau
s)
f (Hz)0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
Yim
(S)
Yre (S)
(a) (b)
Figura 41: (a) Gráfico de Bode e de (b) admitância, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.
Foram realizados experimentos de impedância para averiguar se os açúcares
utilizados no processo de especificidade e seletividade da ConA adsorvida também
interagiam com a superfície do filme. Na Figura 42, pode-se observar uma diminuição
sutil no valor da admitância real (Yre) para as interfaces Au/galactose e Au/glicogênio,
em relação à interface controle Au/NaCl 0,15 M. As diminuições do valor de Yre para
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 113
estas interfaces estão relacionadas ao aumento da impedância do sistema. Deste modo, a
presença dos açúcares promove apenas um pequeno aumento na resistência dos
sistemas, não apresentando, portanto, interações fortes com a superfície do ouro. Este
resultado era esperado, pois os açúcares utilizados não possuem grupos funcionais que
apresentem especificidade para interagir com a superfície do substrato. Os valores do
potencial de circuito aberto registrados para as interfaces Au/galactose e Au/glicogênio
foram -0,162 V e –0,154 V, respectivamente.
0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
Yim
(S)
Yre (S)
Figura 42: Gráfico de admitância, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.
Os resultados apresentados na Figura 43 confirmam que os açúcares
praticamente não adsorveram na superfície do filme, pois, observa-se que o ângulo de
fase não sofreu grande alteração, comparando-se os três sistemas entre si.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 114
101 102 103 100
10
20
30
40
50
60
70
80
90
φ (
grau
s)
f (Hz)
Figura 43: Gráfico de Bode, onde () é o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.
4.3.2 Resultados utilizando a técnica de SPR
A técnica de Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR), fornece informações
que dependem da natureza do feixe incidente, bem como das propriedades ópticas do
meio em questão. Neste contexto, com o sistema óptico descrito anteriormente na seção
3.8.1, foram realizadas medidas de refletividade tanto para verificar a limpeza do
eletrodo de filme fino de ouro, como para caracterizar o eletrólito suporte e,
conseqüentemente, definir as condições de operação do sistema EIS-SPR. Contudo,
deve-se levar em consideração que as constantes ópticas (como por exemplo, índice de
refração e/ou permissividade elétrica) não podem ser identificadas diretamente no
gráfico. Para tal fim, conta-se com análises matemáticas complexas para a obtenção de
dados qualitativos e quantitativos, a partir das características estruturais das curvas de
refletividade obtidas [78, 79, 108, 132].
Inicialmente, a Figura 44 ilustra o ajuste de curvas teórica e experimental,
usando as Equações (2.75) (2.76) (2.77) (3.1) e os resultados experimentais para a
interface Au/ar (célula vazia). Os parâmetros obtidos desse ajuste para o sistema
experimental estão listados na Tabela 5. Na Figura 44, foi destacado o ângulo crítico
(θC) a partir do qual ocorre a reflexão interna total, o ângulo de ressonância θPS, para o
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 115
qual ocorre o mínimo de refletividade e a largura de linha a meia altura ∆θPS. Pode-se
observar (Figura 44) que os resultados obtidos experimentalmente para θPS (44,2 ±
0,01º) e ∆θPS (1,9°) estão de acordo com os valores previstos teoricamente para θPS
(44,2º) e ∆θPS (1,7°).
Na Tabela 6, pode-se observar que os valores medidos das constantes ópticas do
eletrodo de filme fino de ouro são muito próximos daqueles obtidos em filmes de boa
qualidade com permissividade ε = -10,333 – j1,685 [170]. Esses dados, em conjunto
com os valores dos ângulos de plásmons obtidos (Figura 44), refletem a boa qualidade
do filme e precisão do aparato experimental, pois a curva característica da refletividade
é fortemente influenciada pelos parâmetros típicos da estrutura do filme metálico, como
por exemplo, a espessura do filme, a rugosidade da superfície metálica, as constantes
ópticas dos meios envolvidos, etc. Modificações nesses parâmetros (o índice de
refração, por exemplo) podem afetar a posição de ressonância, a largura da curva e o
valor mínimo da refletividade.
θPS (graus)
Ref
letiv
idad
e
37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
0.2
0.4
0.6
0.8
@ DθC
θPS
∆θPS
Figura 44: Curvas teórica (linha contínua) e experimental (pontilhada) da refletividade na interface Au/ar, com n(ar) = 1, ε (Au) = -10,333-j1,685 e d(Au) = 50nm e λ = 670 nm.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 116
Tabela 5: Resultados experimentais obtidos com ajuste de curva teórica/experimental para a interface Au/ar.
λλλλ (nm) n(prisma) εεεε´ εεεε´´ d(nm)
670 1,516 -10,164 -1,735 50
Para a interface Au/NaCl 0,15 M (Figura 45), pode-se observar que houve um
deslocamento do ângulo de ressonância θPS (72,7°), quando comparado com o da
interface Au/ar (44,2°) (Figura 44). Ao adicionar os açúcares ao sistema,
individualmente, praticamente não houve grandes alterações do ângulo de plásmons e
da largura angular (média entre os pontos de meia altura da curva) em relação à
interface Au/NaCl (Tabela 6). É importante notar que a largura da linha de ressonância
aumenta com a absorção do campo incidente pelos plásmons superficiais, que é
provocada pelo aumento da permissividade elétrica do meio em contato com o eletrodo
metálico [171]. Portanto, confirmando os resultados obtidos por impedância
eletroquímica, a galactose e o glicogênio praticamente não adsorveram na superfície do
eletrodo de filme fino de ouro. Essa informação será útil na análise do processo de
adsorção da ConA, pois desta forma pode-se concluir que grandes alterações nas
medidas eletroquímicas e/ou ópticas serão ocasionadas somente pela adsorção da
proteína ao filme.
68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ref
letiv
idad
e
θPS
(graus) Figura 45: Refletividade. () É o eletrodo de filme fino de ouro em solução de NaCl 0,15 M, () em solução contendo galactose e (×) glicogênio. d(Au) = 50nm e λ = 670 nm (laser). Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 117
Tabela 6: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 45.
Interface Intensidade (u.a) Largura angular (°) Ângulo de plásmons (°)b
Au/NaCla 0,040 2,90 72,70 ± 0,01
Au/galactose/NaCla 0,051 3,10 72,81 ± 0,01
Au/glicogênio/NaCla 0,050 3,02 72,75 ± 0,01 a Média de três experimentos
b Intervalo de confiança de 95 %.
Assim, a técnica de SPR constitui de fato uma ferramenta extremamente
importante na caracterização óptica e estrutural envolvendo filmes metálicos. Portanto,
a partir desses resultados, foi possível utilizar o sistema SPR para observações do
processo de adsorção da Concanavalina A e de sua interação com carboidratos.
4.4 Caracterização da adsorção da Concanavalina A
4.4.1 Resultados de impedâncias
A modificação da superfície do eletrodo de filme fino de ouro foi detectada pela
Espectroscopia de Impedância Eletroquímica e Ressonância de Plásmons de Superfície
(seção 4.4.2). Foram realizadas diversas medidas de acordo com o procedimento
descrito na seção 3.7.1 do Capítulo III. Deve ser destacado que, embora a etapa de
adsorção de proteína tenha sido realizada em diferentes potenciais, as medidas de
impedância foram realizadas em um potencial aplicado igual ao potencial de circuito
aberto (ECA).
Para uma análise mais quantitativa dos resultados experimentais foram propostos
vários circuitos equivalentes. O circuito apresentado na Figura 46 apresentou melhor
ajuste com os resultados experimentais. Este modelo considera a resistência da solução,
RΩ, em série com a interface, constituída de um elemento de fase constante CPE em
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 118
paralelo com uma resistência de transferência de elétrons, Rct. A impedância ZCPE (F.
cm-2. sn-1) é definida na Equação (4.2), onde ω é a freqüência (rad/s), Q (µF.cm-2) é
uma constante que reflete simultaneamente as propriedades das superfícies e das
espécies eletroativas e é diretamente proporcional a capacitância. O caráter de ZCPE
depende dos valores do expoente n [71], que se encontram no intervalo de -1 a 1,
apresentando um caráter capacitivo para n=1, resistivo para n=0, indutivo para n=-1 e é
a impedância de Warburg para n=1/2. Este parâmetro pode ser facilmente extraído
através da inclinação dos dados do gráfico de log(|Z|) versus o log(f) [71].
( )nCPEQ
-
ω=
jZ (4.2)
RΩ
Rct
CPE
Figura 46: Circuito equivalente à interface eletrodo/proteína/solução.
Para ilustrar a qualidade do ajuste obtido com o circuito acima (Figura 46), são
apresentados os resultados para as interfaces Au/NaCl, Au/ConA-desativada/NaCl e
Au/ConA-ativada/NaCl na Figura 47. Observa-se que a utilização do modelo possibilitou
um ótimo ajuste para todas as interfaces estudadas, com exceção da região de alta
freqüência. No entanto, isto não afeta a análise dos resultados, uma vez que esta região
não traz informações sobre a presença da proteína adsorvida.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 119
101 102 1030
10
20
30
40
50
60
70
80
90
f (Hz)
φ (
grau
s)
Figura 47: Ajuste utilizando o modelo apresentado na Figura 48, sendo () a interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl, () interface Au/ConA-ativada/NaCl e (____) são os ajustes, nas respectivas cores das interfaces. Experimento realizado em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C e pH 5,5. Gráfico registrado na região de 9 a 3000 Hz para uma melhor visualização.
A adsorção da proteína, em ambas configurações, também foi avaliada em
função do potencial aplicado durante o processo de adsorção, com o intuito de averiguar
o potencial no qual a proteína apresenta uma melhor adsorção (Figura 48). Para cada
interface estudada, foram aplicados potenciais na faixa de -100 mV à 400 mV vs.
Ag/AgCl, KCl sat. a intervalos de 50 mV, determinada em função dos resultados
obtidos por voltametria cíclica (seção 4.3.1).
0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
Yre (S)
Yim
(S)
0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
Yre (S)
Yim
(S)
(a) (b)
Figura 48: Gráficos de admitância, para a interface (a) Au/ConA-desativada/NaCl, (b) Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 120
Os gráficos de admitâncias apresentados na Figura 48 evidenciam que houve
mudanças significativas ao variar o potencial no processo de adsorção da Concanavalina
A, em ambas configurações. Observa-se na Figura 48b uma interface com a proteína
ativada, em que os potenciais –0,10 e -0,05 V comportam-se de maneira muito diferente
dos demais, provavelmente devido a algum erro durante a execução, logo, esses
potenciais negativos serão desprezados na análise desse gráfico. Pode-se observar que a
interface Au/ConA-desativada/NaCl, em todos os potenciais apresentou valores de
admitância menores quando comparado com o sistema Au/ConA-ativada/NaCl, com
exceção dos potenciais +0,20 e +0,35V.
Através dos gráficos de Bode (Figuras 49), não é possível distinguir facilmente o
comportamento da proteína em diferentes potenciais, mas apenas que a proteína, na
forma ativada, sofre um aumento mais rápido no ângulo de fase na região de alta
freqüência, porém, apresenta um φ menor, quando comparada com a proteína
desativada. Este aumento mais intenso na região de alta freqüência e um menor valor do
ângulo de fase, podem ser relacionados a uma menor resistência (Rct) e capacitância (Q)
apresentada pela interface.
A Figura 50 apresenta os parâmetros extraídos do ajuste com o modelo de
circuito equivalente.
101 102 103 104
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
f (Hz)
φ (
grau
s)
101 102 103 104
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
φ (g
raus
)
f (Hz)
(a) (b)
Figura 49: Gráficos de Bode, para a interface (a) Au/ConA-desativada/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 121
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,46,0x104
9,0x104
1,2x105
1,5x105
1,8x105
6,6x106
6,6x106
6,7x106R
ct (
ohm
s)
E (V)
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,43,0x10-7
6,0x10-7
9,0x10-7
1,2x10-6
1,5x10-6
1,8x10-6
2,1x10-6
Q (
µF.c
m-2
)
E (V)
(a) (b)
Figura 50: Parâmetros (a) Rct e (b) Q, versus potencial (E) aplicado durante a etapa de adsorção, para as interfaces () Au/ConA-desativada/NaCl, () Au/ConA-ativada/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.
Os valores de Rct (Figura 50a) extraídos permitem avaliar o efeito do potencial
aplicado durante a etapa de adsorção, sobre os resultados de impedância. Uma análise
geral desse gráfico indica que os valores obtidos para Rct da interface Au/ConA-
desativada/NaCl foram maiores em todos os potenciais aplicados, quando comparados
aos valores de Rct da proteína ativada, inclusive nos potenciais +0,20 e +0,35 V, em que
não foi possível ser observado essa tendência no gráfico de admitância da Figura 49.
Portanto, torna-se claro a necessidade do ajuste com base em um circuito equivalente na
interpretação dos resultados. Pode-se observar também que ambas interfaces apresentam
um comportamento com dois máximos. Um na região de –0,10 a +0,15 V e outro na
região de +0,25 a +0,35 V. O segundo máximo é sutil para a proteína ativada e bastante
acentuado para a proteína desativada. Os valores de Q (Figura 50b) oscilam bastante e
não apresentam uma tendência clara. Uma vez que o valor de Rct pode ser associado à
adsorção da proteína, pode-se dizer que a tendência de adsorção é maior para potenciais
mais positivos, o que sugere a presença de cargas negativas na proteína, nas áreas de
interação com a superfície do eletrodo de filme fino de ouro.
Como já mencionado anteriormente, as medidas de impedância em que foram
aplicados potenciais, durante a adsorção da proteína ao eletrodo, foram realizadas em
um potencial aplicado igual ao potencial de circuito aberto. Portanto, de maneira
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 122
análoga pode-se tentar estabelecer uma correlação do ECA obtido durante a medida de
impedância. A Figura 51 apresenta o gráfico de admitância para o filme de ouro limpo e
para o filme modificado com a Concanavalina A nas configurações desativada e
ativada. As curvas para as interfaces Au/ConA-desativada/NaCl e Au/ConA-
ativada/NaCl apresentam um valor menor de Yre e Yim, quando comparadas com a
interface Au/NaCl. Ao avaliar este comportamento, é possível inferir que tanto Yim
(componentes capacitivos) como Yre (componentes resistivos) dos sistemas foram
mudados, sendo esta mudança observada com mais intensidade para a interface com a
Concanavalina A na configuração desativada, lembrando-se que um decréscimo nos
valores de Yre e Yim significa um aumento da resistência e diminuição da capacitância,
respectivamente.
0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
Yre (S)
Yim
(S)
Figura 51: Gráfico de admitância, onde () é a interface Au/NaCl 0,15 M, () Au/ConA-desativada/NaCl e () Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.
A Figura 52 ilustra os parâmetros Rct, Q e n, em função do potencial de circuito aberto aplicado durante a medida de impedância apresentada na Figura 51.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 123
-0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,086,0x104
9,0x104
1,2x105
1,5x105
1,8x105
6,6x106
6,6x106
6,7x106
Rct (
ohm
s)
ECA (V)-0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,08
3,0x10-7
6,0x10-7
9,0x10-7
1,2x10-6
1,5x10-6
1,8x10-6
2,1x10-6
Q (
µF.c
m-2
)
ECA (V)
(a) (b)
-0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,088,1x10-1
8,4x10-1
8,7x10-1
9,0x10-1
9,3x10-1
9,6x10-1
n
ECA (V)
(c)
Figura 52: Parâmetros (a) Rct, (b) Q e (c) n, versus potencial de circuito aberto (ECA) aplicado durante a medida de impedância, para as interfaces () Au/ConA-desativada/NaCl, () Au/ConA-ativada/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.
Na análise dos resultados da Figura 52a, nota-se-se que os valores de Rct para a
interface Au/ConA-ativada/NaCl, apresentam uma tendencia de queda a medida em que
os potencias tornam-se mais positivos. Como a proteína na configuração ativada possui
cátions metálicos divalentes (Mn2+, Ca2+ e Mg2+) ligados aos seus aminoácidos, ela deve
apresentar uma carga mais positiva, quando comparada com a sua configuração
desativada. Portanto, o potencial de circuito aberto assumido pelo sistema, quando
ocorre a maior adsorção da proteína (maiores valores de Rct), é mais negativo, o que é
justificado pela carga mais positiva na proteína ativada. As interfaces Au/NaCl e
Au/ConA-desativada/NaCl, não apresentam uma tendência clara, contudo, observa-se
um agrupamento dos seus valores de Rct em ECA mais positivos Nota-se que a ConA
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 124
desativada assumiu um intervalo de potencial de circuito aberto menor e mais positivo
em relação a sua configuração ativada. Isto reforça as diferenças de cargas entre as duas
formas de proteína, já que a proteína desativada deve apresentar cargas mais negativas
em relação à proteína ativada. Além disso, verifica-se que a interface ConA desativada
apresentou valores de Rct maiores, em seus ECA, quando comparada a proteína ativada.
Este fato pode ser relacionado a uma maior dificuldade na transferência de elétrons na
interface, causada pela presença da proteína, sendo este bloqueio maior para a
Concanavalina A desativada do que em sua configuração ativada. Comportamento
semelhante foi observado para adsorção de Concanavalina A em eletrodo de platina
[70]. O bloqueio da interface é atribuído à quantidade de proteína adsorvida.
Ambas as configurações da proteína apresentam Q e n (Figuras 52b e 52c)
crescente com o potencial da interface estabelecido. O mesmo comportamento é
observado para interface Au/NaCl 0,15 M. Contudo, no caso da solução salina, o ânion
Cl- é quem deve adsorver. Isso ocorre porque os ânions são fracamente solvatados pelas
moléculas de H2O, devido aos seus raios maiores, quando comparados com os cátions
(quanto menor o raio ou a valência do íon, mais positiva será a energia de solvatação -
∆Gi-sΦ). Conseqüentemente, o ânion consegue chegar mais próximo do eletrodo e perder
a sua camada de solvatação para interagir diretamente com a superfície do eletrodo, ou
seja, adsorvendo. Portanto, pode-se concluir a existência de cargas negativas na proteína
e uma dupla camada mais compacta com potenciais mais positivos. Deste modo, a
presença da ConA, independente da forma, promove uma dispersão heterogênea na
capacitância [71].
A dispersão pode estar relacionada com a natureza do eletrodo e/ou a
distribuição de tempos de relaxação, quando não há homogeneidade da interface [68]. O
tempo de relaxação depende da cinética do deslocamento das cargas que estabelecem a
polarização do meio, logo, a relaxação provoca no meio uma queda da polarização
induzida, isto é, reduz o deslocamento da carga positiva em relação à carga negativa no
dielétrico. Portanto, com base nessa dispersão, a análise dos dados foi realizada em
função do elemento de fase constante CPE (Equação 4.2), que representa estes
fenômenos físico-químicos [68, 71], além de substituir a capacitância da dupla camada.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 125
4.4.2 Resultados utilizando a técnica de SPR
Com o intuito de verificar os resultados obtidos pela EIS, foram realizadas
análises utilizando-se a técnica de Ressonância de Plásmons de Superfície, acoplada ou
não ao sistema eletroquímico, como caracterização.
4.4.2.1 Análise em potencial de circuito aberto
De acordo com a Figura 53, a adsorção da Concanavalina A, em ambas as
formas e em ECA, também pôde ser detectada por SPR. Pode-se observar claramente o
deslocamento dos picos de absorção (θPS), no sentido positivo, ao se adicionar a
proteína ao sistema Au/NaCl. Como já discutido anteriormente, o deslocamento do
ângulo de plásmons está relacionado à mudança da permissividade elétrica e do índice
de refração do meio adjacente ao filme. Conseqüentemente, o crescimento no valor do
θPS nas interfaces com a proteína está relacionado com o aumento do índice de refração
do meio adjacente, que deixou de ser a solução salina (n=1,332) para ser a proteína
(n=1,5) [171].
68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ref
letiv
idad
e
θPS
(graus)
Figura 53: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para () interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl e () interface Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto, 25° C e pH 5,5.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 126
A Tabela 8 fornece os valores experimentais obtidos das curvas de SPR da
Figura 53. Pode-se examinar que houve um aumento sutil no θPS para a interface ConA
desativada, em relação a ConA ativada. Mas, como a diferença é pequena, não se pode
afirmar, somente com este parâmetro, que a Concanavalina A desativada adsorveu mais
que a ConA ativada. Contudo, analisando os dados do θPS em conjunto com a largura
angular dos picos de absorção e com os resultados obtidos pela EIS, pode-se afirmar
com mais clareza que a Concanavalina A desativada adsorveu mais prontamente que a
ConA ativada, em potencial de circuito aberto.
Tabela 8: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 53.
Interface Intensidade (u.a)
Largura angular (°)
Ângulo de plásmons (°)b
Au/NaCla 0,040 2,90 72,70 ± 0,01
Au/ConA-desativada/NaCla
0,035 3,46 74,30 ± 0,02
Au/ConA-ativada/NaCla 0,047 3,40 74,10 ± 0,01 a Média de três experimentos
b Intervalo de confiança de 95 %.
Esses resultados confirmam que a ativação da proteína, pelos cátions metálicos,
torna-a mais ordenada estruturalmente que a configuração sem íons [36, 43, 111-113].
Portanto, a proteína ativada difere da desativada no sentido da orientação dos
aminoácidos em torno dos cátions. Com isto, pode-se afirmar que a proteína desativada
possui um maior número de grupos livres capazes de interagir com a superfície do
eletrodo de ouro [164]. E ainda, conforme citado em literatura [50-59], acredita-se que a
proteína esteja recobrindo toda a área do eletrodo. Portanto, quando a ConA se encontra
na forma desativada, há a formação de um maior número de camadas do que quando
ela está na forma ativada, isto se a adsorção ocorrer com a mesma orientação para as
duas condições.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 127
4.4.2.2 Análise em diferentes potenciais
A análise do efeito da ativação da proteína ConA em diferentes potenciais é
exibida na Figura 54. Percebe-se nitidamente o crescimento do ângulo de plásmons a
medida em que o potencial torna-se mais positivo. Este resultado torna inteligível que a
proteína adsorve mais quando existe um grande contraste entre a carga da mesma e da
superfície. De maneira análoga, Schlereth e colaboradores [159], caracterizaram por
voltametria cíclica acoplada a SPR a obtenção de monocamadas de citocromo-c e
citocromo-c oxidase adsorvidas em superfícies modificadas de ouro. Neste trabalho, os
autores evidenciaram que as hemoproteínas adsorvem em maior quantidade em
potenciais mais positivos.
Similarmente, Moulton e colaboradores [68] verificaram que as proteínas
humanas, soro albumina (HSA) e imunoglobulina G (Ig.G) adsorvem mais facilmente
em superfícies de eletrodos de ouro, quando submetidas a potenciais mais positivos ou
em potenciais de circuito aberto. Os autores relacionaram o aumento da camada
adsorvida ao decréscimo da capacitância da dupla camada (Cd) e ao crescimento do
valor da resistência, à transferência de elétrons (Rct) determinados.
68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ref
letiv
idad
e
θPS
(graus)
68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ref
letiv
idad
e
θPS
(graus)
(a) (b)
Figura 54: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para (a) interface Au/ConA-desativada/NaCl e (b) interface Au/ConA-ativada/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 128
O gráfico da Figura 55 apresenta o resumo do ângulo de plásmons em função do
potencial aplicado para as interfaces Au/NaCl, Au/ConA-desativada/NaCl e Au/ConA-
ativada/NaCl. Através deste gráfico, verifica-se com mais clareza a relação entre a carga
da proteína com o potencial aplicado. Percebe-se que, entre os potenciais mais negativos
(-0,10 a 0,05 V), a Concanavalina A ativada adsorve mais do que a configuração
desativada, ou seja, devido aos cátions metálicos em sua estrutura, a ConA ativada
apresenta uma carga mais positiva. Deste modo, verifica-se que a proteína na
configuração desativada, submetida a potenciais mais positivos, adsorve mais que na
forma ativada. Além disso, observa-se um aumento sutil do θPS para a interface que
contém somente a solução salina, confirmando uma pequena adsorção dos íons Cl-.
Essas observações confirmam a análise dos parâmetros extraídos do circuito
equivalente, ilustrados na Figura 52.
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,471
72
73
74
75
76
77
θ PS (
grau
s)
E (V) Figura 55: Ângulo de plásmons em função da variação do potencial (∆E), para () interface Au/NaCl, () interface Au/ConA-desativada/NaCl e () interface Au/ConA-ativada/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto, 25° C e pH 5,5.
Quando comparados os resultados do θPS da ConA desativada com os valores
dos ângulos de plásmons da proteína na mesma forma, porém, submetida a potencial de
circuito aberto, verifica-se que o potencial que se aproxima do ângulo de plásmons
obtido em ECA (74,30°) corresponde, para a mesma interface, ao potencial +0,15 V.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 129
Considerando que se pode estimar a carga do eletrodo através do potencial de
carga zero (PZC), onde o eletrodo terá a sua carga positiva quando for submetido a um
potencial acima do PZC; e, considerando para o eletrodo de ouro o PZC equivalente a
0,117 V vs Ag/AgCl, KCl sat. em uma solução de cloreto de sódio [172], a superfície do
eletrodo no potencial de +0,15 V encontrar-se-á com carga positiva, aumentando a
possibilidade da proteína, que possui carga negativa, de adsorver no filme de ouro.
4.5 Caracterização da interação entre a Concanavalina A adsorvida e açúcares
4.5.1 Resultados de Impedâncias
4.5.1.1 Análise em potencial de circuito aberto
Um dos objetivos desta dissertação foi verificar se a Concanavalina A, em
ambas as configurações, quando adsorvida ao eletrodo, permanecia com a capacidade
de seletividade e especificidade, ou seja, com a capacidade de reconhecer carboidratos e
distinguí-los. Deste modo, verificou-se se a ConA adsorvida ao eletrodo interagia com
os açúcares glicogênio e galactose, recordando que a ConA não é específica a esse
último carboidrato.
O monitoramento da reação lectina-carboidrato através de um biosensor
impedimétrico se dá freqüentemente pelo acompanhamento do parâmetro capacitância.
Contudo, outros componentes impedimétricos também podem ser monitorados. No
processo de caracterização da interação entre a ConA adsorvida e açúcares, a resistência
e a capacitância foram os parâmetros que se mostraram mais eficientes.
Através do gráfico de admitância apresentado na Figura 56, verifica-se que a
interface Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl apresentou um Yre menor, quando
comparado com as demais interfaces, apresentando, dessa forma, uma maior resistência
à passagem de elétrons devido à presença da proteína na superfície do eletrodo. Nota-se
que a ConA ativada não interagiu com a galactose, pois o seu Yre foi maior que os das
interfaces Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl e Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 130
que o seu valor foi próximo ao obtido na análise da seção 4.4.1. Além disso, percebe-se
que a ConA ativada interagiu mais com o glicogênio que a ConA desativada.
0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
Yre (S)
Yim
(S)
Figura 56: Gráfico de admitância, onde () é a interface Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl 0,15 M, () Au/ConA-ativada/galactose/NaCl e () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas em potencial de circuito aberto (ECA), 25° C, pH 5,5.
Para uma melhor quantificação dos resultados, foi realizado o ajuste, utilizando-
se o circuito ilustrado na Figura 48. Os respectivos ajustes para o sistema ConA ativada
e desativada interagindo com o glicogênio são apresentados na Tabela 9.
Tabela 9: Parâmetros extraídos da modelagem de circuitos equivalentes dos resultados da interação entre a Concanavalina A adsorvida e açúcares por EIS.
Parâmetros Eletrodo sem proteínaa
Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCla
Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCla
RΩ (kΩ) 0,430 ± 0,032 0,513 ± 0,019 0,495 ± 0,070
Rct (kΩ) 92,291 ± 0,001 126,0 ± 25,030 117,655 ± 15,311
Q (µF.cm-2) 1,122 ± 0,084 0,851 ± 0,197 0,768 ± 0,064
n 0,934 ± 0,004 0,922 ± 0,013 0,938 ± 0,032 a Média de dois experimentos. Nota: intervalo de confiança de 95 %.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 131
Na análise dos resultados da Tabela 9, observa-se que os valores de Rct das
interfaces Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl
aumentaram 28% e 37%, respectivamente, em relação ao valor de Rct do eletrodo limpo
(Au/NaCl). Este aumento reflete a maior dificuldade na transferência de elétrons na
interface, causada pela presença da proteína ligada ao açúcar, sendo este bloqueio maior
para a interface Au/ConA-ativada/glicogênio do que em sua configuração desativada. O
bloqueio da interface é atribuído à quantidade de glicogênio ligado a Concanavalina A
adsorvida ao eletrodo.
Além da variação de Rct, observa-se uma diminuição no valor de Q ao se passar
do sistema com proteína ativada/glicogênio para com proteína desativada/glicogênio.
Esses dados confirmam a análise do parâmetro Q da Figura 52b (seção 4.4.1), ou seja, a
presença dos cátions metálicos confere uma forma mais compacta à Concanavalina A na
configuração ativada, aumentando o número de interações entre a proteína ativada e o
carboidrato. Conseqüentemente, uma maior quantidade de glicogênio liga-se aos sítios
da proteína, localizados em uma depressão no topo da superfície de cada subunidade.
Também se pode observar uma diminuição no valor de n quando adicionado o
açúcar ao eletrodo com a proteína adsorvida, sendo a diminuição maior para o sistema
Au/ConA-ativada/glicogênio. Pode-se deduzir que, com a diminuição do valor de n, a
interface passa a ser menos capacitiva, indicando um aumento na resistência à
transferência de elétrons entre a solução e o eletrodo de ouro.
Esses resultados mostram que a ativação da proteína com os íons metálicos é de
fato importante para o reconhecimento dos carboidratos e que a Concanavalina A reteve
a sua capacidade de reconhecimento, mesmo após adsorvida ao eletrodo de filme de
ouro.
4.5.1.2 Análise em diferentes potenciais
Os resultados da execução de ambas configurações da ConA, em diferentes
potenciais, frente a carboidratos, podem ser verificados pelo gráfico de admitância na
Figura 57. Observa-se uma maior variação dos valores de admitância para a interface
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 132
ConA-desativada/glicogênio/NaCl, quando comparada com a interface ConA-
ativada/glicogênio/NaCl, ao se variar o potencial. Nota-se que houve uma inversão ao
adicionar o glicogênio, em ambas interfaces, quando se comparam as Figuras 48 e 57,
pois, após a adição do glicogênio, a interface com a proteína ativada passou a variar
menos e a interface com a proteína desativada passou a ter uma maior variação. na
admitância.
0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
Yim
(S)
Yre (S)
0,0 5,0x10-4 1,0x10-3 1,5x10-3 2,0x10-3 2,5x10-3 3,0x10-3
0,0
5,0x10-4
1,0x10-3
1,5x10-3
2,0x10-3
2,5x10-3
Yre (S)
Yim
(S)
(a) (b)
Figura 57: Gráfico de admitância, para a interface (a) Au/ConA-desativada/Glicogênio/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/Glicogênio/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.
Na Figura 58, relaciona-se Rct com o potencial aplicado durante o processo de
adsorção da Concanavalina A no eletrodo de filme fino de ouro, seguida pela interação
com glicogênio. Uma análise geral indica que os valores obtidos para Rct da interface
Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl foram maiores em todos os potenciais aplicados,
quando comparados aos valores de Rct da proteína na configuração desativada,
comprovando que, em potenciais mais positivos, a Concanavalina A desativada adsorve
mais, porém, é a ConA ativada que reconhece de maneira mais eficaz o glicogênio.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 133
Verifica-se também, uma redução nos valores de Rct da interface com a proteína
desativada, em potenciais mais positivos. Esta redução no valor de Rct pode ser
ocasionado por uma menor ordenação das camadas de ConA desativada adsorvidas, a
medida que o potencial torna-se mais positivo, o que dificultaria a interação com o
açúcar. Os valores de Q (Figura 58b) variam bastante e não apresentam uma tendência
clara.
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,46,0x104
9,0x104
1,2x105
1,5x105
1,8x105
2,1x105
2,4x105
2,7x105
E (V)
Rct (
ohm
s)
-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,43,0x10-7
6,0x10-7
9,0x10-7
1,2x10-6
1,5x10-6
1,8x10-6
2,1x10-6
Q (
µF.c
m-2
)
E (V)
(a) (b)
Figura 58: Parâmetro Rct (a) e Q (b) versus potencial (E) aplicado, para as interfaces () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl e () Au/NaCl. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.
4.5.2 Resultados utilizando a técnica de SPR
4.5.2.1 Análise em potencial de circuito aberto
De acordo com os resultados da Ressonância de Plásmons de Superfície (Figura
59), o θPS para a interface Au/ConA-desativada/galactose/NaCl, foi de 74,20°, igual ao
obtido para a interface Au/ConA-ativada/galactose/NaCl. Portanto, ambas
configurações da ConA não interagiram com a galactose. O ângulo de plásmons para a
interface Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl foi de 75,52°, enquanto da interface
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 134
Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl foi igual a 75,92°. Logo, confirmando os resultados
obtidos por EIS, a interface com a proteína ativada interagiu mais eficazmente com o
glicogênio, em relação à proteína desativada. Portanto, a Concanavalina A adsorvida
manteve sua especificidade e seletividade frente a carboidratos. O resumo dos dados
experimentais é exibido na Tabela 10.
68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ref
letiv
idad
e
θPS (graus)
Figura 59: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para a interface () Au/ConA-desativada/galactose/NaCl, ()Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl, () Au/ConA-ativada/galactose/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas em ECA, a 25° C e pH 5,5.
Tabela 10: Parâmetros experimentais extraídos das curvas do gráfico da Figura 59.
Interface Intensidade (u.a)
Largura angular (°)
Ângulo de plásmons (°)b
Au/ConA-desativada/galactose/NaCla
0,06 3,30 74,20 ± 0,01
Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCla
0,07 4,05 75,52 ± 0,03
Au/ConA-ativada/galactose/NaCla 0,051 3,49 74,20 ± 0,01
Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCla
0,076 4,22 75,92 ± 0,02
a Média de três experimentos b Intervalo de confiança de 95 %.
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Raimundo Rômulo Martins Júnior 135
4.5.2.2 Análise em diferentes potenciais
Verificou-se na seção 4.4.2.2, que a proteína na configuração desativada adsorve
mais facilmente a superfície do eletrodo ao se variar o potencial para valores mais
positivos. Porém, a Figura 60 mostra que, ao se variar o potencial para valores mais
positivos, é a forma ativada que interage com o glicogênio mais eficazmente. A Figura
61 apresenta o resumo do ângulo de plásmons em função do potencial aplicado. A partir
deste gráfico, pode-se confirmar mais uma vez os dados obtidos pela EIS, ou seja, a
proteína na configuração ativada submetida a potenciais mais positivos, reconhece mais
facilmente o glicogênio do que a sua forma desativada.
68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 820,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ref
letiv
idad
e
θPS
(graus)68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Ref
letiv
idad
e
θPS
(graus)
(a) (b)
Figura 60: Curvas experimentais de SPR na configuração de Kretschmann para (a) interface Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e (b) Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl, em diferentes potenciais: () E = -0,10 V, () E = -0,05 V, () E = 0,00 V, () E = +0,05 V, () E = +0,10 V, () E = +0,15V, (♦) E = +0,20 V, () E = +0,25 V, () E = +0,30 V, () E = +0,35 V e () E = +0,40 V. Medidas realizadas a 25° C, pH 5,5.
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-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,471
72
73
74
75
76
77
78
θ PS (
grau
s)
E (V)
Figura 61: Ângulo de plásmons em função da variação do potencial (∆E), para interface () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5.
4.6 Evolução temporal da refletividade
De posse das curvas de ressonância medidas para várias interfaces, foram
realizadas observações em tempo real da reação lectina-carboidrato, semelhante à
interação antígeno-anticorpo. O procedimento experimental para a realização de
medidas de SPR em meios biológicos inicia com a criação de um protocolo sistemático
visando determinar uma seqüência de 4 fases, que devem ser adotadas durante o
experimento em tempo real. A Fase 1 compreende a adição da ConA fornecendo uma
concentração final de 200 µg/mL; após atingido um regime permanente, inicia-se
novamente um processo de lavagem da célula (Fase 2). Na Fase 3, acrescenta-se o
glicogênio e continua-se com o processo de monitoramento da refletividade em função
do tempo. Finalmente, na Fase 4, repete-se o procedimento de lavagem da célula. Para
maiores detalhes ver a seção 3.8.2.1 do capítulo sobre materiais e método.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 137
De acordo com a literatura [114-116, 142-149], a proteína desativada forma um
maior número de camadas na superfície do filme do que quando está na forma ativada.
Portanto, na Figura 62, a ConA na configuração ativada, por adsorver menos, ocasiona
uma menor variação da refletividade, pois não provoca grandes modificações nas
propriedades dielétricas do filme. A proteína desativada, por adsorver mais, provoca
maiores mudanças nas propriedades dielétricas do filme, acarretando uma maior
variação da refletividade. Porém, ao adicionar o glicogênio, a interface com a
Concanavalina A ativada adsorve mais que a interface com a ConA desativada, fato este
já discutido anteriormente.
0 20 40 60 80 100 120 140
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10Fase 4
Fase 3
Fase 2
Fase 1
Var
iaçã
o da
Ref
letiv
idad
e
Tempo (min)
Figura 62: Cinética da reação lectina-carboidrato para uma solução com concentração final de 200mg/mL. Interfaces: () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 138
4.7 Estabilidade do Sistema EIS-SPR
Com base na variação do θPS, verificou-se a estabilidade do sistema EIS-SPR. A
Figura 63a mostra que a estabilidade de operação do sistema EIS-SPR foi de apenas três
dias, pois, a partir do quarto dia, iniciou-se uma variação do ângulo de plásmons em
todas as três interfaces. Porém, através do ângulo relativo em função do tempo, Figura
63b, foi possível verificar que a interface Au/NaCl é a que se manteve mais estável pelo
período de sete dias. A interface Au/ConA-ativada/Glicogênio foi a que sofreu maior
alteração no valor do ângulo de plásmons.
Percebe-se ainda que, a interface Au/NaCl é a única em que o seu ângulo de
plásmons foi crescente ao longo dos sete dias. Este fato pode estar relacionado com o
aumento da concentração de íons na solução, devido à evaporação da solução, e
conseqüentemente aumentando a adsorção de íons Cl- no eletrodo, que por sua vez
ocasiona o aumento do índice de refração, logo, aumenta o valor de θPS.
0 1 2 3 4 5 6 7 872
73
74
75
76
77
θ PS
(gr
aus)
Dia
0 1 2 3 4 5 6 7 897
98
99
100
101
102
103
Âng
ulo
rela
tivo
(%)
Dia
Figura 63: Estabilidade do sensor EIS-SPR. (a) variação do ângulo de plásmons em função do tempo e (b) ângulo relativo em função do tempo. Interfaces: () Au/NaCl, () Au/ConA-desativada/glicogênio/NaCl e () Au/ConA-ativada/glicogênio/NaCl. Medidas realizadas a 25° C e pH 5,5.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo IV
Raimundo Rômulo Martins Júnior 139
Nas interfaces com a proteína adsorvida, verifica-se que o ângulo de plásmons
diminui em função do tempo. Este resultado indica que a proteína adsorvida e ligada ao
carboidrato deve sofrer algum tipo de desnaturação em função do tempo, devido a uma
possível modificação do pH e da força iônica da solução, lembrando que o pH é
responsável por controlar as repulsões laterais entre as proteínas e/ou provocar a
desnaturação das mesmas [54]. Com a evaporação significativa da solução no interior
da célula, conseqüentemente, a solução salina ficou mais concentrada. Sabe-se que os
sais desidratam as proteínas, atraindo as moléculas de água do meio, de modo a ficar
menos água disponível para as moléculas protéicas. Portanto, além da alteração do pH, a
força iônica da solução foi alterada. Logo, essas mudanças em conjunto contribuíram
para uma degradação da interface lectina/carboidrato.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo V
Raimundo Rômulo Martins Júnior 140
CAPÍTULO V
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
5.1 CONCLUSÕES
As técnicas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica juntamente com a
técnica de Ressonância de Plásmons de Superfície, aqui apresentadas, permitem a detecção
da presença de proteína na superfície do eletrodo de filme fino de ouro, além de diferenciar
as duas configurações da proteína Concanavalina A. A EIS detecta a proteína através da
variação da impedância do sistema, que possibilita uma distinção quanto à sua natureza de
bloqueio, possibilitando uma descrição mais detalhada da superfície. Um perfil de adsorção
pode ser obtido pela técnica de SPR através do monitoramento do ângulo de plásmons no
qual ocorre a ressonância, durante um processo de adsorção em função do tempo.
Desta forma, a aplicação conjunta da EIS e SPR constitui uma poderosa ferramenta
no estudo de um grande número de propriedades relacionadas aos processos interfaciais e
superficiais, de forma a implicar maior confiabilidade às investigações desses processos.
Essas técnicas apresentam-se promissoras para aplicação, tanto em configurações
individuais como de forma conjunta ou mesmo simultânea, in situ dos sistemas
investigados.
A reação lectina-carboidrato quando monitorada por um biosensor impedimétrico é
realizada, em geral, pela detecção da capacitância, contudo outros componentes
impedimétricos também podem ser usados, seja de forma separada ou em conjunto. Neste
trabalho, o parâmetro resistência foi o que melhor caracterizou a adsorção da ConA e sua
interação com carboidratos.
Através da EIS e SPR foi possível identificar uma maior adsorção da proteína na
forma desativada sobre a superfície do eletrodo de ouro e que, quando o glicogênio foi
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Capítulo V
Raimundo Rômulo Martins Júnior 141
exposto sobre a superfície com proteína desativada e ativada, percebeu-se que a proteína na
forma ativada era mais sensível ao glicogênio. Esses resultados mostram que a ativação da
proteína com os cátions metálicos são de fato importantes para o reconhecimento do
carboidrato. A proteína (em ambas as formas) reteve a sua capacidade de seletividade (não
reconheceu a galactose), mesmo adsorvida na superfície do eletrodo.
É importante ressaltar que o sucesso obtido nas análises se deve, em parte, a
excelente qualidade dos eletrodos de filmes finos de ouro confeccionados através da técnica
de evaporação por baixa pressão, visto que análises do filme por AFM, voltametria cíclica e
SPR produziram resultados satisfatoriamente concordantes.
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Raimundo Rômulo Martins Júnior 142
5.1. PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos com os estudos impedimétricos e por SPR do sistema filme
fino de ouro/proteína trouxeram uma série de informações quanto a adsorção da
Concanavalina A. No entanto, em um próximo desenvolvimento dessa linha de pesquisa,
seria importante obter e confrontar alguns resultados utilizando-se outras técnicas. Por
exemplo, utilizar a Microbalança de Cristal de Quartzo (QCM) e a Microscopia de Força
Atômica para obter a espessura da camada protéica adsorvida e também se a ativação altera
a conformação da proteína.
A adsorção da Concanavalina A foi observada em ouro, porém, também seria
importante verificar se esse comportamento é semelhante para o metal prata, já que é
possível obter espectros de SPR com filmes de prata, o que reduziria o custo de análise.
Verificar se a Concanavalina A quando adsorvida sobre o filme de ouro consegue
interagir com outros carboidratos, como por exemplo, glicose.
Finalmente, é importante que seja implementado um sistema de fluxo laminar de
reagentes na célula EIS-SPR e incorporado um sistema automático de varredura do prisma,
controlado por computador, de forma a permitir o monitoramento simultâneo de várias
reações. Tornando, dessa forma, as análises mais sensíveis, seletivas e principalmente mais
estáveis.
Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Referências
Raimundo Rômulo Martins Júnior 143
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Raimundo Rômulo Martins Júnior 155
Mestrado – Programa de Pós-graduação, Departamento de Engenharia Elétrica, Universidade Federal de Pernambuco.
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Eletroquímica Acoplada a SPR no Estudo de Adsorção de Proteína em Filme Fino Referências
Raimundo Rômulo Martins Júnior 156
Apêndice A
Código Mathematica para Cálculo do Ângulo de Plásmons, Utilizando a Configuração de Kretschmann, da Interface Ouro/Ar
Programa ângulo de ressonância e refletância mínima Parâmetros utilizados: Índice de refração do prisma: n(670 nm) = 1,516 Permissividade elétrica do filme de ouro [11]: ε = - 10,333 -j1,685 Código escrito: