Post on 19-Jul-2020
Gisele Macêdo Rodrigues da Cunha
Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças
com infecção assintomática por Leishmania
(Leishmania) infantum
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG
Instituto de Ciências Biológicas - ICB
Programa de Pós - Graduação em Parasitologia
Belo Horizonte - MG
Fevereiro - 2015
Gisele Macêdo Rodrigues da Cunha
Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças
com infecção assintomática por Leishmania
(Leishmania) infantum
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG
Instituto de Ciências Biológicas - ICB
Programa de Pós - Graduação em Parasitologia
Belo Horizonte - MG
Fevereiro - 2015
Dissertação apresentada ao programa de
Pós - Graduação em Parasitologia do
Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais,
como requisito parcial à obtenção do
título de Mestrado em Parasitologia.
Área de concentração: Epidemiologia de
Doenças Infecciosas e Parasitárias
Orientador: Dra. Mariângela Carneiro -
ICB/UFMG
Co-Orientador: Dra. Vanessa Peruhype
Magalhães Pascoal - CPqRR/FIOCRUZ
043
Cunha, Gisele Macêdo Rodrigues da Estudo de biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática por Leishmania (Leishmania) infantum [manuscrito] / Gisele Macêdo Rodrigues da Cunha. – 2015.
117 f. : il. ; 29,5 cm.
Orientador: Mariângela Carneiro. Co-orientador: Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas.
1. Leishmaniose visceral - Teses. 2. Resposta imune – Teses. 3. Citocinas – Teses. 4. Infecção assintomática. 5. Biomarcadores. 6. Parasitologia – Teses. I. Carneiro, Mariângela. II. Pascoal, Vanessa Peruhype Magalhães. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. IV. Título.
CDU: 576.88/.89
Equipe Colaboradora:
Dra. Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal - Pesquisadora do Laboratório de
Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração do Centro de Pesquisas René Rachou
(FIOCRUZ/MG).
Dr. Edward Oliveira - Pesquisador do Laboratório de Pesquisas Clínicas do Centro de
Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ/MG).
Dr. Marcelo Antônio Pascoal Xavier - Pesquisador do Departamento de Anatomia
Patológica e Medicina Legal da Faculdade de Medicina (UFMG).
Dra. Ana Rabello - Pesquisadora e chefe do Laboratório de Pesquisas Clínicas do
Centro de Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ/MG).
Iara Caixeta M. Rocha - Doutoranda do Programa de Pós - Graduação em Parasitologia
do Instituto de Ciências Biológicas (UFMG).
Letícia Helena Marques dos Santos - Doutoranda do Programa de Pós - Graduação em
Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas (UFMG).
Thaís Almeida Marques da Silva - Doutoranda do Programa de Pós - Graduação em
Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas (UFMG).
Dra. Maria Helena F. Morais - Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte
(SMS).
Apoio Financeiro:
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
MS – Ministério da Saúde
SES/MG - Secretaria de Estado de Saúde - MG
FAPEMIG – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
PPSUS/FAPEMIG – Programa de Pesquisa para o SUS/FAPEMIG
Os ensaios sorológicos, moleculares e imunológicos foram realizados no Laboratório de
Pesquisas Clínicas do Centro de Pesquisas René Rachou (FIOCRUZ/MG), sob a
coordenação da Dra. Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal e do Dr. Edward Oliveira.
Este projeto foi aprovado nos Comitês de Ética em Pesquisa das seguintes instituições:
Universidade Federal de Minas Gerais em 2009 e 2013 (Parecer 253/09; CAAE:
12046113.0.0000.5149), Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ-MG (Parecer
01/2010) e Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte (Parecer 080.2008).
Agradecimentos
A Deus, que ilumina minha vida.
À minha mãe Inez Morais Macêdo Cunha e ao meu pai Marcos Rodrigues da Cunha
pelo incentivo e amor.
Às minhas irmãs Gabriela, Mariana e Janaina e meus tios, primos e avós pelo carinho e
amizade.
Ao André pelo companheirismo, compreensão e amor.
À minha orientadora, Dra. Mariângela Carneiro pela oportunidade de poder desenvolver
este trabalho junto ao seu grupo de pequisa, pela atenção, disponibilidade e
generosidade demonstrada sempre que era preciso de seu auxilio.
À minha co-orientadora Vanessa Peruhype Magalhães Pascoal por ter colaborado para
o desenvolvimento deste trabalho com tanto empenho e dedicação, pelo incentivo e
pelos ensinamentos.
Ao Dr. Edward Oliveira cuja a colaboração e ensinamentos foram muito importantes
para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Dr. Marcelo Antônio Pascoal Xavier pela realização das análises estatísticas.
À Dra. Ana Rabello que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho no Laboratório
de Pesquisas Clínicas do CPqRR-FIOCRUZ e pelo apoio fornecido.
Aos técnicos da Plataforma de Citometria de Fluxo do CPqRR-FIOCRUZ e aos
pesquisadores do Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração do
CPqRR-FIOCRUZ, que me auxiliaram em vários momentos durante a realização dos
meus experimentos.
Aos professores e funcionários da UFMG pelo excelente trabalho prestado, em especial
ao Departamento de Pós – Graduação em Parasitologia, que tornou possível essa
realização.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisas Clínicas do CPqRR-FIOCRUZ pela amizade e
boa convivência.
Aos amigos do Laboratório de Epidemiologia de Doenças Infecciosas e Parasitárias do
ICB – UFMG pela amizade e ajuda sincera durante os trabalhos desenvolvidos juntos.
Aos amigos da turma de Mestrado, pela agradável companhia, pela amizade sincera,
pelos momentos de descontração nesta jornada.
Sumário
Índice de Tabelas...............................................................................................................x
Índice de Figuras..............................................................................................................xi
Resumo...........................................................................................................................xiii
Abstract............................................................................................................................xv
Lista de Abreviaturas.....................................................................................................xvii
1.0 Introdução..................................................................................................................20
1.1 Leishmanioses................................................................................................21
1.2 Leishmaniose Visceral – Agente Etiológico e Epidemiologia......................21
1.3 Manifestações Clínicas e Diagnóstico da Leishmaniose Visceral.................22
1.4 Resposta Imune na Leishmaniose Visceral Humana.....................................29
2.0 Justificativa e Relevância..........................................................................................36
3.0 Objetivo.....................................................................................................................38
3.1Objetivo geral.......................................................................................................39
3.2 Objetivos específicos...........................................................................................39
4.0 Metodologia...............................................................................................................40
4.1 Seleção da população de estudo..........................................................................41
4.2 Coleta de dados e das amostras...........................................................................43
4.3 Fluxograma metodológico...................................................................................44
4.4 Ensaio imunoenzimático de ELISA-AgT e ELISA-rK39...................................45
4.5 Teste de avidez....................................................................................................46
4.6 Ensaios de qPCR..................................................................................................48
4.6.1 Extração de DNA........................................................................................48
4.6.2 PCR quantitativo em tempo real.................................................................48
4.7 Avaliação do perfil sérico de citocinas................................................................49
4.7.1 Quantificação dos níveis séricos de citocinas por citometria de fluxo.......49
4.7.2 Aquisição e análise dos dados de avaliação dos níveis séricos de
citocinas...............................................................................................................50
4.8 Análise dos dados................................................................................................51
4.8.1 Análises descritivas dos dados....................................................................51
4.8.2 Categorização das variáveis para análise multivariada..............................52
4.8.3 Análise de regressão logística.....................................................................53
4.8.4 Análise discriminante.................................................................................54
4.8.5 Árvores de classificação.............................................................................54
5.0 Resultados..................................................................................................................56
5.1 Seleção por meio dos testes sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 e do
ensaio molecular de qPCR de crianças com infecção assintomática por L.
infantum...............................................................................................................57
5.2 Perfil de avidez de anticorpos IgG em crianças com LV assintomática e LV
clássica.................................................................................................................62
5.3 Correlação entre as taxas de avidez de anticorpos IgG com a evolução da
infecção em crianças com LV clássica................................................................62
5.4 Correlação entre os índices de reatividade para ELISA-rK39 e a taxa de avidez
de anticorpos IgG, em crianças que apresentam LV assintomática e LV
clássica.................................................................................................................63
5.5 Perfil sérico da quimiocina CXCL-8, das citocinas pró-inflamatórias, anti-
inflamatórias/moduladoras e IL-17A em crianças com LV assintomática e LV
clássica.................................................................................................................64
5.5.1 Avaliação do perfil sérico da quimiocina CXCL-8 em crianças com LV
assintomática e LV clássica.................................................................................64
5.5.2 Avaliação do perfil sérico de citocinas pró - inflamatórias em crianças com
LV assintomática e LV clássica...........................................................................65
5.5.3 Avaliação do perfil sérico de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras em
crianças com LV assintomática e LV clássica.....................................................66
5.5.4 Avaliação do perfil sérico da citocina IL-17A em crianças com
LVassintomática e LV clássica............................................................................67
5.6 Identificação de biomarcadores imunológicos úteis para a compreensão dos
fatores que determinam o curso da infecção por L.infantum e que possam ter
potencial aplicação para auxiliar na detecção da infecção assintomática............68
5.6.1 Análise de regressão logística.....................................................................68
5.6.2 Análise discriminante.................................................................................70
5.6.3 Árvore de classificação...............................................................................72
6. Discussão.....................................................................................................................74
7.Conclusão.....................................................................................................................87
8. Referências Bibliográficas...........................................................................................89
9. Anexo.........................................................................................................................114
Anexo 1: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)...........................115
x
Índice de Tabelas
Tabela 1 Regras para a categorização de cada variável..........................................52
Tabela 2 Distribuição dos resultados apresentados pelos testes sorológicos
(ELISA-AgT e ELISA-rK39) e pelo ensaio molecular (qPCR)
realizados..................................................................................................57
Tabela 3 Distribuição dos resultados apresentados pelos testes sorológicos de
ELISA- AgT, ELISA-rK39 e pela qPCR, dos pacientes com LV
clássica.....................................................................................................59
Tabela 4 Associação dos resultados apresentados pelas 19 amostras que foram
submetidas aos testes sorológicos de ELISA AgT, ELISA-rK39 e a
técnica de qPCR ......................................................................................59
Tabela 5 Caracterização das crianças identificadas com infecção assintomática
(AS), diagnosticadas com LV clássica (LVC) e residentes das áreas
endêmicas que apresentaram ensaio molecular e testes sorológicos
negativos (CN).........................................................................................60
Tabela 6 Perfil de avidez de anticorpos IgG observado em crianças com infecção
assintomática e clássica por L.infantum..................................................62
Tabela 7 Resultados da análise de regressão logística comparando os grupos AS e
LVC em relação aos preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1...................69
Tabela 8 Resultados da análise de regressão logística associando os grupos AS e
LVC aos preditores TA , IL-17A, IFN- e IL-1....................................70
Tabela 9 Resultados da avaliação da função discriminante quadrática entre os
grupos AS e LVC para os preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1..........71
xi
Índice de Figuras
Figura 1 Belo Horizonte de acordo com as regiões administrativas. Fonte:
PBH, 2014..........................................................................................41
Figura 2 Fluxograma do delineamento do estudo............................................43
Figura 3 Fluxograma metodológico.................................................................45
Figura 4 Plataforma de esferas no sistema CBA..............................................51
Figura 5 Associação entre resultados positivos para infecção assintomática por
L. infantum de acordo com os testes sorológicos (ELISA-AgT e
ELISA-rK39) e a qPCR......................................................................58
Figura 6 Distribuição em porcentagem das crianças incluídas no grupo AS
(Fig. A), LVC (Fig. B) e CN (Fig. C) em relação à idade...............61
Figura 7 Distribuição em porcentagem das crianças que pertencem ao grupo
LVC em relação ao tempo de sintoma quando internadas.................61
Figura 8 Correlação entre tempo de sintoma, determinado em dias, e as taxas
de avidez em crianças com LV clássica.............................................63
Figura 9 Correlações entre os índices IR-rK39 e taxa de avidez em crianças
que apresentam infecção assintomática e clássica............................64
Figura 10 Avaliação do perfil sérico da quimiocina CXCL-8 em crianças que
pertencem ao Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de
Estudo (AS = 81) e ao Grupo Controle Positivo (LVC = 43)............65
xii
Figura 11 Avaliação do perfil de citocinas pró-inflamatórios séricas em crianças
que pertencem ao Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de
Estudo (AS = 81) e ao Grupo Controle Positivo (LVC = 43)............66
Figura 12 Avaliação do perfil de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras
séricas em crianças pertencentes ao Grupo Controle negativo (CN =
98), ao Grupo de Estudo (AS = 81) e ao Grupo Controle Positivo
(LVC = 43).........................................................................................67
Figura 13 Avaliação do perfil de IL-17A circulante em crianças pertencentes ao
Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS = 81)
e ao Grupo Controle Positivo (LVC = 43).........................................68
Figura 14 Árvore de classificação dos biomarcadores preditores TA, IL-17A,
IFN- e IL-1 entre os grupos AS (AS = 1 ou rosa claro) e LVC
(LVC = 2 ou rosa escuro)...................................................................72
xiii
Resumo
Em áreas endêmicas para leishmaniose visceral (LV), a prevalência da infecção
assintomática pode servir como indicador da extensão e manutenção de transmissão do
parasito, pois o número de indivíduos que abrigam temporariamente e silenciosamente,
o parasito, corresponde à maioria dos infectados. Assim é de extrema importância
identificar a infecção assintomática visando monitorar as áreas endêmicas para
direcionar melhor as ações de controle. Porém os métodos de diagnóstico sorológico
desenvolvidos, não apresentam o mesmo desempenho e eficiência para identificação da
LV assintomática. Neste contexto, este estudo buscou avaliar biomarcadores
imunológicos em crianças infectadas e não infectadas por L. infantum com o intuito de
identificar aqueles com potencial aplicação para auxiliar na detecção da infecção
assintomática. Para tanto, amostras de soro de 179 crianças residentes em 3 áreas da
Regional Noroeste de Belo Horizonte foram submetidas aos testes ELISA-AgT, ELISA-
rK39 e qPCR. Na análise dos resultados, foram identificadas 81 amostras positivas.
Observou-se que a co-positividade entre a qPCR e os dois testes sorológicos foi
notavelmente baixa (2 amostras), pois não foi detectado pela qPCR DNA de Leishmania
spp. em amostras de sangue total em um número considerável de indivíduos que
apresentaram diagnóstico positivo para os testes de ELISA-AgT e/ou ELISA-rK39. Por
outro lado, a qPCR permitiu identificar infecção assintomática em indivíduos que
apresentaram diagnóstico sorológico negativo (17 amostras). A taxa de avidez (TA) de
anticorpos IgG, foi determinada em 44 amostras de soro de crianças com infecção
assintomática e 42 com a forma clássica da doença, que apresentaram resultado positivo
para o teste de ELISA-rK39. Os dados mostraram TA média (entre 41 a 70%), em 29
(66%) das amostras avaliadas como infecção assintomática. Altas TA (acima de 70%)
foram observadas em 27 (64%) das crianças com LV clássica. Os resultados
demonstraram ainda associação inversa entre TA e índice de reatividade em crianças
assintomáticas. Para avaliar o perfil imunológico de crianças não infectadas, crianças
identificadas com infecção assintomática e com LV clássica, foi realizada a
quantificação dos níveis séricos da quimiocina CXCL-8, de citocinas pró-inflamatórias,
anti-inflamatórias/moduladoras e da IL-17A por citometria de fluxo. Os dados
mostraram níveis séricos basais da quimiocina CXCL-8, das citocinas IL-6, IL-1,
TNF, IFN-, IL-2, IL-12p70, IL- 10 e IL-4 em crianças assintomáticas.
Por outro lado, observou-se elevados níveis séricos de IL-17A nesse grupo, sugerindo
xiv
que esse biomarcador desempenha papel protetor na LV assintomática. Em crianças
com LV clássica, observou-se elevados níveis séricos de CXCL-8, IL-6, IL-1, TNF,
IFN- e IL-10. Através da regressão logística foi possível selecionar como potenciais
biomarcadores da infecção por L. infantum, a taxa de avidez, IFN-, IL-17A e IL-1.
Com o emprego da árvore de classificação, foi possível criar uma regra de associação
desses preditores entre crianças com LV assintomática e LV clássica. Valores
categorizados de TA menores que 2,5 juntamente com valores categorizados de IFN-
menores que 2,5 detectados em 40 crianças, indicaram decisão a favor de LV
assintomática. Para valores categorizados de TA maiores que 2,5, acompanhados de
valores categorizados de IFN- maiores que 2,5 e de IL-1 maiores que 1,5 favoreceu a
classificação de 15 crianças como LV clássica. Foi possível observar ainda associações
que indicaram infecção assintomática com os seguintes valores: menor TA, maior IL-
17A e menor IFN-; e indicaram LV clássica com os valores: maior TA, maior IFN-; e
elevado IL-1. A classificação proposta nesse estudo, empregando as abordagens
estatísticas (regressão logística e CART), sugere potencial aplicação como ferramenta
complementar para o diagnóstico da infecção assintomática em crianças residentes em
áreas endêmicas para LV.
xv
Abstract
In endemic areas for visceral leishmaniasis (VL), the prevalence of asymptomatic
infection can serve as an extension of the indicator and maintenance of transmission of
the parasite, since the number of individuals to temporarily house and quietly, the
parasite corresponds to the most infected. So it is extremely important to identify
asymptomatic infection in order to monitor the endemic areas to better design control
actions. But the methods developed serological diagnosis, do not have the same
performance and efficiency for asymptomatic VL. In this context, this study aimed to
evaluate immunological biomarkers in children infected and not infected by L. infantum
in order to identify those with potential application to aid in the detection of
asymptomatic infection. Therefore, serum samples from 179 children living in three
areas of the Northwest Regional Belo Horizonte were subjected to ELISA-AgT,
ELISA-rK39 and qPCR testing. In the analysis of results, we identified 81 positive
samples. It was observed that co-positivity between the qPCR and the two serological
tests were remarkably low (2 samples), since it was not detected by qPCR DNA of
Leishmania spp. in whole blood samples in a considerable number of individuals with a
positive diagnosis for the ELISA-AgT and / or ELISA-rK39 tests. Moreover, qPCR
possible to identify asymptomatic infection in individuals who showed negative
serological diagnosis (17 samples). Avidity (TA) of IgG antibodies was determined in
44 serum samples from children with asymptomatic infection and 42 with the classic
form of the disease, which tested positive for ELISA-rK39 test. Data show TA average
(between 41 and 70%), 29 (66%) of the samples evaluated as asymptomatic infection.
TA high (over 70%) were observed in 27 (64%) of children with classic VL. The results
also demonstrated an inverse correlation between TA and reactivity index in
asymptomatic children. To assess the immune status of children uninfected children
identified with asymptomatic infection and classical VL was performed to quantify
serum levels of chemotactic to neutrophils chemokine CXCL-8, proinflammatory and
anti-inflammatory / modulator and IL-17A cytokines by flow cytometry. The data
showed basal serum levels of chemokine CXCL-8, cytokines IL-6, IL-1, TNF, IFN-,
IL-2, IL-12p70, IL-10 and IL-4 in asymptomatic children. On the other hand, we
observed elevated serum levels of IL-17A in this group, suggesting that this biomarker
plays protective role in asymptomatic VL. In children with classical VL, we observed
xvi
increased serum levels of CXCL-8, IL-6, IL-1, TNF, IFN- and IL-10. By logistic
egression could be selected as potential biomarkers of infection by L. infantum, avidity,
IFN-, IL-17A and IL-1. With the use of the classification tree, it was possible to
create an association rule these predictors among children with asymptomatic VL and
VL classic. Categorized values TA less than 2.5 along with categorized values of IFN-
lower than 2.5 detected in 40 children indicated decision in favor of asymptomatic VL.
For categorized TA values greater than 2.5, together with classified values greater than
2.5 IFN- and IL-1 greater than 1.5 promoted the 15 children as classical VL
classification. It was also possible to observe associations indicated asymptomatic
infection with the following values: lower TA, higher IL-17A and lower IFN-; and
classical VL indicated with the values: high TA, higher IFN- and high IL-1. The
classification proposed in this study using the statistical approaches (logistic regression
and CART), suggests potential application as a complementary tool for the diagnosis of
asymptomatic infection in children living in endemic areas for VL.
xvii
Lista de Abreviatura
ACTB - Gene Humano da β-actina
AgT - Antígeno Total de L. infantum
AIDS - Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AS - Grupo de Estudo
CART - Árvore de Classificação e Regressão
CBA - Cytometric Bead Array
CN - Grupo Controle Negativo
CPqRR – Centro de Pesquisas Rene Rachou
cut-off- Ponto de Corte
DAT - Teste de Aglutinação Direta
LPC - Laboratório de Pesquisas Clínicas
DNA - Ácido Desoxirribonucleico
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético
ELISA - Enzyme –Linked Immunosorbent Assay
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
FSC - Tamanho
HIV - Vírus da imunodeficiência Humana
IFN- - Interferon-gama
IgG - Imunoglobulina G
IL-1 - Interleucina 1
IL-1β - Interleucina 1 beta
IL-2 - Interleucina 2
IL-4 - Interleucina 4
IL-5 - Interleucina 5
IL-6 - Interleucina 6
CXCL-8 - quimiocina quimiotática para neutrófilos
IL-10 - Interleucina 10
IL-12 - Interleucina 12
IL-12p70 - Interleucina 12p70
IL-17 -Interleucina 17
IL-17A - Interleucina 17A
IL-21 - Interleucina 21
xviii
IL-22 - Interleucina 22
IR- Índice de Reatividade
LAT - Teste de Aglutinação em Látex
LBP - Proteínas de Ligação de Lípideos
LT - Leishmaniose Tegumentar
LV - Leishmaniose Visceral
LVC - Como Grupo Controle Positivo
mL - Mililitro
MG - Minas Gerais
NK - Células Natural Killer
nm - Nanometros
OR - Razão de Chances
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PE - Ficoeritrina
pg - picogramas
qPCR - Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa
RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta
rK39 - Antígeno Recombinante K39
RNA - Ácido Ribonucléico
rRNA - Ácido Ribonucléico Ribossomal
SSC - Granulosidade
SSU rRNA - Gene da Pequena Subunidade do RNA ribossomal de Leishmania
spp.
STF-T - Salina Tamponada com Fosfatos Contendo Tween-20 a 0,05%
STF-T - Leite 1% - Salina Tamponada com Fosfatos Contendo Tween-20 a
0,05% Acrescida de 1% de Leite em Pó Desnatado
STF-T - Leite 5% - Salina Tamponada com Fosfatos Contendo Tween-20 a
0,05% Acrescida de 5% de Leite em Pó Desnatado
TA - Taxa de Avidez
TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β - Transforming Growth Factor Beta
TNF - Fator de Necrose Tumoral
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral Alfa
TR - Teste Rápido de Imunocromatografia
xix
U- - Densidade Óptica das Amostras não Tratadas com Uréia
U+ - Densidade Óptica das Amostras Tratadas com Uréia
g - Micrograma
μl - Microlitro
μM - Micromolar
1.0 INTRODUÇÃO
Introdução
21
1.1 Leishmanioses
Protozoários do gênero Leishmania são parasitos intracelulares obrigatórios
que provocam um amplo espectro de doenças, coletivamente conhecidas como
leishmanioses. No homem, as manifestações dessa doença podem variar de formas
clínicas menos graves como a leishmaniose tegumentar (LT), que apresenta duas
principais formas: LT cutânea e muco-cutânea, e a leishmaniose visceral (LV), que se
não diagnosticada e tratada precocemente pode levar ao óbito na maioria dos casos
(OMS, 2010).
Estima-se que aproximadamente 12 milhões de pessoas estejam infectadas e que
cerca de 350 milhões encontram-se em risco de adquirir a doença em todo o mundo,
com incidência anual estimada em cerca de 1 - 1,5 milhões de casos para a LT e
500.000 casos para a LV (OMS, 2010; Alvar et al., 2012).
1.2 Leishmaniose Visceral – Agente Etiológico e Epidemiologia
A leishmaniose visceral é causada, por parasitos pertencentes ao complexo
donovani, que compreendem as espécies Leishmania (Leishmania) donovani e
Leishmania (Leishmania) infantum (ou L. (L.) chagasi) agente etiológico da
leishmaniose visceral nas Américas. A transmissão da doença se dá pela picada das
fêmeas de insetos da ordem Díptera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, do
gênero Phlebotomous e Lutzomyia no velho e novo mundo, respectivamente
(Cummings., 2010).
No Brasil, os canídeos domésticos e silvestres são os mais importantes e
significativos reservatórios da doença. Em áreas endêmicas tem se relatado que a
enzootia canina precede a ocorrência de casos humanos e que a infecção em cães é mais
prevalente do que no homem (Oliveira et al., 2001).
Por muito tempo, no país, a LV foi conhecida como uma zoonose tipicamente
rural, porém, desde a década de 90 tem ocorrido aumento significativo do número de
casos registrados e atualmente encontra-se em pleno processo de dispersão e
disseminação para diferentes regiões, tanto em áreas rurais quanto em áreas urbanas
(Gontijo & Melo, 2004) atingindo as 5 regiões brasileiras, sendo registrados em média
Introdução
22
cerca de 3.500 casos anuais e apresentando incidência de 2,0 casos/100.000 habitantes
(SINAM, 2009).
Vários fatores têm sido relacionados com o rápido processo de urbanização da
doença e o aumento do número de casos, destacando-se entre eles: as mudanças na
estrutura agrária, que provocaram a migração de grande parte da população rural para os
centros urbanos, mudanças ambientais e climáticas, adaptação do vetor aos ambientes
urbanos, a expansão da epidemia da AIDS e do uso de drogas imunossupressores,
aliados a descontinuidade e dificuldades nas ações de controle da doença em grandes
aglomerados urbanos, onde problemas de desnutrição, moradia, saneamento básico,
acesso a educação e a saúde estão presentes (Gontijo & Melo, 2004).
Belo Horizonte, capital do estado de Minas Gerais, ilustra claramente o processo
de urbanização da LV nas cidades brasileiras. Desde 1994 o número de casos de LV
humana tem-se elevado (Luz et al., 2001). No período de 1994 a 2011, foram
confirmados 1.553 casos da doença (PBH, 2012). No período de 2006 a 2013, a
letalidade foi superior a do país, variando de 6% a 23,0%. Apesar do maior percentual
de casos se concentrarem em crianças e adolescentes até 14 anos (36,8%), apenas 7,6%
do total de óbitos ocorreu nesta faixa etária (PBH, 2013). Entre os fatores de risco
envolvidos na transmissão da LV na cidade destaca-se a renda, a educação e o número
de cães infectados por habitantes (de Araújo et al., 2012).
1.3 Manifestações Clínicas e Diagnóstico da Leishmaniose Visceral
A infecção por L. (L.) infantum apresenta um amplo espectro clínico, incluindo
desde formas assintomáticas a quadros muito graves, com potencial de evolução para
óbito e, os fatores associados ao estabelecimento e a manutenção das diferentes formas
clínicas da LV não são completamente compreendidos (Faleiro et al., 2014). No entanto,
aspectos inerentes ao hospedeiro como: fatores genéticos (Bucheton et al., 2006;
Mehrotra et al., 2011; Fakiola et al., 2013), o estado nutricional (Badaró et al., 1986 a e
b; Anstead et al., 2001; Queiroz et al,. 2004; Hughes & Kelly, 2006; Nyle´n & Sacks,
2007), a idade (Badaró et al., 1986 a e b; Queiroz et al,. 2004) e a resposta imune
desencadeada pela infecção (Faleiro et al., 2014) foram associados com a
suscetibilidade para o desenvolvimento da forma clínica clássica da LV. Além disso,
infecções por helmintos também foram identificadas como fator que pode favorecer a
Introdução
23
replicação do parasito (O’Neal et al., 2007; Maurya et al., 2012).
Condições de depressão do sistema imune, tais como a infecção pelo vírus HIV
e o uso de drogas imunossupressores por pacientes transplantados ou com doença
autoimune, também tornam as pessoas mais vulneráveis ao desenvolvimento da forma
clínica clássica da LV, pois prejudicam a capacidade do sistema imune em resolver a
infecção por Leishmania e permite a reativação da infecção que pode ocorrer muito
tempo depois do contato primário com o parasito (Antinori et al., 2008; Cascio et al.,
2010; Antinori et al., 2012; Pitini et al., 2012).
Na América Latina, particularmente no Brasil a co-infecção Leishmania - HIV é
uma condição emergente (Cota et al., 2014). Em pacientes infectados pelo HIV e não
infectados as características clínicas da LV clássica são semelhantes, a principal
diferença é a menor taxa de resposta ao tratamento e consequente alta taxa de recidiva
da doença em pacientes co-infectados (Cota et al., 2014). No entanto há relatos de que
em alguns pacientes a infecção por HIV pode modificar as manifestações clínicas da LV
clássica, o que dificulta o diagnóstico clínico em áreas onde a doença está em expansão.
Além disso, o quadro clínico da LV clássica é semelhante ao de outras doenças
oportunistas disseminadas, o que aumenta ainda mais a dificuldade no diagnóstico de
pacientes co-infectados por HIV- Leishmania (Cota et al., 2014).
Em pacientes imunocompetentes, a forma clínica clássica é o resultado de uma
infecção crônica, cujo o período de incubação varia de 10 dias a 1 ano (OMS, 2010). A
doença é de instalação insidiosa e evolução prolongada, sendo a medula óssea, o fígado
e o baço os órgãos frequentemente afetados. As manifestações clínicas apresentadas
pelos indivíduos infectados incluem: hepatoesplenomegalia, que é caracterizada por
aumento do abdômen com baço e fígado palpáveis, febre irregular, tosse seca, diarréia,
mal estar, anorexia, perda de peso, palidez cutâneo-mucosa, hemorragias (epistaxe,
gengivorragia e petéquias) e icterícia, ocorre desnutrição proteico-calórica, os cabelos
ficam quebradiços, os cílios alongados e a pele seca, podendo a infecção levar o
paciente à caquexia. Os exames laboratoriais evidenciam anemia, pancitopenia,
leucopenia, trombocitopenia, provas de função hepática bastante alteradas e inversão na
relação albumina/gama-globulinas (MS, 2006). A hiperpigmentação da pele é
comumente observada em pacientes infectados por L. donovani, daí a derivação do
nome kala-azar, que quer dizer, febre negra (OMS, 2010). A doença pode ser fatal se
não for tratada e, o tratamento apropriado, geralmente leva a cura completa. A
Introdução
24
recorrência da doença é rara no hospedeiro imunocompetente e quando acontece, ocorre
logo após o final do tratamento e é geralmente sensível a um novo ciclo de tratamento
(MS, 2006)
Vários métodos podem ser utilizados no diagnóstico da LV, mas o diagnóstico
definitivo da doença é dado por meio de métodos parasitológicos ou moleculares (Reus
et al., 2005; Del Olmo et al., 2009).
O diagnóstico parasitológico pode ser realizado através da visualização de
formas amastigotas em preparações de concentrado de leucócitos de sangue periférico,
aspirado de medula óssea, baço, fígado e linfonodo corados pelo Giemsa ou Wright,
Leishman, Panóptico e examinadas ao microscópio óptico (Elmahallawy et al., 2014).
Quando se obtém fragmentos por biópsia do órgão infectado, são elaborados cortes
histológicos para a pesquisa do parasito. A técnica que utiliza como amostra biológica o
aspirado de baço é a mais sensível, seguida pela que utiliza aspirado de medula óssea,
biopsia hepática e aspirado de linfonodos, sendo os procedimentos de coleta para
realização destas técnicas invasivos, gerando dificuldades de diferentes ordens (MS,
2006).
Apesar da técnica de visualização no microscópio óptico de formas amastigotas
em esfregaços de aspirado de medula óssea corados pelo Giemsa apresentar
sensibilidade de 60% a 85%, é a mais comumente utilizada, já que a técnica que utiliza
esfregaços de aspirado de baço apesar de ter sensibilidade maior (93%), apresenta riscos
para o paciente, pois a punção aspirativa do baço pode levar a ruptura do órgão e a
hemorragias fatais (Zijlstraet al., 1992; MS, 2006). Já a técnica que utiliza esfregaços de
concentrado de leucócitos de sangue periférico, apesar de não oferecer nenhum risco ao
paciente no momento da coleta, sendo a punção de sangue periférico menos incomoda e
mais fácil de ser realizada que a punção de medula óssea, apresenta sensibilidade muito
baixa, pois há poucas células parasitadas circulantes, principalmente em pacientes com
baixo parasitismo (John & Petri, 2006; Barrett & Crof, 2012). A biópsia de fígado
também é um método de coleta de material biológico mais seguro que a punção
aspirativa de baço, mas formas amastigotas só são visualizadas em cortes histológicos
em infecções com alta carga parasitária (John & Petri, 2006; Barrett & Crof, 2012).
O isolamento em meio de cultura (in vitro), onde o material biológico obtido por
punção aspirativa ou por biópsia são inoculados em meios de cultura especiais, pode
melhorar a sensibilidade diagnóstica, mas é demorado e caro, estando restrito aos
Introdução
25
centros de referência (Elmahallawy et al., 2014).
O diagnótico também pode ser realizado pela detecção de anticorpos específicos
pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático de ELISA,
teste de aglutinação direta (DAT), teste rápido de imunocromatografia (TR),
“immunoblotting” (“Western-blotting”) e teste de aglutinação em látex (LAT)
(Elmahallawy et al., 2014). .
Porém, todos os testes de detecção de anticorpos apresentam o mesmo
inconveniente: não diferenciam se a infecção é atual ou passada, pois os anticorpos
permanecem circulantes no sangue periférico durante muitos anos após o paciente ter se
curado, sendo que em regiões endêmicas, indivíduos assintomáticos também podem
apresentar resultado positivo para estes testes. Neste contexto, em pacientes que
apresentam apenas um teste sorológico reagente, na ausência de manifestações clínicas
sugestivas de LV, não é autorizado o inicio do tratamento. Sendo assim, os testes
sorológicos são comumente utilizados apenas para reforçar o diagnóstico da LV (MS,
2006).
No Brasil, o kit de RIFI é produzido por Bio-Manguinhos/FIOCRUZ (Rio
de Janeiro, Brasil) e fornecido pelo Ministério da Saúde para ser usado na rotina dos
laboratórios públicos, para o diagnóstico de LV clássica humana. Em 2010, o Ministério
da Saúde introduziu o teste rápido Kalazar-Detect™
(INBIOS Internacional, Seattle, WA,
EUA) e manteve a RIFI na rotina para diagnóstico da LV nos Laboratórios Centrais e
Laboratórios de Referência do Brasil, apesar das limitações de requerer microscópio de
fluorescência, laboratórios relativamente bem equipados e apresentar baixo desempenho
no diagnóstico da doença (Oliveira et al., 2013).
O DAT é um teste sorológico usado em todo o mundo, que não depende de
equipamentos para ser realizado, sendo uma ferramenta simples e robusta, para o
diagnóstico da LV, apresentando bom desempenho (Andrade et al., 1986; Sundar et al.,
2006; Oliveira et al., 2013). Recentemente foi validado um protótipo de kit do teste de
aglutinação direta para o diagnóstico laboratorial da LV clássica, no Laboratório de
Pesquisas Clínicas do CPqRR-FIOCRUZ (DAT-LPC), que utiliza antígeno liofilizado
desenvolvido com Leishmania (L.) infantum. O teste demonstrou sensibilidade de
99,0% e especificidade de 98,2%, taxas superiores às que vêm sendo apresentadas pela
RIFI, adotada pelo Ministério da Saúde. Diante desses resultados, foi sugerido ao
Introdução
26
Ministério da Saúde substituir a RIFI pelo DAT como teste de diagnóstico de rotina no
sistema público de saúde brasileiro (Oliveira et al., 2013).
O teste de ELISA pode ser realizado facilmente e é adaptável para utilização
com várias moléculas antigênicas, sendo uma técnica altamente sensível, mas a sua
especificidade depende do antígeno utilizado (Elmahallawy et al., 2014). Testes de
ELISA utilizando antígeno solúvel produzido a partir de promastigotas, apresentam alta
sensibilidade e especificidade, porém apresentam reação cruzada com amostras de
pacientes com tuberculose, toxoplasmose e com infecção por diferentes
tripanosomatídeos (Bray, 1976; Kumar et al., 2001). Quanto aos antígenos purificados,
foram testadas diferentes moléculas (com pesos moleculares de 116 kDa, 72 kDa, e 66
kDa), sendo a sensibilidade apresentada pelos testes muito baixa (Vinayak et al., 1994;
Maurya et al., 2010). Já os antígenos recombinantes clonados a partir de proteínas de
Leishmania infantum como rK39 (Burns et al., 1993; Badaró et al., 1996; Houghton et
al., 1998; Singh et al., 2010), rK9, rK26 (Mohapatra et al., 2010) e Leishmania
donovani como rKE16 (Sivakumar et al., 2006) e rK28 (Pattabhi et al., 2010), tem
mostrado alta sensibilidade e especificidade quando testados em pacientes
imunocompetentes com LV clássica em diferentes países. A proteína de choque térmico
HPS70, as proteínas histonas H2A, H2B, H3 e H4 e as proteínas de ligação de lípideos
(LBP) também podem ter potencial para o uso no diagnóstico sorológico da LV clássica
(Amorim et al., 1996; Pérez-Alvarez et al., 2001).
Nos últimos anos, diversos ensaios moleculares, particularmente a reação em
cadeia da polimerase (PCR), foram sucessivamente avaliados como alternativa sensível
e específica para o diagnóstico das leishmanioses (Piarroux et al., 1993 e 1994;
Schallig & Oskam, 2002; Antinori et al., 2007; Deborggraeve et al., 2008 a e b; Laurent
et al., 2009; Srivastava et al., 2011; Nicodemo et al., 2013; Khan et al., 2014). A PCR
pode ser usada para detectar DNA de Leishmania spp. em diferentes amostras
biológicas, tais como, sangue periférico (Disch et al., 2003), soro (de Assis et al., 2008),
urina (Fisa et al., 2008) e aspirados de medula óssea (Fraga et al., 2010). Dessa forma, a
PCR vem sendo avaliada para o diagnóstico da LV clássica, LV assintomática e
controle de cura (Disch et al., 2004; Antinori et al., 2007; Moreno et al., 2009)
Mais recentemente, a reação de amplificação quantitativa em tempo real (qPCR)
tem sido a melhor alternativa para avaliação da infecção por Leishmania spp. e
quantificação da carga parasitária em diferentes amostras biológicas (Bretagne et al.,
Introdução
27
2001; Mary et al., 2006; Cota et al., 2013). Assim, a qPCR pode possibilitar ao médico
e ao pesquisador acompanhar a evolução da infecção e monitorar os resultados de um
determinado esquema terapêutico a partir de amostras provenientes de humanos
(Nicolas et al., 2002 a e b; Mary et al., 2004; Rolão et al., 2004; Castilho et al., 2008;
Cota et al., 2013).
Diferentemente da LV clássica, a infecção assintomática é caracterizada por
ausência de manifestações clínicas (sinais e sintomas) na anamnese e no exame físico
realizado pelo médico, podendo ser detectada em pessoas sem história prévia de LV
clássica e normalmente está associada à presença de um caso da doença na família ou na
vizinhança. É importante destacar que, o Ministério da Saúde, preconiza que os
indivíduos com infecção assintomática não devem ser tratados e esses casos não devem
ser notificados (MS, 2006).
Em áreas endêmicas, o número de indivíduos infectados com o parasito, mas que
não desenvolvem a doença, corresponde à maioria dos infectados. Estudos estimam que
a proporção de infecções assintomáticas é de 5 a 10 vezes maior do que o número de
casos de LV clássica em indivíduos imunocompetentes (Desjeux, 1992;
Sakthianandeswaren et al., 2009; OMS, 2010; Antinori et al., 2012), podendo assim, a
prevalência da LV assintomática servir como indicador da extensão e manutenção de
transmissão do parasito (Costa et al., 2002; Riera et al., 2004; Romero et al., 2009; dos
Santos Marques et al., 2012).
Neste contexto, inquéritos epidemiológicos vêm sendo realizados com o intuito
de identificar os indivíduos que apresentam a infecção assintomática por L.infantum,
visando monitorar as áreas endêmicas para direcionar melhor as ações de controle (de
Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009; dos Santos Marques et al.; 2012). Para
tanto, estes estudos vêem empregando como método para identificar os indivíduos
assintomáticos, a detecção de anticorpos anti-leishmania pela reação de
imunofluorescência indireta - RIFI (de Gouvea Viana et al., 2008) e pelo ensaio
imunoenzimático de ELISA (de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009; dos
Santos Marques et al.; 2012) ou o teste intradérmico de Montenegro, que ao contrário
do que ocorre na LT, não pode ser utilizado para o diagnóstico da forma clínica clássica
da LV, pois é sempre negativo durante o período da doença e torna-se positivo após a
cura clínica na maioria dos pacientes em um período de seis meses a três anos após o
término do tratamento (de Gouvea Viana et al., 2008).
Introdução
28
Diferentes estudos mostraram que os testes sorológicos podem não ser eficientes
quando utilizados sozinhos para a identificação de indivíduos assintomáticos, que vivem
numa área endêmica uma vez que, indivíduos que desenvolveram a forma clínica
assintomática, apresentam baixa carga parasitária e, como consequência os títulos de
anticorpos em geral são baixos, tendendo a desaparecer da corrente sanguínea com o
decorrer do tempo (de Gouvea Viana et al., 2008). Mesmo assim, os testes sorológicos
são utilizados para realização de inquéritos epidemiológicos, porque são mais práticos e
aplicáveis quando são testadas muitas amostras. Além dissoa combinação de várias
ferramentas de diagnóstico não seria viável (de Gouvea Viana et al., 2008; dos Santos
Marques et al.; 2012).
Diante deste cenário, onde a utilização de um único método de diagnóstico
compromete e dificulta o amplo reconhecimento de indivíduos com infecção
assintomática, os métodos moleculares, realizados através da detecção de DNA do
parasito em amostras de sangue periférico, mesmo apesar do elevado custo, têm sido
considerados como métodos de diagnóstico complementar, importante para a detecção
da infecção assintomática (de Gouvea Viana et al., 2008; dos Santos Marques et al.;
2012). As técnicas moleculares fornecem resultados mais robustos do que os outros
métodos uma vez que, estudos recentes demonstraram que a degradação do DNA ocorre
rapidamente após a morte do parasito, o que sugere que os resultados obtidos são devido
aos parasitos que estão viáveis e recentes no hospedeiro (Prina et al.; 2007).
No entanto, mesmo com os avanços obtidos pelo desenvolvimento das técnicas
moleculares, os estudos clínicos e laboratoriais, abordando indivíduos assintomáticos,
são escassos e diversificados em termos de definição, sendo que a dificuldade de
diagnosticar indivíduos que abrigam temporariamente e, silenciosamente, o parasito,
ainda é uma limitação desses estudos. Em razão disso, torna-se necessário a realização
de novos estudos para validar uma melhor estratégia de diagnóstico da infecção
assintomática (de Gouvea Viana et al., 2008).
Quanto à possibilidade de evolução da infecção assintomática para forma clínica
clássica, estudos recentes demonstraram que indivíduos residentes de áreas endêmicas,
supostamente infectados pela espécie L. infantum, que não desenvolveram a doença, não
apresentam riscos de progressão para a forma clínica clássica, podendo a infecção
assintomática ser apenas temporária e evoluir para total convalescência (Silva et al.,
2011). No entanto, o mesmo não é observado em indivíduos com infecção
Introdução
29
assintomática por L. donovani em áreas endêmicas, sendo relatada alta taxa de
progressão para a forma clássica da doença (Das VN et al., 2011).
Estudos demonstraram que indivíduos com infecção assintomática por L.
infantum provavelmente não infectam flebotomíneos, devido à parasitemia muito baixa
ou indetectável (Costa et al., 2000). No entanto, a possibilidade de que estas pessoas
possam atuar como reservatórios da infecção vem sendo sugerida por vários
pesquisadores e não deve ser descartada, já que o papel desempenhado por estes
indivíduos no ciclo de transmissão da doença ainda é desconhecida e em países
endêmicos é encontrada grande proporção de indivíduos com infecção assintomática
(Costa et al., 2002). Por outro lado, em infecções assintomáticas por L. donovani, os
indivíduos podem atuar como reservatórios, podendo potencialmente infectar
flebotomíneos (OMS, 2010), pois estudos têm mostrado alto nível de parasitemia em
amostras de sangue destes indivíduos, sendo assim, alvos importantes para a realização
de estratégias de controle da doença (OMS, 2010; Sharma et al., 2000).
1.4 Resposta Imune na Leishmaniose Visceral Humana
A infecção por Leishmania inicia-se quando formas promastigotas infectantes
são inoculadas na pele do hospedeiro vertebrado, desencadeando uma reação
inflamatória local com acúmulo de leucócitos no sítio de infecção (Teixeira et al., 2006,
Silveira et al., 2009). Nesse microambiente, aproximadamente 90% dos parasitos são
lisados pelo complemento através do complexo de ataque à membrana (C5b-C9)
(Domínguez et al., 2002, Domínguez et al., 2003, von Stebut, 2007). No entanto,
aqueles parasitos não destruídos podem se ligar a receptores específicos na superfície de
fagócitos e serem internalizados por um processo denominado fagocitose (Mosser &
Rosenthal, 1993, von Stebut, 2007, Peters et al., 2008).
A interação inicial promastigotas-macrófagos é fundamental para o
estabelecimento da infecção no hospedeiro vertebrado (Rosenthal et al., 1996, von
Stebut, 2007). Nesse contexto, diversos estudos já demonstraram a importância de
determinados receptores no processo de reconhecimento/adesão: receptores manose-
fucose e fibronectina, receptor para glicosilação avançada, bem como receptores Fc e
do complemento (Mosser & Edelson, 1985, Mosser & Handman, 1992, Mosser,
Springer & Diamond, 1992, Guy & Belosevic, 1993). Segundo alguns autores, a
Introdução
30
opsonização através do terceiro componente do complemento (C3) promove aumento
significativo da capacidade fagocítica de macrófagos (Mosser & Edelson, 1985, Mosser,
Springer & Diamond, 1992, von Stebut, 2007). Mosser & Edelson (1987) observaram
também que a incorporação de C3 à promastigotas de L. major aumenta drasticamente a
sobrevivência do parasito dentro dessas células.
Outro grupo de receptores com destaque no reconhecimento de patógenos são os
Receptores de Reconhecimento Padrão (PPRs). Os PPRs são constituídos por vários
membros, incluindo os receptores do tipo Toll (TLRs) que reconhecem patógenos
distintos associados a padrões moleculares (PAMPs) (Janssens and Beyaert, 2003). Os
TLRs estão envolvidos em uma variedade de fenômenos celulares, dentre eles pode-se
destacar: fagocitose, maturação, atividade microbicida do fagossoma via indução da
expressão de iNOS, bem como produção de citocinas moduladoras e pró-inflamatórias
(Singh, Srivastava & Singh, 2012).
Além disso, já foi demonstrado que a Leishmania possui diversos mecanismos
de escape para evadir da resposta imune do hospedeiro e estabelecer a infecção. Dentre
esses mecanimos, alguns podem ser destacados: 1) Inibição da produção da citocina
inflamatória interleucina (IL)-12 (Belkaid, Butcher & Sacks, 1998); Degradação da
molécula de ativação HLA-DR em macrófagos infectados (de Souza-Leao et al., 1995);
3) Inibição da ação do complemento, através da expressão de proteínas quinases que
fosforilam os componentes C3, C5 e C9 (von Stebut, 2007).
Em síntese, ao escaparem dos componentes do meio extracelular, os parasitos
irão penetrar nas células fagocíticas pela interação moléculas de superfície do parasito e
receptores dessas células. No interior dessas células, o parasito assume a forma
amastigota. Há uma complexa interação parasito – hospedeiro dentro do microambiente
dos fagolisossomos e, eventualmente, os mecanismos imunes de defesa são evadidos
(Sher, 2002).
A imunopatogênese da leishmaniose está fortemente associada a dois tipos de
resposta imune: a resposta Tipo1 e Tipo2. Tanto as células que participam da resposta
celular e quanto as que participam da resposta humoral desempenham papel
fundamental na formação da resposta imune do hospedeiro à infecção por Leishmania
pela secreção de citocinas (Cummingset al., 2010).
As citocinas podem atuar tanto de forma sinérgica quanto antagonicamente
através de vias complexas de sinalização, promovendo tanto o desenvolvimento de uma
Introdução
31
resposta imune protetora, tendo papel benéfico na resolução da doença, quanto não
protetora, importante na patogênese (Cummingset al., 2010).
Ao contrário das dificuldades em se caracterizar o perfil de citocinas,
importantes para o desenvolvimento de uma resposta imune envolvida na
suscetibilidade à LV clássica, os mecanismos de resistência à infecção já são bem
estabelecidos. Assim, o desenvolvimento de resposta imune mediada por células, capaz
de ativar macrófagos para eliminar os parasitos intracelulares, controlar a infecção por
Leishmania spp. e promover a resolução da doença em seres humanos está associado
com as citocinas pró-inflamatórias IL-12 (Watford et al., 2004), IFN-γ (Mosser &
Edwards, 2008), e TNF-α (Liew et al., 1990 a e b).
A citocina IL-12, produzida principalmente por macrófagos e células
dendríticas, em resposta a agentes patogênicos (Trinchieri, 2003), promove a
diferenciação das células T CD4+ do tipo Th1 e induz a produção de IFN-γ, por células
T ativadas e células Natural Killer (NK) (Watford et al., 2004; Mondal et al., 2010). A
principal função biológica do IFN-γ é ativar os macrófagos e aumentar a atividade
microbicida destas células para matar agentes patogênicos intracelulares (Sacks &
Noben-Trauth, 2002; Tripathi et al., 2007; Mosser & Edwards, 2008; Kaye & Scott,
2011). O IFN-γ exerce uma ação sinérgica com TNF-α induzindo a expressão de iNOS
( óxido nítrico sintase induzível) e a produção de NO (óxido nítrico) pelos fagócitos
infectados por parasitos intracelulares, promovendo, assim, a eliminação destes e
resolvendo a infecção por Leishmania spp. (Liew et al., 1990 a e b; Ray et al., 2000;
Cunningham et al., 2002).
Em seres humanos, a LV clássica é considerada um protótipo de disfunção
imunológica específica, onde tanto a imunidade celular quanto a humoral estão
comprometidas. Durante a doença ativa uma resposta imune ineficaz contra o parasito é
desenvolvida, levando a sua disseminação no hospedeiro e a um desequilibrio
generalizado da resposta imune, dominado pelo aumento dos níveis de citocinas anti-
inflamatórias IL-10 e TGF-β, que agem de forma a modular a resposta imune celular,
tão importante no controle da infecção (Murray et al., 2005; Goto et al., 2009; Kaye &
Scott, 2011). Essas citocinas (IL-10 e TGF-β) seriam responsáveis pela inibição da
ativação de macrófagos e expressão de iNOS (Melby et al. 2001).
Porém, ainda há controvérsias quanto ao perfil da resposta imune desenvolvida
na LV clássica, o microambiente de citocinas presente durante a infecção e o papel que
Introdução
32
estas desempenham na patogênese da doença humana. Estudos, que avaliaram o padrão
de citocinas, para classificar o perfil da resposta imune desenvolvida na LV clássica,
associaram a resistência à infecção com a ativação e diferenciação de células T do tipo 1
e a progressão da doença foi associada com uma resposta predominante de células T do
tipo 2, determinando, assim, um perfil polarizado de resposta imune relacionado com
LV (Carvalho et al., 1981 e 1989; Kharazmiet al., 1999). Estudos recentes, têm
questionado a simplicidade deste modelo e revelaram a existência de complexidades na
regulação de citocinas e nos mecanismos de aquisição de resistência ou suscetibilidade a
infecção (Holaday et al., 1993; Mary et al., 1999; Peruhype-Magalhães et al., 2005;
Ansariet al., 2006; Costa et al., 2012).
Avaliações do perfil de citocinas na LV, demonstraram que indivíduos com LV
clássica são capazes de produzir tanto citocinas de resposta imune do tipo 1 quanto do
tipo 2, com altos níveis das citocinas pró-inflamatórias IL-6, TNFα e IFN-γ ( Medeiros
et al., 2000; Lagler et al., 2003; Gama et al., 2004; Ansari et al., 2006; Peruhype-
Magalhães et al., 2006; Duarte et al., 2008; Gautam et al., 2011), e de citocinas anti-
inflamatórias/moduladoras IL-10 e TGF-β (Holaday et al., 1993; Mary et al., 1999;
Ansariet al., 2006; Saha et al., 2007; Duarte et al., 2009; Frade et al., 2011; Costa et al.,
2012), o que demonstra uma exarcerbação da resposta imune nestes pacientes (Holaday
et al., 1993; Mary et al., 1999; Ansari et al., 2006; Costa et al., 2012). Sendo assim,
esses estudos sugerem que a resposta imune desenvolvida por indivíduos com LV
clássica é desbalanceada, ocorrendo um desequilíbrio nos níveis de citocinas do tipo1 e
do tipo 2, havendo tanto elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias que vêm sendo
associados com a resistência à infecção, quanto elevados níveis de citocinas anti-
inflamatórias/moduladoras associados a suscetibilidade, que podem ser importantes no
desenvolvimento da doença.
Especialmente em relação às citocinas pró-inflamatórias, é importante observar
que apesar da presença de níveis elevados durante a LV clássica, há progressão da
doença. IL-6 e TNF- são mediadores centrais de alterações fisiopatológicas associadas
à sepse, a distúrbios orgânicos e à resposta de fase aguda (Neta et al. 1992). Indivíduos
portadores da LV clássica em geral apresentam febre, anorexia, caquexia, aumento na
síntese de proteínas de fase aguda e hipergamaglobulinemia. Estas citocinas podem
induzir todos estes sinais e sintomas (Tracey et al. 1988; Hirano, 1998). Alguns estudos
têem mostrado que os níveis séricos de IL-6 em pacientes com LV clássica permanecem
Introdução
33
significativamente elevados em comparação com indivíduos do grupo controle, mesmo
após o tratamento, o que indica que ela pode ter papel na patogênese e também trazem
benefício na resolução da doença (Caldas et al., 2005; Ansari et al., 2006). Outros
estudos, têm relacionado a citocina IL-6 com a diferenciação de células Th2 (Diehl &
Ricon, 2002), inflamação e com a resposta Th1 (Yamamoto et al., 2000), bem como,
com o desenvolvimento de células Th17 (Ouyang et al., 2009), sugerindo que a IL-6 é
importante na manutenção de um equilíbrio entre as respostas de células T durante a
doença (Bhattacharya & Ali, 2013). Diante desses dados, pode-se sugerir que o papel
desempenhado por esta citocina na progressão/controle da doença ainda é inconclusivo.
Já a citocina TNF-α apresenta papel bem definido no controle da doença. TNF-α em
sinergia com a IL-12, promovem produção de IFN- por células NK (Tripp et al. 1993)
e em associação ao IFN-, induzem mecanismos citotóxicos efetores em macrófagos.
Quanto ao elevado nível de IFN-γ, parece que a progressão da doença pode ser
explicada devido a um bloqueio do receptor de IFN-γ em macrófagos, provocando perda
da sua função protetora (Ansari et al., 2006).
Estudos recentes tem mostrado que a citocina IL-17A, desempenha papel
importante na LV humana. É possível que a IL-17A promova o recrutamento e ativação
de neutrófilos, que são conhecidos por exercerem importante função reguladora e/ou
efetora durante a infecção por Leishmania spp., desempenhando papel importante na
LV (Charmoy et al., 2010) . De fato, há relatos do envolvimento de diferentes citocinas
produzidas por células Th17 como a IL-21 (Ansari et al., 2011) e a IL-22, além da IL-
17A (Pitta et al., 2009), na leishmaniose visceral (Pitta et al., 2009; Ansari et al.,2011).
No entanto, a função exata que desempenham na LV parece ser dependente em grande
parte das espécies de parasitos e da genética do hospedeiro (Bhattacharya & Ali, 2013).
A medida que as pesquisas que buscam classificar o perfil da resposta imune
desenvolvida na LV clássica avançam, mais evidências surgem que a IL-10 é a principal
citocina que contribui para a patogênese da LV humana, estando associada com a
gravidade da doença (Holaday et al., 1993; Caldas et al., 2005; Kurkjian et al., 2006;
Nylen & Sacks, 2007; Gautam et al., 2011; Rai et al., 2012). Por outro lado, surgem
controvérsias sobre o papel desempenhado pela IL-4 durante a LV clássica, uma vez
que estudos demonstraram níveis baixos da citocina em áreas nodais e portal de lesões
hepáticas, bem como, no soro de pacientes (Ansari et al., 2006), contradizendo estudos
que sugeriram aumento de IL-4 durante a doença (Peruhype-Magalhaes et al., 2005).
Introdução
34
A IL- 10 é uma citocina anti-inflamatória/moduladora produzida por células T,
monócitos, macrófagos, células dendríticas, células B, entre outras ( Buxbaum & Scott,
2005) e tem como principal função, inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias IL-
1, IL-6, IL-12 e TNF-α por macrófagos e células dendríticas (Imada & Leonard, 2000)
e, portanto, diminui a expansão das células do tipo Th1 necessárias para imunidade
protetora durante a infecção por Leishmania spp. (Thomas & Buxbaum, 2008;
Castellano et al., 2009). A IL-10 então seria a principal citocina envolvida na regulação
da resposta imune na infecção por Leishmania spp. e o principal mecanismo regulador
envolvido, seria o efeito desativador de macrófagos (Carvalho et al., 1994).
A IL-10 está relacionada com a redução direta na ativação de células T e/ou um
efeito inibidor das células do sistema monofagocitário, participando do processo de
supressão da resposta imune protetora (Holaday et al., 1993; Caldas et al., 2005;
Kurkjian et al., 2006; Nylen & Sacks, 2007; Gautam et al., 2011; Rai et al., 2012).
Nesse contexto, a associação entre níveis elevados de IL-10 e estágio avançado da
doença vem sendo documentado em pacientes com LV ( Lagler et al., 2003; Hailu et al.,
2004; Caldas et al ., 2005; Hailu et al ., 2005; Peruhype-Magalhaes et al., 2005; Ansari
et al., 2006; Ghosh et al., 2006; Kurkjian et al., 2006; Saha et al., 2007; Chandra &
Naik, 2008; Khoshdel et al., 2009; Mondal et al., 2010; Gautam et al., 2011; Kushawaha
et al., 2011; Nandan et al., 2012; Singh et al., 2012). Além disso, a IL-10 também
promove a ativação, sobrevivência e a produção de anticorpos por células B e o
desenvolvimento de resposta imune humoral que desempenha papel prejudicial na
defesa do hospedeiro contra a infecção por Leishmania spp. por facilitar a entrada dos
parasitos nas células hospedeiras (Buxbaum, 2008). Assim, considerando-se que a IL-10
desempenha papel importante na supressão da resposta imune, esta citocina torna-se um
importante alvo terapêutico para a LV humana (Gautam et al., 2011; Rai et al., 2012).
A forma clínica assintomática foi caracterizada pela presença de resposta
proliferativa e elevada produção de IFN-γ em diferentes estudos (Carvalho et al., 1992;
Holaday et al., 1993 e Costa et al.,1999).
Em estudos mais recentes, Peruhype-Magalhães et al (2005), ao analisar o perfil
de citocinas produzido por células da imunidade inata de indivíduos assintomáticos,
após estimulação antigênica demonstrou aumento da produção de IFN-γ, IL-12, IL-4,
IL-10 e IL-5, sugerindo assim que os indivíduos assintomáticos apresentam perfil
misto/balanceado de citocina (Tipo 1/Tipo 2). Esse perfil misto/balanceado é importante
Introdução
35
não só para controlar a replicação do parasito, mas também para a manutenção do
estado imunológico destes indivíduos, estando relacionado com o desenvolvimento de
mecanismos antiparasitários eficazes que garantem a proteção e a ausência de sinais e
sintomas da doença .
Carvalho et al. (2003), também tem caracterizado a forma clínica assintomática
imunologicamente pela presença de resposta imune mista/balanceada (Tipo 1/Tipo 2).
Assim, enquanto a imunidade celular (tipo 1) é importante para a eliminação efetiva do
parasito, a modulação dessa resposta através do estabelecimento da imunidade do tipo 2
é igualmente importante, a fim de assegurar a preservação da homeostase imune,
bloqueando uma resposta celular exacerbada. A IL-10 é o principal imunomodulador,
atenuando a resposta celular do hospedeiro e favorecendo o controle da resposta imune
após a eliminação do parasito. Já a citocina IL-5 parece ser importante no controle da
infecção por L. infantum pois alguns trabalhos tem mostrado que a citocina promove a
diferenciação e ativação de eosinófilos e aumenta a produção e ativação de linfócitos T
citotóxicos específicos (Nagasawa et al., 1991; Peruhype-Magalhães et al., 2005).
Por outro lado, estudos avaliando o perfil de citocinas séricas ou plasmáticas
demonstraram que indivíduos com infecção assintomática apresentam perfil basal de
citocinas, semelhante a indivíduos não infectados (Peruhype-Magalhães et al., 2006;
Khoshdel et al., 2009; Costa et al., 2012).
2.0 JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA
Justificativa e Relevância
37
A LV apresenta grande importância médica e social devido à sua gravidade e à
alta taxa de letalidade. No Brasil, é considerada endêmica em várias regiões e encontra-
se em franca expansão em várias áreas urbanas, periurbanas e rurais.
Nestas regiões endêmicas, observa-se que o número de indivíduos que abrigam
temporariamente e silenciosamente, o parasito, corresponde à maioria dos infectados,
podendo a prevalência da infecção assintomática servir como indicador da extensão e
manutenção de transmissão do parasito. Assim é de extrema importância identificar a
infecção assintomática visando monitorar as áreas endêmicas para direcionar melhor as
ações de controle. Porém os métodos de diagnóstico desenvolvidos, não apresentam o
mesmo desempenho e eficiência para identificação da LV assintomática e poucos
estudos têm sido direcionados a esta forma clínica.
Nesse contexto, análises detalhadas, considerando simultaneamente a avaliação
da maturação dos anticorpos IgG, em termos de avidez em crianças com infecção
assintomática, bem como, o estudo do perfil sérico da quimiocina CXCL-8, de
citocinas pró-inflamatórias, anti-inflamatórias/moduladoras e da IL-17A podem ser
úteis na identificação de biomarcadores que possam ter potencial aplicação para auxiliar
na detecção desta forma clínica da LV. Além disso, o entendimento e identificação de
fatores que levam à infecção assintomática poderão fornecer informações importantes
para a compreensão da evolução da doença, provocada por L. infantum. E não podemos
deixar de destacar que esse tipo de abordagem, especificamente em crianças, não tem
sido elaborada e restam várias questões a serem elucidadas.
3.0 OBJETIVO
Objetivo
39
3.1 Objetivo geral
Avaliar biomarcadores imunológicos em crianças com infecção assintomática
por L.infantum.
3.2 Objetivos específicos
Selecionar, por meio dos ensaios de ELISA-AgT, ELISA-rK39 e qPCR, crianças
com infecção assintomática por L. infantum;
Determinar o perfil de avidez de anticorpos IgG em crianças com LV
assintomática e LV clássica;
Correlacionar as taxas de avidez de anticorpos IgG com a evolução da infecção
em crianças com LV clássica;
Correlacionar o índice de reatividade do ELISA-rK39 e a taxa de avidez de
anticorpos IgG em crianças com LV assintomática e LV clássica e avaliar a
potencial aplicação como marcador sorológico indicativo de infecção recente ou
não;
Avaliar o perfil sérico da quimiocina CXCL-8, de citocinas pró-inflamatórias,
anti-inflamatórias/moduladoras e da IL-17A em crianças com infecção
assintomática por L. infantum;
Identificar biomarcadores imunológicos úteis para a compreensão dos fatores
que determinam o curso da infecção por L. infantum e que possam ter potencial
aplicação para auxiliar na detecção da infecção assintomática.
4.0 METODOLOGIA
Metodologia
41
4.1 Seleção da população de estudo
Um estudo coorte está sendo realizado desde 2009 para avaliação do Programa
de Controle da LV na Regional Noroeste de Belo Horizonte (Fig. 1). Como parte desse
trabalho, foi realizado um estudo transversal em 2012 com o objetivo de avaliar a
prevalência da infecção assintomática por L.infantum, a resposta imune do grupo de
assintomáticos e elucidar os fatores de risco individuais e de contexto, relacionados à
infecção por L. infantum em uma amostra de crianças com idades entre 0 a 10 anos,
residentes em três áreas de abrangência da Regional Noroeste de Belo Horizonte
(Serrano, Pindorama e Glória) que apresentam tempos diferentes de evolução e histórico
de controle da doença.
O tamanho da amostra para calcular a prevalência no estudo transversal, foi
estimado com base nos seguintes parâmetros: (1) prevalência média da infecção humana
de 15/100 em crianças menores de 5 anos obtido em um estudo realizado em Belo
Figura 1: Belo Horizonte de acordo
com as regiões administrativas. Fonte:
PBH, 2014.
Metodologia
42
Horizonte -MG (dos Santos Marques et al.; 2012); (2) erro α=0,05; (3) efeito
desenho=1,5. O valor estimado foi de 294 crianças em cada área a ser avaliada,
totalizando aproximadamente 900 crianças.
Portanto, para a realização do estudo transversal uma amostra de 937 crianças foi
selecionada, sendo incluídas crianças que foram resgatadas no estudo transversal
realizado em 2009-2010, que apresentavam resultados negativos em todos os testes
realizados: ELISA-AgT, ELISA-rK39, DAT e qPCR e crianças, que participaram do
estudo pela primeira vez, sendo selecionadas aleatoriamente, utilizando o arquivo de
dados do Programa de Saúde da Família da Região Noroeste (Fig. 2).
A coleta de dados e das amostras foi realizada nas residências das crianças
selecionadas, após leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido,
por um dos pais ou responsável. Foi coletado sangue periférico por punção digital
absorvidas em papel filtro de 317 crianças residentes da região Pindorama, 328 crianças
residentes da região Glória e 292 crianças residentes da região Serrano. No momento da
coleta, realizou-se uma entrevista com um dos pais ou responsável para identificação de
fatores associados a infecção por L. infantum, utilizando-se um questionário
padronizado. As amostras foram submetidas a exames sorológicos (ELISA-AgT e
ELISA-rK39). Nessa avaliação, 209 crianças apresentaram resultado positivo em pelo
menos um dos testes sorológicos (Fig. 2).
Para o desenvolvimento deste estudo no ano de 2013 (doze meses após a
realização da primeira coleta realizada durante o estudo transversal de 2012), os pais ou
os responsáveis das 209 crianças que apresentaram resultado positivo em pelo menos
um dos testes sorológicos (ELISA-AgT e ELISA-rK39) foram convidados a participar
desta nova etapa da pesquisa, onde as crianças foram submetidas a uma nova coleta de
amostra biológica e a realização de exame clínico (Fig. 2).
Assim, foi coletado sangue periférico por punção venosa de 141 crianças que
apresentaram diagnóstico positivo em pelo menos um dos testes sorológicos realizados
(ELISA-AgT e ELISA-rK39), sendo que 68 crianças não foram encontras ou os seus
responsáveis não aceitaram participar desta nova etapa de coleta (Fig. 2).
Foram também incluídas neste estudo 35 crianças que apresentaram diagnóstico
negativo nos dois testes sorológicos (ELISA-AgT e ELISA-rK39) realizados durante o
estudo transversal e 3 crianças que não participaram do estudo transversal e estão
participando da pesquisa pela primeira vez. Assim, foi coletado sangue periférico por
punção venosa de 179 crianças (Fig. 2).
Metodologia
43
4.2 Coleta de dados e das amostras
Os objetivos da pesquisa foram explicados previamente por telefone ao
responsável pela criança selecionada. Caso houvesse interesse do responsável permitir a
participação do menor sob sua responsabilidade, este foi convidado a comparecer nos
respectivos centros de saúde de cada área de abrangência com a criança onde esta foi
examinada por um médico pediatra e submetida ao procedimento de coleta de sangue
por punção venosa realizado por um profissional de saúde qualificado. Novamente um
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (anexo 1), foi lido e assinado por
um dos pais ou responsáveis pela criança antes da realização da coleta do sangue. De
acordo com o protocolo do estudo, a criança que por ventura apresentasse sintomas
clínicos da LV, seria encaminhada para realização de exames preconizados pelo
Ministério da Saúde para o diagnóstico da doença e para a realização do tratamento caso
fosse confirmada a infecção.
Figura 2: Fluxograma da seleção da população de estudo.
ELISA - AgT
728 crianças com resultado
negativo em todos os testes
sorológicos
35 crianças com resultado
negativo em todos os testes
sorológicos
Metodologia
44
As amostras de sangue periférico que foram coletadas em tubos sem
anticoagulante, foram posteriormente centrifugadas a 3000 x g durante 15 minutos a
25°C, para se obter o soro, que foi alíquotado e mantido a -70°C até a realização dos
experimentos. Já as amostras de sangue periférico coletadas em tubos contendo EDTA,
foram somente aliquotadas e mantidas a -70°C, até o momento de uso.
4.3 Fluxograma metodológico
A partir das amostras de sangue periférico coletadas foram realizados os testes
sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 e o ensaio molecular de qPCR, para
selecionar as crianças com infecção assintomática (Fig. 3).
O perfil imunológico do grupo de crianças com infecção assintomática foi
determinado através da comparação com um grupo controle negativo e um grupo
controle positivo. Sendo assim, das 179 crianças que compareceram para a coleta de
sangue periférico, aquelas que apresentaram diagnóstico positivo em qualquer um dos
testes realizados (ELISA-AgT, ELISA-rK39 e qPCR) foram diagnosticadas com
infecção assintomática, sendo incluídas no Grupo de Estudo (AS) deste trabalho (Fig.
3). As crianças que apresentaram diagnóstico negativo em todos os testes realizados
(ELISA-AgT, ELISA-rK39 e qPCR) foram incluídas no Grupo Controle Negativo
(CN). Como Grupo Controle Positivo (LVC), foram usadas 43 amostras de soro
coletadas de crianças também com idades entre 0 a 10 anos, com LV clássica,
diagnosticadas e acompanhadas no Hospital Infantil João Paulo II, e que pertencem ao
biorrepositório do Laboratório de Pesquisas Clínicas (CPqRR/FIOCRUZ-MG). Estas
amostras também foram submetidas ao teste de ELISA-AgT e ELISA-rK39. Dos 43
pacientes selecionados apenas 19 possuíam amostras de sangue total que foram
submetidas ao ensaio molecular de qPCR (Fig. 3).
Para avaliar o perfil imunológico dos diferentes grupos de estudo foi realizada a
quantificação dos níveis séricos de citocinas por citometria de fluxo (Fig. 3).
Metodologia
45
Para determinar o perfil de avidez de anticorpos IgG do Grupo de Estudo (AS) e
do Grupo Controle Positivo (LVC) amostras de soro que apresentaram resultado
positivo para o teste de ELISA-rK39 foram submetidas ao teste de avidez com
tratamento por agente caotropico.
4.4 Ensaio imunoenzimático de ELISA-AgT e ELISA-rK39
Microplacas de poliestireno (Nunc-maxi sorp) foram sensibilizadas durante 18
horas em geladeira (2-8ºC), com 50μL de antígeno solúvel (MHOM/BR/2002/LPC-
RPV) produzido e cedido pelo laboratório de Pesquisas Clínicas do Centro de Pesquisas
René Rachou (FIOCRUZ/MG), a partir de promastigotas de L. infantum , segundo Ho
et al. (1983) e Pedras et al. (2008), diluídos numa concentração de 3g/mL em tampão
carbonato/bicarbonato, pH 9,6 ou com 50µL de antígeno recombinante K39, produzido
e cedido pelo Infectious Disease Research Institute, Seattle, WA, USA, diluído também
em tampão carbonato/bicarbonato, pH 9,6, numa concentração de 1g/mL. Em seguida,
as microplacas foram lavadas quatro vezes com 300µL de salina tamponada com
fosfatos contendo Tween-20 a 0,05% (STF-T) por orifício e foram adicionados 200µL
de solução STF-T acrescida de 5% de leite em pó desnatado (STF-T-Leite 5%) em
todos os orifícios das microplacas, que foram novamente incubadas por 2 horas em
Figura 3: Fluxograma metodológico.
Metodologia
46
câmara úmida a 37ºC. Após a incubação, as microplacas foram lavadas novamente
quatro vezes, embaladas e armazenadas a -20ºC, até o momento de uso.
Para realização do ensaio imunoenzimático, foram depositados, em duplicata,
nos orifícios das microplacas 50µL de soro diluído 1/1.000 (para o teste de ELISA-
AgT) ou 1/100 (para o teste de ELISA-rK39), em solução STF-T-Leite 1%, que foram
incubadas por uma hora em câmara úmida a 37ºC. Após novas lavagens, foram
adicionados 50µL do conjugado (anticorpo anti-IgG humano ligado à peroxidase,
Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA) diluído a 1/10.000 (para o teste de ELISA-
AgT) ou 1/50.000 (para o teste de ELISA-rK39) em solução de STF-T-Leite 1% e as
microplacas foram incubadas por uma hora em câmara úmida a 37º C. Em seguida, as
microplacas foram lavadas novamente e foram adicionados 50µL de mistura
cromogênica (Tetrametilbenzidina+Peróxido de Hidrogênio, Sigma-Aldrich, Saint
Louis, Missouri, USA). As microplacas foram incubadas por 5 minutos ao abrigo da luz
e foram aplicados 50µL de solução de ácido sulfúrico 1N em cada poço. As leituras de
absorbância foram realizadas no leitor de microplaca (Modelo 550, BioRad, Ja)
utilizando o comprimento de onda de 450 nm.
O ponto de corte (cut-off) foi definido diariamente pela média das leituras de
absorbância de 15 amostras negativas somado a três desvios-padrão. Como controle
positivo, foi ensaiada, também em duplicada, uma amostra positiva. O resultado de cada
paciente foi expresso em índice de reatividade, que correspondente à média dos valores
das leituras de absorbância da duplicata dividida pelo ponto de corte diário de cada
ensaio, sendo consideradas positivas somente aquelas amostras que apresentaram um
índice maior do que 1.1.
Os títulos do conjugado (IgG humano ligado a peroxidase) de 1/10.000 usado
para o teste de ELISA-AgT e 1/50.000 usado para o teste de ELISA-rK39, foram
determinados por meio de titulação em bloco usando os títulos de 1:10.000, 1:20.000,
1:30.000 para o teste de ELISA-AgT e 1:30.000, 1:50.000, 1:80.000 para o teste de
ELISA-rK39 no ensaio de seis amostras de pacientes com LV clássica (controles
positivos) e 10 amostras de indivíduos saudáveis (controles negativos).
4.5 Teste de avidez
A avidez de anticorpos IgG foi avaliada pela técnica de ELISA. Portanto, para a
execução dos testes, microplacas que foram sensibilizadas com 50µL de antígeno
Metodologia
47
recombinante K39, produzido e cedido pelo Infectious Disease Research Institute,
Seattle, WA, USA, diluído em tampão carbonato/bicarbonato, pH 9,6, numa
concentração de 1g/mL, como descrito anteriormente, foram incubadas por uma hora
em câmara úmida a 37°C contendo 50µL de soro diluído 1/100, em solução STF-T-
Leite 1%. Cada amostra de soro foi depositada em quatro orifícios da placa.
Previamente à adição do conjugado, o soro foi desprezado e foram depositados
300µL de solução de uréia a 6M diluída em STF-T na duplicata de cada amostra. Logo
após, as microplacas foram incubadas por cinco minutos em temperatura ambiente. Em
seguida, os poços que foram incubados com solução de uréia a 6M diluída em STF-T
foram lavados três vezes com 300µL de STF-T e as duplicatas das mesmas amostras
que não receberam o tratamento foram lavados quatro vezes. Após a lavagem, foram
adicionados 50µL do conjugado (anticorpo anti-IgG humano ligado a peroxidase -
Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA) diluído a 1/30.000, em solução de STF-T-
Leite 1% e, as etapas restantes do ensaio, foram desenvolvidas como descrito
anteriormente.
O ponto de corte (cut-off) foi definido diariamente pela média das leituras de
absorbância de 15 amostras negativas aplicadas em duplicata somado a três desvios-
padrão. Como controle positivo, foi ensaiada, uma amostra positiva, também aplicada
em duplicata. Tais amostras não foram tratadas com a solução de uréia a 6M diluída em
STF-T.
O índice de reatividade de cada amostra que corresponde à média dos valores
das leituras de absorbância da duplicata não tratada com úreia dividida pelo ponto de
corte diário de cada ensaio, foi calculado.
Os resultados expressos em taxa de avidez (TA), foram determinados pela razão
entre os valores da densidade óptica das amostras tratadas com uréia (U+) e a densidade
óptica das amostras não tratadas (U-) e expresso em porcentagem ([TA = U+/U- x
100]), sendo arbitrariamente definidos que: TA menor que 40% é considerado de baixa
avidez, entre 41 e 70%, é considerado de média avidez e maior que 70%, é considerado
de alta avidez (de Souza et al., 2005).
O titulo do conjugado (IgG humano ligado a peroxidase) de 1/30.000, foi
determinado por meio de titulação em bloco usando os títulos de 1:10.000, 1:30.000 e
1:50.000 no ensaio de seis amostras de pacientes com LV clássica (controles positivos)
e 10 amostras de indivíduos saudáveis (controles negativos).
Metodologia
48
4.6 Ensaios de qPCR
4.6.1 Extração de DNA
As amostras de sangue periférico, coletadas em tubos contendo o anticoagulante
EDTA, foram descongeladas e homogeneizadas por inversão por 20 minutos. O DNA
total foi extraído por meio do equipamento Maxwell ®
16 Instrument (Promega,
Madison, Wisconsin, USA), utilizando o Kit para extração de DNA: Maxwell® 16 Lev
Blood DNA Kit (Promega, Madison, Wisconsin, USA), seguindo o protocolo do
fabricante.
4.6.2 PCR quantitativo em tempo real
O ensaio molecular de qPCR foi utilizado como um método de diagnóstico, por
detectar a presença do DNA do parasito em amostras clínicas. Nesse ensaio foram
utilizados os iniciadores senso (5`AAGTGCTTTCCCATCGCAACT – 3`) e o antisenso
(5`GACGCACTAAACCCCTCCAA – 3`) que amplificam um fragmento de 67 pares
de bases do gene da pequena subunidade do RNA ribossomal (SSU rRNA) de
Leishmania spp. (van Eys et al., 1992).
A reação foi preparada, em duplicata, para um volume final de 20µL, contendo
3µL do DNA, diluído 1:10 em água, 0,3μM dos iniciadores senso e antisenso, 0,25μM
da sonda TaqMan®, (FAM 5`- CGGTTCGGTGTGTGGCGCC –3` TAMRA)
(Wortmann et al., 2001) e 10µL de TaqMan® MasterMix (Roche, Branchburg, New
Jersey, USA). O programa de amplificação utilizado apresenta as seguintes etapas:
50°C por 2 minutos para a ativação da enzima UDG, 95ºC por 10 minutos, seguido de
40 ciclos de 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 1 minuto.
Como controle interno dos procedimentos de extração de DNA e de
amplificação foi realizada outra reação, onde 3µL do DNA extraído diluído 1:10 em
água estéril, juntamente com os iniciadores Aco1 e Aco2 (Musso et al., 1996) a uma
concentração de 0,15μM e ao SYBR Green MasterMix (Life Technologies, Warrington,
UK) a uma concentração de 1x, foram utilizados com o objetivo de amplificar o gene
humano da β-actina (ACTB), gerando fragmentos de 120pb. O volume final presente
na reação foi de 20µL e todas as amostras foram também avaliadas em duplicata. Foram
utilizados parâmetros universais para amplificação e em cada reação, para confirmar a
Metodologia
49
especificidade do ensaio, uma análise final da curva de fusão foi realizado. A
temperatura de fusão dos produtos de amplificação foi determinado automaticamente
por análise de software.
Em cada ensaio foi incluído um controle negativo, que consite na mistura da
reação e água em vez de DNA. Além disso, foram realizados ensaios específicos para a
amplificação do gene da pequena subunidade do RNA ribossomal (SSU rRNA) de
Leishmania spp. e do gene ACTB para a avaliação dos controles negativos das
extrações.
Ao longo dos ensaios para a amplificação do gene da pequena subunidade do
RNA ribossomal (SSU rRNA) de Leishmania spp. uma amostra de DNA extraída de
sangue periférico de um paciente com LV clássica, foi ensaiada sendo considerada
controle positivo da reação. O equipamento utilizado na realização dos ensaios foi o
modelo StepOne plus (Life Technologies, Warrington, UK).
4.7 Avaliação do perfil sérico de citocinas
4.7.1 Quantificação dos níveis séricos de citocinas por citometria de fluxo
Para a determinação dos níveis séricos de citocinas, 150µL do soro de cada
indivíduo foram centrifugados a 14.000 rpm durante 10 minutos a 18°C e 50µL da
porção central da amostra (na região entre o sedimento e a gordura) foi alíquotada e
mantida a -20°C até a realização dos experimentos. Os níveis séricos de citocinas foram
quantificados utilizando-se o sistema Cytometric Bead Array (CBA), Becton
Dickinson-BD (San Diego, California, USA), que emprega uma mistura de seis a sete
esferas de poliestireno (dependendo do Kit utilizado), de intensidades de fluorescência
discretas e distintas, recobertas com anticorpos específicos para as citocinas humanas.
Essa metodologia permite a avaliação simultânea de diversas citocinas no mesmo
ensaio, empregando pequenos volumes de amostra.
Assim, alíquotas de 25µL de soro teste, dos padrões de citocinas, submetidos a
diluição seriada com diluente G (reagente presente no kit CBA) (“Top Standart” –
5000pg/mL, 1:2 – 2500pg/mL, 1:4 – 1250pg/mL, 1:8 – 625pg/mL, 1:16 – 312,5pg/mL,
1:32 – 156pg/mL, 1:64 – 80pg/mL, 1:128 – 40pg/mL e 1:256 – 20pg/mL) e 25µL de
diluente G apenas (Controle Negativo), foram transferidas para tubos de poliestireno de
5mL (Falcon n° 2052). Em seguida, a cada tubo foram adicionados 17,5µL da mistura
Metodologia
50
de esferas de captura, conjugadas com anticorpos monoclonais anti-IL-2, IL-4, IL-6, IL-
10, TNF, IFN- e IL-17 (para o Human Th1/Th2/Th17 Cytokine CBA Kit) e 20µL do
reagente B (reagente presente no kit CBA), que corresponde a um coquetel de
anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas, conjugados com o fluorocromo
ficoeritrina (PE) ou 15µL da mistura de esferas de captura, conjugadas com anticorpos
monoclonais anti-IL-1β, IL-6, CXCL-8, IL-10, IL-12p70 e TNF (para o Human
Inflammation CBA Kit) e 18µL do reagente B, citado acima, com subsequente
homogeneização e incubação por 3 horas, à temperatura ambiente, ao abrigo da luz.
Após a incubação, foram adicionados a cada tubo 500µL da solução F (tampão de
lavagem, reagente presente no kit CBA), seguido de centrifugação a 1.500 rpm, por 10
minutos a 18°C. Após centrifugação, foram aspirados aproximadamente 280µL do
sobrenadante de cada tubo. As esferas de captura foram então ressuspendidas no vortex
e as amostras foram imediatamente analizadas em citômetro de fluxo.
4.7.2 Aquisição e análise dos dados de avaliação dos níveis séricos de
citocinas
A aquisição dos dados obtidos foi realizada no citômetro de fluxo LSR Fortessa®
(BD), através da utilização do “BD CBA Template”. As esferas fluorescentes presentes
no kit CBA são projetadas para serem excitadas com o “Laser Vermelho”, filtro de
detecção 660/20. Já os anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas usados na
revelação estavam conjugados ao fluorocromo PE, excitado com o “Laser Azul”, filtro
de detecção 575/26. Após as etapas de marcação, um total de 3.000 eventos/região (R1)
foram obtidos com base em gráficos de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC)
para cada citocina avaliada pelo método. Para a análise dos dados, inicialmente as
microesferas conjugadas com anticorpos monoclonais de captura correspondentes a
cada citocina, foram segregadas em gráficos de distribuição pontual de microesferas
marcadas x PE, onde as seis/sete esferas com intensidades de fluorescência distintas
ocuparam posições específicas ao longo do eixo Y. A análise do deslocamento das
esferas ao longo do eixo X foi empregada como variável proporcional à concentração de
cada citocina presente na amostra (Fig. 4).
Metodologia
51
Figura 4: Plataforma de esferas no sistema CBA. (A) Discriminação das microesferas
conjugadas com anticorpos monoclonais de captura anti-citocinas, posicionadas em
regiões específicas ao longo do eixo Y (APC-A) em gráficos de distribuição puntual PE-
A versus APC-A. (B) Deslocamento das microesferas, ao longo do eixo X (PE-A) em
gráficos de distribuição puntual PE-A versus APC-A, indicativo da concentração de
cada citocina presente nas amostras testes em análise.
Para a obtenção dos resultados da análise quantitativa de citocinas séricas, uma
curva padrão foi construída utilizando os dados dos padrões de citocinas em
concentrações conhecidas (20pg/mL – 5000pg/mL) e empregada para determinar as
concentrações de cada citocina no soro teste. Um modelo de ajustamento através da
curva do 5º parâmetro logístico, que permite o ajuste da melhor curva não linear para
dados detectáveis, foi utilizado. Dessa forma, foi possível extrapolar valores de
intensidades de fluorescência de amostras que não caíram dentro dos limites da curva
padrão. Para análise dos dados foi utilizado o software BD FCAP.
4.8 Análise dos dados
4.8.1 Análises descritivas dos dados
As análises estatísticas para avaliação do perfil sérico de citocinas foram
realizadas com auxílio do software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad San Diego, CA,
EUA). O teste de normalidade para os resultados de dosagem de citocinas indicou
A B
Metodologia
52
distribuição não paramétrica dos dados. Dessa forma, aplicou-se o teste Kruskal-Wallis,
seguido do teste de comparações múltiplas Dunn´s.
O teste de normalidade foi realizado com os resultados dos índices de
reatividade do ELISA-rK39 (IR-rK39) e as taxas de avidez, que indicou distribuição
paramétrica dos dados. Assim, o teste de Pearson foi realizado para verificar correlações
entre os IR-rK39 e as taxas de avidez em crianças do Grupo de Estudo (AS) e do Grupo
Controle Positivo (LVC). O teste de Person também foi realizado para verificar
correlações entre as taxas de avidez e o tempo de sintomas quando internados dos
pacientes com LV clássica.
As diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando p <
0,05.
4.8.2 Categorização das variáveis para análise multivariada
As distribuições das variáveis no Grupo Controle Negativo (CN) foram
utilizadas para a categorização. As regras para a categorização de cada variável estão
demonstradas na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Regras para a categorização de cada variável.
Variável/Categoria 0 1 2 3
(> mínimo) (>1º Quartil) (> Mediana) (>3º Quartil)
Índice de Reatividade
ELISA-AgT (IR-AgT) 0 0,44 0,57 0,75
Índice de Reatividade
ELISA-rK39 (IR-rK39) 0 0,53 0,59 0,79
Taxa de Avidez (TA) 0 44,79 58,87 69,04
IL-17A 0 0,1 2,69 5,71
IFN- 0 0,1 0,39 1,28
IL-4 0 0,1 0,18 0,71
IL-2 0 0,1 0,8 1,4
IL-12p70 0 0,84 2,24 4,69
TNF 0 0,01 0,1 0,33
IL-10 0 1,52 2,85 6,07
IL-6 0 1,75 3,41 6,22
IL-1 0 0,01 0,1 0,55
IL-8 0 7,3 13,21 21,67
Metodologia
53
4.8.3 Análise de regressão logística
Com o propósito de analisar a relação entre duas ou mais variáveis
independentes, numéricas ou categóricas e, variável resposta categórica, por meio de
modelos matemáticos, empregou-se a análise de regressão. Foram utilizadas as análises
de regressão binária ou binomial quando a variável resposta apresentou dois níveis de
codificação e multinomial quando a variável resposta apresentou mais de dois níveis de
codificação.
Assumindo que a variável resposta tivesse distribuição de probabilidade
binomial 𝑌𝑖~𝐵(𝑚𝑖, 𝜋𝑖) , tal que 𝑃(𝑌𝑖 = 𝑦𝑖) = (𝑚𝑖𝑦𝑖
) 𝜋𝑖𝑦𝑖(1 − 𝜋𝑖)
𝑚𝑖−𝑦𝑖 , foi utilizada a
função de ligação logito 𝑙𝑛 (𝜋𝑖
1− 𝜋𝑖) = 𝛽0 + 𝛽𝑖𝑥𝑖. O método da máxima verossimilhança
foi usado para estimativa dos parâmetros 𝛽0 𝑒 𝛽𝑖.
A interpretação dos parâmetros 𝛽0 𝑒 𝛽𝑖 do modelo de regressão logística foi
obtida comparando-se a probabilidade de sucesso com a probabilidade de fracasso,
usando a função odds ratio - OR (razão de chances). Essa função, obtida a partir da
razão entre essas duas probabilidades, foi representada pela equação: OR = g(x) =
𝜋(𝑥)𝑖
1− 𝜋(𝑥)𝑖 = 𝑒𝛽0+ 𝛽𝑖𝑥𝑖 .
As relações entre variáveis seguiram as seguintes orientações: para 𝛽𝑖 > 0, OR
foi considerada maior que 1 (OR > 1) e para 𝛽𝑖 < 0, OR foi considerada menor que 1
(OR < 1).
Posteriormente à estimativa dos coeficientes, a significância das variáveis no
modelo foi avaliada pelos testes de Wald e da Razão da Verossimilhança e a seleção das
variáveis seguiu o método Stepwise. O teste de Wald, obtido por comparação entre a
estimativa de máxima verossimilhança do parâmetro 𝛽𝑖 e a estimativa de seu erro
padrão, foi utilizado para seleção de variáveis quando a probabilidade foi menor que
0,25 (p < 0,25). A estatística do teste Wald, sob a hipótese nula 𝐻0: 𝛽𝑖 = 0 , tem
distribuição normal padrão.
O teste da Razão da Verossimilhança (G) comparou os valores da estatística
Deviance (D) com e sem a variável selecionada no modelo, conforme a descrição: G =
D(modelo sem a variável) – D(modelo com a variável). Sob a hipótese nula 𝐻0: 𝛽𝑖 = 0,
a estatística G, que tem distribuição qui-quadrado com 1 grau de liberdade, foi utilizada
Metodologia
54
para definição das variáveis do modelo final quando a probabilidade foi menor que 0,05
(p < 0,05).
4.8.4 Análise discriminante
Com o objetivo de classificar os elementos da amostra foi utilizada a análise
discriminante, um método estatístico que permite a construção de uma regra matemática
de classificação ou discriminação, fundamentada na teoria das probabilidades. Para sua
aplicação, os grupos foram definidos a priori, considerando-se suas características
gerais. A técnica aferiu as medidas das “p-variáveis” previamente selecionadas pelo
modelo de regressão logística e estabeleceu uma regra para classificação de novos
elementos nos dois grupos estudados, com o menor erro de decisão possível.
O princípio da máxima verossimilhança foi utilizado para construção da regra de
classificação e a qualidade da discriminação relacionou-se ao grau de intersecção entre
as duas distribuições de probabilidades. Assim, a razão de verossimelhança:γ (x) =
𝑓𝑢𝑛çã𝑜 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑥 𝑛𝑜 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 1
𝑓𝑢𝑛çã𝑜 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑥 𝑛𝑜 𝑔𝑟𝑢𝑝𝑜 2 =
𝑓1(𝑥)
𝑓2(𝑥), estava relacionada com a diferença das
distâncias euclidianas ponderadas ao quadrado de x a 𝜇1 e x a 𝜇2 , sendo o fator de
ponderação igual ao inverso da variância 𝜎2 . Quando γ (x) > 1, x foi classificado no
grupo 1 porque se localizava mais próximo de 𝜇1. Quando γ < 1, x foi classificado no
grupo 2 porque se localizava mais próximo de 𝜇2.
A avaliação da qualidade do ajuste da regra de discriminação foi feita através da
estatística de teste de Hotelling (H) para dois grupos independentes. Sob a hipótese de
normalidade multivariada, a estatística H tem distribuição F com p e (n1 + n2 – p – 1)
graus de liberdade. Assim, para o nível α = 0,05, a hipótese de igualdade das médias foi
rejeitada quando o valor da estatística F foi maior que o valor crítico tabelado.
4.8.5 Árvores de classificação
Para maior aplicabilidade e praticidade dos modelos estatísticos preditivos, a
árvore de classificação e regressão (CART), uma abordagem não-paramétrica que
utiliza classificação (quando a variável resposta assume valores categóricos), quanto à
regressão (quando a variável resposta assume valores contínuos) das variáveis, foi
Metodologia
55
utilizada para subdividir o conjunto de dados em grupos mais homogêneos em relação à
probabilidade do desfecho que está sendo avaliado.
A partir das variáveis selecionadas pelo modelo de regressão logística, CART
realizou uma partição recursiva binária a partir do conjunto inteiro, denominado nó
principal ou raiz, em subconjuntos cada vez mais homogêneos. Os critérios de seleção
para a melhor divisão foram baseados na maior homogeneidade ou menor grau de
impureza dos subconjuntos. Este grau de impureza que foi definido pela estatística
Deviance (D). Com base nessas medidas, o algoritmo realizou pesquisa para todas as
variáveis e selecionou a variável que promoveu a melhor divisão em termos de gerar
grupos mais homogêneos em relação à probabilidade do desfecho. Após alcance de
equilíbrio entre grau de homogeneidade em uma amostra específica e taxa de
classificação correta do modelo quando aplicado a um novo conjunto de dados, a árvore
foi podada e a acurácia na classificação do conjunto de dados foi determinada.
5.0 RESULTADOS
Resultados
57
5.1 Seleção por meio dos testes sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 e do
ensaio molecular de qPCR de crianças com infecção assintomática por L.
infantum
As 179 amostras de sangue periférico coletadas por punção venosa foram
submetidas aos testes sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 e ao ensaio molecular
de qPCR, com o intuito de selecionar as crianças com infecção assintomática por L.
infantum. Pelo teste de ELISA-AgT foram diagnosticadas 30 amostras positivas,
enquanto que para o ensaio de ELISA-rK39 foram diagnosticadas 44 amostras
positivas, sendo que um total de 64 amostras foram positivas em pelo menos um dos
testes realizados (Tab. 2). Já pelo ensaio molecular de qPCR foram diagnosticadas 24
amostras positivas (Tab. 2).
Tabela 2: Distribuição dos resultados apresentados pelos testes sorológicos (ELISA-
AgT e ELISA-rK39) e pelo ensaio molecular (qPCR) realizados.
Positivas Negativas
ELISA – AgT 30 149
ELISA – rK39 44 135
ELISA – AgT e/ou ELISA – rK39 64*
115
qPCR 24 155
*10 amostras foram positivas nos dois testes sorológicos simultaneamente.
Observou-se que algumas amostras foram positivas em mais de um teste de
diagnóstico. Sendo 10 amostras diagnosticadas positivas simultaneamente nos dois
testes sorológicos realizados e apenas 7 amostras foram positivas em pelo menos um
dos testes sorológicos e pelo ensaio molecular de qPCR simultaneamente (Fig. 5).
Resultados
58
Figura 5: Associação entre resultados positivos para infecção assintomática por L.
infantum de acordo com os testes sorológicos (ELISA-AgT e ELISA-rK39) e a qPCR.
Sendo assim, das 179 crianças avaliadas no estudo, 81 crianças apresentaram
diagnóstico positivo em qualquer um dos testes realizados (ELISA-AgT, ELISA-rK39 e
qPCR) e foram diagnosticadas com infecção assintomática, sendo incluídas no Grupo
de Estudo (AS) deste trabalho (Fig. 5) e 98 crianças que apresentaram diagnóstico
negativo em todos os testes realizados (ELISA-AgT, ELISA-rK39 e qPCR), foram
incluídas no Grupo Controle Negativo (CN) .
As 43 amostras de soro coletadas de crianças com LV clássica, diagnosticadas e
acompanhadas no Hospital Infantil João Paulo II, armazenadas em congelador -70°C no
Laboratório de Pesquisas Clínicas (CPqRR/FIOCRUZ-MG), foram incluídas no Grupo
Controle Positivo (LVC) e submetidas ao teste de ELISA-AgT e ELISA-rK39.
Dos 43 pacientes selecionados apenas 19 possuíam amostras de sangue total que
foram submetidas ao ensaio molecular de qPCR.
Na tabela 3 podemos observar a distribuição dos resultados apresentados pelos
testes sorológicos de ELISA-AgT, ELISA-rK39 e pela qPCR para o grupo LVC.
ELISA- AgT
Resultados
59
Tabela 3: Distribuição dos resultados apresentados pelos testes sorológicos de ELISA-
AgT, ELISA-rK39 e pela qPCR, dos pacientes com LV clássica.
Positivas Negativas Total de Amostras
Ensaiadas por Teste
ELISA – AgT 43 0 43
ELISA – rK39 42 1
qPCR 15 4 19
A tabela 4 mostra a distribuição dos resultados apresentados pelas 19 amostras
que foram submetidas aos testes sorológicos de ELISA AgT, ELISA-rK39 e ao ensaio
molecular de qPCR. Através da tabela podemos observar que 15 amostras foram
positivas simultaneamente para os dois testes sorológicos realizados e a qPCR e apenas
4 amostras apresentaram resultados negativos pelo ensaio molecular.
Tabela 4: Associação dos resultados apresentados pelas 19 amostras que foram
submetidas aos testes sorológicos de ELISA AgT, ELISA-rK39 e ao ensaio molecular
de qPCR .
qPCR
Positivo Negativo
ELISA- AgT Positivo 15 4
Negativo 0 0
ELISA - rK39 Positivo 15 4
Negativo 0 0
ELISA- AgT e ELISA - rK39 Positivo 15 4
Negativo 0 0
Considerando a amostragem total, das 222 crianças, 46,85% são do sexo
feminino e 53,15% do sexo masculino, a média de idade da população estudada é de
Resultados
60
59,14 meses (± 5 anos), sendo a menor idade 3 meses e a maior idade 10 anos. Na
tabela 5 é possível observar a distribuição das crianças de acordo com o grupo no qual
foram inseridas, o tempo de sintoma quando internadas, no caso das crianças com LV
clássica, a idade e o sexo.
Tabela 5: Caracterização das crianças identificadas com infecção assintomática (AS),
diagnosticadas com LV clássica (LVC) e residentes das áreas endêmicas que
apresentaram testes sorológicos e ensaio molecular negativos (CN).
Grupos Número de crianças Sexo
Idade
Tempo de
sintoma quando
internada
M F 4 a 40
dias
2 a 4
meses
AS 81 49 32 1 a 9 anos * *
LVC 43 22 21 3 meses a 10 anos 39 4
CN 98 47 51 1 a 10 anos * *
M = masculino; F = feminino
A figura 6 abaixo mostra a distribuição das crianças em porcentagem de acordo
com a idade, nos diferentes grupos. Os dados demonstraram que 75% dos casos de LV
clássica ocorreram em crianças com idade entre 1 a 5 anos.
Resultados
61
Figura 6: Distribuição em porcentagem das crianças incluídas no grupo AS (Fig. A),
LVC (Fig. B) b) e CN (Fig. C) em relação à idade.
Já a figura 7 abaixo, mostra em porcentagem a distribuição das crianças que
pertencem ao Grupo Controle Positivo (LVC) de acordo com o tempo de evolução da
doença.
Figura 7: Distribuição em porcentagem das crianças que pertencem ao grupo LVC em
relação ao tempo de sintoma quando internadas.
As crianças do grupo LVC, apresentavam a doença na fase aguda, já que o
tempo de manifestações clínicas até o momento da internação de 39 crianças (91%)
variou de 4 dias a pouco mais de 1 mês e 4 pacientes apresentaram as manifestações
clínicas da doença entre 2 a 4 meses (Tab. 5 e Fig. 7).
A B C
Resultados
62
5.2 Perfil de avidez de anticorpos IgG em crianças com LV assintomática e LV
clássica
As 86 amostras de soro que apresentaram resultado positivo para o teste de
ELISA-rK39 foram submetidas ao teste de avidez de anticorpos IgG. Destas amostras
44 pertencem a crianças identificadas com infecção assintomática (Grupo de Estudo) e
42 pertencem a crianças que foram diagnosticadas com LV clássica (Grupo Controle
Positivo). Os dados mostraram média taxa de avidez (entre 41 e 70%), em 29 (66%) das
amostras avaliadas no Grupo AS. Altas taxas de avidez (acima de 70%) foram
observadas em 27 (64%) das crianças com LV clássica. A tabela 6 mostra o perfil de
avidez de anticorpos IgG encontrado no Grupo de Estudo (AS) e no Grupo Controle
Positivo (LVC).
Tabela 6: Perfil de avidez de anticorpos IgG observado em crianças com infecção
assintomática e clássica por L.infantum.
Formas
Clínicas da LV
Taxa de Avidez dos anticorpos IgG Número de
Crianças < 40% (baixa) 41 – 70% (média) >70% (alta)
Assintomática 9 (20%) 29 (66%) 6 (14%) 44
Clássica 5 (12%) 10 (24%) 27 (64%) 42
5.3 Correlação entre as taxas de avidez de anticorpos IgG com a evolução da
infecção em crianças com LV clássica
O Teste de Pearson foi realizado para verificação da correlação entre o tempo de
sintomas quando internadas e as taxas de avidez de anticorpos IgG (TA), em crianças
que pertencem ao Grupo Controle Positivo (LVC) (Fig. 8). Os resultados demonstraram
correlação fraca e não significativa de 0,250 (p = 0,110).
Resultados
63
Figura 8: Correlação entre tempo de sintoma, determinado em dias, e as taxas de avidez
em crianças com LV clássica. Os resultados, apresentados no gráfico de dispersão,
destacam concentração não linear dos valores da avidez entre 0 e 40 dias.
5.4 Correlação entre os índices de reatividade para ELISA-rK39 e a taxa de
avidez de anticorpos IgG, em crianças que apresentam LV assintomática e
LV clássica
Testes de Pearson também foram realizados para verificar correlações entre os
índices de reatividade para ELISA-rK39 (IR-rK39) e as taxas de avidez (TA) em
crianças do Grupo de Estudo (AS) e do Grupo Controle Positivo (LVC). Em crianças
AS, foi observado o resultado de - 0,646 (p = 0,0001) para a correlação IR-rK39/TA.
No grupo LVC, foi observado o resultado de 0,823 (p = 0,0001) também para a
correlação IR-rK39/TA. Estas correlações estão representadas na figura de dispersão
bidimensional abaixo (Fig. 9).
1101009080706050403020
120
100
80
60
40
20
0
AV
Tempo
r=0,250; p=0,110
TA
Resultados
64
Figura 9: Correlações entre os índices IR-rK39 e taxa de avidez em crianças que
apresentam infecção assintomática e clássica. Os resultados, apresentados no gráfico de
dispersão bidimensional, destacam relação linear entre os índices IR-rK39 e avidez no
Grupo LVC e concentração não linear dos valores da avidez entre baixos valores dos
índices de IR-rK39.
Os dados demonstraram moderada correlação negativa entre IR-rK39/TA, em
crianças do grupo AS e forte correlação positiva entre IR-rK39/TA, no grupo LVC. Os
dados sugerem que a taxa de avidez dos anticorpos IgG pode vir a ser um marcador
sorológico indicativo de infecção recente ou não.
5.5 Perfil sérico da quimiocina CXCL-8, das citocinas pró-inflamatórias, anti-
inflamatórias/moduladoras e IL-17A em crianças com LV assintomática e
LV clássica
5.5.1 Avaliação do perfil sérico da quimiocina CXCL-8 em crianças com LV
assintomática e LV clássica
O perfil de CXCL-8 circulante de crianças que pertencem ao Grupo Controle
Negativo (CN), ao Grupo de Estudo (AS) e ao Grupo Controle Positivo (LVC), foi
avaliado pelo método CBA e está representado na figura 10 abaixo. Os dados
AS - r = - 0,654; p = 0,0001
LVC - r = 0,823; p = 0,0001
TA
Resultados
65
demonstraram menor nível sérico de CXCL-8 nos grupos CN e AS quando comparados
ao grupo LVC.
Figura 10: Avaliação do perfil sérico da quimiocina CXCL-8 em crianças que
pertencem ao Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS = 81) e ao
Grupo Controle Positivo (LVC = 43). Os resultados estão apresentados como níveis
séricos da CXCL-8 em pg/mL, em gráficos de barra destacando a mediana e o intervalo
interquartil. As diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) dos grupos CN e AS
em relação ao grupo LVC estão representadas pela letra c.
5.5.2 Avaliação do perfil sérico de citocinas pró-inflamatórias em crianças
com LV assintomática e LV clássica
O perfil de citocinas pró - inflamatórias circulantes de crianças que pertencem ao
Grupo Controle Negativo (CN), ao Grupo de Estudo (AS) e ao Grupo Controle Positivo
(LVC), foi avaliado pelo método CBA e está representado na figura 11 abaixo. Os
dados demonstraram menor nível sérico das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1,
TNF e IFN- nos grupos CN e AS quando comparados ao grupo LVC. Nenhuma
diferença estatisticamente significativa foi observada para as citocinas IL-12p70 e IL-2
entre os grupos avaliados.
Avaliação do Perfil Sérico de IL-8 (CXCL8)
CN AS
LCV
0
75
150
cc
CX
CL-8
(pg/m
L)
Resultados
66
Figura 11: Avaliação do perfil sérico de citocinas pró-inflamatórios em crianças que
pertencem ao Grupo Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS = 81) e ao
Grupo Controle Positivo (LVC = 43). Os resultados estão apresentados como níveis
séricos de IL-6, IL-1, TNF, IL-12p70, IL-2 e IFN- em pg/mL, em gráficos de barra
destacando a mediana e o intervalo interquartil. As diferenças estatisticamente
significativas (p < 0,05) dos grupos CN e AS em relação ao grupo LVC estão
representadas pela letra c.
5.5.3 Avaliação do perfil sérico de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras
em crianças com LV assintomática e LV clássica
O perfil de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras circulantes de crianças
pertencentes ao Grupo Controle Negativo (CN), Grupo de Estudo (AS) e ao Grupo
Controle Positivo (LVC), foi avaliado pelo método CBA e está representado na figura
12 abaixo. Os dados demonstraram menor nível sérico da citocina moduladora IL-10
nos grupos CN e AS quando comparados ao grupo LVC. Nenhuma diferença
estatisticamente significativa foi observada para a citocina anti-inflamatória IL-4 entre
os grupos avaliados.
IL-6 IL-1
TNF IL-12p70
IL-2 IFN-
Perf
il d
e C
itocin
as
Séricas (
pg/m
L)
Avaliação do Perfil de Citocinas Pró-Inflamatórias
0
5
1010
80
150
cc
0.00
0.25
0.500.50
10.25
20.00
cc
0.00
0.25
0.500.50
5.25
10.00
cc
0
8
16
CN ASLVC
0
2
4
CN ASLVC
0.00
1.25
2.502.50
76.25
150.00
c
c
Citocin
as p
ró -
inflam
ató
ria
s (
pg/m
L)
Resultados
67
Figura 12: Avaliação do perfil sérico de citocinas anti-inflamatórias/moduladoras em
crianças pertencentes ao Grupo Controle negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS
= 81) e ao Grupo Controle Positivo (LVC = 43). Os resultados estão apresentados como
níveis séricos de IL-4 e IL-10 em pg/mL, em gráficos de barra destacando a mediana e o
intervalo interquartil. A diferença estatisticamente significativa (p<0,05) dos grupos CN
e AS em relação ao grupo LVC está representada pela letra c.
5.5.4 Avaliação do perfil sérico da citocina IL-17A em crianças com LV
assintomática e LV clássica
O perfil de IL-17A circulante de crianças pertencentes ao Grupo Controle
Negativo (CN), ao Grupo de Estudo (AS) e ao Grupo Controle Positivo (LVC), foi
avaliado pelo método CBA e está representado na figura 13 abaixo. Os dados
demonstraram maior nível sérico da citocina IL-17A no grupo AS quando comparado
ao grupo LVC.
IL-4 IL-10
Avaliação do Perfil de Citocinas Anti-Inflamatórias/moduladorasP
erf
ild
e C
ito
cin
as
Sé
rica
s(p
g/m
L)
CN AS
LVC
0
1
2
CN AS
LVC
0
50
100
c c
Citocin
as a
nti –
inflam
ató
rias/
modula
dora
s (
pg
/mL)
Resultados
68
Figura 13: Avaliação do perfil de IL-17A circulante em crianças pertencentes ao Grupo
Controle Negativo (CN = 98), ao Grupo de Estudo (AS = 81) e ao Grupo Controle
Positivo (LVC = 43). Os resultados estão apresentados como níveis séricos de IL-17A
em pg/mL, em gráficos de barra destacando a mediana e o intervalo interquartil. A
diferença estatisticamente significativa (p<0,05) do grupo AS em relação ao grupo LVC
está representada pela letra c.
5.6 Identificação de biomarcadores imunológicos úteis para a compreensão dos
fatores que determinam o curso da infecção por L. infantum e que possam
ter potencial aplicação para auxiliar na detecção da infecção assintomática.
5.6.1 Análise de regressão logística
Para identificação de biomarcadores que pudessem estar associados à LV
assintomática e que fossem úteis para melhor compreender fatores determinantes para o
curso da infecção, análises estatísticas multivariadas foram usadas.
Primeiramente uma análise de regressão logística foi realizada. A primeira etapa
da análise de regressão logística, caracterizada pela análise univariada, identificou as
variáveis IR-rK39, TA, IL-17A, IFN-, TNF, IL-1 e IL-8 como representativas para
modelagem logística (p< 0,25). Essas variáveis pré-selecionadas foram incluídas no
modelo geral da análise de regressão logística e, pelo método Stepwise, ao comparar os
testes da Razão da Verossimilhança (G) dos modelos com e sem a variável previamente
Avaliação do Perfil Sérico de IL-17A
I
L-1
7A
(pg/m
L)
CN ASLVC
0.00
0.25
0.500.50
5.25
10.00 c
Resultados
69
selecionada, foram definidos os biomarcadores TA, IL-17A, IFN-, e IL-1 para o
modelo final.
Considerando os Grupos de Estudo (AS) e Controle Positivo (LVC), foi aplicada
a fórmula geral 𝑙𝑜𝑔 [𝜋𝐿𝑉𝐶
𝜋𝐴𝑆] = 𝛼 + 𝛽𝑖𝑥𝑖, onde i representa o biomarcador selecionado, α
representa o intercepto, β representa o coeficiente do biomarcador e x representa o valor
quantitativo do biomarcador. A análise de regressão ajustou o modelo final 𝑙𝑜𝑔 [𝜋𝐿𝑉𝐶
𝜋𝐴𝑆] =
−3,68 + 0,61𝑥𝐴𝑉 + (−0,59)𝑥𝐼𝐿−17𝐴 + 0,99𝑥𝐼𝐹𝑁− + 0,46𝑥𝐼𝐿−1 para os dados. A
tabela 7 abaixo demonstra os valores dos coeficientes do modelo, com respectivos
intervalos de confiança, escores Z e valores P.
Tabela 7: Resultados da análise de regressão logística comparando os grupos AS e
LVC em relação aos preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1
Modelo final comparativo entre AS e LVC
Coeficiente β IC 95% Escore Z Valor P
Intercepto -3,68 (-5,34;-2,01) 4,35 0,0131
Avidez 0,61 (0,23;0,98) 3,11 0,0018
IL-17A -0,59 (-0,98;-0,19) -2,92 0,0034
IFN- 0,99 (0,42;1,55) 3,36 0,0007
IL-1 0,46 (0,12;0,79) 2,64 0,0081
Log-Likelihood = -49.301; Likelihood ratio test: chisq = 61.463 (p.value = 1.4285e-12)
A partir do modelo final acima, foram calculadas as Odds Ratios (OR) dos
preditores selecionados pela fórmula: 𝑒𝛽𝑖.
A tabela 8 abaixo representa os valores das OR para os preditores selecionados,
com respectivos intervalos de confiança e valores P.
Resultados
70
Tabela 8: Resultados da análise de regressão logística associando os grupos AS e LVC
aos preditores TA , IL-17A, IFN- e IL-1
OR IC 95% Valor P
TA 1,84 (1,27;2,67) 0,0023
IL-17A 0,55 (0,37;0,82) 0,0039
IFN- 2,69 (1,52;4,75) 0,0001
IL-1 1,58 (1,14;2,21) 0,0013
Os resultados indicaram uma substancial diminuição na OR no grupo LVC
relacionada à IL-17A (OR = 0,55; IC 95%: 0,37;0,82) (P = 0,0039). Como este
biomarcador esta mais elevado no grupo AS, podemos sugerir uma possivel proteção
para desenvolvimento da LVclássica. Inversamente, os resultados apontaram relevantes
aumentos nas OR no grupo LVC relacionados às citocinas IFN- e IL-1. De acordo
com o modelo ajustado, níveis circulantes de IFN- quase três vezes superiores aos
níveis do grupo AS foram encontrados no grupo LVC (OR = 2,69; IC 95%: 1,52;4,75)
(P = 0,0001). No mesmo sentido das citocinas IFN- e IL-1, a TA no grupo LVC foi
quase duas vezes superior ao grupo AS (OR = 1,84; IC 95%: 1,27;2,67)(P = 0,0023).
5.6.2 Análise discriminante
Após a realização da análise de regressão logística foi realizada a análise
discriminante dos dados. A tabela 9 abaixo apresenta os resultados obtidos da função
discriminante quadrática pelos métodos de ressubstituição e de validação cruzada dos
preditores selecionados previamente pela análise de regressão logística.
Resultados
71
Tabela 9: Resultados da avaliação da função discriminante quadrática entre os grupos
AS e LVC para os preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1
Função quadrática
Método de Ressubstituição
População classificada População real
Grupo AS LVC
AS 65 5
LVC 16 38
Total 81 43
Número de acertos 65 38
Proporção de acerto 0,802 0,884
N = 124; No de acertos = 103; Proporção global de acerto = 0,83
Método da validação cruzada
População classificada População real
Grupo AS LVC
AS 63 7
LVC 18 36
Total 81 43
Número de acertos 63 36
Proporção de acerto 0,778 0,837
N = 124; No de acertos = 99; Proporção global de acerto = 0,798
Foram observados 16 elementos do grupo AS e 5 elementos do grupo LVC
classificados incorretamente, o que resultou nas seguintes porcentagens de acertos: 80%
para o grupo AS e 88% para o grupo LVC, sendo a proporção global de acertos de 83%
para o método de ressubstituição. Para a validação cruzada, os dados mostraram 77%
para o grupo AS e 83% para o grupo LVC, sendo a proporção global de acertos de 79%
para o método de validação cruzada. Estas proporções globais indicaram boa qualidade
da função discriminante dos biomarcadores preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1 entre
os grupos AS e LVC.
Resultados
72
5.6.3 Árvore de classificação
O método CART (Classification and Regression Trees), proposto para
classificação dos biomarcadores TA, IL-17A, IFN- e IL-1, que foram previamente
categorizados (vide Tabela 1) e selecionados na análise de regressão logística (vide
tópico 5.6.1 Análise de Regressão Logística), criou uma regra de classificação desses
preditores entre os grupos AS e LVC. A figura 14 demonstra a árvore de classificação
dos biomarcadores TA, IL-17A, IFN- e IL-1 pelo método CART.
Figura 14: Árvore de classificação dos biomarcadores preditores TA, IL-17A, IFN- e
IL-1 entre os grupos AS (AS = 1 ou rosa claro) e LVC (LVC = 2 ou rosa escuro). Nos
retângulos, a gradação da cor rosa, do claro ao escuro, destaca o aumento da
probabilidade de desenvolvimento da LVC e, o “N”, com seu respectivo percentual, a
quantidade de crianças alocadas após a divisão do nó antecedente. Para converter o
valor padronizado do biomarcador ao seu correspondente sérico, utilizar a Tabela 1 de
1.3
N=124 100%
TA < 2.5sim não
1
1.2
N=86 69%
IFN- < 2.5
2
1
N=40 32%
4
1.7
N=38 31%
IFN- < 2.5
3
1.3
N=46 37%
IL17A ≥ 0.5
5
1.1
N=33 27%
8
1.6
N=13 10%
9
1.2
N=9 7%
6
1.9
N=29 24%
IL1 < 1.5
1.7
N=14 12%
10
2
N=15 12%
11
7
Resultados
73
padronização das variáveis para análise multivariada (subitem 4.8.2 Categorização das
variáveis para análise multivariada, em Metodologia).
A primeira variável de inicialização (“nó raiz”) foi a taxa de avidez. Valores
categorizados de taxa de avidez menores que 2,5 ou valores reais menores que 73,58%
juntamente com valores categorizados de IFN- menores que 2,5 ou valores reais
menores que 0,48 pg/mL, detectados em 40 crianças, indicaram decisão a favor de LV
assintomática.
Para valores categorizados de taxa de avidez maiores que 2,5 ou valores reais
maiores que 73,58%, acompanhados de valores categorizados (ou reais) de IFN-
maiores que 2,5 (0,48 pg/mL ) e de IL-1 maiores que 1,5 (0,075 pg/mL ), a decisão
favoreceu 15 crianças com LV clássica.
Entre os polos AS e LVC demonstrados na Figura 12, foi possível observar
associações entre os biomarcadores preditores TA, IFN-, IL-17A e IL-1 que,
globalmente, indicaram o grupo AS com os seguintes valores: menor TA, maior IL-17A
e menor IFN-; e indicaram o grupo LVC com os valores: maior TA, maior IFN-; e
elevado IL-1.
6.0 DISCUSSÃO
Discussão
75
Uma lacuna frequentemente evidenciada em inquéritos epidemiológicos
realizados em áreas endêmicas para LV é a dificuldade no diagnóstico da infecção
assintomática por L. infantum. Os métodos de diagnóstico sorológico disponíveis, que
são altamente sensíveis para detecção da LV clássica, não apresentam o mesmo
desempenho e eficiência, quando utilizados para identificação da infecção assintomática
(de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009; dos Santos Marques et al., 2012).
Neste contexto, no presente estudo, foi adotado como estratégia para
diagnosticar a infecção assintomática, a combinação de dois testes sorológicos (ELISA-
AgT e ELISA-rK39) e a técnica molecular de PCR em tempo real quantitativo para
aumentar a sensibilidade na detecção de indivíduos com infecção assintomática por L.
infantum, residentes em três áreas de abrangência da Regional Noroeste de Belo
Horizonte (Serrano, Pindorama e Glória).
Na análise dos resultados dos testes diagnósticos realizados, foi observado que a
co-positividade entre a qPCR e os dois testes sorológicos foi notavelmente baixa, pois
não foi detectado pela técnica molecular de qPCR DNA de Leishmania em amostras de
sangue total em um número considerável de indivíduos que apresentaram diagnóstico
positivo para os testes de ELISA-AgT e/ou ELISA-rK39. Por outro lado, a técnica
molecular de qPCR permitiu a identificação da infecção assintomática de indivíduos
que apresentaram diagnóstico negativo em todos os testes sorológicos realizados (Figura
5).
Estes resultados reforçam a conclusão de outros estudos já realizados no Brasil,
onde os autores sugerem que a utilização de um único método de diagnóstico é
inadequada para a ampla identificação da infecção assintomática, e que métodos
moleculares podem ser complementares para ampliar a capacidade de detecção da
infecção assintomática (de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009; dos Santos
Marques et al., 2012). É importante ressaltar que a utilização isolada de métodos
sorológicos pode subestimar as verdadeiras taxas da infecção assintomática em áreas
endêmicas.
No entanto, a combinação de diferentes métodos para identificação da infecção
assintomática, apesar de aumentar a probabilidade em identificar maior número de
indivíduos infectados, aumentando a sensibilidade, pode diminuir a especificidade, pois
tais técnicas apresentam baixos índices de concordância (dos Santos Marques et al.,
2012). Sendo assim, a possibilidade de classificação errada não pode ser
Discussão
76
descartada, ou seja, algumas amostras negativas podem estar sendo definidas como
positivas, uma vez que o método de ELISA é pouco preciso na detecção de
assintomáticos (de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009).
Para explicar a baixa co-positividade entre as técnicas de diagnóstico molecular
e sorológicas utilizadas, dos Santos Marques et al. (2012) sugere que, no início da
infecção, antes de ocorrer a soroconversão, as técnicas moleculares são mais sensíveis
que as técnicas sorológicas, porém, com a progressão da infecção ocorre o aumento da
produção de anticorpos, favorecendo a sensibilidade dos métodos sorológicos. Assim, a
possibilidade de uso de técnicas altamente sensíveis não-invasivas, como a PCR (de
Gouvea et al., 2008) e a qPCR (dos Santos Marques et al., 2012) realizada a partir de
DNA extraído do sangue periférico, para diagnóstico da LV, têm permitido a
identificação de indivíduos assintomáticos, que não seriam identificados, caso fossem
utilizadas apenas técnicas sorológicas. Também é importante considerar a possibilidade
de amostras falso-positivas detectadas na sorologia.
Embora os testes sorológicos de ELISA-AgT e ELISA-rK39 sejam imprecisos
para diagnosticar infecções assintomáticas, os mesmos apresentaram sensibilidade de
89,8%, 88,6% e especificidade de 81% e 92,4%, respectivamente quando foram
avaliados em um estudo para o diagnóstico da forma clássica da LV (Pedras et al.,
2008), demonstrando bom desempenho e eficiência para a detecção da doença. Ao
analisar os resultados apresentados pelos testes sorológicos realizados com amostras
provenientes de crianças sintomáticas, com a confirmação da forma clínica clássica, foi
detectada que a co-positividade entre os dois testes foi considerável (Tabela 3),
concordando com o que foi demonstrado por Pedras et al. (2008).
Considerando que em áreas endêmicas, o número de indivíduos infectados com
o parasito, mas que não desenvolvem a doença, corresponde à maioria dos infectados
(Desjeux, 1992; Sakthianandeswaren et al., 2009; OMS, 2010; Antinori et al., 2012), a
prevalência da LV assintomática pode ser um indicador da extensão e manutenção de
transmissão do parasito (Costa et al., 2002; Riera et al., 2004; Romero et al., 2009; dos
Santos Marques et al., 2012).
Assim é de extrema importância identificar a infecção assintomática visando
monitorar as áreas endêmicas para direcionar melhor as ações de controle. Porém os
métodos de diagnóstico disponíveis, não apresentam o mesmo desempenho e eficiência
para detecção da LV assintomática, podendo a utilização isolada destes subestimar as
Discussão
77
verdadeiras taxas de indivíduos que abrigam temporariamente e silenciosamente, o
parasito em áreas endêmicas.
Diante destas dificuldades e desafios enfrentados em identificar a infecção
assintomática, este estudo buscou avaliar a taxa de avidez de anticorpos IgG anti-
Leishmania spp. e o perfil sérico de citocinas em crianças assintomáticas, crianças
sintomáticas, com a confirmação da forma clínica clássica e crianças não infectadas,
com o objetivo de identificar biomarcadores sorológicos e imunológicos, com potencial
aplicação para auxiliar na detecção da infecção assintomática. Estes marcadores
poderão também fornecer informações para uma melhor compreensão da evolução da
infecção por L. infantum.
Assim, 86 amostras de soro de crianças com idade entre 0 e 10 anos que
apresentaram resultado positivo para o teste de ELISA-rK39 foram submetidas ao teste
de avidez de anticorpos IgG. Destas amostras 44 pertencem a crianças identificadas com
infecção assintomática (Grupo de Estudo) e 42 pertencem a crianças que foram
diagnosticadas com LV clássica (Grupo Controle Positivo). As crianças do grupo LVC,
apresentavam a doença na fase aguda, já que o tempo de manifestações clínicas até o
momento da internação de 39 crianças (91%) variou de 4 dias a pouco mais de 1 mês e
4 pacientes apresentavam as manifestações clínicas da doença entre 2 a 4 meses,
portanto não foram avaliadas crianças com doença crônica, pois nenhuma delas
apresentou mais de 6 meses de sintomas (Figura 7).
Altas taxas de avidez, acima de 70% foram observadas em 27 (64%) pacientes
com LV clássica, (Tabela 6), sendo esse resultado consistente com o longo período de
incubação, geralmente observada na doença, e estando de acordo com o que foi
sugerido por estudos realizados por Redhu et al. (2006) e Tiburcio et al. (2013).
Ao analisar as taxas de avidez de anticorpos IgG e o tempo de evolução da
infecção em crianças com LV clássica, não foi encontrada nenhuma correlação, sendo
observadas altas taxas de avidez (94% a 100%) em pacientes que apresentavam entre 4
dias a 4 meses de manifestações clínicas da doença (Figura 8).
Estes resultados discordam dos apresentados em um estudo realizado na Índia
por Redhu et al. (2006) que avaliou a taxa de avidez de anticorpos IgG, contra o
antígeno recombinante rKE-16. Os autores concluíram que pacientes com doença
crônica que não responderam ao tratamento apresentavam taxas de avidez maiores que
70%, enquanto aqueles infectados que apresentavam manifestações clínicas nos últimos
Discussão
78
6 meses tinham valores de avidez menores que 70%, podendo o teste ser utilizado com
sucesso para estimar o tempo e a duração da infecção por Leishmania donovani.
O que pode explicar resultados tão discordantes, é que Redhu et al. (2006)
avaliou a LV causada por L. donovani que apresenta manifestações clínicas mais graves
e tempo de evolução da doença diferente do apresentado pela LV causada por L.
infantum (Chappuis et al., 2007). Outro fator que poderia explicar a divergência entre os
resultados apresentados pelo presente estudo e os dados demonstrados por Redhu et al.
(2006) foi a utilização de diferentes antígenos recombinantes na avaliação das taxas de
avidez de anticorpos IgG. Redhu et al. (2006) utilizou o antígeno recombinante KE-16 e
o presente estudo utilizou o antígeno recombinante K39. Além disso, o estudo realizado
por Redhu et al. (2006) avaliou pacientes em diferentes faixas etárias, havendo crianças
de 7 meses e adultos de 65 anos e também pacientes com doença crônica.
Embora não tenha o sido observada associação entre o tempo de sintoma clínico
na LV clássica e a taxa de avidez de IgG, quando correlacionamos os índices de
reatividade para o ELISA-rK39 e a taxa de avidez de IgG apresentada por crianças com
a doença, foi possível observar que os maiores índices de reatividade estão
correlacionados com altas taxas de avidez (Figura 9).
Das 42 crianças com LV clássica que foram avaliadas, 24 apresentaram taxa de
avidez na faixa de 86% a 100% e índice de reatividade maior do que 10, variando de 10
até 12. Apenas uma criança apresentou taxa de avidez de 100% e índice de reatividade
de 4,3. Já as 17 crianças que apresentaram taxa de avidez na faixa de 21% a 78%,
apresentaram índice de reatividade igual ou menor a 9,9 (Figura 9).
Por outro lado, quando correlacionamos os índices de reatividade para o ELISA-
rK39 e a taxa de avidez de IgG de crianças com infecção assintomática, foi possível
observar que os maiores índices de reatividade estão correlacionados com baixa taxa de
avidez e os menores índices de reatividade estão correlacionados com media e alta taxa
de avidez (Figura 9).
Das 44 crianças identificadas com infecção assintomática, 11 apresentaram a taxa de
avidez na faixa de 14% a 45% e índice de reatividade maior do que 2, variando de 2 até
8,5, sendo que apenas 2 crianças apresentaram taxa de avidez de 45% e índice de
reatividade menor que 2. Já as 31 crianças que apresentaram taxa de avidez na faixa de
50% a 80%, apenas uma apresentou índice de reatividade de 4,3, o restante apresentou
índice de reatividade igual ou menor a 1,9. Taxas de avidez, acima de 40% até 70%
Discussão
79
predominaram em crianças com LV assintomática, apresentando 66% (29) dos
indivíduos anticorpos de média avidez. Nenhuma criança identificada com infecção
assintomática apresentou taxa de avidez superior a 80% (Figura 9).
Quanto aos resultados discordantes apresentados por três amostras, podemos
considerar a possibilidade de que estas crianças foram erroneamente classificadas com
infecção assintomática pelo teste de ELISA-rK39, já que as amostras destas crianças
foram diagnosticadas como negativas pela técnica de qPCR. Estes resultados
demonstram que o teste de ELISA é impreciso para diagnosticar infecções
assintomáticas como vem sendo demonstrado na literatura (de Gouvea Viana et al.,
2008; Moreno et al., 2009; dos Santos Marques et al., 2012).
Desta forma, estes resultados obtidos evidenciam que crianças com infecção
assintomática além de apresentarem perfis de avidez de anticorpos IgG correlacionados
aos índices de reatividade distintos dos apresentados por crianças com LV clássica,
também apresentam perfis distintos entre si que podem estar provavelmente associados
com o período de tempo após a infecção. Resultados semelhantes também foram
demonstrados pelo estudo realizado por Tiburcio et al. (2013), que observou predomínio
de anticorpos de baixa avidez em indivíduos assintomáticos, logo após a detecção da
infecção, semelhante ao apresentado por indivíduos com LV clássica, que receberam o
tratamento. Houve aumento da taxa de avidez nos indivíduos assintomáticos, quando
avaliados aproximadamente 3 anos após a avaliação inicial (Tiburcio et al., 2013)
Indivíduos infectados mais que não desenvolvem a doença apresentam baixa
carga parasitária e como consequência os níveis séricos de anticorpos em geral são
baixos, e com o decorrer do tempo, estes títulos tendem a diminuir, sendo mais altos no
inicio da infecção (de Gouvea Viana et al., 2008; Moreno et al., 2009). Portanto,
podemos sugerir que indivíduos identificados com infecção assintomática que
apresentaram altos índices de reatividade, podem ter entrado em contato com o parasito
recentemente. Como baixas taxas de avidez de anticorpos IgG está correlacionada a
altos índices de reatividade, a avidez pode vir a ser um potencial marcador sorológico
para avaliar a possível evolução da infecção em crianças assintomáticas. Porém mesmo
com tantas evidências apresentadas por esse estudo e também por Tiburcio et al. (2013),
para confirmar esta hipótese, ainda é necessário que mais estudos sejam realizados.
Ao avaliarmos a dosagem sérica da quimiocina quimiotática para neutrófilos
CXCL-8, das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1, TNF, IFN-, IL-12p70 e IL-2 e
Discussão
80
das citocinas anti-inflamatórias IL-10 e IL-4, com o intuito de identificarmos
biomarcadores imunológicos na LV, nossos dados demonstraram que indivíduos
identificados com infecção assintomática apresentam perfil basal de citocinas,
semelhante aos indivíduos não infectados (Figura 10, 11 e 12). Esses dados corroboram
com aqueles obtidos por diferentes trabalhos que avaliaram o perfil de citocinas
circulantes na LV (Peruhype-Magalhães et al., 2006; Khoshdel et al., 2009; Costa et al.,
2012).
Considerando a ausência de sinais e sintomas relacionados a leishmaniose
visceral na avaliação clínica e o resultado positivo em um dos testes sorológicos ou
molecular, é possível sugerir que no momento em que são infectados por L. infantum, os
indivíduos assintomáticos controlam de maneira efetiva a infecção, mantendo a
homeostasia do sistema imune, o que explica a presença de perfil sérico de citocinas
semelhantes aos indivíduos não infectados (Peruhype-Magalhães et al., 2006).
Ao avaliarmos a dosagem sérica da citocina IL-17A, observamos que as crianças
identificadas com LV assintomática apresentaram níveis séricos da citocina IL-17A
mais altos do que aquelas crianças que desenvolveram a doença e aquelas que não estão
infectadas incluídas no grupo controle negativo, residentes das áreas endêmicas (Figura
13). Esses dados sugerem que a IL-17A desempenha papel protetor na LV, podendo ser
indicada como biomarcador imunológico para infecção assintomática. Além disso,
nossos resultados têm mostrado concordância com um estudo que buscou compreender
a importância da resposta Th1, Th2 e Th17 na LV induzida por Leishmania donovani. O
autor observou que a IL-17A, juntamente com a IL-22 e citocinas do tipo Th1,
desempenham papéis complementares no desenvolvimento de resposta imune protetora
contra LV clássica humana e qualquer alteração neste mecanismo poderia aumentar o
risco da doença (Pitta et al., 2009). Neste estudo foi relatado que indivíduos que não
desenvolveram, ou que estavam protegidos da LV durante um surto, produziram níveis
mais altos de IL-17A do que aqueles com LV clássica (Pitta et al., 2009).
As avaliações dos níveis séricos das citocinas em crianças com LV clássica
causada por L. infantum demonstraram altos níveis da quimiocina quimiotática para
neutrófilos CXCL-8, das citocinas pró-inflamatórias IL-6, IL-1, TNF, IFN- e da
citocina anti-inflamatória/moduladora IL-10, o que indica uma exacerbação da resposta
imune nestas crianças, havendo tanto elevados níveis séricos de citocinas do tipo 1 que
vêm sendo associados com a resistência à infecção, quanto elevados níveis séricos de
Discussão
81
citocinas do tipo 2 associados à suscetibilidade, que podem ser importantes no
desenvolvimento da doença ( Figura 10, 11 e 12).
Altos níveis de citocinas pró-inflamatórias na LV clássica podem também ser
associados às alterações fisiopatológicas, que ocorrem durante a doença (Costa et al.,
2012). Já elevados níveis de IL-10 tem sido associados à sobrevivência e persistência do
parasito dentro dos macrófagos (Peruhype-Magalhães et al., 2006; Nylen & Sacks,
2007) e a medida que as pesquisas que buscam classificar o perfil da resposta imune
desenvolvida na LV clássica avançam, mais evidências surgem e indicam que a IL-10 é
a principal citocina que contribui para a patogênese da LV humana, estando associada
com a gravidade da doença (Holaday et al., 1993; Caldas et al., 2005; Kurkjian et al.,
2006; Nylen & Sacks, 2007; Gautam et al., 2011; Rai et al., 2012). Esta elevação nos
níveis das citocinas IL-10, TNF e IFN- e o relato do desenvolvimento de perfil de
resposta imune descontrolado e ineficaz para o controle da LV clássica, também foi
apresentada por outros estudos (Peruhype-Magalhães et al., 2005 e 2006; Costa et al.,
2012).
O papel desempenhado pela citocina IFN-γ na leishmaniose já foi bem definido
por diferentes estudos (Heinzel et al., 1989; Liew et al., 1990 a e b; Heinzel et al.,
1991). A sua participação na ativação e no aumento da atividade microbicida de
macrófagos para matar agentes patogênicos intracelulares foi relatada por inúmeros
trabalhos (Sacks & Noben-Trauth., 2002; Tripathi et al., 2007; Mosser & Edwards,
2008; Kaye & Scott, 2011) e o seu papel no controle da leishmaniose através da indução
da expressão de iNOS ( óxido nítrico sintase induzível) e da produção de NO (óxido
nítrico) pelos fagócitos infectados por parasitos intracelulares, promovendo, assim, a
eliminação destes e resolvendo a infecção por Leishmania spp. é muito bem aceito
(Sacks & Noben-Trauth, 2002; Tripathi et al., 2007). Porém, apesar da presença de
níveis elevados de IFN-γ durante a LV clássica, há progressão da doença. Esse fato
pode ser explicado pela perda de atividade dessa citocina em pacientes doentes (Barral-
Netto et al., 1989) que pode estar relacionada com a presença simultânea de níveis
elevados de IL-10. A IL-10 parece ser a principal citocina envolvida na desativação de
macrófagos na leishmaniose humana (Carvalho et al., 1994; de Medeiros et al.,
1998; Caldas et al., 2005), não podendo descartar o papel de outras citocinas capazes de
neutralizar as atividades do IFN-γ, tais como TGF-β (Barral-Netto et al., 1992; Barral et
al., 1993; Caldas et al., 2005). Outro fator que pode justificar a relação entre o elevado
Discussão
82
nível de IFN-γ e a progressão da doença é o bloqueio do receptor de IFN-γ em
macrófagos, provocando perda da sua função protetora (Ansari et al., 2006).
Outras citocinas encontradas em altas concentrações em pacientes com LV
clássica foram o TNF-α, IL-6 e IL-8. Dados semelhantes também foram encontrados
por Peruhype-Magalhães et al. (2006) e Costa et al. (2013), que também observaram
elevados níveis de IL-1 em pacientes com LV clássica.
O TNF- tem papel importante na progressão das doenças infecciosas, porque
induz a produção excessiva de NO. Essa citocina, juntamente com IL-6 são mediadores
centrais de alterações fisiopatológicas associadas à sepse, a distúrbios orgânicos e à
resposta de fase aguda (Neta et al., 1992). O TNF- α é responsável por parte dos sinais e
sintomas da doença, tais como febre, anorexia, perda de peso, maior gasto de energia,
palidez cutânea e das mucosas e induz ativação policlonal das células B (Tracey et al.,
1988; Hirano, 1998; Engwerda et al., 2004).
Os níveis séricos de IL-6 em pacientes com LV clássica, permanecem
significativamente elevados em comparação com indivíduos do grupo controle, mesmo
após o tratamento, o que indica que ela pode ter papel na patogênese e também papel
benéfico na resolução da doença (Caldas et al., 2005; Ansari et al., 2006). Considerando
o papel benéfico da IL-6, alguns estudos tem relacionado essa citocina com a resposta
Th1 (Yamamoto et al., 2000), bem como, com o desenvolvimento de células Th17
(Ouyang et al., 2009), sugerindo que a IL-6 seja importante na manutenção de um
equilíbrio entre as respostas de células T durante a doença (Bhattacharya & Ali, 2013).
Também a IL-1 afeta a patogenicidade da leishmaniose pela geração de
resposta inflamatória tecidual e modulação da resposta imune adaptativa mediada por
células T. IL-1 parece estar associada à severidade da LV (Voronov et al., 2010;
Moravej et al., 2012).
A IL-8, quimiocina envolvida no recrutamento e ativação de neutrófilos para o
local da infecção (Sallusto, 1999), tem apresentado nível elevado no sobrenadante de
cultura de PBMC e no soro de indivíduos portadores de LV clássica (Raziuddin et al.,
1994; Santos-Oliveira et al., 2011; Datta et al., 2015). Estes dados dão suporte às nossas
análises dos níveis séricos de IL-8 e mostram o envolvimento de células da imunidade
inata no estabelecimento da resposta imune na LV humana.
A citocina IL-4 que foi inicialmente considerada como um marcador para
doença (Mary et al., 1999), no presente estudo apresenta níveis muito baixos no soro de
Discussão
83
pacientes com LV clássica, semelhantes aos encontrados em indivíduos não infectados,
concordando com resultados obtidos por outros estudos (Ansari et al., 2006; Peruhype-
Magalhães et al., 2006). Os dados sugerem então papel pouco expressivo da IL-4 no
contexto da doença ativa.
Nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada para as citocinas
IL-12p70 e IL-2 entre os grupos avaliados. Hailu et al. ( 2004) também não encontrou
níveis elevados de IL-12p70 nos diferentes grupos que avaliou. Em experimentos
realizados in vitro, tem-se observado que níveis muito baixos de IL-12p70 são
suficientes para influenciar a produção de IFN-γ, o que também pode explicar elevados
níveis de IFN-γ apresentados por pacientes com LV clássica (Lauw et al., 1999). Já em
relação à IL-2, Peruhype-Magalhães et al. (2006) também não observou aumento dos
níveis séricos dessa citocina em pacientes com LV clássica, sugerindo a ausência de
ativação linfocítica eficaz durante a doença ativa.
Para a identificação de biomarcadores que pudessem estar associados à LV
assintomática e que fossem úteis para melhor compreender fatores determinantes para o
curso da infecção, a análise estatística de regressão logística foi realizada, identificando
as variáveis IR-rK39, TA (Taxa de Avidez), IL-17A, IFN-, TNF, IL-1 e IL-8 como
representativas e através de novas análises, foram definidos os biomarcadores TA, IL-
17A, IFN-, e IL-1 para o modelo final.
As análises de regressão logística comparando os grupos AS e LVC em relação
aos biomarcadores selecionados TA, IL-17A, IFN- e IL-1, indicaram que em
pacientes com LV clássica há diminuição na concentração da citocina IL-17A, quando
comparados com indivíduos assintomáticos. Esse dado reforça a hipótese dessa citocina
apresentar papel protetor na infecção por L. infantum. Nascimento et al. (2014),
demonstrou que a IL-17A atua sinergicamente com o IFN-γ potencializando a produção
de NO e a atividade leishmanicida em macrófagos murinos infectados com L. infantum.
Os resultados indicaram que L. infantum induz a produção de IL-17A, que promove o
controle da replicação de parasitos por auxiliar a resposta de linfócitos T tipo 1 e
produção de NO e, impedindo a expansão de células T produtoras de IL-10. Também
como já mencionado, estudos que avaliaram os níveis de IL-17A em pacientes com LV
clássica e de indivíduos que não desenvolveram a doença ativa, ou estavam protegidos
da doença durante um surto, assim como este presente estudo, demonstram associação
desta citocina com o desenvolvimento de resposta imune protetora para LV, tendo papel
Discussão
84
benéfico na resolução da doença (Pitta et al., 2009). Assim observamos que apesar de
diferentes estudos sugerirem diferentes papéis para a IL-17A no contexto das
leishmanioses, nossos dados demonstraram claramente que essa citocina seria um
potencial biomarcador imunológico na LV assintomática podendo contribuir para o
esclarecimento do papel desempenhado pela IL-17A na LV provocada pela infecção por
L. infantum.
Por outro lado, os resultados apontaram relevantes aumentos da concentração
das citocinas IFN- e IL-1 no soro de pacientes com LV clássica, quando comparados
com o grupo AS. De acordo com as analises geradas pelo modelo, os níveis circulantes
do IFN-γ em pacientes com LV clássica foi quase três vezes superiores aos níveis do
grupo AS. No mesmo sentido das citocinas IFN- e IL-1, a taxa de avidez no grupo
LVC foi quase duas vezes superior ao grupo AS, o que está de acordo com o que foi
sugerido por estudos realizados por Redhu et al. (2006) e Tiburcio et al. (2013), que
também demonstraram que altas taxas de avidez predominam em pacientes com LV
clássica.
Assim, levando em consideração as nossas observações e as de outros estudos
(Peruhype-Magalhães et al., 2006; Costa et al., 2013) de que os níveis séricos da
citocina IFN-, são elevados durante a LV clássica e que na LV, o desenvolvimento da
doença ou o controle da infecção depende da eficácia da citocina IFN-γ produzida por
células das respostas imunes inata e adaptativa, que ativam macrófagos para eliminar
parasitos intracelulares (Ribeiro-de-Jesus et al., 1998), sugerimos que o papel benéfico
dessa citocina na resolução da doença está deprimido. Na LV ativa parece ocorrer
ausência de resposta a estímulos de citocinas do tipo 1. Isto pode indicar a possibilidade
de que um aumento de citocinas de resposta imune tipo 1 em paralelo a um grande
bloqueio de receptores de citocinas Th1, como o do IFN- e/ou CXCR3 leva a processos
imunológicos que conduzem à desativação de macrófagos provocando, assim, a
progressão da infecção (Hailu et al., 2004; Ansari et al., 2006).
Após a realização da análise de regressão logística que selecionou as variáveis
que podem ser indicadas como biomarcadores foi realizada a análise discriminante dos
dados. Nesta análise os resultados da dosagem de citocinas e da taxa de avidez das 81
amostras provenientes de crianças identificadas com infecção assintomática e as 43
amostras provenientes de crianças com LV clássica foram utilizados para classificar as
Discussão
85
amostras como pertencentes ao grupo AS ou LVC através dos critérios estabelecidos
pela análise de regressão logística.
Foram observados 16 elementos do grupo AS e 5 elementos do grupo LVC
classificados incorretamente, o que resultou nas seguintes porcentagens de acertos: 80%
para o grupo AS e 88% para o grupo LVC, sendo a proporção global de acertos de 83%
para o método de ressubstituição. Para a validação cruzada, os dados mostraram 77%
para o grupo AS e 83% para o grupo LVC, sendo a proporção global de acertos de 79%
para o método de validação cruzada. Estas proporções globais indicaram boa qualidade
da função discriminante dos biomarcadores preditores TA, IL-17A, IFN- e IL-1 entre
os grupos AS e LVC.
A árvore de decisão, método CART (Classification and Regression Trees),
proposto para classificação dos biomarcadores TA, IL-17A, IFN- e IL-1, que foram
previamente categorizados e selecionados na análise de regressão logística, criou uma
regra de associação desses preditores entre os grupos AS e LVC. Essa estratégia
confirma os dados das análises de regressão logística e possibilita estabelecer uma
interpretação clara e objetiva dos resultados. Dessa forma, a análise empregando a
árvore de decisão nos mostra que crianças apresentando resultados de taxa de avidez
menores que 2,5 (73,58%) e níveis séricos da citocina IFN- também menores que 2,5
(0,48 pg/mL) são classificadas como assintomáticas. Caso os valores da taxa de avidez
sejam menores que 2,5 (73,58%) e os níveis séricos da citocina IFN- seja maior que
2,5 (0,48 pg/mL), a possibilidade de classificá-las como assintomáticas não deve ser
descartada. Nesse caso, a dosagem dos níveis séricos da citocina IL-17A deve ser
considerada e caso seja menor que 0,5 (0,05 pg/mL), a criança será classificada como
pertencente ao grupo LVC. Naqueles casos em que a dosagem dos níveis séricos da
citocina IL-17A for maior que 0,5 (0,05 pg/mL), aumenta a chance da criança pertencer
ao grupo AS (Figura 14).
A análise da árvore de decisão também mostrou que indivíduos que apresentam
valores da taxa de avidez maiores que 2,5 (73,58%), níveis séricos da citocina IFN-
maior que 2,5 (0,48 pg/mL) e da citocina IL-1β maior que 1,5 (0,075 pg/ml), têm
elevada probabilidade de pertencer ao grupo LVC. Além disso, naqueles casos em que a
dosagem da citocina IL-1β sérica for menor que 1,5 (0,075 pg/mL), a criança também
será classificada como pertencente ao grupo LVC (Figura 14).
Discussão
86
A classificação proposta nesse estudo, empregando as abordagens estatísticas
(regressão logística e CART), sugere potencial aplicação como ferramenta
complementar para o diagnóstico da infecção assintomática em crianças residentes em
áreas endêmicas para LV. No entanto, novos estudos são necessários para validar a real
aplicabilidade dessa abordagem no contexto da infecção por L. infantum, especialmente
em indivíduos adultos e portadores do HIV.
7.0 CONCLUSÃO
Conclusão
88
1- Os testes de ELISA-AgT e ELISA-rK39, que são altamente sensíveis para
detecção da LV clássica, não apresentam o mesmo desempenho e eficiência,
quando utilizados para identificação da infecção assintomática. Recomenda-se a
associação de testes sorológicos e moleculares para estimar as taxas de infecção
assintomática em indivíduos residentes em áreas endêmicas;
2- Os resultados demonstraram associação inversa entre taxa de avidez e índice de
reatividade em crianças assintomáticas, o que sugere que a avidez pode vir a ser
um potencial marcador sorológico para determinar infecção assintomática e
avaliar tempo de evolução da infecção;
3- A avaliação do perfil de citocinas na LV demonstrou que, indivíduos com LV
assintomática apresentam perfil basal de citocinas tipo 1 / tipo 2, semelhante aos
indivíduos não infectados. No entanto, observou-se níveis séricos elevados de
IL-17A, sugerindo papel protetor desse biomarcador imunológico na LV
assintomática;
4- A árvore de classificação de biomarcadores (TA, IFN-, IL-17A e IL-1),
previamente categorizados e selecionados na análise de regressão logística, criou
uma regra de associação desses preditores entre os grupos AS e LVC, que pode
ser utilizada como estratégia complementar para o diagnóstico da infecção
assintomática.
8.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9.0 ANEXO
Anexo
115
Anexo 1: Consentimento Livre e Esclarecido - Crianças e menores de 18 anos
Convite para participar
Seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade, cujo nome é
_____________________________________ está convidado(a) para participar,
voluntariamente da segunda etapa do Projeto “Avaliação da associação entre o risco
para leishmaniose visceral e fatores ambientais, socioeconômicos e sanitários em
diferentes áreas de Belo Horizonte, Minas Gerais, 2010 a 2013.”
Leia e/ou ouça atentamente as informações a seguir antes de dar o seu consentimento.
Informações sobre o Estudo
O projeto em andamento é conduzido pela Universidade Federal de Minas
Gerais (UFMG) e a Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte. Seu objetivo é
avaliar o risco de adoecimento por Leishmaniose Visceral em sua região.
Ao concordar com a participação de seu filho(a) ou menor sob sua
responsabilidade você respondeu a um questionário confidencial e autorizou a coleta de
uma pequena quantidade de sangue por punção capilar na ponta do dedo da mão para
pesquisa de anticorpos (células de defesa do corpo humano) para o parasito Leishmania
chagasi, agente causador da leishmaniose visceral em Belo Horizonte.
Sua participação
Ao concordar com a continuidade de participação de seu filho(a) ou menor sob sua
responsabilidade nessa nova etapa você permitirá que
1. Seja coletada de seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade uma pequena
quantidade de sangue por punção venosa para realização de um exame de sangue do
tipo Hemograma, para caracterização imunológica e para pesquisa de fragmentos do
parasito transmissor. A coleta de sangue será realizada por técnicos especialmente
treinados e utiliza-se material esterilizado e descartável, ou seja, material que só é usado
uma única vez.
2. Seja atendido por um médico especialista, contratado pelo projeto no centro de saúde
de sua referência para avaliação clínica da criança.
Anexo
116
Riscos e Benefícios
Os benefícios provenientes da participação do seu filho(a) ou menor sob sua
responsabilidade consistem na geração de novos conhecimentos para embasar as ações
de prevenção e controle da leishmaniose visceral no município; além de subsídios para
futuras análises de adequação do programa de controle vigente. O risco para o seu
filho(a) ou menor sob sua responsabilidade que porventura participe da pesquisa está no
momento da coleta de sangue. Entretanto, a mesma será realizada por profissionais
especializados em local adequado, portanto o risco de perda de integridade da pele é
mínimo.
Confidencialidade:
Toda informação pessoal obtida nesta pesquisa é considerada confidencial e a
identificação de seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade será mantida como
informação sigilosa. A amostra de sangue de seu filho(a) ou menor sob sua
responsabilidade será guardada apenas com um número, sem o nome. Os relatórios e
resultados deste estudo serão publicados na forma de textos, tabelas, gráficos e figuras,
sem nenhuma forma de identificação individual.
Pagamento por participação:
A participação do seu filho(a) ou do menor sob sua responsabilidade é isenta de
despesas e não haverá qualquer pagamento pela participação.
Acesso às informações
Você e seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade poderão receber, se assim o
quiser, os resultados de seus exames. Estes resultados só serão revelados a você ou seu
filho(a) ou menor sob sua responsabilidade, pela equipe da pesquisa. Para informações
adicionais sobre este estudo, você ou seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade
poderá se comunicar com Letícia Helena dos Santos Marques, nos telefones 3409-2973
e 9318-4975 no horário de 8 às 12 horas e de 14 às 18 horas de segunda à sexta-feira.
Para informações éticas do estudo, você poderá contatar o Comitê de Ética da UFMG -
Av. Antônio Carlos, 6627 Unidade Administrativa II - 2º andar - Sala 2005 Campus
Pampulha. Telefone: 3409-4592.
Anexo
117
Você e seu filho(a) ou menor sob sua responsabilidade também podem e devem fazer
todas as perguntas que julgar necessárias, assim como recorrer a seu médico ou agente
de saúde para maiores informações, se assim entender.
Informações adicionais
A participação é totalmente voluntária e você e seu filho(a) ou menor sob sua
responsabilidade poderão se recusar a participar do estudo sem qualquer prejuízo
pessoal para ambos.
Você e seu filho (a) ou menor sob sua responsabilidade têm a liberdade de desistir ou de
interromper a colaboração e participação nesta pesquisa no momento em que desejar,
sem necessidade de qualquer explicação.
A desistência não causará nenhum prejuízo à saúde ou bem estar físico do seu filho ou
menor sob sua responsabilidade. Não virá interferir no atendimento e na assistência a
ser prestada em caso de necessidade.
Declaro que li e entendi as informações relativas a este estudo. Concordo com a
participação voluntária de meu filho(a) ou menor sob minha responsabilidade nesta
pesquisa.
Nome do responsável: ____________________________________________________
Assinatura do participante ou responsável: ____________________________________
Assinatura da criança maior de 7 anos: _______________________________________
Belo Horizonte, de de 2013.
ENDEREÇO E TELEFONE DOS PESQUISADORES
Mariângela Carneiro
Avenida Antonio Carlos 6627-
Campus UFMG
Departamento de Parasitologia/ICB
Bloco E4 - Sala 254
31-34092839
Letícia Helena dos Santos Marques
Avenida Antonio Carlos 6627-
Campus UFMG
Departamento de Parasitologia/ICB
Bloco E4 - Sala 254
31-3409-2973