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Universidade Federal de Ouro Preto
Escola de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
CIPHARMA
ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES
ANTIMICROBIANA E ANTICOLINESTERÁSICA DE
EXTRATOS BRUTOS ACETATO DE ETILA E
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DO FUNGO
Paecilomyces lilacinus
Ana Paula Campos Teles
Ouro Preto - Minas Gerais
2012
Universidade Federal de Ouro Preto
Escola de Farmácia
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
CIPHARMA
ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES
ANTIMICROBIANA E ANTICOLINESTERÁSICA DE
EXTRATOS BRUTOS ACETATO DE ETILA E
METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DO FUNGO
Paecilomyces lilacinus
Ana Paula Campos Teles
Orientadora: Profa. Drª. Jacqueline Aparecida Takahashi
Ouro Preto - Minas Gerais
2012
Dissertação apresentada à Escola de
Farmácia da Universidade Federal de
Ouro Preto como parte dos requisitos
necessários para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
T269e Teles, Ana Paula Campos. Estudo químico e avaliação das atividades antimicrobiana eanticolinesterásica de extratos brutos acetato de etila e metabólitos secundáriosdo fungo Paecilomyces lilacinus [manuscrito] / Ana Paula Campos Teles. -2012. 160f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientadora: Profa. Dra. Jacqueline Aparecida Takahashi.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola deFarmácia. Departamento de Farmácia. Programa de Pós-graduação emCiências Farmacêuticas. Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos.
1. Alzheimer, Doença de. 2. Análise cromatográfica. 3. Fungos. 4.Antibióticos. I. Takahashi, Jacqueline Aparecida. II. Universidade Federal deOuro Preto. III. Titulo.
CDU: 543.544
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo dom da vida e por ter me dado oportunidade e sabedoria para a
realização deste trabalho;
Aos meus pais Ana e Maurício, pelo constante amor, apoio, compreensão,
incentivo e palavras de estímulo em todos os momentos da minha vida, sendo meus
exemplos de vida e perseverança;
À Professora Drª Jacqueline Aparecida Takahashi, pela oportunidade e confiança,
pelos ensinamentos, mas principalmente pela amizade e conselhos sempre acolhedores;
Aos meus irmãos Rose e Rogério, fontes de carinho, apoio e amizade. Irmã, muito
obrigada por tudo que sempre fez e faz por mim, obrigada por cada conversa, por cada
conselho, por não me deixar nunca desistir e por fazer de mim uma pessoa melhor.
Ao Cassio, por todo o carinho, incentivo, apoio e por estar sempre presente na
minha vida apesar da distância;
Aos colegas da turma 2010/2012 do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFOP;
Às amigas do mestrado Leidiane, Bruna Pitol, Danielle e Juliana, por todo o
acolhimento e amizade, por terem compartilhado comigo, de alguma forma, os momentos
de conquistas, frustrações e cansaço durante esse período de descobertas e
aprendizagem;
Aos amigos do Laboratório de Bioensaios e Biotecnologia do Departamento de
Química da UFMG, principalmente à Karine, Ana Sarah, Adriana, Dhionne, Bruna Gomes,
Paulo, Mirra, Arthur e Jo pela ajuda no desenvolvimento do trabalho e por me
proporcionarem um ambiente sempre agradável para o trabalho e por todas as risadas;
Às amigas Bruna Fernandes, Amanda, Juliana Campos e Larissa, pelo apoio e
sincera amizade durante todos esses anos;
Aos Professores e amigos do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da UFOP, em especial, ao Bibo, Dênia e Célia;
À Ivana e ao Ricardo, pela obtenção dos espectros de RMN;
À Líliam, pela ajuda na utilização do HPLC;
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFOP;
À Universidade Federal de Ouro Preto, pela bolsa concedida;
À todos que, de uma forma ou de outra me permitiram concluir esse trabalho,
nunca me deixando desistir.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................i
LISTA DE GRÁFICOS .........................................................................................................iii
LISTA DE TABELAS ...........................................................................................................iv
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................vi
RESUMO ...........................................................................................................................viii
ABSTRACT .........................................................................................................................ix
Capítulo 1
1 INTRODUÇÃO
1.1. Produtos naturais como fonte de fármacos ..............................................................2
1.2. Os fungos e sua relação com substâncias bioativas ................................................4
1.3. O fungo Paecilomyces lilacinus ..............................................................................14
1.4. Antibacterianos ......................................................................................................17
1.5. Anticolinesterásicos ...............................................................................................20
1.6. Técnica OSMAC .....................................................................................................23
Capítulo 2
2 OBJETIVO
2.1. Objetivo geral ..........................................................................................................28
2.2. Objetivos específicos ..............................................................................................28
Capítulo 3
3 PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Equipamentos ........................................................................................................30
3.2. Reagentes ...............................................................................................................31
3.3. Meios de cultura .....................................................................................................32
3.3.1. Meio de cultura BHI ................................................................................................32
3.3.2. Meio de cultura sólido antibiótico ............................................................................32
3.3.3. Meio de cultura caldo batata dextrosado ................................................................32
3.3.4. Meio de cultura ágar batata dextrosado ..................................................................32
3.4. Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detector de arranjo de diodos
(CLAE-PDA)........................................................................................................................33
3.5. Cromatografia a gás (CG) .......................................................................................33
3.5.1. Preparo das amostras para análise em CG ............................................................34
3.6. Ressonância Magnética Nuclear (RMN) .................................................................34
3.7. Espectroscopia de massas por ionização por electrospray (EM-ESI) ....................35
3.8. Manutenção dos micro-organismos ........................................................................35
3.9. Cultivo dos micro-organismos .................................................................................35
3.9.1. Inoculação da bactéria Salmonella tiphymurium .....................................................35
3.9.2. Cultivo do fungo Paecilomyces lilacinus ..................................................................36
3.10. Testes de atividade biológica ..................................................................................39
3.10.1. Avaliação da atividade antimicrobiana - Técnica de difusão em placa utilizando
discos de papel (BAUER et al.,1966).................................................................................39
3.10.2. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de microdiluição em
caldo...................................................................................................................................41
3.10.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia em
camada delgada (CCD) - Método de Ellmann ...................................................................43
3.10.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca – Método
de Ellmann..........................................................................................................................44
3.11. Fracionamento dos extratos do fungo P. lilacinus ....................................................45
3.11.1. Fracionamento do extrato 5 SA .............................................................................45
3.11.2. Fracionamento do extrato 8 SA .............................................................................48
Capítulo 4
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Análise da influência das condições de cultivo de P. lilacinus na produção de
metabólitos secundários, via perfis cromatográficos (CLAE-PDA) ....................................52
4.2. Cromatografia a gás ...................................................................................................59
4.3. Caracterização de P18 ...............................................................................................72
4.4. Testes de atividade biológica ......................................................................................77
4.4.1. Avaliação da atividade antimicrobiana - Técnica de difusão em placa utilizando
discos de papel (BAUER et al., 1966) ...............................................................................77
4.4.1.1. Análise Estatística .................................................................................................81
4.4.2. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de microdiluição em caldo
............................................................................................................................................82
4.4.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia em
camada delgada (CCD)- Método de Ellmann ....................................................................89
4.4.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca – Método
de Ellmann..........................................................................................................................92
Capítulo 5
5 CONCLUSÃO .................................................................................................................97
Capítulo 6
6 REFERÊNCIAS ............................................................................................................100
ANEXOS ..........................................................................................................................113
i
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Classes de metabólitos secundários fúngicos .....................................................5
Figura 2. Linha de tempo apresentando as classes de antibióticos utilizadas na
clínica....................................................................................................................................9
Figura 3. Foto da aparência do fungo P. lilacinus cultivado em meio de cultura ágar batata
dextrosado (A) e microfotografia dos conidióforos (B) .....................................................15
Figura 4. Esquema de uma microplaca usada no ensaio antibacteriano e antifúngico com
as amostras em uma concentração fixa ............................................................................42
Figura 5. Cromatograma do extrato 1SA (sem agitação) .................................................53
Figura 6. Cromatograma do extrato 1CA (com agitação) .................................................53
Figura 7. Cromatograma do extrato 3 SA (sem agitação).................................................54
Figura 8. Cromatograma do extrato 3 CA (com agitação) ................................................54
Figura 9. Cromatograma do extrato 5 SA (sem agitação) ................................................55
Figura 10. Cromatograma do extrato 5 CA (com agitação) ..............................................55
Figura 11. Cromatograma do extrato 9 SA (sem agitação) ..............................................56
Figura 12. Cromatograma do extrato 8 CA (com agitação) ..............................................57
Figura 13. Cromatograma do extrato 10 CA (com agitação) ............................................57
Figura 14. Cromatograma do extrato 12 SA (sem agitação) ............................................58
Figura 15. Cromatograma do extrato 13 SA (sem agitação) ............................................58
Figura 16. Cromatograma do extrato 10 SA (sem agitação) ............................................59
Figura 17. Cromatograma da fração P01 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos....................................................................................................62
Figura 18. Cromatograma da fração P02 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................62
Figura 19. Cromatograma da fração P03 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................63
Figura 20. Cromatograma da fração P04 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................63
Figura 21. Cromatograma da fração P05 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................64
Figura 22. Cromatograma da fração P06 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................64
ii
Figura 23. Cromatograma da fração FH obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................65
Figura 24. Cromatograma da fração C01 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................65
Figura 25. Cromatograma da fração C02 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................66
Figura 26. Cromatograma da fração C03 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................66
Figura 27. Cromatograma da fração C04 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................67
Figura 28. Cromatograma da fração C05 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................67
Figura 29. Cromatograma da fração P12 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................69
Figura 30. Cromatograma da fração P13 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................69
Figura 31. Cromatograma da fração P14 obtido por CG em comparação com padrões de
ésteres de ácidos graxos ...................................................................................................70
Figura 32. Fragmentos propostos para P18 estabelecidos com base nas correlações 1H-
1H COSY ............................................................................................................................73
Figura 33. Correlações espaciais para P18 baseadas no espectro de NOESY ...............75
Figura 34 (A) e (B). Correlações espaciais para P18 baseadas no espectro de
NOESY...............................................................................................................................75
Figura 35. Espectro de massas (ESI +) da substância P18 ..............................................76
Figura 36. Reações envolvidas no método de Rhee ........................................................89
Figura 37. (A) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD (extratos cultivados
sob agitação) e (B) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD (extratos
cultivados sob condição estática) ......................................................................................90
iii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Novos fármacos obtidos entre 01/1981 e 06/2006 (N=1184) ............................2
Gráfico 2. Distribuição da produção de antibióticos por micro-organismos ......................20
Gráfico 3. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob
agitação orbital, após 24 h .................................................................................................83
Gráfico 4. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob
agitação orbital, após 48 h .................................................................................................83
Gráfico 5. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados
sob agitação orbital, após 24 h ..........................................................................................84
Gráfico 6. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados
sob agitação orbital, após 48 h ..........................................................................................84
Gráfico 7. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob
condição estática, após 24 h .............................................................................................85
Gráfico 8. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados sob
condição estática, após 48 h..............................................................................................85
Gráfico 9. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados
sob condição estática, após 24 h .......................................................................................86
Gráfico 10. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13, cultivados
sob condição estática, após 48 h .......................................................................................86
Gráfico 11. Percentual de inibição da enzima AchE pelos extratos, substâncias P18 e
C09, eserina e MeOH ........................................................................................................94
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais classes e alvos de antibióticos ..........................................................18
Tabela 2. Condições de inoculação do fungo P. lilacinus .................................................37
Tabela 3. Massas dos extratos do fungo P. lilacinus ........................................................38
Tabela 4. Dados do fracionamento do extrato 5 S.A (1,098 g) do fungo P. lilacinus por
cromatografia em coluna de sílica gel................................................................................46
Tabela 5. Dados do fracionamento da fração P19 (52,0 mg) por cromatografia em coluna
de sílica ―flash‖ ...................................................................................................................48
Tabela 6. Dados do fracionamento do extrato 8 S.A (1,26 g) do fungo P. lilacinus por
cromatografia em coluna de sílica gel ...............................................................................49
Tabela 7- Composição de ácidos graxos nas frações analisadas.....................................68
Tabela 8- Composição de ácidos graxos nas frações P12, P13 e P14 ............................70
Tabela 9. Dados de RMN de 1H e de 13C, 1H-1H COSY e HMBC para a substância
P18......................................................................................................................................74
Tabela 10. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para os
extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição de agitação ......................................77
Tabela 11. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para os
extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição estática ............................................79
Tabela 12. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para as
substâncias P18 e C09 isoladas de extratos do fungo P. lilacinus ....................................80
Tabela 13. Agrupamento, resultante da análise estatística dos resultados do teste de
atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição de
agitação .............................................................................................................................82
Tabela 14. Agrupamento, resultante da análise estatística dos resultados do teste de
atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição
estática................................................................................................................................82
Tabela 15. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09, após 24
h do início do experimento .................................................................................................88
Tabela 16. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09, após 48
h do início do experimento .................................................................................................88
Tabela 17. Valores dos fatores de retenção (Rf) das substâncias ativas no teste de
inibição da AchE ................................................................................................................91
v
Tabela 18. Percentual (%) de inibição das amostras no ensaio anticolinesterásico em
microplaca pelo método de Ellmann ..................................................................................93
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Ach Acetilcolina
AchE Acetilcolinesterase
AcOEt Acetato de etila
ACTI Iodeto de acetilcolina
BHI Brain Heart Infusion
BuchE Butirilcolinesterase
13C Carbono-13
CCD Cromatografia em camada delgada
CCS Cromatografia em coluna de sílica
CG Cromatografia a gás
CHCl3 Clorofórmio
CLAE-PDA Cromatografia Líquida de Alta Eficiência- Photo Diode Array Detector
cm Centímetro
COSY Correlation Spectroscopy
DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DTNB Ácido 5,5‘-ditiobis-[2- nitrobenzóico]
EM-ESI Espectroscopia de massas por ionização por electrospray
FDA Food and Drug Administration
g Grama
h Hora
1H Hidrogênio- 1
HCl Ácido clorídrico
HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMG-Co-AR 3-hidroxi-3-metil-glutaril Co-A redutase
HSQC Heteronuclear Single- Quantum Correlation
IAchE Inibidor da acetilcolinesterase
iPrOH Isopropanol
L Litro
µL Microlitro
µg Micrograma
vii
MeOH Metanol
mg Miligrama
MHz Megahertz
min Minuto
mL Mililitro
mm Milímetro
nm Nanômetro
NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy
PDA Ágar batata dextrosado
PDB Caldo batata dextrosado
ppm Parte por milhão
Pyr Piridina
q.s.p. Quantidade suficiente para
Rf Fator de Retenção
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de carbono- 13
RMN de1H Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio- 1
RNA Ácido ribonucléico
OSMAC One strain-many active compounds
s Segundo
TMS Tetrametilsilano
UFC Unidades formadoras de colônia
UV Ultra-violeta
ºC Graus Celsius
δ Deslocamento químico
viii
RESUMO
A utilização de produtos naturais pela humanidade, em busca por alívio e cura de
doenças é prática antiga, principalmente devido à vasta riqueza de espécies vegetais e de
micro-organismos pertencentes ao país. Os fungos são importantes organismos utilizados
nesta prática, devido aos avanços no campo da biotecnologia e à capacidade destes de
produzirem uma variedade de metabólitos secundários. Utilizando-se técnicas como
OSMAC (one strain-many active compounds), são obtidos diversos protótipos bioativos,
que podem ser utilizados na prevenção e no tratamento de uma gama de enfermidades,
entre elas encontram-se as doenças infecciosas e a doença de Alzheimer. Este trabalho
teve como objetivo avaliar os diferentes extratos obtidos do cultivo de Paecilomyces
lilacinus quanto às ações antibacteriana, antifúngica e inibidores da acetilcolinesterase,
enzima representativa no Mal de Alzheimer, além de isolar e identificar os metabólitos
secundários. Os resultados dos ensaios biológicos realizados com os extratos brutos e os
cromatogramas, estes últimos obtidos por CLAE, mostraram que, variando-se as
condições de cultivo, houve variação do perfil químico dos extratos de P. lilacinus. No
teste antimicrobiano utilizando o método de difusão em placa, a maioria dos extratos
testados mostrou satisfatória atividade para as bactérias Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes e para a levedura Candida albicans. Utilizando a metodologia de
microdiluição em caldo, os extratos mostraram inibição de até 100% do crescimento
microbiano. Para a avaliação qualitativa de inibição da enzima AchE, dos vinte e oito
extratos brutos testados, utilizando o método de Ellmann, dezesseis apresentaram tal
atividade; no método quantitativo, o percentual de inibição variou entre 78 e 97%. Três
substâncias foram isoladas, por métodos cromatográficos, das quais uma foi identificada
como sendo uma δ-lactama. Duas substâncias isoladas foram bioensaiadas para as
atividades acima citadas, apresentando resultados significativos para o teste de inibição
da enzima AchE. Em ambos os testes antimicrobianos, uma substância mostrou atividade
antibacteriana, contra as bactérias Gram-positivas S. aureus e L. monocytogenes.
ix
ABSTRACT
The use of natural products by the humanity, searching for relief and cure of diseases is
an old practice, mainly due to the vast diversity of plants and micro-organisms belonging to
the country. Fungi are important organisms used in this practice, due to the advances in
biotechnology and to their ability to produce a variety of secondary metabolites. The use of
techniques such as OSMAC (one strain-many active compounds) it is possible to generate
diverse bioactive prototypes, which can be used in the prevention and treatment of a range
of diseases, like infectious diseases and Alzheimer‘s diseases. This work aimed to
evaluate the different extracts obtained from the cultivation of Paecilomyces lilacinus for
antibacterial, antifungal activities and inhibition of acetylcholinestersae, the enzyme in
Alzheimer‘s representative, and to isolate and to identify secondary metabolites. The
results of biological assays performed with crude extracts, and their respective
chromatograms obtained by HPLC, showed that varying the growth conditions there was
variation in the chemical profile of P. lilacinus extracts. In the antimicrobial test using plate
diffusion method most of the extracts showed satisfactory activity against Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes and Candida albicans. Using the broth microdilution
method, the extracts showed up 100% inhibition of microbial growth. For the qualitative
evaluation of AchE enzyme inhibition , from the twenty-eight crude extracts tested, using
the method of Ellmann, sixteen showed such activity, and in the quantitative method, the
percentage of inhibition varied between 78 an 97%. Three substances were isolated by
chromatographic methods, which one was identified as a δ-lactam. Two substances were
isolated bioassayed for the activities above mentioned, with significant results for the test
of inhibition of AchE. In the both antimicrobial testing, one substance showed antibacterial
activity against Gram-positive S. aureus and L. monocytogenes.
1
Capítulo 1
INTRODUÇÃO
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. PRODUTOS NATURAIS COMO FONTE DE FÁRMACOS
A utilização de produtos naturais pela humanidade, em busca por alívio
e cura de doenças, pela ingestão de ervas e folhas, é prática muito antiga
(VIEGAS Jr. et al., 2006). No Brasil, a pesquisa de produtos naturais como
fonte de fármacos é crescente, devido a fatores como o alto custo de
medicamentos industrializados, a vasta riqueza de espécies vegetais e de
micro-organismos pertencentes ao país, visto que, aqui se encontra quase um
terço da flora mundial representada por dez biomas com uma biodiversidade
exuberante (BÔAS, GADELHA, 2007). NEWMAN e CRAGG (2007)
constataram que, entre os anos de 1981 e 2006, mais da metade das novas
substâncias químicas encontradas no mercado eram derivadas de produtos
naturais ou sintetizadas a partir destes (Gráfico 1), sendo que, diversos
fármacos, que se consagraram medicamentos industrializados, foram
resultantes de sínteses direcionadas para reproduzir a ação das moléculas
encontradas na natureza.
B - Biológico N - Produto Natural ND - Derivado de Produto Natural S - Fármaco totalmente sintético S* - Sintetizado tendo como
modelo um produto natural V - Vacina NM – Miméticos de produtos
naturais
Gráfico 1. Novos fármacos obtidos entre 01/1981 e 06/2006 (n=1184).
FONTE: NEWMAN e CRAGG, 2007.
3
Os extratos obtidos de fontes naturais podem servir como ponto de partida
para a obtenção de metabólitos secundários a partir dos quais podem ser
preparados derivados sintéticos. Alguns extratos exibem atividade biológica maior
ou diferente de seus componentes isolados por apresentarem uma rica diversidade
de moléculas químicas como polifenóis, alcalóides, peptídeos e terpenóides, que
podem atuar na manutenção e/ou correção das condições fisiológicas de humanos
e animais (LAMPÉN, 2009).
Atualmente, o cenário da pesquisa de produtos naturais está sendo
modernizado com a utilização de técnicas de química combinatória, a fim de
otimizar o estudo da parte ativa da molécula e sua estrutura (NEWMAN, CRAGG,
2007) e se obter o maior número de substâncias bioativas possível (VIEGAS Jr. et
al., 2006). Outra perspectiva do ponto de vista de inovação nessa área é a
pesquisa utilizando micro-organismos como fontes naturais bioativas, devido ao
fato de serem amplamente disseminados no ecossistema e de, nos últimos anos,
de vários terem tido seus genomas seqüenciados (NEWMAN, CRAGG, 2007),
encorajando esta vertente.
O isolamento de substâncias naturais com atividades biológicas, seja de
origem vegetal ou de outras fontes, como micro-organismos, apresenta várias
vantagens em relação ao uso de extratos, visto que a substância bioativa pode ser
administrada e/ou quantificada de forma reprodutível e em doses exatas, gerando
benefícios do ponto de vista experimental e terapêutico (VOLPATO, 2005). Além
disto, apresentam alta afinidade por respectivos receptores específicos, que
geralmente são proteínas, podendo ativá-los ou inibí-los, e possuem ampla
variabilidade química, sendo utilizadas para a prevenção e tratamento de uma
gama de enfermidades (COS et al., 2006; MOLINARI, 2009; KINGSTON, 2011).
Os produtos naturais isolados de micro-organismos têm importância no
desenvolvimento de agroquímicos menos danosos à saúde humana, mas
principalmente, no desenvolvimento de medicamentos, sendo, os fungos,
importantes organismos utilizados nesta prática (PINTO et al., 2002). Esse fato
advém dos avanços no campo da biotecnologia, aliado ao emprego de técnicas
modernas de fracionamento químico, elucidação estrutural e ―screening‖ na busca
por novos protótipos bioativos (VIEGAS Jr. et al., 2006). Outro ponto relevante e
inovador nessa área é a possibilidade de se trabalhar com uma mesma espécie de
4
micro-organismo submetendo-o a diferentes condições de cultivo, para que assim,
possa se obter uma diversidade de metabólitos secundários, candidatos a novas
moléculas bioativas, técnica conhecida como OSMAC (one strain, many active
compounds).
1.2. OS FUNGOS E SUA RELAÇÃO COM SUBSTÂNCIAS
BIOATIVAS
Fungos são classificados como seres eucarióticos, uninucleados, como as
leveduras, ou multinucleados, como se observa em fungos filamentosos ou bolores
(MARINHO et al., 2007). Os fungos filamentosos possuem hifas e estas podem
crescer formando uma massa filamentosa, o micélio (BRIDGE, SPOONER, 2001).
São aeróbios, com nutrição heterotrófica por absorção e armazenamento de
glicogênio (LACAZ et al., 2002), são encontrados em diversos ambientes, como em
água salgada e doce, solo, plantas, animais, alimentos, entre outros. São
classificados ainda, de acordo com as características dos esporos sexuais e corpos
de frutificação, com os ciclos de vida e com as características morfológicas dos
micélios, sendo denominados fungos perfeitos e imperfeitos, que apresentam todos
os estágios sexuais e os que não os apresentam, respectivamente (MADINGAN et
al., 2004). Estima-se que o ecossistema detenha cerca de 1,5 milhões de espécies
fúngicas diferentes, no entanto somente 5% desse total foram descritos, e apenas
16% desse percentual foram estudados (PINTO et al., 2002).
Historicamente, os fungos têm-se apresentado como um dos organismos
mais importantes na produção de metabólitos secundários, representando 38%
desse total (GUNATILAKA, 2006; BÉRDY, 2005). A grande contribuição para a
pesquisa se baseia na produção de novos produtos de aplicação na agricultura, na
nutracêutica, nas aplicações industriais diversas e na medicina. Isto porque as
moléculas produzidas possuem grande diversidade química, como exemplificada
na Figura 1, devido à possibilidade de variações do meio e condições de cultivo às
quais o fungo está submetido.
5
Figura 1. Classes de metabólitos secundários fúngicos.
FONTE: Adaptado de KELLER et al., 2005.
6
Apesar dessa gama de aplicações atribuídas aos produtos naturais
originários de fungos, os medicamentos são, sem dúvida, os alvos mais
importantes na pesquisa, devido à necessidade de novas farmacoterapias e ao
mercado financeiro que os medicamentos movimentam. Um exemplo disto é o fato
de que, em pesquisa publicada em 2002, apontou-se que, no mercado mundial,
seis dos vinte medicamentos mais vendidos, foram obtidos in natura ou por
transformação química de metabólitos provenientes de fungos (PINTO et al,. 2002).
Muitas classes de fármacos originárias de metabólitos fúngicos podem ser citadas,
como antifúngicos, antitumorais, imunossupressores, inibidores enzimáticos,
hipocolesterolêmicos, antiparasitários, anti-inflamatórios, mas principalmente,
antibióticos (DEMAIN, SANCHEZ, 2009; KINGSTON, 2011).
A pesquisa por metabólitos secundários de fungos é antiga, porém, o
primeiro deles de notória eficácia na indústria farmacêutica foi a penicilina,
substância produzida pelo fungo Penicillium chrysogenun (TAKAHASHI, LUCAS,
2008), descoberta acidentalmente pelo pesquisador Fleming em 1928, que
impulsionou o interesse em se estudar micro-organismos como fonte de novos
antibióticos.
Apesar de descoberta no final da década de 20, somente em 1940 a
penicilina G (1) foi introduzida no mercado. Esta substância, isolada como um pó
amarelo, foi amplamente utilizada como um potente agente antibacteriano de
amplo espectro durante a 2ª guerra mundial, impedindo a morte de muitos
soldados (DEMAIN, SANCHEZ, 2009; GUIMARÃES et al., 2010).
O
HN
N
O
S
OH
O
1
Penicilinas são classificadas de várias formas, como, por exemplo, quanto à
sua origem, podendo ser naturais, como é o caso da penicilina G (1) ou semi-
sintéticas, como a amoxicilina (13) e a oxacilina (14). As penicilinas possuem, em
sua estrutura, um núcleo formado por um anel tiazolidina fundido a um anel β-
7
lactâmico, ao qual se liga uma cadeia lateral sendo, este último, junto com a
distorção da geometria planar do sistema bicíclico, essenciais para atividade
antibacteriana das penicilinas (MOORE, NYGREN, 2004; MOREIRA, 2009). Além
disso, a cadeia lateral é responsável por determinar as características
antibacterianas e farmacológicas de cada uma das penicilinas (MOREIRA, 2009).
Para a síntese de penicilinas, utilizam-se como precursores, substâncias contendo
anéis β-lactâmicos produzidas microbiologicamente que são subseqüentemente
derivatizados.
OH
NH2HN
N
O
S
O
OH
N
O
S
O
OH
HN C
OHC N
O
13 14
São conhecidas seis diferentes tipos de penicilinas de origem natural, das
quais duas são usadas como medicamentos antibacterianos, a benzilpenicilina
(penicilina G) (1) e a fenoximetilpenicilina (penicilina V) (15) (MOORE, NYGREN,
2004).
O
O
HN
N
O
S
OH
O 15
Outro antibiótico β-lactâmico produzido por micro-organismos, a
cefalosporina C (16), pertence à classe das cefalosporinas, consideradas
antibióticos β-lactâmicos de 2ª geração. A cefalosporina C foi isolada pela primeira
vez do fungo Cephalosporium acremonium em 1955 e deu origem a vários outros
antibióticos semi-sintéticos. Cefalosporinas também possuem, em sua estrutura,
um anel β-lactâmico, porém este se encontra ligado a um anel di-hidrotiazina
8
(BRULE, MARCHLAND-BRYNAERT, 2007). As cefalosporinas semi-sintéticas são
classificadas em cefalosporinas de primeira geração (ex. cefalotina), de segunda
geração (ex. cefaclor), de terceira geração (ex. cefotaxima) e de quarta geração
(ex. cefepima) (BRUGUERAS, GARCÍA, 1998), possuindo, todas, a mesma
estrutura básica com variações nos substituintes (R1 e R2) (17).
Uma 3ª geração de antibióticos β-lactâmicos são os carbapenemos (18),
descobertos na década de 70. Os carbapenemos possuem, igualmente aos outros
antibióticos β-lactâmicos, o anel β-lactâmico, porém este está fundido a um anel
carbocíclico de cinco membros. Como fármaco representante dessa classe, pode
ser citado o imipenemo (19) (SINGH, BARRETT, 2006).
S
N
HN
O
OCOOH
O
O
HO
O
NH2
S
N
HN
R2
COOH
O
R1
O
16 17
NR
CO2H
H
O
OH
H
N
H3C
COOHO
OHH H
S
HN
NH
19
18
Além dos β-lactâmicos, antibióticos pertencentes a outras classes e com
relevante importância clínica, foram também isolados de micro-organismos. A
Figura 2 ilustra agentes antibacterianos obtidos de fontes naturais e de origem
sintética, descobertos e produzidos, respectivamente, ao longo dos anos.
9
Figura 2. Linha de tempo apresentando as classes de antibióticos utilizados na
clínica. Compostos listados em fonte normal são derivados de produtos naturais e,
os listados em itálico são derivados de origem sintética.
FONTE: Adaptado de SINGH e BARRETT, 2006.
Outra classe de substâncias biotivas produzidas por fungos filamentosos são
os antifúngicos. A descoberta de antibióticos antifúngicos data de 1939 com o
isolamento do primeiro antifúngico, a griseofulvina (20), isolada do fungo
Penicillium griseofulvum. A griseofulvina inibe o crescimento de várias espécies
fúngicas, como Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton, agindo como
fungistático e, dependendo da concentração usada, pode inibir a divisão celular
(GUPTE et al., 2002).
20
O
O
OCH3OOCH3
Cl
H3CO
H3C H
1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000
Sulfa 1936
Fenilpropanóides Cloranfenicol
1946
Aminoglicosídeos Estreptomicina
1946-1960
Macrolídeos Eritromicina
1952
2ª geração β-lactâmicos Cefalosporinas
1962
Β-lactâmicos Penicilina 1929-1941
Policetídeos Tetraciclinas
1949
Glicopeptídeos Vancomicina 1956-1975
Quinolonas Ácido nalidíxico
1960-1962
Oxazolidinonas Linezolida 1979-2000
3ª geração β-lactâmicos Carbapenemos
1975-1985
Daptomicina 2003
10
Nistatina (21) e anfotericina B (22), também são substâncias com atividade
antifúngica, pertencentes ao grupo dos macrolídeos poliênicos, porém, têm o uso
clínico restrito, devido à alta toxicidade e baixa especificidade (GUPTE et al., 2002).
21
CH3
O
OH
O
O
O
CH3
HO
H3C
OH OH OH OH
OH
O OH
COOH
NH2
OH
CH3
OH
22
Atualmente, inibidores da síntese de β-D-glucano na parede celular dos
fungos estão sendo utilizados no tratamento de aspergilose invasiva em pacientes
que apresentam intolerância aos tratamentos convencionais (BOWMAN et al.,
2002). Um importante grupo desses inibidores é o das equinodinas, que englobam
moléculas que contem, em sua estrutura, um anel hexapeptídico N-acetilado e que
se diferenciam entre si pelos substituintes ligados a esse anel (VICENTE et al,.
2003). Um fármaco pertencente a esse grupo é a caspofugina (23), que exibe
atividade in vitro contra uma ampla variedade de leveduras, fungos filamentosos e
dimórficos clinicamente importantes, inclusive Candida spp. e Aspergillus spp
(BERGOLD, GEORGIADIS, 2004). Outro fármaco deste grupo é a micafugina (24),
originada do antibiótico FR901379, produzido pelo fungo Coleophoma empedri;
micafugina também mostrou atividade contra Candida spp. e Aspergilus spp. in
vitro (TAWARA et al., 2000), além de ser eficaz em animais (MATSUNOTO et
al.,1998). Quando aplicada em população com o vírus da AIDS, micafugina foi
11
efetiva na melhora ou eliminação dos sinais clínicos e sintomas da candidíase
(WAKAI et al., 1998).
HO
NH
O
N
HN
CH3HO
NH
R5
OH
R4
HN
O
N
NH
R2
O
R1
HO
OH
OH
OHR3
O
OO
R1 R2 R3 R4 R5
23 H NH2(CH2)2CHOH H NH(CH2)2NH
O
24 OHSO3 NH2(CO)CH2CHOH CH3 OH
O
N O
O
Fungos filamentosos também produzem estatinas, substâncias com ação
hipocolesterolêmica, ou seja, que agem reduzindo os níveis sanguíneos de
colesterol. Em 1975, no Japão, isolou-se, pela primeira vez, do fungo Penicillum
brevicompactum, a mevastatina (25), posteriormente obtida também de Penicilium
citrinum (DEWICK, 2002). Lovastatina (12), outra substância hipocolesterolêmica
foi isolada posteriormente de culturas de Aspergillus terreus e Monascus ruber com
estrutura semelhante à mevastatina (possui um grupo 6´-metílico adicional), mas
com potência superior, levando à sua aprovação como medicamento, em 1987,
pelo FDA (Food and Drug Administration), enquanto a mevastatina foi abandonada
devido a efeitos indesejáveis em animais (CAMPO, CARVALHO, 2007). Estudos de
otimização levaram à síntese da simvastatina (26), análogo sintético da lovastatina,
que ingressou no mercado farmacêutico na década de 70 como o primeiro fármaco
antilipidêmico sintético, atuando como inibidor da 3-hidroxi-3-metil-glutaril Co-A
redutase (HMG-Co-AR), enzima cineticamente limitante da biossíntese do
12
colesterol, tendo como substrato natural o hidroxi-metil-glutaril-Co-A, levando ao
ácido mevalônico ou à mevalo-lactona. Este fármaco representa uma autêntica
inovação terapêutica para controle do colesterol plasmático (VIEGAS Jr. et al.,
2006).
HO
OO
OHO
HO
O
H3C
O
OHO
H3C
CH3CH3
HO
OO
OHO
25 12 26
Outras substâncias com importantes atividades biológicas também isoladas
de micro-organismos são os imunossupressores ciclosporina A (3), rapamicina (27)
e ácido micofenólico (28), tendo, este último, originado o fármaco semi-sintético
micofenolato de mofetila (29) (USUI, et al., 2006).
NN
N
HN
NN
O O O
OH
HOO
O
N
HN
NH
NNH
O O
O
O
O
OMe
OHOMe
OH
O
O
OOMe
H OH
Me
O
N
O
Me
Me OMe Me Me
Me
3 27
13
O
O
O
OH
OH
O
O
O
O
OH
O
O
N O
28 29
No entanto, alguns fungos produzem também substâncias tóxicas para os
seres vivos, denominadas micotoxinas. As micotoxinas são substâncias naturais
produzidas pela estrutura micelial dos fungos filamentosos, não tendo significado
bioquímico no crescimento e desenvolvimento destes (HUSSEIN, BRASEL, 2001).
São encontrados mais de 400 destes compostos e estes são classificados de
acordo com suas características químicas e origem biossintética (BENNETT,
KLICH, 2003). Entre as micotoxinas mais importantes encontram-se as aflatoxinas,
como a aflatoxina B1 (10), ocratoxinas, como a ocratoxina A (30), citreoviridinas,
como a citrinina (31), fuminosinas, como a fuminosina B1 (32), patulina (33) e
alcalóides do ergot, como a ergotamina (34) (PINTO et al., 2002; BENNETT,
KLICH, 2003). Surpreendentemente, algumas micotoxinas, como a di-
hidroergotamina (35) e a metilergonovina (36) possuem relevantes propriedades
farmacológicas, sendo utilizadas na medicina humana no tratamento da enxaqueca
e no controle de hemorragias pós-parto, respectivamente (MOSS, 2002;
MOREIRA, 2009).
O O
O
O O
OCH3
NH
OH
O
O
Cl
O
H
CH3
COOH
10 30
14
O
OH
HOOC
O
CH3 CH3
CH3
CH3
H3C
O C C
OHOH
CH3
O
CH3 OH
O C OH OH
O O
O
OH
O
OH
NH2
31 32
O
O
O
OH 33
HN
N
HCH3
H
O
NH
CH3
O
N
O
OH
N
H
H CH2
O
34
HN
N
HCH3
H
O
NH
CH3
O
N
O
OH
N
H
H CH2
O
HN
H
N
O NH
OH
35 36
1.3. O FUNGO Paecilomyces lilacinus
Paecilomyces lilacinus (Figura 3) é uma espécie de fungo filamentoso que
pertence ao filo Ascomycota, classe Euascomycete, ordem Eurotiales, família
Trichocomaceae, gênero Paecilomyces e espécie lilacinus (GABOARDI, 2007).
15
As colônias de espécies deste gênero apresentam inicialmente formas
planas e flocosas, mas à medida que amadurecem, desenvolvem textura
aveludada ou pulverulenta. A cor das colônias pode ser altamente variada
(FISHER, COOK, 2001), sendo que as colônias de Paecilomyces lilacinus
apresentam conidióforo pigmentado, parede rugosa e reverso incolor ou púrpura
(LACAZ et al., 2002).
Figura 3. Foto da aparência do fungo P. lilacinus cultivado em meio de cultura ágar
batata dextrosado (A) e microfotografia dos conidióforos (B).
FONTES:http://www.biotec.or.th/tncc/dbstore/StrainDetails.asp?Genus=Paecilomyces&Species=lil
acinus&id=82&DB=BCC [acessado em: 12/07/11]
http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_SEM.htm [acessado em 12/07/11]
O gênero Paecilomyces é morfologicamente similar ao gênero Penicillium e,
no ano de 1971, já eram descritas 31 espécies diferentes. As espécies mais
comuns são P. variotti e P. lilacinus (SAMSON, 1974), podendo esta última, no
Brasil, ser encontrada em diferentes tipos de solo, cultivados ou não, em
profundidades variáveis de 0-40 cm ou mais (CARNEIRO, 1986) e em estruturas
marinhas, como esponjas e outros (ELBANDY et al., 2009).
Fungos deste gênero são capazes de produzir uma diversidade de
metabólitos secundários de diferentes classes químicas e com diferentes atividades
biológicas, como antimicrobiana, citotóxica e imunoestimulante (KIONG et al.,
2001). Estudos mostram a produção de paeciloquinonas, antraquinonas inibidoras
da enzima tirosina quinase por P. carneus P-177 (FRENDENHAGEN et al., 1995);
paecilosetina (37), um ácido tetrâmico produzido por P. farinosus (LANG et al.,
2005), uma série de tricotecanos de P. tenuipes (KIKUSHI et al., 2004);
cornexistina (38) e 14-hidroxicornexistina (39), fitotoxinas, produzidas por P. variotii
16
(FIELDS et al., 1996), além de α-pironas (40-41) e ciclo-hexenonas (42-43),
isoladas de P. lilaninus, derivados de uma esponja marinha (ELBANDY et al.,
2009). Outras substâncias foram isoladas, recentemente, de Paecilomyces sp.
SC0924, seis novas lactonas β-resorcíclicas (44-49) denominadas paecilomicinas
A-F e outras cinco já conhecidas, na qual, algumas mostraram atividade anti-
plasmodial contra Plasmodium falciparum (XU et al., 2010).
H
H
HO
NH
HO
O
OO
O
O
OH
OH
R
37 38 R = CH3 / 39 R = CH2OH
O
O
R2
R1
R3
O
R3
O
R1
OCH3
R2
40 R1 = OH, R2 = CH3, R3 = H 42 R1 = O
O
, R2 = OOH, R3 = OCH3 41 R1 = CH3, R2 = H, R3 = H
43 R1 = OOH, R2 =O
O
, R3 = OCH3
O
OOH
OHH3COO OH
H
OH 44 45
O
O
H3CO
OH
O
HO OH
OH
17
O
OH
H3CO
OH OHR1R2 OH
O
OH
O
OOH
OHH3CO
R1
R2
OH
46 R1 = H, R2 = OH
47 R1 = OH, R2 = H
48 R1 = H, R2 = OH
49 R1 = OH, R2 = H
P. lilacinus possui distribuição cosmopolita e seus metabólitos secundários
são amplamente utilizados no controle biológico de nematóides, sendo, muitas
vezes, a produção desses metabólitos induzida pela presença dos nematóides no
meio (SANTIAGO et al., 2006). Os metabólitos secundários produzidos por esta
espécie são diversos, variando com o meio e as condições às quais estão
submetidos os micro-organismos.
1.4. ANTIBACTERIANOS
As doenças infecciosas representam, atualmente, umas das principais
causas de morte da população humana, devido ao surgimento de micro-
organismos multirresistentes aos antibióticos, ocasionada por diversos fatores,
entre eles, o uso constante e irracional de antibióticos (DAFFRE et al., 2001;
ANTUNES et al., 2006), o surgimento de organismos oportunistas fatais,
associadas à AIDS, quimioterapia anti-neoplásica e transplantes (PENNA et al.,
2001). Diante de tal situação, a pesquisa por novos agentes antimicrobianos
eficazes é de grande relevância, alargando o campo da pesquisa nesta área.
O interesse pelo isolamento de metabólitos secundários de fungos, capazes
de inibirem outros micro-organismos, tem aumentado na pesquisa aplicada e na
investigação acadêmica (LIMA et al., 2004). O uso de fungos para este fim, por
exemplo, em substituição às plantas é benéfico, pois micro-organismos não
acarretam danos ao serem isolados de um dado ecossistema, como pode ocorrer
18
com a retirada de plantas e algas da natureza, além de os fungos, poderem ser
cultivados em grande escala em fermentadores (TAKAHASHI, LUCAS, 2008).
Os antibióticos são compostos naturais ou sintéticos que inibem o
crescimento ou provocam a morte de bactérias e fungos (GUIMARÃES et al.,
2010), sendo, as principais classes, mostradas na Tabela 1.
Tabela 1. Principais classes e alvos de antibióticos
Antibióticos Alvo
β-lactâmicos (penicilinas, cefalosporinas,carbapeninas, monobactamas)
Enzima transpeptidase
β-lactâmicos (oxapeninas, sulfoxapeninas)
Enzima β-lactamase
Macrolídeos, lincosamidas, estreptograminas (dalfopristina e quinupristina), cloranfenicol,
oxazolidinonas (linezolida)
Subunidade 50S ribossômica
Aminoglicosídeos, tetraciclinas
Subunidade 30S ribossômica
Glicopeptídeos (vancomicina, teicoplanina)
Dipeptídeo terminal D-Ala-D-Ala do peptideoglicano
Peptídeos não ribossomais (bacitracina, gramicidina C, polimixina B)
Membrana plasmática
Lipodepsipeptídeos (daptomicina)
Membrana plasmática
Rifampicina
RNA polimerase dependente de DNA
Fluoroquinolonas
Enzima DNA girase
Sulfonamidas
Enzima di-hidropteroato sintetase
FONTE: Adaptado de GUIMARÃES et al., 2010.
Para o tratamento de infecções fúngicas, os principais medicamentos
utilizados são a anfotericina B (22) e os azóis [cetoconazol (50), fluconazol (51),
itraconazol (52), e outros], que têm como alvo a membrana celular dos fungos
(BERGOLD, GEORGIADIS, 2004). A anfotericina B é um potente fungicida de
amplo espectro, mas seu uso pode causar efeitos adversos significantes, como
nefrotoxicidade e febre devido à reação aguda à sua infusão intravenosa; já os
azóis, compostos totalmente sintéticos, causam menos reações adversas, sendo
preferencialmente escolhidos no tratamento de infecções fúngicas sistêmicas. Há,
19
N N O
O
O
NN
Cl
ClO
H3C
Cl
Cl
N
N
NO
O
O N N N
N
N
O
F
F
OH
NN
N
N
N
N
no mercado, novos fármacos antifúngicos como as aureobasidinas, que agem
inibindo a síntese da membrana plasmática dos fungos (PELÁEZ, OLGA, 2009) e
o posaconazol, um triazólico de segunda geração (TELLES, 2007).
50
51
52
As fontes de antibióticos são, entre outras, os estreptomicetos, os
actinomicetos raros, os fungos e as bactérias (BÉRDY, 2005). O Gráfico 2 ilustra a
distribuição da produção de antibióticos por esses organismos.
20
Gráfico 2. Distribuição da produção de antibióticos por micro-organismos.
As infecções são causadas por uma variedade de micro-organismos, sendo
alguns mais patogênicos que outros. Colombo e Guimarães (2003) mostraram que
as leveduras do gênero Candida são responsáveis por cerca de 80% das infecções
fúngicas hospitalares, sendo a principal causa de infecção fúngica sistêmica, com
taxa de mortalidade geral de fungemias da ordem de 40 a 60%. Quanto às
infecções bacterianas, algumas das espécies mais patogênicas compreendem
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Diante o
exposto, faz-se necessária a descoberta de novas substâncias antibióticas que
atuem combatendo as infecções.
1.5. ANTICOLINESTERÁSICOS
A doença de Alzheimer é uma afecção neuro-degenerativa progressiva e
irreversível, que acarreta perda da memória e diversos distúrbios cognitivos
(SMITH, 1999). Esta patologia acomete cerca de 1,5% da população com idade
entre 65-69 anos, 21% entre 85-86 e 39% acima dos 90 anos, sendo presente em
aproximadamente 15 milhões de pessoas em todo o mundo (VIEGAS Jr. et al.,
2004). Os sinais e sintomas estão relacionados à redução de neurotransmissores
cerebrais, como acetilcolina, noradrenalina e serotonina (BRYNE, 1998).
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
Bactérias Fungos Actinomycetales (Estreptomicetos +
Actinomicetos raros)
Porc
enta
ge
m d
a p
rod
ução d
e
antibió
ticos p
or
mic
ro-o
rga
nim
os
em
2005
Micro-organismo
21
NH2
O
NH
Me
O
N N
H
Me
MeMe
O tratamento da doença de Alzheimer é baseado na tentativa de restauração
da função colinérgica. Dessa forma, a elevação do nível da acetilcolina é realizado
pela utilização de inibidores da acetilcolinesterase (IAchEs), enzima que atua na
degradação desses neurotransmissores na fenda sináptica. Atualmente, há uma
diversidade de substâncias sendo pesquisadas para tal fim, o que se tornou
possível graças à modernização dos ensaios, que agora permitem a utilização da
enzima AchE para avaliação rápida de grandes quantidades de amostras. Este
bioensaio sensível é capaz de detectar e selecionar amostras com ação
anticolinesterásica (TREVISAN, 2003).
A tacrina (53) foi o primeiro fármaco sintético aprovado pelo FDA para o
tratamento da doença de Alzheimer, porém apresenta sérios efeitos colaterais.
Outros fármacos, como fisostigmina (54) e rivastigmina (55) também tem sido
utilizados. Porém, a galantamina (56), um alcalóide isolado de plantas da família
Amaryllidaceae, apresenta ação seletiva, reversível e competitiva para inibir a
acetilcolinesterase (TREVISAN et al., 2006), sendo considerada mais efetiva do
que a fisostigmina e a tacrina (INGKANINAN et al., 2000; RHEE et al., 2001). A
galantamina tem sido utilizada como protótipo para novos fármacos
anticolinesterásicos. Outra substância anticolinesterásica é a Huperzina-A (57),
isolada de Huperzia serrata. Esta substância mostrou potente atividade IAhE e seu
uso sistêmico pode aumentar a liberação de ACh, dopamina e norepinefrina, sendo
que o aumento da concentração de ACh pode persistir por até 6 h após a
administração do chá desta planta (CHANG , 2000; RAJENDRAN et al., 2002).
A atividade anticolinesterásica de extratos da planta Ginkgo biloba (VIEGAS
Jr., et al., 2004), aliada à diversidade estrutural dos IAchEs conhecidos e à
possibilidade de se estudar diferenciados modos de ação, estimularam o estudo
químico de várias espécies vegetais e de micro-organismos, que pudessem
fornecer novas substâncias anticolinesterásicas.
53 54
22
O
O
N
CH3
CH2CH3
H3C
CH3
CH3 O
MeO
H
N
OH
Me
55 56
H2NH3C
NH
O
CH3
57
Trevisan e colaboradores (2003) realizaram um estudo com 50 extratos de
38 espécies de variados gêneros vegetais, para identificar, nestes extratos,
substâncias inibidoras da enzima AchE. Para a pesquisa, foram utilizados o ensaio
bioautográfico de Rhee et al e o ensaio de Ellmann, em microplacas. Os autores
observaram que Paullinia cupana (guaraná), Amburana cearensis (cumaru) e
Lippia sidoides (alecrim-pimenta) foram as espécies que demonstraram os
melhores resultados, inibindo de 65-100% da atividade enzimática.
Produtos naturais produzidos por micro-organismos também são candidatos
a novas fontes de substâncias anticolinesterásicas, como as quinolactacina A1 (58)
e quinolactacina A2 (59) isoladas de uma cultura de Penicillium citrinum 90648
(KIM et al., 2001) . Estudos como estes evidenciam a contribuição e a relevância
da pesquisa de metabólitos fúngicos com a finalidade de sua utilização no
desenvolvimento de novos fármacos anticolinesterásicos.
N
HN
OO
CH3
H3C
CH3
N
HN
OO
CH3H3C
H3C
58 59
23
1.6. TÉCNICA ―OSMAC‖ (One strain-many active compounds)
Como visto anteriormente, produtos naturais produzidos por micro-
organismos são alvos de grande interesse de pesquisadores e da indústria
farmacêutica, principalmente após a descoberta do antibiótico penicilina, isolado de
um fungo. Este fato pode ser atribuído a fatores como a alta diversidade química
das moléculas produzidas no metabolismo de micro-organismos e à facilidade de
manuseio, pouco tempo e espaço que demandam o cultivo dos mesmos (ELIAS et
al., 2006). Além disso, técnicas estão sendo desenvolvidas para otimizar, direcionar
e/ou diversificar a produção de metabólitos secundários de micro-organismos,
sendo que essas técnicas podem ser divididas em dois tipos: técnicas moleculares
e técnicas de cultivo onde parâmetros do mesmo são alterados (GROSS, 2007).
Esta última vem sendo utilizada há algum tempo por pesquisadores que trabalham
com produtos naturais de micro-organismos e é denominada OSMAC (one strain-
many active compounds).
O método OSMAC baseia-se no cultivo de uma determinada espécie de
micro-organismo variando-se alguma (s) condição (ões) de incubação. São vários
os parâmetros que podem ser variados, dentre eles, a composição do meio de
cultura, aeração do meio, alterando a rota metabólica daquele micro-organismo
(SALEEM et al., 2009), período de cultivo, pH, temperatura e a adição de agentes
para induzir ou inibir a produção de determinado (s) metabólito (s) (BODE et al.,
2002; BUGNI, IRELAND, 2004). Uma importante ferramenta aliada ao OSMAC é a
utilização de modelos estatísticos para se delinear experimentos (PIMENTA, et al.,
2010), o que pode otimizar o crescimento microbiano, aumentando a produção de
metabólitos bioativos e direcionando a pesquisa para a produção de determinada
(s) substância (s) (COCKSHOTT, SULLIVAN, 2001; CHAKRAVARTI, SAHAI, 2002;
FURTADO et al., 2005; SAYYAD et al., 2007; TULLY et al., 2007).
Cueto e colaboradores (2001) realizaram um importante trabalho, no qual
um potente antibiótico foi obtido a partir da técnica de OSMAC. Pestalone (60),
uma benzofenona clorada, foi isolada a partir de uma mistura contendo o fungo
marinho Pestalotia sp. (linhagem CNL-365) e uma bactéria marinha não
identificada, antibiótico-resistente, sendo que, quando a espécie fúngica era
cultivada individualmente, essa substância não era produzida.
24
HO
OH
CHO
O OH
Cl
Cl
RO
60
Fatos como este demonstram que a produção de substâncias antibióticas
pode ser induzida em resposta ao antagonismo microbiano (BURGESS et al.,
1999) e que a produção de metabólitos secundários específicos pode ser
aumentada 400 vezes quando espécies são cultivadas na presença de um
antagonista (SONNENBICHLER et al., 1994). Pestalone mostrou potente atividade
antibacteriana contra Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MIC = 37
ng/mL) e Enterococcus faecium resistente à vancomicina (MIC = 78 ng/mL).
Wang e colaboradores (2011) realizaram uma pesquisa na qual, utilizando a
técnica OSMAC, isolaram três novas citocalasinas (alcalóides fúngicos) (61, 62 e
63) e cinco novos análagos, as aspocalasinas, de uma cultura de Spicaria elegans.
A obtenção desses produtos foi decorrente da variação do meio de cultivo e da
adição de aminoácidos precursores dessa molécula, pois o tipo de citocalasina
produzido depende do aminoácido incorporado à sua estrutura. As moléculas 61,
62 e 63 foram avaliadas quanto à atividade citotóxica, contra linhagens celulares.
HNO
OH
O
OH
HO
HNO
O
O
O OH
O
61 62
25
HNO
O
O
O
O
OH 63
As substâncias 61 e 62 mostraram grande atividade citotóxica contra a linhagem A-
549 com IC50 de 8,2 µM e 20,0 µM, respectivamente.
Em outro estudo, realizado por Bode e colaboradores (2000), induziu-se a
mutação do fungo Sphaeropsidales sp. (linhagem F-249707) por exposição à luz
UV. Esta espécie de fungo, produtora de espirobisnaftalenos, policetídeos com
diferentes atividades biológicas, como por exemplo, a cladospirona bisepóxido (64),
após mutação, produziu um novo policetídeo, denominado mutolide (65). A nova
substância foi submetida ao teste antibacteriano, contra B. subtilis e E. coli,
produzindo halo de inibição de 10 mm na placa.
O OO
OH OH
O O
O O
OH
OH
H3C
64 65
Na pesquisa realizada por Scherlach e Hertweck (2006), quatro novas
aspoquinolononas (66–69) foram obtidas a partir de uma cultura de Aspergillus
nidulans, submetida à técnica de OSMAC. Um total de 40 extratos foi preparado
em 40 diferentes condições de cultivo (seis diferentes meios de cultura, cultivo sob
agitação e condição estática, além de variação no tempo de cultivo).
26
NH
HO
O
OCH3
OCH3
H
OHO
NH
HO
O
OCH3
OCH3
H
OHO
66 67
NH
HO
O
OCH3
OCH3
H
OHOHO
diasteroisômeros 68-69
As aspoquinolonas 66 e 67 exibiram grande atividade citotóxica contra células
fibroblásticas L-929 de ratos com IC50 de 10,6 e 11,4 lg mL-1, respectivamente e
bom efeito antiproliferativo de células leucêmicas K-562 (IC50 =17,8/21,2 lg mL-1),
respectivamente.
27
Capítulo 2
OBJETIVO
28
2. OBJETIVO
2.1. OBJETIVO GERAL
Realizar o estudo químico de metabólitos secundários do fungo
filamentoso Paecilomyces lilacinus, utilizando-se a técnica OSMAC em
seu cultivo, para a obtenção de substância (s) com atividade (s)
antibacteriana (s), antifúngica (s) e anticolinesterásica (s).
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Cultivar o fungo P. lilacinus, em diferentes condições, para a obtenção
dos extratos brutos;
Selecionar, por meio de testes biológicos, as condições de cultivo que
levarem aos extratos mais ativos;
Produzir os extratos mais ativos em quantidades adequadas ao seu
fracionamento;
Submeter os extratos brutos selecionados à técnicas de cromatografia
para o isolamento de constituintes químicos;
Elucidar a estrutura das substâncias isoladas utilizando técnicas
espectrométricas;
Realizar testes biológicos (atividade antibacteriana, antifúngica e inibição
de acetilcolinesterase) para as substâncias isoladas.
29
Capítulo 3
PARTE EXPERIMENTAL
30
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1. EQUIPAMENTOS
Agitador de tubos Phoenix, modelo AP 56, série 10359;
Agitador magnético Corning;
Autoclave vertical Fanen, modelo 415/3, série J03610;
Balança analítica Quimis, modelo Q-ILA2104, 210g/0,1 mg;
Balança eletrônica Digimed KN1000C, classe exatidão II, série 04G6;
Banho Büchi waterbath B-480;
Banho de ultra-som UltraCleaner 800ª com aquecimento;
Bomba de pressão Quimis, modelo Q-355B1, série 806377;
Bomba de pressão Millipore WP6111560;
Bomba de vácuo Tecnal TE-0581;
Capela de exaustão em madeira;
Cabine de segurança biológica VECO, modelo JLF 912, série FL 5799;
Câmera fotográfica Sony Cyber-shot 7.2 mega pixels;
Chapa de aquecimento Laboratory Stirrer, modelo PC-320, série 440893;
Cromatógrafo a gás HP5890;
Cromatógrafo líquido Waters Alliance 2695;
Colunas de vidro;
Espectrofotômetro Bioespectro, modelo SP-22;
Espectrômetros BRUKER AVANCE DPX200 e DRX400;
Espectrômetro de massas MicroTOF, Bruker Daltonics;
Estufa de secagem Fanen Ltda, modelo 002 CB;
Estufa para meio de cultura Quimis Q-316.12, série 807.131;
Estufa para placa cromatográfica Quimis G-317 8122;
Incubadora B.O.D. MA 415/ Marconi;
Lâmpada UV 254 nm Mineralight UVG-54;
Leitora de microplaca Thermo Plate, modelo: TP-READER;
Mesa agitadora Tecnal, modelo TE-421;
Mesa agitadora Cientec CT- 712;
31
Microondas Máster Cooking CCE M-500;
Micropipeta automática Digipet de 5-50 µL, série 05012635;
Micropipeta automática Finnpipette 4027, Labsystems de 200-1000 µL, série
E19971;
Micropipeta automática Kacil de 100 µL, série 0037201;
Micropipeta automática multicanal Digipet de 20-100 µL;
Paquímetro digital 150 mm/0,01mm, Jomarca;
Placas de vidro para CCD;
Ponto de fusão Gehaka, modelo PF 1000, série 0530/06001020;
Purificador de água Millipore- Milli Q;
Refrigerador Consul Pratice 230;
Refrigerador Eletrolux Double D440;
Rotavapor Büchi Waterbath, modelo B-480;
Rotavapor Fisaton, modelo 802, série 531782;
Termômetro Incoterm, série 313675.
3.2. REAGENTES
Ágar batata dextrosado- PDA, Acumedia;
Caldo de batata dextrosado- PDB, Acumedia;
Caldo infusão de cérebro e coração- BHI, Acumedia;
Cloreto de Sódio, Vetec;
Discos com cloranfenicol (30 µg/disco), Sensidisc;
Discos com miconazol (50 µg/disco), Sensifungidisc- CECON;
Iodo sublimado;
Meio de cultura antibiótico, Difco TM ;
Sílica gel para CCS, Vetec;
Sílica gel para CCD, Sigma;
Solventes P.A: acetato de etila, acetona, álcool isopropílico, álcool metílico,
clorofórmio, diclorometano, dimetilsulfóxido, éter etílico, hexano, piridina;
Solvente grau HPLC: álcool metílico;
32
Kit SIGMA para teste de inibição da enzima aceticolinesterase: Albumina
bovina sérica B4287-25G, Ácido 5,5‘-ditiobis- [2-nitrobenzóico] (DTNB) D8130-
5G, Tris/HCl 0,1 M pH 8, Iodeto de acetilcolina (ACTI) A5751-5G,
Acetilcolinesterase liofilizada tipo V-S C2888.
3.3. MEIOS DE CULTURA
3.3.1. Meio de cultura BHI
BHI (Brain heart infusion) .......... 37,0 g/L
Água destilada qsp
3.3.2. Meio de cultura sólido antibiótico
Meio antibiótico .......... 30,5 g/L
Água destilada qsp
3.3.3. Meio caldo batata dextrosado
Caldo batata dextrosado .......... 24,0 g/L
Água destilada qsp
3.3.4. Meio ágar batata dextrosado
Ágar batata dextrosado .......... 39,0 g/L
Água destilada qsp
33
3.4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADO À
DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS (CLAE-PDA)
Os extratos brutos, obtidos a partir do cultivo do fungo P. lilacinus em
diferentes condições, foram analisados por CLAE-PDA para a obtenção dos perfis
cromatográficos dos mesmos, a fim de se verificar o perfil da produção de
metabólitos secundários em função dos parâmetros estudados. As amostras
analisadas por CLAE-PDA foram devidamente filtradas com unidades filtrantes
MILLEX LCR (0,45µm) PTFE modificadas para solventes orgânicos - Millipore. Os
extratos fúngicos foram analisados utilizando-se um cromatógrafo líquido Waters
Alliance 2695, equipado com bomba quaternária, auto-injetor, detector de arranjo
diodo (PDA) e forno para coluna. As separações foram realizadas em uma coluna
de fase reversa C18 Shimadzu ODS (150 x 4,6 mm; 5 µm). O volume de amostra
injetado foi de 20,0 µL, na concentração de 1,0 mg/mL. O sistema cromatográfico
foi operado utilizando-se o software EMPOWER.
O método empregado na corrida cromatográfica apresentou as seguintes
características: a fase móvel consistiu de uma mistura de H2O e metanol e o
gradiente linear de eluição usado foi H20-MeOH 90:10 a 0:100 em 30 min. O
gradiente foi retornado ao valor inicial e mantido por 5 min, para equilíbrio do
sistema, antes da injeção da próxima amostra. A fase móvel utilizada (H20 –
MeOH) foi filtrada e desgaseificada por 30 min em banho de ultra-som antes do
experimento. O fluxo do eluente foi de 0,8 mL/min.
3.5. CROMATOGRAFIA A GÁS (CG)
As análises por CG foram realizadas em um cromatógrafo a gás HP5890
equipado com detector por ionização de chamas. Utilizou-se uma coluna HP-
INNOWax (HP) 15 m X 0,25 mm com gradiente de temperatura: 150ºC, 1 min, 7
ºC/min até 240 ºC; injetor (split de 1/50) a 250 ºC e detector a 250 ºC. Hidrogênio
como gás de arraste (2,0 mL/min) e volume de injeção de 2,0 l. A identificação
dos picos foi feita por comparação com padrões de ácidos graxos metilados
SUPELCO37. As porcentagens de acilglicerídios e/ou ácidos graxos livres foram
34
comparadas com óleo de soja (12,0 mg) hidrolizado, metilado e analisado sob as
mesmas condições.
3.5.1. Preparo das amostras para análise em CG
I. Hidrólise de lipídeos
Dissolveram-se, em tubo criogênico de capacidade de 2,0 mL, ~10,0 mg do
óleo em 100 µL de uma solução de etanol (95%)/ hidróxido de potássio 1 mol/L
(5%). Após agitação em vórtex por 10 s, o óleo foi hidrolisado em um forno de
micro-ondas doméstico (Panasonic Piccolo), à potência de 80 W (Potência 2),
durante 5 min. Após resfriamento, adicionaram-se 400 L de ácido clorídrico a
20%, uma ponta de espátula de NaCl e 600 L de acetato de etila. Após agitação
em vórtex por 10 s e repouso por 5 min, uma alíquota de 300 L da camada
orgânica foi retirada, colocada em tubos de microcentrífuga e seco por evaporação,
obtendo-se assim os ácidos graxos livres (adaptado de W. W. Christie, Gas
Chromatography and Lipids, 1989, Pergamon Press).
II. Metilação dos ácidos graxos
Os ácidos graxos livres foram metilados com 100 µL BF3 / metanol (14%),
usando-se aquecimento durante 10 min em banho de água a 80 ºC. Foram, em
seguida, analisados por cromatografia a gás.
3.6. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
Os espectros de RMN de 1H, RMN de 13C, subespectros DEPT 135 e os
mapas de contornos HSQC, HMBC, COSY e NOESY foram obtidos em
espectrômetros BRUKER AVANCE DPX200 e DRX400 no Laboratório de
Ressonância Magnética de Alta Resolução (LAREMAR) do Departamento de
Química- ICEx- da Universidade Federal de Minas Gerais. Os deslocamentos
químicos (δ) foram registrados em ppm e as constantes de acoplamento em Hertz
(Hz). O tetrametilsilano, TMS, foi usado como padrão de referência interno para
deslocamento químico (δ 0).
35
3.7. ESPECTROSCOPIA DE MASSAS POR IONIZAÇÃO POR
ELECTROSPRAY (EM-ESI)
Os espectros de massas foram obtidos em espectrômetro de massas marca
Bruker Daltonics, modelo MicroTOF, equipado com fonte de ionização electrospray
operando no modo positivo em alguns espectros e no modo negativo em outros, no
Laboratório Central Analítica do Instituto de Química da Universidade de São
Paulo. Soluções MeOH/água dos compostos foram preparadas e analisadas na
faixa de m/z entre 200 e 500 daltons.
3.8. MANUTENÇÃO DOS MICRO-ORGANISMOS
Os micro-organismos utilizados neste trabalho pertencem à coleção
microbiológica do Laboratório de Biotecnologia e Bioensaios do Departamento de
Química da Universidade Federal de Minas Gerais. Os fungos encontravam-se
armazenados na forma de suspensão de esporos em glicerol 12% a -86 ºC. Para a
utilização diária, estes se encontravam armazenados em geladeira (a 8 ºC), em
tubos de ensaio contendo ágar batata dextrosado.
3.9. CULTIVO DOS MICRO-ORGANISMOS
Todo o procedimento de obtenção do pré-inóculo e inóculo da bactéria e do
fungo foi realizado em cabine de segurança biológica sob condições assépticas,
próximo à chama do bico de Bunsen. Os materiais e reagentes utilizados foram
previamente esterilizados em autoclave a 121 ºC durante 20 min.
3.9.1. Inoculação da bactéria Salmonella typhimurium
Preparo do pré-inóculo: com o auxílio de uma alça de platina, retirou-se uma
quantidade suficiente de bactéria (S. typhimurium), armazenada em tubo de ensaio
e inoculou-se em outro tubo de ensaio contendo 3,0 mL de meio de cultura BHI. O
tubo foi incubado em estufa a 37 ºC, durante 8-18 h.
36
Preparo do inóculo: o pré-inóculo contendo a bactéria (S. typhimurium) foi
transferido para um Erlenmeyer contendo 200 mL de meio de cultura (BHI), em
duplicata. Após inoculação da bactéria, os frascos foram incubados em estufa a 37
ºC, durante 24 h.
3.9.2. Cultivo do fungo Paecilomyces lilacinus
Preparo do pré-inóculo I: com o auxílio de uma alça de platina, foi realizada
a raspagem do micro-organismo armazenado em um tubo de ensaio, mantido em
geladeira (a 8 ºC). O micro-organismo foi, em seguida, inoculado em outro tubo de
ensaio contendo meio de cultura ágar batata dextrose (PDA). O fungo foi cultivado
durante sete dias, sem agitação, à temperatura ambiente (25 ºC).
Preparo do pré-inóculo II: após o crescimento do fungo, o mesmo foi
inoculado em Erlenmeyers contendo 200 mL de meio de cultura líquido caldo
batata dextrose (PDB). Em seguida, foi realizada a homogeneização do meio com
o micro-organismo. O fungo foi cultivado durante sete dias, sob agitação, à
temperatura ambiente (25 ºC). Este procedimento foi realizado para que se
obtivesse quantidade suficiente de biomassa, para que pudesse então, ser iniciado
o experimento de cultivo do fungo em diferentes condições.
Preparo dos inóculos: após obtenção da biomassa do fungo, o mesmo foi
inoculado em Erlenmeyers contendo meio de cultura líquido caldo batata dextrose
(PDB). Em seguida, foi realizada a homogeneização do meio com o micro-
organismo.
O experimento foi iniciado com o preparo de 28 frascos (14 frascos sob
condição estática e 14 frascos sob condição de agitação em agitador orbital). O
fungo foi cultivado durante 21 dias, à temperatura ambiente (25 ºC).
Os frascos foram numerados de 1 a 14 S.A (sem agitação) e 1 a 14 C.A
(com agitação), e inoculados conforme a seqüência apresentada na Tabela 2.
37
Tabela 2. Condições de inoculação do fungo P. lilacinus
Frasco Conteúdo
1 PDB + fungo
2 PDB, controle
3 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano e fungo
4 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano
5 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano, adicionou-se o fungo após 7 h;
6 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano, após 7 h, autoclavou-se o frasco
e inoculou-se o fungo
7 PDB + 1 mL do inóculo bacteriano, após 7 h autoclavou-se o frasco
8 PDB + fungo, após 8 dias, inoculou-se 1 mL do inóculo bacteriano
9 PDB, após 8 dias, inoculou-se 1 mL do inóculo bacteriano
10 PDB + fungo, após 8 dias, inocularam-se 10 mL do inóculo
bacteriano
11 PDB, após 8 dias, inoculou-se 1 mL do inóculo bacteriano
12 PDB + fungo, após 8 dias, inocularam-se 10 mL do inóculo
bacteriano autoclavado
13 PDB + fungo, após 8 dias, inocularam-se 10 mL do inóculo
bacteriano submetido à irradiação de micro-ondas
14 PDB, após 8 dias, inocularam-se 10 mL do inóculo bacteriano
submetido à irradiação de micro-ondas
PDB= caldo de batata dextrosado
Oito dias após o inicio do experimento, os frascos contendo os inóculos da
bactéria usados no início do experimento foram utilizados da seguinte forma, o
primeiro foi submetido à irradiação de micro-ondas por 2 min e, o segundo,
autoclavado a 121 ºC, por 20 min. Estes procedimentos foram realizados a fim de
se interromper o crescimento bacteriano, para que se pudesse trabalhar somente
com o material genético bacteriano. Em seguida, os inóculos bacterianos tratados
foram adicionados nos respectivos frascos.
Preparo do extrato fúngico: após o período de 21 dias, o crescimento dos
micro-organismos foi interrompido adicionando-se acetato de etila. Os meios de
38
cultura foram filtrados a vácuo com o auxílio de funil e papel de filtro, separando-se
o filtrado do micélio. O filtrado foi extraído com acetato de etila utilizando-se funil de
separação. O procedimento foi realizado por três vezes. O micélio também foi
submetido à extração com acetato de etila, e seu extrato combinado com o filtrado
orgânico. Em seguida, os extratos orgânicos obtidos foram concentrados em
rotavapor a vácuo e transferidos para frascos limpos e previamente pesados. As
massas de extratos obtidas encontram-se listadas na Tabela 3.
Os extratos foram submetidos aos testes biológicos e aqueles que
apresentaram a melhor combinação dos resultados (maior atividade e perfil por
CCD) foram novamente preparados, em escala ampliada, para as etapas
posteriores.
Tabela 3. Massa dos extratos do fungo P. lilacinus
Extrato Código do extrato
Meio de cultura (L)
Massa do extrato (mg)
1 1 S.A 1,0 115,0
2 2 S.A 1,0 3,7
3 3 S.A 1,0 327,0
4 4 S.A 1,0 265,0
5 5 S.A 1,0 278,0
6 6 S.A 1,0 238,0
7 7 S.A 1,0 12,0
8 8 S.A 1,0 127,0
9 9 S.A 1,0 213,0
10 10 S.A 1,0 206,0
11 11 S.A 1,0 66,0
12 12 S.A 1,0 109,0
13 13 S.A 1,0 106,0
14 14 S.A 1,0 51,0
15 1 C.A 0,2 18,7
16 2 C.A 0,2 4,1
17 3 C.A 0,2 33,7 Continua página 39…
39
C.A = com agitação S.A = sem agitação
3.10. TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA
3.10.1. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de difusão em placa
utilizando discos de papel (BAUER et al., 1966)
Para a realização do teste de atividade antimicrobiana foram utilizadas as
bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes, as
bactérias Gram-negativas Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa, e a
levedura Candida albicans. Discos de papel contendo 30 µg de cloranfenicol foram
utilizados como controle positivo para as bactérias e discos contendo 50 µg de
miconazol para o fungo; como controle negativo foram utilizados discos de papel
contendo o solvente usado na dissolução das amostras.
CONSIDERAÇÕES:
I. Foram utilizadas placas de Petri previamente esterilizadas;
II. O teste foi realizado em duplicata;
III. Os halos de inibição formados foram mensurados utilizando-se um
paquímetro digital;
… continuação Tabela 3
18 4 C.A 0,2 17,0
19 5 C.A 0,2 23,1
20 6 C.A 0,2 20,3
21 7 C.A 0,2 48,4
22 8 C.A 0,2 6,0
23 9 C.A 0,2 15,2
24 10 C.A 0,2 5,7
25 11 C.A 0,2 13,2
26 12 C.A 0,2 14,6
27 13 C.A 0,2 6,0
28 14 C.A 0,2 7,7
40
IV. Os extratos e as substâncias testadas foram consideradas ativas
quando o halo de inibição apresentou valor igual ou maior que 7,5 mm.
Preparo das amostras: uma quantidade de 2,0 mg de cada amostra foi
pesada e solubilizada em 1,0 mL de clorofórmio, e 50,0 µL de cada solução
foi quantitativamente aplicada em um disco de papel resultando em uma
concentração final de 100,0 µg/disco. O solvente foi removido por ar seco.
Todo o procedimento de obtenção do pré-inóculo e inóculo do fungo e da
bactéria foi realizado em cabine de segurança biológica sob condições assépticas,
próximo à chama do bico de Bunsen. Os materiais e reagentes utilizados foram
previamente autoclavados a 121 ºC durante 20 min.
Preparo do pré-inóculo bacteriano: as bactérias estocadas em tubos de
ensaio foram raspadas com o auxílio de uma alça de platina e inoculadas
em tubos de ensaios pequenos contendo 3,0 mL de meio de cultura BHI. Em
seguida, os tubos foram incubados em estufa a 37 ºC durante 8-18 h.
Preparo do inóculo bacteriano: com o auxílio de uma micropipeta, 500 µL do
pré-inóculo bacteriano foram transferidos para tubos de ensaio contendo 4,5
mL de água destilada estéril. Os tubos foram homogeneizados e a
concentração ajustada comparando-se com o tubo 0,5 da escala de
McFarland de turbidez padrão (108 UFC/mL).
Com o auxílio de uma micropipeta, foram transferidos 500 µL do inóculo
bacteriano padronizado para tubos de ensaio contendo 7,5 mL de meio de cultura
antibiótico. Em seguida, os tubos foram agitados no vórtex e o meio de cultura
transferido para placas de Petri previamente esterilizadas. Após a solidificação do
meio semi-sólido, foram colocados, com auxílio de uma pinça estéril, os discos de
papel contendo as amostras, sendo que em cada placa foram colocados cinco
discos, o controle positivo e o negativo. As placas de Petri foram incubadas em
estufa a 37 ºC. Após 24 h foi realizada a primeira leitura do teste medindo-se o
41
diâmetro dos halos de inibição e, após 48 h, foi realizada uma nova leitura para a
determinação de cepas resistentes.
3.10.2. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de microdiluição em caldo
Para a realização do ensaio da atividade antibacteriana foram utilizadas as
bactérias Gram-positivas S. aureus e L. monocytogenes, as bactérias Gram-
negativas E. coli e P. aeruginosa, e a levedura C. albicans.
Todo o procedimento de obtenção do pré-inóculo e inóculo do fungo e da
bactéria foi realizado em cabine de segurança biológica sob condições assépticas,
próximo à chama do bico de Bunsen. Os materiais e reagentes utilizados foram
previamente autoclavados a 121 ºC durante 20 min.
CONSIDERAÇÕES:
I. Foram utilizadas microplacas de 96 poços (12 colunas e 8 linhas);
II. Foram realizados controles;
III. O teste foi realizado em quintuplicata;
IV. Os extratos brutos foram testados em uma concentração fixa de
1000 μg/mL e as substâncias isoladas em uma concentração de 250 μg/mL;
V. Os resultados do teste foram mensurados por Leitor de microplacas
Thermo Plate.
Preparo das amostras: as amostras foram pesadas e solubilizadas
em DMSO, resultando em uma concentração de 50 mg/mL e 12,5 mg/mL,
para os extratos brutos e substâncias isoladas, respectivamente.
Preparo do pré-inóculo bacteriano: as bactérias estocadas em tubos de
ensaio foram raspadas com o auxílio de uma alça de platina e inoculadas
em tubos de ensaios pequenos contendo 3,0 mL de meio de cultura BHI. Em
seguida, os tubos foram incubados em estufa a 37 ºC durante 8-18 h.
42
Preparo do inóculo bacteriano: com o auxílio de uma micropipeta, 500 µL do
pré-inóculo bacteriano foram transferidos para tubos de ensaio contendo 4,5
mL de água destilada estéril. Os tubos foram homogeneizados e a
concentração ajustada comparando-se com o tubo 0,5 da escala de
McFarland de turbidez padrão (108 UFC/mL). Após, 500 µL do inóculo
preparado foram adicionados a 4,5 mL de meio de cultura BHI, obtendo-se
assim, os inóculos bacterianos utilizados no teste.
PROCEDIMENTOS:
Placa teste:
I. Em cada placa teste foram testados 12 extratos, ou seja, um em cada
coluna, utilizando-se, assim, três placas para teste com cada micro-
organismo.
Figura 4. Esquema de uma microplaca usada no ensaio antibacteriano e
antifúngico com as amostras em uma concentração fixa.
II. Em cada poço foram adicionados 100 µL da solução de trabalho (40 µL
de solução do extrato + 960 µL de meio de cultura BHI) e 100 µL de
inóculo do micro-organismo testado.
quintuplicata
43
Placa de controle de crescimento do micro-organismo:
I. Adicionaram-se, a cada poço da placa de controle de crescimento do
micro-organismo, 100 µL de inóculo do micro-organismo em teste e 100
µL de meio de cultura BHI.
Placa do branco:
I. Adicionaram-se, a cada poço das placas do branco, 100 µL da solução
de trabalho (40 µL da solução do extrato + 960 µL de meio de cultura
BHI) e 100 µL de água destilada estéril.
Placa de controle de esterilidade do meio de cultura BHI:
I. Adicionaram-se a cada poço da placa de controle de esterilidade do meio
de cultura, 100 µL de meio de cultura BHI e 100 µL de água destilada
estéril.
As microplacas foram incubadas em estufa a 37 ºC e após 24 h foi realizada
a primeira leitura do teste em leitor de microplacas. Após 48 h foi realizada uma
nova leitura, finalizando o teste. As leituras foram realizadas em comprimento de
onda fixo de 492 nm.
3.10.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia
em camada delgada (CCD) – Método de Ellmann
O ensaio para a avaliação qualitativa da atividade anticolinesterásica foi
realizado seguindo-se a metodologia de Ellmann (1961), adaptada por Rhee et al.
(2001), para cromatografia em camada delgada, utilizando-se placas
cromatográficas de sílica gel.
Procedimentos:
I. Aplicaram-se, na placa cromatográfica, 5 µL de amostra (extratos brutos
dissolvidos em MeOH) e do padrão na concentração de 10 mg/mL;
II. A placa foi eluída com solvente apropriado;
44
III. Após a secagem, à temperatura ambiente, borrifou-se a placa com
solução 1:1 de ácido 5,5‘-ditiobis-[2- nitrobenzóico] (DTNB) (1mM) e
iodeto de acetilcolina (ACTI) (1mM);
IV. Após a secagem por 5 min, à temperatura ambiente, a placa foi borrifada
com a enzima (3U/mL) em tampão Tris/HCl (50mM) pH 8 contendo 0,1%
p/v de albumina sérica bovina;
V. A observação da presença de halos brancos, após 10 min, em meio ao
fundo amarelo, na placa, indicou a inibição da enzima acetilcolinesterase.
Observação: O padrão utilizado foi uma solução de cafeína.
3.10.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca –
Método de Ellmann
O ensaio para a avaliação quantitativa da atividade anticolinesterásica foi
realizado seguindo-se a metodologia de Ellmann (1961) para microplacas, fazendo-
se a leitura utilizando-se uma microplaca, absorbância a 406 nm.
Esse teste foi realizado para os extratos que apresentaram resultados
positivos no ensaio qualitativo de inibição da enzima AchE e para as substâncias
isoladas. Foi realizado em quintuplicata e, utilizando-se como padrão positivo de
inibição da enzima AchE, uma solução de eserina na concentração de 10 mg/mL e
como controle negativo o solvente utilizado para solubilizar as amostras.
Procedimentos:
I. Preparo da solução de trabalho:
a. Foram solubilizados 10 mg de amostra em 1 mL de DMSO,
resultando em solução de concentração de 10 mg/mL;
b. Retiraram-se 25 µL dessa solução, que após, foi diluída em 225 µL de
solução tampão Tris/HCl (50 mM), obtendo-se, assim, a solução de
trabalho ;
45
II. Adicionaram-se 25 µL da solução de trabalho aos poços da placa de
Elisa;
III. Adicionaram-se ao mesmo poço:
a. 25 µL da solução de ACTI;
b. 125 µL da solução de DTNB;
c. 50 µL de Tris/HCl (50mM) pH 8,0 com albumina sérica bovina
0,1% (p/v);
IV. Mediu-se a absorbância a 406 nm a cada 1 minuto por 8 vezes;
V. Adicionaram-se 25 µL da solução de AchE (0,222 U/mL) em Tris/HCl pH
8,0 (contendo albumina sérica bovina 0,1% p/v) aos poços da microplaca;
VI. Mediu-se novamente a absorbância a 406 nm a cada 1 minuto por 10
vezes.
3.11. FRACIONAMENTO DOS EXTRATOS DO FUNGO P. lilacinus
Após a etapa de triagem dos testes biológicos, utilizando-se os extratos do
fungo P. lilacinus, os extratos obtidos de acordo com as condições 5 e 8 de
inoculação (Tabela 2, página 37) e sob condição estática (5 SA e 8 SA), foram
novamente preparados, em escala ampliada, para as etapas posteriores.
3.11.1. Fracionamento do extrato 5 S.A
O extrato do fungo P. lilacinus obtido de acordo com a condição 5 de
inoculação (Tabela 2, página 37) e sob condição estática (5 S.A) foi preparado em
escala ampliada, produzindo um rendimento de 1,098 g. Este foi, então, fracionado
empregando-se técnicas cromatográficas. Inicialmente, o extrato foi solubilizado em
clorofórmio e, logo, incorporou-se uma quantidade de sílica que ocupasse
aproximadamente o mesmo volume de extrato utilizado. Após a evaporação do
46
solvente, realizada em rotavapor, a sílica incorporada ao extrato foi adicionada
lentamente ao topo da coluna, para que pudesse ser iniciado o fracionamento
desse material em cromatografia em coluna de sílica, utilizando-se eluentes de
polaridade crescente, na seguinte ordem, hexano, acetato de etila e metanol.
Foram coletadas 138 frações de 100 mL que foram combinadas em 32 grupos
após a obtenção do perfil cromatográfico em cromatografia em camada delgada e
revelação em vapor de iodo. As frações, eluentes e massas estão apresentadas na
Tabela 4.
Tabela 4. Dados do fracionamento do extrato 5 S.A (1,098 g) do fungo P. lilacinus por cromatografia em coluna de sílica gel
Código Frações Eluente Massa (mg)
P01 1 – 4 Hexano 100% 17,0
P02 5 Hexano/AcOEt 85:15 13,0
P03 6 – 8 Hexano/AcOEt 85:15 15,0
P04 9 – 10 Hexano/AcOEt 85:15 13,0
P05 11 – 18 Hexano/AcOEt 85:15 26,0
P06 19 – 21 Hexano/AcOEt 70:30 15,0
P07 22 – 25 Hexano/AcOEt 70:30 22,0
P08 26 – 30 Hexano/AcOEt 70:30 61,0
P09 31 – 33 Hexano/AcOEt 70:30 14,0
P10 34 – 38 Hexano/AcOEt 55:45 42,0
P11 39 – 41 Hexano/AcOEt 55:45 31,0
P12 42 – 44 Hexano/AcOEt 55:45 250,0
P13 45 Hexano/AcOEt 55:45 13,0
P14 46 – 63 Hexano/AcOEt 40:60 93,0
P15 64 – 67 AcOEt 100% 16,0
P16 68 AcOEt 100% 19,0
P17 69 – 78 AcOEt 100% 49,0
P18 79 – 80 AcOEt/MeOH 95:05 69,0
P19 81 – 82 AcOEt/MeOH 95:05 52,0
P20 83 – 86 AcOEt/MeOH 95:05 18,0
Continua página 47...
47
... continuação Tabela 4
P21 87 AcOEt/MeOH 95:05 10,0
P22 88 – 90 AcOEt/MeOH 95:05 9,0
P23 91 – 93 AcOEt/MeOH 95:05 16,0
P24 94 – 99 AcOEt/MeOH 80:20 42,0
P25 100 – 105 AcOEt/MeOH 80:20 23,0
P26 106 – 109 AcOEt/MeOH 80:20 17,0
P27 110 – 112 AcOEt/MeOH 50:50 30,0
P28 113 – 118 AcOEt/MeOH 50:50 44,0
P29 119 – 123 AcOEt/MeOH 50:50 23,0
P30 124 – 125 MeOH 100% 7,0
P31 126 – 127 MeOH 100% 6,0
P32 128 – 138 MeOH 100% 15,0
Amostras contendo 10 mg das frações P01, P02, P03, P04, P05 e P06 foram
enviadas ao Laboratório de Cromatografia Gasosa do Departamento de Química
da Universidade Federal de Minas Gerais, para análise.
As frações P12 (250,0 mg) e P13 (13,0 mg) foram caracterizadas como
sólidos amarelos, e quando analisada por CCD e revelada com vapor de iodo, a
fração P13 produziu uma mancha única na cromatoplaca. Após, ambas as frações
foram enviadas para a obtenção dos espectros de RMN de 1H, de 13C e DEPT.
As frações P14 (93,0 mg) e P18 (69,0 mg) tiveram um rendimento superior
comparado às outras frações, sendo, então, enviadas para a obtenção dos
espectros de RMN.
A fração P19 (52,0 mg) foi fracionada por CCS usando-se sílica para
cromatografia em coluna ―flash‖. Utilizou-se uma mistura de hexano/isopropanol em
polaridade crescente. Foram coletadas 55 frações de 13 mL que, após obtenção do
perfil cromatográfico em CCD e revelação em vapor de iodo, foram agrupadas em
7 subgrupos. A CCD da fração AC-05 indicou tratar-se de substância pura após
revelação com vapor de iodo, e então, foi enviada para a obtenção dos espectros
de RMN. Os dados da coluna cromatográfica da fração P19 estão apresentados na
Tabela 5.
48
Tabela 5. Dados do fracionamento da fração P19 (52,0 mg) por cromatografia em coluna de sílica ―flash‖
Código Frações Eluente Massa (mg)
AC-01 1 – 2 Hexano/iPrOH 90:10 2,0
AC-02 3 – 4 Hexano/iPrOH 90:10 3,0
AC-03 5 – 20 Hexano/iPrOH 90:10 8,0
AC-04 21 – 29 Hexano/iPrOH 50:50 5,0
AC-05 30 – 40 Hexano/iPrOH 50:50 19,0
AC-06 41 – 45 Hexano/iPrOH 50:50 1,0
AC-07 46 – 55 iPrOH 100% 2,0
3.11.2. Fracionamento do extrato 8 S.A
O extrato do fungo P. lilacinus obtido de acordo com a condição 8 de
inoculação (Tabela 2, página 37) e sob condição estática (8 S.A) foi preparado em
escala ampliada, com um rendimento de 1,5 g.
Anteriormente ao processo de fracionamento foi realizada uma extração
utilizando-se aproximadamente 20 mL de hexano, com o objetivo de extrair parte
da porção oleosa presente na amostra, para ser analisada por cromatografia a gás.
Após, a fração resultante (1,26 g) foi, então, fracionada empregando-se técnicas
cromatográficas. Inicialmente, o extrato foi solubilizado em clorofórmio e, logo,
incorporou-se uma quantidade de sílica que ocupasse aproximadamente o mesmo
volume de extrato utilizado. Após a evaporação do solvente, realizada em
rotavapor, a sílica incorporada ao extrato foi adicionada lentamente ao topo da
coluna, para que pudesse ser iniciado o fracionamento desse material em
cromatografia em coluna de sílica. Utilizaram-se eluentes em polaridade crescente,
na seguinte ordem, hexano, acetato de etila e metanol. Foram coletadas 172
frações de 100 mL que foram combinadas em 24 grupos após a obtenção do perfil
cromatográfico em cromatografia em camada delgada e revelação em vapor de
iodo. As frações, eluentes e massas estão apresentadas na Tabela 6.
49
Tabela 6. Dados do fracionamento do extrato 8 S.A (1,26 g) do fungo P. lilacinus por cromatografia em coluna de sílica gel
Código Frações Eluente Massa (mg)
C01 3 – 6 Hexano 100% 9,0
C02 7 – 10 Hexano/AcOEt 90:10 27,0
C03 11 – 18 Hexano/AcOEt 90:10 16,0
C04 19 – 26 Hexano/AcOEt 80:20 45,0
C05 27 – 30 Hexano/AcOEt 80:20 8,0
C06 31 – 38 Hexano/AcOEt 65:35 76,0
C07 39 – 43 Hexano/AcOEt 65:35 35,0
C08 44 – 49 Hexano/AcOEt 50:50 27,0
C09 50 – 60 Hexano/AcOEt 50:50 27,0
C10 61 – 64 Hexano/AcOEt 35:65 8,0
C11 65 – 72 Hexano/AcOEt 35:65 17,0
C12 73 – 75 Hexano/AcOEt 35:65 5,0
C13 76 – 82 AcOEt 100% 20,0
C14 83 – 91 AcOEt 100% 20,0
C15 92 – 96 AcOEt/MeOH 95:05 57,0
C16 97 - 103 AcOEt/MeOH 95:05 31,0
C17 104 – 105 AcOEt/MeOH 85:15 13,0
C18 106 – 118 AcOEt/MeOH 85:15 73,0
C19 119 – 133 AcOEt/MeOH 70:30 90,0
C20 134 – 147 AcOEt/MeOH 50:50 121,0
C21 148 – 154 AcOEt/MeOH 25:75 42,0
C22 155 – 160 AcOEt/MeOH 25:75 17,0
C23 161 – 166 MeOH 100% 33,0
C24 167 – 172 MeOH 100% 6,0
Amostras contendo 10 mg das frações C01, C02, C03, C04 e C05 foram
enviadas ao laboratório de Cromatografia Gasosa do Departamento de Química da
Universidade Federal de Minas Gerais, para análise.
A fração C09 (27,0 mg) foi caracterizada como um pó fino amarelo, e com
ponto de fusão na faixa entre 92-97 °C e quando analisada por CCD e revelada
50
com vapor de iodo, produziu uma mancha única na cromatoplaca, sendo então
enviada para a obtenção dos espectros de RMN de 1H, de 13C e DEPT.
A fração C16 apresentou duas manchas bem distintas quando analisadas
por CCD e revelada com vapor de iodo e luz UV. Sendo assim, fez-se
cromatografia de camada delgada preparativa utilizando-se alumina, como fase
estacionária, e sistema de fase móvel constituído por AcOEt/Hexano 9:1 (100 mL).
A amostra foi solubilizada em CHCl3/MeOH e aplicada na parte inferior da placa. A
mancha de interesse foi raspada da placa e extraída com CHCl3/MeOH e, após
filtração à vácuo, fez-se concentração do material purificado (C16-P), obtendo-se
um rendimento de 3,0 mg. A substância C16-P apresentou um Rf de 0,7 e mostrou-
se positiva frente a revelação com Reagente de Dragendorff.
No entanto, infelizmente, devido à falta de dados espectroscópicos
suficientes, as substâncias C09 e C16-P não puderam ser identificadas.
51
Capítulo 4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
52
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES DE CULTIVO DE P.
lilacinus NA PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS, VIA PERFIS
CROMATOGRÁFICOS (CLAE-PDA)
A análise dos extratos do fungo P. lilacinus, cultivado em diferentes
condições, pela técnica de OSMAC, foi realizada por CLAE-PDA. Estas análises
foram realizadas com o objetivo de investigar se as diferentes condições de cultivo
de P. lilacinus interferiram nos perfis químicos dos extratos brutos obtidos. Dessa
forma, não foram utilizados padrões internos ou externos, visto que, o objetivo não
foi identificar substâncias indiretamente.
Os cromatogramas foram obtidos na faixa entre 190 e 600 nm, no entanto,
226 nm foi o comprimento de onda escolhido para a apresentação dos
cromatogramas, pois é conhecido que a maioria dos metabólitos secundários
naturais podem ser analisados próximos a região de 210-215 nm (FURTADO et al.,
2005). A variedade de metabólitos produzidos foi associada ao número de picos
detectados nos cromatogramas, visto que, diferentes compostos apresentam
diferentes índices de retenção (RI).
P. lilacinus foi cultivado em meio de cultura líquido caldo batata dextrose,
variando-se, aeração do meio (cultivo sob agitação e sem agitação), co-adição de
material genético bacteriano ao meio, quantidade de inóculo bacteriano (1 ou 10
mL), condição do inóculo (bactéria viva, exposta à autoclave e exposta à irradiação
de micro-ondas) e diferentes tempos de inoculação pois, diferentes condições de
crescimento podem influenciar drasticamente o perfil dos metabólitos produzidos
por fungos e bactérias (SCHERLACH, HERTWECK, 2006).
Os cromatogramas dos extratos de P. lilacinus mostraram-se com um nível
de complexidade relevante, devido ao fato de serem extratos brutos, podendo
conter moléculas de classes variadas. Algumas substâncias parecem ter sido
produzidas em praticamente todas as condições de cultivo, pois alguns extratos
apresentaram cromatogramas com picos com o mesmo tempo de retenção, como
por exemplo, a substância que mostrou tempo de retenção de aproximadamente
22,5 min. No entanto, variação na produção de metabólitos foi observada ao se
53
analisar os cromatogramas. A produção de metabólitos secundários por P. lilacinus
foi influenciada qualitativa e quantitativamente pela aeração do meio, cultivo sob
agitação e sem agitação, em praticamente todas as condições comparadas, como
é mostrado nas Figuras 5 a 10. Nestas, as setas apontam picos referentes a
substâncias diferentes, enquanto elipses indicam a presença de picos referentes a
substâncias comuns nos cromatogramas dos diferentes extratos.
1S.A 226 nm
Figura 5. Cromatograma do extrato 1S.A (sem agitação) 1C.A 226 nm
Figura 6. Cromatograma do extrato 1C.A (com agitação)
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
54
3 S.A 226 nm
Figura 7. Cromatograma do extrato 3 S.A (sem agitação) 3 C.A 226 nm
Figura 8. Cromatograma do extrato 3 C.A (com agitação)
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
55
5 S.A 226nm
Figura 9. Cromatograma do extrato 5 S.A (sem agitação)
5 C.A 226 nm
Figura 10. Cromatograma do extrato 5 C.A (com agitação)
A substância que apresentou tempo de retenção de aproximadamente 14,0
min é um bom exemplo, pois os picos referentes a ela são notáveis nos
cromatogramas dos extratos obtidos sem agitação (Figuras 5, 7 e 9), enquanto,
nos obtidos sob agitação não foi detectado o mesmo pico (Figuras 6 e 8), com
exceção do extrato 5 C.A. Isto pode ser atribuído ao fato de que a oxigenação do
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
56
meio altera a velocidade de crescimento dos fungos e, conseqüentemente, a
produção de metabólitos.
No que se refere à co-adição de material genético bacteriano ao meio, os
perfis cromatográficos também se mostraram diferentes, sendo assim, a presença
da bactéria pode ter induzido a produção de determinadas substâncias. O
cromatograma do extrato 3 S.A, apresentado na Figura 7, foi obtido de um meio,
nos quais foram cultivados o fungo P. lilacinus e a bactéria S. tiphymurium
concomitantemente, enquanto, o cromatograma do extrato 1 S.A, apresentado na
Figura 5, foi obtido do cultivo individual do fungo. Nestes, notou-se diferença das
substâncias produzidas, pois foram observados picos em diferentes tempos de
retenção em ambos cromatogramas, indicando diferentes moléculas nos extratos.
Diferentes perfis cromatográficos também foram encontrados quando a bactéria foi
cultivada separadamente (condição 9), em relação ao cultivo de P. lilacinus e a
bactéria S. tiphymurium concomitantemente (condição 3) (Figuras 7 e 11).
9 S.A 226 nm
Figura 11. Cromatograma do extrato 9 S.A (sem agitação)
Dado que os antibióticos podem ser produzidos na natureza para fornecer
vantagem competitiva para determinado micro-organismo, é possível que as vias
responsáveis pela biossíntese de certos compostos sejam reguladas por fatores
provocados por outros micro-organismos, sendo assim, a produção de antibióticos
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
57
pode ser induzida em resposta a um antagonismo microbiano (CUETO et al.,
2001).
Quanto ao parâmetro quantidade de inóculo bacteriano adicionado ao meio,
os perfis cromatográficos apresentaram-se muito semelhantes, mostrando que a
quantidade de inóculo adicionado [1 mL (condição 8) e 10 mL (condição 10)] não
interferiu significativamente na produção de metabólitos (Figuras 12 e 13).
8 C.A 226 nm
Figura 12. Cromatograma do extrato 8 C.A (com agitação) 10 C.A 226 nm
Figura 13. Cromatograma do extrato 10 C.A (com agitação)
Em relação às diferentes condições da bactéria inoculada (viva, exposta à
autoclave e exposta à irradiação de micro-ondas), os perfis químicos obtidos,
quando comparados, mostraram a seguinte informação: os extratos obtidos a partir
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
58
da adição de bactéria exposta à autoclave ou ao à irradiação de micro-ondas, ao
meio, mostraram-se muito semelhantes (Figuras 14 e 15); por outro lado, os
extratos obtidos a partir de cultivo com bactéria viva, mostraram perfis químicos
com menor semelhança quantitativa das substâncias em relação aos outros dois
(Figura 12). Sendo assim, a presença do material genético bacteriano no meio,
mesmo após sofrer danos físicos, foi capaz de induzir a produção de substâncias
pelo fungo.
12 S.A 226 nm
Figura 14. Cromatograma do extrato 12 S.A (sem agitação)
13 S.A 226 nm
Figura 15. Cromatograma do extrato 13 S.A (sem agitação)
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
59
10 S.A
226 nm
Figura 16. Cromatograma do extrato 10 S.A (sem agitação)
Os diferentes perfis obtidos apontam que a técnica OSMAC foi efetiva para
gerar diversidade da produção de metabólitos por um mesmo micro-organismo.
4.2. CROMATOGRAFIA A GÁS (CG)
Ao longo do desenvolvimento do trabalho foi observado que as frações
obtidas a partir do fracionamento dos extratos do fungo P. lilacinus possuíam
significante concentração de acilgliceróis e ácidos graxos, logo este fungo mostrou
boa capacidade em sintetizar os mesmos. Portanto, as frações menos polares
(eluídas com hexano) das colunas dos extratos 5 S.A e 8 S.A foram analisadas por
CG. As frações P01, P02, P03, P04, P05 e P06 obtidas do fracionamento do
extrato 5 S.A, a fração resultante da extração com hexano (FH) do extrato 8 S.A, e
as frações C01, C02, C03, C04 e C05 obtidas do fracionamento do extrato 8 S.A,
foram enviadas para obtenção do perfil de ácidos graxos das mesmas. Antes da
análise, realizou-se uma reação de derivatização (produção dos ésteres metílicos
dos ácidos graxos presentes nos acilgliceróis- procedimento descrito em 3.5.1) dos
acilgliceróis e ácidos graxos livres das amostras.
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00
60
Os espectros de RMN de 1H, de 13 C e DEPT das frações P12 (anexos 1.1,
1.2 e 1.3, páginas 114, 115 e 116), P13 (anexos 2.1, 2.2 e 2.3, páginas 117, 118
e 119) e P14 (anexos 3.1, 3.2 e 3.3, páginas 120, 121 e 122) apresentaram sinais
característicos de ácidos graxos livres. No espectro de RMN de 1H foram
observados sinais entre δ 1,27-1,31 ppm, atribuíveis aos átomos de hidrogênio de
grupos metilênicos e entre δ 0,8-0,9 ppm, atribuíveis aos átomos de hidrogênio
metílicos. Nos espectros de RMN de 13C foram observados, entre δ 173,4-176,3
ppm, os sinais correspondentes à carbono de carbonilas, na região entre δ 22,9-
32,14 ppm, os sinais dos átomos de carbono metilênicos e, em δ 14,3 ppm, sinal
característico de grupos metila terminais.
Ácidos graxos são ácidos carboxílicos com cadeia carbônica variando entre
12 e 36 átomos de carbono, sendo que esta cadeia pode ser ramificada e
totalmente saturada ou pode conter insaturações, com uma ou mais ligações
duplas. Em micro-organismos, estes ácidos graxos costumam estar dispostos
quimicamente ligados à membrana celular (FILHO, 2010).
O estudo do perfil de ácidos graxos livres ou presentes nos glicerídios tem
ampla utilização, como, por exemplo, a literatura apresenta métodos de
classificação e diferenciação de micro-organismos de acordo com a presença ou
ausência de determinados ácidos graxos em sua composição (STAHL, 1996). Além
da aplicação como marcadores quimiotaxonômicos, diferenciando espécies
distintas de fungos, ácidos graxos de micro-organismos podem ser aplicados como
matrizes novas e promissoras em processos que envolvem a produção de
biocombustíveis (VICENTE, 2009).
A cromatografia a gás é uma técnica muito importante na análise de
compostos facilmente volatilizáveis e termicamente estáveis. Esta técnica possui
ampla aplicabilidade, sensibilidade, rapidez nas análises, boa precisão quantitativa
e um alto poder de resolução (FILHO, 2010). A partir da utilização de padrões de
ácidos graxos metilados, como o SUPELCO 37, utilizado neste trabalho, os picos
das substâncias podem ser comparados e identificados.
A análise dos cromatogramas obtidos em comparação com o cromatograma
de ésteres de ácidos graxos revelou que as frações P01, P02, P03, P04, P05, P06,
a fração FH e as frações C01, C02, C03, C04 e C05 eram compostas por uma
mistura de ácidos graxos, formados principalmente pelos ácidos palmítico (C16:0)
61
(1), esteárico (C18:0) (2), oléico (C18:1 ∆9 cis) (3), linoléico (C18:2
∆9,12 cis) (4) e linolênico
(C18:3), este último apresenta-se como uma mistura de isômeros, o isômero alfa-
linolênico (C18:3 ∆9,12,15 cis) (ALA) (5) e o isômero gama-linolênico (C18:3
∆6,9,12 cis)
(GLA) (6) (Figuras 17 a 28 e Tabela 7).
HO
O
1
HO
O
2
HO
O
3
HO
O
4
HO
O
5
HO
O
6
62
Figura 17. Cromatograma da fração P01 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
Figura 18. Cromatograma da fração P02 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
63
Figura 19. Cromatograma da fração P03 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
Figura 20. Cromatograma da fração P04 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
64
Figura 21. Cromatograma da fração P05 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
Figura 22. Cromatograma da fração P06 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
65
Figura 23. Cromatograma da fração FH obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
Figura 24. Cromatograma da fração C01 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
66
Figura 25. Cromatograma da fração C02 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
Figura 26. Cromatograma da fração C03 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
67
Figura 27. Cromatograma da fração C04 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
Figura 28. Cromatograma da fração C05 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
68
Tabela 7- Composição de ácidos graxos nas frações analisadas
Frações
% de ácido graxo na fração
Palmítico
(C16:0)
Esteárico
(C18:0)
Oléico
(C18:1∆9 cis)
Linoléico
(C18:2∆9,12 cis)
Linolênico
(C18:3)
Outros
P01 18,99 14,08 N.D. N.D. N.D. 66,93
P02 31,29 8,63 17,54 18,45 0,71 23,38
P03 38,2 9,43 4,9 5,94 10,64 30,84
P04 40,97 5,17 4,83 7,37 0,91 40,71
P05 22,49 8,95 8,16 5,52 N.D. 54,88
P06 23,14 8,39 7,44 N.D. 1,71 59,32
FH 24,12 2,63 10,81 50,82 0,94 10,68
C01 25,51 8,21 6,4 4,05 N.D. 55,83
C02 20,17 4,65 11,28 29,21 N.D. 34,69
C03 32,31 6,34 13,99 14,45 N.D. 32,91
C04 34,0 3,54 12,31 37,49 0,46 12,2
C05 10,12 2,66 4,42 65,37 3,71 13,72
N.D.= não detectado
Através dos cromatogramas, foi observado que as frações P12, P13 e P14
(Figuras 29-31 e Tabela 8) possuem constituições muito semelhantes às amostras
anteriores. No entanto, foi detectado um pico bastante significativo no tempo de
retenção de aproximadamente 1 min, compondo entre 40 a 70% das amostras,
porém este não apresentou correlação com nenhum ácido graxo presente no
padrão utilizado, não sendo, então, identificado.
69
Figura 29. Cromatograma da fração P12 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
Figura 30. Cromatograma da fração P13 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
70
Figura 31. Cromatograma da fração P14 obtido por CG em comparação com
padrões de ésteres de ácidos graxos
Tabela 8 - Composição de ácidos graxos nas frações P12, P13 e P14
Frações
% de ácido graxo na fração
Pico não
identificado
Palmítico
(C16:0)
Esteárico
(C18:0)
Oléico
(C18:1∆9 cis)
Linoléico
(C18:2∆9,12 cis)
Linolênico
(C18:3)
P12 60,15 9,78 8,04 0,85 0,74 0,65
P13 71,83 3,72 5,53 0,89 0,74 1,21
P14 42,16 12,99 11,63 7,68 2,3 0,53
Os acilgliceróis constituem-se a mais importante forma de armazenamento
de energia e ácidos graxos em células eucarióticas, correspondendo à classe de
lipídios mais comumente isolada de fungos (SORGER, DAUM, 2002). Vários micro-
organismos oleaginosos, tais como leveduras, fungos, bactérias e microalgas
podem acumular alto nível de lipídios em sua biomassa. Dentre estes, fungos e
leveduras têm sido considerados fontes potenciais e economicamente viáveis para
a produção de compostos lipídicos, visto que têm grandes rendimentos e um
71
potencial enorme de custo/eficiência da produção desses compostos. Várias
moléculas de lipídios sintetizadas por fungos têm recebido grande atenção na
produção de óleos e gorduras como uma alternativa das fontes agrícolas e animais,
na biotecnologia como fatores especiais na dieta ou como agentes farmacológicos,
como é o caso dos ácidos graxos insaturados γ-linolênico (AGL) e araquidônico
(AA). O primeiro é de interesse farmacológico, pois é precursor das
prostaglandinas da série PGE1 e é o principal componente em preparações
farmacêuticas que apresentam efeitos benéficos nos tratamentos de eczema
atópico, doenças cardiovasculares, diabetes, síndrome pré-menstrual, câncer
dentre outras condições (WAINWRIGHT, 1992; SANCHOLLE; LÖSEL, 1995;
WELLBAUM, 2006).
Os ácidos graxos insaturados majoritários, detectados nos extratos de P.
lilacinus, são os conhecidos ômegas 3 (ácido alfa-linolênico), 6 (ácido linoléico) e 9
(ácido oléico) que podem auxiliar na redução dos níveis plasmáticos de
triglicerídeos e colesterol LDL, sendo também capazes de favorecer o aumento do
HDL. Possuem ainda, importante papel em alergias e processos inflamatórios, pois
são necessários para a formação das prostaglandinas inflamatórias, tromboxanos e
leucotrienos, como citado anteriormente (GARÓFOLO, PETRILLI, 2006).
Em pesquisa realizada por PARK e colaboradores (2004), foram isolados,
majoritariamente, de culturas de P. lilacinus, cultivo em caldo batata dextrose por 7
dias, os ácido oléico (C18:1 ∆9), linoléico (C18:2
∆9,12 ) e linolênico (C18:3), corroborando
com este trabalho.
72
4.3. CARACTERIZAÇÃO DE P18
COOH
N O
H
OH1
2
4
35
6
12
10
9
7
11
8
A fração P18 não foi isolada como uma substância totalmente pura,
apresentando sinais de impurezas observados nos espectros de RMN de 1H, 13C e
sub-espectro DEPT-135. No entanto, os espectros apresentaram sinais bastante
representativos, o que permitiu uma proposta da estrutura da substância,
aparentemente, majoritária na fração. A fração apresentou-se como uma cera
amarela de característica oleosa.
No espectro de RMN de 1H (anexos 4.1 e 4.1.1, páginas 123 e 124) foram
observados vários sinais (multipletos) na região entre δ 1,0 ppm e δ 3,7 ppm
atribuíveis aos átomos de hidrogênio metilênicos. Na região entre δ 4,1 ppm e δ
4,6 ppm foram observados dois sinais de átomos de hidrogênio ligados a carbonos
terciários, de acordo com DEPT (anexo 4.3, página 126). Dois sinais presentes em
δ 7,2 ppm e δ 7,4 ppm foram caracterizados como sendo de átomos de hidrogênio
ligados a carbonos aromáticos. Foi observado, ainda, em δ 8,6 ppm, um sinal com
integração para um hidrogênio, atribuível a hidrogênio de grupo carboxílico.
No espectro de RMN de 13C (anexo 4.2, página 125) foram observados 12
sinais, sendo que quatro deles não apresentaram sinais no DEPT, permitindo
concluir que na molécula havia quatro átomos de carbono quaternários. Um sinal
de carbonila do grupo amida foi observado em δ 165,8 ppm, um sinal de carbonila
de grupo carboxílico em δ 169,8 e outros dois átomos de carbono quaternários
apresentaram sinais em δ 127,7 ppm e δ 157,8 ppm.
Dos oito átomos de carbono hidrogenados, quatro apresentaram sinais entre
δ 22,5 ppm e δ 45,3 ppm, sendo caracterizados como átomos de carbono
metilênicos. Sinais de quatro grupos metínicos foram observados em δ 57,0 ppm,
73
δ 59,4 ppm, δ 116,2 ppm e δ 131,3 ppm, estes dois últimos caracterizados como
átomos de carbono aromáticos.
A proposta da presença do átomo de nitrogênio foi feita com base no sinal
em δ 165,8 ppm, caracterizando um grupo amida na molécula (SILVERSTEIN,
1991), e ainda, com o resultado positivo frente à revelação com Reagente de
Dragendorff em CCD.
Na tentativa de elucidação estrutural das substâncias, os carbonos foram
numerados em ordem crescente de deslocamento químico e, através do mapa de
contornos HSQC (anexos 4.4 e 4.4.1, páginas 127 e 128), foram obtidas as
correlações entre carbonos e hidrogênios que participam da mesma ligação
química. A análise do espectro de 1H-1H COSY (anexo 4.5 e 4.5.1, páginas 129 e
130) permitiu correlacionar os hidrogênios acoplados e a análise do mapa de
contornos HMBC permitiu estabelecer a conectividade entre os carbonos da
molécula e os hidrogênios próximos. Os dados obtidos da numeração dos
carbonos e hidrogênios e as correlações estão apresentados na Tabela 9.
A análise dos dados da Tabela 9 (página 74) permitiu a montagem de dois
fragmentos da molécula, apresentados na Figura 32.
Figura 32. Fragmentos propostos para P18 estabelecidos com base nas
correlações 1H-1H COSY
COOH
H
H
H
H
H
H A
N
H
O
OH
B
Correlações 1H-
1H COSY
74
Tabela 9. Dados de RMN de 1H e de 13C, 1H-1H COSY e HMBC para a substância
P18
Nº Carbono Tipo δC (ppm) δH (ppm) COSY HMBC
1 CH2 22,5 H1a- 0,8
H1b- 1,6 H1a x C4
2 CH2 29,5 H2a- 1,9
H2b- 2,2
H2a x H2b
δ 2,2
H2a x C6,
C12
3 CH2 36,2 H3a- 3,3
H3b- 3,6
H3a x C5,
C8, C9
H3b x C9
4 CH2 45,3 H4a- 3,4
H4b- 3,7
H4a x H1b
δ 3,4
H4b x H1b
δ 3,65
H4b x C1
5 CH 57,0 4,6
H5 x H3a;
H5 x H3b
δ 4,6
6 CH 59,4 4,15 H6 x H2b
δ 4,2
H6 x C2,
C12
7 CH 116,2 7,15 H7 x C8,
C10,
8
C 127,7
9 CH 131,3 7,5 H9 x C3,
C10
10
C 157,8
11
C=O 165,8
12
COOH 169,8
75
O fragmento B corresponde a uma δ-lactama e apresenta correlação com o
fragmento A observada no mapa de contornos HMBC (anexos 4.6 e 4.6.1,
páginas 131 e 132). A análise do espectro de DEPT não mostrou a presença de
nenhum grupo metila, alem disso as poucas correlações observadas no mapa de
contornos 1H-1H COSY, levou à proposta de uma molécula bicíclica.
A conformação mais favorável de um cicloexano 1,2- dissubstituído seria
com os dois substituintes em posição equatorial. Esta proposta está de acordo com
as correlações visualizadas no mapa de contornos NOESY (anexos 4.7 e 4.7.1,
páginas 133 e 134), que mostrou as correlações entre H1b x H4a, H1b x H4b, H2b
X H6 e H3b x H5, conforme mostrado na Figura 33.
HH
H
H
H
H
H
H
H
COOH
H
R
6
21
43
5
R = NH
O
OH
Figura 33. Correlações espaciais para P18 baseadas no espectro de NOESY
Devido à possibilidade de rotação livre da ligação sigma C5-C10, podem
também ser observadas correlações no mapa de contornos NOESY entre H3a x
H9, H3b x H9 e H5 x H9, conforme Figuras 34 (A) E (B).
HH
H
H
H
H
H
H
H
H
3
5 NH
H
OHO
10
9
11
7
8
HH
H
H
H
H
H
H
H
H
5
NH
OH
OH
10
9 11
7
8
(A) (B)
Figura 34 (A) e (B). Correlações espaciais para P18 baseadas no espectro de
NOESY
76
No espectro de massas obtido da substância P18, de fórmula molecular
C12H15NO4, foi observado um pico em m/z 261,1284, atribuível à estrutura
proposta, com a possível integração de um íon Na+ à molécula, no momento do
desenvolvimento da técnica [238 + Na+] (Figura 35).
Figura 35. Espectro de massas (ESI +) da substância P18
A pesquisa por dados da literatura de estruturas semelhantes à proposta
levou à estrutura da ilicicolina H (70), um antibiótico com alta potência contra C.
albicans, isolado de micélio do fungo Cylindrocladium ilicicola (MATSUMOTO,
MAKOTO, 1979).
NH
HOOH
O
CO
CH3
HC CH
CH3
CH3
70
A produção quali e quantitativa de metabólitos secundários depende da
capacidade biossintética do micro-organismo e das condições de fermentação.
Assim, a manipulação dos parâmetros do processo fermentativo pode alterar a
expressão dos metabólitos secundários produzidos (TAKAHASHI, LUCAS, 2008),
sendo assim, pode haver alteração em alguma etapa da biossíntese de
determinados metabólitos, resultando em diferentes substâncias, ou concentração
destas.
207.1096 219.1128
240.1233261.1284
267.1139
283.1109
+MS, 0.2-0.5min #(14-30)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10
Intens.
160 180 200 220 240 260 280 m/z
77
4.4. TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA
4.4.1. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de difusão em placa
utilizando discos de papel (BAUER et al., 1966)
Os extratos obtidos, nas diferentes condições de cultivo, do fungo P. lilacinus
e as substâncias isoladas (P18 e C09) foram avaliadas no teste de atividade
antimicrobiana utilizando-se as bactérias Gram-positivas S. aureus e L.
monocytogenes, as bactérias Gram-negativas P. aeruginosa e E. coli, além da
levedura C. albicans. Foram realizadas leituras 24 h e 48 h após a incubação das
placas em estufa a 37 ºC. Não foi observada diferença estatística dos valores das
duas mensurações, em função disso, serão apresentados, neste trabalho, somente
os resultados da leitura realizada após 24 h após o início do teste. Os valores das
médias dos halos de inibição produzidos pelas amostras, após 24 h, estão
apresentados nas Tabelas 10, 11 e 12.
Tabela 10. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para
os extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição de agitação
Extrato
Halo de inibição de crescimento (mm)
S. aureus L. monocytegenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
1 0,00 0,00 0,00 0,00 17,66
2 C.E.M. C.E.M. C.E.M. C.E.M. C.E.M.
3 9,39 8,21 0,00 0,00 21,96
4 8,57 7,66 0,00 0,00 14,57
5 20,76 18,79 0,00 0,00 0,00
6 14,16 9,40 0,00 0,00 19,47
7 8,52 8,00 0,00 0,00 18,99
8 8,13 8,83 0,00 0,00 23,27
9 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
11 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
12 8,98 0,00 0,00 0,00 21,47
Continua página 78...
78
... continuação Tabela 10
13 7,75 0,00 0,00 0,00 13,11
14 0,00 0,00 0,00 0,00 11,54
Controle
negativo
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Controle
positivo
18,12 20,61 17,75 18,18 11,36
C.E.M. = Controle de esterilidade do meio de cultura
Dos treze extratos testados, oito apresentaram atividade contra a bactéria
Gram-positiva S. aureus e seis apresentaram atividade contra L. monocytogenes,
sendo que, todos os extratos ativos contra o último micro-organismo, também
foram ativos contra S. aureus. Portanto, dois extratos foram seletivamente ativos
contra S. aureus. Os extratos testados produziram halos de inibição significativos,
sendo que o extrato contendo o fungo P. lilacinus e a bactéria Salmonella
tiphymurium, ambos inoculados ao meio de cultura no mesmo dia (extrato 5),
apresentou a maior inibição das bactérias. visto que, no teste com S. aureus, o
valor médio dos halos de inibição produzidos pelo extrato (20,76 mm) foi maior do
que o valor médio dos halos apresentados pelo controle positivo (cloranfenicol,
18,12 mm). Não foram detectados halos de inibição para nenhuma das bactérias
Gram-negativas testadas. Nove extratos foram ativos contra C. albicans, sendo que
dois deles, mostraram atividade antifúngica. Praticamente todos os extratos ativos
contra C. albicans apresentaram halos de inibição maiores do que aquele
observado para o controle positivo utilizado (miconazol).
A presença do material genético bacteriano no meio de cultivo do fungo P.
lilacinus influenciou a atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do mesmo, sob
condição de agitação, pois o extrato 1, obtido do cultivo individual do fungo,
somente apresentou atividade contra a levedura, enquanto, a maioria dos outros
extratos obtidos do co-cultivo de P. lilacinus e S. tiphymurium foram ativos contra
as bactérias Gram-positivas testadas, além da levedura.
79
Tabela 11. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para
os extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição estática
Extrato
Halo de inibição de crescimento (mm)
S. aureus L. monocytegenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
2 C.E.M. C.E.M. C.E.M. C.E.M. C.E.M.
3 0,00 14,80 0,00 0,00 0,00
4 10,11 0,00 0,00 0,00 0,00
5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
6 0,00 10,87 0,00 0,00 0,00
7 9,11 0,00 0,00 0,00 0,00
8 8,34 0,00 0,00 0,00 0,00
9 0,00 9,48 0,00 0,00 10,76
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
11 0,00 12,50 0,00 0,00 0,00
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
13 0,00 10,44 0,00 0,00 11,42
14 8,25 9,54 0,00 0,00 0,00
Controle
negativo
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Controle
positivo
22,65 34,22 27,01 21,21 16,38
C.E.M. = Controle de esterilidade do meio de cultura
Para os extratos obtidos do fungo P. lilacinus, cultivados sob condição
estática, foram observadas diferentes atividades contra as bactérias Gram-positivas
S. aureus, L. monocytogenes e contra a levedura C. albicans, em comparação com
os extratos cultivados sob condição de agitação orbital, mostrando que a aeração
do meio é um parâmetro que interfere na produção de metabólitos secundários
com atividade antimicrobiana. Em relação às bactérias Gram-negativas testadas,
P. aeruginosa e E. coli, os resultados foram similares, ou seja, não houve nenhum
extrato ativo contra esses micro-organismos.
80
Tabela 12. Média dos halos de inibição do crescimento microbiano (em mm) para
as substâncias P18 e C09 isoladas de extratos do fungo P. lilacinus
Substância
Halo de inibição de crescimento (mm)
S.
aureus L. monocytegenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
P18 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
C09 0,0 9,5 0,0 0,0 0,0
Controle
positivo 28,4 33,0 22,1 23,2 14,1
Controle
negativo 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Como observado na Tabela acima, foi verificada atividade antimicrobiana
contra a bactéria Gram-positiva L. monocytogenes, pela substância C09. A partir
disto, propõe-se que, a atividade antimicrobiana observada pelos extratos brutos
ensaiados é causada pela presença de outras substâncias com tal atividade nos
extratos obtidos.
Estudo como o de Mori e colaboradores, realizado em 1982 no Japão, levou
ao isolamento de leucinostatina, uma mistura composta por várias substâncias
sendo as principais, as leucinostatinas A (71) e B, altamente potentes contra
bactérias Gram-positivas, fungos e com atividade antitumoral contra carcinoma de
Ehrlich (MORI et al., 1982).
71
81
Um estudo posterior, também no Japão, corroborou com os resultados
acima, obtendo também paecilotoxinas, peptídeos contendo um ácido graxo
insaturado e um resíduo de amina nos grupos N-terminal e C-terminal,
respectivamente, isolados de P. lilacinus, alguns dos quais, de origem clínica
(MIKAMI et al., 1989). As paecilotoxinas apresentam grande atividade
antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e fungos, além de fitotoxicidade
(MIKAMI et al., 1984; MIKAMI et al., 1989). Leucinostatinas também foram
produzidas por culturas de P. lilacinus do solo e outros substratos na Austrália e
apresentaram atividade nematicida contra Caenorhabditis elegans (PARK et al.,
2004).
4.4.1.1. Análise estatística
Os resultados do teste de atividade antimicrobiana, para as bactérias Gram-
positivas e a levedura testada, utilizando-se a técnica de difusão em placa, foram
apresentados como média ± erro padrão da média com n=2 para cada extrato
obtido. Os resultados foram submetidos à análise de variância (One-way ANOVA)
seguida do teste de Tukey para análise múltipla de comparação das médias. Foi
adotado intervalo de confiança de 95 %, sendo as diferenças consideradas
significativas quando o valor P foi menor ou igual a 0,05 (P˂0,05). Para análise
estatística foi utilizado o Software GraphPad Prism 5.0.
Os resultados obtidos a partir do teste de Tukey, para análise múltipla de
comparação das médias, foram transpostos para uma planilha do programa
Microsoft Office Excel 2007, para melhor interpretação dos resultados. As médias
dos valores dos halos de inibição produzidos pelos extratos, para cada micro-
organismo testado, foram comparadas e agrupadas de acordo com a característica
de apresentarem médias estatisticamente iguais entre si (Tabelas 13 e 14).
82
Tabela 13. Agrupamento, resultante da análise estatística dos resultados do teste
de atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição
de agitação
Grupos
S. aureus L. monocytogenes C. albicans
Extratos
A 1, 9, 10, 11, 14, controle
negativo
1, 9, 10, 11, 12, 13,
14, controle negativo
5, 9, 10, 11,
controle negativo
B 13, 8, 7, 4, 12, 3 4, 7, 3, 8, 6 Controle positivo,
14, 13, 4
C 6, controle positivo 5, controle positivo 1, 7, 6, 12, 3, 8
D controle positvo, 5 --- ---
Tabela 14. Agrupamento, resultante da análise estatística dos resultados do teste
de atividade antimicrobiana dos extratos obtidos do fungo P. lilacinus, sob condição
estática
Grupos
S. aureus L. monocytogenes C. albicans
Extratos
A 1, 3, 5, 6, 9, 10, 11, 12,
13, controle negativo
1, 4, 5, 7, 8, 10, 12,
controle negativo
1, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
10, 11, 12, 14,
controle negativo
B 14, 8, 7, 4 9, 14, 13, 6, 11, 3 9,13
C controle positivo, 3 controle positivo
D --- controle positivo ---
4.4.2. Avaliação da atividade antimicrobiana – Técnica de microdiluição em caldo
Os extratos obtidos, nas diferentes condições de cultivo, do fungo P. lilacinus
e as substâncias P18 e C09 foram submetidos à avaliação da atividade
antimicrobiana utilizando-se o método de microdiluição em caldo, testados a uma
concentração fixa de 1000 μg/mL e 250 μg/mL, respectivamente. Foram utilizadas
as bactérias Gram-positivas S. aureus e L. monocytogenes, as bactérias Gram-
83
negativas P. aeruginosa e E. coli, além da levedura C. albicans. Foram realizadas
leituras 24 h e 48 h após a incubação das placas em estufa a 37 ºC.
Todos os extratos brutos apresentaram atividade antimicrobiana contra os
micro-organismos testados (Gráficos 3 a 10).
Gráfico 3. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados
sob agitação orbital.
Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento
Gráfico 4. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados
sob agitação orbital.
Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus L. monocytogenes
P. aeruginosa E. coli C. albicans
% d
e Inib
ição
Extrato 1
Extrato 3
Extrato 5
Extrato 6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% d
e Inib
ição
Extrato 1
Extrato 3
Extrato 5
Extrato 6
84
Gráfico 5. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13,
cultivados sob agitação orbital.
Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento
Gráfico 6. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13,
cultivados sob agitação orbital.
Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% d
e Inib
ição
Extrato 8
Extrato 10
Extrato 12
Extrato 13
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% d
e Inib
ição
Extrato 8
Extrato 10
Extrato 12
Extrato 13
85
Gráfico 7. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados
sob condição estática.
Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento
Gráfico 8. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 1, 3, 5 e 6, cultivados
sob condição estática.
Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% d
e Inib
ição
Extrato 1
Extrato 3
Extrato 5
Extrato 6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% d
e Inib
ição
Extrato 1
Extrato 3
Extrato 5
Extrato 6
86
Gráfico 9. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13,
cultivados sob condição estática.
Obs: Valores da leitura realizada após 24 h do início do experimento
Gráfico 10. Percentual de inibição antimicrobiana dos extratos 8, 10, 12 e 13,
cultivados sob condição estática.
Obs: Valores da leitura realizada após 48 h do início do experimento
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% d
e Inib
ição
Extrato 8
Extrato 10
Extrato 12
Extrato 13
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus L. monocytogenes P. aeruginosa E. coli C. albicans
% d
e Inib
ição
Extrato 8
Extrato 10
Extrato 12
Extrato 13
87
Os resultados do presente teste diferem daqueles encontrados no teste
antimicrobiano utilizando-se o método de difusão em placa com discos de papel,
visto que, no último, não foi observada nenhuma atividade antimicrobiana frente às
bactérias Gram-negativas testadas, P. aeruginosa e E. coli . Este fato pode ser
explicado em função das diferenças dos fundamentos existentes entre as duas
técnicas. O teste de difusão em placa com discos de papel é um método físico, no
qual a substância ativa presente no extrato precisa sofrer difusão no meio de
cultura sólido, de caráter hidrofílico, para inibir o crescimento do micro-organismo
em teste. Assim, o tamanho da zona de inibição de crescimento do mesmo, não
está relacionado somente com a concentração da substância ativa no extrato, mas
sim, com a propriedade dela de sofrer difusão no meio. Isto significa que, quanto
mais hidrossolúvel for a substância, maior a capacidade de difusão no meio de
cultura, maior a interação com o micro-organismo e, por conseqüência, maior o
halo de inibição de crescimento do micro-organismo. Desta forma, este método é
caracterizado como um método qualitativo. Na técnica de microdiluição em caldo
utiliza-se a amostra previamente solubilizada no meio de cultura, portanto a
substância não necessita sofrer difusão no meio, visto que ela está solubilizada ou
finamente suspendida no mesmo. Com isso, a interferência da propriedade química
da substância ensaiada é menor do que no primeiro teste. Neste método
considera-se a relação entre a proporção de crescimento do micro-organismo no
meio líquido e a concentração da substância testada, caracterizando-se como um
ensaio quantitativo.
Diante o exposto, observa-se que são vários os fatores interferentes em
ambos os testes, como concentração e origem dos meios de cultura,
principalmente no primeiro teste, disponibilidade de oxigênio, padronização do
inóculo, condições de incubação e garantia de esterilidade do meio de cultura
(PINTO et al., 2003; OSTROSKY et al., 2008).
Das substâncias testadas no teste antimicrobiano utilizando-se a
metodologia da microdiluição em caldo, foi observada atividade frente às bactérias
Gram-positivas, pela substância C09, como mostrado nas Tabelas que se seguem.
88
Tabela 15. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09,
após 24 h do início do experimento
Amostra S. aureus L.
monocytogenes
P.
aeruginosa E. coli
C.
albicans
P18 0 0 0 0 0
C09 4,3 9,4 0 0 0
Tabela 16. Percentual (%) de inibição antimicrobiana das substâncias P18 e C09,
após 48 h do início do experimento
Amostra S. aureus L.
monocytogenes
P.
aeruginosa E. coli
C.
albicans
P18 0 0 0 0 0
C09 6,1 10,2 0 0 0
89
4.4.3. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em cromatografia
em camada delgada (CCD) – Método de Ellmann
A avaliação qualitativa da inibição da AchE foi realizada seguindo-se a
metodologia de Ellmann, adaptada por Rhee et al. para cromatografia em camada
delgada. Este método é baseado na hidrólise do ACTI pela AchE, produzindo
tiocolina, que reage com DTNB originando o composto 5-tio-2-nitro-benzoato
(Figura 36), que apresenta coloração amarela (SILVA, 2009). A visualização da
inibição da enzima foi constatada pela formação de halos brancos, que
desapareceram após 20 a 30 min da aplicação.
Figura 36. Reações envolvidas no método de Rhee (SILVA, 2009).
Os vinte e oito extratos brutos obtidos e o padrão cafeína foram testados na
concentração de 10 mg/mL, sendo uma quantidade de 5 µL aplicada nas placas de
testes. Do total testado, dezesseis extratos produziram halos brancos na placa,
indicando atividade de inibição da enzima AchE, como mostrado na Figura 37 (A)
e (B). O valor de Rf de cada amostra está indicado na Tabela 17.
90
Figura 37. (A) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD (extratos
cultivados sob agitação) e (B) Foto da placa do teste de Inibição da AchE em CCD
(extratos cultivados sob condição estática).
91
Tabela 17. Valores dos fatores de retenção (Rf) das substâncias ativas no teste de
inibição da AchE
Extrato
Fator de retenção (Rf)
Cultivo sob
agitação
Cultivo em
condição estática
1 0,05 0,25
2 N.D. N.D.
3 0,05 0,20 / 0,62
4 0,23 0,20 / 0,62
5 0,05 0,20 / 0,62
6 N.D. 0,18
7 N.D. N.D.
8 0,25 0,25
9 N.D. 0,06
10 N.D. N.D.
11 0,25 N.D.
12 N.D. 0,25
13 N.D. 0,25
14 0,25 0,25
Cafeína (padrão positivo) 0,45
N.D. = Não detectado
Estes resultados foram bastante satisfatórios, sendo quase 60% dos extratos
testados ativos na inibição da enzima AchE. Analisando-se a Tabela 17 pode-se
perceber que, em determinados extratos, existe mais de uma substância ativa,
afirmando a capacidade de micro-organismos em produzir substâncias
anticolinesterásicas.
Após a triagem com os vinte e oito extratos obtidos, o extrato 8, cultivado
sob condição estática, foi selecionado para produção em escala ampliada para que
92
se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e isolamento de
constituintes químicos.
4.4.4. Avaliação da atividade de inibição de acetilcolinesterase em microplaca –
Método de Ellmann
O teste de inibição da AchE em CCD, descrito no tópico 3.10.3, apresenta
apenas caráter qualitativo. Para quantificar o valor da inibição da enzima AchE
apresentado pelos extratos obtidos neste estudo, utilizou-se a metodologia de
Ellmann. Portanto o critério de escolha dos extratos testados por este método
baseou-se na triagem do primeiro ensaio, sendo então, dezesseis extratos
ensaiados. As substâncias isoladas, P18 e C09 também foram testadas nesse
bioensaio.
A primeira etapa do ensaio constituiu-se em medir a absorbância da solução
(solução de trabalho + solução de ACTI + solução de DTNB + tampão Tris/HCl pH
8,0) por oito vezes, obtendo-se, assim, para cada amostra, a média de quarenta
medidas de absorbância, visto que o teste foi realizado em quintuplicata. Na
segunda etapa, realizada após a adição da solução da enzima AchE aos poços
testes, foi mensurada a absorbância novamente, por dez vezes, resultando na
média de cinqüenta medidas para cada amostra.
As porcentagens de inibição foram calculadas comparando-se as taxas das
reações das amostras com a taxa de reação do controle (solvente utilizado para
solubilizar as amostras) através da fórmula: % inibição = 100 - (taxa da reação
amostra/taxa da reação controle x 100). Os resultados das avaliações do potencial
inibitório dos extratos e das substâncias P18 e 09 de P. lilacinus estão
apresentados a seguir.
93
Tabela 18. Percentual (%) de inibição das amostras no ensaio anticolinesterásico
em microplaca pelo método de Ellmann
Amostra % Inibição (média ± d.p.)
01 S.A 86 ± 1,87
03 S.A 80 ± 4,0
04 S.A 85 ± 2,73
05 S.A 91 ± 2,91
06 S.A 93 ± 4,73
08 S.A 97 ± 4,68
09 S.A 78 ± 2,30
12 S.A 81 ± 0,80
13 S.A 83 ± 1,75
14 S.A 79 ± 1,60
1 C.A 92 ± 3,52
4 C.A 87 ± 2,30
5 C.A 86 ± 1,10
8 C.A 86 ± 2,13
11 C.A 92 ± 2,07
14 C.A 88 ± 2,10
P18 57,5 ± 5,50
C09 67 ± 4,0
Controle
positivo
(eserina)
98 ± 1,66
Controle
negative 0 ± 0
*d.p.= desvio padrão
94
Gráfico 11. Percentual de inibição da enzima AchE pelos extratos, substâncias
P18 e C09, eserina e MeOH
Como pode ser observado, todos os extratos ensaiados apresentaram alto
potencial anticolinesterásico, visto que é descrito que extratos que apresentam
porcentagens de inibição maiores do que 50% têm potencial anticolinesterásico
considerado como alto e porcentagens de inibição entre 15 a 50% como de
atividade moderada a baixa (SEIDL, 2010). O extrato 8 S.A apresentou a maior
porcentagem de inibição, 98%, similar ao controle positivo, eserina. As substâncias
isoladas P18 e C09 também mostraram significativa atividade de inibição da
enzima AchE, como níveis de inibição de 57,5 e 67%, respectivamente.
Estudos realizados utilizando-se fungos como produtores de substâncias
anticolinesterásicas corroboram com essa pesquisa. Os diasteroisômeros
quinolactacina A1 (58) e quinolactacina A2 (59), isolados de uma cultura de
Penicillium citrinum 90648, apresentaram grande atividade inibitória da enzima
AchE, sendo a quinolactacina A2, ainda, seletiva para a AchE versus
butirilcolinesterase (BuchE), uma enzima semelhante à acetilcolinesterase, porém
com distribuição tecidual diferente da última, e sem real função definida. (KIM et al.
2001).
Em outras pesquisas, utilizando-se culturas do fungo Aspergillus terreus,
Kim e colaboradores (2002), isolaram um meroterpenóide, denominado
terreulactona A (72) e, em 2005, um novo meroterpenóide foi isolado, a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de inibição da enzima AchE %
95
O
O
R1
R2
R3O
O
OH
OH
isoterreulactona A (73). Ambas inibiram consideravelmente a enzima AchE, a
primeira com um IC50 de 0,2 µM e, a segunda, com IC50 de 2,5 µM.
O
O
O
O
O
OCH3
OH
OH
O
OO
OCH3
OH
O
H3CO
OO
72 73
Outro estudo que apresentou resultados positivos foi o de Sunazuka e
colaboradores (2004), que pesquisaram uma enorme variedade de fungos do solo,
na busca por produtores de inibidores de AChE. Neste trabalho, estes autores
isolaram (+)-arisugacinas A (74) e B (75), ciclofostina (76), territrems B (77) e C
(78) e a ciclopenina (79), todas com satisfatório poder de inibição de AchE. As
arisugacinas A e B e a ciclopenina foram seletivas, pois não inibiram a enzima
BuChE.
O
P
O
CH3
O
H
H3CO
O
76
N
N
O
HO
CH3
O
79
74 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = H
75 R1 = H, R2 = OCH3, R3 = H 77 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = OCH3
78 R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = H
96
Capítulo 5
CONCLUSÃO
97
5. CONCLUSÃO
Nesse trabalho foi realizado o estudo da variação de parâmetros no cultivo
do fungo filamentoso Paecilomyces lilacinus, a fim de se obter diferentes extratos
brutos e testá-los quanto às atividades antimicrobiana e anticolinesterásica.
Os extratos brutos apresentaram atividade antibacteriana seletiva, no teste
antimicrobiano utilizando-se o método de difusão em ágar, sendo ativos somente
contra as bactérias Gram-positivas. Quando submetidos ao mesmo teste,
utilizando-se a metodologia de microdiluição em caldo, todos os extratos ensaiados
mostraram atividade antimicrobiana contra os micro-organismos utilizados no teste,
o que é explicado pela diferença dos fundamentos entre os dois testes. O extrato 5,
cultivado sob condição estática (5 S.A), foi selecionado para produção em escala
ampliada para que se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e
isolamento de constituintes químicos.
Dos vinte e oito extratos brutos obtidos e testados no teste de inibição da
enzima AchE, utilizando-se o método qualitativo em CCD, dezesseis extratos
apresentaram atividade de inibição da enzima AchE. Estes foram submetidos ao
teste quantitativo de inibição da mesma enzima, e apresentaram percentual de
inibição entre 78 e 97%. Em seguida às triagens, o extrato 8, cultivado sob
condição estática (8 S.A), foi selecionado para produção em escala ampliada para
que se obtivesse quantidade adequada ao seu fracionamento e isolamento de
constituintes químicos.
Análise dos extratos brutos, por CLAE-PDA, revelou que a variação de
alguns parâmetros de cultivo, como co-adição de material genético bacteriano ao
meio e aeração do meio, interferiu na produção de metabólitos pelo fungo
estudado, visto que os extratos obtidos deste apresentaram diferenças nos seus
perfis químicos.
Do fracionamento cromatográfico do extrato 5 S.A, foi isolada a substância
P18, para a qual baseando-se em dados espectroscópicos, foi proposta a estrutura
química de uma δ-lactama.
Do fracionamento cromatográfico do extrato 8 S.A, foram isoladas duas
substâncias, C09 e C16-P, para as quais, infelizmente, não se conseguiu dados
espectroscópicos suficientes para suas respectivas caracterizações.
98
As substâncias P18 e C09 foram submetidas aos testes antimicrobianos, por
ambas as metodologias citadas acima e ao teste de inibição da enzima AchE. Nos
testes antimicrobianos, foi observada atividade para a substância C09, contra as
bactérias Gram-positivas S. aureus, quando se utilizou a metodologia de
microdiluição em caldo e L. monocytogenes, em ambas as metodologias. Em
relação ao teste de atividade anticolinesterásica, ambas as substâncias
apresentaram relevante atividade de inibição da enzima, com percentual de
inibição de 57,5% e 67% para as substâncias P18 e C09, respectivamente.
99
Capítulo 6
REFERÊNCIAS
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112
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113
ANEXOS
114
ANEXO 1. Espectros da fração P12
1.1 – Espectro de RMN de 1H (200 MHz, Pyr, δ)
115
1.2 – Espectro de RMN de 13C (50 MHz, Pyr, δ)
116
1.3 - Espectro de DEPT (50 MHz, Pyr, δ)
117
ANEXO 2. Espectros da fração P13
2.1 – Espectro de RMN de 1H (200 MHz, MeOH, δ)
118
2.2 – Espectro de RMN de 13C (50 MHz, MeOH, δ)
119
2.3 – Espectro de DEPT (50 MHz, MeOH, δ)
120
ANEXO 3. Espectros da fração P14
3.1 - Espectro de RMN de 1H (200 MHz, Pyr, δ)
121
3.2 – Espectro de RMN de 13C (50 MHz, Pyr, δ)
122
3.3 – Espectro de DEPT (50 MHz, Pyr, δ)
123
ANEXO 4. Espectros da substância P18
4.1 – Espectro de RMN de 1H (400 MHz, Pyr, δ)
124
4.1.1 – Expansão do espectro de RMN de 1H
125
4.2 – Espectro de RMN de 13C (100 MHz, Pyr, δ)
126
4.3 – Espectro de DEPT (100 MHz, Pyr, δ)
127
4.4 – Mapa de contornos HSQC
128
4.4.1 – Expansão do mapa de contornos HSQC
129
4.5 – Mapa de contornos H-H COSY
130
4.5.1 – Expansão do mapa de contornos H-H COSY
131
4.6 – Mapa de contornos HMBC
132
4.6.1 – Expansão do mapa de contornos HMBC
133
4.7 – Mapa de contornos NOESY
134
4.7.1 – Expansão do mapa de contornos NOESY
135
ANEXO 5. Espectros da substância C09
5.1 – Espectro de RMN de 1H (400 MHz, Pyr, δ)
136
5.2 - Espectro de RMN de 13C (50 MHz, Pyr, δ)
137
5.2.1 – Expansão do espectro de RMN de 13C
138
5.3 – Espectro de DEPT (50 MHz, Pyr, δ)
139
5.4 - Mapa de contornos HSQC
140
5.5 - Mapa de contornos H-H COSY
141
5.6 - Mapa de contornos HMBC
142
5.7 - Mapa de contornos NOESY
143
ANEXO 6. Espectros de RMN de AC-05
6.1 - Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, δ)
144
6.2 – Espectro de RMN de 13C (50 MHz, CDCl3, δ)
145
6.3 – Espectro de DEPT (50 MHz, CDCl3, δ)