EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EM

BACTÉRIAS

João Fernando Bortoleto

Jeanne Blanco De Molfetta Machado

Uso de uma célula ou um organismo para expressar uma proteína produzida em outra célula ou outro organismo.

Ex.: TAQ DNA Polimerase, enzimas de restrição

produção de proteínas heterólogas

Para que produzir proteínas recombinantes?

Pesquisa em estrutura e função de proteínas

Imunização

Fármacos: anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação

Fator VIII da imunoglobulina recombinante

Interferon α

Insulina

Por que expressar proteínas recombinantes?

Dificuldade de se purificar do tecido original

Proteínas do tecido podem estar contaminadas

Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas

Processo completamente controlado

Especificidade

Quantidade

Como preparar um sistema recombinante.

Isolar e preparar o DNA ou cDNA

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro

Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a proteína foi expressa

Checar se está solúvel

Purificar

Checar se está ativa

Caracterizar a proteína

CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO EM PLASMÍDEOS

CLIVAGEM

ou

PCR

TRANSFORMAÇÃO

LIGAÇÃO

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro

Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a proteína foi expressa

Checar se está solúvel

Purificar

Checar se está ativa

Caracterizar a proteína

Vetores de expressão- componentes básicos

malE

M13 ORI-

Marcadores seletivos

Origem de replicação

Promotor

Sítio de poliadenilaç

ãoTerminador

Sítio de ligação do ribossomo

Características que devem ser avaliadas em cada sistema de expressão

Taxa de crescimento celular

Complexidade do meio de cultura

Custo do meio de cultura

Nível de expressão

Capacidade de expressar extracelularmente

Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como: dobramento correto, formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação

Vantagens dos sistemas de expressão

eucarióticos - Dobramento das proteínas eucarióticas mais semelhante.

- Modificações pós-traducionais.

- Pode produzir grandes quantidades de proteínas com o uso de equipamentos próprios (fermentadores).

Desvantagens dos sistemas de expressão

eucarióticos

- Sistemas caros

- Necessitam equipamentos adequados

- Poucos vetores disponíveis- Adequado para proteínas ricas em cisteínas- pontes dissulfeto.

- Níveis de expressão mais baixos.

Escolha do sistema - hospedeiros

Bactérias Gram-negativas – E. coli e Caulobacter

Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis

Leveduras – Saccharomyces pichiapastoris

Fungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma

Células de inseto

Células de mamífero

Células vegetais em cultura

Oócito de Xenopus

Plantas transgênicas e Animais transgênicos

Replicação a cada 20 minutos em condições ideais de crescimento

Disponibilidades de vários vetores de clonagem

Disponibilidade de várias cepas mutantes, deficientes em proteases

Linhagens de E. coli modificadas - Gram negativa

EXPRESSÃO PROTEÍNA HETERÓLOGA

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro

Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a proteína foi expressa

Checar se está solúvel

Purificar

Checar se está ativa

Caracterizar a proteína

Eletroporação, biobalistica, vírus, ... X sistema

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro

Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a proteína foi expressa

Checar se está solúvel

Purificar

Checar se está ativa

Caracterizar a proteína

Seleção Cepa Transformada

Vetores carregam gene resistência a antibióticos ManutençãoPressão Seletiva

Meio + antibiótico

Seleção

Antibióticos: ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina.

Gentamicina

Higromicina, canamicina

Herbicidas: BASTA

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro

Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a proteína foi expressa

Checar se está solúvel

Purificar

Checar se está ativa

Caracterizar a proteína

Tempo/ solubilidade Controle da indução

PM S0 S1 S2 S3 S4 P0 P1 P2 P3 P4 S0 S3 C3 PM

Desvantagens

Sistema procariótico

Não realiza modificações pós-traducionais

- Não realiza secreção de proteínas.

Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias.

Dobramento incorreto de proteínas (proteínas ricas em cys)

Codon usage (uso de tRNAs)

-Tendência a formar corpúsculos de inclusão.

Degradação proteolítica

PROBLEMAS COMUNS da EXPRESSÃO em E. coli

PROTEÍNA NÃO EXPRESSA

Alternativa sequenciar, uso do código

AGA, AGG, CGA, CGG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ArgUGU, UGC..........................................CysGGA, GGG...........................................GlyAUA.....................................................IleCUA, CUC............................................LeuCCC, CCU, CCA...................................ProUCA, AGU, UCG, UCC......................Ser

ACA......................................................Thr

Presença de codons raros na proteína de interesse

Codons raros em E.coli

CÓDON PLUS, ROSETA

Como preparar um sistema recombinante

Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar

Escolher o sistema apropriado

Transformar hospedeiro

Selecionar hospedeiro transformado

Checar se a proteína foi expressa

Checar se está solúvel

Purificar

Checar se está ativa

Caracterizar a proteína

PURIFICAÇÃO PROTEÍNA RECOMBINANTE

pGEX – Glutationa S-Transferase agarose-glutationa

pQE, pET – tag de Histidinas coluna de níquel

Clivagem química ou enzimática

Proteína de interesseGST

Clivagem com fator Xa

Sistemas de Purificação

clonagem

Cromatografia

lavagens eluição