Post on 01-Dec-2018
Isolamento de ácidos nucléicos de células e
tecidos
Extração de ácidos nucléicos
Obtenção do material:
• Vírus
• Bactérias; fungos
• Célula vegetal / célula animal
Extração de ácidos nucléicos
Requerimento essencial:
quantidade (rendimento)
pureza
integridade
Etapas na obtenção de ácidos nucléicos:
1) Lise física ou bioquímica das paredes e celulares e membranas
2) Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares
3) Precipitação
Extração de ácidos nucléicos
1. Rompendo membranas celulares
Lise das células liberação dos
componentes citoplasmáticos e/ou nucleares
Estratégia: de acordo com o tipo de célula
envolvida (deve ser o mais “gentil”
possível)
Extração de ácidos nucléicos
Bactérias (parede glicoproteica)
- tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede enfraquecimento rompimento em solução hipotônica);
- outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação.
Células de plantas ou animais presentes em tecidos:
Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual célula individual lise: digestão enzimática / homogeneização
Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.
Extração de ácidos nucléicos
Células sem cobertura externa ou em solução:
Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente
- SDS (dodecil sulfato de sódio)
- substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas
2. Desnaturando proteínas celulares:
- DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos.
- Fragmentos de membrana lipídica.
- Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses interferem no rendimento dos ácidos nucléicos
Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos:
- Extração em baixas temperaturas
- Incubação dos lisados com reagentes desnaturantes de proteínas
- Agentes que retardam atividade das nucleases
Extração de ácidos nucléicos
Extração de ácidos nucléicos
Agentes que retardam atividade das nucleases:
- tampões de extração com agentes quelantes (EDTA – ácido etileno diaminotetracético)
- Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração
- RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC –dietil pirocarbonato )
3. Separando DNA / RNA / Proteínas
Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação
Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas
Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos)
interface: proteínas
camada do fenol
Extração de ácidos nucléicos
Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:
Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico)
3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA)
interface: proteínas
camada do fenol
Camada aquosa
Camada de proteínas
Camada do fenol
p
H
pH neutro
ou básico
Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:
Extração de RNA (fenol com pH ácido)
3 fases: aquosa (RNA)
interface: proteínas
camada do fenol (DNA)
Camada aquosa
Camada de proteínas
Camada do fenol
p
HpH ácido
Extração de ácidos nucléicos
4. Precipitação e lavagem com álcool
DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 –(Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC -20º C
DNA precipitado
Extração de ácidos nucléicos
Soluções utilizadas
tampão de extração
solução de lise
solução desnaturante de proteínas
fenol
clorofórmio
Etanol
Proteinase K
Extração de ácidos nucleicosFunção dos reagentes
Tampão: proporciona um pH ideal para manutenção
da integridade das moléculas de ácidos nucléicos;
inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE -
pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino
tetracético).
Detergentes: substâncias tensoativas que agem
dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e
dissolvendo os lipídios de membrana; SDS =
sodium dodecyl sulfate.
Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento
de DNA/RNA de amostras biológicas.
Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a
eficiência da extração de ácidos nucléicos.
Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA)
DEPC – dietil pirocarbonato).
Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de
ácidos nucléicos provocando a agregação das
moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos
de fenol e clorofórmio).
Proteinase K – a contaminação com proteínas pode ser
removida pela digestão com proteinase K
Extração de ácidos nucleicosFunção dos reagentes
Conceito
“Eletroforese em gel: é uma técnica deseparação de moléculas que envolve amigração de partículas em um determinado geldurante a aplicação de um potencial elétrico.As moléculas são separadas de acordo com asua carga elétrica e seu peso molecular, logoas de menor massa irão migrar maisrapidamente que as de maior massa”.
A eletroforese normalmente é utilizada paraseparar proteínas e moléculas de DNA e RNA.
Breve Histórico...
• Inicialmente proposta por Arne Teselius (1937).
• A eletroforese era técnica empregada para visualização
de proteínas com suas diferenças de comprimento de
fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas.
• Atualmente, o uso desta técnica é comum também para
estudos com ácidos nucléicos (Brown 1998; Farah
2000), na visualização de material genético (ácido
desoxirribonucléico e ribonucléico, DNA e RNA).
Arne Tiselus
Prêmio Nobel de
Química em 1948
Princípios da Eletroforese
O princípio da eletroforese utilizada
para separação de DNA, baseia-se na
carga total negativa do DNA (dada
pelos oxigênios do grupamento
fosfato). Assim, fragmentos de DNA
obtidos da técnica de PCR, podem
ser separados pela aplicação de uma
voltagem. Ao final do processo, as
cadeias de DNA estarão próximas ao
pólo positivo.
Princípios da Eletroforese
1.Separar partículas por diferença de carga
e massa
2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre o gel
3.Isolar fragmentos de DNA, RNA e
proteínas
Gel de Agarose
• Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha.
• Não-tóxico.
• Fácil de preparar.
• Possuem ampla capacidade de separação,mas baixa
resolução.
• Dependendo da concentração podem separar
fragmentos de DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.
• Custo elevado.
• Ao solidificar, após o aquecimento, os longos
filamentos de agarose formam uma matriz (malha) que
serve de "peneira" de separação de fragmentos de DNA.
•
•
Gel de Agarose
• Alguns fatores determinam a migração
do DNA através do gel de agarose:
a) tamanho da molécula de DNA
b) concentração da agarose
c) conformação do DNA
(formas circulares ou lineares)
d) a presença de brometo de etídio no gel
e) voltagem aplicada
f) tipo de agarose
g) tipo do tampão de eletroforese
Soluções e Reagentes
• Tampão
O gel é submerso em um tampão que possui
íons para a corrente passar e também para
manter o pH mais ou menos constante.
a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer –
Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA)
b) TPE (Tris-phosphate-EDTA lectrophoresis buffer
Tampão de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)
c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer
Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDTA)
Soluções e Reagentes
• Tampão de carregamento (loading
buffer)
É uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou
xileno cianol ) e glicerol, é misturado às amostras
antes de carregar o gel e possui três finalidades:
1) aumentar a densidade da amostra
2) adicionar cor às amostras
3) simplificar o processo de carregamento
Soluções e Reagentes
• Coloração do gel:
1) Brometo de etídio
O brometo de etídio intercala-se com a molécula de
DNA a cada 2,5 bp do fragmento, após sua inserção
esse exerce uma ligação do tipo Van der Waals. A
radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o
DNA e o corante tornando a molécula ou banda visível
no gel através de um dispositivo de transiluminação.
Como o brometo de etídio se intercala no DNA, esta
substância tem um poderoso efeito mutagênico e,
possivelmente pode ser cancerígeno ou teratogênico.
Marcadores de peso
molecular.A distância que o fragmento percorre a partir do ponto de
aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos
de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses
fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular),
misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e
eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel
no início do processo.
Montando a Eletroforese
•Preparação do Gel de Agarose
1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose.
2. Adicionar 100mL de TAE 1X.
3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar
(sugestão: 2 a 2,5 min, potência 7).
4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte
de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba.
5. Acrescentar 5μL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar
com agitação leve.
6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas.
7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte.
8. Esperar a solução solidificar.
9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese.
Montando a Eletroforese
•Preparação das Amostras (DNA)
1. Extrair 3μL da amostra de DNA.
2. Homogenizar com 1μL de tampão de corrida 5X
(Loading Buffer).
3. Aplicar as amostras nos poços.
4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida
(Ladder-1Kb).
Montando a Eletroforese
•Montar a Cuba Eletroforética
•Adicionar o gel, previamente preparada
•Adicionar tampão TAE 1X até cobrir a
superfície do gel.
•Adiciona as amostras a serem separadas
•Ajustar a voltagem desejada(média 80v)
e ligar a cuba
Eletroforese em gel
• Eletroforese em gel de poliacrilamida: a
poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros,
acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula
linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T".
Misturando essas duas moléculas, temos a formação de
uma "rede".O gel de poliacrilamida tem maior
capacidade de resolução e é mais efetivo para separar
pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de
base).
• Eletroforese Desnaturante: normalmente feita
em gel de agarose, inclui um agente desnaturante
(normalmente uréia), o que ajuda a tornar a separação
melhor entre moléculas que apresentam diferenciação
em suas estruturas secundárias.
Visualização após a
Eletroforese.Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e
olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.
Visualização após a
Eletroforese
SYBR Green > Molecular Probes 1995
.
Revolucionou a detecção de DNA em géis.
A intensidade da fluorescência do SYBR
Green é aumentada em 100X quando se
liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas
de DNA.
Junto a sua sensibilidade superior o SYBR
Green tem outras vantagens sobre o EtBr:
- É muito menos mutagênico,
- Pode ser adicionado diretamente à
amostra antes da eletroforese.