Pascholati, Sérgio F.

Esalq/USP

LFT - 5755

Controle de Doenças Através

da Indução de Resistência

Uso intensivo de defensivos agrícolas (agrotóxicos) para

o controle de doenças, pragas e plantas invasoras tem

gerado:

- Contaminação de alimentos, solo, água, animais

- Intoxicação de agricultores

- Resistência de patógenos, pragas e plantas invasoras

- Surgimento de doenças iatrogênicas

- Desequilíbrio biológico (ciclagem de nutrientes e matéria orgânica)

- Eliminação de organismos benéficos / redução biodiversidade

(Brasil responsável por 1/5 do consumo mundial de agrotóxicos –

herbicidas / inseticidas / fungicidas)

“Entretanto, a preocupação da sociedade com o

impacto da agricultura no ambiente e a

contaminação da cadeia alimentar com agrotóxicos

está alterando o cenário agrícola, resultando em

mercados de alimentos produzidos sem o uso de

agrotóxicos ou aqueles com selos que garantem que

os agrotóxicos foram utilizados adequadamente”

Morandi & Bettiol, 2009

Controle alternativo*

Controle biológico Indução de resistência

* Não inclui:

- Melhoramento genético clássico para resistência

- Controle químico clássico

(* Visão do Professor e de outros autores)

Controle Biológico – Conceito

“Controle biológico é a redução da soma de inóculo ou atividades determinantes da

doença, provocada por um patógeno, realizada por um ou mais organismos que

não o homem”

(Cook & Baker, 1983)

Definição mais simples e direta:

“Controle biológico é o controle de um microrganismo através de outro

microrganismo”

(Bettiol & Ghini, 1995)

Controle biológico

Uso de qualquer microrganismo para

controlar um patógeno

Efeito direto sobre

o patógeno

Levedura

Bactéria

Levedura

ou

Bactéria

+ Patógeno

Água – Penicillium sp Streptomyces sp – Penicillium sp

Controle biológico*

Mecanismos de ação dos antagonistas:

- Antibiose

- Competição

- Parasitismo

- Predação

- Hipovirulência

- Indução de defesa do hospedeiro

(* Visão de outros autores, mas não do Professor)

Indução de Defesa do Hospedeiro

(Resistência induzida)

Ativação de mecanismos de resistência

latentes em resposta ao tratamento

com agentes bióticos ou abióticos

A ação se dá sobre a planta hospedeira

modificando a sua relação com o patógeno

Resistência induzida

Indutor

Provocador*

Local Sistêmica

*Provocador = desafiador = patógeno (“Challenger”)

Horas / dias

Características importantes:

- Resposta sistêmica

- Resposta inespecífica

Indutor

Resistência

ativada

.

Sinal é transportado

sistemicamente na

planta

C - Tomateiro cv. Hildaris

protegido por

Piriformospora indica

contra Fusarium

oxysporum

(Qiang et al., 2012 MPP 13: 508-518)

Defesa das plantas:

mecanismos estruturais

e bioquímicos ativados

Componentes do triângulo da doença

Ciclo das relações patógeno-hospedeiro (Ciclo da doença)

O desenvolvimento de doenças infecciosas é caracterizado pela

ocorrência de uma série de eventos sucessivos e ordenados.

Hospedeiro doente

*

*

*

Fisiologia do Parasitismo

(Fisiologia / bioquímica fitopatológica)

Especialidade dentro da fitopatologia envolvida no

esclarecimento das bases bioquímicas e fisiológicas das

interações hospedeiro-patógeno

Tratado: Die Exantheme der Pflanzen

Franz Unger (1833)

Pedra fundamental

Interação planta

x

microrganismo patogênico

Patógeno x Planta

Reconhecimento

Patógeno x Planta

Defesa

(Cavalcanti et al. 2005)

Patógeno x Planta – complexidade da interação

Patógeno Planta

Ataque

Defesa

“NA NATUREZA RESISTÊNCIA É A

REGRA”

“Capacidade da planta em evitar ou atrasar a

entrada e/ou a subsequente atividade de um

patógeno”

A defesa da planta

Estrutural Estrutural

Química

Parede celular

Cutícula

Parede celular

Química

Local Sistêmica

PASSIVA (Constitutiva)

ATIVA (Induzida)

MECANISMOS DE RESISTÊNCIA

(Fatores de resistência)

1)ESTRUTURAIS (FÍSICOS)

Atraso na penetração do hospedeiro

2) BIOQUÍMICOS

Inibição do crescimento

Condições adversas para a sobrevivência

Resistência

Sistema multicomponente / Resulta de um

número de mecanismos operando de maneira

integrada e coordenada

Resistência

Sistema multicomponente / Resulta de um

número de mecanismos operando de maneira

integrada e coordenada

Para serem efetivos os mecanismos de defesa

devem ocorrer em uma seqüência específica

durante a infecção e a colonização

Nível de resistência

“Soma das contribuições de um número de

mecanismos de resistência (constitutivos /

induzidos)”

Cevada

X

Cochliobolus sativus

(Plant Disease 83(3). 1999)

Fatores de resistência

estruturais

Pré-formados Cutícula

Estômatos

Tricomas

Vasos Condutore

Pós-formados

Papilas

Halos

Lignificação

Camadas de cortiça

Camadas de Abscisão

Tiloses

- DEFESAS (BARREIRAS) CELULARES

- DEFESAS (BARREIRAS) HISTOLÓGICAS

Fatores de resistência estruturais

PÓS-FORMADOS

ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) CELULAR

ATAQUE DO PATÓGENO

MUDANÇAS MORFOLÓGICAS MUDANÇAS BIOQUÍMICAS

Aumento do fluxo citoplasmático em direção

ao sítio de penetração

Rearranjo do citoesqueleto

Migração do núcleo

Justaposição de materiais componentes da

parede celular

Barreiras estruturais pós-formadas

ATAQUE DO PATÓGENO

MUDANÇAS MORFOLÓGICAS MUDANÇAS BIOQUÍMICAS

Agregação citoplasmática

Halos

Papilas

Lignificação

Agregação citoplasmática

Halos

Papilas

Lignificação

Acúmulo de massa de citoplasma no sítio sob ataque

Resposta rápida

Composição: estruturas celulares do tipo retículo

endoplasmático rugoso e complexo de Golgi

AGREGAÇÃO CITOPLASMÁTICA

AGREGAÇÃO CITOPLASMÁTICA

Polarização celular

Movimentação de diferentes

compostos

Mudança na arquitetura

celular

Movimentação do núcleo

(Schmelzer, E. Trends in Plant Science, v. 7, p. 411-415, 2002)

Phytophthora infestans (batata)

ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) CELULAR

Agregação citoplasmática

Halos

Papilas

Lignificação

HALOS

Alterações da parede celular no ponto (sítio) de

penetração do patógeno

Região parcialmente degradada / sofre reparos

Após formação do halo pode ocorrer a formação de

papila

HALOS

HALOS

Oidio (trigo, cevada)

(Mishina, G.N. et al., Biology Bulletin, 4: 354-360, 2001)

ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) CELULAR

Agregação citoplasmática

Halos

Papilas

Lignificação

Conídio

Vesícula de

infecção

Hifa primária

Necrotrófico

Papila

Hifa de

penetração

Apressório

Epiderme

PAPILAS

Papilas

Deposição de material

heterogêneo entre a

membrana plasmática e a

parede celular no sítio de

infecção.

Plant Cell 10(8). 1996.

PAPILAS

PAPILAS

Formação: pode iniciar antes da penetração do fungo

e continuar após

Composição: calose, lignina, derivados fenólicos,

silício, suberina, celulose

Função:

barreira contra penetração de fungos (lignificação)

dificulta troca de metabolitos (hospedeiro x

patógeno)

mecanismo de reparo

Blumeria graminis f. sp. hordei (cevada)

(Rudolf Heitefuss. Naturwissenschaften, 88, 273-283, 2001)

Interação Compatível Interação Incompatível

C - conídio

H - hifa

PA - papila

ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) CELULAR

Agregação citoplasmática

Halos

Papilas

Lignificação

LIGNIFICAÇÃO

Ocorre: citoplasma em degeneração / depósitos extracelulares / paredes

celulares

Lignina: componente da parede celular

Importante: lamela média, paredes

Lignificação Fenilalanina

amônia-liase

(PAL)

Peroxidase

Polímero tridimensional =

unidades de fenil propano

Polimerização - oxidação de

hidroxilas dos grupos fenólicos

pela peroxidase

Lignificação Resistência mecânica

Barreira contra movimento de nutrientes

(Hospedeiro Patógeno)

Barreira contra movimento de toxinas /

enzimas (Patógeno Hospedeiro)

Precursores: tóxicos, lignificação do

patógeno (intercelular)

LIGNIFICAÇÃO

Tubo lignífero

Acúmulo lignina

Lignificação Xanthomonas campestris pv. campestris (repolho)

(Gay, P.A. & Tuzun, S. Canadian Journal of Botany 78: 1144–1149, 2000)

PB e S – Suscetíveis

C – Parcialmente resistentes

GC e H - Resistentes Hidatódios

LIGNIFICAÇÃO

Lignificação (atividade peroxidase)

Xanthomonas campestris pv. campestris (repolho)

(Gay, P.A. & Tuzun, S. Canadian Journal of Botany 78: 1144–1149, 2000)

Controle Inoculado

ESTRUTURA DE DEFESA (BARREIRA) HISTOLÓGICA

Camadas de Cortiça

Camada de Abscisão

Tilose

Camadas de Cortiça

Camada de Abscisão

Tilose

CAMADAS DE CORTIÇA

Podem ser formadas em resposta: - Injúria Mecânica - Presença de patógenos

CAMADAS DE CORTIÇA

Manchas / lesões locais - fungos / bactérias

Morangueiro X

Mycosphaerella fragariae

Maçã X

Venturia inaequalis

Mancha de micosferela Sarna da macieira

Camada de células suberosas (suberina – polímero insolúvel associado com ceras solúveis) Tecido morto

- Impede invasão

- Impede fluxo de nutrientes

- Impede fluxo metabolitos tóxicos (patógeno planta)

CAMADAS DE CORTIÇA

Camada de Cortiça

Tecido sadio

Felogênio

Tecido doente

Folha com mancha

Epiderme Micélio

Camada de Cortiça

CAMADAS DE CORTIÇA

Formação de camada de cortiça em tubérculo de batata após infecção com Rhizoctonia sp

Grão amido

Camadas de Cortiça

Camada de Abscisão

Tilose

CAMADA DE ABSCISÃO

Podem ser formadas:

- Processo natural - Presença de patógeno

Poda

Fenologia

Colheita

Abscisão do órgão

Camada de abscisão

Camadas de

células

separadas por

dissolução da

lamela média

CAMADA DE ABSCISÃO

Abscisão de folhas, frutos e/ou flores

Interação Patógeno X Hospedeiro

- Sítios de Infecção

- Camadas de células separadas por

dissolução da lamela média

- Enzimas celulolíticas e pectinolíticas

- Proteção do hospedeiro

- Invasão sistêmica

- Metabólitos tóxicos

CAMADA DE ABSCISÃO

Zona de abscisão

Zona de lignificação

Tecido doente Tecido sadio

Células sadias suberizadas

Camadas de

células

separadas por

dissolução da

lamela média

Pessegueiro X

Cladosporium carpophilum

Ameixeira X

Xanthomonas campestris pv. ipruni

Perfurações (Shot hole)

CAMADA DE ABSCISÃO

Camadas de Cortiça

Camada de Abscisão

Tiloses

TILOSES

Vasos lenhosos (xilema)

Situações de estresse, envelhecimento e invasão

por patógenos vasculares

TILOSES

- Células parenquimáticas (xilema) emitem

porções do protoplasma para o interior dos

elementos condutores

TILOSES

- Processo de hipertrofia

- Crescimento em tamanho e número

- Obstrução parcial ou total dos vasos

- Invasão sistêmica

* Acúmulo de terpenóides fungitóxicos

- Transporte de água

TILOSES

Xilema

Tiloses

Fatores de resistência

bioquímicos

ATAQUE DO PATÓGENO

MUDANÇAS BIOQUÍMICAS MUDANÇAS MORFOLÓGICAS

Bioquímicos Inibição do crescimento

Condições adversas para a sobrevivência

Pré-formados

- Fenóis

- Alcalóides

- Lactonas insaturadas

- Glicosídeos fenólicos

- Glicosídeos cianogênicos

- Fototoxinas

- Proteínas / peptídeos antimicrobianos

Pós-formados

- Fitoalexinas

- Espécies reativas de oxigênio

- Quitinases

- -1,3-glucanases

- Proteínas-RP

- Peptídeos antimicrobianos

SUBSTÂNCIAS PRÉ- E PÓS-FORMADAS x RESISTÊNCIA

Presentes em concentracões adequadas nas partes

invadidas

Forma acessível ao patógeno

Mudancas na [substância]

Mudancas na expresão da doenca

Bioquímicos Inibição do crescimento

Condições adversas para a sobrevivência

Pré-formados

- Fenóis

- Alcalóides

- Lactonas insaturadas

- Glicosídeos fenólicos

- Glicosídeos cianogênicos

- Fototoxinas

- Proteínas / peptídeos antimicrobianos

Pós-formados

- Fitoalexinas

- Espécies reativas de oxigênio

- Quitinases

- -1,3-glucanases

- Proteínas-RP

- Peptídeos antimicrobianos

Espécies reativas de oxigênio (EAOs)

Interação de um patógeno com a célula da planta hospedeira

Espécies (re) ativas de oxigênio (EAOs)

(Reactive oxygen species (ROS)

Reconhecimento

elicitor-receptor

Membrana plasmática

célula vegetal

Explosão oxidativa

(rápida geração e

acúmulo de EAOs)

EAOs disparam

peroxidação de lipídeos na

membrana e

a indução de outras

respostas de defesa

Peroxidação

lipídeos

ativa cascata de

sinalização

do ácido

jasmônico

Síntese de

proteínas de defesa

e fitoalexinas

Queima ou explosão oxidativa

(Oxidative burst)

- Um dos fenômenos mais estudados em relação à interação planta-

patógeno (1983 – primeiro relato EAOs x defesa vegetal)

- Produção de moléculas de H2O2, ânion superóxido (O2-) e radicais

hidroxila livres (OH-)

- Substâncias citotóxicas / causam danos oxidativos em lipídeos,

enzimas e ácidos nucleicos podem causar morte celular

(RH)

Espécies reativas de oxigênio

- Podem estar envolvidas na resposta de defesa contra patógenos

- Induzem a síntese de fitoalexinas, participam na síntese de lignina

e etileno, ativam genes de resistência

- Exibem atividade antimicrobiana direta

- Inibição da produção de EAOs favorece a compatibilidade

Reconhecimento

Defesa

Funções das EAO’s na planta

• Efeito tóxico direto do H2O2 ao patógeno

(antifúngico e antibacteriano)

O H2O2 a 0,1 mM inibiu completamente o crescimento de E.

carotovora e mais de 95% do crescimento de P. infestans

(Wu et al. 1995)

Erwinia carotovora sp. carotovora Phytophthora infestans

MECANISMOS DE RESISTÊNCIA

Bioquímicos pós-formados

FITOALEXINAS

MECANISMOS DE RESISTÊNCIA

Bioquímicos pós-formados

Fitoalexinas

Compostos antimicrobianos de

baixa massa molecular,

sintetizados pelas plantas, que

acumulam em células vegetais em

resposta à infecção microbiana.

Síntese de fitoalexinas

• Modelo hipotético para a síntese de fitoalexinas

(Côté, 1995)

SAÍDA DE ELETRÓLITOS

Kievitone (fitoalexina)

Triton X-100 (detergente)

X

Rhizoctonia solani

Fitoalexinas x resistência

• Atividade antifúngica de duas cumarinas de girassol no

crescimento Sclerotinia sclerotiorum

Aiapina

Escopoletina

URDANGARIN et al., 1999

Mecanismos de Defesa

Fitoalexinas

22 horas

30 horas

45 horas

Apressório

Sorgo

X

Colletotrichum

sublineolum

(Ralph L. Nicholson)

Concentração

fitoalexinas

150 mM

9 uM inibe

C. graminicola

in vitro

PROTEÍNAS RELACIONADAS A PATOGÊNESE

(PR-proteins)

“Proteínas-RP” = proteínas induzidas no

hospedeiro após a infecção com patógenos

(podem compreender 10% das proteínas solúveis da folha)

PROTEÍNAS RELACIONADAS A PATOGÊNESE

(PR-proteins)

1970 – folhas de fumo exibindo reação de hipersensibilidade

ao TMV – 10 proteínas isoladas

1993 – 33 proteínas isoladas / 31 caracterizadas / 25

encaixavam nos 5 grupos existentes

2007 – 17 grupos com sub-grupos

(centenas de proteínas isoladas / caracterizadas)

“Proteínas-RP” = proteínas induzidas no

hospedeiro após a infecção com patógenos

(podem compreender 10% das proteínas solúveis da folha)

Características

Características

PR básicas

PR ácidas

Classificação das “Proteínas-RP”

Classificadas em 17 famílias de acordo com:

- Massa molecular

- Composição de amino-ácidos

- Reações serológicas

Exemplos de mecanismos de ação

PR-2

PR-3, PR-4, PR-

8, PR-11

PR-5

MECANISMOS DE RESISTÊNCIA - Bioquímicos pós-formados

-1,3-glucanases e quitinases

(a) - -1,3 e -1,6-glucanas

(b) - Retículo glicoproteico

(c) - Proteína

(d) - Microfibrilas de quitina (e) - Plasmalema

Mecanismos de Defesa - Quitinases e B-1,3-Glucanases

Célula vegetal Lamela média

Ação antifúngica

• Inibição de Phytophthora infestans em tomate

(Niderman et al., 1995)

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)

- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução

- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)

- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução

- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)

- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução

- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas

Proteínas ligantes de quitina (PLQs)

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Proteínas com sequência conservada de aminoácidos (“chitin-binding domain” – 30 a 43 aa)

- Atividade antifúngica – ligam-se a quitina (altera polaridade celular / inibindo crescimento)

- Induzíveis: algumas incluídas nas “Proteínas-RP “ -

(Proteínas relacionadas a patogênese) – família PR-4

Proteínas ligantes de quitina (PLQs)

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Proteínas com sequência conservada de aminoácidos (“chitin-binding domain” – 30 a 43 aa)

- Atividade antifúngica – ligam-se a quitina (altera polaridade celular / inibindo crescimento)

- Induzíveis: algumas incluídas nas “Proteínas-RP “ -

(Proteínas relacionadas a patogênese) – família PR-4

Heveina (4,7 kDa / rica

cisteína) - seringueira

Acúmulo induzido por injúria

em folhas e tronco

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)

- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução

- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas

Tioninas

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Peptídeos (5 kDa) ricos em cisteína e aminoácidos básicos

- Encontradas em folhas e sementes

- Podem ser constitutivas ou induzidas por patógenos (Família PR-13)

- Tóxicas a fungos, bactérias, células vegetais e animais (formam canais iônicos

nas membranas celulares)

Tioninas

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Peptídeos (5 kDa) ricos em cisteína e aminoácidos básicos

- Encontradas em folhas e sementes

- Podem ser constitutivas ou induzidas por patógenos (Família PR-13)

- Tóxicas a fungos, bactérias, células vegetais e animais (formam canais iônicos

nas membranas celulares)

Plantas de arroz

Transformadas com gene

codificador para tionina Não-transformadas

Resistentes a

Burkholderia plantarii

Mortas pelo

patógeno

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Plantas possuem famílias de multi-genes (codificam os mesmos)

- Alguns constitutivos – comuns em órgãos de armazenamento / reprodução

- Outros produzidos em resposta ao ataque de patógenos – ex. folhas

Inibidores de proteases (IPs) / poligalacturonases (PIPGs)

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Inibidores de proteases: 10 a 90 kDa / apresentam especificidade quanto a classe de

protease inibida (serino proteases, aspártico proteases, metalo proteases, cisteíno

proteases)

- Comum a presença de IPs em sementes / tubérculos: atuam como agentes regulatórios

de proteases endógenas e/ou como mecanismo de proteção contra proteases de insetos

e/ou patógenos

- Inibidores de tripsina (trigo sarraceno) inibiram in vitro proteases de Botrytis cinerea

Inibidores de proteases (IPs) / poligalacturonases (PIPGs)

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Inibidores de proteases: 10 a 90 kDa / apresentam especificidade quanto a classe de

protease inibida (serino proteases, aspártico proteases, metalo proteases, cisteíno

proteases)

- Comum a presença de IPs em sementes / tubérculos: atuam como agentes regulatórios

de proteases endógenas e/ou como mecanismo de proteção contra proteases de insetos

e/ou patógenos

- Inibidores de tripsina (trigo sarraceno) inibiram in vitro proteases de Botrytis cinerea

Superexpressão heteróloga de

genes IP de Nicotiana alata em

fumo transgênico

Aumento da resistência

contra B. cinerea

Inibidores de proteases (IPs) / poligalacturonases (PIPGs)

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Inibidores de poligalacturonases: proteínas com domínios ricos em leucina

- Contribuem na resistência das plantas:

a) Pela inibição das poligalacturonases

b) Prolongando a vida de oligômeros (10-13 resíduos de galacturonato)

eliciadores da defesa (HR, lignificação, fitoalexinas)

Inibidores de proteases (IPs) / poligalacturonases (PIPGs)

Proteínas e peptídeos antimicrobianos

- Inibidores de poligalacturonases: proteínas com domínios ricos em leucina

- Contribuem na resistência das plantas:

a) Pela inibição das poligalacturonases

b) Prolongando a vida de oligômeros (10-13 resíduos de galacturonato)

eliciadores da defesa (HR, lignificação, fitoalexinas)

Tomateiro / videira

superexpressando o gene pgip

de pereira

Aumento na atividade

inibitória de PIPG

Diminuição na

suscetibilidade a

Botrytis cinerea

Patógeno x Planta – defesa é o foco da indução de

resistência

Patógeno Planta

Ataque

Defesa