Post on 18-Apr-2015
Genômica e Proteômica
Genômica e Proteômica
O que é Genômica ?
Subdivisão da genética de mapeamento, sequenciamento e análise do funcionamento de genomas inteiros (Thomas Roderick, 1986)
Revista Genômica
1) Estrutural
2) Funcional
Visa a caracterização física do genoma
Caracterização do Transcriptoma (transcritos produzido) Caracterização do Proteoma (proteínas codificadas)
1) Genômica Estrutural
Atribuição de loci a cromossomos
específicos
localização destes loci nos cromossomos
obtenção das sequências
nucleotídicas destes loci
Mapas Cromossômicos: Níveis crescentes de resolução
Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural
Mapeamento Meiótico por Recombinação
Inicialmente utilizava-se marcadores fenotípicos qualitativos
Limitações: - precisa realizar cruzamentos controlados - necessidade de obtenção de um grande número de descendentes
É aplicado principalmente a organismos experimentais (Drosophila, Arabidopsis, Neurospora, etc)
Nestes organismos, existem muitos marcadores fenotípicos já mapeados
Entretanto, intervalos entre marcadores ainda era grande
Intervalos não podiam ser mapeados por análise de ligação pois não haviam outros marcadores nestas regiões
Baseado na análise da frequência de recombinantes
Genômica e Proteômica
Marcadores Moleculares
Sítio de heterozigose para algum tipo de variação neutra de DNA Preenchem os intervalos entre os marcadores fenotípicos
RFLPs (Restriction Fragment-Length Polymorphisms)
Minissatélite
Microssatélite
RAPDs (Randonly Amplified Polymorphic DNAs)
AFLPs (Amplified Fragment-Length Polymorphisms)
SSCPs (Single-Strand Conformational Polymorphisms)
DGGEs (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
SNPs (Single Nucleotide Polymorphysms)
1) Genômica Estrutural
Mapeamento Meiótico por Recombinação
Ex. 1: Uso de marcadores Microssatélite
Genômica e Proteômica
1) Genômica Estrutural
Posicionamento de loci em Mapas Citológicos:
Hibridização in situ
Marcação com sonda radioativa (cromossomo politênico de
Drosophila)
Marcação com sonda fluorescente – FISH
(Cromossomo humano 11)
Mapeamento Físico
É assim chamado pois é obtido pela manipulação direta de fragmentos de DNA, material físico do genoma
Meta: identificar um conjunto de fragmentos clonados superpostos que englobem todo o cromossomo ou o genoma
Biblioteca genômica
RFLP
Grupos superpostos de clones (contigs)
Clones
1) Genômica Estrutural
Genômica e Proteômica
Mapeamento Físico
Ordenamento dos clones por clivagem com enzimas de restrição
1) Genômica Estrutural
Marcação com sonda fluorescente - FISH
Mapa Citológico cromossomo 11
Ordenamento dos clones por FISH
Mapa Citológico cromossomo 11
Marcação com sonda fluorescente – FISH(Cromossomo humano 11)
Mapeamento Físico: Ordenamento por FISH
1) Genômica Estrutural
Genômica e Proteômica
Mapa de Ultra-Estrutura: Sequenciamento
Estratégias:
1) Sequenciamento aleatório de clones:
2) Sequenciamento de clones ordenados
1) Genômica Estrutural
1) Sequenciamento aleatório de clones:
- DNA é fracionado e clonado aleatóriamente
- As pontas dos clones são sequenciadas
- As regiões sequenciadas são usadas para ordenar os clones
2) Sequenciamento de clones ordenados
clones em YAC ordenados
subclonagem em BACs
BACs são novamente ordenados (STS)
subclonagem de inserções menores
sequenciamento aleatório dos clones
Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional
Dados de sequências em larga escala são o começo da genômica funcional
Algumas das análises que podem ser feitas:
a) Caracterização do proteoma por análise de ORFs
b) Perturbação gênica por nocaute
c) Silenciamento gênico por Interferência do RNA
d) Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido
e) Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA
f) Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas
a) Caracterização do proteoma por análise de ORF (sequências abertas de leitura)
Softwares de previsão analisam as sequências de DNA
- Examinam os 6 possíveis quadros de leitura
- Buscam sequências com códons de início e término de tradução
- Análise da função da ORF através da busca por sequências homólogas em bancos de dados
Ex.: Distribuição provisória dos genes pode ser deduzida
Genômica e Proteômica
b) Perturbação gênica por nocaute
Investiga a função da ORF Inativação do gene (nocaute) por mutagenese in vitro procura de qualquer fenótipo mutante Mais da metade das ORFs inativadas não apresentam efeitos fenotípicos
c) Silenciamento gênico por interferência do RNA (RNAi)
Investiga a função da ORF Duplas fitas de RNA são reconhecidas e clivadas. Silencia o gene procura de qualquer fenótipo mutante
2) Genômica Funcional
Genômica e Proteômica
2) Genômica Funcional
d) Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido
Investiga a interação entre proteínas
Proteína GAL4 de leveduras tem 2 domínios: a) ligação ao DNA b) ativação
Genômica e Proteômica
Avalia a expressão gênica em organismos, tecidos ou células em diferentes situações fisiológicas ou patológica
Analisa o nível de expressão de milhares de genes simultaneamente
Necessita confirmação posterior por Northern-blotting ou RT-PCR Quantitativo.
e) Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA
2) Genômica Funcional
Genômica e Proteômica
Fusão traducional entre o gene de interesse e a proteína GFP
Monitora a sintese e localização de proteínas específicas in vivo
f) Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas
2) Genômica Funcional