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Centro Estadual de Educação Tecnológica Paula Souza
Governo do Estado de São Paulo
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba
Curso Superior em Sistemas Biomédicos
WEIJUN YU
PADRONIZAÇÃO DO ENSAIO COMETA PARA CÉLULAS VEGETAIS DE
Tradescantia pallida
SOROCABA
2º Semestre/2016
INTRODUÇÃO
O Ensaio do Cometa, ou Eletroforese em Gel de Célula Única, é um método de
estudo genotoxicológico sensível, que avalia danos ao DNA de células individuais e
possibilita quantificar quebras da fita. As células embebidas em agarose sobre uma
lâmina de microscópio são lisadas com detergente e sal elevado, para formar nucleóides
contendo laços de DNA superenrolados ligados à matriz nuclear. A eletroforese em alto
pH resulta em estruturas semelhantes a cometas, que podem ser observados por
microscopia de fluorescência, quando o corante for brometo de etídio (LIMAN, 2013) ou
em microscópio óptico comum, quando se utiliza a impregnação pela prata (CERDA et al.,
1997). A intensidade da cauda do cometa em relação à cabeça reflete o número de
quebras no DNA. A base provável para isso é que, os anéis contendo uma pausa perdem
seu superenrolamento (“supercoilling”) e tornam-se livres para correr em direção ao
ânodo.
Tradicionalmente, a coloração do material é feita com brometo de etídio e
analisada por microscopia de fluorescência, tendo intensidade proporcional à quantidade
de DNA presente. Porém, essa coloração apresenta alguns fatores negativos, como ação
mutagênica do corante, curta durabilidade da coloração e necessidade de equipamentos
específicos para análise das lâminas. Por esses motivos, mais recentemente, a coloração
por prata vem sendo utilizada como uma alternativa eficaz para o ensaio, demonstrando
alta sensibilidade quando comparada à coloração por brometo de etídio (REINHARDT-
POULIN et al., 2000). Algumas das vantagens são: a análise é feita em microscópio
óptico comum, o método apresenta baixo custo, a coloração do material mantém-se
estável por período prolongado (KIZILIAN et al., 1999; NADIN et al., 2001) e há
confiabilidade para análise da morfologia de cometas associada aos parâmetros de
análise visual (GARCÍA et al., 2004, ANDRADE et al., 2004), possibilitando rápida
obtenção de resultados.
O ensaio tem aplicações em testes de novos produtos químicos, para a
genotoxicidade, monitoramento de contaminação ambiental com genotoxinas,
biomonitorização humana, epidemiologia molecular e investigação fundamentais em
danos e reparo do DNA (COLLINS, 2004). Qualquer tipo celular pode ser avaliado, animal
ou vegetal, bastando que haja presença de núcleo, e uma característica importante do
ensaio é que apenas pequena quantidade de células, pode ser utilizada.
As técnicas do ensaio cometa foram desenvolvidas principalmente por Östling e
Johanson (1984), pela metodologia de eletroforese do DNA em micro-gel, sob condições
neutras; e de Singh e colaboradores (1988), que lhe atribuíram maior sensibilidade
através do uso de soluções alcalinas no método (pH ≥ 13).
Medidas como o comprimento total da “cauda” e a densidade de DNA fornecem
dados indiretos sobre o estado do DNA da amostra (BRIANEZI et al., 2009). Têm sido
considerados dois princípios que determinam o padrão de formação do cometa. O
primeiro é a habilidade de migração dos fragmentos de DNA, que é uma função tanto do
tamanho do DNA quanto do número de fragmentos quebrados que se unirão a
fragmentos maiores do DNA, que podem migrar uma curta distância desde o núcleo. O
outro é a extensão de migração dos fragmentos de DNA, que inicialmente aumenta com o
dano, porém, atinge um máximo, que é definido pelas condições da eletroforese, mas não
pelo tamanho dos fragmentos (FAIRBAIRN et al., 1995).
Comparada com outras técnicas a do cometa apresenta algumas vantagens,
dentre elas: apresenta sensibilidade em apontar baixo nível de danos no DNA,
requerendo baixo número de células por amostras, flexibilidade, baixo custo, fácil
aplicação, habilidade de conduzir estudos utilizando pequenas porções de substâncias e
tempo relativamente curto para a realização de experimentos (TICE et al., 2000).
MATERIAS E MÉTODO
Materiais
Amostra de Raízes de Allium cepa
Cultivo das Amostras de Raizes de Allium cepa
Em duas placas de Petri contendo 100 sementes de Allium cepa cada sobre uma folha
de papel filtro umedecido com 2 ml de água da torneira. A placa é vedada por filme
plástico e colocado em um local fresco e abrigada da luz até a germinação das
sementes (cerca de 2 cm).
Uma das placas contendo as sementes já germinadas é acrescido 2 ml de trifuralina
ou formol e, em seguida encubado por mais 24. Esta será a placa exposta enquanto a
outra será a de controle negativo (LIMAN, 2013).
Figura 2 – (A) Amostra de Allium cepa exposto a trifuralina; (B) Amostra sem exposição.
Fonte: Oliveira, 2015.
Preparo das Amostra de Raízes de Allium cepa
As raízes são cortadas com um bisturi, descartando as sementes e em seguida
maceradas com 500 l de PBS numa placa de Petri e depois espremidos com a ajuda
de uma lâmina limpa, o líquido resultante é inclinado para escorrer e sugado por uma
pipeta e armazenado num micro tubo (LIMAN, 2013).
Figura 3 - Procedimento para obtenção da amostra. (A) separação das raízes e das sementes; (B) raízes já separadas; (C) raízes trituradas com tampão; (D) mistura de tampão e raízes trituras
escorrendo para ser coleta.
Fonte: Oliveira, 2015
Amostras de Folhas jovens de Tradescantia pallida (Figura 2)
Figura 4 – Folhas jovens de Tradescantia pallida.
Fonte: Autor
Plantio da Tradescantia pallida
As Tradescantia pallida foram cultivados em vasos (22 cm de diâmetro e 17 cm de
altura) (Figura 3) na área externa do laboratório de Ecotoxicologia do NEPA da Fatec –
Sorocaba, utilizando substrato orgânico controlado, sendo 1:4 de vermiculita, 1:4
húmus de minhoca e 1:2 de terra vegetal.
Figura 5 – Vaso de Tradescantia pallida
Fonte: Autor
Preparo das AmostrasSegundo o protocolo de LIMAN (2013), a
amostra deve ser macerada com 200l de PBS. Enquanto no artigo de LEITE (2013)
as folhas jovens devem ser colhidas, lavadas em água corrente e secas em
temperatura ambiente. Após estes processos, as folhas são maceradas com 5 ml de
PBS acrescido de EDTA e peneirado.
*Observação: quanto mais macerar melhor será a visualização das células.
Reagentes
Ácido Acético;
Agarose Ponto de Fusão Normal (APFN);
Agarose Low Melting Point (Baixo Ponto de Fusão) (ABPF);
Carbonato de Sódio;
DMSO;
EDTA;
Formol;
Glicerina (Glicerol);
H2Od (Água destilada e deionizada);
HCL (Ácido clorídrico);
MgCl2 (Cloreto de Magnésio);
N-Lauroyl-Sarcosine;
NaCL (Cloreto de Sódio);
NaOH (Hidróxido de Sódio);
Nitrato de Amônio;
Nitrato de Prata;
Sulfato de zinco Heptahidratado;
Tris;
Triton X-100;
Soluções
Solução de Lise (Estoque) - (Protocolo de SINGH et al., 1988)
Tabela 1 – solução de Lise (estoque)
Reagente/Solução Quantidade
NaCL 146,1 g (2,5M)
EDTA 37,2 g (100mM)
Tris 1,2 g (10 mM)
N-lauroyl-sarcosine 10 g (1%)
H2Od 1000 ml (q.s.p.)
Preparo:
Ajustar o pH para 10, antes de colocar o N-lauroyl-sarcosine;
Completar para 1000 ml com H2od.;
Conservar em temperatura ambiente, abrigada da luz.
Solução de Lise (Uso) – (Protocolo de SINGH et al., 1988)
Tabela 2 – Solução de Lise (uso)
Reagente / Solução Quantidade
Triton - X 100 1ml DMSO 10 ml Solução de Lise (estoque) 100 ml (q.s.p.)
Preparo:
Essa solução deve ser feita na hora do uso;
Deve ser colocada na geladeira até atingir no mínimo 4°C.
Solução de Lise – (Protocolo de LIMAN, 2013)
Tabela 3 – Solução de Lise
Reagente/Solução Quantidade
NaCl 14.61 g
NaOH 0,3 g H2Od 250 ml
Preparo:
Esta solução deve estar em pH alcalino, aproximadamente 12,3;
Deve ser armazenada na geladeira.
Solução de EDTA (A)
Tabela 4 – Solução de EDTA (A)
Reagente/Solução Quantidade
EDTA 14,89 g
H2Od 200 ml (q.s.p.)
Preparo:
O pH deve ser ajustado para 10 com HCl;
Consevar em temperatura ambiente.
Solução de NaOH (B)
Tabela 5 – Solução de NaOH (B)
Reagente/Solução Quantidade
NaOH 200 g
H2Od 500 ml (q.s.p.)
Preparo:
Completar em 500 ml com água destilada;
Conservar em temperatura ambiente, abrigada da luz.
Solução de Eletroforese – (Protocolo de SINGH et al., 1988)
Deve-se fazer separadas as soluções: A (EDTA) e B (NaOH);
Em balão volumétrico, reagir 5 mL de solução A com 30 mL de solução B,
completando para 1L com H2O destilada;
O pH deve ser ajustado para >13 com NaOH.
Solução de Eletroforese – (Protocolo de LIMAN, 2013)
Tabela 6 – Solução de Eletroforese
Reagente/Solução Quantidade
EDTA 0,219 g
NaOH 0,6 g
H2Od 500 ml
Preparo:
Esta solução deve ter pH alcalino, aproximadamente 12,3;
Deve ser armazenada na geladeira.
Solução de Neutralização
Tabela 7 – Solução de Neutralização
Reagente/Solução Quantidade
Tris 48,5 g (0,4 M)
H2Od 1000 ml (q.s.p.)
Preparo:
O pH deve ser ajustado para 7,5 com HCl ou NaOH;
Conservar em temperatura ambiente abrigada da luz.
Agarose – Ponto de Fusão Normal – 1,0%
Tabela 8 – Agarose de Ponto de Fusão Normal – 1,0%
Reagente/Solução Quantidade
Agarose PFN 200 mg
PBS (livre de Ca++ e 20 ml
Mg++) ou Tris – MgCl2
Preparo:
Diluir a Agarose de Ponto de Fusão Normal, deixando-a ferver por três vezes no
micro-ondas.
Ponto de Fusão Normal – 1,5%
Tabela 9 – Agarose de Ponto de Fusão Normal – 1,5%
Reagente/Solução Quantidade
Agarose PFN 300 mg PBS (livre de Ca++ e Mg++) ou Tris – MgCl2 20 ml
Preparo:
Diluir a Agarose de Ponto de Fusão Normal, deixando-a ferver por três vezes no
micro-ondas.
Agarose – Low Melting Point (Baixo Ponto de fusão) – 0,5%
Tabela 10 – Agarose Low Melting Point (Baixo Ponto de Fusão) – 0,5%
Reagente/Solução Quantidade
Agarose LMP 100 mg PBS (livre de Ca++ e Mg++) ou Tris – MgCl2 20 ml
Preparo:
Diluir a Agarose Low Melting Point, deixando-a ferver por três vezes no micro-ondas,
até que se dissolva por completo.
Agarose – Low Melting Point (Baixo Ponto de fusão) – 0,8%
Tabela 11 – Agarose Low Melting Point – 0,8%
Reagente/Solução Quantidade
Agarose LMP 160 mg PBS (livre de Ca++ e Mg++) ou Tris – MgCl2 20 ml
Preparo:
Diluir a Agarose Low Melting Point, deixando-a ferver por três vezes no micro-ondas, até que se dissolva por completo.
Tampão PBS (livre de Ca++ e Mg++) – (Protocolo de SINGH et al.,
1988)
Tabela 12 – Tampão Fosfato Salina (PBS) (Livre de Ca++
e Mg++
)
Reagente/Solução Quantidade
KCl 0,2 g
(74,55M)
KH2HPO4 0,2 g
(136,09M)
NaCl 8,0 g
(58,44M)
Na2HPO4 1,15 g
(141,96M)
H2Od 1000 ml (q.s.p.)
Preparo:
Acertar o pH em 7,4. Estocar na geladeira.
Tampão PBS acrescido de EDTA – (LEITE, 2013)
Tabela 13 - Tampão PBS acrescida de EDTA
Reagente/Solução Quantidade PBS (livre de Ca++
e Mg++) ou Tris – MgCl2 20 ml
EDTA 2,72 g
Preparo:
Suspender o EDTA em PBS num agitador magnético até ficar homogêneo.
Tampão Tris- MgCl2 – (Protocolo de LIMAN, 2013)
Tabela 14 – Tris-MgCl2
Reagente/Solução Quantidade
Tris 6,055 g
MgCl2 0,203 g
H2Od 250 ml
Preparo:
Acertar o pH em 7,4. Estocar na geladeira.
Solução Fixadora
Tabela 15 – Solução Fixadora
Reagente/Solução Quantidade Ácido Tricloroacético 150 g Sulfato de Zinco Heptahidratado 50 g
Glicerol 50 ml
H2Od 1000 ml (q.s.p.)
Preparo:
Conservar em temperatura ambiente, abrigada da luz.
Soluções de Coloração
Tabela 16 – Solução de Coloração “A” (Estoque)
Reagente/Solução Carbonato de Sódio 50 g
H2Od 1000 ml (q.s.p.)
Preparo:
Conservar em temperatura ambiente, abrigada da luz.
Tabela 17 – Solução de Coloração “B” (Estoque)
Reagente/Solução Quantidade
Nitrato de Amônio 1 g
Nitrato de Prata 1 g Ácido Tungstosilícico 2,5 g
Formol 1,5 ml
H2Od 1000 ml (q.s.p.)
Preparo:
Conservar em temperatura ambiente, abrigada da luz.
Para o preparo da Solução de Coloração adicionar:
53 mL da “A” com;
27 mL da “B” em cada cuba (que deve ser coberta com papel alumínio).
Solução de Parada
Tabela 18 – Solução de Parada
Reagente/Solução Quantidade
Ácido Acético 10 ml
H2Od 1000 ml (q.s.p.)
Observação:
Conservar em temperatura ambiente, abrigada da luz.
Aparelhos
Agitador magnético e aquecedor (Marca: Nova, modelo:NI 1104);
Balança de Precisão (Marca: AND, modelo: HR-200);
Cuba de Eletroforese (Marca: Kasvi; modelo: K33-10H)
Fonte de Eletroforese (Marca Kasvi);
Fonte Elétrica “comum” (Marca; Kenntech; modelo: KPS-303);
Micro-ondas (Marca Eletrolux, modelo: MAG41);
Microscópio (Marca Zeiss, modelo: Primo Star);
PHmetro (Marca Jenway, modelo: 3510 pH Meter).
Vidrarias
Balão Volumétrico;
Lâminas fosca lapidada (Precision Glass Line);
Lamínulas para microscopia (Precision Glass Line);
Pipeta Automática (Labmate Soft);
Proveta;
Placa de Petri.
Outros
Gelo;
Gral com pistilo;
Filtro de Papel;
Papel Alumínio;
Peneira.
Método
Preparo das Lâminas
As lâminas foram cobertas com uma camada de agarose (ponto de fusão normal) com
1% ou 1,5% de concentração em PBS (procotolo de Singh et al., 1988), ou em
Tampão Tris- MgCl2 (protocolo de Liman, 2013), por cerca de 24 horas antes do
experimento ser realizado. Foram testadas duas concentrações de agarose a fim de
observar qual delas resultaria em melhor preparação para a corrida eletroforética.
Após a obtenção da amostra foram misturados 20μL desta preparação e 100μL de
Agarose Low Melting Point (ABPF) (protocolo de Liman, 2013). Em seguida transferiu-
se 100μL dessa mistura para a lâmina e cobriu-se com uma lamínula para conter o
material sobre a lâmina, numa fina camada.
Em seguida as lâminas ficaram na geladeira por cerca de 20 minutos para que a ABPF
pudesse solidificar sobre a lâmina. As lamínulas foram retiradas após o endurecimento
da ABPF, cuidadosa e lentamente a fim evitar a retirada do material.
Lise
Depois de retirar as lamínulas das lâminas e com o material incluído na ABPF, deixou-
se em solução de lise (uso) (SINGH et al., 1988) ou solução de lise (LIMAN, 2013) por
1 hora dentro da geladeira. Nesta etapa, a solução de lise alcalina deve romper as
membranas celulares para expor o material genético.
Após isso, as lâminas foram lavadas por 5 minutos com solução de neutralização ou
PBS. A solução utilizada nesta fase, tem o objetivo de neutralizar a solução de lise que
tem pH 10, que é bastante alcalino. Assim, este procedimento é responsável por
limitar o processo de lise.
Eletroforese
Seguindo protocolo de Singh et al., 1988, as lâminas foram colocadas na cuba de
eletroforese e deixar descansaram em solução de eletroforese por 20 minutos. E
seguindo o protocolo de LIMAN (2013), as lâminas foram deixadas na cuba de
eletroforese, descansando em solução de eletroforese (LIMAN, 2013) por 1 hora. A
solução de eletroforese é rica em íons, os quais são responsáveis pela hidrólise da
água, que por sua vez permite a troca entre elétrons e íons.
Em seguida ligou-se a fonte de eletroforese com 300 mA e 36 V seguindo o protocolo
de Singh et al. (1988), e pelo protocolo de Liman (2013) é necessário de 25 V, ambos
por 20 minutos. Colocar a cuba de eletroforese no gelo para proteger o material
genético da desnaturação, decorrente da energia térmica gerada pela corrente elétrica.
Após a eletroforese lavou-se as lâminas por 3 vezes de 5 minutos com solução de
neutralização e 2 vezes com H2Od, respectivamente. Colocou-se as lâminas em estufa
a 37 °C por uma hora e meia (1,5 h) para secagem. Se for mais conveniente, pode-se
deixar as lâminas secando à temperatura ambiente, por 24 horas.
Após este passo, as lâminas foram deixadas por 10 minutos em solução fixadora e
lavadas 3 vezes com H2Od. E novamente levadas para estufa de secagem a 37°C por
uma hora e meia. Após secas, reidratadas por 5 minutos com H2Od.
Figura 7 – Cuba de eletroforese contendo as amostras.
Fonte: Autor
Figura 8 – Migração fragmentos de acordo com o peso molecular.
Fonte: Kasvi, 2016.
Coloração
Durante o procedimento de coloração as luzes do laboratório foram apagadas a fim de
impedir a oxidação da prata presente na solução de coloração (solução B) e também
de quebras adicionais no DNA ou RNA. A solução de coloração foi feita com 53 mL da
solução de coloração “A” com 27 mL da solução de coloração “B”, que foram
misturadas diretamente num recipiente, o mesmo onde as lâminas devem estar
alocadas. Esse recipiente deve ser coberto com papel alumínio para evitar o contato
da solução de coloração com a luz. Deixar as lâminas por 35 minutos em solução de
coloração. Em seguida, lavar por 3 vezes com H2Od, deixar em solução de parada por
5 minutos e lavar novamente 3 vezes com H2Od.
As lâminas foram secas em temperatura ambiente para em seguida observar num
microscópio óptico comum (LIMAN, 2013).
Análise das Lâminas
As lâminas devem ser analisadas com um microscópio óptico, que permite a
visualização das seguintes imagens microscópicas: com contorno circular (sem danos
no DNA) ou estruturas em forma de “cometa” (com danos no DNA).
As células podem ser classificadas em cinco categorias (0-4) correspondente às
seguintes quantidades de danos na cauda do DNA:
Nível 0 → sem danos (<5%)
Nível 1 → baixo nível de danos (5-20%)
Nível 2 → médio nível de danos (20-40%)
Nível 3 → alto nível de danos (40-95%)
Nível 4 → dano total (>95%)
Para cada lâmina, 50 núcleos devem ser escolhidos aleatoriamente e analisados
utilizando um microscópio óptico comum (LIMAN, 2013).
Figura 9: Níveis de cometa
Fonte: Singh, 1988.
RESULTADO
O objetivo do presente trabalho foi realizar a padronização do teste do Cometa
para células vegetais de Tradescantia pallida, afim de estabelecer um protocolo para
avaliação da genotoxicidade nestas células, acrescentando mais uma ferramenta aos
protocolos já estabelecidos neste laboratório.
O desenvolvimento do estudo fundamentou-se em protocolos descritos por vários
autores. Os resultados melhores obtidos foram, na maior parte, baseados no protocolo de
Liman (2013), que é originalmente aplicado a células de Allium cepa. Apesar disso, os
primeiros resultados utilizando células de Allium cepa, em nossas condições de
laboratório, foram frustrantes, pois não havia células nas lâminas e pôde-se observar uma
grande perda do material devido a problemas na fixação da amostra na agarose low
melting, que é o primeiro passo do ensaio.
Um novo ensaio foi realizado, atentando-se para este passo, mas novamente
houve muita perda de material durante as etapas de lise e de incubação em solução de
eletroforese. Desta vez levantou-se a hipótese de que o excesso de tempo de imersão
das lâminas nas etapas de lise alcalina ou na incubação em solução de eletroforese,
também bastante alcalina, poderia estar prejudicando o experimento. Pensando nessa
possibilidade recorreu-se a outras publicações a fim de, se buscar soluções de modo que,
reduziu-se este tempo de incubação de 1 hora para 20 minutos, conforme recomendação
de Singh (1988). Com esta alteração, notou-se alguma melhora na fixação da amostra e,
não houve interferência com as características da corrida. Contudo a alteração não foi
efetiva o suficiente para solucionar o problema. A falha poderia ter mais de uma causa e,
a partir disso buscamos novamente, outras variações nos procedimentos anteriores, como,
o procedimento de preparo da agarose e das lâminas.
Com o intuito de resolver essas contradições, observou-se que no artigo de Leite
(2013), recomendava-se uma concentração de ágar low melting (0,8%) maior que o de
Liman (2013) (0,5%), o que em tese, poderia melhorar a fixação, pois o aumento da
concentração, aumenta a densidade da preparação. Com a realização desta alteração
confirmou-se a melhora na fixação e, com a finalidade de melhorar mais ainda a fixação
evitando qualquer desprendimento do amterial, foi acrescentada uma camada extra de
agarose sobre a amostra já solidificada, formando um “sanduíche” e também foi
aumentado o tempo de refrigeração das amostras de 20min conforme o protocolo de
Liman (2013) para 30min. tanto na primeira camada quanto na camada extra. Deste modo,
estas modificações foram padronizadas para os experimentos seguintes.
Com essas alterações constatou-se uma melhora significativa em relação aos
resultados dos primeiros experimentos nos quais havia grandes perdas das amostras.
Entretanto outros problemas persistiam, como o reduzido número de células encontrado
nas lâminas após a coloração, quando se comparava com o mesmo procedimento
realizado com amostras de sangue, onde nota-se abundância de células. Este fato,
descarta qualquer possibilidade de falha no procedimento da corrida de eletroforese.
Pensou-se então, na possibilidade de falhas durante preparação das amostras, o
que poderia afetar a obtenção de número adequado de células. Deste modo, observando-
se o artigo de Leite (2013), constatou-se que a preparação da amostra era distinta do
modo de preparo de Liman (2013), uma vez que Liman descrevia a amostra macerada
com 5l de PBS, e Leite com 5ml de PBS acrescido de EDTA. Adotando-se esta alteração
percebeu-se maior número de células fixadas. Foi também testada a aplicação da
centrifugação das amostras, a fim de concentrar a quantidade de células, mas não se
obteve sucesso, portanto, esta alteração foi descartada, voltando ao método anterior.
Com essas últimas alterações bem-sucedidas, pode-se afirmar que a padronização
foi alcançada satisfatoriamente, já que foi possível visualizar nucleóides e cometas de
células de Tradescantia pallida nas lâminas coradas pela prata, ainda não se conseguiu
obter lâminas com número suficiente de nucleóides para quantificação.
A pesquisa deve continuar para se refinar o protocolo e finalmente, se obter o
resultado satisfatório, quanto ao número de células.
Figura 10 – (A; B; C) Nucleóides de Tradescantia pallida isolados sem danos (10X); (D) Cometa e nucleóide sem danos isolado (10X). A seta aponta cometa.
Fonte: Autor
CONCLUSÃO
O processo de padronização do ensaio do cometa com células vegetais
apresenta complicações relacionadas às sutilezas da técnica como, a fixação e a
preparação das amostras as quais devem ser rigorosamente observadas na condução
dos experimentos.
A padronização do ensaio do cometa com células vegetais de Tradescantia
pallida foi alcançada satisfatoriamente, porém não foi possível realizar a análise
quantitativa e será necessário a realização de mais experimentos para o aprimoramento
da técnica.
REFERÊNCIAS
ARAÚJO, M.M., 2008 apud LEITE, A.S.; ZANDONATO, V. V.; FLUMINHAN, A.
Avaliaçãoda Genotoxicidade Provocada por Fatores Ambientais em Tradescantia pallida
cv purpúrea através do Ensaio Cometa. Fórum Ambiental da Alta Paulista, v. 9, n.11,
2013, p. 399-417.
BATALHA, J.R.F.; GUIMARÃES, E.T.; LOBO, D.J.A.; LICHTENFELS, A.J.F.C.; DEUR, T.;
CARVALHO, H.A.; ALVES, E.S.; DOMINGOS, M.; RODRIGUES, G.S.; SALDIVA, P.N.H.
Exploring the clastogenic effects of air pollution in São Paulo (Brazil) using the
Tradescantia micronuclei assay. Mutation Research 426:229-232, 1999.
BETTI, C.; DAVINI, T.; GIANNESI, L.; LOPRIENO, N.; BARALE, R. comparative studies
by comet test and SCE in human lymphocytes from 200 healthy subjects. Mutation
Research, v. 343, p. 201-207. 1995.
BRIANEZI, G.; DE CAMARGO, J. L. V.; MIOT, H. A. Desenvolvimento e validação de
técnica quantitativa de análise de imagem para avaliação do teste do cometa corado
pela prata. Bras Patol Med Lab, Rio de Janeiro, v. 45, n. 4, p. 325-334, ago 2009.
CENTRO PAULA SOUZA. Histórico da Instituição. Disponível em:
<http://www.cps.sp.gov.br/quem-somos/perfil-historico/>. Acesso em: 20 de agosto de
2016.
CERDA, H.; DELINCÉE, H.; HAINE, H.; RUPP, H.(1997). The DNA‘comet assay’ as a
rapid screening technique to control irradiated food. Mutat.Res. 375, 167–181.
doi:10.1016/S0027-5107(97)00012-2.
CHAPMAN, P. M. Emerging substances — Emerging problems? Environmental
Toxicology and Chemistry, v.25, n.6, p.1445-1447. 2006. Disponível em: <
http://ecologia.ib.usp.br/portal/index.php?option=com_content&view=article&id=143&Itemi
d=356>. Acesso em: 19 de mar. 2016
CHAPMAN, P. M. Integrating toxicology and ecology: putting the "eco" into
ecotoxicology. Marine Pollution Bulletim, v.44, p.7-15. 2002. Disponível em: <
http://ecologia.ib.usp.br/portal/index.php?option=com_content&view=article&id=143&Itemi
d=356>. Acesso em: 19 de mar. 2016
COTELLE, S.; FÉRARD, J.F. Comet Assay in Genetic Ecotoxicology: A Review.
Environment and Molecular Mutagenesis, v. 34, p. 346-255. 1999.
COLLINS, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles,
applications, and limitations. Mol Biotechnol, v. 26, n.3, p. 249-61, mar. 2004.
DELINCÉE, H., 1996. CERDA, H.; DELINCÉE, H.; RUPP, H., 1997. CERDA, H.; KOPPEN,
G., 1998 APUD LEITE, A.S.; ZANDONATO, V. V.; FLUMINHAN, A. Avaliaçãoda
Genotoxicidade Provocada por Fatores Ambientais em Tradescantia pallida cv purpúrea
através do Ensaio Cometa. Fórum Ambiental da Alta Paulista, v. 9, n.11, 2013, p. 399-
417.
DOUST, J.L.; SCHMIDT, M.; DOUST, L.L. Biological assessment of aquatic pollution: a
review, with emphasis on plants as biomonitors. Biol Rev Camb Philos Soc. 1994
May;69(2):147-86.
FAIRBAIRN, D.W.; OLIVE, P.L.; O’NEILL, K.L. The comet Assay: a comprehensive review.
Mutation Research, v. 339, p. 37-59, 1995.
FATEC SOROCABA. A Fatec Sorocaba, 2016. Disponível em:
<http://www.fatecsorocaba.edu.br/afatec.asp>. Acesso em: 17 de agosto de 2016
GARCÍA, O.; MANDINA, T.; LAMADRID, A. I.; DIAZ, A.; REMIGIO, A.; GONZALEZ, Y.;
PILOTO, J.; GONZALEZ, J. E.; ALVAREZ, A. 2004. Sensitivity and variability of visual
scoring in the comet assay: Results of an inter-laboratory scoring exercise with the
use of silver staining. Mutat. Res.-Fundam. Mol. Mech. Mutag., 556(1-2): 25-34.
GUIMARÃES, E.T.; DOMINGOS, M.; ALVES, E.S.; CALDINI JR, N.; LOBO, D.J.A.;
LICHTENFELS, A.J.F.C.; SALDIVA, P.H.N. Detection of the genotoxicity of air
pollutants in and around the city of São Paulo (Brazil) with the
Tradescantiamicronucleus (Tra- MCN) assay. Environ.Exp.Bot. 44,1-8, 2000.
GONTIJO, A.M.M.C.; TICE, R. Teste do cometa para a detecção de dano no DNA e
reparo em células individualizadas. In: RIBEIRO, R.L.; SALVADORI, D.M.F.; MARQUES,
E.K. (Org.). Mutagênese Ambiental, Canoas; ULBRA, p. 173-200, 2003.
JHA, A.N. Ecotoxicological applications and significance of the comet assay
Mutagenesis. 2008 May;23(3):207-21. doi: 10.1093/mutage/gen014. Epub 2008 Apr 1.
KAPPEL, B. P., 2007 apud LEITE, A.S.; ZANDONATO, V. V.; FLUMINHAN, A.
Avaliaçãoda Genotoxicidade Provocada por Fatores Ambientais em Tradescantia pallida
cv purpúrea através do Ensaio Cometa. Fórum Ambiental da Alta Paulista, v. 9, n.11,
2013, p. 399-417.
KASVI. Pricípios da Técnica de Eletroforese. Disponível em:
<http://www.kasvi.com.br/principios-da-tecnica-de-eletroforese/>. Acesso em: 20 de
agosto de 2016.
KIZILIAN, N.; WILKINS, R. C.; REINHARDT, P.; FERRAROTTO, C.; MCLEAN, J. R. N.;
MCNAMEE, J. P. 1999. Silver-stained comet assay for detection of apoptosis.
Biotechniques, 27: 926-930.
LAU, A.H., 2002 apud LEITE, A.S.; ZANDONATO, V. V.; FLUMINHAN, A. Avaliaçãoda
Genotoxicidade Provocada por Fatores Ambientais em Tradescantia pallida cv purpúrea
através do Ensaio Cometa. Fórum Ambiental da Alta Paulista, v. 9, n.11, 2013, p. 399-
417.
LEITE, A.S.; ZANDONATO, V. V.; FLUMINHAN, A. Avaliaçãoda Genotoxicidade
Provocada por Fatores Ambientais em Tradescantia pallida cv purpúrea através do Ensaio
Cometa. Fórum Ambiental da Alta Paulista, v. 9, n.11, 2013, p. 399-417.
LIMAN, R. Genotoxic effects of Bismuth (III) oxide nanoparticles by Allium and
Comet assay. Chemosphere. 2013 Sep; 93(2):269-73. doi:
10.1016/j.chemosphere.2013.04.076. Epub 2013 Jun 20.
MARSHAK, A. 1937. The effect of X-rays on chromosomes in mitosis. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 23, 362.
MAURICI, D.; AARDEMA, M.; CORVI, R.; KLEBER, M.; KRUL, C.; LAURENT, C.;
LOPRIENO, N.; PASANEN, M.; PFUHLER, S.; PHILLIPS, B.; SABBIONI, E.; SANNER, T.;
VANPARYS, P. (2005) Genotoxicity and mutagenicity. Altern Lab Anim 33(Suppl
1):117–130
MARSHAK, A. 1937. The effect of X-rays on chromosomes in mitosis. Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 23, 362.
NADIN, S. B.; VARGAS-ROIG, L. M.; CIOCCA, D. R. 2001. A silver staining method for
single-cell gel assay. J. Histochem. Cytochem., 49(9): 1183-1186.
READ, J. 1959. Radiation Biology of Vicia faba in Relation to the General Problem. C.C.
Thomas, Springfield.
OLIVEIRA, D. Padronização do Ensaio Cometa para Anãlise de Células vegetais de
Allium cepa. Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, Sorocaba, 2015.
OSTLING, O.; JOHANSON, K.J., 1984 apud LEITE, A.S.; ZANDONATO, V. V.;
FLUMINHAN, A. Avaliaçãoda Genotoxicidade Provocada por Fatores Ambientais em
Tradescantia pallida cv purpúrea através do Ensaio Cometa. Fórum Ambiental da Alta
Paulista, v. 9, n.11, 2013, p. 399-417.
PEDRO, J., 2008 apud LEITE, A.S.; ZANDONATO, V. V.; FLUMINHAN, A. Avaliaçãoda
Genotoxicidade Provocada por Fatores Ambientais em Tradescantia pallida cv purpúrea
através do Ensaio Cometa. Fórum Ambiental da Alta Paulista, v. 9, n.11, 2013, p. 399-
417.
REINHARDT-POULIN, P.; MCLEAN, J. R.; DESLAURIERS, Y.; GORMAN, W.; CABAT, S.;
ROUABHIA, M. 2000. The use of silver-stained “comets” to visualize DNA damage
and repair in normal and Xeroderma pigmentosum fibroblasts after exposure to
simulated solar radiation. J. Photochem. Photobiol. B. Biol., 71(4): 422-425.
RILEY, H.P. 1936. The effect of X-rays on the chromosomes of Tradescantia
gigantea. Cytologia 7, 131 - 142.
ROJAS, E.; LOPEZ, M. C.; VALVERDE, M. 1999. Single cell gel eletrophoresis assay:
methodology and applications. J. Chromatogr. B, 722: 225-254.
SANT’ANNA, E.T.G. Poluição atmosférica urbana na cidade de São Paulo e
mutagênese: avaliação de riscos utilizando bioindicadores vegetais do gênero
SAVÓIA, E.J.L. Potencial de Tradescantia pallida cv. Purpurea para
biomonitoramento da poluição aérea de Santo André- São Paulo, por meio do
bioensaio Trad-MCN e do acúmulo foliar de elementos tóxicos. Dissertação
(Mestrado em Ciências). Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, São Paulo,
2007.
SAVÓIA, E.J.L.; DOMINGOS, M.; GUIMARÃES, E.T.; BRUMATI, F.; SALDIVA, P.H.N.
Biomonitoring genotoxic risks under the urban weather conditions and polluted
atmosphere in Santo André,SP,Brazil, through Trad-MCN bioassay. Ecotoxicology
and Environmental Safety.v 72, p.255-260, 2009.
SILVA, M.D. Delimitação de plantas Tradescantia pallida cv. Purpurea cultivadas na
cidade de São Paulo para indicação de riscos clastogênicos impostos pela poluição
aérea. Tese (Doutorado em ecologia de ecossistemas terrestres). Universidade de São
Paulo, São Paulo. 2005.
SINGH, N.P.; MCCOY, M.T.; TICE, R.R.; SCHNEIDER, E.L. A simple technique for
quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 75(1):184-
91, 1988.
SOUZA, S.A.M. Biotestes na avaliação da fitotoxicidade de extratos aquasos de
plantas medicinais nativas do Rio Grande do Sul. 2005. 89 f. Monografia (Bacharel em
Ciências Biológicas) – Instituto de Biologia. Universidade Federal de Pelotas.
SUMITA, N.M. Avaliação da poluição ambiental da cidade de São Paulo pela análise
elementar em plantas (Tradescantia pallida), por método de ativação com nêutrons.
Tese (Doutorado em Ciências). Faculdade de Medicina. Universidade de São Paulo, São
Paulo, 2002.
SUYAMA, F.; GUIMARÃES, E.T.; LOBO, D.J.; RODRIGUES, G.S.; DOMINGOS, M.;
ALVES, E.S.; CARVALHO, H.A.; SALDIVA, P.H.N. Pollen mother cells of Tradescantia
clone 4430 and Tradescantia pallida var. purpurea are equally sensitive to the
clatogenic effects of X-rays. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 35:
127-129, 2002.
Tradescantia. Tese (Doutorado em Ciências). Faculdade de Medicina, Universidade de
São Paulo, São Paulo, 2003.
TICE, R.R.; AGURELL, E.; ANDERSON, D.; BURLINSON, B.; HARTMANN, A.;
KOBAYASHI, H.; MIYAMAE, Y.; ROJAS, E.; RYU, J.C.E.; SASAKI, Y.F. Single Cell
Gel/Comet Assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.
Environmental and Molecular Mutagenesis, v.35, p.206-221, 2000.
TICE, R. R.; ANDREWS, P. W.; HIRAI, O.; SINGH, N. P. 1991. The single cell gel (SCG)
assay: an electrophoretic technique for the detection of DNA damage in individual
cells. In Witmer,C.R., Snyder,R.R., Jollow,D.J., Kalf,G.F., Kocsis,J.J. and Sipes,I.G. (eds),
Biological Reactive Intermediates IV, Molecular and Cellular Effects and their Impact on
Human Health. Plenum Press, New York, NY, pp. 157–164
VENTURA, B.C. 2004 apud LEITE, A.S.; ZANDONATO, V. V.; FLUMINHAN, A.
Avaliaçãoda Genotoxicidade Provocada por Fatores Ambientais em Tradescantia pallida
cv purpúrea através do Ensaio Cometa. Fórum Ambiental da Alta Paulista, v. 9, n.11,
2013, p. 399-417.
VILLELA, I.V.; OLIVEIRA, I.M.; SILVA, J. HENRIQUES, J.A. DNA damage and repair in
haemolumph cellsof Golden mussel (Limnoperna fortune) exposed to environmental
contaminants. Mutation Research, v. 605, p. 78-86, 2006.
WANG. W.; FREEMARK, K. The use of plants for environmental monitoring and
assessment. Ecotox Environ Safe 30:289–301, 1995.