Introdução à Biologia Molecular

Prof. Leonardo Crema

HISTÓRICO

1865 - GREGOR MENDEL

Estudou cruzamento entre

diferentes tipos de

ervilhas demonstrando

que certas características

físicas dessas plantas

eram transmitidas de

geração para geração

através de “fatores”.

HISTÓRICO

1902 – SUTTON e BOVERI

Padrão de herança dos

“fatores” acompanhava a

segregação dos cromossomos

de células em divisão

1909 – JOHANNSEN

Nomeou as unidades

mendelianas da

hereditariedade “fatores” de

GENES

HISTÓRICO

1915 – THOMAS MORGAN

Concluiu que os genes estavam

organizados de maneira linear nos

cromossomos

Propôs, pela 1ª vez, uma correlação

entre um gene = genótipo e uma

característica física = fenótipo

HISTÓRICO

• 1941 – BEADLE e TATUM

• Demonstraram que os genes

agiam através da regulação de

diferentes eventos químicos

• HIPÓTESE:

UM GENE → UMA ENZIMA

HISTÓRICO

• 1952 –Hershey–Chase

Demonstraram que é o ADN a base

do material genético (e não as

proteínas)

Hershey, A. D., i Chase, M. (1952) Independent functions of viral protein

and nucleic acid in growth of bacteriophage. J Gen Physiol. 36:39-56

HISTÓRICO

1953 – JAMES WATSON e FRANCIS CRICK

Descrição da estrutura física do DNA

baseando-se nos estudos de difração de

raio X de Rosalind Franklin e Maurice

Wilkins e em estudos químicos da

molécula

Modelo da dupla fita proposto foi

fundamental para a compreensão do

mecanismo de transmissão e execução

da informação genética

•1953: Watson and Crick

Estrutura do DNA

HISTÓRICO

1955 – JOE HIN TJIO

Definiu como 46 o número exato

de cromossomos humanos

ARTHUR KORNBERG

Isolou a enzima DNA polimerase da bactéria

E. coli

HISTÓRICO

1957 – CRICK e GAMOV

Dogma Central da

Biologia Molecular

DNA → RNA

→ PROTEÍNA

• 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON

• mRNA é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma

Dogma Central da

Biologia

Molecular

ORGANISMO

CÉLULA

NÚCLEO

CROMOSSOMOS(DNA+PROTEÍNAS)

- Informação das proteínas eRNAs que serão sintetizadaspelas células do organismo aolongo da sua vida.

-Capacidade de se auto-duplicar para originar outras células.

DNA

NOS SERES HUMANOS

1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA

Sequências sucessivas de trêsnucleotídeos do DNA (códon)determinam a sequência deaminoácidos de uma proteína

O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!!

DNA

1. Regulação transcricional

mRNA 2. Regulação no processamento doRNA primário

3. Regulação no transporte do mRNA para o citoplasma

RETÍCULO ENDOPLASMÁTICORUGOSO

4. Regulação dasíntese proteíca

Proteínasintetizada

5. Regulaçãopós-síntese

A CÉLULA

- DIFERENCIAÇÃO- CRESCIMENTO- FUNÇÃO CELULAR- RESPOSTA AO

AMBIENTE

NÚCLEO

DNACromossoma

Gene

Promotor IntronExon

Núcleo

DNA

ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)

Contém toda a informação genética de um organismo

Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatrodiferentes nucleotídeos:

• Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA eRNA

• Timina – encontrada somente no DNA

• Uracila – encontrada somente no RNA

Todos os nucleotídeos

apresentam uma estrutura em

comum:

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS

NUCLEICOS

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS

NUCLEICOS

2 tipos de bases nitrogenadas.

O grupo hidroxil ligado ao carbono3 da pentose de um nucleotídeoforma uma ligação fosfodiéster como fosfato do outro nucleotídeo

ESTRUTURA DOS ÁCIDOS

NUCLEICOS

DNA

• Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estruturade dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fitae as bases projetam-se para o interior da mesma

• As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes dehidrogênio entre as bases, o que contribui para a estabilidade dadupla hélice

. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes dehidrogênio

. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes dehidrogênio

DNA

As fitas do DNA estão dispostas em

direções opostas

Antiparalelismo

Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita

Complementariedade

Durante a replicação do DNA as duas fitas velhas

ou mães servem de molde para cada fita

nova ou filhacomplementar, que está

sendo sintetizada.

Fita nova

Fita velha

Complementariedade

Fatores que estabilizam a dupla hélice:

• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio

• interações iônicas

Entre as bases nitrogenadas

Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+) presentes na solução fisiológica

A Dupla Hélice

Sulco menor

Sulco maior

A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as

proteínas da cromatina

A Dupla Hélice

Proteínas:níveis de complexidade estrutural

O Empacotamento do DNA:a estrutura terciária do DNA

DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-super-helicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)

A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário

A Dupla Hélice

Propriedades Químicas e Físicas do DNA

REPLICAÇÃO DO DNA

Conservativa ou Semiconservativa?

Unidirecional ou Bidirecional?

REPLICAÇÃO

SEMICONSERVATIVA

Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958

• Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio paracrescimento contendo sais de amônia preparados com 15N (nitrogêniopesado – “heavy”) até todo o DNA celular conter o isótopo.

• As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14N(nitrogênio leve – “light”).

• As amostras foram analisadas com gradiente de densidade quesepara as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.

•The Meselson-Stahl experiment

A replicação é semi-conservativa

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

Experimento com SV40 (Simian Virus)

• DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com aenzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único.

• A partir de um “ponto” vai se formando uma bolhachamada bolha de replicação comprovando a existência deum ponto de origem da replicação

Características da origem de replicação:

. estrutura repetitiva

. seqüências ricas em AT

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

ORIGEM Sítio de restrição EcoRI

Cromossomo viral circular

EcoRI

Bolha de replicação

ORIGEM DA REPLICAÇÃO

Biologia – Campbell & Cols.

Procariontes vs Eucariontes

Síntese de DNA em Eucariontes: As “Bolhas de

Replicação”

• Nos eucariontes, a replicaçãorequer “múltiplas origens”,devido ao tamanho de seugenoma. A replicação ébidirecional e, em ambas asfitas, simultânea.

• Este processo gera “bolhas dereplicação”.

Região GênicaÉ a porção que codifica para um

produto final, que pode ser uma cadeia polipeptídica ou

um RNA

O DNA é formado por 2 regiões:

Gênicas Intergênicas

Região IntergênicaÉ a porção regulatória, que

sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a

transcrição gênica, ou que é o ponto de início para a

replicação do DNA

Intergênicas Gênicas

Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

Os mecanismos celulares responsáveis pelareplicação do DNA foram descobertosprimeiramente em bactérias.

A replicação em eucariotos ocorre através deproteínas análogas e com processos semelhantes àreplicação do DNA de E. coli

PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA)

1. DNA Polimerases

2. Endonucleases

3. Helicases

4. Topoisomerases

5. Primases

6. Telomerases

DNA POLIMERASE

• São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênioque ligam as duas fitas do DNA

• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente

• Catalisam a adição de um nucleotídeo no radicalhidroxil da extremidade 3’ da cadeia que está seformando. Desta forma, as fitas só podem crescer nosentido 5’ 3’

Biologia – Campbell & Cols.

DNA Polimerases

• principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo

• requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início –alongamento

• 3 tipos principais : I, II e III; existem pelo menos 11

I : importante no sistema de reparo

III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)

Adição de nucleotídeos

1

2

3

FORQUILHA DE

REPLICAÇÃO

• Fita contínua

“leading”

FORQUILHA DE

REPLICAÇÃO

• Fita descontínua I

“Lagging”

FORQUILHA DE

REPLICAÇÃO

• Fita descontínua II

• “Lagging”

OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO

HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se moverao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATPpara separar as duas fitas da molécula.

SSB (“single-strand-binding”- proteínas de ligação à fita simples) –ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.

PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNAutilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA.

TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fitaque não está sendo replicada.

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

O movimento da forquilha de replicação revela uma fitamolde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’

Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidosopostos

FITA “LEADING” – crescimento segue adireção do movimento da forquilhade replicação

FITA “LAGGING” – crescimento nosentido oposto ao movimento daforquilha de replicação

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

FITA “LEADING” – sintetizada continuadamente a partir de uminiciador na fita molde 3’ 5’

FITA “LAGGING” – sintetizada descontinuadamente a partir demúltiplos iniciadores

• Sítios descobertos no molde da fita “lagging” são copiados empequenos iniciadores de RNA pela primase.

• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando naformação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.

•DNA polimeraseI remove o primer do RNA do fragmento adjacentee preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidospela DNA ligase.

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

PROCESSO DE REPLICAÇÃO

A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua

ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE

MOLÉCULAS LINEARES DE DNA

ENCURTAMENTO DAS EXTREMIDADES DE

MOLÉCULAS LINEARES DE DNA

TELOMERASE

• Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentamseqüências repetitivas em suas extremidades denominadastelômeros

• A síntese da fita “leading” continua até o término da fitamolde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feitapela primase na fita “lagging” não é digerida.

• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempodiminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.

• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.

TELOMERASE

REGULAÇÃO

-única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ;

-afetada pela metilação de DNA

-DAM metilase na (5´) GATC sobre a fita parental

Gene

RNA polimerase

hnRNA

mRNA

Citoplasma

Transcrição

Processamento

Núcleo

Tradução

proteína

O RNA ou ARN

• O açúcar é uma Ribose;

• É formado, geralmente, por uma fita simples que pode enrolar-se;

• Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila.

• Os pareamentos seguem a ordem A-U e G-C).

O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere doDNA em três aspectos básicos:

A-U

U-A

G-C

C-G

A-T

T-A

G-C

C-G

DN

A

RN

A

RNA - É o ácido ribonucléico; possui a função de síntese protéica. O RNA é encontrado no núcleo principalmente no nucléolo, e no citoplasma (ribossomos). Composição química - é formada por ácido fosfórico, pentose (ribose) e pelas bases nitrogenadas ( A, G, C e uracila (U )).

A molécula de DNA é responsável pela formação do RNA. O RNA apresenta-se constituído por um único filamento de nucleotídeo, cuja seqüência de bases é determinada a partir de um molde de DNA.

1-RNA mensageiro (RNAm) - É formando no núcleo tendo como molde uma das fitas de uma molécula de DNA. A produção de um RNAm, cujas bases são complementares as bases de uma das hélices de uma molécula de DNA, recebe o nome de transcrição. Este fenômeno pode ser definido de forma mais simples como sendo a passagem das bases de uma linguagem do DNA para a linguagem de RNAm. EX:

T - A - C - T - G - A - DNA 3 bases correspondem a um aa, e um

! ! ! ! ! ! conjunto de bases uma proteína.

A - U - G - A - C - U RNAm

Códon início códon proteína

aa A aa B

Tipos de RNA

Síntese Protéica

• A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA e inicia a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5’ 3’.

• Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C.

• Ao final da transcrição a RNA-polimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida.

A Transcrição

Observe a complementação de uma fita de DNA para RNA

A T A C A T G G G C T A G A A

UU U U U UGG C C CC AAA

Sempre com a adenina se ligando a uracila e a guanina se ligando a citosina.

DNA

RNA

RNAm

2-RNA transportador (RNAt) - é produzidonos cromossomos a partir de DNAespeciais. É uma molécula cadeia curta, (éo menor RNA) que transporta os aa queestão dispersos no citoplasma até osribossomos. O RNAt tem formato de“folhas de trevo” e contém outros tipos debases, além das comumente encontradasnos outros RNAs. Cada RNAt é capaz dereconhecer um determinado aadeterminado códon, no RNAm. Todo RNAttem um filamento livre de sua moléculacomposta pela seguinte seqüência debases: ACC. É nesse local que ocorre aassociação com o aa. Em cada região damolécula existe uma seqüência de 3 basesdenominadas anticódon, que reconhece aposição do aa no RNAm.

Tipos RNAs (2/2)

RNA TRANSPORTADOR

3-RNA ribossômico (RNAr) é o RNA que ocorre emmaior quantidade nas células. Esse RNA é encontradono nucléolo, onde é produzido, e no citoplasma,associado às proteínas, formando os ribossomos.

Tipos de RNA

• RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a

“mensagem” - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON.

• RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é

responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON.

• RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da

estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.

SÍNTESE DE PROTEÍNAS:

A síntese começa quando ocorre a transcrição das bases de DNA para RNA. Essa transcrição é o código genético. O RNAm formado no núcleo passa para o citoplasma, deslocando-se para os ribossomos. Os RNAtque estão no citoplasma, através de suas moléculas, unem-se ao aa livre levando até o ribossomo. Lá o anticódon do RNAt reconhece no códon do RNAm o aa, que será codificado. Assim, ocorrendo sucessivamente, até dar origem a uma proteína.

Núcleo

DNA RNAm RNAm Transcrição Proteínas TraduçãoNúcleoDNA-RNAm

A síntese completa de uma proteína leva de 20 a 60 seg, e o mesmoRNAm pode ser traduzido por vários ribossomos, que mantêm uma Distância entre si de aproximadamente 80 nucleotídeos.

Os Íntrons e os Éxons

Nos eucariontes, o RNA transcrito pelo gene é normalmente chamado de pré-RNA, no sentido de que ele ainda não está pronto para ser traduzido, produzindo proteínas. O pré-RNA seria, assim uma versão ainda não acabada do RNAm, que precisa ser primeiro processado no núcleo para, em seguida, migrar ao citoplasma.

A

Éxon Íntron Éxon ÉxonÍntron Íntron

Os Íntrons são retirados e os éxons são soldados um ao outro

Síntese Protéica

• O RNAm transcrito no núcleo chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos.

• O ribossomo “lê” o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon.

• O ribossomo se desloca, no sentido 5’3’ e lê o próximo códon.

• Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas.

• Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.

A Tradução

O ribossomo acomoda dois tRNAs carregados

4. Terminação

Dogma Central da Biologia Molecular

• Foi estabelecido em 1956 por Francis Crick.

• Postulava que o sentido da construção das moléculas é sempre de DNA à Proteína – fluxo unidirecional da informação.

• O DNA é o “molde” para formar DNA (replicação) e RNA (transcrição). Este por sua vez é o “molde” para formação das proteínas (tradução).

• Hoje se sabe que, em alguns vírus, o RNA pode replicar-se e, em outros, o RNA pode produzir DNA (transcrição reversa) utilizando o maquinário genético da célula-hospedeira.

• Porém, não é possível se sintetizar ácidos nucléicos a partir de proteínas.

• Os novos conhecimentos permitiram que se ampliasse o dogma central sem contudo perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico à proteína.

• Projeto Proteômico.

Diferenças entre RNA e DNA

O RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas.

Ele é formado por uma cadeia de ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma base nitrogenada (veja abaixo).

As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o último seja mais estável do que o primeiro. O RNA é formado por uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel simples) é diferente da do DNA (uracila ao invés de timina), além disso o açucar do RNA é a ribose invés da desoxirribose do DNA.

DNA

RNA

Os processos de síntese de proteínas na célula são controlados pelo metabolismo de controle.As duas

principais personagens do metabolismo de controle são as moléculas de DNA e RNA. O DNA (ácido

desoxirribonucléico) é o patrimônio genético, que contém as instruções para a síntese de todas as

proteínas que a célula é capaz de realizar. O RNA atua como mensageiro (RNA mensageiro) entre o

DNA e o ribossomo, local de síntese de proteínas.

DNA (ácido desoxirribonucléico) RNA (ácido ribonucléico)

Se localiza somente no núcleo Se localiza no núcleo e no citoplasma

Apresenta forma de dupla hélice com duas fitas

Apresenta apenas uma fita

É formado com a pentose (açúcar) desoxirribose

É formado com a pentose ribose

Bases nitrogenadas participantes: A, T, C, G

Bases nitrogenadas participantes: A, U, C, G

DNA e RNA

Código Genético

Codon que dá origem à síntese dequalquer proteína

Código Genético – correspondência entre cada tripleto (codon) de RNA e cada um dos 20 aminoácidos habituais das proteínas (desde 1964)No código genético há 64 trincas possíveis, apenas 61 delas correspondem a aminoácidos. As tres trincas restantes são usadas como pontuação; elas dizem à célula o ponto em que termina a codificação de cada proteína.

Genoma Conjunto de moléculas de DNA

Disciplina de Biologia Molecular(60 h)

Prof. Leonardo Crema

Ementa

• EMENTA:

1) Mecanismos moleculares da replicação doDNA, transcrição e tradução gênica.Características do código genético. Tipos demutações. Polimorfismos. Organização dogenoma. Técnicas de biologia molecular.Bioinformática. Genética forense. Clonagem.Transgenia. Tipos de células tronco. PráticaProfissional Integrada.

Bibliografia Básica

• ALBERTS, B.; et al. Biologia molecular da célula. 5 ed. Porto Alegre: Artmed. 2010.

• GRIFFITHS, A. J. F.; et al. Introdução à genética. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2002.

• SNUSTAD, P. & SIMMONS, M. J. Fundamentos de Genética. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.

Bibliografia Básica

• ALBERTS, B.; ANDRADE, A. E. Fundamentos da biologia celular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed, 2011.

• COOPER, G. M.; HAUSMAN, R. E. A célula: uma abordagem molecular. 3 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.

• JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular.8 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 332 p. 2011.

• RAVEN, P. H.; EVERT, R. F. Biologia Vegetal. 7 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.

• SADAVA, D.; HELLER, C.; ORIANS, G.H.; PURVES, W.K.; HILLIS, D.M. Vida: A Ciência da Biologia - Célula e Hereditariedade. V. 1, 8 ed. Porto Alegre: Artmed. 2009.