CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA

EFICIÊNCIA – CLAE (HPLC)

ELAINE LOPES JULHO/2012

INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

CROMATOGRAFIA

Vem do grego “CHROMA”,

que significa “COR”

Vem do grego “GRAPHE”,

que significa “ESCREVER”

Métodos cromatográficos, de uma forma geral, permitem a separação, quantificação e

identificação de espécies químicas, ENTRETANTO a Cromatografia Líquida é uma

técnica de separação de grande resolução, mas não identifica com precisão o

composto.

INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Entre as vantagens desta técnica Diversidade de suas aplicações;

Desvantagens custo dos equipamentos, tempo para formação de um técnico ;

Uma expressão usada é que “os tempos de retenção são característicos, porém não

são exclusivos”.

Emprega-se outras técnicas espectrometria de massas, espectrometria de

infravermelho ou ressonância magnética;

INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Princípio da Técnica

Separação pela distribuição destes

componentes em duas fases que se

encontram em contato;

Durante a passagem da fase móvel pela

estacionária, os componentes da

mistura são seletivamente retido pela

fase estacionária;

A retenção seletiva pode operar por

mecanismos entrópicos e entálpicos.

Cromatografia Líquida Clássica colunas de vidro;

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou High Perfomance Liquid

Chromatography (HPLC) auxílio de uma bomba de alta pressão;

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Tipos

Adsorção-Cromatografia Líquido-sólido Competição pelos sítios ativos da fase

estacionária;

Partição-Cromatografia líquido-líquido Baseada nas diferenças de solubilidade dos

componentes;

Troca iônica Diferentes tendências dos componentes iônicos da amostra a permutar

com os íons da fase estacionária;

Exclusão Os componentes são separados conforme o tamanho efetivo das

moléculas.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Classificação pelos mecanismos de separação

Cromatografia em Fase Normal

Fase Móvel APOLAR

Fase Estacionária POLAR

Exemplo uso de sílica gel com hexano ou diclorometano.

Cromatografia em Fase Reversa

Fase Móvel POLAR

Fase Estacionária APOLAR

Exemplo: uso de sílica gel modificada (C18) com metanol/água.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições

Fase Móvel Fase Estacionária

K’a = Tra-to

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições

Fator de Capacidade (K’) de “A” Velocidade

com que um dado composto migra ao longo da

coluna.

Tempo morto(to) Amostra não retida na coluna;

Tempo de retenção da fase móvel.

Resolução Medida quantitativa da separação

de dois picos consecutivos. OBS: Quando R = 1,5

separação é completa; Quando R = 1,0 os

picos estão somente 90% resolvidos.

Tempo de Retenção de “A” (Tra) Amostra introduzida no sistema até o ponto máximo do

pico da amostra.

Tra = tr-to

Figura: Resolução entre dois picos.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições

Eficiência da coluna Número de pratos teóricos (N);

Quanto maior o valor de N MAIOR a eficiência da coluna;

Exemplos de Eficiências de Colunas:

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Definições

HPLC Fármacos

Cosméticos

Polímeros

Corantes

Aminoácidos, etc.

Alimentos

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA Aplicabilidade

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Esquema Básico do Aparelho

O sistema cromatográfico é composto de:

Reservatório e sistema de Bombeamento da Fase Móvel (Solvente ou Solventes)

Sistema de Introdução da Amostra

Sistema Analítico (Coluna Cromatográfica – Fase Estacionária)

Sistema de Detecção

Sistema de Registro e Tratamento dos Dados

Pressão máxima de operação, fluxo, reprodutibilidade e constância do fluxo;

Todo solvente deve ser filtrado e desgaseificado;

Deve apresentar resistência a líquidos corrosivos, a facilidade de troca de fase

móvel e a limpeza do sistema;

É importante o estudo do manual da bomba;

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Bombas cromatográficas – Aspectos Importantes

Precisão das medidas Reprodutibilidade com a qual as amostras podem ser

introduzidas na coluna.

Injeção Manual pouca repetibilidade;

Injeção Automática maior repetibilidade;

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Introdução da Amostra (Injeção) – Aspectos Importantes

Podem ser universal ou seletivo;

Os detectores seletivos são compatíveis com eluição em gradiente e são usados

quando se quer minimizar interferentes;

Sensibilidade a razão entre o sinal gerado e a quantidade de amostra que

produziu o sinal;

Ruído é a variação do sinal que não é atribuído à amostra;

Linearidade deve-se guardar uma relação linear com a concentração da amostra;

Estabilidade o detector deve ser indiferente as variações de temperatura e fluxo.

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Detectores – Aspectos Importantes

Ultra Violeta

Seletivo Detecta a quantidade de luz UV absorvida;

Proporcional a concentração da amostra;

É relativamente insensível as mudanças de fluxo e de temperatura

Índice de Refração

Universal Detecta a diferença de índice de refração entre a solução e o solvente empregado;

Menor sensibilidade do que detectores de UV;

Não há destruição da amostra;

Muito sensível a mudança de temperatura e pressão.

Fluorescência

Mais sensível Compostos que fluorescem;

Massas

Combina sensibilidade, versatilidade e universalidade – alto custo

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Detectores – Tipos

CROMATOGRAMA

17

Identificação dos picos

Em todo sistema cromatográfico a coluna é o “ coração” do sistema;

Segmento de tubo de aço inoxidável;

Diâmetro uniforme;

Capaz de resistir a altas pressões;

Paredes internas finamente polidas;

O aço inoxidável é o material mais usado.

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes

A capacidade da coluna Comprimento, diâmetro e material de empacotamento.

Diâmetro interno de cerca de 0,45 micra para separações analíticas e na faixa de 2,2 micra para

preparativas;

O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno

de 25-30 cm.

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes

O tamanho e a configuração das partículas

variam segundo a aplicação cromatográfica.

Estas partículas geralmente são de sílica ou

alumina e podem ser recobertas com outras

substâncias.

As partículas devem ter a menor variação de

diâmetro possível.

Quanto maior o tamanho da partícula porosa mais lento o processo de difusão;

Em consequência, mais lenta a transferência de massa entre a fase estacionária e a

fase móvel.

Conforme diminui o tamanho da partícula a profundidade dos poros diminui,

permitindo obter análises rápidas, sem perda na eficiência.

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes

Fase Normal

Fase estacionária polar Sílica, alumina, grupo amino(-NH2), grupo nitrilo (-CN);

Fase móvel relativamente apolar (Ex. hexano, éter isopropílico);

O componente menos polar é eluído primeiro;

O componente mais polar é eluido depois;

Fase Reversa

Fase estacionária não polar–grupos octil (C8H17), octadecil (-C18H37);

Fase móvel relativamente polar (água, metanol,acetonitrila).

O componente mais polar é eluído primeiro;

O componente menos polar é eluido depois;

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Fase Normal x Fase Reversa

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes

Sílica gel

Figura: Estrutura da sílica gel mostrando um possível poro da partícula

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Colunas – Aspectos Importantes

Sílica gel

Figura: Diferentes formas de ligação entre moléculas de água e os grupos silanóis da superfície

Registrar ou manipular os dados obtidos

Registrador;

Computador

Vantagens do Computador

Aumentar a versatilidade, exatidão e precisão;

Processar os dados;

E também controlar parâmetros de análise.

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Registro e Tratamento de Dados

SISTEMA CROMATOGRÁFICO Registro e Tratamento de Dados

Os solventes devem possuir:

Alto poder de solubilização das amostras;

Baixa reatividade;

Compatibilidade com o detector utilizado;

Baixa viscosidade;

Altíssimo grau de pureza (Grau HPLC);

Exemplos de solventes

FASE MÓVEL Características dos Solventes

Verdadeiro motor das separações cromatográficas;

Deve ser livre de impurezas;

Recomenda-se sua filtração e sua desgaseificação antes do uso;

Armazenamento em garrafas de vidro;

FASE MÓVEL Importância e recomendações para uma separação cromatográfica

A água é um solvente

comum na CLAE.

Entretanto, esta deve

ser purificada. Sua

armazenagem em

tambores plásticos não

é recomendada.

Isocrática quando se mantém a composição da fase móvel constante;

Programação de gradiente quando altera-se a composição da fase móvel

durante a execução da análise.

FASE MÓVEL Tipos de Eluição

Antes de desenvolver um método, é preciso definir alguns parâmetros:

Qual coluna?

Qual fase móvel?

Qual detector?

PARÂMETROS DE ANÁLISE O que usar??

A regra básica é:

Fase Estacionária com polaridade semelhante à amostra e uma Fase Móvel de

polaridade diferente;

Se o analito apresentar na sua estrutura parte polar e apolar Usar coluna de fase

reversa;

Começar a eluição com uma fase móvel com alto poder de eluição:

Fase Normal – 100% diclorometano, metanol ou clorofórmio;

Fase Reversa – 50 a 100% de metanol ou acetonitrila em água;

Obs: Nestas condições todos os componentes devem eluir no volume morto.

PARÂMETROS DE ANÁLISE Como definir??

PARÂMETROS DE ANÁLISE Como definir??

Início da eluição:

Fase Normal – 100% diclorometano, metanol ou clorofórmio;

Fase Reversa – 50 a 100% de metanol ou acetonitrila em água;

Para aumentar a retenção, adicionar:

Fase Normal – Hexano ou Heptano;

Fase Reversa – Aumentar a porcentagem de solvente mais fraco (H2O)

Baixar o fluxo;

Trocar a coluna;

Reduzir a concentração da amostra e/ou volume da amostra.

Obs: A amostra deve ser filtrada e solúvel na FM.

PARÂMETROS DE ANÁLISE Como melhorar a eficiência da separação??

Fazer uma limpeza prévia na amostra usando um cartucho de extração de sílica ou

fase reversa;

O uso de uma pré-coluna também é recomendado;

Sempre correr um branco antes de começar a analisar a amostra;

A escolha do detector deve ser feita considerando se a amostra contém grupos

cromóforos;

PARÂMETROS DE ANÁLISE Ajustes necessários

Vantagens: Análises mais rápidas;

Melhora na separação;

Maior simetria dos picos.

PARÂMETROS DE ANÁLISE Análise com gradiente de eluição – Quando usar??

Mistura contendo 5 componentes;

FM: Hexano;

Eluição: Isocrática (tempo de análise longo);

Picos largos no final do cromatograma;

E o 5º componente não saiu.

DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 1

DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 2

Mesma mistura contendo os 5 componentes do exemplo anterior;

FM mais forte: Diclorometano;

Eluição: Isocrática;

O 5º componente foi eluído; Tempo de análise reduzido;

Perda de resolução entre os picos 1 e 2, 3 e 4

DEFININDO OS PARÂMETROS DE ANÁLISE Exemplo 3

Mesma mistura contendo os 5 componentes dos exemplos anteriores;

Empregou-se um gradiente de eluição resolução dos picos foi resolvida;

FM: 100% de Hexano até a eluição do 2º pico; A partir daí, adição de DCM a uma taxa

de 2%/min;

Composição final da FM é 100% DCM.

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

Amostras:

Obter sempre o MÁXIMO de informações sobre a amostra;

Sempre filtrar!

Testar a solubilidade com a fase móvel;

Sempre que possível, usar a FM para dissolver a amostra

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

Fase Móvel:

Usar SEMPRE solventes grau HPLC;

Filtrar a FM;

Usar filtro no reservatório da FM;

Evitar o uso de solventes alcalinos em colunas à

base de sílica;

FM com pH < 2 pode provocar o rompimento da

ligação Si-C

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

Para desenvolvimento, usar solvente de um mesmo fabricante até o final da pesquisa;

Causa: altera o Tr, pode parecer uma “dobra” de pico, interferência no sinal, etc.

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

Utilização de um solvente do fabricante B necessita de uma etapa de

purificação Remoção de contaminantes coluna de alumina

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

Colunas:

Deixar a coluna equilibrar com a FM;

Nunca deixar a coluna exposta a fontes instáveis de radiação térmica;

Evitar queda da coluna;

Controlar a pressão do sistema.

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

Não deixar que o leito da coluna seque;

Antes de usar uma coluna nova, avaliar sua eficiência;

Guardar a coluna no solvente adequado;

Nunca guardar uma coluna com soluções-tampão ou solventes halogenados;

Fechar as conexões da coluna.

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

Mudanças em parâmetros T e P durante uma análise influenciam a resposta do

detector ;

Impurezas produzem a diminuição da resposta do detector e interferência;

Limpeza da célula do detector:

Passar solvente pelo sistema sem coluna;

Pode-se usar HNO3 6 N, MeOH, ACN, clorofórmio e hexano

Pisos achatados soluções concentradas resposta do detector não linear

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

Bombas:

Mudanças bruscas de pressão do sistema pode ser consequência de

vazamento, bolhas, etc.;

Verificar miscibilidade dos solventes; Exemplo: Uma FM com água mudando

para hexano;

Fase móvel deve ser filtrada.

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

O que causa perda de resolução?

Componentes fortemente retidos na coluna;

Coluna fisicamente danificada;

Perda de eficiência da coluna;

Coluna com sobrecarga de amostra.

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

O que causa diminuição do Tr?

Perda de sítios ativos da coluna;

A coluna pode ter sido má regenerada;

Contaminantes podem estar adsorvidos na coluna. na coluna

O que causa aumento do Tr?

Fluxo baixo;

Solvente com baixo poder de eluição. na coluna

CUIDADOS, MANUTENÇÃO E RESOLUÇÃO

DE PROBLEMAS

O que causa alargamento na forma do pico?

Força iônica da FM pode estar muito baixa;

Adsorção da amostra;

Perda de fase ligada – baixa eficiência;

Sobrecarga de amostra.

GRADIENTE ADEQUADO Resolução

Inadequado Solvente forte em todo cromatograma

Inadequado no início Solvente A é muito forte e

causa uma eluição rápida

Inadequado no final A troca do solvente A por B não

foi suficientemente forte e causa uma eluição rápida

GRADIENTE ADEQUADO Resolução

O que fazer para aumentar a resolução?

Diminuir a força do solvente;

Se for FN diminuir a polaridade;

Se for FR aumentar a polaridade;

Diminuir as condições iniciais;

Aumentar o tempo do gradiente;

Dobrar o fluxo.

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

CROMATOGRAMAS Exercícios de Fixação

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