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- Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por
membranas Extrao em sistemas de duas fases lquidas
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- Processos de Separao por Membranas Os processos mais empregados
para purificao de bioprodutos so os que utilizam a diferena de
presso como fora motriz; Em razo da natureza e do tipo de solutos e
da presena ou no de partculas em suspenso, existem diferentes
membranas com diferentes tamanhos e distribuio de poros
caracterizando 4 processos: Microfiltrao; Ultrafiltrao;
Nanofiltrao. Osmove inversa.
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- Principais caractersticas dos processos que utilizam diferena
de presso como fora motriz
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- Faixas de tamanho de poros das membranas
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- Microfiltrao similar a uma filtrao clssica que utiliza
membranas sintticas como barreira seletiva Emprega membranas
microporosas, isotrpicas ou anisotrpicas, com tamanho de poros
entre 0,05 a 5 m empregada para reter partculas em suspenso, tanto
no ar quanto em misturas aquosas So membranas totalmente permeveis
aos compostos solveis, independentemente do valor de suas massas
molares Aplicao: filtrao estril, tanto de lquidos quanto de
gases
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- Ultrafiltrao Emprega membranas microporosas anisotrpicas, com
dimetros de poros entre 1 e 500 nm. Capaz de reter macromolculas em
soluo, e permevel a todos os solutos de baixa massa molar Bastante
utilizada na purificao quanto na concentrao de protenas e
enzimas
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- Osmose Inversa Utiliza membranas anisotrpicas densas, portanto,
so permeveis apenas ao solvente, em geral, gua, retendo,
praticamente, todas as molculas solveis e materiais em suspenso;
Alta presso faz a gua atravessar a membrana no sentido da soluo
mais concentrada para a menos concentrada.
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- Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por
membranas Extrao em sistemas de duas fases lquidas
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- Extrao em sistemas de duas fases aquosas Utilizada na purificao
de antibiticos e cidos orgnicos; Consiste na separao da
molcula-alvo e impurezas baseada em suas diferentes solubilidades
nas fases lquidas
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- Sistemas de duas fases aquosas so formados pela reunio de
determinados polmeros, polieletrlitos, ou polmeros em combinao com
solutos de baixa massa molar formando quatro grupos: 2 polmeros
no-inicos. Polieletrlito e um polmero no-inico; 2 polieletrlitos
Polmero no-inico e um composto de baixa massa molecular Extrao em
sistemas de duas fases aquosas
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- Sistemas formados por polietilenoglicol e um sal so
intensamente empregados por apresentarem rpida separao das fases,
baixo custo e elevada seletividade na separao de molculas com base
na solubilidade Extrao em sistemas de duas fases aquosas
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- Duas solues aquosas imiscveis; Molcula-alvo P apresenta maior
solubilidade na fase de topo em relao fase de fundo; Maior grau de
pureza da molcula-alvo se os contaminantes apresentarem
solubilidade maior na fase de fundo
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- Diagrama de Equilbrio em sistemas de duas fases aquosas (SDFA)
Curva de equilbrio de um sistema PEG/fosfato Reta TMB: linha de
amarrao (tie-line)
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- Curvas de equilbrio do sistema PEG/fosfato de potssio em funo
dos parmetros massa molecular e pH do meio
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- Coeficiente de Partio (K) Grandeza adimensional que representa
a relao entre as concentraes da molcula de interesse na fase de
topo e na fase de fundo no equilbrio: K= C Ti C Fi C Ti =
Concentrao de soluto i na fase de topo (g/L); C Fi = Concentrao de
soluto i na fase de fundo (g/L); Utilizado para avaliao da extenso
das separaes nos sistemas de duas fases aquosas; Ocorrncia de
purificao: coeficientes distintos para a molcula de interesse e
para as demais molculas.
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- Fatores que influenciam no coeficiente de partio K Interaes
hidrofbicas Cargas superficiais / pH Diferena de potencial eltrico
entre as fases Efeito de salting-out da fase salina Diferenas de
viscosidade Diferenas de densidade Diagramas de fases (ex.:
concentrao de PEG e sal) Massa molecular da biomolcula
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- Mtodos de Purificao de alta resoluo: Cromatografia
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- Cromatografia Princpio Geral: Reteno e Liberao da molcula-alvo
A matriz slida capaz de reter a molcula por um determinado perodo
de tempo (tempo de reteno) Eluio do fluido e consequente separao da
molcula-alvo
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- Cromatografia
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- Cromatografia de excluso molecular Cromatografia de troca-inica
Cromatografia de interao hidrofbica Cromatografia de afinidade
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- Cromatografia de excluso molecular Processo: Os solutos de um
meio lquido (protenas, peptdeos, anticorpos) so adsorvidos ou
retidos em um leito de material poroso; As molculas sofrem partio
em virtude das diferenas no tamanho das espcies entre um solvente
(fase mvel) e uma fase estacionria de porosidade definida; A
posterior remoo gradual dos solutos por ao de uma fase lquida mvel
(eluente), resulta na separao das diferentes molculas
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- Cromatografia de excluso molecular A ordem de recuperao
seletiva das molculas no fluxo eluente tem incio com as maiores
molculas, prosseguindo em direo s menores. Separao por tamanho das
molculas
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- Cromatografia de excluso molecular Eluio de uma mistura de trs
protenas de massas moleculares diferentes em uma coluna de permeao
em gel, com a formao de faixas distintas medida que a amostra
permeia a coluna
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- Cromatografia de excluso molecular Aplicaes: Dessalinizao
Determinao de massas moleculares Determinao de tamanho de
poros
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- Baseia-se na afinidade que componentes de uma amostra tem com
os stios inicos em uma matriz slida, ou seja, existe uma competio
entre ons de interesse e contaminantes pelos grupos carregados da
matriz ou da fase estacionria. As resinas empregadas apresentam
elevada capacidade de adsoro de protenas A fase estacionria,
eletricamente carregada, tem a capacidade de reter solutos que esto
na fase mvel e apresentam cargas de sinais opostos Controle de pH e
fora inica Cromatografia de troca-inica
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- Matrizes de troca-inica: Trocadores aninicos: contm grupos
positivamente carregados e adsorvem protenas com carga lquida
negativa Trocadores catinicos: contm grupos negativamente
carregados e adsorvem protenas com carga lquida positiva Aps serem
adsorvidos matriz, os solutos podem ser eludos por deslocamento com
outros ons, com a mesma carga da protena adsorvida, porm com maior
fora de interao com a fase estacionria. Cromatografia de
troca-inica
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- Princpio bsico da cromatografia de troca inica Cromatografia de
troca-inica
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- Cromatografia de interao hidrofbica Baseia-se na reteno das
molculas pela interao da sua regio hidrofbica com a matriz A
protena colocada em meio com elevada concentrao de sal (expe a
regio hidrofbica, aumentando a interao com a matriz)
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- Cromatografia de interao hidrofbica Molcula de protena
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- Cromatografia de interao hidrofbica Modelos de adsoro a: modelo
uniponto; b e c: adsoro uniponto; d: foras hidrofbicas de
intensidades diferentes em razo das irregularidades na superfcie da
matriz.
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- Tcnica de separao altamente especfica que depende das interaes
entre os pares de materiais biolgico: enzima-substrato,
enzima-inibidor, antgeno-anticorpo. O ligante imobilizado em uma
matriz porosa Cromatografia de Afinidade
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- Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas
ativas de formas desnaturadas
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- Purificao de alta resoluo Alta especificidade Separao de formas
nativas de formas desnaturadas
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- O complexo formado entre o ligante e a protena tem que ser
reversvel; A protena eluda e o ligante regenerado.
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- Cromatografia Ampliao de Escala Critrios: Manter os mesmos
graus de pureza, rendimento, atividade biolgica e, se possvel,
rendimento, alcanados em escala de bancada; Purificao de miligramas
a gramas de produto; Principal caracterstica: aumento do dimetro da
coluna e a manuteno constante da altura do leito cromatogrfico,
exceto para excluso molecular (ainda deve ser aumentado em 10 % a
altura do leito);
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- Parmetros que devem ser mantidos constantes: Volume da fase
estacionria; Grau de empacotamento; Altura do leito cromatogrfico;
Velocidade linear de alimentao (vazo volumtrica dividida pela rea
de corte transversal da coluna). Parmetros que devem ter o valor
aumentado: Dimetro da coluna; Fluxo volumtrico; Volume de amostra
Cromatografia Ampliao de Escala Colunas industriais Altura de leito
em torno de 30 cm e dimetro da ordem de 1 m. Maiores volumes de
colunas da ordem de 700 a 2000 L (ex.: purificao do soro de
queijo)
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- Cromatografia Ampliao de Escala