GabrielPadillagpadilla@icb.usp.br

2020

MétododeisolamentoedetecçãodeMicro-organismos

IsolamentodeMicro-organismos  O isolamento de micro-organismos permite quanti>icar e identi>icar

membrosdeumacomunidademicrobiana  Otipodeambienteaseravaliado interferenaestratégiaparaobterasuspensãodecélulasv  Osolodeveseragitadaemsoluçãotampãov  Para remoção da comunidade microbiana de super>ícies, asamostras devem ser agitadas em solução contendo pérolas(bolinhas)devidro.

v  Compostossurfactantes(p.e.Tween80)podemserutilizadosparafacilitaradispersão

  Diluiçõesouconcentraçãodeamostraspodemsernecessárias.v  Paraamostrasdesolo,diluiçõesapropriadassãonecessárias.v  Para amostras de água e ar, podem ser utilizados >iltros paraconcentrarascélulasdasamostras

IsolamentodeMicro-organismos

 Seletividadedosmeiosdecultivopermiteavaliareisolargruposmicrobianosespecí>icos–substratosespecí>icosecorantes  Onúmerodecolôniasdeveestarentre30e300UFC.gdeamostra-1.oupermitiraobservaçãodecolôniasisoladas

IsolamentodeMicro-organismos

MétododaSobrecamadaMeiodeculturasobreascélulas

Métododeespalhamentosobreomeiodecultura

MétododesemeaduraemPlacadePetri

IsolamentodeMicro-organismosMétododesemeaduraemPlacadePetri

MétododaSobrecamada-CélulasnoMeiodecultura

Métododeespalhamento-sobreomeiodecultura

IsolamentodeMicro-organismos

Estratégiasdeenriquecimento:•  Fontesdecarbono•  Temperatura•  Resistênciaafatores>ísico-químicoseetc

Métododeenriquecimento

Puri>icaçãodemicro-organismosemmeiodecultura

DetecçãodeMicro-organismosMétododecoloraçãoporDAPIouAcridinaLaranja(AO)

Estratégias:•  DAPI(diamidino-2-phenylindole)coraascélulasdeazul>luorescente•  AOcoradelaranjaoularanjaesverdeado•  FluorescênciaéobservadasobreLuzU.V.•  Permitem a quanti>icação de micro-organismos ao microscópio de>luorescência.

•  Sãoinespecí>icospoiscoramosácidosnucleicos•  Nãopermitediferenciarcélulasvivasdecélulasmortas

AcridinaLaranjaDAPI

DetecçãodeMicro-organismosHibridizaçãocomsondas

Estratégias:•  Utiliza sondas deDNA especí>icasparaosgruposquesequerdetectar

DetecçãodeMicro-organismos

Hibridizaçãocomsondas

DetecçãodeMicro-organismos

Métodoimunológico-anticorpos

Amostraambiental

Meiodecultura1 Meiodecultura2

Inconsistênciaentreoobservadoeoisolado

CulturabilidadedosMicro-organismos

InconsistênciaentreaDiversidadeobservadaeaisolada

 Baixaculturabilidademicrobiana

 Seletividadedosmeiosdecultivo

 Seletividadedascondiçõesdecultivo:CO2,O2,temperatura,fontedeC,Neetc.

  Pequenarepresentatividadedacomunidadeinvivo(coleçõesdeculturas)

CulturabilidadedosMicro-organismos

 Presenteemtodasasespécies

 Regiõesvariáveiseconservadas

 Permiteousodeprimers“universais”

AnálisedacomunidademicrobiananãoCultiváveis

 GenesConservados(ribossomais,girase,RNApolimerase)

MétodosIndependentesdeCultivo

BibliotecasdeClones

ExtraçãodeDNAdeamostraambiental

PCR(16SrRNA) LigaçãoaoVetor

ConstruçãodeBibliotecaseanálise

MétodosIndependentesdeCultivo

BibliotecadeclonesfuncionaisMétodosIndependentesdeCultivo

MétodosIndependentesdeCultivo-Metagenoma

MétodosIndependentesdeCultivoDiversidade

MétodosIndependentesdeCultivo

MétodosIndependentesdeCultivo

MétodosIndependentesdeCultivo

MétodosIndependentesdeCultivo