MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS EM INDÚSTRIA

DE PRODUTOS ESTÉREIS E NÃO ESTÉREIS.

Alessandra Cristo

Agosto 2021

CONCEITO

“O CONTROLE DE QUALIDADE É A PARTE DE BOAS PRÁTICAS DE FABRICAÇÃO

REFERENTE A AMOSTRAGEM, ESPECIFICAÇÕES, ENSAIOS, PROCEDIMENTOS DE

ORGANIZAÇÃO, DOCUMENTAÇÃO E PROCEDIMENTO DE LIBERAÇÃO QUE ASSEGURE

QUE OS ENSAIOS NECESSÁRIOS E RELEVANTES SEJAM EXECUTADOS E QUE OS

MATERIAIS NÃO SEJAM LIBERADOS PARA USO, NEM OS PRODUTOS LIBERADOS PARA

VENDA OU FORNECIMENTO ATÉ QUE A QUALIDADE DOS MESMOS SEJA JULGADA

SATISFATÓRIA.”

LEGISLAÇÕES

• Orgão Regulador: ANVISA/ Visa Local

• RDC Nº 301, DE 21 DE AGOSTO DE 2019

• RDC 79, de 11 de Abril 2003 – Dispõe que na ausência de monografiaoficial/métodos gerais inscrito na Farmacopéia Brasileira poderá seradotada a última edição das seguintes compêndios internacionais:Farmacopéia Alemã, Farmacopéia America (USP), FarmacopéiaBritânica, Farmacopéia Européia, Farmacopéia Francesa,Farmacopéia Japonesa e Farmacopeía Mexicana.

LEGISLAÇÕES

• RDC 169, de 21 de Agosto de 2006 – Incluiu a FarmacopéiaPortuguesa.

• RE 166, de 24 de Julho de 2017 – Validação de Métodos Analíticos (Não inclui métodos Microbiológicos).

• <61> USP Microbiological Examination Of Non-sterile Products: Microbial Enumeration Tests.• < 62> USP Microbiological Examination of Non-sterile Products: Tests for Specified.

Microorganisms.• <71> Sterility Test• <81> Antibiotics - Microbial Assays• <85> Bacterial Endotoxin Test• <1072> Disinfectants anda Antiseptics• <1227> Validation of Microbial Recovery from Pharmacopeial Articles• <1111> USP Microbiological Quality of Non-sterile Pharmaceutical Products• <1112> Apllication of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Products

• <1116> Microbiological Controle and Monitoring of Aseptic Processing Environments.• <1115> USP Bioburden Control of Nonsterile Drug Substances and Products.• <1231>USP Water for pharmaceutical purposes.• <1223>USP Validation of Alternative Microbial Methods. • <1229.3> USP Sterilization of Compendial Articles - Monitoring of Bioburden • Relatório Técnico nº70 Fundamentos de Limpeza e Programas de Desinfecção para

instalações produtivas assépticas.

PRÉ-REQUESITOS

• Meios de cultura adquiridos de fornecedores qualificados.

• Meios previamente preparados e aprovados no Teste de Promoção de Crescimento e Esterilidade.

• Cepas adquiridas de fornecedores qualificados.

• Cepas utilizadas até quinta passagem.

• Controle de reconstituição e repique de cepas.

• Água de boa Qualidade para preparo dos meios de cultura.

TESTES PRECONIZADOS PARA PRODUTOS

NÃO ESTÉREIS E ESTÉREIS

ANÁLISE DE ÁGUA

TIPOS DE ÁGUA

• Água Potável: água que atenda o padrão de potabilidade que é um conjunto de valores permitidos como parametron da qulaidade da água para o consumohumano, o que não oferece riscos a saúde humama.

• Água Purificada: É a água potável que passou por algum tipo de tratamento para retirar os possíveis contaminantes e atender aos requisites de pureza requeridosestabelecidos. Geralmente preparade por destilação, troca ionica, osmose reversa, termocompressão ou outro processo adequado. Deve estar livre de qualquer substância dissolvidas. Geralmente é utilizada na preparação de medicamentos que não requeiram água estéril e nem apirogênica, destinada aouso não parenteral.

TIPOS DE ÁGUA

• Água Para Injetáveis: É o insumo utilizado na preparação de medicamentosparenteral, como veículo ou na dissoução ou diluição de substâncias ou de preparações. Outros exemplos de fabricações farmacêuticas são a fabricação de princípios ativos de uso parenteral, para lavagem final de equipamentos, tubulações e recipientes usados em preparações parenterais, e na limpeza de certos equipamentos.

• Água Ultrapurificada (Milli-Q): É a água que passou por tratamento adicional para retirar os possíveis contaminantes e atender os requisitos de pureza estabelecido.

AMOSTRAGEM

• A amostragem é uma etapa importante na avaliação da qualidade da água, uma vez que a amostra retirada para análise deve refletir com precisão o desempenho do sistema de produção e distribuição e a qualidade da água utilizada. Uma amostragem inadequada pode levar a uma avaliação equivocada, gerando intervenções desnecessárias no sistema de purificação, ou comprometendo a veracidade do estado da qualidade da água por meio de um resultado impreciso. Considerando as particularidades de cada sistema, as amostras de água devem ser retiradas desde o local de sua geração até os pontos de uso, visto que os resultados obtidos na geração podem não refletir a qualidade da água nos pontos de uso. A coleta de amostras nos pontos de uso deve ser realizada utilizando práticas idênticas àquelas empregadas rotineiramente na utilização da água naquele ponto, mimetizando a operação do sistema (purga da válvula, utilização de mangueiras, sanitização do ponto, etc).

CUIDADOS AMOSTRAGEM

• As amostras devem ser coletadas em recipientes de vidro borossilicato estéreis ou bolsas plásticas estéreis apropriadas para o uso microbiológico. O volume da amostra deve ser suficiente para realizar todas as análises necessárias. A quantidade de amostra adicionada nos recipientes deve permitir a homogeneização antes da realização dos ensaios, sendo sugerido um espaço de pelo menos 2,5 cm acima da superfície da água (headspace).

• Agentes desinfetantes, como cloro ou outros compostos halogenados, quando presentes nas amostras de água, devem ser neutralizados antes da realização dos testes, para garantir uma recuperação adequada dos micro-organismos possivelmente presentes. Um agente neutralizante comumente usado é a solução de tiossulfato de sódio (0,1 mL de uma solução a 3% neutraliza acima de 5 mg/L de cloro residual em uma amostra de 120 mL).

FREQUÊNCIA DE COLETA

• Validação1 fase: 14 dias, 2 fase: 14 dias,3 fase: 12 meses.

• Após fase 3 → Análise Risco determinando os pontos a serem coletados e sua frequência.

ESPECIFICAÇÃO ÁGUA

• ÁGUA POTÁVEL – TESTES PRECONIZADOS

CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS : No máx 500 UFC/mL

PESQUISA DE COLIFORME FECAIS E ESCHERICHIA COLI – AUSÊNCIA 100ML

• ÁGUA PURIFICADA – TESTES PRECONIZADOS

PESQUISA DE PSEUDOMONAS AERUGIONSA - AUSÊNCIA 20OML

• ÁGUA ULTRA- PURIFICADA – TESTES PRECONIZADOS

PESQUISA DE PSEUDOMONAS AERUGIONSA - AUSÊNCIA 20OML

• ÁGUA PARA INJETÁVEIS – TESTES PRECONIZADOS

CONTAGEM TOTAL DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS : No máx 10 UFC/100mL

PESQUISA DE PSEUDOMONAS AERUGIONSA: AUSÊNCIA 200ML

PESQUISA DE COLIFORME FECAIS E ESCHERICHIA COLI: – AUSÊNCIA 100ML

ENDOTOXINA BACTERIANA: 0,25EU/ML

METODOLOGIA

Método por profundidade em placa: adicionar 1 mL da amostra em placa de Petri e verter 15 mL a 20 mL do meio de cultura mantido de 45 °C a 50 °C, conforme Tabela 1. Realizar o teste pelo menos em duplicata.

Método de filtração em membrana: utilizar equipamento de filtração que possibilite a transferência da membrana para os meios de cultura. Utilizar membrana estéril com 47 mm de diâmetro e porosidade de 0,45 µm, lavando-se a membrana, após a filtração da amostra, com três porções de 20 mL a 30 mL de água purificada estéril. O volume a ser filtrado poderá variar de acordo co

Fonte: FB 6ª edição, pg.454

Pesquisa de Coliformes Totais e E. coli:

• NPM

• Método de filtração em membrana: utilizar equipamento de filtração que possibilite a

transferência da membrana para os meios de cultura. Utilizar membrana estéril com 47 mm

de diâmetro e porosidade de 0,45 µm, lavando-se a membrana, após a filtração da amostra,

com três porções de 20 mL a 30 mL de água purificada estéril. O volume a ser filtrado

poderá variar de acordo com a amostra obedecendo a um volume máximo que forneça de

20 UFC a 200 UFC por membrana. Para pesquisa de coliformes, a membrana deve ser

incubada em meio específico (por exemplo, MacConkey, endo Farmacopeia Brasileira, 6ª

edição 456 C, eosina azul de metileno, etc), às temperaturas preconizadas para as

pesquisas de coliformes totais e fecais por 24 horas.

Pesquisa de Coliformes Totais e E. coli:

• Método cromogênico: O teste baseia-se na adição de 100 mL de amostra aos substratos e

incubação de 35 ºC a 37 ºC por 24 horas. A atividade dos coliformes totais sobre o substrato

ONPG produz uma coloração amarela, indicando a sua presença. A presença da E. coli

pode ser confirmada por fluorescência sob a luz UV, devido sua atuação sobre o substrato

Pesquisa de Pseudomonas aeruginosa:

A pesquisa de Pseudomonas aeruginosa na água para uso farmacêutico pode ser realizada pelo

método de filtração por membrana. Para todos os tipos de água para uso farmacêutico, P.

aeruginosa deve estar ausente.

PROCEDIMENTO Método de filtração por membrana: filtrar 200 mL da amostra através de

membrana de filtração estéril. Colocar cada membrana sobre a placa de ágar M-Pa-C de modo que

não fique espaço entre a membrana e a superfície do ágar. Inverter as placas e incubar a (41,5 ±

0,5) °C por 72 horas. Tipicamente, as colônias de P. aeruginosa possuem de 0,8 mm a 2,2 mm de

diâmetro e são aparentemente planas com borda clara e centro de acastanhado a verde escuro.

Contar as colônias típicas, de preferência a partir do filtro contendo de 20 a 80 colônias. Confirmar

a presença de P. aeruginosa por meio de testes bioquímicos adequados. Podem ser utilizados

outros métodos e meios de cultura, desde que devidamente validados

Limite de Alerta e Ação

❑ Limite de Alerta e Limite de Ação devem ser estabelecidos.

❑ Limite de Alerta não requer necessáriamente uma ação, serve para observar que algo

está saindo fora da tendência.

❑ Limite de Ação requer uma intervenção e ação de imediato para impedir que a

contaminação chegue na especificação.

Monitoramento Ambiental

❑ Áreas limpas

❑ Áreas não estéreis

Objetivo: Avaliar o perfil microbiológico da área, considerando

essencialmente a susceptibilidade de contaminação dos medicamentos nela

fabricados.

O QUE MONITORAR?

❑ Partículas viáveis

✓ Ar passivo

✓ Ar ativo

❑ Placa de Contato

✓ Superfície, chão, parede, bancada, cortina do fluxo.

❑ Swabs

✓ equipamentos.

❑ Luvas e Uniformes.

COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES SISTEMAS DE CLASSIFICAÇÃO

FREQUÊNCIA DE AMOSTRAGEM

Fonte: USP 43 <1116>

• ANÁLISE DE RISCO

PARA DEFINIÇÃO

PERIODICIDADE E

FREQUENCIA.

ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO - ATIVO

ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO - PASSIVA

ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO - SEDIMENTAÇÃO

ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO SWAB

Fonte: USP 43 <1116>

ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO LUVAS

ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO UNIFORMES

1 – visor do óculos

2 – antebraço direito

3 – antebraço esquerdo

4 – Corpo – Nivel de bancada

ILUSTRAÇÃO DA TÉCNICA DE MONITORAMENTO UNIFORMES

1 – visor do óculos

2 – antebraço direito

3 – antebraço esquerdo

4 – Corpo – Nivel de bancada

ANÁLISE DE RISCO – MONITORAMENTO AMBIENTAL

MAPA DE MONITORAMENTO AMBIENTAL

LIMITE MICROBIANO EM PRODUTOS FARMACÊUTICOS

O limite microbiano de medicamentos e insumos pode se constituir em

ausência absoluta de formas viáveis (estéreis) ou presença em

grandezas definidas, restritas ou não a determinadas cepas

microbianas para produtos não estéreis.

FONTE DE CONTAMINAÇÕES

✓ Matérias primas de origem natural podem conter

cargas elevadas.

✓ Instalações inadequadas,

✓ Equipamento com limpeza inadequada;

✓ Processo não validado;

✓ Particularidades de pontos críticos e procedimentos

de limpeza ineficaz.

AMOSTRAGEM

• 03 amostras Início processo

• 04 amostras meio processo

• 03 amostras fim processo

PREPARO DA AMOSTRA

Alguns produtos necessitam de adição de inativantes

especícicos durante o preparo da amostra:

Exemplos:

• Amoxicilina – Penicinilase

• Hidróxido de Alumínio – 0.5% Tiossulfato de Sódio

• Agente espessantes ou que causam entumecencia

(plantago ovata) diluição do teste 3:97mL Caldo TAT

LIMITE MICROBIANO – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

ALMOÇO

PESQUISA DE PATÓGENOS

Através de meios seletivos/Provas Bioquímicas:

• Pseudomonas aeruginosa

• Staphylococcus aureus

• Escherichia coli

• Salmonella sp.

• Candida albicans

• Bactéria Gram-negativa bile-tolerante

• Clostridium

VALIDAÇÃO

PESQUISA DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA

PESQUISA DE S. AUREUS

PESQUISA DE SALMONELLA

PESQUISA DE E. COLI

PESQUISA DE CANDIDA

PESQUISA DE BG- TOLERANTES A BILE

COLORAÇÃO DE GRAM

• Montagem úmida com água, podendo ser usado

corante como azul de metileno

• Usar magnificação 400x, observar, e só depois

passar para 1000x (óleo de imersão)

• Medida real de tamanho

• Fungos: KOH (10%)

• Coloração de Gram, se for bactéria

• Cotton Blue (Azul de Algodão) se for fungo

• Outras colorações diferenciais, se necessário

COLORAÇÃO DE GRAM

Cristal

VioletaLugol Álcool 3X

Lavar Lavar Lavar

COLORAÇÃO DE GRAM – DIFERENÇAS DA PAREDE CELULAR

Gram Positivas Gram Negativas

IDENTIFICAÇÃO POR PROVA BIOQUÍMICA

Gram Positivas Gram Negativas

IDENTIFICAÇÃO POR PROVA BIOQUÍMICA

ATIVIDADE DE ÁGUA

Enquanto o teor de umidade simplesmente define a quantidade de água nos insumos e produtos, a

atividade de água, em termos práticos, é a água do insumo ou produto que vai reagir com microrganismos

(e também participar de outras reações, como as enzimáticas). Quanto mais elevada for a atividade da

água, mais rápido os microrganismos (como bactérias, leveduras e bolores) serão capazes de crescer;

logo a importância da Aw está na sua relação com a conservação do insumo e produto.

Primeiramente, preciso citar as três formas de apresentação da água nos alimentos propostas por Labuza

(1970): Água livre (disponível ou não ligada); Água adsorvida (hidratada); Água ligada.

ATIVIDADE DE ÁGUA

O crescimento e a atividade metabólica dos microrganismos precisam de água em forma disponível.

A medida mais comumente empregada para expressar a estabilidade de um produto é a

determinação do nível de água em sua forma livre, que em alimentos, denomina-se Índice de

Atividade de Água, Aw.

Valores de atividade de água entre 0 e 0,20 indicam que a água está fortemente ligada, enquanto

valores de atividade de água na faixa de 0,70 a 1,00 indicam que a maioria da água encontra-se

livre, sendo esta passível de ser utilizada em reações químicas, enzimáticas e para o

desenvolvimento de microrganismos.

O comportamento microbiano frente à Aw quanto à disponibilidade de água livre é extremamente

variável, sendo as bactérias mais exigentes, em relação aos fungos e as leveduras.

Os alimentos de baixa atividade de água (< 0,60) são microbiologicamente estáveis.

TESTE DE ESTERILIDADE

✓ Aplicado a produtos estéreis.

TESTE DE ESTERILIDADE - AMOSTRAGEM

Tamanho do lote / volume do frasco / número

de frasco.

Ex. lote > 500un / < 100ml / = 20un

MÉTODO DE ANÁLISE - ESTERILIDADE

❑Inoculação Direta

❑ Inoculação Indireta (filtração em membrana)

MÉTODO DE ANÁLISE - ESTERILIDADE

Meios de Cultura :

• Caldo Tioglicolato com rezarsurina,

• Caldo Casoy ( TSB)

• Fluído A, D ou K

PESQUISA MEIO TEMPERATURA

BACTÉRIAS CALDO TIOGLICOLATO 30 – 35

FUNGOS E LEVEDURAS CALDO CASEÍNA SOJA 20-25

14 DIAS DE

INCUBAÇÃO

SISTEMA ABERTO – INOCULAÇÃO DIRETA

Inocula-se a MP ou produto diretamente aos meios

de cultura.

5 a 7 dias realiza-se a transferencia de 100uL para

outros tubo contendo os meios utilizados.

14 DIAS DE

INCUBAÇÃO

SISTEMA ABERTO – FILTRAÇÃO POR MEMBRANA

Ex: 10 unidades de 10mL para realização do teste. Faça um pool e filtre metade

Fitrar com 3 porções de 100mL Fluido validado ( A, D ou K) .

Inocula no Meio TIO.

Repete a mesma operação para o TSB.

14 DIAS DE

INCUBAÇÃO

Membrana 0.45u estéril

SISTEMA FECHADO - STERITEST

Ex: 10 unidades de 10mL para realização do teste. Faça um pool e filtre

metade

Fitrar com 3 porções de 100mL Fluido validado ( A, D ou K) .

Inocula no Meio TIO.

Repete a mesma operação para o TSB.

14 DIAS DE

INCUBAÇÃO

Canister

TESTE INICIAL

Não há

crescimento

Gram e

Mocs ≠ dos

MA das áreas

Falhas no

M.A das

áreas

Mocs = ao

MA da áreas

de fabricação

Reteste

AprovadoReprovado

crescimento

Gram e

TESTE DE ENDOTOXINA

✓ Métodos disponíveis IN VITRO

• Ponto Final de Gelificação

• Ensaio Colorimétrico

• Ensaio Turbidimétrico

✓ Métodos disponíveis IN VIVO

• Coelhos

FONTES DE PIROGÊNIO

Bactérias Gram-positivas

Fungos

Vírus

Fármacos

Bactérias Gram-negativas - LPS

MORFOLOGIA MICROBIANA

PIROGÊNIO

Pirogênio exógeno atua no centro termorregulador do hipotálamo

Leucócitos fagocitários liberam pirogênio endógeno

Aumento da temperatura corpórea (febre) Choque pirogênico

(morte)

PONTO FINAL DE GELEIFICAÇÃO (GEL CLOT)

Ponto Final de Gelificação

Mais simples e mais usado, baseia-se na formação de gel em presença de

endotoxina.

Volumes de 0,1mL de Lisado e 0,1mL da diluição da amostra são transferidos para o tubo teste, e

incubado a 37C ± 1,0C durante 60 minutos.

PONTO FINAL DE GELEIFICAÇÃO – MECANISMO DE AÇÃO

Proenzima Enzima

ativada

Coagulogênio Coagulina

Formação

de Gel

Endotoxina

PONTO FINAL DE GELEIFICAÇÃO

Teste de Sensibilidade do LAL

Realizar a cada lote novo.

Realizar em quadruplicata.

Cinco concentrações

Lambda (٨ concentração do LAL) variar 2 ٨ a ¼ ٨.

Ex. ٨ = 0,125EU/mL

0,50 0,25 0,125 0,06 0,03

A sensibilidade do LAL deve estar na metade ou 2

vezes lambda.

PONTO FINAL DE GELEIFICAÇÃO – CONDIÇÃO DO TESTE

Amostra

Amostra +

Endotoxina

Diluente

(Água)

+ Presença

de Gel

-Ausência

de Gel

MÁXIMA DILUIÇÃO VÁLIDA

MDV = Limite X Concentração

Sensibilidade LAL

Exemplo:

Limite = 0,5 EU/mg

Concentração = 2,0 mg/mL

Sensibilidade = 0,125 EU/mL

MDV = 0,5 X 2,0 = 8X

REALIZAÇÃO DO TESTE

Quantidade de Réplicas Soluções

Controle Negativo

(Água)

Controle Positivo

(Água + Endotoxina 2 lambda)

Água + Amostra 2

Água + Amostra + Endotoxna 2

Lambda.

REALIZAÇÃO DO TESTE – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Soluções Réplica 1 Réplica 2

Controle Negativo

(Água)

Controle Positivo

(Água + Endotoxina 2

lambda)

Água + Amostra _ _

Água + Amostra +

Endotoxna 2 Lambda.

Resultado: Negativo

Controle Negativo

(Água)

Controle Positivo

lambda)

Água + Amostra + +

Água + Amostra +

Endotoxna 2 Lambda.

Resultado: Positivo

Controle Negativo

(Água)

Falha Falha

Controle Positivo

lambda)

Falha Falha

Água + Amostra + +

Água + Amostra +

Endotoxna 2 Lambda.

Resultados Inválidos

Reteste

REALIZAÇÃO DO TESTE – FATORES DE INFLUÊNCIA

❑ pH 6,0 e 8,0 (regentes tamponados)

❑ Temperatura37 ± 1ºC

❑ Tempo 60 ± 2ºC 2 minutos

❑ Substâncias interferentesCálcio, Magnésio, β-glucanos

REALIZAÇÃO DO TESTE – FATORES DE INTERFERÊNCIAS

❑ Inibição Falso negativo

✓ Diluição

✓ Ajuste de pH

✓ Aquecimento

❑ Exacerbação Falso positivo

✓ Diluição

✓ Eliminar Ca++ / Mg++

✓ Aquecimento

VALIDAÇÃO DO TESTE

❑ Confirmação da sensibilidade do LAL

❑ Qualificação do analista

❑ Confirmação da Não-Interferência do Produto

ENSAIO COLORIMÉTRICO

Teste quantitativo de endotoxina, semelhante ao método turbidimétrico, é baseado na

observação de que concentrações crescentes de endotoxina irão

precipitar proporcionalmente a proteína do reagente L.A.L, formando o coagulogênio, que

será quantificado pelo método colorimétrico.

Alíquotas iguais da amostra e do lisado são misturados e incubados por 1 hora e então

centrifugados 1375 x g por 10 minutos. O sobrenadante é então removido do precipitado

por aspiração a vácuo.

Utiliza-se um espectrofotómetro com leitura a 660nm, para quantificar os resultados frente

a uma curva padrão.

ENSAIO COLORIMÉTRICO

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

CV = < 25%

CV entre as amostras = <25%

SPIKE de recuperação = Entre 50% A 200%

Tempo de reação.

ENSAIO TURBIDIMÉTRICO

Superior a técnica colorimétrica, o mesmo se baseia na medição da turbidez da amostra.

ENSAIO TURBIDIMÉTRICO – MECANISMO DA REAÇÃO

ENSAIO TURBIDIMÉTRICO – PREPARO

Preparar curva padrão de endotoxina

Preparar amostras (diluição adequada)

Incubar em leitora/incubadora de microplaca (ELISA) a 37 ºC com 100 leituras em

intervalos de 60 segundos

Determinar tempo de reação para atingir variação de 30 mOD a 340 nm Turbidez Tempo

(min) TURBIDIMÉTRICO KINECT

ENSAIO TURBIDIMÉTRICO

INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

CV Amostra = <20%

CV Controle Positivo = <10%

Coeficiente de correlação = >0,98

% Recuperação Spike = 50 a 200%

TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO

O teste´´ in vivo´´ envolve medir o aumento de temperatura retal de coelhos após a injeção

intravenosa do produto em teste.

É usado para produtostolerados por essas cobaias em doses inferiores a 10ml/kg por

período máximo de 10 minutos.

O procedimento descrito na Farmacopéia Brasileira recomenda o uso de coelhos de ambos

os sexos , adultos e sadios.

Os animais devem ser mantidos em gaiolas individuais em sala de temperatura climatizada

(20±2C) e livre de pertubações que os possam excitar.

Obtido resultado negativo no teste de pirogênio, pode-se usar o mesmo animal após 48h.

Quando o teste for positivo, não se usam os mesmos animais por duas semanas.

✓ Elevação de temperatura de coelhos após administração intravenosa

da solução teste, provocada pela presença de pirogênio

✓ Limitações: Alta variabilidade, falso positivo, fármacos antipiréticos,

tóxicos e outros

✓ Efeito bifásico de febre:

✓ Pirogênio exôgeno: 1 hora

✓ Pirogênio endôgeno: 3 horas

❑ Pré-teste: verificar temperatura dos coelhos (variação < 1ºC)

❑ Administração intravenosa da amostra pré aquecida a 37±2ºC

❑ Registrar temperatura a cada 30 minutos por 3 horas

TESTE DE PIROGÊNIO IN VIVO - INTERPRETAÇÃO

❑ 1º etapa:

3 coelhos

Nenhum de temperatura ≥ 0,5ºC.

❑ 2ª etapa:

5 coelhos (8 total)

Não mais que 3 temperatura ≥ 0,5ºC

Soma temperatura ≤ 3,3ºC

COMPARATIVOS

Método Vantagens Desvantagens

Gel-Clot • Faciliade de

execução

• Não necessita

equipamento

• Baixo custo (em

relação aos

métodos

turbimétrico e

cromogênico)

• Ensaio semi-

quantitavo

• Baixa sensibilidade

(em relação aos

métodos

turbidimétrico e

cromogênico)

COMPARATIVOS

Colorimétrico • Ensaio quantitative

• Alta sensibilidade

(em relação ao

método gel clot)

• Interferência em

amostra colorids

• Alto custo de

reagentes

comparado ao

método gel clot

COMPARATIVOS

Turbidimétrico • Ensaio quantitative

• Alta sensibilidade

(em relação ao

método gel clot)

• Interferência em

amostra colorids

• Alto custo de

reagentes

comparado ao

método gel clot

DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO

É a quantificação da substância ativa frente a um padrão biológico de referência.

O ensaio microbiológico para determinação da potência dos antibióticos é indicado para

substâncias ou preparações , em que o seu teor não pode ser definido por métodos físico-

químicos.

“A atividade (potência) dos antibióticos pode ser demonstrada sob condições específicas

através de seu efeito sobre o crescimento de microrganismo-padrão sensível.”

Ensaios: Turbidimétricos e Difusão em Ágar

Dois fenômenos ocorrem simultaneamente:

1. Difusão do antibiótico

2. Crescimento microbiano Resultando na zona de inibição de crescimento

DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – DOSE RESPOSTA

DOSEAMENTO MICROBIOLÓGICO – ESQUEMA DO TESTE

FATORES DE INFLUÊNCIA: QUANTIDADE DO INÓCULO

FATORES DE INFLUÊNCIA: COMPOSIÇÃO E PH

FATORES DE INFLUÊNCIA: MICROORGANISMO E INÓCULO

FATORES DE INFLUÊNCIA: MEIO DE CULTURA,

MICROORGANISMO E INÓCULO

FATORES DE INFLUÊNCIA: ESPESSURA DO ÁGAR

FATORES DE INFLUÊNCIA: DISPOSITIVO DAS APLICAÇÕES DAS SOLUÇÕES

FATORES DE INFLUÊNCIA: TEMPO E TEMPERATURA

DOSEAMENTO 2X2

Simétrico ou balançeado

DOSEAMENTO 2X2

DOSEAMENTO 3X3

DOSEAMENTO 5X1

Na USP utiliza o delineamento 5X1, em que as concentrações do padrão devem

aumentar em progressão geométrica e a mediana servir como de

referência(interpolação em curva padrão).

DOSEAMENTO 5X1

TURBIDIMÉTRICO

COMPARATIVO DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

EFICÁCIA DE CONSERVANTES

Objetivo Assegurar, a eficácia de conservantes antimicrobianos

adicionados aos produtos farmacêuticos.

Conservantes antimicrobianos são substâncias adicionadas em

formas farmacêuticas não estéreis com a finalidade de protegê-las de

quaisquer crescimentos microbianos.

Para as formas farmacêuticas estéreis, acondicionadas em

embalagens de doses múltiplas, os conservantes antimicrobianos são

adicionados para inibir o crescimento de microrganismos

contaminantes durante o uso repetido das doses individuais.

A quantidade de conservante utilizada em uma formulação deverá ser

a mínima necessária para a proteção do produto sem prejudicar o

paciente ou consumidor.

Conservante deve ter largo espectro de atividade, em larga faixa de

pH ,durante a meia vida do produto,ser efetiva sobre cepas

específicas ATCC, ser compatível com componentes da fórmula,sem

interferir com a cor,sabor ou fragrância do produto ou da embalagem

primária,ser atóxico e não irritante e ser de custo aceitável.

Pequenas Quantidades de Conservante = crescimento

Alterações produtos ( propriedades organolépticas,viscosidade)

tornando-o inadequado ao uso;

Grandes Quantidade de Conservante =

efeitos tóxicos, como irritação de pele,levando

custo do produto que geralmente é repassado ao consumidor.

Insatisfação do Consumidor

A eficácia antimicrobiana, seja ela inerente ao produto ou devida à

adição de conservantes , precisa ser demonstrada para produtos

tópicos múltipla-dose; produtos orais; oftálmicos; otológicos; nasais;

fluidos de diálise; irrigação, etc.

Utilização de cepas padrão em concentrações conhecidas(105 e

à 106 UFC/g ou ml.

Teste realizado com bactérias , fungos e leveduras.

Testes são realizados 0h ,7dias, 14dias, 21dias e 28dias.

Microrganismos utilizados

• Candida albicans ATCC 10231

• Aspergillus niger ATCC 16404

• Escherichia coli ATCC 8739

• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

• Staphylococcus aureus ATCC 6538

• In house

Critérios de Aceitação

DESINFETANTES, SANITIZANTES E ESPORICIDAS

Sanitizantes, desinfectantes e esporicidas são agentes químicos que reduzem,

eliminam ou destroem microorganismos.

Ambientes de alta carga microbiana incluem hospitais, processadores de alimentos,

laboratórios clínicos, instituições, consumidor, entre outros.

Testes para utilização desses mesmos agentes químicos em operações de fábrica

com BPF também são requeridos antes de sua utilização.

✓ Álcool

✓ Composto contendo bromo/Iodo

✓ Aldeídos

✓ Compostos de Quaternário de Amônio

✓ Fenólico

✓ Peróxido de Hidrogênio

✓ Cloro e Hipoclorito

Composição

✓ Ácido Peracético / Peróxido de Hidrogênio

✓ Β-Propiolactona

✓ Òxido de Etileno

✓ Ozônio

✓ Dioxido de Cloro

Composição

CLASSIFICAÇÃO DOS SANITIZANTES

Fonte: <1072> USP43-NF38 - 7608

ASPECTO REGULATÓRIO

IN 35/2019 – Boas Práticas de Fabricação Complementares a Medicamentos

Estéreis.

ASPECTO REGULATORIO

Annex 1 do PIC/S

4.37 The disinfection process should be validate. Validation studies should demonstrate

the suitability and effectiveness of disinfectants in the specific manner in wich they are

used and should support the in-use expiry periods of prepared solutions.

O processo de desinfecção deve ser validado Os estudos de validação devem

demonstrar a adequação e eficácia dos desinfetantes na forma específica em que são

usados e devem apoiar os prazos de validade em uso das soluções preparadas.

FARMACOPÉIAS E GUIAS

✓ <1072> Disinfectants And Antiseptics

✓ Relatório Técnico nº70 – PDA Fudamentos de Limpeza e Programa de Desinfecção

para instalações produtivas assépticas.

MÉTODOS

✓ Relatório Técnico nº70 – PDA Fudamentos de Limpeza e Programa de Desinfecção

para instalações produtivas assépticas.

✓ AOAC Internacional

✓ ASTM (American Society for Testing and Materials.

TESTE DE EFICÁCIA DE SANITIZANTES

SELEÇÃO DOS AGENTES DESINFETANTES

Escolha do sanitizante

Composto por vários processos: Validação do sistema desinfetante, Validação do

Procedimento de Limpeza in vitro, Validação do Procedimento de Limpeza in situ.

• Biocarga – Qual a biocarga média (histórico), sabendo a classificação da área eu sei

qual o microorganismo eu pretendo encontra.

• Quais são o microorganismos indesejáveis

• Superfície Verificar a compatibilidade entre o desinfetante e o material que compõe a

superfície que ele vai ser aplicado.

✓ Tempo de Contato (tempo de contato é compatível com o processo de produção?)

decisão multidisciplinar.

✓ Presença de Matéria Orgânica (avaliar se o resíduo ataca a eficácia do meu

desinfetante)

✓ Preparo (pronto para uso? Preparado in loco? Quais materiais serão utilizados?

Frascos âmbar?

✓ Aspecto regulatório – Regulamentado pela Anvisa?

✓ Segurança – Quais são o riscos envolvidos

✓ Vida útil – Qual o tempo de vida útil após o preparo?

✓ Residuos – Resíduos é compatível ao processo? Métodos de Remoção?

Compatibilidade do Blend? Agua?

✓ Método de Aplicação (MOP? Borrifar?)

✓ . Água

FATORES QUE INTERFEREM

✓ Temperatura

✓ pH

✓ Concentração

✓ Tempo de Contato

✓ Superfície

✓ Qualidade da água (dureza)

✓ Presença de matéria orgânica

Um nível mais elevado de inóculo deve ser utilizado e não deve

exceder 105.

. Cepas 06 a 10 microorganismos incluindo os microorganismos in

house.

Fonte: <1072> USP43-NF38 - 7608

O que avaliar?

Tempo de contato (Time Kill)

Avaliação da Estabilidade

RD = log (N0) – log (NT)RD é a redução

NO é a contagem inicial obtida no controle do inóculo

em UFC/mL

NT é a contagem obtida no tempo de contato T com a

amostra em UFC/mL

PASSO A PASSO

1. Sobre uma placa de petri colocar a superfície teste e adicionar 100uL do microorganism na

concentração prevista no protocolo.

2. Espalhar e secar o inóculo.

3. Adicionar 5mL do desinfetante desafio sobre a superficie a ser testada (molde)

4. Com auxílio de um cronômetro deixar em contato de acordo com os tempos previstos no

protocolo.

5. Adicionar 20ml do caldo neutralizante sobre a superficie teste e agitar suavemente

6. Transferir a superfície teste para o conjunto de filtração, dispensar o neutralizante que

estava na placa e completer o caldo até 200mL.

7. Aguardar 1 minute, realizar a filtração e exaguar a placa com 3 porções de 200ml de

diluente de enxague.

8. Ao final da filtração, retirar o molde e colocar a membrana sobre o meio de cultura

específico para bactérias e bolores e incubar conforme métodos especifícios previsto no

protocolo.

FALHAS

1. Relação de desinfetante e microorganismo inadequado

2. Uso de métodos inadequados

3. Falta de planejamento

4. Tempo de contato insuficiente

5. Neutralização inadequada

6. Toxicidade do neutralizador

7. Baixa Viabilidade da suspensão do inóculo

8. Erros no prepare da suspensão de esporos fungicos e bacterianos

9. Superfícieis porosas

10. Moldes não passiveis de esterilização ao calor umido

11. Letalidade após secagem

12. Definição de metas de redução logarítimas altas

13. Placas incontáveis

14. Método de recuperação não validado

Cálculo:

RD = log (N0) – log (NT)RD é a redução

NO é a contagem inicial obtida no controle do inóculo em UFC/mL

NT é a contagem obtida no tempo de contato T com a amostra

em UFC/mL

Critérios de aceitação:

A taxa de recuperação deve ser suficiente para demonstrar o log de redução de

eficácia dos agentes saneantes, de não menos que 3 log de redução para

microorganismos na forma não esporulada e não menos que 2 logs para

microorganismos na forma esporulada.

✓ Testes de Controle ( Neutralizante, Diluente, Fertilidade e Esterilidade dos meios

de cultura) aprovados.

Alessandra Cristo,

alessandraapmoraes@hotmail.com,

(62) 99121-1361

OBRIGADO!

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