Obtenção de Proteínas Para Análise Proteômica

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCentro de Desenvolvimento Tecnológico

– CDTecCurso de Pós-Graduação em

Biotecnologia

Prof. Luciano Pinto

Característica das Proteínas

Caroline Rizzi/Luciano

Caroline Rizzi/Luciano

Ponto Isoelétrico

É no ponto isoelétrico que a proteína apresenta-se com menor solubilidade!!!!

Caroline Rizzi/Luciano

Importância do cálculo do pI

1.Vector NTI2.Expasy

• Focalização isoelétrica• Solubilidade• Purificação:• Proteínas ácidas:

pH>pI: troca iônica• Proteínas básicas:

pH<pI: troca catiônica

Caroline Rizzi/Luciano

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Caroline Rizzi/Luciano

Caroline Rizzi/Luciano

Caroline Rizzi/Luciano

Caroline Rizzi/Luciano

Preparação do extrato bruto para purificação

Questões?

Qual é a fonte de proteínas?

Tecido, bactérias, intra ou extracelular?

Quais são os equipamentos disponíveis?

Qual é a escala de purificação?

Quais serão os procedimentos de purificação a serem utilizados?

Qual é o grau de pureza e atividade biológica desejados?

Luciano

Preparação do extrato bruto para purificação

Condições básicas de obtenção

Realização rápida

Temperaturas baixas

Presença de tampão adequado e capaz de manter o pH e de força iônica que estabilize a amostra

Amostras limpas e livres de partículas insolúveis.

Luciano

Escolha do tampão• Características do tampão• Concentração:quanto maior,maior tamponamento,mas

não maior que 0,1M• Tampões desejáveis:

– 1. pKa do tampão deve ser próximo ao pH final da solução e não exceder o limite de 1;

– 2. O pH do tampão não pode ser afetado pelas pequenas variações de temperatura, diluições e adição de sais neutros;

– 3. O tampão não deve ser reativo quimicamente;– 4. Não pode absorver luza 280 nm;– 5. Para cromatografias de troca iônica, usar tampão iônico;– 6.Tampões não podem interagir com componentes da

mistura(ex;ácidobórico e glicoproteínas).

• Good’s buffers*:• MES, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, HEPES, TAPS,

CHES, CAPS: quimicamente não reativos, não absorvem a 280 nm, o valor de pH não varia com temperatura e sais

• Muito mais caros• Variações pequenas no pH (0,05 u): concentrações de

0,1 a 0,2 mM• Variações bruscas no pH (> 0,1 u): concentrações acima

de 50mM• Reações enzimáticas: cuidar a liberação ou captação de

prótons•*N. E. Good. G. D. Winget, W. Winter, T. N. Connolly, S. Izawa, and R. M. M. Singh, Biochernisrry5, 467 (1966)

Escolha do tampão

Caroline Rizzi

Caroline Rizzi

Aditivos ao tampão• NaCl;• EDTA;• Detergentes;• Inibidores de proteases;• Agentes redutores;• DNAsese RNAses;• Estabilizantes;• Conservantes.

Caroline Rizzi/Luciano

Aditivos ao tampão

Caroline Rizzi

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Caroline Rizzi

Caroline Rizzi

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Preparação do extrato bruto

• Centrifugação• Remoção de ácidos nucléicos• Precipitação de proteínas• Diálise• Filtração• Concentração

Eliminação da maior parte dos contaminantes e substâncias insolúveis

Caroline Rizzi

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