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LIANA MELO LINS DE AZEVEDO
POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DO PETRÓLEO POR FUNGOS ISOLADOS DE SEDIMENTOS DE MANGUEZAL IMPACTADO
RECIFE
FEVEREIRO/2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS
POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DO PETRÓLEO POR FUNGOS ISOLADOS DE SEDIMENTOS DE MANGUEZAL IMPACTADO
Liana Melo Lins de Azevedo Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Biologia de Fungos. Área de Concentração: Fungos de Interesse Industrial Orientador: Cristina Maria de Souza Motta Co-orientador: Norma Buarque Gusmão
RECIFE
FEVEREIRO/2010
Azevedo, Liana Melo Lins de Potencial de degradação do petróleo por fungos isolados de sedimentos de manguezal impactado/ Liana Melo Lins de Azevedo. – Recife: O Autor, 2010. 58 folhas : il., fig., tab. Orientador: Cristina Maria de Souza Mota. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Biologia de fungos, 2010. Inclui bibliografia. 1. Fungos filamentosos 2. Biorremediação 3. Degradação do petróleo I. Título. 579.5 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2010-205
POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DO PETRÓLEO POR FUNGOS ISOLADOS DE SEDIMENTOS DE MANGUEZAL IMPACTADO
LIANA MELO LINS DE AZEVEDO
Data da defesa: 10/02/2010
COMISSÃO EXAMINADORA
MEMBROS TITULARES
Drª Cristina Maria de Souza Motta – Orientador Universidade Federal de Pernambuco
Drª. Janete Magali de Araújo Universidade Federal de Pernambuco
“Por mais que lutemos por um mundo melhor, sabemos que não podemos mudá-lo sozinhos. Mas a
esperança é sabermos que o aprendizado torna possível fazê-lo juntos!”
Bruno Ahnert
Agradecimentos
À Deus que esteve presente em todos os momentos, principalmente nos difíceis, concedendo a oportunidade do aprendizado, revelando seu poder e sua glória a cada instante da minha vida. À Universidade Federal de Pernambuco e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos pelo conhecimento e formação. Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos. Às orientadoras Profª Cristina Maria de Souza Motta e a Profª Norma Buarque Gusmão pela confiança em mim depositada, por estimular o meu crescimento na pesquisa e pela agradável convivência e amizade. Às professoras Maria José Fernandes e Débora Massa Lima da Coleção de Culturas – Micoteca URM, pelo carinho e competência fundamentais na identificação dos fungos filamentosos. Às amigas da Micoteca Marília, Stheffânia, Roberta, Paula, Odacy, Tatiane, Minelli, Polyanna, Juliana e Eliane pelos momentos descontraídos e auxílio quando solicitado. Um agradecimento especial à Cynthia, Rita, Carla, Diana, Breno e Persio por toda ajuda e apoio durante o desenvolvimento da fase prática em laboratório e, principalmente, pela amizade e carinho de todos vocês. À todos os colegas do Departamento de Antibióticos: Adriana, Mariana, Julliana, Erick, Flávia, Aline, Nelânia, Débora e Bárbara. Aos meus pais Davi e Letícia e irmãs Luísa e Gabi, pois sem o carinho, amor e amizade deles, não estaria aqui. Ao meu marido Eduardo pela paciência e incentivo fundamentais para a conclusão deste trabalho. À minha família pelo apoio incondicional.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... i
RESUMO
Os manguezais são considerados como um dos ambientes mais susceptíveis a
acidentes envolvendo derramamento de petróleo, o que constitui a principal e mais
danosa causa de contaminação dos solos e águas, demandando o desenvolvimento de
tecnologias que visam solucionar os problemas causados por esse impacto ambiental.
Dentre as novas tecnologias, a biorremediação tem surgido como a mais atrativa e
menos agressiva ao ambiente, pois utiliza o próprio metabolismo dos microrganismos
para eliminar ou reduzir os poluentes presentes na área contaminada. Neste trabalho
objetivou-se isolar fungos filamentosos de sedimentos de mangue impactado e
selecionar os mais promissores quanto à capacidade de degradação do petróleo. O
isolamento foi realizado pela técnica de diluições seriadas utilizando os meios de cultura
Ágar Sabouraud e Ágar Martin. As espécies obtidas no isolamento foram submetidas a
um teste qualitativo de degradação do petróleo utilizando o indicador redox 2,6-
diclorofenol-indofenol (DCPIP). A partir do teste qualitativo foram selecionados 5
isolados: Aspergillus niger, A. terreus, A. oryzae, Penicillium waksmanii e
Tallaromyces flavus, para serem submetidos à aclimatação em concentrações crescentes
de petróleo (2 a 12%), e em seguida foi realizado um planejamento fatorial para
conhecer a influência da agitação, pH, concentração celular e concentração da fonte de
nitrogênio (NH4NO3), tendo como variável resposta a biodegradação do petróleo. Foram
identificadas 14 espécies pertencentes aos gêneros Aspergillus, Cunninghamella,
Curvularia, Penicillium, Tallaromyces e Trichoderma. Todas as espécies testadas
promoveram a descoloração do indicador em tempos variados, destacando-se A. oryzae
e A. terreus, que apresentaram menor tempo de descoloração, 10 e 15h,
respectivamente. De uma maneira geral, observou-se aumento da biomassa e o pH se
manteve próximo a neutralidade. Com relação à fitotoxicidade, os produtos metabólicos
e o material residual presente no meio com A. oryzae e A. terreus demonstraram os
maiores índices de germinação para as sementes de pepino com 65,12% e 55,45%,
respectivamente. Com relação aos parâmetros avaliados, apenas a agitação apresentou
significância estatística. Os resultados obtidos sugerem A. oryzae como espécie
promissora para biorremediação de ambientes impactados por petróleo.
Palavras-chave: fungos filamentosos, biorremediação, sedimentos mangue, petróleo.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... ii
ABSTRACT
Mangroves are classified as one of the environments more prone to accidents
involving oil spills, which are the single and most damaging cause of contamination of
soil and waters, requiring the development of technologies to solve the problems caused
by this environmental impact. Among the new technologies, bioremediation has
emerged as the most attractive and less aggressive to the environment because it uses
the own metabolism of microorganisms to eliminate or reduce pollutants in the
contaminated area. This work aimed to isolate filamentous fungi from mangrove
sediments impacted and select the most promising on the ability of degradation of oil.
The isolation was performed by serial dilution technique using the culture media
Sabouraud Agar and Agar Martin. The species obtained in culture were subjected to a
qualitative test of degradation of oil using the redox indicator 2,6-dichlorophenol-
indophenol (DCPIP). From the qualitative test 5 isolates were selected: Aspergillus
niger, A. terreus, A. oryzae, Penicillium waksmanii and Tallaromyces flavus to be
submitted to acclimation to increasing concentrations of oil (2 to 12%), and then was
performed a factorial design to know the influence of agitation, pH, cell concentration
and concentration of nitrogen source (NH4NO3), having as variable response the
biodegradation of oil. There were identified 14 species belonging to the genera
Aspergillus, Cunninghamella, Curvularia, Penicillium, Tallaromyces and Trichoderma.
All species tested promoted the bleaching of the indicator at various times, especially A.
oryzae and A. terreus, which showed lower clearing time, 10 and 15h, respectively. In
general, there was an increase in biomass and the pH remained near neutrality. In
relation to the phytotoxicity, metabolic products and wastes present in the medium with
A. oryzae and A. terreus showed the highest rates of germination for seeds of cucumber
with 65.12% and 55.45% respectively. In relation to the parameters evaluated, only
agitation was statistically significant. The results suggest A. oryzae as promising specie
in the bioremediation of environments impacted by oil.
Keywords: filamentous fungi, bioremediation, mangrove sediments, oil.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... iii
Lista de Figuras
Fundamentação Teórica Pág.
Figura 1 – Estrutura de alguns hidrocarbonetos do petróleo...................................................... 3
Capítulo 1
Figura 1. Número de espécies identificadas a partir dos experimentos - O (osmocote); NPK e
C (controle) - nas 6 coletas realizadas.....................................................................................
Figura 2. Tempo (horas) da redução do indicador DCPIP das 14 espécies testadas obtidas do
sedimento de mangue impactado por petróleo...........................................................................
Capítulo 2
27
29
Figura 1. Biomassa (g/L) dos fungos após 7 dias de experimento em concentrações
crescentes de petróleo.................................................................................................................
38
Figura 2. Valores de pH após 7 dias de experimento à concentrações crescentes de petróleo... 38
Figura 3. Teor de óleos e graxas após 7 dias de experimento à concentrações crescentes de
petróleo.......................................................................................................................................
39
Figura 4. Diagrama de Pareto para o planejamento fatorial 24, cuja variável dependente é a
redução no teor de óleos e graxas...............................................................................................
42
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... iv
Lista de Tabelas
Capítulo 1 Pág.
Tabela 1 - Espécies isoladas nas seis coletas realizadas a partir de sedimento do manguezal
de São Francisco do Conde – BA...........................................................................................
26
Capítulo 2
Tabela 1 - Matriz do Planejamento Experimental 24.................................................................. 36
Tabela 2 - Índice de Germinação para sementes de pepino nos ensaios de aclimatação dos
fungos a diferentes concentrações de petróleo...........................................................................
39
Tabela 3 - Análise de variância entre as variáveis pH, agitação, concentração celular e
concentração da fonte de nitrogênio NH4NO3..........................................................................
41
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... v
SUMÁRIO
Pág.
RESUMO.................................................................................................................................................. i
ABSTRACT............................................................................................................................................. ii
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................................. iii
LISTA DE TABELAS............................................................................................................................. iv
SUMÁRIO................................................................................................................................................ v
1. INTRODUÇÃO................................................................................................................................... 1
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...................................................................................................... 2
2.1. Petróleo e derivados............................................................................................................................ 2
2.2. Processos utilizados para limpeza de áreas poluídas.......................................................................... 5
2.2.1. Biorremediação................................................................................................................................ 6
2.3. Fatores que influenciam na biodegradação de hidrocarbonetos......................................................... 8
2.4. Microrganismos na biorremediação................................................................................................... 9
2.4.1 Bactérias........................................................................................................................................... 10
2.4.2 Fungos.............................................................................................................................................. 12
2.5. Aspectos bioquímicos da biodegradação de hidrocarbonetos............................................................ 14
2.6. Manguezal.......................................................................................................................................... 15
2.7 Ecotoxicidade...................................................................................................................................... 17
2.8 Planejamento de Experimentos........................................................................................................... 18
CAPÍTULO 1 - Avaliação do potencial de fungos filamentosos isolados de sedimento de mangue impactado na degradação do petróleo...................................................................................................
22
Resumo...................................................................................................................................................... 22
Introdução.................................................................................................................................................. 22
Material e Métodos.................................................................................................................................... 24
Resultados e Discussão.............................................................................................................................. 26
Conclusão.................................................................................................................................................. 31
CAPÍTULO 2 - Potencial de degradação de petróleo por fungos filamentosos................................. 33
Resumo...................................................................................................................................................... 33
Introdução.................................................................................................................................................. 33
Material e Métodos.................................................................................................................................... 34
Resultados e Discussão.............................................................................................................................. 37
Conclusão.................................................................................................................................................. 42
CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................................................................ 43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................................. 44
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 1
1. INTRODUÇÃO
A contaminação do solo com petróleo e derivados tem se tornado um problema
mundial. O óleo cru é física, química e biologicamente prejudicial ao solo devido aos
seus compostos tóxicos, presentes em concentrações elevadas (Franco et al., 2004).
Entre os ecossistemas costeiros, o manguezal está classificado como um dos mais
sensíveis e vulneráveis a vazamentos de óleo, devido ao aumento das atividades
portuárias, mais especificamente, do transporte de petróleo (Cury, 2002; Monteiro,
2003). A necessidade de descontaminar esses ambientes conduz ao desenvolvimento de
técnicas de limpeza como, por exemplo, a biorremediação (Baker e Herson, 1994;
Rosenberg et al., 1996).
A biorremediação pode ser definida como um conjunto de tecnologias, que
utilizam processo(s) biológico(s), aplicados à recuperação ou remediação de áreas
contaminadas. Para isto, em geral, utilizam-se microrganismos, plantas ou produtos
biológicos, como enzimas e componentes celulares, com a finalidade de transformar os
poluentes orgânicos em água e CO2, num processo chamado mineralização (Genow et
al., 1994; Dias, 2000). Esta técnica pode ser considerada uma alternativa promissora e
ecológica na limpeza de ambientes contaminados por petróleo, devido a maioria dos
compostos orgânicos serem biodegradáveis (Atlas, 1995). A biorremediação pode ser
realizada com a adição de nutrientes e a otimização de condições ambientais do solo
(pH, temperatura, umidade, etc.), num processo chamado de bioestimulação, ou pela
adição de microrganismos com a capacidade de degradar rapidamente contaminantes
específicos, conhecida como bioaumento (Seabra, 2001). Também pode ser executada
ex situ, quando há a necessidade de remoção do material contaminado para a realização
do processo de tratamento fora do local poluído, ou in situ, quando o tratamento do
material é realizado no próprio ambiente onde ocorreu a contaminação, não sendo
recomendada a remoção do material contaminado a fim de evitar maior impacto
(Boopathy, 2000).
A biodegradação é um processo lento e sua cinética pode estar condicionada à
concentração de oxigênio, temperatura, nutrientes (especialmente o nitrogênio e o
fósforo), salinidade, receptores de elétrons, pH, composição estrutural dos
hidrocarbonetos e biodegradabilidade dos compostos (Raymond et al., 2001).
Entretanto, a pré-exposição do local a um composto químico poluente ou a um
composto quimicamente semelhante, pode influenciar na velocidade de degradação
deste composto, pela indução de enzimas específicas dos microrganismos presentes, ou
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 2
pelo aumento da população degradadora (Racke, 1990). Esse processo tem sido
chamado de adaptação, o qual pode ser resultado de mudanças genéticas, fisiológicas ou
ecológicas da comunidade microbiana (Brito et al., 2004).
Os fungos constituem uma grande parte da biomassa microbiana no solo,
contribuindo para muitos processos de decomposição, sendo relatados como os
microrganismos mais importantes na biodegradação de hidrocarbonetos presentes em
solos (Jones e Eddington, 1968; Rosato, 1998), principalmente por serem capazes de
interagir fisicamente com o poluente e crescer sob condições ambientais de estresse,
como baixos valores de pH, pobres em nutrientes e com baixa atividade de água
(Mollea et al., 2005; Atagana, 2006).
Paralelamente à remediação de locais contaminados por petróleo, existe a
necessidade do desenvolvimento de testes para a avaliação da ecotoxicidade dos
produtos gerados, visando à definição da qualidade aceitável do solo para o
restabelecimento do equilíbrio do ecossistema (Chapman, 1999; Andréa e Pettinelli Jr.,
2000). Dentre esses, os testes utilizando vegetais constituem um recurso prático de
baixo custo e de sensibilidade razoável na indicação qualitativa da presença de
substâncias tóxicas ou inibidores biológicos (Pelegrini et al., 2006). Neste sentido, os
testes de fitotoxicidade baseados na germinação de sementes e no crescimento radicular
têm sido propostos por diversas agências governamentais, como parte da avaliação do
potencial de contaminação de resíduos e/ou rejeitos dispostos no ambiente (OECD,
1984; USEPA, 1996).
Este estudo teve como principal objetivo avaliar a capacidade de fungos isolados
de sedimento de mangue impactado, quanto à degradação de petróleo e avaliar a
influência de diferentes parâmetros no processo de biodegradação.
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. PETRÓLEO E DERIVADOS
O termo petróleo refere-se aos derivados de matéria orgânica, originados há
milhões de anos, a partir da decomposição de pequenos animais marinhos, plâncton e
vegetação típica de regiões alagadiças que foram depositados sob camadas sucessivas
de lama e sedimentos, resultando na produção e acumulação de milhares de diferentes
tipos de moléculas orgânicas em sedimentos antigos (UNEP, 1992; Fonseca, 1992). É
encontrado em grandes quantidades sob a superfície terrestre e usado como combustível
e matéria-prima para a indústria química (Wasserman e Plachta, 1994). A fração líquida
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 3
total do petróleo, denominada de óleo cru, é encontrada junto ao gás natural (metano),
formando bolsões entre rochas impermeáveis ou impregnando rochas de origem
sedimentar. Na composição química do petróleo encontram-se uma mistura complexa
de diversos compostos orgânicos, os quais podem ser separados em classes distintas em
função da sua estrutura molecular, como olefinas, n-alcanos, parafinas ramificadas,
parafinas cíclicas, compostos aromáticos, compostos oxigenados e compostos
sulfurados. Entretanto, destacam-se os hidrocarbonetos, compostos orgânicos que
contém carbono e hidrogênio, os quais constituem de 50-98% da composição total do
petróleo, sendo formados por alcanos, cicloalcanos e compostos aromáticos, com pelo
menos um anel benzênico em sua estrutura (Fig.1) (Botello, 2005).
Figura 1. Estrutura de alguns hidrocarbonetos do petróleo
Os derivados de petróleo são obtidos a partir da destilação do óleo cru, onde as
frações são submetidas a tratamentos complexos para que sejam convertidas nos
produtos finais desejados, tais como: a) produtos de baixo peso molecular - gasolina,
combustíveis de aviação e óleo Diesel; b) produtos de alto peso molecular - óleos
lubrificantes e outros combustíveis; c) produtos de altíssimo peso molecular - asfaltenos
e piches (Millioli et al., 2008).
A sociedade moderna é dependente do petróleo, porém, este, representa uma
significativa fonte de poluição, por causar efeitos ecológicos de curta e longa duração e
trazer prejuízos às atividades socioeconômicas nos territórios atingidos (La Grega et al.,
1994). Os impactos ambientais ocasionados pelo petróleo ocorrem, principalmente pelas
diversas atividades destinadas à exploração como extração, transporte, refino,
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 4
transformação e utilização deste hidrocarboneto e/ou derivados (Aleixo et al., 2007;
Jacques et al., 2007). Todas essas atividades envolvem riscos de derrames acidentais,
que podem ser minimizados, mas não totalmente eliminados. Felizmente, os grandes
derrames que contaminam oceanos e áreas costeiras de forma significativa não ocorrem
com frequência, como os desastres ambientais com 200 mil toneladas de petróleo
despejadas na costa da França pelo acidente com o navio petroleiro Amoco Cadiz
(1978) deixando uma mancha de 110km nas praias da Grã-Bretanha e ainda, as cerca de
40 mil toneladas de petróleo lançadas pelo Exxon Valdez no litoral do Alasca (1989),
onde a riqueza da fauna local fez deste, um dos mais graves acidentes da história; o
incêndio do Haven, na costa da Itália, devido a 140 mil toneladas de óleo a bordo
(1991); o navio Prestige (2002) que transportava 77 mil toneladas de petróleo e se partiu
na costa da Galícia, Espanha, provocando o vazamento de 40 mil toneladas, as quais
atingiram centenas de quilômetros da costa causando grande impacto ambiental e
transtornos econômicos irreparáveis (Drago, 2003; CETESB, 2009; ITOPF, 2009).
O primeiro acidente ocorrido no Brasil foi em 1974, com o navio Takimyia
Maru no estado de São Paulo. O segundo ocorreu em 1975, causado pelo rompimento
do casco do navio-tanque iraquiano Tarik Ibn Ziyad, no canal central de navegação da
Baía de Guanabara atingindo várias praias nas cidades do Rio de Janeiro e de Niterói,
tanto no interior da Baía quanto na costa oceânica. O óleo provocou incêndios em áreas
de manguezal, em torno da baía, e a contaminação afetou seriamente a biota da zona
entremarés (Crapez et al., 2002). Outro grande acidente ambiental envolvendo
vazamento de petróleo ocorreu no Estado de São Paulo em 1978, quando o navio-
tanque Brazilian Marina, derramou cerca de 6000 toneladas de óleo no Canal de São
Sebastião. Em agosto de 1997, um vazamento nas instalações dos Dutos e Terminais do
Sudeste (DTSE) atingiu o manguezal adjacente à Refinaria Duque de Caxias (Reduc),
na baía de Guanabara. Além do manguezal, o óleo se espalhou pelas praias de
Freguesia, Barão, Pitangueiras, Bandeira e Zumbi, localizadas na ilha do Governador.
Em janeiro de 2000, outro vazamento de óleo ocorreu no mesmo local, atingindo
inúmeros manguezais, além da ilha de Paquetá e do norte e leste da ilha do Governador.
Esse vazamento foi considerado um dos maiores acidentes com petróleo já ocorridos na
baía de Guanabara. Neste mesmo ano o duto da Refinaria Getúlio Vargas se rompeu, em
Araucária - Paraná, espalhando mais de 4 milhões de litros de óleo no rio Iguaçu,
provocando um grave impacto ao ambiente, acarretando a morte de peixes e várias
espécies de animais (Santo, 2002). Em 2004, mais um registro de acidente ocorreu no
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 5
Paraná com um navio de bandeira chilena que derramou óleo e metanol, atingindo
manguezais e praias (CETESB, 2009). Mais recentemente, em abril de 2009, ocorreu
um vazamento de aproximadamente 2,5 mil litros de óleo da Refinaria Landulfo Alves,
em Mataripe - Bahia, que atingiu praias na Baía de Todos os Santos (IMA, 2009).
Em virtude dessas ocorrências, a recuperação de áreas degradadas vem se
configurando como um desafio e tornando-se objeto de interesse cada vez maior para os
pesquisadores.
2.2. PROCESSOS UTILIZADOS PARA A LIMPEZA DE ÁREAS POLUÍDAS
Após a detecção de um acidente ou mesmo de pequenos vazamentos, medidas
emergenciais são tomadas durante o derramamento de óleo com intuito de minimizar o
efeito do desastre. As técnicas existentes para o tratamento de áreas poluídas podem ser
classificadas segundo a natureza do processo – físico (mecânico), químico ou biológico
- e local onde ocorre o tratamento - in situ ou ex situ. Nos processos in situ, o tratamento
é feito no próprio local de contaminação, sem a extração do meio contaminado. Já nos
processos ex situ, o meio extraído é tratado em instalação de depuração específica
(Seabra, 2001). Essas técnicas devem levar em conta os tipos de microrganismos
existentes no local; condições da área e toxicidade do poluente; volume do material a
ser tratado; tempo e custo para a utilização da tecnologia e, principalmente, a
concentração final do contaminante, no término do tratamento, que deve ser considerada
como aceitável para o tipo de resíduo e uso futuro da área (Walter e Crawford, 1997).
A atenuação natural pode ser descrita como o conjunto de processos físicos,
químicos e biológicos que ocorrem espontaneamente após contaminação em uma
determinada área. Este processo inclui diversos mecanismos tais como: adsorção,
biodegradação, diluição, dispersão, estabilização, evaporação, fotoxidação,
volatilização, entre outros (Fernandes, 1994; Moreno, 2004).
Os processos abióticos de tratamento de áreas poluídas são definidos como
aqueles que envolvem métodos físicos ou químicos de remoção de poluentes (Piña et
al., 2002).
Os métodos físicos mais utilizados, em ambientes marinhos são as barreiras
mecânicas para a contenção da mancha oleosa e barcos dotados de bombas
recuperadoras de óleo. A coleta manual, com auxílio de pás e baldes é utilizada para a
remoção física do óleo nas areias das praias, seguida de lavagens, porém os meios
mecânicos de remoção não são totalmente eficazes e permitem o acúmulo nas áreas
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 6
atingidas pelo derramamento (Burns et al., 2000). Dentre os métodos químicos, os mais
comuns são a neutralização, precipitação, oxidação, aplicação de surfactantes e a
extração por solventes (Yerushalmi et al., 2003; Mariano, 2005). A maioria dos
surfactantes é obtida por síntese química a partir de derivados do petróleo, entretanto
sua aplicação e utilização podem causar impacto ambiental, uma vez que aumentam a
dissolução do óleo na água, afetando a biota; são tóxicos e não são biodegradáveis
(Nordvik et al., 1996; Desai e Banat, 1997).
As dificuldades encontradas na remediação abiótica de áreas contaminadas tem
levado ao desenvolvimento de novas tecnologias que enfatizam a detoxificação dos
contaminantes de uma forma não convencional, ou seja, sem a utilização de métodos
somente químicos ou físicos.
2.2.1 BIORREMEDIAÇÃO
Dentre as novas técnicas que visam à remediação de ambientes poluídos e a
recuperação de solos contaminados, a biorremediação surgiu como prática atrativa de
remoção de hidrocarbonetos de petróleo, por causa da simplicidade da manutenção,
aplicação em grandes áreas, baixo custo e da possibilidade de ocasionar a redução do
contaminante no local (Bento et al., 2005), além de ser a forma de tratamento menos
agressiva ao meio ambiente e a mais adequada à manutenção do equilíbrio ecológico, já
que é um sistema que estimula os processos naturais de remediação (Rahman et al.,
2002).
A biorremediação pode ser definida como um conjunto de tecnologias, que
utilizam processo(s) biológico(s) para a estimulação de situações naturais de
biodegradação visando a limpeza de derramamentos de óleos e tratamento de ambientes
terrestres e aquáticos contaminados com compostos xenobióticos (substância sintética
que polui o meio ambiente) (Prince, 1993; Dias, 2000). Os mais eficientes
biodegradadores são as bactérias, os fungos e as leveduras, devido à abundância, grande
diversidade de espécies, versatilidade catabólica e anabólica, bem como a capacidade de
adaptação às condições adversas do meio (Teixeira e Lima, 1991 apud Kataoka, 2001).
Através do metabolismo desses microrganismos, os poluentes orgânicos podem ser
transformados até água e CO2 (processo chamado de mineralização) (Genow et al.,
1994), além de biomassa e materiais húmicos (Grove, 1978; Thomas e Ward, 1989),
metano (CH4) e sais inorgânicos (Dineen et al., 1992). Esse processo pode ocorrer tanto
sob condições anaeróbicas como aeróbicas, sendo a última mais expressiva (Cookson,
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 7
1995), pois uma baixa concentração de oxigênio geralmente afeta a mineralização dos
hidrocarbonetos pelos microrganismos (Vasudevam e Rajaram, 2001). O resultado final
de um tratamento de biodegradação depende especialmente da toxicidade e
concentração inicial do contaminante, biodegradabilidade, propriedades do solo
contaminado e do sistema de tratamento escolhido (Dias, 2000).
Em função da importância do tema o Conselho Nacional do Meio Ambiente -
CONAMA publicou a resolução 314 de 29 de outubro de 2002, que dispõe sobre o
registro de produtos destinados à remediação, considerando que os acidentes com
vazamentos de substâncias potencialmente poluidoras, incluindo petróleo e seus
derivados, constituem uma das principais fontes de poluição do meio ambiente e que o
uso de remediadores - definidos como o produto, constituído ou não por
microrganismos, destinado à recuperação de ambientes e ecossistemas contaminados - é
uma opção viável nas ações específicas de recuperação, além de que em função de suas
peculiaridades ou de um uso inadequado, os remediadores podem acarretar
desequilíbrio no ecossistema e danos ao meio ambiente (CONAMA, 2002).
A biorremediação pode ser realizada aumentando-se a atividade microbiana
local, por meio da alteração da área degradada para propiciar as condições ótimas de
degradação biológica dos componentes tóxicos. O bioestímulo pode ser realizado
usando-se a adição de nutrientes e a otimização de condições ambientais do solo, como
ajuste de pH e controle da umidade e da aeração. Já o bioaumento, consiste na adição
de microrganismos exógenos com a capacidade de degradar rapidamente contaminantes
específicos, isolados naturalmente ou manipulados geneticamente, ou apenas seu DNA
purificado (Baker e Herson, 1994; Rosato, 1998; Boopathy, 2000; Seabra, 2001;
Martins, 2003).
Outras técnicas são citadas por Baker e Herson (1994) e Bento et al. (2005)
como a bioventilação, tratamento no qual o crescimento e atividade microbiana são
estimulados pela passagem de oxigênio pelo solo contaminado; o “landfarming” que é,
atualmente, uma das técnicas preferidas para a remediação de solos contaminados por
derramamento de combustíveis. Este método envolve o espalhamento e mistura dos
resíduos à camada fértil do solo, sendo, periodicamente, revolvidos para promover a
homogeneização, aeração e para facilitar o contato de microrganismos nativos como o
poluente. A homogeneização e a aragem do solo, geralmente, são realizadas por meio de
tratores utilizados na agricultura (Jorgensen et al., 2000); a compostagem, tratamento
aeróbico, termofílico que pode ser feito usando pilhas estáticas ou reatores de
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 8
alimentação contínua; a fitorremediação que utiliza sistemas vegetais (árvores,
arbustos, plantas rasteiras e aquáticas) e a sua microbiota com o fim de remover,
degradar ou isolar substâncias tóxicas do ambiente; os biorreatores técnica que pode
ser usada para tratar líquidos ou lodo, onde a biodegradação ocorre em um container ou
reator e os biofiltros que consiste no uso de colunas de suspensão microbiana para
tratar emissão de gases.
2.3. FATORES QUE INFLUENCIAM NA BIODEGRADAÇÃO DE
HIDROCARBONETOS
A biodegradação é o mecanismo primário de eliminação de hidrocarbonetos e
substâncias xenobióticas, sendo considerado como o processo mais importante para
determinar o destino final do óleo no ambiente marinho (Atlas, 1981; Ghazaly e Sayed,
2000).
A velocidade da degradação microbiológica dos hidrocarbonetos é influenciada
por diversos fatores físicos, químicos e biológicos, que direta ou indiretamente tem
influência sobre o metabolismo e, por conseguinte, no crescimento das espécies
microbianas, afetando a eficiência do processo (Macedo et al., 2002). Os principais
fatores que afetam a biodegradabilidade são relatados a seguir:
- Temperatura: Influencia no processo de biodegradação devido ao seu efeito no
metabolismo, composição da microbiota presente no sítio contaminado e nas
características físico-químicas dos hidrocarbonetos. Em geral, temperaturas mais altas
aumentam a taxa de metabolismo atingindo valores ideais entre 30°C e 40°C (Atlas,
1991). Nyer (1992) defende que a faixa ótima está entre 20°C e 45°C. Del’Arco e
França (2001) também relatam que a biorremedição em locais impactados por petróleo é
favorecida quando a temperatura está entre 20°C e 40°C.
- pH: A maioria dos microrganismos apresenta uma melhor taxa de desenvolvimento
em pH entre 6 e 8, com valor ótimo em torno de 7, sendo que os fungos são tolerantes a
condições mais ácidas, podendo ocorrer o dobro da taxa de biodegradação com a
correção do pH do solo (Verstraete et al., 1976; Bosset e Bartha, 1984; Rosato, 1998).
Condições extremas de pH, como as que ocorrem em solos ácidos ou desertos alcalinos,
influenciam negativamente na capacidade dos microrganismos degradarem
hidrocarbonetos em solo (Atlas, 1991).
- Nutrientes: Os hidrocarbonetos presentes na composição do petróleo podem servir
como substrato para o desenvolvimento dos microrganismos. Entretanto, outros
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 9
nutrientes como nitrogênio e fósforo são necessários, uma vez que em ambientes
contaminados por este poluente, as fontes de N e P estão em quantidades inadequadas
para o crescimento microbiano, tendo em vista a elevada quantidade de carbono
disponível a ser degradado (Miroslav et al., 1996). As fontes de nitrogênio mais
utilizadas em protocolos de biorremediação são uréia, cloreto de amônio e nitrato de
amônio e de fósforo são: fosfato de potássio e fosfato de sódio (Leahy e Colwell, 1990;
Lieberg e Cutright, 1999).
- Disponibilidade de Oxigênio: Geralmente a biorremediação ocorre mais facilmente
sob condições aeróbicas, uma vez que o catabolismo de hidrocarbonetos envolve a
oxidação inicial do substrato por oxigenases, sendo sua principal importância a de
funcionar como aceptor final de elétrons (Atlas, 1984). Amellal (2001) verificou que
regiões próximas à superfície do solo têm demonstrado maior velocidade na taxa de
degradação, enquanto que em regiões mais profundas estas taxas diminuem.
- Umidade: A umidade é um dos fatores que mais afeta a atividade microbiana pois, a
água é um componente indispensável à viabilidade das células vivas, além de auxiliar
nas trocas gasosas e no transporte de nutrientes (Alexander, 1999). Del’Arco e França
(2001), destacaram que o teor de umidade na faixa de 23,3% a 25,5% é o mais
apropriado para solos contaminados com hidrocarbonetos.
- Outros Fatores: Por fim, o uso da técnica da biorremediação depende de muitos outros
fatores, entre os quais: características do solo; tipo, composição, concentração,
biodisponibilidade e toxicidade dos poluentes; o histórico da contaminação; o
conhecimento da densidade da população de microrganismos degradadores de óleo e o
seu potencial de biodegradação, para o alcance das condições ótimas de biodegradação
(Hamdi et al., 2007; Bento et al., 2005).
2.4. MICRORGANISMOS NA BIORREMEDIAÇÃO
Diversos microrganismos possuem capacidade de degradar hidrocarbonetos do
petróleo, contudo, os principais são as bactérias e os fungos, os quais podem ser
encontrados em ambientes marinhos, de água doce e no solo. Até o momento, vários
gêneros de microrganismos com capacidade para degradar hidrocarbonetos foram
detectados no solo ou água contaminada por petróleo, o que sugere que cada um
desempenhe um papel no processo de transformação de hidrocarbonetos (Atlas, 1991;
Ramsay et al., 2000; Ghazali et al., 2004).
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 10
Os fungos são conhecidos pela sua diversidade e habilidade notável para
degradar materiais naturais complexos e persistentes, tais como lignina, quitina e
celulose. Portanto, algumas características dos fungos filamentosos, como a
bioatividade e o crescimento morfológico, os tornam potencialmente melhores
degradadores do que as bactérias. Além disso, os fungos demonstram que são capazes
de crescer sob condições ambientais de estresse, mesmo em baixos pH, baixo teor de
nutrientes e com baixa atividade de água (Mollea et al., 2005; Atagana, 2006). Porém, é
conhecido que os microrganismos podem não degradar o contaminante numa exposição
inicial, mas fazê-lo após uma exposição duradoura (Simom, 1999). Segundo Linkfield
et al. (1989), normalmente existe um período inicial de adaptação ao poluente em que
nenhuma transformação ocorre ou não é detectada, seguida por um período de início e
aceleração da degradação. Essas adaptações metabólicas tem sido objeto de estudo
quanto aos mecanismos que as causam, dentre elas a de adaptação e indução de enzimas
biodegradadoras, mutações genéticas ou adaptação fisiológica a condições de estresse
por carência nutricional (Brito et al., 2004).
2.4.1 Bactérias
Os primeiros estudos da utilização de hidrocarbonetos por microrganismos
foram realizados por Sohnger e Kaserer em 1906 (Bushnell e Haas, 1941). Em 1913,
Sohnger relatou que gasolina, querosene, parafina e óleo de parafina poderiam ser
oxidados a CO2, água e traços de ácidos orgânicos por bactérias pertencentes,
principalmente, aos gêneros Mycobacterium e Pseudomonas. Gray e Thornton (1928)
isolaram vários organismos capazes de decompor compostos aromáticos como
naftaleno, tolueno, cresol e fenol pertencentes aos seguintes gêneros: Micrococcus,
Mycobacterium, Bacterium, Bacillus e Spirillum.
Kobayashi e Rittmann (1982) relataram em seu trabalho, que os organismos
mais comumente isolados em áreas contaminadas por hidrocarbonetos foram bactérias
heterotróficas dos gêneros Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus, Vibrio,
Acinetobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium.
Leahy e Colwell (1990) citam os gêneros Achromobacter, Acinetobacter,
Alcaligenes, Arthobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia e Pseudomonas como os
mais importantes na degradação de hidrocarbonetos no ambiente.
Outros estudos sobre degradação de hidrocarbonetos feitos por Kadri et al.
(1986), Shamshoom et al. (1990), Sorkhoh et al. (1990), Al-Hadhrami et al. (1997),
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 11
identificaram como potenciais degradadores os isolados de Acinetobacter, Aeromonas,
Bacillus, Escherichia coli, Flavobacterium, Klebsiella cepacia, Micrococcus luteus,
Moraxella phenylpiruvica, Nocardia, Ochrobactrum anthropi, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas sp., Proteus mirabilis, Vibrio, Rhodococcus, Streptomyces,
Vibrio fisheri e Xanthomonas maltophilia.
Robert e Israel (1994) isolaram várias cepas de bactérias oleofílicas incluindo
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas fluorescens e
espécies de Acinetobacter e Flavobacterium, as quais foram capazes de utilizar vários
hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos (Diesel, óleo mineral, hexadecano, fenantreno,
entre outros), como fonte de energia.
Em estudo para avaliar o crescimento sobre o petróleo, Rentería e Miranda
(1998) utilizaram noventa cepas de bactérias, pertencentes a diversos gêneros
provenientes de amostras de água e solo contaminados com petróleo e observaram que
os gêneros que mostraram maior atividade de degradação foram: Micrococcus,
Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter e Flavobacterium. No processo de
biodegradação dos hidrocarbonetos do petróleo pelas bactérias, aproximadamente 50%
do carbono é usado para crescimento da biomassa bacteriana (Sharabí e Bartha, 1993).
Ururahy (1998) estudaram a viabilidade técnica do tratamento biológico de borra
oleosa em escala de bancada. A partir de estímulo de microrganismos nativos presentes
no resíduo oleoso, concluíram que os mesmos foram capazes de crescer em meio
contendo borra de óleo como única fonte de carbono e energia. A identificação desses
microrganismos revelou a presença das bactérias Pseudomonas cepacia, Pseudomonas
aureofaciens, Pseudomonas picketti, Flavobacterium indologenes, Xanthomonas
maltophilia e Ochrobactrum anthropi, além das leveduras Candida tropicalis e
Rhodotorula mucilaginosa e duas espécies de fungos filamentosos.
Bracho et al. (2005) demonstraram a capacidade de algumas bactérias
pertencentes aos gêneros Pseudomonas, Bacillus, Staphylococcus e Micrococcus,
provenientes de solos contaminados por petróleo na Venezuela, em degradar
hidrocarbonetos, constituindo-se como potenciais recuperadoras de ambientes
impactados.
Pedroti (2007) isolou um total de 19 cepas de bactérias, a partir de solos de horta
e sedimento de manguezal no Espírito Santo, que apresentaram capacidade de
biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo, as quais pertencem aos gêneros:
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 12
Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Serratia, Hafnia, Staphylococcus, Enterobacter,
Citrobacter, Listonella e Micrococcus.
2.4.2 Fungos
Os fungos parecem ser os microrganismos mais importantes na biodegradação
de hidrocarbonetos presentes em solos (Rosato, 1998). Neste ambiente, os atributos que
distinguem os fungos filamentosos das outras formas de vida determinam porque eles
são bons biodegradadores. Primeiramente o crescimento micelial proporciona uma
vantagem competitiva sobre as formas unicelulares como as bactérias e leveduras,
especialmente com respeito à colonização do substrato. Os fungos filamentosos podem
rapidamente se ramificar através do substrato, literalmente digerindo seu caminho
através da excreção de enzimas degradadoras. Em segundo lugar, a natureza
extracelular das enzimas de degradação permite que estes fungos tolerem concentrações
de substâncias químicas tóxicas mais altas, do que seria possível se estes compostos
tivessem de ser incorporados à célula. Adicionalmente os compostos insolúveis que não
são capazes de atravessar a membrana celular são suscetíveis ao ataque. E finalmente,
as enzimas produzidas frequentemente não apresentam natureza específica o que
significa que podem agir numa diversa gama de substratos químicos (Cerniglia et al.,
1992; Bennett e Faison 1997; Paszczynski e Crawford, 2000).
Alguns gêneros tais como Beauveria, Acremonium, Cladosporium, Fusarium e
Trichoderma tem sido descritos como degradadores de hidrocarbonetos de petróleo
(Hölker et al., 1995; Peintner e Moser, 1996; Chaîneau et al., 1999). Cunningamella
elegans e Phanerochaete crysosporium têm sido citados na literatura como agentes
capazes de serem utilizados na despoluição de solos e ambientes contaminados por
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (Barbiere, 1998). Ainda entre os fungos
hidrocarbonoclásticos mais citados estão Penicillium, Verticillium, Mortieriella, Phoma,
entre outros (Brito, 2004).
Emtiazi et al. (1997) estudaram algumas espécies de fungos filamentosos
isoladas de solo contaminado por petróleo para degradar derivados deste composto.
Dentre as espécies testadas, Aspergillus niger e Aspergillus puvus foram capazes de
crescer utilizando o fenantreno e antraceno como única fonte de carbono e energia.
Lima et al. (2006), identificaram oito fungos filamentosos isolados de solo
contaminado com óleo Diesel, pertencentes aos gêneros Aspergillus, Penicillium e
Trichoderma e avaliaram o potencial de degradação da fonte de carbono a partir da
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 13
velocidade de crescimento radial da colônia em meios contendo resíduos de derivados
de petróleo (Diesel e gasolina) e óleo de soja, como fontes de carbono. Os isolados que
apresentaram maior velocidade de crescimento radial pertenciam aos gêneros
Aspergillus e Trichoderma. Burkert et al. (2008) também utilizaram a taxa de
crescimento radial para avaliar o potencial de degradação de quatro linhagens de
Aspergillus sp. isoladas de solo contaminado no Rio Grande do Sul. As linhagens
demonstraram ser capazes de crescer em meios contendo diferentes hidrocarbonetos
específicos ou derivados de petróleo, como gasolina, óleo Diesel, hexano e
clorobenzeno, como únicas fontes de carbono.
Em estudo com fungos filamentosos isolados de águas residuárias de postos de
gasolina, Silva et al. (2007) selecionaram linhagens resistentes a condições adversas,
capazes de degradar compostos fenólicos. Foram isoladas e purificadas quatro linhagens
de fungos filamentosos pertencentes aos gêneros Aspergillus, Cladosporium, Penicilium
e Phoma.
Silva e Monteiro (2000) identificaram os gêneros Acremonium, Paecilomyces e
Penicillium, isolados de areia contaminada com fenóis, com potencial em degradar
compostos xenobióticos, como o organoclorado PCF (composto derivado do fenol) e os
corantes índigo e Azul Brilhante de Remazol – R (RBBR). Também estudando a
capacidade de descoloração do corante RBBR, Vitalli et al. (2006) testaram cinqüenta e
cinco isolados de fungos filamentosos obtidos de solos da Região da Baixada Santista
contaminados com resíduos industriais contendo uma mistura de organoclorados,
principalmente hexaclorobenzeno (HCB). Dentre as espécies testadas, Eupenicillium
crustaceum foi selecionada devido a sua capacidade de descolorir o corante
promovendo a transformação do HCB em um composto ambientalmente estável,
sugerindo esta como sendo uma espécie interessante para estudos de biorremediação.
Okerentugba e Ezeronye (2003) testaram algumas espécies de fungos
(Penicillium spp., Aspergillus spp. e Rhizopus spp) isoladas de dois rios e de um
efluente de uma refinaria na Nigéria para degradar óleo cru. Foi observado que os
microrganismos foram capazes de utilizar e degradar os constituintes do óleo cru, e
também que os degradadores podem ser isolados de um ambiente que não sofreu
poluição por petróleo, embora aqueles provenientes de ambientes impactados possuam
maior potencial de degradação.
A fim de investigar a possibilidade de utilização de espécies de fungos, isolados
de sementes oleaginosas de Detarium senegalense para degradar hidrocarbonetos do
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 14
petróleo e produtos derivados como Diesel, querosene e óleo de motor, Adekunle e
Adebambo (2007) identificaram cinco isolados: Aspergillus flavus, A. niger, Mucor,
Rhizopus e Talaromyces, com capacidade para serem explorados em processos de
biorremediação.
Uzoamaka et al. (2009) estudaram o potencial de degradação de hidrocarbonetos
por fungos filamentosos isolados a partir de solo contaminado por petróleo e concluíram
que dentre os 12 isolados, apenas 8 mostraram potencial para biodegradação. A maior
eficiência de biodegradação (>98%) foi exibida por A. versicolor e A. niger.
A capacidade dos fungos em recuperar ambientes contaminados por diferentes
poluentes aplica-se também a metais pesados (Peintner e Moser, 1996; Barclay et al.,
1998), defensivos agrícolas (Paoletti, 1999), corantes e compostos radioativos
(Haselwandter e Berreck, 1988), plásticos (Beuadette et al., 1998), herbicidas (Colla et
al., 2008), entre outros.
2.5. ASPECTOS BIOQUÍMICOS DA BIODEGRADAÇÃO DE
HIDROCARBONETOS
As vias bioquímicas utilizadas para a degradação de hidrocarbonetos dependem
do substrato a ser utilizado e do tipo de microrganismo envolvido. Embora muitos
mecanismos de biodegradação sejam conhecidos alguns aspectos precisam ainda ser
elucidados. Contudo, segundo Baker e Herson (1994) e Pereira-Jr et al. (2009), algumas
generalizações podem ser feitas:
i. Hidrocarbonetos alifáticos são em geral, mais facilmente biodegradados que os
aromáticos;
ii. Hidrocarbonetos alifáticos de cadeia normal são mais fáceis de serem
biodegradados do que os de cadeia ramificada. A introdução de uma ramificação
diminuirá sua biodegradabilidade;
iii. Hidrocarbonetos saturados são mais susceptíveis à degradação que os
insaturados. A presença de insaturações dificulta a biodegradação;
iv. Hidrocarbonetos alifáticos com tamanho de cadeia a partir de 8 átomos de
carbono são mais facilmente biodegradados tanto menor seja o tamanho de sua cadeia.
Hidrocarbonetos com menos de 7 átomos de carbono são mais difíceis de serem
biodegradados devido a sua toxicidade para os microrganismos.
O caminho metabólico responsável pela biodegradação aeróbica completa dos
alcanos lineares, normalmente envolve a ação de enzimas hidroxilases, conhecidas
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 15
também como monoxigenases, gerando os alcoóis correspondentes, a partir da oxidação
do grupo terminal (oxidação monoterminal). Posteriormente, os alcoóis produzidos são
oxidados a aldeídos e, então, a ácidos graxos, seguindo seu caminho metabólico até
atingir CO2 e H2O como produtos finais (Connan, 1981). Os alcanos ramificados
sobrem β-oxidação, como via degradativa mais comum, com formação de ácidos
dicarboxílicos (Fall et al., 1979).
Os cicloalcanos são particularmente resistentes a biodegradação (Chosson et al.,
1991). Inicialmente são transformados nos alcoóis correspondentes, que então sofrem
uma desidrogenação, formando cetonas. As enzimas envolvidas neste processo são as
ciclo-desidrogenases e monooxigenases, respectivamente. Numa etapa posterior há a
lactonização do anel por monooxigenases e a abertura do mesmo pela lactona-hidrolase
(Ururahy, 1998; Pereira-Jr et al., 2009).
O potencial de biodegradação dos hidrocarbonetos aromáticos está relacionado
ao número de anéis, posições, tipos e natureza das ramificações encontradas nas
moléculas (Peters e Moldowan, 1993). Tipicamente, a biodegradação de um composto
aromático simples pode envolver a oxidação do átomo de hidrogênio do anel aromático,
gerando dihidroxibenzeno (catecol) que, posteriormente, é clivado na posição orto ou
meta, sendo estas reações catalisadas por enzimas oxigenases (Ratledge, 1993; Baker &
Herson, 1994).
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) constituem a classe de
compostos orgânicos perigosos que contem dois ou mais anéis benzênicos condensados,
podendo se apresentar sob forma linear, angular, ou ainda em forma de cacho. Não são
abundantes no petróleo, mas geralmente os principais constituintes dos óleos
combustíveis. Esses compostos exercem, de maneira geral, efeitos carcinogênicos e
mutagênicos, além de tenderem a recalcitrância, devido à elevada hidrofobicidade e
consequente baixa solubilidade em água. O caminho metabólico sugerido para estes
compostos é o mesmo dos compostos aromáticos simples (Cookson, 1995; Pereira-Jr et
al., 2009).
2.6. MANGUEZAL
O manguezal é um ecossistema costeiro complexo, de transição entre os
ambientes terrestre e marinho. Característico de regiões tropicais e subtropicais está
sujeito ao regime das marés, dominado por espécies vegetais típicas, caracterizadas por
colonizarem sedimentos predominantemente lodosos, com baixos teores de oxigênio, às
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 16
quais se associam com outros componentes vegetais e animais (Hoff et al., 2002). As
florestas de mangue de todo o litoral brasileiro são compostas de três gêneros:
Avicennia (mangue preto), Laguncularia (mangue branco) e Rhizophora (mangue
vermelho), podendo existir ainda representantes do gênero Conocarpus, que vivem nos
bordos da floresta, sendo comum no litoral Norte (Por, 1994; Schaeffer-Novelli, 1995).
Citrón & Schaeffer-Novelli (1983) citam ainda as bactérias e os fungos como
importantes componentes dos manguezais, onde exercem destacado papel, atuando
como agentes decompositores da matéria orgânica produzida por todo o conjunto de
produtores primários.
A importância ecológica do manguezal é devida as funções que desempenha na
estabilização e proteção da linha costeira e por apresentar condições propícias para
alimentação, proteção e reprodução de muitas espécies animais, sendo considerado
importante transformador de nutrientes em matéria orgânica e gerador de bens e
serviços (Schaeffer-Novelli, 1995). Por outro lado, o manguezal tem um valor
econômico incalculável devido ao seu papel como criatório de espécies para a pesca,
extração de madeira para usos artesanais e comerciais, bem como extração de taninos -
substância a partir da qual se produzem tintas utilizáveis na manufatura de roupas - e
compostos úteis à indústria farmacêutica (Ipieca, 1993; Lewis, 2005).
Em todo o mundo, os manguezais estão sujeitos a impactos naturais e processos
de erosão, além dos impactos antrópicos associados às atividades das civilizações nas
zonas costeiras (NOAA, 1993). Estima-se que mais de 1 milhão de hectares de
manguezais são perdidos anualmente no mundo (Moscatelli, 1999). Entretanto,
derramamentos de petróleo no mar, ocasionados por acidentes marítimos no transporte
ou na exploração, tem causado catástrofes de grandes proporções ao meio ambiente e
aos seres vivos, principalmente quando atingem a região costeira (Cury, 2002; Ferrão,
2005). Áreas costeiras são classificadas como um dos ambientes mais críticos para
acidentes envolvendo derramamento de óleo, isto devido ao longo tempo de residência
do material fóssil nestes ambientes, que pode exceder a 10 anos, com um tempo
estimado de recuperação de 20 anos (Gundlach e Hayes, 1978).
Devido as suas características peculiares, o manguezal é fonte de
microrganismos promissores para serem utilizados em processos de biodegradação. O
trabalho de Zhuang e Peng (1995) demonstrou que os microrganismos isolados de solo
de manguezal possuem uma habilidade excepcional na degradação de óleo Diesel,
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 17
destacando o manguezal como importante na “bio-engenharia” das regiões estuarinas e
costeiras para a degradação do óleo Diesel.
Gomez-Roxas e Ayuno (2002) conduziram um estudo em dois manguezais
situados ao sul das Filipinas, para determinar o efeito do petróleo sobre as populações
de bactérias e fungos, bem como isolar microrganismos com potencial para
biodegradação do petróleo. A partir de análise por cromatografia em camada fina,
concluíram que três isolados de bactéria e dois de fungos degradaram parcialmente o
petróleo, e outros dois isolados de fungos foram capazes de degradar totalmente as
moléculas do óleo.
Salvo et al. (2005) encontraram comunidades de fungos com alta capacidade
para degradação in situ de compostos xenobióticos em ambientes impactados. Os
resultados apresentados por Brito et al. (2006) apontam para a rica diversidade
microbiana dos manguezais, cujo potencial para degradação de hidrocarbonetos é
promissor para futuros estudos sobre biorremediação de poluentes.
O impacto ambiental causado por vazamento de óleo na costa brasileira tem sido
uma ameaça permanente à integridade dos ecossistemas costeiro e marinho. Com o
aumento da produção petrolífera, um grande número de ocorrências de vazamentos e
derrames acidentais de petróleo em operações rotineiras (com pequena e média
gravidade) tem sido registrado (Botelho, 2003). Neste contexto faz-se necessário a
ampliação do conhecimento dos microrganismos presentes em manguezais visando
utilizar seu potencial metabólico para o desenvolvimento de tecnologias mais eficientes
na recuperação de ambientes impactados por petróleo e derivados.
2.7. ECOTOXICIDADE
A toxicidade é uma propriedade inerente dos agentes químicos que produzem
efeitos danosos a um organismo quando este é exposto durante certo tempo a
determinadas concentrações. Bioensaios de ecotoxicidade são metodologias analíticas
que buscam compreender a forma como os ecossistemas metabolizam, transformam,
degradam, eliminam, acumulam e sofrem ação da toxicidade das diversas substâncias
químicas neles introduzidas (Mello, 1981; Azevedo e Chasin, 2003). A exposição de
organismos vivos (bioindicadores) a estas substâncias é uma ferramenta valiosa de
análise ambiental. Dentre esses testes, os de fitotoxicidade tem recebido maior atenção
por se mostrarem úteis na previsão dos efeitos de uma complexa mistura de
componentes, como o petróleo (Banks e Schultz, 2005). A fitotoxicidade pode ser
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 18
determinada pela germinação das sementes, alongamento da raiz e crescimento da
muda. Os estudos de germinação são conduzidos por exposição direta da semente à
substância teste usando uma solução ou um suporte embebido na solução, como por
exemplo, papel de filtro. Para a avaliação do teste de germinação e crescimento das
raízes pode-se analisar tanto a taxa de germinação quanto o alongamento das raízes (ou
os dois) (Kapanen e Itavaara, 2001). Os testes de ecotoxicidade utilizando vegetais
possuem como vantagens o baixo custo e simplicidade, pois não requerem
equipamentos sofisticados, além da utilização de pouca quantidade de amostra. Por
estes motivos, muitos autores têm optado em utilizar esse teste para avaliar a
ecotoxicidade de metais pesados e compostos fenólicos (Wong, 1995), lodos de estação
de tratamento de efluentes e resíduos sólidos urbanos (Pascual, 1997), herbicidas
(Boutin et al., 2004) e para a obtenção do registro de produtos químicos comerciais
(Reis, 2003), além de serem propostos por diversas agências governamentais, como
parte da avaliação do potencial de contaminação de resíduos e efluentes dispostos no
ambiente (OECD, 1984; USEPA, 1996).
Algumas sementes que podem ser utilizadas nos testes de germinação e
crescimento das raízes são as de repolho, cebola, tomate, trigo e milho, sendo
recomendadas por órgãos internacionais como a OECD (Organization for Economic
Cooperation and Development); USEPA (United States Enviromental Protection
Agency) e FDA (Federal Drug Administration) (Fletcher, 1991). Muitos estudos têm
demonstrado a eficiência de outras espécies também recomendas por estes órgãos como
pepino, agrião (Helfrich et al., 1998), alface e soja (Gundersson et al., 1997) em testes
realizados para verificar a ecotoxicidade do óleo cru.
Barros (2007) utilizou o teste de fitotoxicidade utilizando a espécie Lactuca
sativa (alface) para verificar o efeito da adição de diferentes concentrações do
biossurfactante raminolipídio em solo contaminado com óleo cru e concluíram que à
medida que aumentou a concentração do biossurfatante, ocorreu um efeito inibitório da
germinação, chegando até 70 e 80 % no índice de germinação em relação à germinação
controle (sem o biossurfatante).
2.8. PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS
O planejamento de experimentos representa um conjunto de ensaios
estabelecidos com critérios científicos e estatísticos em que são realizadas alterações nas
variáveis consideradas importantes para o processo, denominadas de variáveis
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 19
independentes, de forma que se possa observar e identificar o efeito destas alterações
por meio das variáveis respostas ou dependentes (Montgomery, 2000). Entretanto, nem
sempre todas as variáveis estudadas apresentam influência significativa sobre as
variáveis de resposta, desta forma realiza-se uma triagem de descarte das variáveis não
significativas visando à racionalização do experimento (Barros-Neto et al., 1995).
O planejamento fatorial é de grande utilidade em investigações preliminares,
pois ainda não existe preocupação com uma descrição muito rigorosa da influência
desses fatores sobre a resposta (Barros-Neto et al., 1995).
Para executar um planejamento fatorial precisa-se especificar os níveis em que
cada fator será estudado, ou seja, os valores dos fatores (ou versões, nos casos
qualitativos) empregados nos experimentos. Um planejamento fatorial requer a
execução de experimentos para todas as possíveis combinações dos níveis dos fatores.
Cada um desses experimentos, em que o sistema é submetido, é um ensaio experimental
(Baptista, 2003).
Uma forma de identificar se um fator estudado ou interação entre os fatores
são ou não significativos no processo consiste na análise do teste t de Student. Caso
esse valor calculado seja maior que o tabelado, entende-se que este fator ou interação
é importante. Tal análise é melhor visualizada através do Gráfico de Pareto (Borges,
2001).
Tendo-se os devidos conhecimentos estatísticos, o planejamento experimental
fatorial é importante para a realização de trabalhos, pois permite verificar e selecionar as
variáveis que realmente interferem na obtenção dos resultados.
Baptista (2003) utilizou o planejamento de experimentos para avaliar a
concentração dos nutrientes, (NH4)2 SO4 e KH2PO4, que melhor contribuísse para a
biodegradação em um solo argiloso contaminado com petróleo e água de produção e
verificou que o teor de fósforo foi uma variável fundamental para favorecer a
biodegradação do óleo cru no solo contaminado. Ademais, observou que a eficiência de
remoção de matéria orgânica foi comprometida em função da concentração de (NH4)2
SO4, pois o aumento desta fonte de nitrogênio no solo ocasionou uma redução no
consumo de fósforo que foi prejudicial ao processo.
Pereira e Lemos (2003) realizaram um planejamento fatorial 32, para obter
informações sobre a influência da temperatura e capacidade de retenção de água sobre a
eficiência da biodegradação, usando Aspergillus versicolor como agente degradador,
visando otimizar os níveis apropriados para a biodegradação de hidrocarbonetos de
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 20
petróleo. Concluíram que a variável de resposta (eficiência de biodegradação) atingiu
resultados mais expressivos quando foi utilizado 100% da capacidade de retenção de
água e temperatura igual a 40ºC.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 21
CAPÍTULO 1
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 22
3. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS
DE SEDIMENTO DE MANGUE IMPACTADO NA DEGRADAÇÃO DO
PETRÓLEO1
RESUMO
O desenvolvimento de atividades industriais, portuárias, pesqueiras, exploração
mineral, turísticas, entre outras, sem planejamento adequado, vem colocando em risco
os atributos básicos dos estuários e ecossistemas associados, como os manguezais. Estas
atividades favorecem o acúmulo de diferentes poluentes no solo, entre eles o petróleo,
gerando impactos consideráveis, inclusive sobre a microbiota, fauna e flora. No presente
trabalho foram isolados fungos filamentosos a partir de amostras de sedimento de
mangue contaminado por petróleo e avaliado o potencial de degradação. Para o
isolamento foi utilizada a técnica de diluição seriada empregando os meios Ágar
Sabouraud e Ágar Martin, em placas de Petri, as quais foram incubadas em temperatura
de 28°C até o crescimento das colônias. Os isolados foram submetidos a teste
qualitativo de degradação de petróleo utilizando como indicador redox 2,6-diclorofenol-
indofenol. Os resultados obtidos indicaram 14 espécies pertencentes aos gêneros
Aspergillus, Cunninghamella, Curvularia, Penicillium, Tallaromyces e Trichoderma,
sendo Aspergillus e Penicillium os gêneros com maior número de isolados. Todas as
espécies promoveram a descoloração do indicador em tempos variados, destacando-se
Aspergillus oryzae (10h), A. terreus (15h), A. niger (20h), P. waksmaii (24h) e T. flavus
(27h) que apresentaram os menores tempos de descoloração do indicador, sugerindo que
esses isolados podem ser utilizados em processos de biorremediação.
Palavras-chave: fungos filamentosos, biorremediação, sedimento de mangue,
petróleo.
INTRODUÇÃO
Os manguezais são uma área de transição entre o ambiente terrestre e aquático
caracterizados por grande variação dos parâmetros físicos e químicos, característicos de
regiões tropicais e subtropicais, os quais favorecem a adaptação de várias espécies,
1Trabalho a ser enviado a revista Soil Biology and Biochemistry Azevedo, L.M.L., Souza, C.S., Fernandes, M.J., Lima, D.M.M., Araújo, J.M., Gusmão, N.B., Souza-Motta, C.M.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 23
inclusive microrganismos como fungos e bactérias (Odum,1988; Schaeffer-
Novelli,1995). Por apresentar-se em regiões costeiras e estuarinas, estão em uma
localização propícia à contaminação de dejetos dos grandes centros urbanos e também
de derramamentos de petróleo causados principalmente pelo transporte, exploração e
estocagem de grandes volumes de óleo, o que tem sido identificado como uma das mais
sérias ameaças aos ecossistemas costeiros (Hansel, 2000; Botelho, 2003).
Microrganismos capazes de oxidar hidrocarbonetos são relativamente
abundantes e frequentemente isolados de ambientes nos quais essas fontes de carbono
estão presentes, tanto de maneira natural (reservas petrolíferas), como introduzidas pelo
homem (casos de contaminação) (Atlas, 1991; Crapez et al., 1997; Greene et al., 2000).
A capacidade microbiana de catabolizar diferentes compostos orgânicos, naturais ou
sintéticos, e inorgânicos, extraindo destes compostos fontes nutricionais e energéticas,
veio possibilitar o emprego dos agentes biológicos, em processos de biorremediação,
como uma forma de mitigar os impactos gerados pelos rejeitos lançados no meio
ambiente (Bouwer e Zehnder, 1993).
A biorremediação é um processo biológico por meio do qual ocorre a
degradação de poluentes por microrganismos e segundo Raymond et al. (2001) está
condicionada a fatores como tipo de microrganismo, condições ambientais
(temperatura, níveis de oxigênio, umidade, salinidade), pH composição estrutural dos
hidrocarbonetos e biodegradabilidade dos compostos. Apesar de ser um processo lento,
a biodegradação é um dos maiores mecanismos naturais de remoção de compostos de
petróleo do ambiente (Braddock et al., 1994).
Os fungos constituem uma grande parte da biomassa microbiana no solo,
contribuindo para muitos processos de decomposição, sendo relatados como os
microrganismos mais importantes na biodegradação de hidrocarbonetos presentes em
solos (Jones e Eddington, 1968; Rosato, 1998), principalmente por serem capazes de
interagir fisicamente com o poluente e crescer sob condições ambientais de estresse,
como meios com baixos valores de pH, pobres em nutrientes e com baixa atividade de
água (Mollea et al., 2005; Atagana, 2006).
Este estudo teve como principal objetivo isolar e identificar espécies de fungos
filamentosos de sedimento de mangue (área de produção de petróleo) proveniente de um
manguezal ao norte da Baía de Todos os Santos, pertencente ao município de São
Francisco do Conde – BA e avaliar a capacidade de degradação de petróleo.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 24
MATERIAL E MÉTODOS
Área de Estudo
O município de São Francisco do Conde está localizado na Baía de Todos os
Santos (BTS), que é uma reentrância costeira inserida na microrregião do recôncavo
baiano, entre as coordenadas 12º37'40" S – 38°40'48" O, onde está localizado um campo
de produção de óleo da Petrobras.
Coleta
As coletas das amostras foram realizadas entre os meses de setembro a
dezembro de 2008 nos aquários do Laboratório de Simulação contendo sedimento de
mangue submetido a 3 condições experimentais :
• Experimento Controle – apenas o sedimento homogeneizado
• Experimento 1 – Sedimento homogeneizado + NPK™.
• Experimento 2 – Sedimento homogeneizado + OSMOCOTE™.
Os fertilizantes NPK™ e o OSMOCOTE™ foram utilizados na concentração de
1% do sedimento úmido.
Amostragens dos Sedimentos
Após a montagem do experimento foi realizada a coleta de três amostras no
tempo inicial do experimento e após 15, 30, 45, 60 e 90 dias. Em cada período foi
coletado 01 proveta de cada aquário o que equivale a 3 amostras dos aquários controles;
3 amostras dos aquários com NPK® e 3 amostras dos aquários com Osmocote®,
perfazendo um total de 09 amostras em cada período.
Após a coleta, as amostras foram acondicionadas em sacos plásticos
esterilizados, mantido a baixa temperatura e enviadas para o Laboratório de
Microbiologia, do Departamento de Antibióticos da UFPE, para o processamento e
isolamento dos fungos.
Isolamento e Identificação dos Fungos
Para o isolamento, 10g do sedimento foram colocados em frasco de Erlenmyer
(capacidade 250 mL) contendo 90mL (10-1) de tampão fosfato, seguido de agitação em
mesa agitadora a 180rpm, por 30min e 28°C. Posteriormente foram feitas suspensões
até 10-2 e 10-3 e em seguida 1mL de cada uma das suspensões foi transferido para placas
de Petri, em triplicata, contendo os meios Ágar Sabouraund e Ágar Martin, ambos
acrescidos de 100 (mg/L) de cloranfenicol. As placas foram incubadas em estufa a 30°C
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 25
por um período de até 5 dias. Posteriormente, fragmentos das colônias que
apresentavam características morfológicas visualmente distintas como cor, forma e
textura, foram transferidos para tubo de ensaio com meio apropriado, sendo em seguida
purificados. As amostras de fungos purificadas foram transferidas para meios de cultura
específicos (Ágar Czapek, Batata Dextrose Ágar ou Ágar Malte) a fim de se fazer a
identificação, onde foram observadas as características macroscópicas (coloração,
aspecto, e diâmetro das colônias) e microscópicas (microestruturas somáticas e
reprodutivas) segundo Ellis (1971, 1976), Raper e Fenell (1977), Sutton (1980),
Domsch et al., (1993), Pitt (1991), e Klich (2002), Kirk (2004), Leslie; Summerell
(2006), dentre outros.
Amostra e Caracterização Química do Petróleo
A amostra de petróleo utilizada em todos os ensaios foi proveniente da Bacia do
Recôncavo Baiano, extraído do Campo de Candeias – Bahia. Esta amostra foi cedida
pelo Laboratório de Estudos do Petróleo (LEPETRO), pertencente ao Núcleo de
Estudos Ambientais do Instituto de Geociências da Universidade Federal da Bahia
(UFBA).
A análise química da amostra do petróleo, referente a determinação das frações
de hidrocarbonetos saturados, aromáticos e dos compostos nitrogenados, sulfurados e
oxigenados (NSO), foi realizada pelo Laboratório de Processos Fermentativos,
pertencente ao Departamento de Antibióticos do Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE). As principais frações do petróleo foram
separadas por cromatografia liquida, realizada, a pressão ambiente, em colunas de vidro
recheadas com sílica gel, como agente adsorvente; e através de método gravimétrico
foram determinadas as porcentagens de cada fração (Souza, 2003).
Avaliação do Potencial de Degradação do Petróleo
A potencialidade dos fungos para degradar o petróleo foi avaliada segundo a
metodologia de Hanson et al. (1993), adaptada para estes microrganismos. O teste
qualitativo foi realizado com todas as espécies identificadas, utilizando placas de
poliestireno com 24 cavidades, onde foram adicionados, em cada cavidade, 475 µL do
meio Bushnell Haas (BH), 50 µL de petróleo, 375 µL do indicador redox 2,6-
diclorofenol-indofenol (DCPIP) e 100 µL de uma suspensão de conídios de cada isolado
utilizado. Foram utilizados dois controles sendo um biótico e outro abiótico, cuja
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 26
diferença foi a presença de glicose como fonte de carbono, no controle biótico e
ausência do inóculo no abiótico. O material foi incubado em estufa a 30ºC por até 72h
onde o tempo de redução do indicador DCPIP, de azul (oxidado) para incolor
(reduzido), foi observado diariamente no meio de cultivo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Baía de Todos os Santos - BTS apresenta características similares aos demais
setores costeiros, com atividades portuárias, ocupação urbana, a pesca, coleta de
mariscos e crustáceos para alimentação, além da atividade de produção de petróleo e
manutenção das embarcações utilizadas na pesca (Leão e Domingues, 2000; Queiroz e
Celino, 2009).
Onofre et al. (2009) determinaram que o sedimento na Baía de Todos os Santos
apresentam valores variando de 1 a 7% de areia grossa, 85 a 89% de areia fina, 1 a 2%
de silte e de 4 a 8% de argila, enquanto a matéria orgânica varia de 5,95 a 13%, o
carbono orgânico total de 3,45 a 7,23%, nitrogênio de 0,10 a 0,16% e a relação
carbono/nitrogênio de 36,5 a 57,89%.
Isolamento e Identificação dos Fungos
Após o isolamento dos fungos, foi observado que o meio Ágar Sabouraud
mostrou-se mais recomendável, tanto em relação ao número de colônias (1,6 x 102
UFC/mL), quanto pela variedade de espécies, enquanto que no meio Ágar Martin foram
isoladas 0,7 x 102 UFC/mL. Foram identificadas 14 espécies de fungos filamentosos
pertencentes a seis gêneros: Aspergillus, Cunninghamella, Curvularia, Penicillium,
Talaromyces e Trichoderma. Os gêneros que apresentaram maior número de espécies
foram Aspergillus (6 espécies) e Penicillium (4 espécies) (Tabela 1). Dentre as espécies
isoladas, 85,71% pertencem aos fungos anamorfos (conhecidos anteriormente por
Deuteromycetes), 7,14% aos Zygomycota e 7,14% aos Ascomycota.
Tabela 1. Espécies isoladas nas seis coletas realizadas a partir de sedimento do manguezal de São Francisco do Conde – BA.
Coletas Espécies 1° 2° 3° 4° 5° 6° Sab M Sab M Sab M Sab M Sab M Sab M Aspergillus niger Tiegh x x x x x x x x x x x x A. oryzae (Ahlb.) E. Cohn - - - - x - - - - - - - A. parasiticus Speare x - - - - - - - - - - - A. sydowi Thom e Church x - - - - - - - - - - - A. terreus Thom x x x x x x x x x x x x
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 27
A. versicolor Vuill - - - - - - - - - - x - Cunninghamella echinulata Thaxt - - x x - - - - - - - - Curvularia pallescens Boedjin - - - - - - x x - - - - Penicillium aurantiogrieseum Dierckx - - - - - - - - - - x - P. commune Thom - - - - - - x - - - - - P. duclauxi Delacr - - - - - - - - x - - - P. waksmani Zalessky x - - - - - - - - - - - Talaromyces flavus Stolk & Samson - - - - - - - - x - - - Trichoderma longibrachiatum Rifai - - x x - - - - - - - -
x = presença da espécie; - = ausência da espécie; Sab = Ágar Sabouraud; M = Ágar Martin.
A maioria dos isolados foi obtida no experimento controle (Figura 1), resultado
contrário ao de Rosa e Trigüis (2006) ao quantificar bactérias hidrocarbonoclásticas em
experimento de simulação de biorremediação, em unidades com 3 experimentos: (1)
apenas o sedimento homogeneizado; (2) Sedimento + óleo (controle) e (3) sedimento +
óleo + NPK (biorremediação). Esses autores constataram a presença das bactérias em
todas as unidades, sendo encontradas em maiores proporções nas unidades de
biorremediação, concluindo que a presença de nutrientes favoreceu o crescimento da
população microbiana degradadora.
Figura 1. Número de espécies identificadas a partir dos experimentos - O (osmocote); NPK e C (controle) - nas 6 coletas realizadas.
As espécies isoladas no presente estudo fazem parte da micota cosmopolita,
presentes em praticamente todos os ambientes terrestres, e os gêneros são considerados
comuns no solo (Domsch et al., 1980). No ambiente estudado, foi verificado que há
poucas espécies raras ou diferentes de levantamentos realizados para fungos do solo
(Schoenlein-Crusius et al., 2006). Foi encontrado um maior número de colônias das
espécies Aspergillus niger e Aspergillus terreus, que foram isoladas em todas as coletas
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 28
realizadas e que dominaram o crescimento nas placas em relação às outras espécies. Rai
et al. (1981) também obtiveram Aspergillus como o gênero dominante em isolamento
feito do sedimento de um manguezal na Índia, em que espécies de Trichoderma,
Pestalotiopsis, Curvularia, Fusarium e Penicillium também foram frequentemente
isoladas. Leahy e Colwell (1990) relatam Aspergillus e Penicillium como os gêneros de
fungos filamentosos mais frequentes tanto em ambientes terrestres como em marinhos,
assim como Moreira e Siqueira (2002) que além destes dois gêneros, destacam Mucor,
Rhizopus, Trichoderma, Fusarium, Pythium, Verticillium e Alternaria como os gêneros
mais comuns encontrados no solo.
No presente estudo, também foram isoladas espécies pertencentes aos gêneros
Cunninghamella, Curvularia, Tallaromyces e Trichoderma, porém estas foram
observadas em apenas uma ou duas das coletas realizadas. Sugere-se que foi encontrada
esta baixa variabilidade em virtude de se tratar de um ambiente alterado, em que as
espécies capazes de sobreviver às condições adversas dominem sobre as outras. Atlas
(1984) afirma que a poluição do solo pode conduzir a um decréscimo na diversidade
microbiana em termos de abundância de espécies, devido à extinção de espécies não
adaptadas ao estresse imposto; mas, pode também ocasionar o enriquecimento de
espécies particulares mais adaptadas a esse estresse, corroborando com o resultado
encontrado no presente trabalho. Santiago e Souza-Motta (2006) também verificaram o
efeito negativo do impacto ambiental na abundância das espécies de fungos, em estudo
com espécies da ordem Mucorales, isoladas a partir de solo de mineração de cobre na
região Jaguarari/Bahia.
Caracterização química da amostra de petróleo
A análise química, referente à determinação das frações dos principais
compostos da amostra de petróleo, evidenciou que o óleo em estudo é constituído por
71,05% de hidrocarbonetos saturados, 20,62% de hidrocarbonetos aromáticos e 8,33%
de compostos NSO. Como demonstrado pelo trabalho de Tissot e Welte (1984), na
composição do petróleo geralmente predomina a fração dos hidrocarbonetos saturados
(57%), seguida de compostos aromáticos (29%) e NSO (14%). A suscetibilidade dos
produtos de petróleo à biodegradação varia com o tipo e estrutura dos componentes
(Englert et al., 1993). Os hidrocarbonetos saturados possuem ligações simples entre os
átomos de carbono e são mais susceptíveis à degradação por microrganismos do que os
insaturados, os quais possuem ligações duplas ou triplas entre seus átomos de carbono,
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 29
pois a presença de dupla ou tripla ligação carbono-carbono dificulta a biodegradação
(Tissot e Welte, 1984; Pereira-Jr et al., 2009). A baixa concentração dos compostos
NSO, em relação às demais frações, sugere certa susceptibilidade do petróleo ao ataque
microbiano.
Avaliação do Potencial de Degradação do Petróleo
Todas as 14 espécies submetidas ao teste qualitativo promoveram a oxidação
biológica evidenciada através da descoloração do meio de cultivo contendo o indicador
DCPIP, o que apóia o fato da capacidade de degradação de hidrocarbonetos (Uzoamoka
et al., 2009). A mudança do indicador ocorreu em tempos diferentes para cada espécie,
variando entre 10h e 68h, destacando-se o Aspergillus oryzae com 10 horas, seguido por
A. terreus (15h), A. niger (20h), P. waksmanii (24h) e Talaromyces flavus (27h) (Figura
3). Maciel (2008) observou oxidação biológica de querosene por A. tamarii após 14
horas de ensaio.
Figura 2. Tempo (horas) da redução do indicador DCPIP das 14 espécies testadas obtidas do sedimento de mangue impactado por petróleo.
De acordo com Colla et al. (2008), locais contaminados com poluentes
constituem uma boa fonte de obtenção de microrganismos para estudos de
biorremediação desses mesmos poluentes, uma vez que o local contaminado atua como
um meio de cultivo seletivo para esses microrganismos, sendo que os que permanecem
nestes locais tornam-se adaptados ao poluente, que por sua vez, pode ser utilizado como
fonte de nutrientes para o crescimento. Um dos primeiros estudos de biorremediação
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 30
por fungos relatou que os gêneros Aspergillus, Cephalosporium, Penicillium e
Cunninghamella foram isolados de ambiente estuarino, e, capazes de utilizar o petróleo
como fonte exclusiva de carbono e energia (Cerniglia e Perry, 1973). Segundo Ramsay
et al. (2000) as populações microbianas em solo de mangue possuem potenciais
degradadores de hidrocarbonetos, e isto deve estar relacionado à adaptação destes
microrganismos à grande quantidade de matéria orgânica presente nestes solos. Os
resultados obtidos no presente estudo ainda corroboram com os obtidos por Olguín et
al. (2007) os quais afirmam que a maioria dos solos contaminados por hidrocarbonetos
contem microrganismos capazes de degradá-los.
Segundo Riser-Roberts (1992) a habilidade dos fungos em utilizar
hidrocarbonetos ocorre principalmente em duas ordens: Mucorales (que inclui, por
exemplo, o gênero Cunninghamella) e Moniliales (que inclui os gêneros Aspergillus,
Penicillium, entre outros). Esse mesmo autor enfatiza que Aspergillus e Penicillium
possuem muitas espécies que assimilam hidrocarbonetos, contudo, esta característica é
uma propriedade individual da espécie e não necessariamente uma característica
particular do gênero. Em revisão feita por Leitão (2009), espécies de Penicillium são
apontadas como importantes agentes de remedição em ambientes impactados por
diferentes compostos xenobióticos. Juhasz e Naidu (2000) destacam ainda os gêneros
Aspergillus e Penicillium como os fungos filamentosos mais eficientes na degradação
de hidrocarbonetos.
Araújo e Lemos (2002) identificaram fungos filamentosos isolados a partir de
solo contaminado por petróleo que apresentaram potencialidade para degradação de
hidrocarbonetos, os quais foram agrupados em quatro gêneros (Aspergillus, Penicillium,
Paecilomyces e Fusarium) incluindo as seguintes espécies: A. terreus, A. fumigatus, A.
versicolor, A. niveus, A. niger, P. corylophilum, Paecilomyces variotti e Pae. niveus. A
capacidade de degradação de hidrocarbonetos foi avaliada seguindo a mesma
metodologia utilizada no presente trabalho, porém com outras fontes de carbono.
Os fungos isolados da Baía de Todos os Santos foram capazes de promover a
oxidação biológica em tempos inferiores a 20 horas, como demonstrado por Maciel
(2008) e Souza (2008) que quando utilizaram como fonte de carbono o querosene e o
óleo Diesel observaram que os fungos reduziram o indicador DCPIP em tempos entre
14 e 24 horas e degradaram até 90% da fonte oleosa.
Celino et al. (2009) relataram em estudo realizado na Baía de Todos os Santos
entre os meses de fevereiro e julho de 2007, que os valores de referência dos
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 31
hidrocarbonetos, segundo metodologia adotada, não deve ultrapassar de 0,01µg.g-1.
Nesse mesmo estudo os autores encontraram valores superiores a 0,1318µg.g-1 dos
HPAs.
CONCLUSÃO
Na área de manguezal estudada há uma maior riqueza de espécies pertencentes
aos gêneros Aspergillus e Penicillium, sendo A. niger e A. terreus as espécies mais
frequentes. A partir dos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se concluir que
as espécies isoladas dos experimentos de bioestímulo de sedimento do manguezal, da
Baía de Todos os Santos/BA, contaminado por petróleo apresentam potencialidade para
serem utilizadas em processos de biorremediação, sendo Aspergillus oryzae, A. terreus,
A. niger, Penicillium waksmanii e Talaromyces flavus indicadas para avaliação da
degradação do petróleo.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 32
CAPÍTULO 2
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 33
4. POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DE PETRÓLEO POR FUNGOS FILAMENTOSOS2 RESUMO
A poluição ambiental causada por derramamentos e vazamentos de petróleo e de
seus derivados tem sido um grande motivo de preocupação. Fungos filamentosos são
relatados como agentes potenciais de biorremediação de ambientes impactados,
principalmente por serem eficientes decompositores. No presente trabalho foram
testadas cinco espécies de fungos filamentosos quanto à degradação de petróleo.
Inicialmente os isolados foram submetidos à aclimatação em concentrações crescentes
de petróleo (2 a 12%) sendo avaliados o pH, biomassa (g/L), teor de óleos e graxas e a
fitotoxicidade para sementes de Cucumis sativus (pepino). Posteriormente foi realizado
um planejamento fatorial para obter informações sobre a influência da agitação, pH,
concentração celular e concentração de NH4NO3 sobre a variável resposta eficiência de
biodegradação, usando Aspergillus oryzae como agente de degradação. De uma maneira
geral, houve aumento na biomassa e o pH se manteve próximo a neutralidade. Com
relação a fitotoxicidade, os resíduos gerados por A. oryzae e A. terreus causaram menor
impacto as sementes de pepino alcançando, respectivamente, 65,12% e 55,45% para o
índice de germinação. Com relação aos parâmetros avaliados, a agitação foi a única
variável que apresentou significância estatística. Os resultados obtidos destacam A.
oryzae como espécie promissora na biorremediação de ambientes impactados por
petróleo.
Palavras-chave: biodegradação, fungos filamentosos, fitotoxidade, petróleo
INTRODUÇÃO
O petróleo é um recurso natural consumido em todo o mundo, principalmente
pelos países mais desenvolvidos, o que tem garantido avanços tecnológicos na área de
exploração e produção em áreas marinhas cada vez mais profundas. Apesar de suas
indiscutíveis qualidades associadas ao desenvolvimento econômico dos países, inerente
a qualidade de vida de suas populações, este valioso produto está relacionado a grandes
fontes de poluição do meio ambiente (Ferrão, 2005). Acidentes com derrames de
petróleo constituem uma grande preocupação em todos os países do mundo, pois 2Trabalho submetido à revista Brazilian Journal of Microbiology. Azevedo, L.M.L., Souza, C.S., Miranda, R.C.M, Maciel C.C.S., Araújo, J.M., Gusmão, N.B., Souza-Motta, C.M.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 34
quando ocorrem, representam tanto uma grande perda de óleo quanto um grande
impacto negativo na flora, na fauna e na saúde humana (Ribeiro et al., 2003).
Os microrganismos são os principais agentes dos processos bioquímicos que
ocorrem no solo, como a decomposição da matéria orgânica e liberação de nutrientes,
formação e estabilização de agregados, ciclagem de nutrientes, transformações de
elementos metálicos, produção de metabólitos, degradação de pesticidas e herbicidas e
alterações nas características físicas do solo (Pfüller, 2000).
O tratamento de um ambiente contaminado, utilizando a habilidade natural dos
organismos em mineralizar, transformar ou até mesmo combinar compostos poluentes
com outras moléculas, é conhecido como biorremediação. Estas técnicas vem sendo
muito estudadas nos últimos anos porque, além de ser menos dispendiosa, pode resultar
na transformação dos contaminantes orgânicos, no caso ideal, em CO2, água e biomassa
(processo chamado de mineralização), ou pode reduzir a concentração dos poluentes em
níveis não detectáveis, não tóxicos ou aceitáveis pelas agências de controle ambiental
(Litchfield, 2005).
Os fungos se destacam em processos de biodegradação devido, principalmente, à
produção de enzimas extracelulares e a capacidade de crescer sob condições ambientais
consideradas extremas, com baixos valores de pH e umidade relativa e pobres em
nutrientes, favorecendo o seu desenvolvimento diante de outros organismos (Bouchez et
al., 1996; Mollea et al., 2005; Atagana, 2006).
Este estudo teve como principal objetivo avaliar a capacidade de espécies de
fungos em biodegradar o petróleo e testar algumas condições que poderiam influenciar
neste processo.
MATERIAL E MÉTODOS
Fungos Filamentosos
Foram utilizadas cinco espécies isoladas de sedimento de mangue impactado e
selecionadas a partir do ensaio primário de degradação do petróleo, evidenciado através
da redução do corante 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP), a saber: Aspergillus niger,
A. terreus, A. oryzae, Penicillium waksmanii e Tallaromyces flavus.
Aclimatação dos fungos ao petróleo
Os isolados foram submetidos à aclimatação por meio de variações nas
concentrações de petróleo (2, 4, 6, 8, 10 e 12%), ou até a concentração mais baixa onde
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 35
houve indicativo de crescimento. O experimento foi conduzido em frascos de
Erlenmeyer de 250mL contendo 50 mL do meio Bushnell Haas (BH) líquido com 2%
de petróleo e 1mL da suspensão contendo 107conídios/mL. Os frascos foram mantidos
sob agitação de 150 rpm, a 30°C por 7 dias. Após o período de incubação, os fungos
crescidos foram transferidos para placas de Petri contendo 10mL do meio ágar BH e
petróleo na mesma concentração a que foram submetidos, sendo mantidos a 30° por 7
dias. Foram feitas re-inoculações sucessivas, sempre seguindo uma escala aritmética de
razão 2, até a concentração de 12% de petróleo e mantendo-se 7 dias de aclimatação em
cada uma das concentrações. Adicionou-se 1% de glicerina a cada concentração para
estimular o cometabolismo. Ao final do cultivo em cada concentração de petróleo, a
biomassa (g/L), o pH, a fitotoxicidade e o teor de óleos e graxas dos resíduos foram
analisados.
Biomassa e pH
A determinação da biomassa foi realizada através da medida do peso seco. A
suspensão micelial foi filtrada a vácuo e a massa celular lavada três vezes com água
destilada e, posteriormente, seca em estufa por um período de 12h a 80ºC. O pH foi
medido a partir do líquido metabólico livre de células em potenciômetro.
Determinação do teor de óleos e graxas
A determinação das concentrações de óleos e graxas foi determinada pelo
método gravimétrico de acordo com American Public Association-AWWA, (2005). O
material residual foi separado por filtração, e a cada 20mL do filtrado foi colocado
10mL de n-Hexano. Este procedimento foi realizado três vezes e, ao final, a fase
orgânica foi reunida e evaporada. O peso do material seco é considerado como o valor
total do teor de óleos e graxas (TOG). Para a realização da determinação foi utilizado o
evaporador rotatório da marca Fisatom, modelo 558-série 0836768.
Ensaio de Fitotoxicidade
A fitotoxicidade do resíduo foi avaliada utilizando-se sementes de Cucumis
sativus L. (pepino) - Feltre, segundo a metodologia de Tiquia et al. (1996). As sementes
foram lavadas, inicialmente, com água destilada, em seguida com hipoclorito de sódio a
1% por cinco minutos e novamente com água destilada. Após a desinfecção, as
sementes foram colocadas em placas de Petri (5 unidades por placa), forradas com papel
filtro duplo e impregnadas com 2mL do meio líquido residual. Foi utilizado um controle
com água destilada esterilizada. As placas foram deixadas à temperatura de 28ºC ± 2ºC
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 36
durante 5 dias, após este período foram calculados inicialmente a porcentagem de
germinação das sementes, a porcentagem de crescimento das raízes e finalmente o
índice de germinação (%IG), calculado através da seguinte fórmula:
%IG = (% germinação das sementes) x (% crescimento das raízes): 100
Onde: % Germinação de sementes = (% germinação no teste): (% germinação no
controle) x 100; % de crescimento das raízes = (média de crescimento no teste): (média
de crescimento no controle) x 100.
Foram utilizados 2 controles, um com água destilada esterilizada e outro com o
petróleo na concentração equivalente à etapa de aclimatação. O experimento foi
realizado em triplicata e os dados do teste de toxicidade foram analisados usando a
análise de variância (ANOVA) para detectar diferenças entre os tratamentos, seguindo o
teste de Tukey (p<0,05) usando o programa Biostat®5.0.
Análise Estatística
Os parâmetros obtidos no processo de aclimatação serviram como dados para
definição do melhor isolado, onde foi realizado um planejamento estatístico fatorial
completo que envolveu dois níveis e quatro variáveis (24), utilizando como ferramenta o
software STATISTICATM versão 6.0. Os ensaios foram realizados em duplicata, à
temperatura de 28 ± 2ºC, durante 7 dias. A Tabela 1 apresenta a matriz trabalhada
durante o planejamento experimental, onde o pH, agitação, concentração celular e
concentração do nitrato de amônia (NH4NO3), foram as variáveis independentes e a
redução no teor de óleos e graxas foi a variável resposta.
Tabela 1. Matriz do Planejamento Experimental 24.
Experimentos Variáveis
pH Agitação (rpm) Concentração celular (esporos/mL) NH4NO3 (g) 1 5,5 0 105 0,5 2 7,0 0 105 0,5 3 5,5 130 105 0,5 4 7,0 130 105 0,5 5 5,5 0 108 0,5 6 7,0 0 108 0,5 7 5,5 130 108 0,5 8 7,0 130 108 0,5 9 5,5 0 105 2,0
10 7,0 0 105 2,0 11 5,5 130 105 2,0 12 7,0 130 105 2,0 13 5,5 0 108 2,0 14 7,0 0 108 2,0 15 5,5 130 108 2,0 16 7,0 130 108 2,0
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 37
RESULTADOS E DISCUSSÃO Ensaios de Aclimatação dos Fungos frente ao Petróleo
Na presença exclusiva do petróleo como fonte de carbono não houve
crescimento dos fungos, o que só foi possível com a adição de glicerina (1%), para
estimular o cometabolismo, sugerindo que o petróleo foi metabolizado como substrato
secundário. Vários estudos dividem as estratégias de biorremediação em três categorias
gerais: (1) o composto alvo é usado como fonte de carbono; (2) o composto alvo é
atacado pelas enzimas, mas não é utilizado como fonte de carbono e (3) o composto
alvo não é metabolizado totalmente, mas é concentrado dentro do organismo
(bioacumulação). Embora os fungos sejam capazes de realizar as três estratégias,
geralmente empregam mais o cometabolismo e a bioacumulação do que a utilização dos
compostos xenobióticos como única fonte de carbono (Bennet et al., 2002). Araújo e
Lemos (2002) observaram em seu estudo de biodegradação de hidrocarbonetos de
petróleo, que a ação dos fungos foi estimulada nos experimentos com adição de outras
fontes de carbono como glicose ou extrato de levedura, acelerando a degradação do
petróleo. Pointing (2001) e Tucker et al. (1995) observaram que uma fonte externa
nutricional é geralmente necessária aos fungos, devido à inaptidão dos mesmos em usar
organopoluentes como fonte primária de C e N. Bennet et al. (2002) também relataram
que muitos fungos precisam de uma fonte suplementar de carbono para sustentar seu
crescimento, ou seja, a degradação ocorre por cometabolismo.
Biomassa e pH
Na Figura 1 podem ser observados os valores de biomassa que, de uma maneira
geral, mostrou um acréscimo com o aumento do teor de petróleo, sendo o valor máximo
2,45 g/L, atingido por Aspergillus oryzae na concentração de 8%, seguido por
Tallaromyces flavus com 2,44 g/L na mesma concentração. Os valores de pH
observados na Figura 2 indicam que os mesmos se mantiveram próximos a neutralidade
para todos os isolados com exceção de A. niger que apresentou pH bastante ácido entre
os valores 2 e 3. Segundo Gadd (2001), a acidez no meio em processo de degradação
indica a produção de ácidos orgânicos como produtos intermediários. Leahy e Colwell
(1990), observaram que valores de pH entre 6,0 e 8,0 favorecem a ação de
microrganismos degradadores de petróleo, embora seja relatado que os fungos
filamentosos são tolerantes à valores de pH ácidos.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 38
Figura 1. Biomassa (g/L) dos fungos após 7 dias de experimento em concentrações crescentes de petróleo.
Figura 2. Valores de pH após 7 dias de experimento à concentrações crescentes de petróleo.
Análise Química – Teor de Óleos e Graxas
O percentual de redução do teor de óleos e graxas variou de 81,94% a 97,62%,
sendo este último obtido por Aspergillus oryzae na concentração de 6% e A. terreus na
concentração de 2% (Figura 3). Os percentuais obtidos no presente trabalho foram
maiores que os de Souza (2009) que avaliando a biodegradação de petróleo em
biorreator, que observou uma redução no teor de óleos e graxas de 70,46% em ensaio
contendo uma concentração inicial de 10% (v/v) de petróleo.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 39
Figura 3. Teor de óleos e graxas após 7 dias de experimento à concentrações crescentes de petróleo.
Ensaio de Fitotoxicidade
A diminuição da concentração do poluente orgânico não é um critério suficiente
para avaliar a eficácia da técnica de biorremediação (Fava, 1999). Para comprovar a
eficiência do tratamento, é necessário demonstrar que a biorremediação não produziu
nenhum composto intermediário tóxico, a fim de evitar efeitos ecológicos e ambientais
indesejáveis, portanto uma determinação da ecotoxicidade residual faz-se necessária
(Cerniglia, 1984; Prince, 1993).
O maior índice de germinação (65,12%) foi registrado para as sementes em
contato com os resíduos produzidos por A. oryzae na concentração de 6% de petróleo
(p<0,05). Para este mesmo fungo, nas concentrações testadas, foi observado diferença
estatística significativa (p<0,05) entre os índices de germinação das sementes nas
porcentagens de 2 e 12%, 6 e 10%, bem como entre 6 e 12% (Tabela 2).
Tabela 2. Índice de Germinação para sementes de pepino nos ensaios de aclimatação dos fungos a diferentes concentrações de petróleo.
Espécies de fungos Concentrações de petróleo
2% 4% 6% 8% 10% 12% Aspergillus niger 36,3 34,21 35,38 29,43 26,06 22,14 A. oryzae 57,96a 52,91 65,12bc 53,6 39,95b 33,86ac
A. terreus 51,9de 55,45fg 48,06h 44,23 38,69df 33,18egh Penicillium waksmanii 45,98ij 45,73lm 44,04no 41,18pq 31,65ilnp 23,53jmoq Tallaromyces flavus 38,79x 34,06 38,36z 32,28 26,99 22,98xz
Letras iguais (sobrescritas) representam diferença estatística (p<0,05).
Este resultado sugere que A. oryzae metabolizou o petróleo originando produtos
de baixa fitotoxicidade para as sementes de pepino. No entanto, A. niger apresentou
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 40
menor valor para o índice de germinação (22,14%), na concentração de 12% de
petróleo, indicando que este microrganismo degradou de forma parcial o petróleo ou
originou subprodutos tóxicos que prejudicaram o desenvolvimento das sementes. A
partir da concentração de 8% pode ser observada uma redução gradativa do índice de
germinação com relação a todos os fungos testados. Kirk et al. (2002) avaliando a
porcentagem de germinação de sementes de gramíneas, também observaram redução
com o aumento da concentração de petróleo. Rivera-Cruz e Trijillo-Narcía (2004)
relataram que a toxicidade dos hidrocarbonetos pode provocar a inibição da germinação
e a redução do crescimento da raiz de vegetais, o que foi observado para os resíduos
gerados por A. niger. Ogbo (2009) observou inibição da germinação de sementes de
Sorghum bicolor (sorgo) e Vigna unguiculata (feijão caupi) na concentração de 4% de
óleo Diesel.
Os resultados obtidos no presente trabalho foram contrários aos de Maciel
(2008) que utilizou sementes de repolho roxo (Brassica oleracea var. capitata) para
avaliar a toxicidade do resíduo gerado pela degradação de querosene por Aspergillus
tamarii e observou que o resíduo causou pouco impacto às sementes até a concentração
de 12%, onde foi obtido um índice de germinação de 62,6%. Barros (2007) avaliando a
aplicabilidade de testes de fitotoxicidade com sementes de alface (Lactuva sativa) em
solos contaminados por derivados de petróleo, constataram que a contaminação de 10%
(mL/g) de óleo Diesel no solo não foi suficiente para afetar a germinação das sementes,
nem o crescimento das radículas.
Petruccioli et al., (2006) utilizaram o teste de fitotoxicidade com sementes de
agrião (Lepidium sativum L.) para avaliar a biorremediação em um solo contaminado
com hidrocarbonetos aromáticos e concluíram que os fungos utilizados levaram a uma
diminuição significativa da toxicidade do solo, avaliada através do índice de germinação
(58 ± 1,5%). Tiquia et al. (1996) afirma que o índice de germinação maior que 80%
indica o desaparecimento da fitotoxicidade do composto.
Avaliação Estatística - Planejamento Fatorial
Após os resultados obtidos nos ensaios de aclimatação, o isolado A. oryzae, na
concentração de 6% de petróleo, foi selecionado por apresentar melhor resultado em
relação aos parâmetros avaliados para ser submetido às condições do planejamento
fatorial. Após a análise dos dados do planejamento fatorial (24) foi realizada uma análise
de variância (ANOVA) para verificar se existia alguma diferença estatística entre os
tratamentos propostos. Foi observado que a variável agitação foi a única que influenciou
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 41
estatisticamente (p<0,05) (Tabela 3). Como pode ser observado na Figura 4, que mostra
o gráfico de Pareto, a agitação (2) foi a única variável que teve influência significativa
no processo. Já a concentração do NH4NO3 (4) bem como as interações entre (2 e 4) e (3
e 4) influenciaram negativamente o processo. Quanto às demais variáveis (pH (1) e
concentração celular (3)), pode-se perceber que não foram significativas (Figura 4). A
agitação pode ser considerada um fator importante por promover a aeração e o contato
óleo-água, já que tanto o oxigênio, como a relativa insolubilidade do óleo na água, são
fatores limitantes na biodegradação (Tolosa et al., 2005; Baird, 2002). Esperava-se que
a variável concentração de nitrogênio fosse significativa já que os fungos utilizados
foram isolados de sedimento de manguezal, ambiente caracterizado por apresentar lenta
ciclagem de nutrientes (Scherrer e Mille, 1989), contudo Atlas (1995) e Teal et al.
(1992) relatam que em ambientes com baixa energia (por exemplo os mangues)
normalmente não há limitação de fósforo e nitrogênio, sendo a taxa de biodegradação
limitada pela condição anóxica. Os resultados encontrados no presente trabalho são
contrários aos de Baptista (2003), que em estudo para selecionar as melhores condições
de biodegradação de petróleo em solo argiloso verificou que o aumento da concentração
de sulfato de amônio - (NH4)2SO4 - adicionado ao solo promoveu uma melhor eficiência
na remoção de matéria orgânica; e os de Borges et al. (2001), pois ao empregarem
maiores concentrações de (NH4)2SO4 e cloreto de amônio (NH4Cl) como fontes de
nitrogênio, observaram que a eficiência de remoção da matéria orgânica, além de óleos
e graxas tendiam a melhorar.
Tabela 3. Análise de variância entre as variáveis pH, agitação, concentração celular e concentração da fonte de nitrogênio NH4NO3.
Variáveis SS df MS F p
(1)pH 0,001954 1 0,001954 6,008070 0,057855 (2)agitação 0,002218 1 0,002218 6,819379 0,047590
(3)concentração celular 0,000152 1 0,000152 0,467674 0,524459 (4)NH4NO3 0,000073 1 0,000073 0,225446 0,654936
1*2 0,001298 1 0,001298 3,991256 0,102225 1*3 0,001125 1 0,001125 3,460682 0,121925 1*4 0,000013 1 0,000013 0,041022 0,847478 2*3 0,001073 1 0,001073 3,299612 0,128992 2*4 0,000251 1 0,000251 0,771284 0,420013 3*4 0,000038 1 0,000038 0,117726 0,745470 Erro 0,001626 5 0,000325
Total SS 0,009822 15 SS – some square; df – degrees of freedom; MS – media square, F e p – variáveis.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 42
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: óleos e graxas2**(4-0) design; MS Residual=,0003252
DV: óleos e graxas
,20254
-,343112
-,474812
,6838672
-,878228
1,816483
1,860291
1,997813
2,451137
2,611394
p=,05
Effect Estimate (Absolute Value)
1by4
3by4
(4)NH4NO3
(3)conc. cel
2by4
2by3
1by3
1by2
(1)pH
(2)agitação
Figura 4. Diagrama de Pareto para o planejamento fatorial 24, cuja variável dependente é a redução no teor de óleos e graxas. CONCLUSÃO
Dentre as espécies avaliadas, é possível inferir que Aspergillus oryzae pode ser
indicada para processos de biodegradação de petróleo, considerando a capacidade de
degradação apresentada e baixa fitotoxicidade frente as sementes de Cucumis sativus
(pepino). Não foram observadas influência significativa do pH, concentração celular e
concentração da fonte de nitrogênio (NH4NO3), apenas a agitação apresentou relevância
estatística para o processo.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 43
CONSIDERAÇÕES GERAIS
• São encontradas em sedimento de manguezal da Baía de Todos os Santos/BA,
contaminado por petróleo, espécies de fungos filamentosos.
• Os Hyphomycetes predominam no sedimento da área estudada, sendo
Aspergillus niger e A. terreus as espécies mais encontradas.
• Todas as espécies investigadas apresentam potencialidade para degradação de
petróleo, evidenciada a partir do teste qualitativo.
• O produto da biodegradação do petróleo por A. oryzae apresenta baixa
fitotoxicidade frente às sementes de pepino, até 8%, contudo não há produção de
substâncias totalmente inócuas.
• Não há influência significativa do pH, concentração celular e concentração da
fonte de nitrogênio (NH4NO3), na biodegradação do petróleo por A. oryzae.
• A agitação apresenta influência significativa no processo de biodegradação do
petróleo por A. oryzae, sendo recomendada 130rpm.
• A. oryzae apresenta potencialidade para degradar o petróleo podendo ser
utilizada como ferramenta biológica em processos de biorremediação.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 44
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adekunle, A.A. e Adebambo, O. A. 2007. Petroleum Hydrocarbon Utilization by Fungi Isolated From Detarium Senegalense (J. F Gmelin) Seeds. Journal of American Science 3(1):69-76.
Aleixo, L. A. G., Tachibana, T. I.; Casagrande, D. 2007. Poluição por Óleo: Formas de Introdução de Petróleo e Derivados no Ambiente. Revista Integração: Ensino, Pesquisa, Extensão. Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, SP, Brasil. 49:159-166
Alexander, M. 1999. Biodegradation and Bioremediation. Academic Press. California. Al-Hadhrami, M.N., Lappin-Scott, H. M., Fisher, P. J. 1997. Studies on the n-alcanes in the presence of biodegradation of three groups of pure molasses and mineral fertilizer by Pseudomonas aeruginosa. Marine Pollution Bulletin 34(11):969-974. Amellal, N., Portal, J. M., Berthelin, J. 2001. Effect of soil structure on the bioavailability of polycyclic aromatic hydrocarbons within aggregates of a contaminated soil. Applied Geochemistry 16:1611-1619. Andrea, M.M., Pettinelli, Jr. 2000. Efeitos de aplicação de pesticidas sobre a biomassa e a respiração de microrganismos de solos. Arquivo Instituto Biológico 67(2):223 228. Araújo, F.S.M. e Lemos, J.L.S. 2002. Isolamento e identificação de fungos degradadores de petróleo. In: X Jornada de Iniciação Científica, Centro de Tecnologia Mineral – CETEM/MCT. Atagana, H.I., Haynes, R.J., Wallis, F.M. 2006. Fungal Bioremediation of creosote contaminated soil: a laboratory scale bioremediation study using indigenous soil fungi. Water, Air, and Soil Pollution 172: 201-219. Atlas, R.M. 1981. Microbial Degradation of Petrolium Hydrocarbons – an Environmental Perspective. Microbial Reviews: 180 – 209. Atlas, R.M. 1984. Use of microbial diversity measurements to assess environmental stress. In: KLUG, M.J; REDDY, C.A. Current perspectives in microbial ecology. Washington: American Society for Microbiology, p. 540-545. Atlas, R.M. 1991. Microbial hydrocarbon degradation - bioremediation of oil spills. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 52(2):149-156. Atlas, R.M. 1995. Petroleum biodegradation and oil spill bioremediation. Marine Pollution Bulletin 31(9):178-182. Azevedo, F. A., Chasin, A. A. M. 2003. As bases toxicológicas da ecotoxicologia. São Carlos: ed.Rima, 322p. Baird, C. 2002. Química ambiental. Ed Bookman. São Paulo-SP. p.662 Baker, K. H., Herson, D. S. 1994. Bioremediation. McGraw-Hill Inc., New York, Vo.1, 376p.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 45
Banks, M.K., Schultz, K.E. 2005. Comparison of plants for germination toxicity tests in petroleum contaminated soil. Water, Air e Soil Pollution 167(4):211-219. Baptista, S.J. 2003. Seleção das Melhores Condições de Biodegradação de Petróleo em Solo Argiloso. Dissertação de Mestrado. UFRJ/EQ. pp.163. Barbiere, S.M. 1998. Biodegradação de compostos aromáticos. In: Melo, I.S., Azevedo, J.L. (eds) Microbiologia Ambiental. Jaguariúna. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. 242p. Barclay, M., Hart, A., Knowles, C.J., Meeussen, J.C.L., Tett, V.A. 1998. Biodegradation of metal cyanides by mixed and pure cultures of fungi. Enzyme and Microbial Technology 22:223-231 Barros, D. 2007. Avaliação da ecotoxicidade de solos contaminados por hidrocarbonetos. Monografia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro Brasil. Barros-Neto, B. de, Scarminio, I.S., Bruns, R. E. 1995. Planejamento e otimização de experimentos. 2ª ed. Editora da UNICAMP. Bennett, J.W. e Faison, B.D. 1997. Use of fungi in Biodegradation. In: Manual of Environmental Microbiology, Ed. Christon J. Hurst, J. ASM Press, Washington D. C., USA, p. 758-765. Bennet, J.W., Wunch, K.G., Faison, B. D. 2002. Use of fungi biodegradation. In: Manual of Environmental Microbiology. ASM Press Washington, D.C. Bento, F.M., Camargo, F.A.O., Okeke, B.C., Frankenberger, W.T. 2005. Comparative bioremediation of soils contaminated with Diesel oil by natural attenuation, biostimulation and bioaugmentation. Bioresource Technology 96:1049-1055. Beuadette, L.A., Davies, S., Fedorak, P.M., Ward, O.P., Pickard, M.A. 1998. Comparison of gas chromatography and mineralization experiments for measuring loss of selected polychlorinated biphenyl congeners in cultures of white rot fungi. Apllied Environmental Microbiology 62:2554-2559. Boopathy, R. 2000. Factors limiting bioremediation technologies. Bioresource Technology 74: 63 – 67. Borges, R. M. H. 2001. Biodegradação em solo argiloso contaminado com petróleo. Rio de Janeiro. Dissertação de Mestrado. EQ/UFRJ. Bossert, I., Bartha, R. 1984. The fate of petroleum in soil ecosystems. In: Atlas, R.M. (Ed.), Petroleum Microbiology. Macmillan Publishing Company, New York. p. 435–473. Botello, A.L.M. 2003. Análise da contaminação por óleo na APA de Guapimirim – RJ. Aspectos Geoquímicos e Sócioambientais. Dissertação de Mestrado Universidade Federal Fluminese 100p.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 46
Botello A.V. 2005. Características composición y propiedades fisicoquímicas del petróleo. En: Golfo de México Contaminación e Impacto Ambiental: Diagnóstico y Tendencias.(A.V. Botello, J. Rendón von Osten, G. Gold-Bouchot, C. Agraz-Hernández, Eds.) 2ª ed. Universidad Autónoma de Campeche, Universidad Nacional Autónoma de México, Instituto Nacional de Ecología. Campeche, México. pp. 261-268. Bouchez, M., Blanchet, D., Haeseler, F., Vandecasteele, J. P. 1996. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques dans I’environment. Revue I’Institut français du pétrole 51(6):797-828. Boutin, C., Elmegaard, N., Kjeer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology 13:349–369. Bouwer, E.J. e Zehnder, A.J.B. 1993. Bioremediation of organic compounds- putting microbial metabolism to work. Trends in Biotechnology 11:360-367. Bracho, M., Díaz, L., Soto, L.M. 2005. Degradación de hidrocarburos aromáticos por bacterias aisladas de suelos contaminados con petróleo en el estado Zulia, Venezuela. Biologico 38(3)1:9 Braddock, J.F., Lindstrom, J.E., Brown, E.J. 1994. Distribution of hydrocarbons-degrading microorganisms in sediments from Prince William Sound, Alaska, following the Exxon Valdez oil spill. Marine Pollution Bulletin 30(2):125–132. Brito, E. M. S. 2004. Degradação de Óleo por Bactérias Isoladas dos sedimentos de Manguezal da A.P.A. de Guapimirim - Baía de Guanabara – RJ. Tese de Doutorado em Geociências. Universidade Federal Fluminense. Brito, N.N., Zamora, P.P., Neto, A.L.O., De Battisti, A., Paterniani, J.E.S., Pelegrini, R.T. 2004. Utilização de fungos na remediação de efluentes industriais. IV Fórum de Estudos Contábeis, Faculdades Integradas Claretianas, Rio Claro, SP. Brito, E.M. S., Guyoneaud, R., Goñi-Urriza M., Ranchou-Peyruse, A., Verbaere, A., Crapez, M.A.C., Wasserman, J.C.A., Duran, R. 2006. Characterization of hydrocarbonoclastic bacterial communities from mangrove sediments in Guanabara Bay, Brazil. Research in Microbiology 157:752-762. Burkert, C.A.V, Santos, E.O, Rosa, C.F.C., Passos, C.T., Sanzo, A.V.L., Burkert, J.F.M., Kalil, S.J. 2008 Pre-screening of filamentous fungi isolated from a contaminated site in Southern Brazil for bioaugmentation purposes. African Journal of Biotechnology 7(9):1314-1317. Burns, K.A., Codi, S., Duke, N.C. 2000. Gladstone, Australia Field Studies: Weathering and Degradation of Hydrocarbons in Oiled Mangrove and Salt Marsh Sediments With and Without the Application of an Experimental Bioremediation Protocol. Marine Pollution Bulletin 41:392-402.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 47
Bushnell, L.D., Haas, H.F. 1941. The utilization of certain hydrocarbons by microorganisms. Journal of Bacteriology 41:653-673. Cerniglia, C.E. e Perry, J.J. 1973. Crude oil degradation by microorganisms isolated from the marine environment. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie 13:229-306. Cerniglia, C.E., Yang, S.K., 1984. Stereoselective metabolism of anthracene and phenanthrene by fungus Cunninghamella elegans. Applied and Environmental Microbiology 47:119–124. Cerniglia, C.E. 1992. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Biodegradation 3:351-368. CETESB - Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. 2009. Secretaria do Estado do Meio Ambiente. São Paulo. Disponível em: http://www.cetesb.sp.gov.br. Chaîneau, C.H., Morel, J., Dupont, J., Bury, E., Oudot, J. 1999. Comparison of fuel oil biodegradation potential of hydrocarbon-assimilating microorganisms isolated from a temperate agricultural soil. The Science of the Terestre Environmental, 227:237-247. Chapman, P.M. 1999. Environmental Quality Criteria. Environmental Science Technology 25:1353-1359. Chosson, P., Lanau, C, Connan, J., Dessort, D. 1991. Biodegradation of refractory hydrocarbon biomarkers from petroleum under laboratory conditions. Nature 351:640-642. Citrón, G.; Schaeffer-Novelli, Y. 1983. Introducción a la ecología del manglar. Montevideo, UNESCO/RESTLOC. p.109. Colla, L.M., Primaz, A.L., Lima, M., Bertolin, T.E., Costa, J.A.V. 2008. Isolamento e seleção de fungos para biorremediação a partir de solo contaminado com herbicidas triazínicos. Ciência e Agrotecnologia 32(3):809-813. Connan, J. 1981. Biological Markers in crude oils. Petroleun Geology in China, Penn Well-Books, Oklahoma, 1(1):48-82. Conselho Nacional do Meio Ambienta - CONAMA. 2002. Resolução nº 314, de 29 de outubro de 2002. Publicada no DOU n 224, de 20 de novembro de 2002, Seção 1, página 90. Cookson, T. 1995. Bioremediation Engineering: Design and Application. McGraw-Hill Inc, New York, 525p. Crapez, M.A.C., Tosta, Z.T., Bispo, M.G.S., Mesquita, A.C., Logullo, C.J., Côrrea-Júnior, J.D. 1997. Biorremediação em sedimento de praias arenosas utilizando Bacillus isolados de solo de floresta. Oecologia Bresiliensis 3:19-28. Crapez, M.A.C., Borges, A.L.N., Bispo, M.G.S., Pereira, D.C. 2002. Biorremediação: tratamento para derrames de petróleo. Ciência hoje 30:32-37.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 48
Cury, J. C. 2002. Atividade microbiana e diversidades metabólica e genética em solo de mangue contaminado com petroleo. Dissertação de Mestrado. Piracicaba – São Paulo. Del’Arco, J.P. e França, F.P. 2001. Influence of oil contamination leves on hydrocarbon biodegradation in Sandy sediment. Environmental pollution 110:515-519. Desai, J. D., Banat, I. M. 1997. Microbial production of surfactants and their commercial application. Microbiology and Molecular Biology Reviews 61(1):47–74. Dias, A.E.X.O. 2000. Biorremediação de áreas afetadas por resíduos sólidos tóxicos. In: Sisinno, C.L.S., Oliveira, R.M. (Org.) Resíduos Sólidos, Ambiente e Saúde: uma visão multidisciplinar.Rio de Janeiro: Editora Fiocruz, pp.142. Dineen, D, Slater, J.P., Hicks, P., Holland, J., Clendening, L.D. 1992. In: situ biological remediation of petroleum hydrocarbons in unsaturated soils. p 453 – 463. In: Principles and Practices for Petroleum Contaminated Soils (Calabrese, E.J., Kostecki, P.T. – ed.). Boca Raton: Lewis Publishers. 658p. Domsch, K.H., Gams, W., Anderson, T.H. 1980. Compendium of soil fungi. Academic Press, New York, 859p. Domsch, K.H., Gams, W., Anderson, T.H. 1993. Compendium of soil fungi. Academic Press, New York, 860p. Drago, T. 2003. O acidente marítimo mais caro da história. Disponível em http://www.tierramerica.info/index_pt.php. Acessado em outubro de 2009. Ellis, M.B. 1971. Dematiaceus hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute, Kew, 608p. Ellis, M.B. 1976. More Dematiaceus hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute, Kew, 507p. Emtiazi G., Habibi, M.H. e Mazaherian, M. 1997. Biodegradation of petroleum products by fungi as the only source of energy and carbon. 15° World Petroleum Congress – Beijing, China. Englert, C.J., Kenzie, E.J., Dragun, J. 1993. Bioremediation of petroleum products in soil. In: Principles and Practices for Petroleum Contaminated Soils (Calabrese, E.J., Kostecki, P.T. – Ed.). Boca Raton: Lewis Publishers p.111–129. Fava, F. e Bertin L. 1999. Use of exogenous specialised bacteria in the biological detoxification of a dump site-polychlorobiphenyl-contaminated soil in slurry phase conditions. Biotechnology and Bioengineering 64:240–249. Fall, R. R., Brown, J. L., Shaeffer, T. L. 1979. Enzyme recruitment allows the biodegradation of recalcitrant branched hydrocarbons by Pseudomonas citronellolis. Applied & Environmental Microbiology 38:715-722.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 49
Fernandes, M. 1994. Efeito da 9,10 – Fenatrenoquinona na fotodegradação do petróleo. Dissertação de Mestrado. Instituto de Química UFRJ. Ferrão, C.M. 2005. Derramamentos de óleo no mar por navios pertroleiros. Dissertação de Especialização em M.B.E. Pós Graduação Executiva em Meio Ambiente. Fletcher, J. 1991. A brief overview of plant toxicity testing. In: Goruch, J.W., Lower, W.R., Lewis, M.A., Wang, W. Plants for toxicity Assessment. Astm, Philadelphia, PA. ASTM Publication code number (PCN) 04011150-16. pp. 1-11. Fonseca, M.R.M. 1992. Química: química orgânica. São Paulo: FTD, 368 p. Franco, I., Contin, M., Bragato, G., De Nobili, M. 2004. Microbiological resilience of Soils Contamined with crude oil. Geoderma 121:17-30. Gaad, G.M. 2000. Bioremedial potential of microbial mechanism of metal mobilization and immobilization. Current Opinion in Biotecnology 11:271-279. Gallego, P.A.V., Cuéllar, R.R., Dussán, J. 2004. Biorremediación de resíduos del petróleo. Hipótesis / Apuntes Científicos Uniandinos 4:42-44. Ghazaly, F.M., Rahman, R.N.Z.A., Salleh, A.B., Basri, M. 2004. Biodegradation of hydrocarbons in soil by microbial consortium. International Biodeterioration & Biodegradation 54(1):61-67. Ghazaly, O.M. e Sayed, E. 2000. Oil Spill. SPE International Conference on Health, Safety and Environment in Oil and Gas Exploration and Production, Stavanger, Norway p.26-28. Gomez-Roxas, P.L. e Ayuno, J. 2002. Oil-degrading microorganisms from mangrove ecosystems in southern Phillipines. Trees 16:239–243. Gray, P.H.H., Thornton, H.G. 1928. Soil bacteria that decompose certain aromatic compounds. Zentralbl Bakteriol Parasintenk 73:74-96. Greene, E.A., Kay, J.G., Jaber, K., Stehmeier, L.G., Voordouw, G. 2000. Composition of Soil Microbial Communities Enriched on a Mixture of Aromatic Hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology 66(12):5282-5289. Grove, G.W. 1978. Use landfarming for oily waste disposal. Hydrocarbon Processing 5:138-140. Gundersson, C.A., Kostuk, J.M., Mitcell, H.G., Napolitano, G.E., Wicker, L.F., Richmond, J.E., Stewart, A.J. 1997. Multispecies toxicity assessment of compost produced in bioremediation of an explosives-contaminated sediment. Environmental Toxicology and Chemistry 16:2529-2537. Gundlach, E. R. e Hayes, M. O. 1978. Vulnerability of coastal environments to oil spill impacts. Journal of Marine Technology Society. Carolina do Sul, 12(4):18-27.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 50
Hamdi, H., Benzarti, S., Manusadzianas, L., Aoyama, I., Jedidi, N. 2007. Bioaugmentation and biostimulation effects on PAH dissipation and soil ecotoxicity under controlled conditions. Soil Biology Biochemistry 39:1926 – 1935. Hansel, F.A. 2000. Análise de biomarcadores lipídicos em sedimentos de manguezais. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Santa Catarina, 98p. Hanson, K. G., Desai, D., Desai, A. J. 1993.A rapid and simple screening technique for potential crude oil degrading microorganisms. Biotechnology Techniques 10:745-748. Haselwandter, K., Berreck, M. 1988. Fungi as bioindicators of radiocesium contamination: pre and post chernobyl activities. Transctions of the Bristish Mycological Society 90:171-174. Helfrich, P., Chefetz, B., Hadar, Y., Chen, Y., Schnabl, H. 1998. A novel method for determining phytotoxicity in compost. Compost Science and Utilization 6:6-13. Hoff R., Hensel P., Proffitt E., Delgado P., Shigenaka G., Yender R. y Mearns A.J. 2002. Oil Spills in mangroves. Planning & Response Considerations. National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA). EUA. Technical Report. 69 p. Hölker, U., Fakoussa, R.M., Höfer, M. 1995.Growth substrates control the ability of Fusarium oxysporum to solubilize low-rank coal. Applied Microbiology and Biotechnology 44:351-355. IMA – Instituto do Meio Ambiente. 2009. Disponível em: http://www.ima.ba.gov.br/index.php/noticias/326-ima-considera-derramamento-de-oleo-infracao-gravissima. Acessado em setembro de 2009 Ipieca. 1993. Impactos biológicos de la contaminación por hidrocarburos de manglares. International Petroleum Industry Environmental Conservation Association. Londres, 20 p. ITOPF - Internation Tanker Owners Pollution Federation. 2009. Disponível em: http://www. Itopf.com/. Acessado em outubro de 2009. Jacques, R.J.S., Bento, F.M., Antoniolli, Z.I., Camargo, F.A.O. 2007. Biorremediação de solos contaminados com hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Ciência Rural 37(4):1192-1201. Jones, J.G., Eddington, M.A. 1968 An ecological survey of hydrocarbon oxidizing microorganisms. Journal of General Microbiology 52:381-390. Jorgensen, K. S., Puustinen, J., Suortti, A.M. 2000. Bioremediation of Petroleum Hydrocarbon Contaminated Soil by Composting in Biopiles. Environmental Pollution 107:245-254. Juhasz, A.L., Naidu, R. 2000. Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons: a review of the microbial degradation of benzo(a)pyrene. International Biodeteriation and Biodegradation 45:57-88.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 51
Kadri, M.H., Salem, A.A., Salma, M. 1986. Oil degrading bacteria in Kuwait Bay. Journal of Marine Science 15:50-51. Kapanen, A. e Itavaara, M. 2001. Ecotoxicity tests for compost applications. Ecotoxicology and Environmental Safety 49:1-16. Kataoka, A. P. A. G. 2001. Biodegradação de resíduo oleoso de refinaria de petróleo por microorganismos isolados de “landfarming”. Tese Doutorado – Instituto de Biociências, Unesp – Rio Claro. Kirk, J.L., Kironomos, J.N., Lee, H., Trevors, J.T. 2002. Phytotoxicity assay to assess plant species for phytoremediation. Bioremediation Journal 6(1):57-63. Kirk, P. M., Cannon, P. F., David, J.C., Stalpers, J.A. 2004. Dictionary of the Fungi, 9th ed. Oxon: CAB International 655p. Klich, M.A. 2002. Identification on Common Aspergillus Species. United States Department of Agriculture. New Orleans, Louisiana, 116p. La Grega, P.L., Buckingham, J.C. Evans. 1994. In: Hazardous Waste Management, McGraw-Hill, New York , pp. 859. Leahy, J.G., Colwell, R.R. 1990. Microbial Degradation of Hydrocarbons in the Environment. Microbiological Reviews, 54(3):305 – 315. Leão, Z.M.A.N. e Dominguez, J.M.L. 2000. Tropical coast of Brazil. Marine Pollution Bulletin 41:112-122. Leitão, A.L. 2009. Potential of Penicillium Species in the Bioremediation Field. International Journal of Environmental Research and Public Health 6:1393-1417. Leslie, J. F., Summerell, B.A. 2006. The Fusarium Laboratory Manual. 1st ed. Iowa: Blackwell Publishing, pp. 388. Lewis R.R. 2005. Ecological engineering for successful management and restoration of mangrove forests. Ecological Engineering 24:403-418. Liebeg, E.W., Cutright, T.J. 1999. The investigation of enhanced bioremediation through the addition of macro and micro nutrients in a PAHs contaminated soil. International Biodeterioration and Biodegradation 44:55– 64. Lima, M., Primaz, A.L., Costa, J.A.V., Colla, L.M. 2006. Isolamento e Seleção de Fungos para Biorremediação de Resíduos de Petróleo e Óleo Vegetal. In: XVI Mostra de iniciação científica da Universidade de Passo Fundo: Ediupf 1:1-2. Linkfield, T.G., Suflita, J.M., Tiedje, M. 1989. Characterization of the acclimatation period before anaerobic dehalogenation of halobenziates. Applied and Environmental Microbiology 55:2773 – 2778.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 52
Litchfield, C. 2005. Thirty Years and Counting: Bioremediation in Its Prime? BioScience 55(3):273-279. Macedo, R.C., Berbert, V.H.C., Lemos, J.L.S., Trindade, P.V.O., Rizzo, A.D.L. 2002. Biorremediação de solos impactados por óleo cru utilizando fungos filamentosos. In: XI Jornada de Iniciação Científica, Centro de Tecnologia Mineral – CETEM/MCT. Maciel, C.C.S. 2008. Degradação de querosene de aviação por fungos filamentosos. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brasil. Mahan, B.H. 1972. Química: um curso universitário. Departamento de Química, Universidade da Califórnia, Berkeley. Ed. Edgard Blücher Ltda. 654p. Mariano, J. B. (2005). Impactos ambientais do refino do petróleo. Rio de Janeiro: Interciência. Martins, A., Dinardi, A.L., Formagi, V.M., Lopes, T.A., Barros, R.M., Coneglian, C.M.R., Brito, N.N., Sobrinho, G.D., Tonso, S., Pelegrini, R. 2003. Biorremediação. III Fórum de Estudos Contábeis, Faculdades Integradas Claretianas, Rio Claro, SP. Disponível em: www.ceset.unicamp.br/lte/artigos/ 3fec2401 – Acessado em novembro de 2009. Mello, D. 1981. Ecotoxicologia: introdução, conceito, principais ramos. In: Jornada Brasileira de Ecologia, Campinas. Anais p.127-131. Millioli S. V., Sobral, L.G.S., Sérvulo, E. F. C., Carvalho, D.D. 2008. Biorremediação de solo impactado com óleo cru: Avaliação da potencialidade da utilização de Surfatantes. Rio de Janeiro: CETEM/MCT 93p. Miroslav, N., Horakova, D. 1996. Mixture of microorganisms, its use for biodegradation of hydrocarbons, as well as process for its application. Patent Number: US 5575998. Mollea, C., Bosco, F., Ruggeri, B. 2005. Fungal biodegradation of naphthalene: microcosms studies. Chemosphere 60:636-643. Monteiro, A.G. 2003. Metodologia de avaliação de custos ambientais provocados por vazamento de óleo, o estudo de caso do complexo REDUC-DTSE. Tese de Doutorado. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Montgomery, D. C. 2000. Design and analysis of experiments. 5th John Wiley and Sons, Inc. Arizona. USA. Moreno, C.M., Becerra, A.G., Santos, M.J.B. 2004. Tratamientos biológicos de suelos contaminados: contaminación por hidrocarburos. Aplicaciones de hongos en tratamientos de biorrecuperación. Revista Iberoamericana de Micología 21:103–120. Moreira, F e Siqueira, J.O. 2002. Microbiologia e Bioquímica do Solo. Editora UFLA, p.623.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 53
Moscatelli, M. 1999. Salvando o manguezal. Revista Brasileira de Ecologia do Século 21 41:41-42. NOAA - National Oceanic and Atmospheric Administration. Technical Memorandum Nos Orca 71. 1993. Sampling and analytical methods of the national status and trends program national benthic surveillance and mussel watch project 1984-1992. Silver Sring, Maryland v.4, 179p. Nordvik, A.B., Simmons, J.L., Bitting, K.R., Lewis, A., Strom-Kristiasen, T. 1996. Oil water separation in marine oil spill clean-up operations. Research 3(3): 107-122 Nyer, E. 1992. Groundwater treatment technology. New York Van Nostrand Reinhold. 306p. Odum, E.P. 1988. Ecologia. Rio de Janeiro- RJ. Editora Guanabara. p.434. OECD (Organization for Economic Cooperation and Development). 1984. Guideline 208: Terrestrial Plants, Growth Test. OECD Guidelines for testing of chemical. OECD Paris. Ogbo, E.M. 2009. Effects of Diesel fuel contamination on seed germination of four crop plants – Arachis hypogaea, Vigna unguiculata, Sorghum bicolor and Zea mays. African Journal of Biotechnology 8(2):250-253. Okerentugba, P.O. e Ezeronye, O.U. 2003. Petroleum degrading potentials of single and mixed microbial cultures isolated from rivers and refinery effluent in Nigeria. African Journal of Biotechnology 2(9):288–292. Olguín, E. J., Hernández M.E. e Sánchez-Galván G. 2007. Contaminación de manglares por hidrocarburos y estrategias de biorremediación, fitorremediación y restauración. Revista Internacional Contaminación Ambiental 23(3):139-154. Onofre, C.R.E., Argôlo, J.L., Celino, J.J., Queiros, A.F.S., Nano, R.M.W. 2009. Sulfetos voláteis acidificados (SVA) e metais extraídos simultâneos (MES) em sedimentos de manguezais da Baía de Todos os Santos. In: Queiroz, A.F.S e Celino, J.J. (Eds). Avaliação de Ambientes na Baía de Todos os Santos. Aspectos geoquímicos, geofísicos e biológicos. Editora da Universidade Federal da Bahia p.134-148. Paoletti, M. G. 1999. Using bioindicators based on biodiversity to assess landscape sustainability. Agriculture, Ecosystems & Environment 74:1-18. Pascual, J.A., Ayuso, M., Garcia, C., Hernandéz, T. 1997. Characterization of urban wastes according to fertility and phytotoxicity parameters. Waste Management & Research 15:103–112. Paszczynski, A. e Crawford, R.L. 2000. Recent advances in the use of fungi in environmental remediation and biotechnology. Soil Biochemistry 10:379-422.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 54
Pedroti, G.I. 2007. Ensaios de biodegradabilidade aeróbia de hidrocarbonetos derivados do petróleo em solos. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Espírito Santo. 119p. Peintner, U. e Moser, M. 1996. Survey of heavy metal deposition at the schulterberg (Achenkirch Altitude Profile) by using basidiomycetes as bioindicators. Phyton-Annales Rei Botanicae 35(4):155-162. Pelegrini, N.N.B., Paterniani, J.E.S., Carniato, J.G., Silva, N.B., Pelegrini, R.T. 2006. Estudo da sensibilidade de sementes de Euruca sativa (rúcula) utilizando substâncias tóxicas para agricultura. In: XXXV Congresso Brasileiro de Engenharia Agrícola (CONBEA) João Pessoa - PB. Pereira, L.T.C. e Lemos, J.L.S. 2003. Os Fungos Filamentosos, uma opção em estudo para a Biorremediação I. In: XI Jornada de Iniciação Científica, Centro de Tecnologia Mineral – CETEM/MCT. Pereira-Jr. N., Gomes, E.B., Soriano, A.U. 2009. Biodegradação de Hidrocarbonetos. Rio de Janeiro: Escola de Quimica/ UFRJ. Peters, K. E. e Moldowan, J. M. 1993. The Biomarker Guide: Interpreting Molecular Fossil in Petroleum and Ancient Sediments. Prentice Hall, New Jersey, 361p. Petruccioli, M., D’Annibale A., Rosetto, F., Leonardi,V., Federici, F. 2006. Role of autochthonous filamentous fungi in bioremediation of a soil historically contaminated with aromatic hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology 72(1):28-36. Pfüller, E. 2000. População Microbiana de um solo sob dois sistemas de plantio e dois sistemas de rotação de culturas. Dissertação de Mestrado em Agronomia. Universidade Federal de Santa Maria, 71p. Piña, J., Merino, J., Errazu, A.F., Bucal, V. 2002. Thermal treatment of soils contaminated with gas oil: influence of soil composition and treatment temperature. Journal of Hazardous Materials 94(3):273-290. Pitt, J.I. 1991. A laboratory Guide to Common Penicillium Species. North Wales: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization – Division of Food Processing, 187p. Pointing, S. B. 2001. Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Applied Microbiology and Biotechnology 57:20–33. Por, F.D. 1994. Guia Ilustrado do Manguezal Brasileiro. Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. p.82. Prince, R.C. 1993. Petroleum spill bioremediation in marine environments. Microbiology 19(4):217-242. Queiroz, A.F.S., Celino, J.J. 2009. Manguezais e ecosistemas estuarinos da Baía de Todos os Santos. In: Queiroz, A.F.S e Celino, J.J. (Eds). Avaliação de Ambientes na
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 55
Baía de Todos os Santos. Aspectos geoquímicos, geofísicos e biológicos. Editora da Universidade Federal da Bahia p. 39-58. Racke, D.K. 1990. Implications of enhanced biodegradation for the use and study of pesticides in the soil environment. In: Racke, D.K. and Coats, J.R., eds. Enhanced biodegradation of pesticides in the environment. Washington, DC, ACS, p.269-282. Rahman, K. S., Bareat, I. M., Thaira, J., Thayumanavan, T., Lakshmanaperumalsamy, P. 2002. Bioremediation of gasoline contaminated soil by a bacterial consortium amended with poutry litter, coir pith and rhamnolipid biosurfactant. Bioresource Technology 81:25-32. Rai, J.N., Garg, K.L., Jaitly, A.K. 1981. Saprophytic fungi isolated from woods in mangrove swamps and their wood-decaing capability. Transactions of the Mycological Society of Japan 22:65–74. Ramsay, M.A., Swannell, R.P.J., Shipton, W.A., Duke, N.C., Hill, R.T. 2000. Effect of bioremediation on the microbial community in oiled mangrove sediments. Marine Pollution Bulletin 41:413-419. Raper, K.B.; Fennell, D.I. 1977. The genus Aspergillus. Robert and Krieger, Publishing Company, Inc., Florida, 686p. Ratledge, C. 1993. Biochemistry of Microbial Degradation. Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 590p. Raymond, J.W., Rogers, T.N., Shonnard, D.R., Kline, A.A. 2001. A review of structure-based biodegradation estimation methods. Journal of Hazardous Materials 84:189-215. Reis, J.L.R. 2003. Estudo dos efluentes da indústria de borracha sintética com objetivo de avaliação de toxicidade. Tese de Doutorado em Tecnologia Ambiental COPPE/UFRJ 383p. Rentería, A. e Miranda, H. 1998. Aislamento y selección primaria de cultivos bacterianos capaces de utilizar petróleo como fuente de carbono. Laboratório de Biotecnología. Universidad Nacional de Trujillo – Peru. Ribeiro, T.H., Rubio, J., Smith, R.W.2003. A dried hydrophobic aquaphyte as an oil filter for oil/water emulsions. Spill Science & Technology Bulletin 8(5):483-489. Riser-Roberts, E. 1992. Bioremediation of petroleum contaminated sites. Boca Ratón, FL. CRC Press. Rivera-Cruz, M.C. e Trujillo-Narcía, A. 2004. Estudio de toxicidad vegetal em suelos com petróleos nuevo e intemperizado. Interciencia 29(7):369-376. Robert, F., Israel, S. 1994. Response of bacterial populations to petroleum hydrocarbon contamination in tropical soils. Presentación en el 94th Am. Soc. Microbiol. Gen. Meeting, 23-27, Mayo, Las Vegas, Nevada.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 56
Rosa, A.P. e Trigüis, J.A. 2006. Processo de biorremediação usando o fertilizante NPK, em eventuais derrames de óleo – experimentos laboratoriais. Revista Brasileira de Geociências 36(2):232-242. Rosato, Y.B. 1998. Biodegradação do Petróleo. In: Melo, I.S., e Azevedo, J.L. (eds) Microbiologia Ambiental. Jaguariúna/SP, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA-CNPMA), pp415-438. Rosenberg, E., Legmann, R., Kushmaro, A., Adler E., Abir H., Ron, E.Z. 1996. Oil bioremediation using insoluble nitrogen source. Journal of Biotechnology 51:273-278. Salvo, V.S., Gallizia, I., Moreno, M., Fabiano M. 2005. Fungal communities in PAH-impacted sediments of Genoa-Voltri Harbour (NW Mediterranean, Italy). Marine Pollution Bulletin 50:553–559. Santiago, A.L.C.M.A., Souza-Motta, C.M. 2006. Mucorales isolados do solo de mineração de cobre e produção de amilase e inulinase. Acta botanica brasilis 20(3): 641-647. Santo, L.S.E. 2002. Biodegradabilidade de óleo Diesel por microrganismos nativos da areia da praia de Suape-PE e predição de um modelo relacionado ao derramamento do poluente. Dissertação de Mestrado DEQ/UFPE 84p. Schaeffer-Novelli, Y. 1995. Manguezal: Ecossistema entre a terra e o mar. São Paulo. Caribbean Ecological Research p.64. Scherrer, P. e Mille, G. 1989. Biodegradation of crude oil in a experimentally polluted peaty mangrove soil. Marine Pollution Bulletin 20(9):430-432. Schoenlein-Crusius, I.H., Milanez, A.I., Trufem, S.F.B., Pires-Zottarelli, C.L.A., Grandi, R.A.P., Santos, M.L., Giustra, K.C. 2006. Microscopic fungi in the atlantic rainforest in cubatão, São Paulo, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology 37:267-275 Seabra, P.N. 2001. Uso da biorremediação em áreas impactadas pela indústria de petróleo. Rio de Janeiro, CENPES. Shamshoom, S.M., Ziara, T.S., Abdul-Ritha, A. N., Yacoub, A.E. 1990. Distribution of oil bacteria in the north-west Arabian Gulf. Marine Pollution Bulletin 21:38-40. Sharabi, N.E.D. e Bartha, R. 1993. Testing some assumptions about biodegradability in soil as measured by carbon dioxide evolution. Applied Environmental Microbiology 59: 1201-1205. Silva, J. H. e Monteiro R.T.R. 2000. Degradação de xenobióticos por fungos filamentosos isolados de areia fenólica. Revista Brasileira de Ciência do Solo 24:669-674. Silva, I.E.C., Ludwig, K.V.F., Neumann, D., Scheneider, A.C., Onofre, S.B. 2007. Fungos filamentosos degradadores de compostos fenólicos isolados de águas residuárias
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 57
de postos de combustíveis. Revista de Biologia e Saúde da UNISEP Biology & Healthy Journal 1:101-108. Simom, M.A., Bonner, J.S., Mcdonald, T.J., Autenrieth, R.L. 1999. Bioaugmentation for the Enhanced Bioremediation of Petroleum in a Wetland. Polycyclic Aromatic Compounds 14:231-239. Sorkhoh, N.A., Ghannoum, M.A., Ibraim, A.S., Stretton, R.J., Radwan, S.S. 1990. Crude oil and hydrocarbon-degrading strains of Rhodococcus rhodochous isolated from soil and marine environment in Kuwait. Environmental Pollution 65:1-17. Souza, E.S. 2003. Desenvolvimento de Métodos de Biorremediação Aplicados a Derrames de Petróleo em Água do Mar – Testes Laboratoriais. Tese de doutorado Universidade Estadual do Norte Fluminese. Souza, C.S. 2008. Biodegradação de óleo Diesel por fungos. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Pernambuco. Souza, D. 2009. Biodegradação de petróleo por consórcio bacteriano. Monografia de Graduação. Universidade Federal de Pernambuco. Sutton, B. C. 1980. The Coelomycetes: fungi imperfect with picnidia, acervuli and stroma. Kew, CAB International Mycological Institute, 696 p. Teal, J.M., Farrington, J.W., Burns, K.A., Stegman, J.J., Tripp, B.W., Woodin, B., Phinney, C. 1992. The West falmouth oil spill after 20 years: fate of fuel compounds and effects on animals. Marine Pollution Bulletin 24:607-614. Thomas, J.M., Ward, C.H. 1989. In situ biorestoration of organic contaminants in the subsurface. Environmental Science Technology 23:760-766. Tiquia, S. M., Tam, N. F., Hodgkiss, I. J. 1996. Effects of composting on phytotoxicity of spent pig-manure sawdust litter. Environonmental Pollution 93(3):249-256. Tissot, B.P., Welte, D.H. 1984. Petroleum Formation and Occurrence: a new approach to oil and gas explotation. Springer-Verlag, Berlim. Tolosa, I., Mora, S. J., Fowler, S. W., Villeneuve, J. P., Bartocci, J., Cattini, C. 2005. Aliphatic and aromatic hydrocarbons in marine biota and coastal sediments from the Gulf and Gulf of Oman. Marine Pollution Bulletin 50:1619-1633. Tucker, B., C. Radtke, S. I. Kwon, and A. J. Andersson. 1995. Suppression of bioremediation by Phanerochaete chrysosporium by soil factors. Journal of Hazardous Materials 41:251–265. UNEP - United Nations Environment Programme. 1992. Determinations of petroleum hydrocarbons in sediments. Reference methods for marine pollution studies, nº20. Disponível em: http://195.97.36.231/acrobatfiles/NonMAP/RefMethods/20eng.pdf. Acessado em outubro de 2009.
Azevedo, Liana - Potencial de degradação do petróleo por fungos filamentosos isolados de manguezal... 58
Ururahy, A.F.P. 1998. Biorremediação de resíduo oleoso proveniente de refinaria. Tese de Doutorado. Universidade Federal do Rio de Janeiro. USEPA 8015B. 1996. Nonhalogenated organics using CG/FID. EPA, revision 2, 28p. Uzoamaka, G.O., Tasie, F., Muotoe-Okafor. 2009. Hydrocarbon Degradation Potentials of Indigenous Fungal Isolates from Petroleum Contaminated Soils. Journal of Physical and Natural Sciences 3(1):1-6. Vasudevan, N. e Rajaram, P. 2001. Bioremediation of oil sludge-contaminated soil. Environment International 26:409 – 411. Verstraete, W., Vanloocke, R., Deborger, R., Verlinde, A. 1976. Modeling of the breakdown and the mobilization of hydrocarbons in unsaturated soil layers. In Sharpley, J.M., e Karplan, A.M (eds). Proceeding for the 3rd International Biodegradation Symposium. Apllied Science Publishers, Ltd., London, PP. 99-112. Vitalli, V.M.V., Machado, K.M.G., Andrea, M.M., Bononi, V.L.R. 2006. Screening mitosporic fungi for organochlorides degradation. Brazilian Journal of Microbiology 37:256-261. Walter, M.V. e Crawford, R.L. 1997. Manual of environment microbiology. ASM Press, Washington, D.C. 894p. Wasserman, A., Plachta, I. 1994. Petroquímica: Introdução. McKlausen Editora. Wong, M.H. 1985. Effects of animal manure composts on tree (Acacia confusa) seedling growth. Agricultural Wastes 13:261-272. Yerushalmi, L., Rocheleau, S., Cimpoia, R., Sarrazin, M., Sunahara, G., Peisajovich, A., Leclair, G., Guiot, S.R. 2003. Enhsnced biodegradation of petroleum hydrocarbons in contaminated soil. Bioremediation Journal 7:37 51. Zhuang, T. e Peng, L. 1995. The degradation of Diesel oil micro-organisms in the mangrove-soil. Journal of Xiamen University 34(3):442-446.