Post on 20-Nov-2018
Desenvolvimento de tecnologias que
possibilitem uma análise detalhada
tanto dos estados normais e anormais
dos genes, quanto da expressão de
milhares de genes nos estados normal
e patológico
Northern blot
• Técnica utilizada para analisar a expressão gênica de umgene em particular pela detecção do mRNA de umaamostra (diferentes tecidos, estágios de desenvolvimento,infecção por patógeno)
• Se um gene é observado como sendo super expressopela sua abundância de mRNA, em um estado de doençaem comparação com o estado normal, ele seria um genealvo de estudo
• Uso de uma sonda específica complementar à sequênciaalvo a ser analisada
Western blot
• Análise da função genética frequentemente
requer o exame da proteína codificada pelo
gene normal ou mutante de interesse
• Saber como o defeito no DNA altera a proteína
codificada para produzir o fenótipo clínico
• Técnica utilizada para detectar proteínas em
uma dada amostra de tecido ou extrato celular
Aplicar extrato proteico
total em gel de
poliacrilamida
Transferência para
membrana de
nitrocelulose
Incubação
anticorpos
ELETROFORESE
REVELAÇÃO
Proteínas
separadas
por
tamanho
Western blot
demonstrando a
presença ou ausência
da proteína muscular
distrofina nos extratos
proteicos de pacientes
com a Duchene ou
Becker (forma mais
branda)
Hibridação em tecido
Utiliza de sondas de DNA marcadas para
um determinado gene para ver os
locais no tecido onde ocorre a
expressão;
Por hibridação a sonda se liga no RNA
mensageiro transcrito no tecido;
Ex. MMP 2 localizada em ligamento
periodontal;
Imunohistoquímica
Utiliza de anticorpos específicos para
determinadas proteínas para a
localização dos locais onde estão
presentes as proteínas no tecidos;
Estes anticorpos permitem a ligação de um
composto fluorescente para
visualização em microscópio
apropriado;
Ex. MMP 2 localizada em ligamento
periodontal;
• Arranjos conhecidos de milhares
de pequenas sequências de DNA
(SONDAS) em spots microscópicos
ligação a uma lâmina de vidro ou
chip de silicone
Microarray (micro-arranjos)
Sondas hidridizarão com amostras de
DNA alvo complementaridade de
bases FLUORESCÊNCIA
• Técnica utilizada para a análise da
expressão gênica de milhares de
genes SIMULTANEAMENTE
A – T
G - C
Maceração do tecido
em N2 líquido
Extração de
RNA total e
síntese de cDNA
Vermelho: cDNA paciente pré operatório
Verde: cDNA paciente pós operatório
Marcar DNA com
corantes fluorescentes
MICROARRAY
Scanner de
fluorescência
reconhece DNAs
marcados
Vermelho: cDNA paciente pré operatório
Verde: cDNA paciente pós operatório
Amarelo: expresso nas 2 condições de forma semelhante
Lâmina com 55.000 genes humanos
Identificação de 62 genes diferencialmente
expressos nas condições pré e pós-operatórias
PCR em Tempo Real
• Técnica para amplificar (aumentar quantidade) e, simultaneamente,
QUANTIFICAR uma molécula de DNA alvo
•Altamente sensível e específica
• Uso de fluoróforos que se intercalam em
DNA dupla fita à medida que ocorrem as
amplificações durante cada ciclo
• Fluorescência detectada por um
equipamento conectado a um computador
Quanto mais cópias de DNA (gene) presentes na
amostra (pré ou pós), maior será a fluorescência
detectada EXPRESSÃO AUMENTADA DO
GENE NAQUELA CONDIÇÃO
SYBR® Green
• Intercalante de DNA dupla fita
• Fluoróforo em suspensão
• Inespecífico
• Não permite multiplex
• A emissão de fluorescência é
proporcional ao número de
moléculas e ao tamanho do
amplicon