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PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO
POR Zymomonas mobilis NATURALMENTE
OCORRENTE E RECOMBINANTE, EMPREGANDO
BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
DDAANNIIEELLLLEE DDAA SSIILLVVEEIIRRAA DDOOSS SSAANNTTOOSS
ORIENTADOR:
Prof. Nei Pereira Jr, PhD
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Química
2012
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Química
Programa de Pós-Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e
Bioquímicos
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PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E
RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA
LIGNOCELULÓSICA
DDAANNIIEELLLLEE DDAA SSIILLVVEEIIRRAA DDOOSS SSAANNTTOOSS
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos para a
Obtenção do Grau de Doutor em Ciências (DSc)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Escola de Química
2012
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PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE E
RECOMBINANTE, EMPREGANDO BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
Danielle da Silveira dos Santos
Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos
Químicos e Bioquímicos da Escola de Química da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em
Ciências, sob orientação do Prof. Nei Pereira Jr.
Banca examinadora:
Prof. Nei Pereira Junior, PhD (EQ/UFRJ)
(Orientador-Presidente)
Profa. Janete Magali de Araújo, DSc (CCB/ UFPE)
Prof. Antonio Carlos Augusto da Costa, DSc (IQ/ UFRJ)
Profa. Eliana Flávia Camporese Sérvulo, DSc (EQ/UFRJ)
Prof. Rodrigo Pires do Nascimento, DSc (EQ/UFRJ)
Profa. Lídia Maria Melo Santa Anna, DSc (PETROBRAS)
EQ/UFRJ 2012
iv
F ICHA CATALOGRÁFICA
Santos, Danielle da Silveira dos.
Produção de etanol de segunda geração por Zymomonas mobilis
naturalmente ocorrente e recombinante, empregando biomassa
lignocelulósica/ Danielle da Silveira dos Santos. -- Rio de Janeiro, 2012.
Tese (Doutorado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Química, Rio de Janeiro, 2012. 218 p.: il.
Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.
1. Zymomonas mobilis. 2.Fermentação. 3.Bagaço de cana-de-açúcar.
4. Engenharia genética. 5. Teses I. Pereira Jr., Nei (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Escola de Química, Pós-Graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos. III. Título.
v
A meus pais, Maria Ignês e José Fernando, à minha irmã, Vanessa, ao meu
afilhado, João Guilherme, aos meus avós e ao meu amor, Bruno.
Dedico esta Tese a vocês, que são tudo em minha vida.
vi
“A cada dia que vivo, mais me
convenço de que o desperdício da
vida está no amor que não
damos, nas forças que não
usamos, na prudência egoísta
que nada arrisca.”
Carlos Drummond de Andrade
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AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao querido professor Nei Pereira Jr., obrigada pela orientação exemplar,
pautada por um elevado e rigoroso nível científico, contribuindo para enriquecer
todas as etapas subjacentes ao processo de investigação. Obrigada pela
confiança depositada, pela oportunidade oferecida, pela partilha do saber, por
estimular o meu interesse pelo conhecimento, pelo acompanhamento
incansável nesta jornada, me encorajando para que eu prosseguisse e
concluísse este trabalho. Orgulho-me de ter desenvolvido este estudo sob a
sua orientação. Acima de tudo, obrigada por ter sido responsável pelo meu
amadurecimento profissional. Jamais teria ido tão longe sem o seu auxílio,
amizade e dedicação. Meu profundo respeito, admiração e gratidão.
viii
AGRADECIMENTOS
Agradeço principalmente ao meu amado Deus, que com seu amor
incondicional e sua imensa graça tem me dado forças para enfrentar todos os
obstáculos da vida, permitido que eu realize todos os meus sonhos.
À minha família, da qual sempre tive apoio total e um amor incondicional:
meus pais, José Fernando e Maria Ignês; minha irmã, Vanessa; meu sobrinho,
João Guilherme; meu cunhado, Mario; meus avós, Geraldo, Isaura, Maria
Clara, Luís Fernando, Neide e Nyldo, que sempre estiveram presentes em
minha vida, me dando apoio e me erguendo em qualquer situação; a meus
primos e tios, em especial, Walter Silveira, pelo auxílio e carinho. Minha
felicidade não se realizaria sem a participação de vocês.
A meu futuro marido, Bruno Moreira Martins, por ser o meu porto seguro e
anjo da guarda em todos os aspectos da minha vida, por todo amor, dedicação,
carinho e conforto em todos os momentos. Com toda a certeza, se não
estivesse do seu lado não seria tão feliz e completa. Agradeço também à sua
família, pela convivência agradável e carinho.
Ao Professor Dr. Fernando Araripe Torres (IB, UnB), pela dedicação,
profissionalismo e grande colaboração depositada; assim como ao seu grupo
de pesquisa; em especial, Viviane. Meus sinceros agradecimentos.
A todos os integrantes do Laboratório de Desenvolvimento de Bioprocessos
pelo auxílio e companheirismo, tornando o laboratório um lugar agradável:
Liliana, Patrycia, Sabrina Dias, Mariana Ruiz, Vanessa Rocha, Fabrício, Luís
André, Paulo, Mariana Faber, Mônica, Camylle, Leonard, Beatriz, Guilherme,
Vanessa, Renata, Lys, Ludmilla, Sabrina Mesquita, Mariana Mello, Elisabete e
Eleandro, Wilma, Marcio, Carla; ao Jorge, pela colaboração e atenção em
todos os momentos.
Às queridas alunas, Aghata e Jéssica, pelo auxílio, amizade e carinho.
ix
Ao Luís Carlos por ter sido fundamental na elaboração da minha tese, por
todo apoio, estímulo, amizade, dedicação e confiança a mim depositadas. Não
tenho palavras que descrevam tamanha gratidão.
À Carolina e Maeda, pela colaboração neste trabalho, auxílio, amizade e
companheirismo.
Ao meu melhor amigo, Elcio, pela presença em todos os momentos,
contribuindo efetivamente para formulação de minha tese, por todo carinho,
dedicação e amizade depositados.
À Dona Edina, que já faz parte da família, por todo o carinho, amor e
companheirismo.
Às minhas melhores amigas, Bárbara, Ticiane, Regianne, Alessandra,
Daiane, Camila e à nova amiga, Janaína, pelo companheirismo, carinho,
momentos de descontração, desabafo e pela amizade sincera.
Ao Professor Dr. Donato Aranda, pelo auxílio e amizade, assim como os
integrantes de seu grupo de pesquisa; em especial às queridas amigas, Ana
Paula, Andréia, Mariana Barreto e Laiza; e ao amigo Dower, pelo
companheirismo e confiança depositados.
Ao Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e
Bioquímicos da Escola de Química da UFRJ; ao Departamento de Engenharia
Bioquímica, especialmente aos funcionários da Secretaria de Pós-graduação
da Escola de Química, pela agradável recepção e convivência diária.
À PETROBRAS, CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro.
Aos membros da banca, por terem aceitado a participar da avaliação deste
trabalho.
"A glória da amizade não é só a mão estendida, o sorriso carinhoso nem mesmo a companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você
descobre que alguém acredita e confia em você”. Anônimo.
E a todos que participaram direta ou indiretamente na realização deste trabalho,
Muito Obrigada!
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RESUMO
SANTOS, Danielle da Silveira dos. Produção de etanol de segunda geração por Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e recombinante empregando biomassa lignocelulósica. Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de Química- Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2012.
O desenvolvimento de tecnologias para produção de bioetanol a partir de materiais lignocelulósicos mostra-se promissor devido às várias vantagens da utilização de biomassa residual para produção de etanol de segunda geração. Dessa forma, o atual cenário dos biocombustíveis pode ser contemplado com mais uma alternativa tecnológica, pois o bagaço de cana-de-açúcar, principal material lignocelulósico em países tropicais, possui enorme potencial energético. A bactéria Zymomonas mobilis mostrou-se extremamente atraente
para a produção de etanol combustível de segunda geração a partir da glicose proveniente da fração celulósica, em virtude de sua elevada capacidade de absorção, resultando em altos valores de produtividade. No entanto, as linhagens nativas mostraram-se incapazes de metabolizar outro açúcar importante encontrado nas biomassas de composição lignocelulósica, a xilose oriunda da fração hemicelulósica. Visando avançar neste tema e tornar a produção de etanol de segunda geração mais eficiente, recomendou-se a incorporação de técnicas da Biologia Molecular, a fim de dotar as linhagens utilizadas no presente estudo capazes de fermentar também a xilose. Com isto, motivados com a procura de novas alternativas energéticas e industriais, nas quais diferentes derivados de petróleo sejam substituídos, avançar-se-ia para a concepção SSCF. Desta forma, o objetivo deste
trabalho consiste em avaliar a produção de etanol a partir do bagaço de cana por Zymomonas mobilis, utilizando-se a estratégia de processo SSF (hidrólise enzimática e fermentação simultâneas) e SSCF (hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas) a
partir da linhagem nativa e recombinante, respectivamente. Inicialmente, para se conseguir o fácil acesso das enzimas do complexo celulásico até a celulose, o bagaço passou por um pré-tratamento ácido para extração dos açúcares da fração hemicelulósica, resultando em um resíduo sólido denominado celulignina. Em seguida, foi realizado um pré-tratamento alcalino, que promove sua deslignificação parcial. Inicialmente, a celulose presente na celulignina parcialmente deslignificada foi pré-hidrolisada com enzimas de um complexo enzimático comercial denominado celulases, permitindo a conversão da celulose a açúcares fermentáveis, nas temperaturas de 50°C, durante 12 horas. No que tange à transformação genética aplicada em Z. mobilis, o plasmídio pZMO1 (1565 kb) foi sintetizado quimicamente, contendo os genes relacionados à origem de replicação de E. coli e de Z. mobilis, os genes
que codificam as enzimas XI, XK, TAL e TKL, bem como a marca de seleção tetraciclina. Posteriormente a essa etapa, a adaptação metabólica foi empregada, seguida de planejamentos experimentais de superfície de resposta; os quais avaliaram a adição de glicose e xilose no meio de cultivo em diferentes concentrações, bem como de hidrolisado hemicelulósico em diferentes proporções. As condições ótimas para o processo SSF utilizando-se a bactéria Zymomonas mobilis nativa, empregando o bagaço de cana pré-tratado e o resíduo da indústria de celulose, respectivamente, foram: teor de sólido, 30% e 20%; carga enzimática, 25 FPU/g e 17,5 FPU/g; concentração celular, 4 g/L e 1,59% (v/v); atingindo a concentração final de etanol de 60 g/L e 58 g/L; avaliando a adição dos nutrientes complementares ao processo SSF: extrato de levedura, 12,5 e 6,25 g/L; KH2PO4,
2,5 e 1,25 g/L; (NH4)2SO4, 1,5 e 2,25 g/L e MgSO4, 1,5 e 2,25 g/L. Os melhores resultados alcançados foram de 65 g/L e 54 g/L de etanol. Foi alcançado 25 g/L de etanol, constatando-se que cerca de 50% desta pentose foi convertida ao produto, a partir do processo SSCF pela linhagem Zymomonas mobilis CP4 recombinante, empregando 30% de sólidos, 20,5%
de hidrolisado hemicelulósico, 10 mg/L de tetraciclina, carga enzimática de 25 FPU/g de celulignina e 10% (v/v) de inoculo inicial. Os resultados alcançados com o presente trabalho foram satisfatórios e apontam para o desenvolvimento de novas pesquisas.
xi
ABSTRACT
SANTOS, Danielle da Silveira dos. Second generation ethanol production by native and recombinant strain of Zymomonas mobilis employing lignocellulosic biomass. Supervisor: Nei Pereira Jr. School of Chemistry of
Federal University of Rio de Janeiro – Brazil, 2012.
During the past decades, considerable efforts have been made to utilize agricultural and forest residues as biomass feedstock for the production of bioethanol as an alternative fuel. Sugarcane bagasse, composed of 38.1 w% cellulose, 28.4 w% hemicellulose and 18.4 w% lignin, represents the main lignocellulosic material to be considered by most of tropical countries. The bacterium Zymomonas mobilis possesses technological advantages which
make of it a potential fermentative agent for industrial ethanol production: fast glucose uptake, high ethanol tolerance and production yields, besides the ability of fermenting in anaerobiose. Compared with Saccharomyces cerevisiae, the ethanol yield and specific productivity of Zymomonas mobilis are higher, because less biomass is produced and a higher metabolic rate of glucose is maintained through its special Entner–Doudoroff pathway. The bacterium Zymomonas mobilis was shown to be extremely attractive for the
ethanol second generation production from glucose of the cellulosic fraction, due to its high capacity to absorb this sugar, resulting in high ethanol productivity values. However, the wild-type strains proved to be unable to metabolize xylose arisen from the hemicellulose fraction. In order to turn the strain used in this study also able to ferment xylose into ethanol and make more efficient the production of second generation ethanol, the incorporation of molecular biology techniques was planned. Thus, the aim of this study was to evaluate the fermentation utilizing strains of Z. mobilis by simultaneous saccharification and fermentation
(SSF) and simultaneous saccharification for and co-fermentation (SSCF) processes, in which the fermentation of both sugars occurs in one step. Initially, to make easier the accessibility of cellulases to the cellulose microfibrils, the bagasse had to be submitted to a pretreatment with diluted acid to fractionate it and extract the hemicellulose component from the solid residue termed cellulignin. This solid residue was pretreated using NaOH (4%) aiming at its partial delignification. Thereafter, the pretreated cellulignin underwent the action of a commercial celulolytic preparation, allowing the conversion of cellulose to glucose. This enzymatic pretreatment occurred under temperature of 50°C for 12 hours, after which the temperature was reduced to 30°C and the system was inoculated with cells of Z. mobilis. Regarding the genetic transformation, the Z. mobilis plasmid pZMO1 of 1565 kb was chemically synthesized and cloned into a synthetic vector, that contain the E. coli and Z. mobilis replication checkmark origin; the XI, XK, TAL, TKL genes, and the tetracycline resistance. Metabolic adaptation was performed, followed by response surface experimental, evaluating the addition of glucose and xylose in the culture medium with different concentrations, as well as hemicellulosic hydrolyzate in different proportions. Employing the original strain, statistical experimental design was used to optimize the SSF
conditions, evaluating the solid content, enzymatic load and cell concentration by submerged fermentation. Using the pretreated sugarcane bagasse and the paper industry residue, respectively, the optimum conditions were found to be: solid content, 30% and 20%; enzyme load, 25 FPU/g and 17.5 FPU/g; cell concentration, 4 g/L and 1.59%(v/v), resulting in a maximum ethanol concentration of 60 g/L and 58 g/L, evaluating the nutrients addition in the SSF process: yeast extract, 12.5 and 6.25 g/L; KH2PO4, 2.5 and 1.25 g/L; (NH4)2SO4, 1.5 and 2.25 g/L and MgSO4, 1.5 and 2.25 g/L, were achieved 65 g/L and 54 g/L of ethanol concentration. The recombinant Zymomonas mobilis CP4 strain reached 25
g/L of ethanol, confirming that about 50% of this pentose were consumed in the SSCF process, employing 30% of solids, 20.5% of hydrolyzed hemicellulosic, 10 mg/L of tetracycline, enzyme load of 25 FPU/g cellulignin, and 10% of the initial inoculum. The results were very interesting and pointed out for future developments.
xii
SSUUMMÁÁRRIIOO
CAPÍTULO 1
1
1. APRESENTAÇÃO DO TEMA 1
CAPÍTULO 2
7
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 7
2.1. A ERA DOS BIOCOMBUSTÍVEIS 8
2.2. ETANOL: O PRINCIPAL BIOCOMBUSTÍVEL 9
2.2.1. PANORAMA MUNDIAL 9 2.3.2. PANORAMA NACIONAL 10
2.3. CANA-DE-AÇÚCAR: A MATÉRIA-PRIMA BRASILEIRA PARA PRODUÇÃO DE ETANOL
12
2.3.1. PRODUÇÃO DE AÇÚCAR E ETANOL DO CALDO DE CANA 13 2.3.2. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 15
2.4. MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 16
2.4.1. MATÉRIA-PRIMA PARA A PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS 16
2.4.1. ESTRUTURA CELULAR 18 2.4.2. CONSTITUIÇÃO QUÍMICA 20
2.4.2.1. Celulose 21 2.4.2.2. Hemicelulose 23 2.4.2.3. Lignina 24
2.5. PRÉ-TRATAMENTO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 26
2.5.1. PRETRATAMENTO ÁCIDO 27 2.5.2. PRETRATAMENTO ALCALINO 28 2.5.3. INIBIDORES 29
2.5.4. PRÉ- HIDRÓLISE ENZIMÁTICA 30
2.6. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis 31
2.6.1. BREVE HISTÓRICO 31 2.6.2. CARACTERÍSTICAS GERAIS 33
2.6.2.1. Biologia molecular básica de Z. mobilis 34 2.6.3. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS 35
2.6.3.1. Z. mobilis X S. cerevisiae 35 2.6.3.2. Outras Habilidades 36
2.6.4. UTILIZAÇÃO DE AÇÚCARES 37 2.6.5. ROTA METABÓLICA 38
2.6.6. FORMAÇÃO DE SUBPRODUTOS 39 2.6.7. MEIOS DE CULTIVO 40
2.6.7.1. Nitrogênio 41 2.6.7.2. Fósforo 43 2.6.7.3. Enxofre 43 2.6.7.4. Meios de cultivo de baixo custo 43
2.6.9. PRODUÇÃO DE ETANOL CONVENCIONAL POR Z. mobilis 45 2.6.9.1. Inibição pelo produto, substrato e temperatura 47
2.7. ESTRATÉGIAS DE PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO
50
2.7.1. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEPARADA DA FERMENTAÇÃO 50 2.7.2. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS 51 3.7.3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E CO-FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS 52 2.7.4. BIOPROCESSO CONSOLIDADO 53 2.7.5. PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR
Z. mobilis 54
xiii
2.8. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis
56
2.8.1. METABOLIZAÇÃO DA XILOSE 56 2.8.1.1. Breve Histórico 58
2.8.2. METABOLIZAÇÃO DA ARABINOSE 60 2.8.3. PROBLEMÁTICAS 64
2.8.3.1. Estabilidade 64 2.8.3.2. Proteína Transportadora 65
2.8.3.3. Xilose X Glicose 66 2.8.3.4. Atividades Enzimáticas 68 2.8.3.5. Produção de Xilitol 69 2.8.3.6. Inibição pelo Substrato/ Produto 70 2.8.3.7. Inibição por Compostos Tóxicos 70
2.8.4. ALTERNATIVAS 72 2.8.4.1. Linhagens adaptadas à toxicidade 72 2.8.4.2. Redução de cargas enzimáticas no processo SSCF
73
2.8.4.3. Modificação genética da glf 74 2.8.4.4. Inativação da GFOR 74 2.8.4.5. Adaptação Metabólica 74 2.8.4.6. Integração Cromossomal 75
2.8.5. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA PARA DIFERENTES FINALIDADES
75
2.9. CONSIDERAÇÕES GERAIS 77
CAPÍTULO 3
79
3. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS 79
3.1. JUSTIFICATIVAS 79
3.2. OBJETIVO GERAL 81
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 81
CAPÍTULO 4
83
4. MATERIAIS E MÉTODOS 84
4.1. MATÉRIA-PRIMA 84
4.1.1. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 84 4.1.2. RESÍDUO DA INDÚSTRIA DE CELULOSE 84
4.2. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR 84
4.2.1. PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO 84 4.2.2. PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO 86 4.2.3. PRÉ-HIDRÓLISE ENZIMÁTICA 87
4.3. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis NATIVA 87
4.3.1. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE Z.mobilis 88 4.3.2. PRÉ- INÓCULO E INÓCULO: COMPOSIÇÃO DE MEIO E
CONDIÇÕES DE CULTIVO 89
4.3.1. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO 90 4.3.3.1. Desempenho das linhagens nativas frente à utilização de glicose e xilose
91
4.3.3.2. Produção de etanol a partir do bagaço de cana e resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis nativa através do processo SSF
91
I. Otimização da produção de etanol a partir de bagaço de cana e PM2 por Z. mobilis CP4 nativa
92
II. Análise da adição de diferentes componentes do meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e PM2 frente à produção de etanol a partir por Z. mobilis CP4 nativa
93
xiv
4.4. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis 95
4.4.1. APLICAÇÃO DA ENGENHARIA GENÉTICA EM Z. mobilis 95 4.4.1.1. Desenho dos genes 95 4.4.1.2. Amplificação gênica em E. coli 96 4.4.1.3. Extração do DNA 96 4.4.1.4. Transformação em Zymomonas mobilis 97
I. Células competentes de Z. mobilis 97 II. Plasmídeo exógeno 98 III. Eletroporação 98
4.4.1.4. Etapa pós-transformação 98 4.4.1.5. Meio de crescimento e manutenção 99
4.4.2. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO 100 4.4.2.1. Ensaios preliminares para avaliar o consumo de glicose e xilose em meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada
100
I. Seleção de clones 101 I. Adaptação metabólica 101
4.4.2.2. Ensaios para produção de etanol a partir de bagaço de cana através do processo SSCF
102
I. Adaptação metabólica 102 II. Processo de propagação mediante
diferentes estratégias de aclimatação celular
103
III. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos experimentais sequenciais
104
4.5. PRODUÇÃO DE ETANOL EM BIORREATOR INSTRUMENTADO ATRAVÉS DOS PROCESSOS SSF E SSCF
105
4.6. MÉTODOS ANALÍTICOS 106
4.6.1. DETERMINAÇÃO DE ETANOL E AÇÚCARES POR CLAE 1 106 4.6.2. QUANTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO 1 107
4.7. ANÁLISE DOS RESULTADOS 1 107
4.7.1. ESTATÍSTICA 107 4.7.2. CÁLCULO DE EFICIÊNCIA 108 4.7.3. TAXA INSTANTÂNEA ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO 108 4.7.4. TEMPO DE DUPLICAÇÃO 109 4.7.5. VARIÁVEIS DE RESPOSTA 109
CAPÍTULO 5
110
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 110
5.1. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO EMPREGANDO A BACTÉRIA Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE
111
5.1.1. DESEMPENHO DAS LINHAGENS NATIVAS FRENTE À UTILIZAÇÃO DE GLICOSE E XILOSE
111
5.1.2. OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SIMULTÂNEA À FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR Zymomonas mobilis CP4
114
I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado 114
II. Resíduos da indústria de celulose 126
5.1.3. ANÁLISE DA ADIÇÃO DE DIFERENTES COMPONENTES DO MEIO NO PROCESSO FRENTE À PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR POR Z. mobilis CP4 NATIVA
130
I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado 130
Delineamento fatorial 130 Planejamento Composto Central Rotacional 134
II. Resíduo da indústria de celulose 139
5.1.4. ANÁLISE COMPARATIVA 145
xv
5.2. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis 149 5.2.1. ETAPA PÓS-TRANSFORMAÇÃO 149 5.2.2. ADAPTAÇÃO METABÓLICA EM MEIO SINTÉTICO 150 5.2.3. ENSAIOS PRELIMINARES AVALIANDO O CONSUMO DE
GLICOSE E XILOSE EM MEIO SINTÉTICO POR Z. mobilis GENETICAMENTE MODIFICADA
153
I. Planejamento Experimental 153 II. Comparação do desempenho de diferentes
clones 157
5.2.4. PRODUÇÃO DE ETANOL ATRAVÉS DO PROCESSO SSCF POR Zymomonas mobilis RECOMBINANTE
158
I. Adaptação metabólica em meio SSCF 158 II. Processo de propagação mediante diferentes estratégias de aclimatação celular
160
III. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos experimentais sequenciais
161
5.3. CONSIDERAÇÕES GERAIS 169
CAPÍTULO 6
171
6. CONCLUSÕES 171
6.1. CONCLUSÕES 171
6.2. SUGESTÕES 174
CAPÍTULO 7
175
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 175
xvi
SUMÁRIO DE FIGURAS Figura 2.1. Participação, de países selecionados, no consumo mundial de
petróleo no ano de 2011.
8
Figura 2.2. Evolução do consumo de etanol no Brasil e EUA. 10
Figura 2.3. Cana-de-açúcar. 12
Figura 2.4. Excedente de Palha de cana-de-açúcar. 14
Figura 2.5. Excedente de Bagaço de cana-de-açúcar. 15
Figura 2.6. Diagrama da estrutura das camadas da parede de uma fibra. 18
Figura 2.7. Principais componentes de materiais lignocelulósicos. 20
Figura 2.8. Estrutura simplificada da cadeia linear da celulose, formada por
várias unidades consecutivas de celobiose.
22
Figura 2.9. Representação das ligações de Hidrogênio na estrutura da
celulose
23
Figura 2.10. Monossacarídeos constituintes das hemiceluloses. 24
Figura 2.11. Estrutura simplificada da lignina. 25
Figura 2.12. Efeito do pré-tratamento químico em materiais lignocelulósico. 26
Figura 2.13. Atuação sinérgica das celulases. 30
Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4. 33
Figura 2.15. Via metabólica de formação de produtos da fermentação de
carboidratos por Zymomonas mobilis.
38
Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática
separada da fermentação (SHF).
51
Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática e
fementação simultâneas (SSF).
51
Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificação e co-
fermentação simultâneas (SSCF).
53
Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produção
de etanol de segunda geração (BPC).
53
Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff de Z.
mobilis.
57
Figura 2.21. Mapa do plasmídeo pZMETX. 60
Figura 4.1. Etapas do pré-tratamento ácido. 85
Figura 4.2. Bagaço de cana-de-açúcar in natura (A); Bagaço de cana-de-
açúcar após pré- tratamento ácido (Celulignina) (B).
85
Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino. 86
Figura 4.4. (A) Fração líquida após pré-tratamento alcalino, (B- E) Sequência
de lavagens com água destilada para a remoção da lignina residual.
86
Figura 4.5. Perfil cromatográfico típico do hidrolisado celulósico pré-tratado
enzimaticamente.
87
Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis. 88
Figura 4.7. Linhagem floculante de Z. mobilis CP4, em meio de cultura. 88
Figura 4.8. Sistema de operon duplo para os genes do metabolismo de
xilose.
96
Figura 4.9. Microscopia das linhagens de Zymomonas mobilis CP4. 99
xvii
recombinante (aumento de 1000 X).
Figura 4.10. Diagrama de blocos indicando a estratégia empregada para
aclimatação celular.
104
Figura 4.11. Experimento em Biorreator BIOFLO III (New Brunswick). 106
Figura 4.12. Sistema cromatrográfico CLAE com detecção por índice
refração.
106
Figura 5.1. Cinética de acompanhamento de consumo de glicose, produção
de etanol e crescimento celular de Z. mobilis linhagem AG11.
111
Figura 5.2. Cinética de acompanhamento de consumo de glicose, produção
de etanol e crescimento celular de Z. mobilis linhagem CP4
112
Figura 5.3. Perfil cromatográfico típico de fermentação de Z.mobilis 113
Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose. 113
Figura 5.5. Material celulósico deslignificado (A), logo após a adição de
enzimas e meio (B) e após a pré-hidrólise enzimática (C)
115
Figura 5.6. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da
relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre
a concentração inicial de glicose do processo SSF a partir do bagaço de
cana pré-tratado.
117
Figura 5.7. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da
relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre
a concentração de etanol através do processo SSF a partir do bagaço de
cana pré-tratado por Z. mobilis CP4.
119
Figuras 5.8. Superfícies de resposta mostrando os efeitos combinados da
entre (A) relação sólido: líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro
B), (B) relação sólido: líquido (parâmetro A) e concentração celular
(parâmetro C), (C) carga enzimática (parâmetro B) e concentração celular
(parâmetro C) sobre a produtividade volumétrica de etanol através do
processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4.
122
Figura 5.9. Cinética do processo de hidrólise enzimática de celulose e
fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado através do
processo SSF por Z. mobilis CP4, em frascos agitados. Condições
operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células.
124
Figura 5.10. Cinética do processo de hidrólise enzimática de celulose e
fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado através do
processo SSF por Z. mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condições
operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células.
125
Figura 5.11. Superfície de resposta mostrando os efeitos da relação
sólido:líquido, carga enzimática e suas interações na produção de etanol
através do processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z.
mobilis CP4.
129
Figura 5.12. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e
fermentação simultâneas a partir de resíduos da indústria de celulose por Z.
mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condições operacionais: relação
sólido:líquido (2:10 g/mL), carga enzimática (17,5 FPU/g) e concentração
celular (1,59 %).
129
Figura 5.13. Validação experimental da condição ótima obtida no 133
xviii
Planejamento fatorial 24, a partir de bagaço de cana pré-tratado: 2,5 g/L de
extrato de levedura, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de (NH4)2SO4 e 0,5 g/L de
MgSO4.7H2O, atingindo 53 g/L de etanol em biorreator instrumentado.
Condições: relação sólido líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25
FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L.
Figura 5.14. Superfície de resposta mostrando efeitos de MgSO4.7H2O (g/L)
e (NH4)2SO4 (A); KH2PO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) (B); KH2PO4 (g/L) e
(NH4)2SO4 e suas interações para a produção de etanol (C).
137
Figura 5.15. Cinética da produção de etanol a partir de bagaço de cana pré-
tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/
g, através do processo SSF por Z. mobilis CP4, utilizando 12,5 g/L de extrato
de levedura, 2,5 g/L de KH2PO4, 1,25 g/L de (NH4)2SO4 e 0,5 g/L
MgSO4.7H2O no meio fermentativo.
139
Figura 5.16. Superfícies de resposta mostrando efeitos de extrato de
levedura e MgSO4.7H2O (A); KH2PO4 e (NH4)2SO4 (B); (NH4)2SO4 e
MgSO4.7H2O (C) e suas interações para a produção de etanol a partir de
resíduo da indústria de celulose.
143
Figura 5.17. Cinética da melhor condição obtida (extrato de levedura, 5 g/L;
KH2PO4, 1 g/L; (NH4)2SO4, 2 g/L e MgSO4.7H2O, 2 g/L) para a produção de
etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de resíduo da
indústria de celulose, em biorreator instrumentado.
144
Figura 5.18. Crescimento de diferentes linhagens após 168 h de crescimento
a 30C frente à utilização de meio RMG, contendo glicose (20 g/L), KH2PO4
(2 g/L), extrato de levedura (10 g/L), ágar (20 g/L) e tetraciclina (10 mg/L).
149
Figura 5.19. Histograma representando os 50 ciclos de adaptação metabólica,
empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis em meio sintético.
Figura 5.20. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre a
glicose (Parâmetro A) e a xilose (Parâmetro B) sobre a produção de etanol
por Zymomonas mobilis recombinante.
152
156
Figura 5.21. Cinética comparativa de diferentes clones selecionados após
crescimento em meio RMGX durante 72 horas, em 30C de temperatura e
agitação de 150 rpm
158
Figura 5.22. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre os
parâmetros sobre a produção de etanol a partir do primeiro Planejamento
referente ao processo SSCF pela linhagem recombinante de Z. mobilis.
164
Figura 5.23. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre os
parâmetros sobre a produção de etanol a partir do segundo Planejamento
referente ao processo SSCF pela linhagem recombinante de Z. mobilis.
165
Figura 5.24. Processo SSCF2 em biorreator instrumento por Z. mobilis
modificada, empregando 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico e 2,99:10
(g:mL) de relação sólido:líquido de bagaço de cana pré-tratado.
166
xix
SUMÁRIO DE TABELAS
Tabela 2.1. Perspectivas da produção de etanol. 11
Tabela 2.2. Composição química média do bagaço de cana. 16
Tabela 2.3. Composição química dos resíduos agrícolas (%). 21
Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produção de
etanol convencional por Zymomonas mobilis.
46
Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produção de etanol de
segunda geração por Zymomonas mobilis.
55
Tabela 2.6. Comparação do desempenho de diferentes linhagens
recombinantes de Z. mobilis para a produção de etanol.
61
Tabela 4.1. Meio de manutenção de Z. mobilis. 89
Tabela 4.2. Meio de crescimento de Z. mobilis. 89
Tabela 4.3. Experimentos sequenciais avaliando a bactéria Zymomonas
mobilis naturalmente ocorrente frente à produção de etanol.
90
Tabela 4.4. Variáveis independentes do planejamento experimental central
composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e
concentração celular (g/L), avaliando a produção de etanol, produtividade
volumétrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando o bagaço
de cana-de-açúcar.
93
Tabela 4.5. Variáveis independentes do planejamento experimental central
composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e
concentração celular (%), avaliando a produção de etanol, produtividade
volumétrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando PM2.
94
Tabela 4.6. Parâmetros e níveis usados no Planejamento Experimental
Fatorial 24: extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e
MgSO4.7H2O (g/L), adicionados no hidrolisado celulósico do bagaço de cana.
94
Tabela 4.7. Variáveis independentes do planejamento central composto
avaliando a adição de extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4
(g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) no hidrolisado celulósico do bagaço e de PM2
frente à produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4
nativa.
99
Tabela 4.8. Composição do meio RM, empregado na linhagem recombinante
de Z. mobilis.
100
Tabela 4.9. Experimentos sequenciais avaliando a bactéria Zymomonas
mobilis frente à produção de etanol.
101
Tabela 4.10. Variáveis independentes do planejamento experimental,
avaliando diferentes concentrações de glicose e xilose, em g/L, quanto à
produção de etanol por Z. mobilis recombinante.
102
Tabela 4.11. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos, variando
as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.
102
Tabela 4.12. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos
fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente
do bagaço de cana, mantendo-se a glicose em 20 g/L.
105
Tabela 4.13. Variáveis independentes do primeiro planejamento 105
xx
experimental avaliando o percentual de hidolisado ácido, bem como a
relação sólido:líquido (g:mL) do mesmo do bagaço de cana no que tange à
produção de etanol. através do processo SSCF.
Tabela 4.14. Variáveis independentes do segundo planejamento
experimental avaliando o percentual de hidolisado ácido, bem como a
relação sólido:líquido (g:mL) do mesmo do bagaço de cana no que tange à
produção de etanol através do processo SSCF.
105
Tabela 4.15. Curvas padrão de absorvância versus concentração da massa
celular para as linhagens de Z. mobilis.
107
Tabela 5.1. Desempenho das linhagens AG11 e CP4 de Z. mobilis na
fermentação de glicose (concentração inicial de 20 g/L).
112
Tabela 5.2. Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23,
avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular
frente à produção de etanol a partir do bagaço de cana pré-tratado através
do processo SSF por Z. mobilis CP4.
115
Tabela 5.3. Análise de variância da concentração de glicose inicial do
processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4,
através do Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23,
avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.
116
Tabela 5.4. Análise de variância da concentração de etanol através do
processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4,
utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23,
avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.
118
Tabela 5.5. Análise de variância da produtividade volumétrica de etanol
através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z.
mobilis CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de
Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e
concentração celular.
121
Tabela 5.6. Planejamento Superfície de Resposta 24 investigando efeitos da
Relação sólido:líquido (g:mL), Carga enzimática (FPU/g) e Concentração
celular (%) na produção de etanol a partir de resíduos da indústria de
celulose por Z. mobilis CP4.
126
Tabela 5.7. Análise de Variância da concentração de etanol através do
processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis
CP4, utilizando o Planejamento Superfície de Resposta 24, o qual avaliou os
efeitos da Relação sólido:líquido (g:mL), Carga enzimática (FPU/g) e
Concentração celular (%).
128
Tabela 5.8. Planejamento fatorial 24, avaliando efeitos da concentração de
extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L)
na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de cana
pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25
FPU/g, por Z. mobilis CP4.
131
Tabela 5.9. Análise da variância da produção de etanol, empregando
diferentes concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e
MgSO4.7H2O, através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-
132
xxi
tratado por Zymomonas mobilis CP4.
Tabela 5.10. Planejamento Composto Central 24, avaliando efeitos da adição
de extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O
(g/L) na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de
cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de
25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
134
Tabela 5.11. Análise de variância da produção de etanol, empregando
diferentes concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e
MgSO4.7H2O, através do processo SSF por Z. mobilis a partir do bagaço de
cana.
136
Tabela 5.12. Planejamento Superfície de Resposta 24 investigando efeitos
da adição de extrato de levedura, KH2PO
4, (NH4)
2SO
4 e MgSO
4.7H
2O na
produção de etanol a partir de resíduos de celulose.
140
Tabela 5.13. Análise de variância da produção de etanol, empregando
diferentes concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e
MgSO4.7H2O, através do processo SSF por Zymomonas mobilis a partir de
resíduo da indústria de celulose.
142
Tabela 5.14. Principais resultados relatados na literatura para o processo
SSF com linhagens de Zymomonas mobilis.
145
Tabela 5.15. Resultados obtidos pela linhagem nativa de Zymomonas
mobilis CP4 a partir do processo SSF e a partir da fermentação em meio
sintético.
147
Tabela 5.16. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos,
variando as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.
151
Tabela 5.17. Comparação das variáveis de resposta entre diferentes etapas
de adaptação metabólica.
152
Tabela 5.18. Planejamento experimental preliminar avaliando diferentes
concentrações de glicose e xilose no meio RM frente à produção de etanol e
crescimento de biomassa a partir de meio sintético pela linhagem
recombinante de Zymomonas mobilis CP4.
154
Tabela 5.19. Avaliação de diferentes concentrações de glicose e xilose na
produção de etanol a partir de meio sintético pela linhagem recombinante de
Zymomonas mobilis CP4.
155
Tabela 5.20. Análise de Variância da concentração de etanol a partir de
diferentes concentrações de glicose e xilose pela linhagem recombinante de
Z. mobilis CP4, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.
156
Tabela 5.21. Avaliações de diferentes clones frente ao consumo de glicose e
xilose provenientes no meio RMGX, assim como à produção de etanol por
Zymomonas mobilis recombinante.
157
Tabela 5.22. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos
fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente
do bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L.
159
Tabela 5.23. Comparação das variáveis medidas e calculadas entre
diferentes etapas de adaptação metabólica.
160
Tabela 5.24. Crescimento celular em diferentes estratégias de aclimatação. 160
xxii
Tabela 5.25. Primeiro Planejamento 22
avaliando o percentual de hidrolisado
hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de
cana-de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF1 no que tange à
produção de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis
CP4.
161
Tabela 5.26. Segundo Planejamento 22 avaliando o percentual de hidrolisado
hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de
cana-de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF2 no que tange à
produção de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis
CP4.
162
Tabela 5.27. Análise de Variância da concentração de etanol alcançada no
primeiro Planejamento Experimental do processo SSCF1.
163
Tabela 5.28. Análise de Variância da concentração de etanol alcançada no
segundo Planejamento Experimental do processo SSCF2.
163
Tabela 5.29. Evolução dos resultados obtidos pela linhagem recombinante
de Z.mobilis CP4 a partir do processo SSCF e da fermentação em meio
sintético.
167
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Abs600 600 nanômetros de absorbância Acr: Mutante tolerante ao acetato ADP Adenosina difosfato Aj.
Ajustado
ANOVA Análise de variância araA L-arabionose isomerase araB L-ribuloquinase ara D L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase ATP Adenosina trifosfato ART Açúcares redutores totais BNDES Banco Nacional de Desenvolvimento Econômico e Social BPC Bioprocesso consolidado BR Biorreator CBH Celobiohidrolases CE Carga enzimática [cell] Concentração celular CFU Colony-forming unit COGEN Associação da Indústria de Cogeração de Energia CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CMC carboximetilcelulose CmR gene de resistência ao clorofenicol CNI Confederação Nacional da Indústria CONAB Companhia Nacional de Abastecimento EISA Energy Independece and Security Act EL Extrato de levedura EMP Embder-Meierhopf-Parnas
EPE Empresa de Pesquisa Energética Etanol 2G Etanol de segunda geração EUA Estados Unidos da América Ex. Experimentos F Fisher Calculado FA Frascos agitados FPU Filter Paper Units fru Frutose GFOR Glicose-frutose oxidorredutase glf Proteína facilitadora do transporte de glicose gli Glicose gaL Galactose GL Grau de Liberdade gl Gluconolactona h Hora HMF hidroximetilfurfural IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística LB Meio Luria-Bertani, contendo 10 g/L de triptona, 0,5 g/L de extrato de
levedura, 1 g/L de NaCl (pH7) LADEBIO Laboratório de Desenvolvimento de Bioprocessos LM Lamela Média MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento min. Minuto(s) MJ Megajoule MME Ministério de Minas e Energia MP Matéria-prima MQ Média Quadrática mV Milivolts
xxiv
NAD Nicotinamida adenina dinucleótido NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato-oxidase OCDE Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Econômicos OD600 Densidade ótica em 600 nanômetros de absorbância ODM Organic dry matter ORI Plasmídeo contendo a origem de replicação para Z. mobilis ORI ZYMO Plasmídeo contendo a origem de replicação para Z. mobilis, além dos
genes que metabolizam a xilose: xilose isomerase, xululoquinase, transaldolase e transquetolase.
P Produto PC Pontos centrais Peno Promotor enolase PEA Policy Energy Act Pgap Promotor glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase P.H. Pré-hidrólise enzimática Pi Radical fosfato inorgânico PP Parede Primária Ppdc Promotor piruvato decarboxilase PROALCOOL Programa Nacional do Álcool PS Parede Secundária pZMO1 Plasmídio de Z. mobilis utilizado neste trabalho (1565 kb) p15a Origem de replicação de E. coli QP Produtividade volumétrica em etanol Ref. Referências Bibliográficas PM2 Resíduo da indústria de celulose rpm Rotações por minuto S Substrato
S:L Relação sólido:líquido
sac Sacarose RM Meio de cultura contendo fosfato de potássio, 2 g/L; extrato de
levedura, 10 g/L; tetraciclina, 10 mg/L RMG Meio de cultura contendo fosfato de potássio, 2 g/L; extrato de
levedura, 10 g/L; glicose, 20 g/L; xilose, 20 g/L; tetraciclina, 10 mg/L RMGX Meio de cultura contendo fosfato de potássio, 2 g/L; extrato de
levedura, 10 g/L; glicose, 20 g/L; tetraciclina, 10 mg/L SQ Soma Quadrática SHF Hidrólise enzimática separada da fermentação SSCF Hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas SSF Hidrólise enzimática e fermentação simultâneas TAL Transaldolase Tc Tetraciclina TKT Transquetolase UNICA União de Agroindústria Canavieira de São Paulo v/v Relação volume/volume XI, xylA Xilose isomerase XK, xylB Xululoquinase xil Xilose ZM22; ZM27 Origem de replicação de Z. mobilis
xxv
NOMENCLATURA MATEMÁTICA
Ef Eficiência, expressa em porcentagem
g gravidade
g Grama
g/mL Microgramas por mililitro
g/L Gramas por litro
h Hora
µmax Taxa específica máxima de crescimento (h-1)
μ Taxa de crescimento específico (h-1)
L Litro
mg Miligrama
mL Mililitros
P Concentração de produto (g/L)
p>F Probabilidade de Fisher
μm Micrômetro
pH Potencial hidrogeniônico
p/v Relação peso/volume
QP Produtividade volumétrica em etanol, g/L.h
So Concentração inicial de substrato, g/L
T Temperatura, oC
v/v Relação volume/volume
Xo Concentração inicial de células, g/L
w/v Massa por volume
YP/S
Fator de conversão em produto, em g.g-1
CAPÍTULO 1: Apresentação do tema de tese
Danielle da Silveira dos Santos
1
_____________________CAPÍTULO 1
APRESENTAÇÃO DO TEMA DE TESE
1.1. INTRODUÇÃO
As matérias-primas de origem lignocelulósica contêm de 20% a 60% de
celulose, que pode ser totalmente convertida à glicose por ação enzimática,
após etapa de pré-tratamento para desorganização do complexo
lignocelulósico. Por sua vez, a glicose caracteriza-se por ser um
monossacarídeo utilizado pela maioria dos microrganismos, fazendo desta
molécula um importante bloco de construção para a obtenção de uma imensa
gama de substâncias de interesse comercial, abrangendo desde combustíveis
até polímeros (KNAUF & MONIRUZZAMAN, 2004). O bagaço de cana-de-
açúcar, resíduo gerado pelos processos de produção de etanol, é considerado
uma matéria-prima lignocelulósica por excelência, apesar de ser utilizado para
a geração de energia em unidades de produção, ainda assim existem enormes
excedentes. Neste contexto, a Companhia Nacional de Abastecimento estima
que a produção de cana-de-açúcar deva crescer 6,5% na safra de 2012/2013 e
atingir 596,63 milhões de toneladas, resultando em cerca de 180 milhões de
toneladas de bagaço gerado (CONAB, 2012).
CAPÍTULO 1: Apresentação do tema de tese
Danielle da Silveira dos Santos
2
A hidrólise completa das frações polissacarídicas dos materiais de
composição lignocelulósica busca o aproveitamento integral dos resíduos
agroindustriais, potencializando o rendimento de produto em relação à matéria-
prima. Como exemplo, pode-se citar que no contexto brasileiro, onde o etanol é
produzido utilizando-se apenas uma fração da matéria-prima (caldo de cana-
de-açúcar), tem-se os resíduos (bagaço excedente e palha) de composição
lignocelulósica, que são passíveis de processos hidrolíticos, disponibilizando
açúcares que podem ser fermentados a etanol. Adicionalmente, este tema vem
hoje acompanhado do conceito de “Biorrefinaria”, que são semelhantes a
refinarias de petróleo, em concepção, entretanto utilizam material biológico em
oposição às fontes fósseis, para a produção de combustíveis para transporte,
substâncias químicas e energia. As Biorrefinarias industriais têm sido
identificadas como as rotas mais promissoras para a criação de um novo
segmento industrial com base nas matérias-primas renováveis. A realidade
nacional se encaixa perfeitamente neste conceito, graças à diversidade de
recursos naturais aqui existentes e a vocação do país para estes
desenvolvimentos.
A produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica lança mão de
pré-tratamentos químicos/enzimáticos para a hidrólise da celulose e da
hemicelulose, fornecendo carboidratos (hexoses e pentoses), que
posteriormente podem ser convertidos a etanol por microrganismos
fermentadores. Dentre os pré-tratamentos, que visam desorganizar o complexo
lignocelulósico, o pré-tratamento ácido tem se mostrado uma alternativa
interessante, pois além de desestruturar o complexo, provoca a hidrólise da
hemicelulose, o que resulta em uma fração líquida contendo, no caso do
bagaço de cana, majoritariamente a xilose. Após o pré-tratamento, o líquido
contendo o hidrolisado hemicelulósico é separado de um resíduo sólido,
composto fundamentalmente de celulose e lignina, denominado de celulignina.
A neutralização do pH, seguida de uma etapa de deslignificação do resíduo
sólido gerado é necessária quando se vislumbra a hidrólise enzimática, a fim
de se aumentar a acessibilidade da celulose ao ataque catalítico.
CAPÍTULO 1: Apresentação do tema de tese
Danielle da Silveira dos Santos
3
A hidrólise enzimática da celulose ocorre em condições brandas de
pressão, temperatura e pH. Sua alta especificidade elimina a ocorrência de
furfurais e derivados da lignina, que seriam seguramente produzidos caso a
opção fosse a hidrólise ácida da celulose, obstaculizando o processo
fermentativo subsequente. O consórcio enzimático utilizado na hidrólise da
celulose é denominado de celulases, composto por diferentes atividades em
função da especificidade pelo substrato. Assim, as celulases são divididas em
três grupos: endoglucanases, que clivam ligações internas em regiões
amorfas da fibra celulósica; exoglucanases, que atuam na região externa da
celulose cristalina; e ß-glucosidases, que hidrolisam oligossacarídeos solúveis
a glicose (LYND et al., 2002; HENRISSAT, 1991). Ressalta-se que estas
enzimas são conhecidas por serem fortemente inibidas pelos seus produtos de
hidrólise (glicose e celobiose). Desta forma, as pesquisas em etanol de
segunda geração têm sido orientadas para o processo SSF, que combina em
uma só etapa a hidrólise enzimática e a fermentação alcoólica da glicose,
oriunda da hidrólise da celulose (PEREIRA JR., 2008).
Os processos de sacarificação e fermentação alcoólica simultâneas de
resíduos agrícolas são reconhecidos por propiciarem o aproveitamento de
substratos disponíveis e de baixo custo, motivo pelo qual vêm sendo
empregados na obtenção de etanol de segunda geração e produtos de maior
valor agregado. Esforços têm sido envidados no sentido de se aumentar os
rendimentos e produtividades desses processos (McMILLAN et al., 1999).
A espécie bacteriana Zymomonas mobilis, existente em fontes naturais
como frutas, ou contaminantes “benéficos” de fermentação alcoólica industrial,
é capaz de produzir etanol com muita eficiência, fermentando açúcares pela via
de Entner-Doudoroff. Nesta via, a glicose é convertida à duas moléculas de
etanol e uma de ATP, ao contrário da via glicolítica clássica, que gera duas
moléculas de ATP para cada mol de glicose, produzindo duas moléculas de
etanol. Esta espécie é classificada como gram-negativa, utiliza sacarose,
glicose e frutose como fonte de carbono e energia, produzindo quantidades
equimolares de etanol e CO2 (SWINGS & DE LEY, 1977). Pode fermentar 1
mol de glicose em cerca de 1,9 moles de etanol; 1,8 moles de CO2 e pequenas
CAPÍTULO 1: Apresentação do tema de tese
Danielle da Silveira dos Santos
4
quantidades de outros subprodutos como lactato, acetaldeído, ácido acético e
outros. Este microrganismo utiliza mínima fração de açúcar como fonte de
carbono, sendo aproximadamente 98% destinados para a fermentação e
apenas 2% para o crescimento. Por isso é muito utilizado na fabricação de
bebidas, leite enriquecido com açúcares fermentáveis e em processos de
industrialização de bebidas tradicionais como Pulque (LIEGH, 1985). Devido ao
seu alto potencial fermentativo, Zymomonas mobilis tem sido objeto de
inúmeras pesquisas, as quais resultam em uma produção de etanol
comparável ou até mesmo superior a obtida por leveduras (KANNAN;
SANGILIYANDI; GUNASEKARAN, 1998; DOELLE et al., 1993; YANASE et al.,
1992).
A busca de microrganismos fermentadores de xilose, açúcar mais
abundante proveniente da fração hemicelulósica, é um dos maiores desafios da
Biotecnologia moderna; uma vez que se faz necessária a eficiente e integral
conversão dos carboidratos potenciais oriundos de materiais lignocelulósicos.
No entanto, uma limitação ao potencial de Z. mobilis para a produção industrial
de etanol é a sua capacidade de utilizar apenas a glicose, frutose ou sacarose
como fonte de energia (YANASE et al., 2005). Desta forma, a engenharia
genética e metabólica aplicada em Z. mobilis apresenta-se como a melhor e
possivelmente a única alternativa para tornar esta bactéria capaz de fermentar
esta pentose, oferecendo uma excelente oportunidade para o processo de
melhoria deste microrganismo.
Com o objetivo de se avançar neste tema e tornar a produção de etanol
de segunda geração mais eficiente recomenda-se o desenvolvimento de
pesquisa e desenvolvimento, particularmente com a incorporação de técnicas
da Biologia Molecular, a fim de dotar as linhagens utilizadas no presente estudo
capazes de fermentar também a xilose em etanol. Com isto, avançar-se-ia para
a concepção SSCF (Simultaneous Saccharification and Cofermentation), na
qual a fermentação de ambos os açúcares ocorreriam em uma mesma etapa.
Este trabalho faz parte de uma das linhas de pesquisas desenvolvidas
nos Laboratórios de Desenvolvimento de Bioprocessos – Escola de Química/
CAPÍTULO 1: Apresentação do tema de tese
Danielle da Silveira dos Santos
5
UFRJ, sob a coordenação do Prof. Dr. Nei Pereira Jr., intitulada Produção de
etanol de segunda geração por Zymomonas mobilis naturalmente ocorrente e
recombinante, empregando biomassa lignocelulósica.
Neste contexto, a presente tese de doutorado está estruturada da
seguinte maneira: após este capítulo introdutório, realizou-se uma revisão
bibliográfica sobre o tema, discorrendo sobre a composição de resíduos
agrícolas e agro-industriais, seus pré-tratamentos, novas concepções
tecnológicas para a produção de etanol de segunda geração, características da
bactéria agente do processo em tela, ressaltando os principais resultados
reportados na literatura (capítulo 2). Na sequência, são apresentados os
objetivos e as justificativas do trabalho (capítulo 3), seguidos das metodologias
experimentais e analíticas estão descritas no capítulo 4. Os resultados estão
apresentados no capítulo 5, onde foram discutidos e comparados com base
nas informações disponibilizadas na literatura especializada. Finalmente, no
capítulo 6 registraram-se as principais conclusões, bem como as
recomendações para trabalhos futuros. Por fim, as referências bibliográficas
são apresentadas no sétimo capítulo, através das quais todas as informações
contidas nesse texto poderão ser localizadas e, obtidos mais detalhes sobre
seus registros.
Com o desenvolvimento da presente pesquisa, foram publicados
(ANEXO) os seguintes trabalhos:
Artigo publicado em periódico indexado:
Santos, D. S.; Camelo, A. C.; Rodrigues, K. C. P.; Carlos, L. C. & Pereira Jr., N. Ethanol production from sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) Process, Applied Biochemistry and Biotechnology. v. 161, n. 1-8, p. 93-105, 2010.
Artigos em preparação:
Santos, D. S.; Peña, J. D Santa Anna, L. M. M. & Pereira Jr., N. Optimization of fermentation conditions for the ethanol production from sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Response Surface Methodology.
Santos, D. S.; Reis, V. C. B.; Borges, E. R.; E. R.; Santa Anna, L. M. M; Torres, F. A. G. & Pereira Jr., N. Preliminary analysis of ethanol production using the simultaneous saccharification for and co-fermentation process by recombinant Zymomonas mobilis CP4.
CAPÍTULO 1: Apresentação do tema de tese
Danielle da Silveira dos Santos
6
Trabalhos em congressos nacionais:
Santos, D. S.; Souza, A. R.; Reis, V. C. B.; Borges, E. R.; Torres, F. A. G. & Pereira Jr, N. (2012) Produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar pelo processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas (SSCF) por Zymomonas mobilis. XIX COBEQ- Congresso Brasileiro de Engenharia Química, Búzios, RJ.
Santos, D. S.; Souza, A. R.; Reis, V. C. B.; Torres, F. A. G. & Pereira Jr, N. (2012) Ethanol production from glucose and xylose using the recombinat Zymomonas mobilis CP4. 4º Congresso Brasileiro de Biotecnologia, Guarujá- SP.
Santos, D.S.; Borges, E. R.; Peña, J. D. & Pereira Jr., N. (2011) Produção de etanol a partir de resíduos da indústria de papel através do processo SSF por Zymomonas mobilis XVIII SINAFERM – Simpósio Nacional de Bioprocessos, Caxias do Sul – RS.
Santos, D.S.; Peña, J. D. & Pereira Jr., N. (2010) Otimização da concentração de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico do bagaço de cana-de-açúcar. XVIII COBEQ- Congresso Brasileiro de Engenharia Química, Foz do Iguaçu, PR
Santos, D.S.; Camelo, A.C.; Schirmer, L.; Santos, D. & Pereira Jr., N. (2009). Análise preliminar da produção de etanol do bagaço de cana-de-açúcar pela bactéria Zymomonas mobilis CP4, empregando o processo SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation). XVII Simpósio Nacional de Bioprocessos – SINAFERM. Natal- RN.
Trabalhos em congressos internacionais:
Santos, D. S.; Borges, E. R.; Souza, A. R.; Carlos, L. C.; Santa Anna, L. M. M. & Pereira Jr, N. (2012). Preliminary analysis of ethanol production using the simultaneous saccharification for and co-fermentation process by recombinant Zymomonas mobilis CP4. 34nd Symposium on Biotechnology for Fuels and
Chemicals.
Santos, D. S.; Borges, E. R.; Souza, A. R.; Carlos, L. C. & Pereira Jr, N. (2011) Control strategy for the ethanol production from sugar cane bagasse by Zymomonas mobilis in a fed-batch Bioreactor. International symposium of alcohol fuels (ISAF).
Santos, D.S.; Peña, J. D.; Carlos, L. C.; Borges, E. R. & Pereira Jr., N. (2011) Ethanol production from waste paper industry using the Simultaneous Saccharification and Fermentation process by Zymomonas mobilis. 33nd Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.
Santos, D.S.; Peña, J. D.; Carlos, L. C.; Gomes, E. B. & Pereira Jr., N. (2010) Optimization of fermentation conditions for the ethanol production from sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Response Surface Methodology. 32nd Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.
Santos, D.S.; Camelo, A.C.; Carlos, L.C. & Pereira Jr., N. (2009). Ethanol production from Sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) Process. 31st Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
7
_____________________CAPÍTULO 2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Neste capítulo são apresentados os diferentes aspectos teóricos
referentes à temática abordada: aspectos gerais da produção de
bicombustíveis; o bagaço de cana como matéria-prima para a produção de
etanol; algumas características relevantes ao processo de aproveitamento do
material lignocelulósico; o microrganismo Zymomonas mobilis sendo
empregado na produção de etanol a partir da glicose e xilose, através de
processos de primeira e de segunda geração; bem como a transformação
genética no que tange à inserção de genes que codificam enzimas
responsáveis pela metabolização da xilose: histórico, atualidades,
problemáticas e perspectivas.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
8
2.1. A ERA DOS BIOCOMBUSTÍVEIS
A matriz energética mundial tem participação total de 80% de fontes de
carbono fóssil, sendo 38,4% de petróleo, 26% de carvão mineral e 20,5% de
gás natural. A biomassa corresponde apenas a 10,1% da matriz energética
mundial (IEA, 2008).
Material oleoso e inflamável, o petróleo é atualmente, a principal fonte de
energia. Estimativas apontam que o consumo de petróleo deve passar dos
atuais 88 milhões de barris para 103 milhões de barris em 2015. Os Estados
Unidos e a China estão entre os principais responsáveis por este aumento,
conforme observado na figura 2.1 (ANP, 2012).
Figura 2.1. Participação dos países no consumo mundial de petróleo no ano de 2011. Fonte: ANP (2012).
Todavia, devido ao esgotamento progressivo do petróleo e às ameaças
ambientais que a exploração de fontes não renováveis ocasiona,
particularmente em termos de emissões de CO2, a busca por outras fontes de
energia torna-se cada vez mais imperiosa. Desta forma, a indústria química do
século XXI será obrigada a passar por uma completa reestruturação,
recorrendo ao uso de recursos renováveis como matéria-prima básica e à
36,6%
2,1%
2,6%
2,6%
2,7%
2,7%
3%
3,3%
3,9%
4%
5%
11,1%
21,4%
0% 10% 20% 30% 40%
Outros
Irã
México
Canadá
Alemanha
Coreia do …
Brasil
Arábia …
Rússia
Índia
Japão
China
Estados …
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
9
Biotecnologia para realização de transformações químicas (BRDTAC, 2002;
NRC, 2000; WILKE, 2000).
2.2. ETANOL: O PRINCIPAL BIOCOMBUSTÍVEL
2.2.1. PANORAMA MUNDIAL
O etanol, também denominado álcool etílico (C2H5OH) é produzido desde os
tempos antigos pela fermentação dos açúcares encontrados em produtos vegetais.
Ainda hoje, grande parte do etanol industrial é obtido pelo mesmo processo, embora
também possa ser produzido a partir de eteno, derivado do petróleo (BASTOS, 2007).
O uso do bioetanol tem suscitado grande interesse devido à alta dos
preços e aos problemas ambientais causados pelos combustíveis fósseis.
Trata-se de um produto renovável com características combustíveis, que
contribui para a redução do efeito estufa e diminui substancialmente a poluição
do ar, minimizando os seus impactos na saúde pública. Atualmente, este é o
principal biocombustível empregado mundialmente, correspondendo por 10%
da energia mundial. No entanto, estimativas indicam que a utilização mundial
do mesmo será de 27% em 2050 (IEA, 2010).
Diversos são os países com interesse em iniciativas que envolvam o uso
do álcool combustível, entre os quais se destacam: Austrália, Guatemala,
União Européia, Índia, Japão, Nova Zelândia, Nicarágua e Tailândia. Os
importadores tradicionais são os EUA, a União Européia, Japão e Coréia
(CASTRO, 2005).
O acordo implementado pela PEA, Policy Energy Act, seguida pela
EISA, Energy Independece and Security Act, almejam que em 2022 obtenha-se
cerca de 36 bilhões de galões de bioetanol por ano (LIMAYEM & RICKE,
2012), bem como a União Européia almeja o uso de 10% de biocombustíveis
de segunda geração no setor de transporte em 2020 (PORZIO et al. 2012).
Neste contexto, estudos de modelagem realizados por Giacomo et al. (2012)
indicaram que uma planta piloto produziria 40.000 t etanol/ ano a partir de
240.000 t biomassa/ ano.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
10
O Brasil e os Estados Unidos produzem o etanol a partir de cana-de-
açúcar e milho, respectivamente, sendo os maiores produtores mundiais e
juntos respondem por 89% da produção global. De acordo com a Associação
de Combustíveis Renováveis, a produção de etanol foi de 10,9 e 12,82 bilhões
de galões nos anos de 2009 e 2010, respectivamente (LIMAYEM & RICKE,
2012), representando 55% da produção mundial. Adicionalmente, a figura 2.2
compara a demanda de etanol nos EUA e no Brasil, indicando que em
dezembro de 2011, os países consumiram cerca de 44,5 e 19,1 milhões de m3
deste álcool, respectivamente.
Figura 2.2. Evolução do consumo de etanol no Brasil e EUA.
Fonte: MME (2012).
2.2.2. PANORAMA NACIONAL
A substituição da gasolina pelo etanol no Brasil começou em 1975,
quando o governo lançou o Programa do Álcool, denominado de PROALCOOL.
Atualmente, o Brasil tem sido líder no uso de combustíveis renováveis,
possuindo 851 milhões de hectares de área total, dos quais cerca de 8 milhões
são utilizadas para plantações de cana-de-açúcar (CONAB, 2011; CARVALHO,
2006).
No Brasil, 44,1% da energia fornecida são de origem renovável, uma das
maiores proporções mundiais, contrastando significativamente com a média
mundial, de 13,3%, e mais ainda com a média dos países que compõem a
Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Econômicos (OCDE), em
sua grande maioria países desenvolvidos - de apenas 8% (EPE, 2012).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
11
A produção nacional em 2010 foi de 27,9 bilhões de litros de etanol, um
grande aumento em relação ao volume de 2002/2003 (12,5 bilhões de litros),
antes da introdução dos veículos flex-fuel. O número de licenciamento de
veículos leves em janeiro de 2012 foi de 252,6 mil, apresentando um
crescimento de 9,89% em relação a janeiro de 2011. Desse total, os carros
flex-fuel representaram 83,7%. Em janeiro de 2012, o setor automotivo
alcançou a marca de 15,60 milhões de veículos bicombustíveis licenciados
desde 2003 e a sua participação estimada na frota total de veículos leves foi de
48% (CENBIO, 2011; MMA, 2012).
A tabela 2.1 aponta os avanços na produção de etanol para os próximos
anos, indicando que no período de 2020/2021 serão produzidos 65,3 milhões
de toneladas de etanol, sendo 49,6 milhões de toneladas voltados para o
consumo interno e 15,7 milhões de toneladas à exportação (ÚNICA, COGEN,
2009)
Tabela 2.1. Perspectivas da produção de etanol
2008/2009 2015/2016 2020/2021
Produção de cana de açúcar (milhões de toneladas)
562 829 1.038
Etanol (bilhões de litros)
27,0 46,9 65,3
Consumo interno 22,0 34,6 49,6
Excedente para exportação 4,8 12,3 15,7
Fonte: UNICA, COGEN (2009).
O fato de o Brasil ser o maior país tropical do mundo é um diferencial
positivo para a produção de energia de biomassa. Portanto, considera-se que a
grande quantidade de bagaço de cana-de-açúcar gerado pelos processos de
produção de etanol venha a se tornar matéria-prima para outros processos
produtivos, incluindo a produção de mais etanol através de tecnologias
portadoras de futuro, gerando emprego e desenvolvimento. Este é um cenário
tão promissor que para cada 10 milhões de toneladas de biomassa seca é
possível produzir 600 milhões de galões de etanol, considerando apenas o seu
componente celulósico (PEREIRA, 2008).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
12
2.3. CANA-DE-AÇÚCAR: A MATÉRIA-PRIMA BRASILEIRA PARA PRODUÇÃO DE ETANOL
A cana-de-açúcar (Figura 2.3) é uma gramínea, cujo potencial, variado e
complexo, ainda pode ser muito explorado. Tem origem asiática e pertence a
uma das mais importantes e maiores famílias de angiospermas, a Poaceae.
Das seis espécies mais conhecidas, duas são consideradas silvestres
(Saccharum robustum Brandes & Jewiest e Saccharum spontaneum L.) e
quatro cultivadas (Saccharum officinarum L., Saccharum sinense Roxb.,
Saccharum edule Hassk e Saccharum barberi Jewiest.) (DANIELS & ROACH,
1987).
Figura 2.3. Cana-de-açúcar. Fonte: NUNES (2008).
São herbáceas, perenes, caule do tipo colmo cheio, com nós (de onde
saem gemas) e entrenós, epiderme característica, raiz fasciculada e flores
monóclinas (JOLY, 2002). As folhas da cana-de-açúcar são alternas ou
opostas, possuem nervuras paralelinérvias e bainhas largas, são lineares e
podem chegar a 140 centímetros de comprimento. Já o fruto é bem pequeno,
do tipo cariopse. Dentre seus constituintes químicos estão o ácido hidrociânico,
o ácido ascórbico, sais minerais (sobretudo de cálcio e de ferro), fibras e
sacarose.
O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, seguido da
Índia, China, Tailândia e Paquistão. No Brasil, a cana-de-açúcar utilizada,
principalmente na produção de álcool (anidro e hidratado) e açúcar, é uma das
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
13
culturas agrícolas mais importantes em países tropicais, gerando diversos
recursos e empregos diretos, e contribuindo, dessa forma, para o
desenvolvimento com melhores fontes de renda. O interior paulista, principal
produtor mundial de cana-de-açúcar, é uma das regiões mais desenvolvidas do
Brasil, possuindo elevados índices de desenvolvimento urbano e renda per
capita muito acima da média nacional (BNDES, 2006).
2.3.1. PRODUÇÃO DE AÇÚCAR E ETANOL DO CALDO DE CANA
Para a produção de açúcar, a cana é prensada, submetida a uma etapa
de sulfitação, seguida de clarificação e, por fim, cristalização, onde é obtido o
produto para ser comercializado (NANDY et al., 2002). Diversos tipos de
açúcares podem ser fabricados, e posteriormente, é gerado o melaço, um
xarope altamente viscoso que contém cerca de 35% (p/p) de sacarose e 15%
(p/p) de açúcares invertidos (glicose e frutose).
Para a produção de etanol, o caldo da cana ou o melaço diluído são
utilizados como meio de fermentação, resultando em uma solução com um teor
alcoólico de 6-8% (v/v) (COSTA et al., 2001; ROGERS, 2005). Após a
separação das células, da destilação do meio fermentado e da retificação do
destilado, obtém-se o produto com 94-95% (v/v) de etanol (RYAN &
JOHNSON, 2001).
Como exemplo de uma usina que produz tanto açúcar como álcool
(usina de açúcar com destilaria anexa), para cada tonelada de cana
processada podem ser produzidos 100 a 150 kg de açúcar e 70 a 90 L de
etanol, gerando 300 kg de bagaço, 980 L de vinhoto, dentre outros resíduos
(NANDY et al., 2002).
O vinhoto, resíduo da destilação fracionada do caldo de cana-de-açúcar
fermentado para a obtenção do etanol, tem sido aproveitado como fertilizante
ou na produção de biogás. A torta de filtro, resíduo composto da mistura de
bagaço moído e lodo da decantação, proveniente do processo de clarificação
do açúcar, é um composto orgânico (85% da sua composição) rico em cálcio,
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
14
nitrogênio e potássio, com composições variáveis dependendo da variedade da
cana e da sua maturação, podendo ser utilizado como fertilizante ou na
composição de ceras.
A biomassa microbiana, gerada com o esgotamento do reciclo celular,
vem sendo utilizada na indústria alimentícia. É possível utilizar a levedura seca
para a produção de ração, uma vez que esse produto possui 40% de proteína.
Há estudos para a utilização da levedura seca também na alimentação
humana. Há oportunidades para a comercialização de gás carbônico (CO2),
principalmente para as fábricas de refrigerantes e indústria química (ROGERS,
2005).
O potencial energético da cana-de-açúcar é desmembrado em seus três
principais contribuintes: para cada tonelada de cana, 1.700 MJ vêm do etanol
produzido, enquanto que 2.100 e 2.150 MJ são referentes ao bagaço e à palha,
respectivamente (MOREIRA, 2000).
A palha (Figura 2.4) não é considerada um resíduo do processamento
industrial. Este resíduo agrícola ainda é queimado no campo de colheita.
(BNDES, 2006), embora esta prática, por força da lei nº 11.241, venha sendo
proibida no estado de São Paulo. O bagaço, obtido após a prensagem dos
colmos de cana, destaca-se por ser gerado em grandes quantidades e possuir
enormes potenciais energéticos e biotecnológicos.
Figura 2.4. Excedente de Palha de cana-de-açúcar. Fonte: PEREIRA (2006).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
15
2.3.2. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
O bagaço da cana de açúcar (Figura 2.5) é um resíduo lignocelulósico e
um dos subprodutos da indústria da cana.
Figura 2.5. Excedente de Bagaço de cana-de-açúcar. Fonte: PEREIRA (2006).
A Companhia Nacional de Abastecimento estima que a produção de
cana-de-açúcar deva crescer 6,5% na safra 2012/13 e atingir 596,63 milhões
de toneladas, gerando cerca de 180 milhões de toneladas de bagaço de cana
(CONAB, 2012). Atualmente, 90% do bagaço gerado na usina é consumido
para produção de energia por meio da co-geração, tornando a usina auto-
sustentável energeticamente.
Este material, constituído por celulose, hemicelulose e lignina, compõe
em média, 28% do peso da cana de açúcar. Sua composição elementar é de
44,6% de carbono, 5,8% de hidrogênio, 44,5% de oxigênio, 0,6% de nitrogênio,
0,1% de enxofre e 4,4% de outros elementos (SIMÕES, 2005). Neste contexto,
a tabela 2.2 apresenta a composição química do bagaço de cana em base
úmida, indicando que há mais de 20% de hexoses e 10% de pentoses.
A hemicelulose e a celulose apresentam-se como uma das principais
frações estruturais do bagaço de cana, representando uma fonte potencial de
xilose e glicose, respectivamente; porém, a obtenção desses açúcares requer a
aplicação de técnicas que permitam a sua extração seletiva. No caso da
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
16
extração de xilose, são utilizadas diferentes metodologias de solubilização e
hidrólise, dentre as quais o pré-tratamento ácido é normalmente empregado
(BETANCUR & PEREIRA JR, 2010; FUJITA et al., 2004).
Tabela 2.2. Composição química média do bagaço de cana
Composição química (%)
Glicose 19,50 Xilose 10,50
Arabinose 1,50 Galactose 0,55
Lignina 9,91
Organosolúveis 2,70
Outros AR 1,85
Cinzas 1,6
Umidade 50,00
Hexoses Totais 20,04
Pentoses Totais 12,00
Fonte: SOARES (2011). Onde: AR: açúcares redutores.
Neste contexto, o bagaço de cana-de-açúcar apresenta-se como um dos
materiais lignocelulósicos com maior potencial para a obtenção de diversos
produtos de interesse comercial. No que tange à produção de etanol, são
realizadas reações químicas e/ou biológicas, aumentando-se a produtividade
das indústrias. Estimativas estabelecem que a produção de etanol no Brasil
possa ser duplicada, sem a necessidade de aumentar áreas de cultivo de cana-
de-açúcar (PEREIRA, 2008).
2.4. MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
2.4.1. MATÉRIA-PRIMA PARA A PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS
Os materiais lignocelulósicos constituem-se em matéria-prima para a
produção de etanol, bem como de outros produtos utilizados em diversos
segmentos industriais, devido ao seu caráter renovável, abundante e de seu
baixo custo (BINOD et al., 2010; YAMASHITA et al., 2008; DEMIRBAS, 2003).
Devido à grande disponibilidade de resíduos agrícolas foi estimado que
491 bilhões de litros deste biocombustível possam ser gerados a partir de
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
17
biomassa lignocelulósica residual, ampliando em até 16 vezes a sua produção
anual (BINOD et al., 2010; SARKAR et al., 2012). Só nos Estados Unidos, a
biomassa residual gerada é estimada em torno de 1,4 bilhões de toneladas de
matéria seca por ano, 30% originadas de florestas. Neste contexto, tais
biomassas podem suprir em grande escala a produção deste combustível,
utilizando diferentes resíduos agro-industriais (CARDONA & SANCHEZ, 2007;
HU et al., 2008; CARDONA et al., 2009).
Atualmente, os resíduos derivados de materiais lignocelulósicos mais
promissores para serem empregados em bioprocessos são o bagaço de cana,
palha de arroz, de milho e de trigo, provenientes da América do Sul, Ásia,
Estados Unidos e Europa, respectivamente (KADAM & MCMILLAN, 2003;
CHENG et al., 2008). Segundo Sarkar et al. (2012), a Ásia gera cerca de 667,6
milhões de toneladas de palha de arroz e 145,2 milhões de toneladas de palha
de trigo, enquanto que a América produz 140,86 milhões de toneladas de palha
de milho.
Embora alguns destes resíduos sejam utilizados como ração animal,
combustíveis domésticos ou mesmo para co-geração de energia, grande parte
ainda é inutilizada, constituindo-se em excedentes. Adicionalmente, muitos
países da Europa Ocidental proíbem a queima no campo, menos de 1% de
palha de milho é recolhida para o processamento industrial, bem como cerca
de 5% é utilizado como alimento e forragem para animais. No entanto, nos
Estados Unidos, mais de 90% de palha de milho é deixada nos campos
(BANERJEE, 2010).
Adicionalmente, a indústria de celulose também gera resíduos
industriais, contendo alto teor de fibras de celulose (cerca de 80%) com
potencial suficiente para se tornar também matéria-prima. Isto se deve,
principalmente, à presença destes materiais em abundância e a não
necessidade das etapas de pré-tratamento para muitos deles, uma vez que no
processo é realizada a deslignificação das polpas, que permite a remoção de
grande parte da lignina para obtenção da celulose (SILVA, et al., 2009).
Neste contexto, segundo a associação brasileira de celulose e papel, nos
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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18
últimos 10 anos, a produção mundial de papel cresceu 35%; sendo que o Brasil
somou 8,2 milhões de toneladas de papel em 2004 e ocupou a posição de
sétimo maior fabricante mundial de celulose, com cerca de 9,4 milhões de
toneladas (BRACELPA, 2006).
2.4.2. ESTRUTURA CELULAR
A estrutura microscópica da maioria das células vegetais é formada por
uma parede celular rígida composta basicamente de polissacarídeos (cerca de
70% da massa) com propriedades físico-químicas tais como plasticidade,
elasticidade, resistência à tensão e decomposição por microrganismos.
Conforme ilustrado na figura 2.6, a parede celular dos materiais
lignocelulósicos é formada por arranjos/concêntricos divididos em camadas
com diferente composição química e orientação dos elementos estruturais
(FENGEL & WEGENER, 1991).
Figura 2.6. Diagrama da estrutura das camadas da parede de uma fibra. Onde: PP: Parede Primária; Subdividida em 3 camadas: S1, S2, S3; PS:Parede
Secundária, LM: Lamela Média. Fonte: BRUM (2007).
A parede primária é a camada depositada durante o aparecimento da
célula, onde as fibrilas de celuloses formam arranjos com aspectos de redes.
Além da celulose, polioses (hemiceluloses), pectinas e proteínas também estão
presentes na parede primária, envolvidas pela lignina. A parede primária é fina
e elástica nas células vegetais mais jovens. Já nas células adultas, esta parede
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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19
sofre um espessamento, que pode formar internamente à parede primária, uma
parede secundária, composta de lignina, hemicelulose e suberina. A formação
da parede secundária não é uniforme, o que pode ser constatado por locais
onde ocorre interrupção da sua formação, as chamadas pontuações
(SJÖSTRÖM, 1981; FENGEL & WEGENER, 1991).
A celulose, a pectina e as glicoproteínas, formam a parede celular das
células vegetais e contribuem em sua textura rígida. Quando analisada mais
detalhadamente nota-se que a parede celular é formada por uma trama de
fibrilas de celulose. Existem algumas camadas distintas que formam a parede
celular: a camada mais interna que delimita o lúmem celular, denominada de
lamela terciária; a camada intermediária formada pela parede secundária, que
pode ser formada por quatro lamelas, lamela transicional, parede primária,
lamela média, camada externa, em contato com a parede primária. A lamela
média é uma camada fina (0,2 a 1 μm) que une as células entre si para formar
o tecido e possui grandes quantidades de lignina (SJÖSTRÖM, 1981; FENGEL
& WEGENER, 1991).
Cada uma das fibrilas que compõem a trama de celulose é formada pela
agregação de mais ou menos 250 microfibrilas, as quais são constituídas por
pequenos números de feixes de molécula de celulose (fibrilas elementares),
sendo que cada molécula de celulose é formada por mais de mil resíduos de
glicose, os quais se interligam por pontes de oxigênio (FENGEL & WEGENER,
1991).
Em alguns pontos das fibrilas elementares as moléculas de celulose
estão dispostas de maneira desordenada e em outros pontos, este
polissacarídeo se dispõe ordenadamente, formando as micelas de estrutura
cristalina. Entre as fibrilas, microfibrilas e fibrilas elementares ocorrem outros
componentes da parede celular como a hemicelulose, lignina, etc. Quando não
há a presença destas outras substâncias, ocorrem microcapilares que
transportam água e outros solutos, o que confere à parede celular uma grande
permeabilidade à água (SJÖSTRÖM, 1981).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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20
2.4.3. CONSTITUIÇÃO QUÍMICA
Como se pode observar na figura 2.7, os materiais lignocelulósicos são
constituídos basicamente pelos compostos estruturais ou celulares. Além da
celulose, lignina e hemicelulose, outros constituintes menores também se
mostram presentes. Estes incluem compostos orgânicos também chamados de
extrativos (ésteres, álcoois, esteróides e outros) e inorgânicos (sulfatos,
oxalatos, carbonatos e silicatos de cálcio, potássio e magnésio,
principalmente). As proporções entre os constituintes dependem do tipo de
material (LEWIN & GOLDSTEIN, 1991).
Figura 2.7. Principais componentes de materiais lignocelulósicos. Fonte: RITTER (2008).
A tabela 2.3 indica a composição química básica de alguns dos
principais resíduos lignocelulósicos. Conforme observado, a massa seca
vegetal é composta por cerca de 70% de polissacarídeos, sendo que 40-60%
de celulose, 20-40% de hemicelulose e 15-25% de lignina (BALAT et al., 2008).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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21
Tabela 2.3. Composição química dos resíduos agrícolas (%)
Resíduos Celulose Hemicelulose Lignina Proteína Cinzas
Palha de arroz 32-47 19-27 5-24 - 12,4
Palha de trigo 35-47 20-30 8-15 3,1 10,1
Palha de milho 42,6 21,6 8,2 5,1 4,3
Bagaço de
cana-de-açúcar 33-36 28-30 18,4 3 2,4
Fonte: SARKAR et al. (2012)
A hemicelulose e celulose são estruturas duras e fibrosas, entremeadas
por uma macromolécula composta por álcoois aromáticos, a lignina, que se
encontra unida por ligações covalentes e de hidrogênio (LEE, 1997).
2.4.2.1. Celulose
A celulose (C6H1005)n, principal componente da parede celular da fibra
vegetal, é um polímero de cadeia longa composto de um só monômero
(glicose) e por isso classificado como homopolissacarídeo. É a matéria
orgânica mais abundante sobre a Terra, consistindo aproximadamente em 50%
de toda a biomassa e uma produção anual de cerca de 100 bilhões de
toneladas (YANG et al., 2007).
Estudos obtidos na área de espectroscopia no infravermelho,
ressonância magnética nuclear e difratometria de raios-X permitiram constatar
que a molécula de celulose tem uma forte tendência a formar ligações de
hidrogênio (LAKABI, 1990). Sua estrutura forma-se pela união de moléculas de
β-D-glicose através de ligações β-1,4-glicosídicas carbono-carbono, nas quais
se estabelecem inúmeras ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxilas das
distintas cadeias juntapostas de glicose, fazendo-as impenetráveis a água e,
portanto, insolúveis, originando fibras compactas que constituem a parede
celular dos vegetais, dando origem a um polímero linear (LEMOS, 2001).
O comprimento das cadeias de celulose pode variar de 1.000 a 15.000
unidades de glicose, dependendo da origem e do possível grau de degradação
durante o processo de isolamento (FENGEL & WEGENER, 1991). Seu
tamanho é normalmente expresso em termos do grau de polimerização, ou
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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seja, o número de unidades de glicose anidra presente em cada fibra. No
entanto, a análise estrutural da cadeia polimérica informa que sua unidade de
repetição é a celobiose, conforme mostrado na figura 2.8 (RAMOS, 2003). Isto
se deve às ligações do tipo β, pelas quais os monômeros de glicose são
unidos, fazendo com que moléculas adjacentes encontrem-se arranjadas com
uma rotação de 180º entre si (STRYER, 1996).
Este tipo de ligação permite que haja ligações não só intramoleculares,
mas também intermoleculares, do tipo ligações de hidrogênio e forças de van
der Waals, decorrendo na formação de fitas planas de anéis de glicopiranose
simetricamente dispostas que compõem uma estrutura altamente cristalina,
estável e com uma alta força de tensão (ZHANG & LYND, 2004).
Figura 2.8. Estrutura simplificada da cadeia linear da celulose, formada por
várias unidades consecutivas de celobiose. Fonte: TÍMÁR-BALÁZSY & EASTOP (1998).
Conforme observado na figura 2.9, o principal tipo de ligações de
hidrogênio intermoleculares (entre moléculas de glicoses adjacentes) ocorre
entre o C6-OH e o oxigênio do C3, ao longo da cadeia de celulose (LAI, 1996),
fazendo com que as moléculas se alinhem, formando as rnicrofibrilas, as quais
se ordenam para formar as paredes celulares (FENGEL & WEGENER, 1991).
Como resultado das ligações de hidrogênio, as moléculas de celulose
podem formar regiões cristalinas e amorfas (BRISTOW & KOLSETH, 1986;
MITRA & MUKHELJEE, 1980). As regiões cristalinas apresentam um arranjo
ordenado das cadeias moleculares, que resulta de espaçamentos
interatômicos, os quais se repetem tridimensionalmente e difratam raios-X
(SJÖSTRÖM, 1981; LAKABI, 1990). Entre essas regiões se encontram as
regiões amorfas ou desordenadas, em que as cadeias podem ser deformadas
e assumir formas encurvadas. No entanto, supõe-se que não existam limites
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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bem definidos entre essas regiões e, sim, transições contínuas entre elas,
podendo existir nas regiões desordenadas cadeias mais ou menos paralelas
até completamente aleatórias (KOGA, 1988).
Figura 2.9. Representação das ligações de hidrogênio na estrutura da celulose. Fonte: GARRET & GRISHAM (1999).
2.4.2.2. Hemicelulose
Outro componente essencial na parede celular das plantas são as
hemiiceluloses. Estas macromoléculas estão intimamente ligadas à celulose,
definindo propriedades à parede celular e desempenhando funções de
regulação do crescimento e desenvolvimento das plantas (FENGEL &
WEGENER, 1991; LIMA & RODRIGUES, 2007). As hemiceluloses são
polissacarídeos formados por diferentes unidades de açúcares pertencentes
aos grupos das pentoses, hexoses, ácidos hexourônicos e desoxiexoses.
Estes polissacarídeos consistem, principalmente, de cadeias poliméricas
ramificadas com grau de polimerização de 100 a 200 unidades de açúcares,
entre os quais incluem, como principais componentes: glicose, galactose,
manose, xilose, arabinose e ácido glucurônico (Figura 2.10), que podem ser
lineares ou ramificados, além de serem amorfos e possuírem massa molecular
relativamente baixa (LIMA & RODRIGUES, 2007).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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24
As hemiceluloses encontram-se intercaladas às microfibrilas de celulose,
promovendo a elasticidade e impedindo que elas se toquem (RAMOS, 2003).
Estas macromoléculas são solúveis em água e facilmente solubilizados em
solução alcalinas. Apresentam-se divididas em xilanas, mananas, galactanas e
galacturonanas e suas unidades monoméricas são unidas por ligações do tipo
1,3; 1,4 e 1,6 (SZENGYEL, 2000). Destas moléculas, as presentes em maiores
proporções são as xilanas (BISSOON et al., 2002), que consistem em
moléculas de xilose unidas por ligação β-1,4 (DAMASO et al., 2004).
Diferentemente da celulose, as hemiceluloses são constituídas por
vários tipos de unidades de açúcares. Estas macromoléculas são ramificadas e
apresentam cadeias curtas, além de serem solúveis em álcalis fortes e são
fundamentalmente amorfas, sendo mais suscetíveis a pré-tratamentos
químicos (SHLESER, 1994).
Figura 2.10. Monossacarídeos constituintes das hemiceluloses. Onde: (1) D-Glucose; (2) D-Galactose; (3) L-Arabinose; (4) D-Xilose; (5) D-Manose; (6) 4-O-Metil-D-Glucurônico; (7); L-Ramnose. Fonte: SJÖSTRÖM (1999).
2.4.2.3. Lignina
Uma das substâncias orgânicas macromoleculares naturais mais
abundantes da Terra é a lignina, que ocupa cerca de 30% dos carbonos da
biosfera (FENGEL & WEGENER, 1991). Sua estrutura é bastante heterogênea
e consiste em uma rede de anéis aromáticos unidos, principalmente por
ligações alquil-aril-éter, formando um arranjo amorfo com grandes quantidades
de ligações cruzadas entre os anéis aromáticos (ARGYROPOULOS &
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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25
MENACHEM, 1997) (Figura 2.11).
As ligninas são substâncias de estruturas complexas, macromoléculas
tridimensionais fenilpropanóidicas formadas pela polimerização dos álcoois p-
cumarílico, coniferílico e sinapílico (BRISTOW & KOLSEÚI, 1986; FENGEL &
WEGENER, 1991). A proporção destes três compostos resulta em diferentes
tipos de ligninas: as formadas pela combinação dos álcoois coniferílico e p-
cumarílico apresentam estruturas mais complexas do que as formadas pelos
álcoois coniferílico e sinapílico (FENGEL & WEGENER, 1991; ABREU &
OERTEL, 1999). Sabe-se que os polímeros derivados do álcool sinapílico são
os principais responsáveis pela ligação com a fração hemicelulósica contida
nessa biomassa (SUN et al., 2004).
Figura 2.11. Estrutura simplificada da lignina. Fonte: FENGEL & WEGNER (1991).
Durante o desenvolvimento das células, a lignina é incorporada como o
último componente na parede, interpenetrando as fibrilas e, assim, conferindo
rigidez, impermeabilidade e resistência a ataques microbiológicos. Estas
ligações são, em parte, responsáveis pela forte e rígida natureza da molécula
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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26
da celulose na estrutura da fibra vegetal (FENGEL & WEGENER, 1991;
MESHITSUKA & LSOGAI, 1996). Nas partes da madeira, age como agente
permanente de ligação entre as células, gerando uma estrutura resistente ao
impacto, compressão e dobra.
A lignina, por ser altamente energética, pode ser utilizada para produzir calor e
eletricidade necessários ao processo de produção de etanol. Além disso, pode ser
utilizada para formação de diversos produtos, incluindo compostos fenólicos,
aromáticos, ácidos dibásicos e metil, formado pela reação da fração fenólica com
álcoois (WYMAN, 1994).
2.5. PRÉ-TRATAMENTO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS
O pré-tratamento tem por objetivo aumentar a área de superfície da
biomassa, aumentar a porosidade dos materiais e reduzir a cristalinidade da
celulose (Figura 2.12).
Figura 2.12. Efeito do pré-tratamento químico em materiais lignocelulósicos. Fonte: HECTOR (2009).
O pré-tratamento de biomassa Iignocelulósica é uma etapa que aumenta
significativamente a eficiência da hidrólise enzimática da celulose para
posterior fermentação, realizada por leveduras ou bactérias produtoras de
etanol (McMILLAN, 1994). Enquanto o pré-tratamento ácido promove a
hidrólise da fração hemicelulósica, o alcalino resulta na remoção de parte da
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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27
fração de lignina, expondo as fibras de celulose e tomando a celulose mais
acessível ao ataque enzimático (HAHN-HAGERDAL et aI., 2006).
2.5.1. PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO
Esta técnica é efetiva na solubilização do componente hemicelulósico da
biomassa, provocando desacetilação e despolimerização da fração
hemicelulósica. Combinações entre concentração de ácido, temperatura e
tempo de reação podem gerar grandes quantidades de açúcares provenientes
da fração hemicelulósica (BAUDEL, 2006).
Durante o pré-tratamento ácido, os catalisadores liberam prótons que
clivam as ligações heterocíclicas de éter entre os monômeros das cadeias
macromoleculares da hemicelulose e, no caso de ácidos concentrados, da
celulose (BORGES, 2011). Após clivagem da hemicelulose são liberadas
diversas substâncias, sendo majoritária a presença de xilose, glicose e
arabinose na maioria dos materiais lignocelulósicos. Entre os ácidos utilizados
para este tipo de pré-tratamento, encontram-se: H2SO4, HCl, HF, CH3COOH e
HNO3 (AGUILAR et al., 2002; SUN & CHENG, 2002; CUZENS & MILLER,
1997; RODRÍGUEZ-CHONG et al., 2004).
Além do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica empregando ácidos
utiliza-se também à explosão a vapor, a qual consiste no aquecimento do
material com vapor saturado em temperaturas elevadas. Posteriormente, tal
processo é seguido de uma súbita descompressão do equipamento,
produzindo assim, o "slurry", resultante da fragmentação da biomassa
(BAUDEL, 2006).
A utilização de H2SO4 permite uma elevada reatividade da fibra
celulósica, apresentando cerca de 90% de digestibilidade da mesma ao ataque
enzimático; porém, ao empregar elevadas concentrações deste composto, o
processo demanda complexas configurações de equipamentos, necessitando
de elevado consumo de água e energia (BAUDEL, 2006). Após esta etapa é
necessária a neutralização do pH (MARTÍN et al., 2007).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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28
2.5.2. PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO
O tratamento alcalino, empregado após execução do pré-tratamento
ácido, o qual visa à remoção de hemicelulose, consiste na remoção de Iignina
da biomassa, causando o desnovelamento da estrutura lignocelulósica,
separando as ligações entre lignina e carboidratos, reduzindo o grau de
polimerização, bem como de cristalinidade e aumentando a porosidade das
matérias-primas lignocelulósicas (SUN & CHENG, 2002).
O efeito deste pré-tratamento varia de acordo com as concentrações de
álcalis, tempo reacional, assim como combinações de pH e temperatura em
condições moderadas. Estudos recentes de Stenseng (2001) investigaram o
uso do ultra-som no auxílio da hidrólise, onde o pequeno aumento da eficiência
é explicado pela ação mecânica deste na parede celular, resultando em maior
acessibilidade e consequente extração dos componentes da hemicelulose e
lignina. Visando contornar a formação de compostos inibitórios, Karagos et al.
(2012) e Karimi et al. (2008) empregaram o peróxido alcalino na biomassa
lignocelulósica. Os autores não detectaram concentrações de furfural e HMF,
favorecendo as etapas fermentativas do processo para a obtenção de etanol.
2.5.3. INIBIDORES
Todavia, em consequência das altas temperaturas empregadas nos pré-
tratamentos químicos, os açúcares originados se degradam, provocando a
formação de compostos que podem interferir, posteriormente, no processo de
fermentação e hidrólise do material lignocelulósico. Martin et aI. (2007)
relataram a produção dos seguintes inibidores: ácido acético (formado pela
hidrólise do grupo acetil presente na fração hemicelulósica), aldeídos, álcoois
aromáticos, bem como compostos fenólicos (formados principalmente pela
degradação parcial da Iignina) e furaldeídos, como o furfural e o 5-
hidroximetilfurfural (HMF) (formados pela degradação de pentoses e hexoses);
estes que por sua vez podem dar origem a outros produtos, como os ácidos
fórmico e levulínico, respectivamente (RANATUNGA et al., 1997, JARDINI et
al., 2009).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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O ácido acético é o composto presente nos hidrolisados que apresentou
maior inibição sobre Z. mobilis, seguido do furfural, o qual apresentou efeito
moderado. Adicionalmente, os ácidos orgânicos e os aldeídos resultaram em
maiores toxicidades ao microrganismo do que a presença de derivados da
lignina e alcalóides (RANATUNGA et al., 1997). Desta forma, Baudel et al.
(2006) enfatiza que o pré-tratamento deve ser eficiente em termos de
rendimento e funcionalidade, com redução de insumos químicos e de energia,
visando uma menor geração desses compostos inibitórios.
2.5.4. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
A conversão da celulose à glicose enzimaticamente é catalisada por um
grupo de enzimas denominadas celulases, as quais rompem as ligações
glicosídicas das microfibrilas de celulose, resultando na liberação de
oligossacarídeos, celobiose e glicose. Este processo é de crucial importância
na ciclagem de nutrientes, uma vez que tal polímero representa cerca de 40%
do material de origem vegetal (DILLON, 2004).
Embora existam muitas bactérias celulolíticas, especialmente os
anaeróbios Clostridium thermocellum e Bacteroides cellulosolvens, que
produzem celulases com altas atividades específicas (UI/mg proteína), estes
microrgansimos não produzem altas concentrações de enzima, pois possuem
baixa taxa de crescimento em celulose. Dessa forma, a maioria dos estudos
sobre produção de celulase comercial está centralizada em fungos
filamentosos (DUFF & MURRAY, 1996).
Dentre os fungos que produzem celulases estão as espécies Sclerotium
rolfsii, Phanerochaete chrysosporium e principalmente os pertencentes aos
gêneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum. De todos estes
gêneros, Trichoderma reesei é o mais reportado na literatura, possuindo pelo
menos cinco tipos de endoglucanases (MARTINS, 2005).
A ação sinérgica dos componentes individuais do sistema de celulases
(Figura 2.13), composto por endoglucanases, exoglucanases e β-glucosidase
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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30
(CHAHAL, 1991) tem sido relatada por diversos trabalhos (BÉGUIN &
AUBERT, 1994; BHAT & BHAT, 1997; MANSFIELD & MEDER, 2003; MAEDA
et al., 2011). Basicamente, as endoglucanases atacam as regiões de baixa
cristalinidade da fibra celulósica, criando extremidades livres na cadeia; as
exoglucanases degradam ainda mais a molécula através da liberação de
unidades de celobiose das extremidades livres da cadeia e as β–glucosidases
hidrolisam as moléculas de celobiose, produzindo glicoses (COUGHLAN &
LJUNGDAHL, 1988). Cabe ressaltar que existem outras enzimas auxiliares que
atacam a hemicelulose, como as glucuronidases, acetilesterases, xilanases, β-
xilosidases, galactomannanases e glucomannanases (DUFF & MURRAY,
1996).
Figura 2.13. Atuação sinérgica das celulases. BG: β-Glicosidases, CBH: Celobiohidrolases, EG: Endoglucanases, R: Terminal redutor, NR: Terminal não redutor. Fonte: USDOE (2003).
O acúmulo gradativo dos produtos finais da hidrólise enzimática, como a
celobiose e a glicose, resulta na inibição da atividade das próprias enzimas do
complexo celulásico. Vários métodos têm sido desenvolvidos com o intuito de
contornar essa problemática, incluindo a utilização de elevadas concentrações
enzimáticas, a suplementação de β-glucosidases durante a hidrólise, bem
como a adoção da estratégia de sacarificação e fermentação simultâneas (SUN
& CHENG, 2002).
Dentre os diversos fatores que podem afetar a hidrólise enzimática estão
incluídos: tamanho de partícula, porosidade do material, presença de fibras
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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cristalinas na celulose, assim como presença de Iignina e de hemicelulose, as
quais dificultam o acesso da enzima à celulose, resultando na redução da
eficiência do processo de hidrólise. Neste contexto, a relação sólido:líquido, a
atividade das celulases, as condições de reação (tempo, temperatura e pH), as
quais normalmente são amenas, bem como a composição do meio específico e
o tempo de fermentação também apresentam grande importância no processo
enzimático (SUN & CHENG, 2002; OLIVEIRA & VASCONCELOS, 2006).
De acordo com Baudel (2006), a disponibilidade da glicose oriunda da
celulose, em termos de custo global, rendimento glicosídico e fermentabilidade
do hidrolisado apresenta-se como um obstáculo no que tange à viabilização
econômica da produção do bioetanol proveniente de resíduos lignocelulósicos.
Desta forma, a técnica de reciclo enzimático aumentaria o rendimento de
hidrólise, reduzindo consideravelmente o custo do processo, porém, cabe
ressaltar que a eficiência de hidrólise diminui gradativamente a cada reciclo
(XIN, 1993).
2.6. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis
Cosmopolita, a bactéria Z. mobilis encontra-se em áreas tropicais da
América, Ásia e África. Esta bactéria foi originalmente descoberta em
fermentações com seivas de plantas ricas em açúcar, como a seiva do agave
no México e em vinho de palmáceas. Foi identificada como contaminante em
melaço, em cidras e em cervejas produzidas em países da Europa. Hoje em
dia, produzem-se bebidas alcoólicas de sucos de frutas por fermentação mista
com Zymomonas sp. associada a leveduras (VIIKARI & LINKO, 1986; LIEGH et
al., 1985; O’MULLEN et al., 1991).
2.6.1. BREVE HISTÓRICO
Os primeiros estudos sobre Zymomonas mobilis datam do início do
século XX. Em 1911, esta bactéria foi isolada por Baker e Hillier a partir da
cidra, uma bebida produzida pela fermentação do suco de maçã, que
freqüentemente se deteriorava e apresentava sinais característicos como
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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32
formação de espuma, liberação de gases e aumento da acidez, gerando um
líquido turvo, com depósito no fundo da garrafa (SWINGS & DE LEY, 1977).
Contudo, a descoberta da bactéria é comumente atribuída a Lindner, que
a isolou no México, em 1924, a partir da seiva fermentada do Agave atrovirens,
conhecida como pulque, uma bebida alcoólica de 4 a 6% em etanol, dando à
bactéria o nome de Thermobacterium mobile (CHANG et al., 1981;
MONTENECOURT, 1985; PARKER et al.,1995). Em 1931, Kluyver e
Hoppenbrouwers modificaram o nome da bactéria para Pseudomonas lindneri,
devido a sua semelhança bioquímica com a família Pseudomonadaceae.
Somente em 1936, Kluyver e van Nielr criaram o gênero Zymomonas e
deram o nome de Zymomonas mobilis à bactéria, por existirem maiores
diferenças do que similaridades com essa família (PARKER et al.,1995). Em
1937, Shimwell isolou Zymomonas sp. durante a primeira etapa de
fermentação da cevada, na elaboração da cerveja e lhe deu o nome provisório
de Achromobacter anaerobium.
Na década de 50, esta bactéria chamou a atenção dos bioquímicos por
utilizar uma via metabólica semelhante à utilizada por microrganismos
estritamente aeróbios, como os do gênero Pseudomonas. Em 1950, lhe deram
o nome de Saccharomonas sp. e em seguida, foi denominada como
Zymomonas anaerobia (VIIKARI & KORHOLA, 1986). Em 1956, já havia sido
reportada como: A. anaerobium e T. mobile. Neste período, já era conhecida a
sua capacidade de produzir levana, um polímero de frutose, que possui
diversas utilidades na indústria alimentícia. Nos anos 70, esta bactéria foi
apontada como a mais rápida e eficiente produtora de etanol, empregando
sacarose, glicose ou frutose como únicas fontes de carbono e energia (DOELE
et al., 1993).
No Brasil, a pesquisa com Z. mobilis foi iniciada pelo pesquisador
Gonçalves de Lima em 1952, quando trouxe do México a cepa AG11. Em
1970, este pesquisador isolou as linhagens CP1, CP2, CP3 e CP4 de amostras
de caldo de cana-de-açúcar ligeiramente degradadas. A linhagem conhecida
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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como CP4 foi mundialmente distribuída e tem sido detectada como
contaminante nas indústrias de fermentação alcoólica (ABUD, 2005).
2.6.2. CARACTERÍSTICAS GERAIS
Zymomonas mobilis é uma bactéria Gram-negativa, não patogênica que
engloba apenas uma espécie, dividida em duas subespécies: Zymomonas
mobilis subespécie mobilis e Zymomonas mobilis subespécie pomaceae
(SWINGS & DE LEY, 1977).
Estas bactérias podem ocorrer isoladamente, embora seja mais comum
sua ocorrência aos pares (Figura 2.14). Não possuem cápsulas e não formam
esporos e, em sua grande maioria, não possuem mobilidade (algumas
linhagens perderam a mobilidade, embora cerca de 30% são móveis). Suas
células possuem a forma de bastonetes com 2 a 6 μm de comprimento e de 1 a
1,5 μm de largura, com extremidades arredondadas, possuindo de 1 a 4
flagelos polares. As colônias apresentam coloração branca ou creme,
crescentes em temperaturas em torno de 30°C (FALCÃO DE MORAIS, 1983).
Figura 2.14. Linhagem Zymomonas mobilis CP4. Fonte: PALHA (2002).
O crescimento celular ocorre na faixa de pH variando de 3,5 a 7,5,
embora a faixa ótima seja entre 5 a 7. Muitas linhagens crescem a pH 3,5 e 4,
igualmente como ocorre com as bactérias acéticas, que apresentam habilidade
de crescimento em valores de pH entre 4 e 4,5 (SWINGS & DE LEY, 1977;
SCHMIDT et al., 1986; ERZINGER & VITOLO, 2006).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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Desta forma, as bactérias do gênero Zymomonas se assemelham à
maioria das bactérias acéticas, por apresentarem rápido consumo de glicose,
ciclo de Krebs incompleto, ocorrência do mecanismo de Entner Doudoroff e, no
caso das linhagens que possuem mobilidade, por apresentarem flagelos
polares. Além disso, estes microrganismos ocorrem em plantas e preferem
crescer em nichos ricos em sucos de plantas, tolerando um pH baixo. Apesar
de sua alta capacidade fermentativa, Zymomonas mobilis apresenta funções de
cadeia de transporte de elétrons e bom crescimento em ambientes
microaeróbicos, ocupando uma posição taxonômica claramente próxima dos
organismos aeróbios Glucanobacter e Acetobacter (SPRENGER, 1996).
Algumas linhagens de Zymomonas, assim como a maioria das bactérias
acéticas são hábeis em crescer em meio contendo 20% de glicose.
Adicionalmente, grande parte destas linhagens é hábil em crescer em meio
contendo 40% de glicose, de forma semelhante a muitas bactérias acéticas,
que são capazes de crescer rapidamente em um meio contendo 50% de
glicose. No vinho da palma, é a principal bactéria tolerante ao alto conteúdo de
glicose, frutose, sacarose e, em consequência, ao conteúdo alcoólico, assim
como também ocorre no caldo de cana-de-açúcar e no mel de abelhas
(VIIKARI & LINKO, 1986).
As bactérias do gênero Zymomonas possuem mecanismos de
adaptação para crescer em presença de etanol. Esses mecanismos incluem a
alteração da composição da sua membrana lipídica, evitando assim a
penetração de etanol no interior da célula, aumentando-se as propriedades da
barreira hidrofóbica e diminuindo a perda de material intracelular. Em níveis
acima do máximo tolerável, o álcool atua na dissolução da membrana
citoplasmática, de composição fosfolipídica, afetando a sua fluidez e
aumentando a sua permeabilidade, resultando no fluxo de íons, cofatores e
coenzimas para o meio exterior (SCHMIDT et al., 1986).
2.6.2.1. Biologia molecular básica de Zymomonas mobilis
O genoma da bactéria Zymomonas mobilis apresenta cerca de 1,53 ±
0,19.109 Da, 56% do tamanho do genoma de Escherichia coli podendo
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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acomodar cerca de 1500 cístrons, bem como 48,5 ± 1,0% de composição das
bases nitrogenadas G e C. Alguns genes presentes no microrganismo em
estudo apresentam destaque em relação à possível origem genética. Neste
contexto, o gene adh (40 kDa), o Gap (36,1 kDa) e o phoC (29 kDa)
apresentam homologias com o Adh IV de S. cereviseae (SWINGS & DE LEY,
1977), com microrganismos termofílicos, e com isoenzimas de cloroplasto
(POND et al., 1989); assim como semelhança com genes de E. coli, e com
sequências reguladoras de S. cerevisae. A organização dos genes trp é
semelhante à encontrada em espécies de Rhizobium, calcoaceticus
Acinetobacter, Pseudomonas e acidoovorans (CONWAY et al., 1987). Cabe
ressaltar que 50% das proteínas celulares existentes nesta bactéria
correspondem às enzimas responsáveis pelo processo fermentativo.
2.6.3. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS
2.6.3.1. Zymomonas mobilis X Saccharomyces cerevisiae
O interesse em Zymomonas mobilis tem sido reavivado nos últimos
anos, devido às vantagens de sua utilização sobre a tradicional levedura
Saccharomyces cerevisiae, como o seu alto rendimento de conversão de
açúcar a etanol e sua elevada produtividade. Esse microrganismo possui um
enorme potencial para utilização na produção de etanol combustível,
apresentando valores de produtividade específica (g etanol/g células. h) 3 a 5
vezes maior quando comparados aos obtidos com a tradicional levedura, bem
como um rendimento em etanol a partir de glicose próximo ao máximo
obtenível pela estequiometria (97%) (SPRENGER, 1996; BAI et al., 2007).
Contudo, cabe ressaltar que a bactéria possui baixa tolerância a inibidores,
bem como pequeno espectro de utilização de açúcares fermentáveis.
Na África e na Ásia, a bactéria Z. mobilis ocupa uma posição similar à
que a tradicional levedura ocupa na Europa e na América. Z. mobilis consegue
catabolizar o substrato com altas taxas específicas, pois o seu balanço de
energia resulta na formação de uma molécula de ATP por glicose metabolizada
durante a fermentação alcoólica (que equivale à metade da quantidade
produzida pela levedura). Desta forma, há produção de baixos rendimentos de
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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biomassa durante a fermentação, pois apenas cerca de 2% da glicose é
utilizada como fonte de carbono. O tempo de geração é relativamente rápido,
variando de 90 a 120 minutos (OSMAN et al., 1985; CONWAY et al., 1987;
SWINGS & DE LEY, 1977). Outra diferença entre os dois microrganismos
ocorre em suas rotas metabólicas. A bactéria executa uma simples rota
catabólica, sem alternativas metabólicas encontradas em outros
microrganismos.
O microrganismo Z. mobilis também se diferencia da levedura pelo maior
crescimento em anaerobiose e, portanto, não necessita de controle de oxigênio
para manter sua viabilidade em cultivo contínuo. Além disso, a bactéria tolera
elevadas concentrações de glicose, fermenta etanol em níveis maiores
(especialmente em cultivo continuo), produzindo elevadas concentrações deste
produto (GUNASEKARAN & RAJ,1999).
Portanto, as simples condições para seu crescimento, o baixo
rendimento celular, a formação de poucos produtos secundários, facilidade de
manipulação genética, a alta tolerância a açúcares, resistência a temperaturas
próximas de 40oC, resistência a altas concentrações de etanol, em até 120 g/L
(ARISTIDOU & PENTTILÄ, 2000; LEE & ROGERS, 1983) e 140 g/L (DIEN et
al., 2003), assim como a possível utilização na alimentação animal tornam
Zymomonas mobilis um potencial concorrente às tradicionais leveduras (DIEN
et al., 2003; LIMAYEM & RICKE, 2012), em particular para a produção de
etanol 2G .
2.6.3.2. Outras habilidades
Esta bactéria já demonstrou diversas outras habilidades: produção de
levana, produção de substâncias antimicrobianas (CALAZANS, 1997) e
desenvolvimento de probióticos (culturas de microrganismos vivos
administrados a humanos e/ou animais para fins terapêuticos). Além da
produção de substâncias de maior valor agregado, como sais de gliconato,
sorbitol e levana, concomitantemente à produção de etanol (ALVES, 1993;
FONSECA, 2003).
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Clavijero (1968), em seu livro intitulado “A História do México”, relata o
uso pelos astecas do “aguamiel” (seiva açucarada do agave), considerada o
habitat natural da Zymomonas mobilis, como agentes terapêuticos no
tratamento de diversas doenças, tais como distúrbios intestinais (ABUD, 2005).
Adicionalmente, a utilização do caldo fermentado por este microrganismo vem
sendo muito estudada para o tratamento de diversas outras doenças: Lindner
(1928) menciona a utilização de soluções contendo células de Zymomonas
mobilis no tratamento de doenças contra a febre aftosa, brucelose e doenças
renais em bovinos, assim como no tratamento de furúnculos e feridas
purulentas, distúrbios ginecológicos e intestinais (como colites crônicas
resistentes a medicamentos quimioterápicos e antibióticos) em seres humanos
(GONÇALVES DE LIMA, 1958; FALCÃO DE MORAIS, 1993; ABUD, 2005).
2.6.4. UTILIZAÇÃO DE AÇÚCARES
As bactérias da espécie Zymomonas mobilis são quimioorganotróficas,
ou seja, utilizam fontes de carbono orgânicas, como glicose, frutose ou
sacarose, para seu crescimento, gerando quantidades praticamente
equimolares de etanol e CO2. Estes carboidratos são indispensáveis na
composição do meio de cultura de Zymomonas mobilis. Porém, é com a
utilização da glicose que se tem melhores resultados em relação à produção de
etanol (CAMÊLO, 2009).
As características únicas do metabolismo de Z. mobilis têm atraído
considerável interesse de pesquisadores, servindo como modelo para as
investigações sobre o fluxo glicolítico e sua regulação. A glicose é
metabolizada em uma taxa extraordinariamente alta, onde, a cada minuto, tal
bactéria consome concentrações deste açúcar equivalentes a um terço de sua
biomassa; uma vez que, somente cerca de 2% são utilizados para a
plasticidade celular, compensando o seu baixo rendimento energético. Desta
forma, a hexose é transportada por um sistema de difusão facilitada de alta
velocidade, baixa afinidade e sem dependência energética (DOELLE & KIRK,
1993; PARKER et al., 1997).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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Seo et al. (2005) atribuem a sua rápida e elevada produção de etanol à
presença de duas enzimas, álcool desidrogenase, juntamente com piruvato
descarboxilase. Teoricamente, estas bactérias podem fermentar 1 mol de
glicose a quase 1,8 a 1,9 moles de etanol, 1,8 moles de CO2, 0,15 moles de
ácido acético e pequena quantidade de outros subprodutos, como lactato,
acetaldeído, glicerol, acetoína, dihidroxicetona, sorbitol, manitol e ácido
glicônico, seguindo um balanço metabólico simples (BERTASSO, 1996).
2.6.5. ROTA METABÓLICA
O metabolismo de açúcares em células de Zymomonas mobilis (Figura
2.15), assim como em algumas bactérias Gram-negativas, incluindo
Rhizobium, Pseudomonas e Agrobacterium, ocorre através da via de
Entner–Doudoroff (SPRENGER, 1996).
Figura 2.15. Via metabólica de formação de produtos da fermentação de carboidratos por Zymomonas mobilis. 1. glucoquinase; 2. glicose 6-P-desidrogenase; 3. 6-P-
gluconolactonase; 4. 6-P-gluconato desidratase; 5. aldolase; 6. gliceraldeído P-desidrogenase; 7. fosfoglicerato quinase; 8. fosfoglicerato mutase; 9. enolase; 10. piruvato quinase; 11. frutoquinase; 12. glicose 6-P isomerase; 13. glicose-frutose oxidoredutase (GFOR); 14. gluconolactonase (GL); 15. gluconato quinase; 16. piruvato descarboxilase; 17. álcool desidrogenase. Fonte: SPRENGER (1996).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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Nesta via, a partir de cada molécula de glicose há a produção de duas
moléculas de NADPH e uma molécula de ATP, que serão utilizadas nas
reações biossintéticas celulares (SPRENGER, 1996). Dessa forma, a glicose é
transportada do meio para o interior da célula, sendo fosforilada a glicose-6-
fosfato através da enzima glucoquinase. Em seguida, é formada a molécula de
glucono-6-fosfato lactona, através da desidrogenação pela enzima glicose-6-
fosfato desidrogenase (que age na presença da coenzima NADP).
A molécula de glucono-6-fosfato lactona sofre reação de hidratação,
através da enzima 6-fosfato gluconolactonase, e, com isso, ocorre a formação
da molécula 6-fosfogluconato, que é desidratada pela enzima 6-fosfogluconato
desidratase e forma a molécula 2-ceto-3-desoxi-fosfogluconato. Esta é
hidrolisada, através da enzima aldolase, ocorrendo à formação de outras duas
moléculas: gliceraldeído-3-fosfato ou piruvato.
A molécula de gliceraldeído-3-fosfato pode ser utilizada na síntese de
componentes celulares ou sofrer as mesmas transformações da rota de
Embder-Meierhopf-Parnas (EMP), na sua conversão para piruvato. Este
importante intermediário sofre descarboxilação, reação catalisada pela enzima
piruvato descarboxilase (requer Mg++ e tiamina pirofosfato como co-fatores),
gerando acetaldeído e dióxido de carbono através de reação irreversível.
Finalmente o acetaldeído é reduzido a etanol. A enzima álcool desidrogenase é
comum a muitos microorganismos; porém, a enzima piruvato descarboxilase é
a enzima-chave desta via, pois direciona o fluxo de piruvato para etanol, além
de ser pouco encontrada em bactérias (CAMÊLO, 2009).
Adicionalmente, a GFOR foi identificada como sendo uma enzima
periplasmática relativamente abundante na bactéria em estudo. A mesma
pertence à categoria enzimática em que a oxidorredução é realizada com
NADP não dissociável (ZHANG & CHEN, 2009).
2.6.6. FORMAÇÃO DE SUBPRODUTOS
A conversão de sacarose ou de misturas de glicose e frutose a etanol
pela bactéria Z. mobilis é significantemente inferior à obtida pela glicose ou
frutose separadamente, atingindo apenas cerca de 70% do valor teórico. Este
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
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40
fato ocorre, pois a frutose formada da hidrólise da sacarose não é
primariamente transportada para o interior das células via difusão facilitada,
mas sim utilizada na formação de levana, sorbitol e fruto-oligômeros,
subprodutos de alto valor agregado (DWIDAR et al., 2012).
A síntese da levana é dependente dos monossacarídeos livres,
especialmente a frutose formada após a hidrólise da sacarose. Neste contexto,
a concentração de sacarose decresce no meio de cultura, enquanto que a
glicose e a frutose geradas se acumulam no mostro, sendo posteriormente
absorvidas pela bactéria (DOELLE & KIRK, 1993).
Uma vez que a taxa de consumo da glicose é mais rápida que a da
frutose, geralmente a mesma se acumula em maiores quantidades, sendo
posteriormente reduzida a sorbitol, enquanto a glicose é oxidada (KANNAN et
al., 1997). Desta forma, tal composto, assim como o ácido glucônico, é formado
por monômeros de frutose, sendo obtido equimolarmente em reação catalisada
por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glucono-δ-lactonase (GL),
enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis.
Adicionalmente, Loss et al. (1994) reportaram que a formação do sorbitol
é conseqüência de um mecanismo de proteção osmótica, quando as células se
encontram sob o estresse de altas concentrações de açúcares. Desta forma,
este soluto compatível funciona como um osmoprotetor para o microrganismo,
que o acumula intracelularmente até concentrações de 1M, visando compensar
os efeitos exercidos pela alta pressão osmótica externa.
2.6.7. MEIOS DE CULTIVO
Assim como grande parte dos organismos quimiorganotróficos, a
bactéria Z. mobilis necessita de fontes de nitrogênio, fósforo, enxofre e
micronutrientes para o funcionamento do metabolismo e para a síntese das
células em uma forma assimilável pelo microrganismo. Além disso, necessitam
de água, carbono, fator de crescimento e oxigênio. A glicose e o extrato de
levedura são fundamentais para a fermentação pelo microrganismo em estudo
(OTHUMOANGAT et al. 1999).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
41
Nas fermentações com Zymomonas mobilis em meio de cultivo contendo
glicose, extrato de levedura, sulfato de amônio, fosfato de potássio e sulfato de
magnésio, quando a hexose é exaurida, cessa-se a utilização da fonte
inorgânica de nitrogênio NH4+ e a bactéria começa a metabolizar os
aminoácidos da meio como fonte de carbono, com liberação do nitrogênio na
forma de amônia, resultando em um aumento do pH do meio (ERNANDEZ et
al., 2009).
Alimentando-se novamente o meio com glicose após a sua exaustão, o
mecanismo gera um potencial eletroquímico e direciona o processo de
transporte de entrada deste carboidrato opera via excreção de prótons com os
produtos metabólicos por ação de uma proteína de membrana, a próton-
translocante ATPase, fazendo com que o pH do meio de cultivo decresça
gradualmente (ISHIZAKI et al., 1994).
Belaich et al. (1972) estudaram o efeito da limitação de pantotenato no
crescimento de Zymomonas mobilis, observando a redução da taxa específica
de crescimento. Sreekumar et al. (1999), citam que o mesmo é uma vitamina
essencial para a produção de etanol porque a bactéria não a sintetiza, embora
necessite desta substância para a produção de compostos orgânicos
essenciais ao crescimento celular, produzindo, consequentemente, o etanol.
Recentemente, Soleimani et al. (2012) também constataram que a
produção de etanol foi significativamente reduzida após remoção de nutrientes
do meio de cultura, tais como o extrato de levedura e peptona. No entanto,
alguns estudos demonstram que a utilização de alguns resíduos agro-
industriais pode substituir fontes de carbono ou nitrogênio, conforme observado
por Patle & Lal (2008).
2.6.7.1. Nitrogênio
A bactéria é capaz de utilizar diversas fontes de nitrogênio para o seu
crescimento, variando de simples componentes inorgânicos, como nitratos, a
componentes complexos, como os aminoácidos, mas nem todas as fontes de
nitrogênio suportam bem o crescimento bacteriano.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
42
As rotas metabólicas para o metabolismo do nitrogênio podem ser
divididas em duas classes: a rota necessária para a assimilação do nitrogênio
proveniente do meio extracelular e a rota biossintética para a produção
intracelular de compostos que contêm nitrogênio. Os aminoácidos após a
metabolização são incorporados diretamente às proteínas ou catabolizados de
acordo com as necessidades da célula em termos de carbono, nitrogênio e
energia (ABUD, 2005).
A fonte de nitrogênio pode ser adicionada na forma de aminoácidos,
peptona, sais de amônia e peptídeos. Segundo França & Rodrigues (1985), os
sais de amônio e os aminoácidos conduzem para um melhor crescimento, uma
vez que não causam acúmulo de nitritos e nitratos. Sanchez & Demain (2002)
citam que, em geral, amônia, glutamina e asparagina são boas fontes de
nitrogênio, enquanto prolina, leucina e uréia são qualificadas como más fontes
de nitrogênio. Galani et al. (1985) constataram que sais como NH4Cl e
(NH4)2SO4 são as melhores fontes de nitrogênio. Pinheiro (2001) ressaltou uma
relação mássica entre glicose e asparagina (entre 75:1 e 100:1), para a qual a
bactéria apresenta a maior taxa de crescimento.
Neto et al. (2005) notaram que grandes concentrações de extrato de
levedura podem provocar diminuição da produção de etanol, devido a um
excesso de fonte de nitrogênio. Desta forma, ocorre um aumento na
concentração de biomassa, uma vez que Zymomonas utiliza esse composto
não apenas como fonte de nitrogênio, mas também como blocos para
biossíntese, implicando em uma menor necessidade de energia. Tal fato
justificaria a diminuição na produção de etanol e, consequentemente, a menor
formação de ATP. A regulação do nitrogênio é de fundamental importância na
microbiologia industrial, uma vez que afeta a síntese de enzimas envolvidas
tanto no metabolismo primário quanto no secundário. Desta forma, muitas rotas
metabólicas secundárias são negativamente afetadas por fontes de nitrogênio
favoráveis ao crescimento, como os sais de amônio, assim como elevadas
concentrações de nitrogênio podem afetar a síntese dessas enzimas (BELAÏCH
& SENEZ, 1965; Neto et al., 2005).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
43
2.6.7.2. Fósforo
O fósforo tem papel importante nas vias metabólicas que são iniciadas
com uma fosforilação do substrato. Esse elemento, constituinte das moléculas
de ATP, é absorvido pelas células sob a forma de sais, como KH2PO4 ou
K2HPO4 (RANZAN, 2010).
2.6.7.3. Enxofre
O enxofre, constituinte estrutural da célula é de grande importância para
a formação de proteínas, pode ser suprido por metionina, cisteína e sulfatos
(FRANÇA & RODRIGUES, 1985). No entanto, MgSO4 é a melhor fonte deste
elemento, por servir também como de fonte de magnésio; que por sua vez é
responsável pela estabilidade estrutural de diversas enzimas, como também
por prevenir a formação de vesículas na membrana externa da célula (GALANI
et al., 1985).
2.6.8. Meios de cultivo de baixo custo
A elaboração de meios de cultivo de baixo custo é um importante fator
em processos fermentativos industriais. Desta forma, Neto et al. (2005)
reportaram a utilização de melaço de cana, subproduto da indústria do açúcar,
que apresenta alta concentração de sacarose. Através de um planejamento
experimental, onde as variáveis estudadas foram: a concentração de sacarose,
a concentração de extrato de levedura e o tempo, as condições ótimas para a
produção de etanol do melaço foram, respectivamente, 100 g/L, 2,0 g/L e 24
horas. Recentemente, Thanonkeo et al. (2011) também obtiveram sucesso ao
avaliar a produção de etanol a partir de alcachofra de Jerusalém pela linhagem
de Z. mobilis isolada na Tailândia, TISTR548, alcançando 95,9 g/L de etanol a
partir de 250 g/L de açúcares redutores totais.
Ruanglek et al. (2006) utilizaram meio sintético contendo glicose como
substrato (100 g/L), além de fontes de nitrogênio provenientes de resíduos
agro-industriais de Ajinomoto Co. Ltd. atingindo cerca de 43 g/L de etanol. O
mesmo resultado foi alcançado quando adicionou-se 10 g/L de extrato de
levedura.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
44
A formulação de meios com diferentes composições foi reportada por
Tanaka et al. (1999), que utilizaram suco de abacaxi sem diluição, contendo
125 g/L de sacarose, e traços de glicose e frutose, além de outros
componentes em menores proporções, como Mg, Ca, P, Fe, Na e K. Foi
alcançada a concentração de 59 g/L de etanol, sem nenhum controle de pH e
agitação. Em seguida, os autores fizeram a comparação com a fermentação
em meio sintético nas mesmas concentrações de sacarose, além da adição de
extrato de levedura e de outros nutrientes, reduzindo-se a concentração de
etanol para 42,5 g/L, sob as mesmas condições de pH e agitação.
Silva et al. (2007) utilizaram a farinha de algaroba na formulação do
meio para a fermentação pela bactéria Z. mobilis, atingindo 77 g/L de etanol.
Através de um planejamento experimental, foi constatado que a condição ótima
da farinha era de 30% (m/v), a qual apresentou elevados níveis de nutrientes,
principalmente açúcares, e minerais, como o fósforo e o cálcio.
Patle & Lal (2008) investigaram a fermentação por Z. mobilis e C.
tropicalis em resíduos agro-industriais de amido, o thippi -subproduto do
processo do processamento de amido, contém além deste carboidrato, pectina,
fibras e proteínas- atingindo 72,8 g/L de etanol quando as duas culturas
microbianas ocorriam simultaneamente e 65,3 g/L apenas com a bactéria Z.
mobilis.
Soleiman et al. (2012) reportaram a otimização das melhores condições
fermentativas pela linhagem de Z. mobilis PTCC 1718 (DSMZ 424), utilizando
resíduos de baixo custo, tais como soro de leite e farelo de trigo, associados à
nutrientes sintéticos, onde as melhores condições foram de 25 g/L de sacarose,
15 g/L de soro de leite, 2,5 g/L de farelo de trigo, 5 g/L de extrato de levedura,
2,5 g/L de peptona, 7 g/L KH2PO4, 1 g/L de (NH4)2SO4, e 0,5 g/L MgSO4; sob
50oC de temperatura, pH 5,5 e inóculo de 12% (v/v); alcançando até 91,22 g/L
em biorreator instrumentado, durante 48 horas.
Dwidar et al. (2012) obtiveram 25 g/L de etanol por Z. mobilis ZM4 a partir
de 55-60 g/L de bebidas carbonatadas, em 10 horas de fermentação. Os
autores ressaltam a importância de tal pesquisa, indicando que estudos
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
45
posteriores apontam para a produção de etanol em maior escala a partir destes
resíduos industriais.
2.6.9. PRODUÇÃO DE ETANOL CONVENCIONAL POR Z. mobilis
A bactéria Z.mobilis possui um grande potencial para a produção
industrial de etanol a partir de açúcar, xarope e caldo de cana, dentre outros
substratos (LEE & HUANG, 2000). Comparações de resultados recentes
reportados na literatura utilizando a bactéria Zymomonas mobilis na
fermentação de etanol convencional estão apresentadas na tabela 2.4.
A produtividade e produção de etanol variam, dentre diversos fatores, de
acordo com o substrato empregado, nutrientes adicionais, bem como o
microrganismo a ser utilizado. Pinilla et al. (2011) obtiveram elevadas
concentrações de etanol (83,81 g/L), a partir de glicose adicionada de extrato
de levedura, peptona e sais, após isolamento de colônias crescidas no melaço
de cana. Já Wiikins (2009) empregaram misturas de açúcares, frutose, glicose,
sacarose e galactose, atingindo 43,5 g/L de etanol ao final do processo
fermentativo, ao passo que Maiti et al. (2011) alcançaram 58,4 g/L a partir de
melaço de cana-de açúcar.
Sabe-se que bactéria Z. mobilis possui baixa tolerância a sais quando
está na sua forma livre, entretanto, a imobilização proporciona maior aceitação
desses compostos, assim como reduz a produção de sorbitol pelo
microrganismo (IIDA et al., 1993). Tais autores estudaram a imobilização em
diversas linhagens de Z. mobilis (B-69 147, MX 3303, HSZA 1006, HSZI 4160,
e NRRL B-14023) utilizando gel de resina (photo-crosslinkable) através de um
processo contínuo, atingindo 80 g/L de etanol e 60 g/L.h de produtividade
volumétrica pela linhagem B-69 147, durante 14 dias. O desempenho da
linhagem utilizada foi superior ao do microrganismo Saccharomyces uvarum,
que a partir de 200 g/L de glicose inicial, produziu 60 g/L de etanol, bem como
cerca de 44 g/L.h de produtividade volumétrica.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
46
Tabela 2.4. Principais resultados relatados na literatura para produção de etanol convencional por Zymomonas mobilis.
Onde: MP: matéria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal: galactose; ART: açúcares redutores totais; FA:
frascos agitados; BR: biorreator; QP: produtividade volumétrica em etanol. Referências Bibliográficas: 1. SILVA (2007); 2. ZHANG (2003); 3.CAZETTA et al. (2007); 4. TANAKA et. al. (1999); 5. WIIKINS (2009); 6. ZHANG et al. (2008); 7. NETO et al. (2005); 8. COSTA et al. (2001); 9. MAITI et al. (2012); 10. RUANGLEK et al. (2006); 11. DAVIS et al. (2006); 12. BANDARU et al. (2006); 13. PATLE & LAL (2008).
MP/Meio Substrato
Xo
Sistema
reacional
Etanol
(g/L)
QP
(g/L.h) Ref.
Farinha de algaroba 30% (m/v) 5% (v/v) FA 77 4,3 1
Meio sintético 35 g/L de xil + 35 g/L de gli 2,5 g/L BR 38 1,59 2
Meio sintético 200 g/L de sac 0,2 g/L FA 55,8 1,16 3
Suco de abacaxi 125 g/L de sac 10 % (v/v) BR 59 2,81 4
Meio sintético 29.9 g/L de fru; 7.7 g/L de gal;
51,7 g/L de gli; 1,3 g/L de sac 0,3 g/L FA 43,5 0,60 5
Meio sintético 200 g/L de gli 1,8 g/ L FA 72,5 1,2 6
Melaço de cana 100 g/L de ART 2 g/L FA 30 1,25 7
Meio sintético 20% (v/v) 10% (v/v) BR 67,7 2,25 8
Melaço de cana 216 g/L de ART Não consta BR 58,4 1,33 9
Meio sintético 100 g/L de gli 2,3 g/L FA 43 2,38 10
Amido Hidrolisado 110 g/L de gli 10% (v/v) BR 54 4,90 11
Sagu 150 g/L de amido 93,2 g /L de
esferas FA 55,3 3,20 12
Resíduos alimentares 254.45 g. kg-1 2.8x108
CFUmL-1 FA/ BR 72,8 1,51 13
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
47
Amutha & Gunasekaran (2001) também empregaram a tecnologia de
imobilização associada à fermentação, atingindo 46,7 g/L de etanol a partir de
hidrolisado de mandioca por células co-imobilizadas de Z. mobilis e S.
diastaticus, contrastando com 37,5 g/L por S. diastaticus. Já Bandaru et al.
(2006) avaliaram a co-imobilização de células de Z. mobilis MTCC 92, assim
como da enzima amiloglicosidase, onde a produção de etanol ocorreu em
55,3 g/L, na temperatura de 32,4oC, pH 4,93, durante 17,24 horas, a partir de
150 g/L de amido.
Behera et al. (2010) compararam a performance de Z. mobilis
(MTCC92) e S. cerevisiae (CTCRI) frente à produção de bioetanol a partir das
flores de Madhuca latifólia L. Após 96 h de fermentação, a produção e
produtividade de etanol foi de 20,47 e 24,83 g/L; 0,213 e 0,258 g/L.h,
respectivamente. Bansal & Singh (2003) também reportaram que a levedura
produziu maiores concentrações de etanol do que a bactéria em meio de
fermentação contendo 15% (m/v) de açúcares; assim como os estudos
realizados por McGheeet al. (1981), apontando para o maior desempenho da
levedura imobilizada em processo contínuo, a partir de concentrações de 1%
a 5% de glicose. No entanto, Raman & Pothiraj (2008) afirmaram que a
bactéria apresenta melhor desempenho em relação à levedura, atingindo 9,25
g/L e 8,73 g/L de etanol, respectivamente, a partir de resíduos da mandioca,
em pH 6, durante 36 h.
2.6.9.1. Inibição pelo produto, substrato e temperatura
Karsch et al. (1983) propuseram que o microrganismo Z. mobilis
apresenta maior produção de etanol e menor crescimento de biomassa em
relação à levedura S. cerevisiae, tendo como uma de suas peculiares
características, a variação do pH de 5,5 a 3,8. No entanto, a levedura
apresenta maior aplicabilidade na produção industrial, por ser menos sensível
a alguns fatores, tais como temperatura elevada e toxicidade ao etanol,
podendo desencadear um estresse fisiológico na bactéria, o que pode alterar
a fluidez da membrana plasmática, provocando redução do crescimento
específico, prejudicando a viabilidade celular, bem como a habilidade
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
48
fermentativa (OSMAN et al., 1985; BARBOSA et al., 1994; MOREAU et al.,
1997; THANONKEO et al., 2007).
É importante ressaltar que há controvérsias em relação à faixa de
inibição pelo etanol e temperatura do processo, variando de acordo com a
linhagem e o substrato empregado, conforme experimentos realizados por
Ernandez et al. (2009) e Gunassekaran & Raj (1999). Utilizando 20% de
sacarose, Jobses et al. (1985) relataram que a concentração limitante deste
álcool foi de 57,5 g/L, provocando redução do crescimento celular, bem como
um aumento do substrato residual. Já a partir da glicose, a bactéria
apresentou tolerância nas concentrações de 70 a 80 g/L (GALLEGOS et al.
2006).
Panesar et al. (2007) constataram que a linhagem Zymomonas mobilis
MTCC2428 tolera até 8% (v/v) de etanol em meio contendo glicose, em
temperatura de 30°C. No entanto, quando a temperatura se elevou para 35 e
40°C, o microrganismo tolerou apenas 6 % (v/v) e 2 % (v/v) deste produto,
respectivamente.
Adicionalmente, Lee, Wroble e Ross (1989) notificaram que em
temperaturas próximas de 40°C, os rendimentos de formação de biomassa e
produção do álcool por tal microrganismo decresciam. Porém, as taxas
específicas de consumo de substrato, crescimento e formação de produtos
não foram afetadas.
Ranzan (2010), e Bekers et al.(1990) estudaram as oscilações que
ocorrem no processo fermentativo pela bactéria em questão, indicando que
estas são decorrente da inibição pelo produto ou pelo substrato, ambos em
elevadas concentrações. Consequentemente, as oscilações podem afetar a
produção de etanol e de biomassa, aumentando as concentrações de
açúcares residuais.
Estudos iniciais desenvolvidos por Rogers et al. (1979) aplicaram
elevadas concentrações de substrato, onde houve a conversão de 250 g/L de
glicose a 100 g/L de etanol no período de 40 horas, empregando Zymomonas
mobilis ATCC10988 e Saccharomyces carlsbergensis (uvarum). O
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
49
crescimento de biomassa bacteriana foi consideravelmente menor do que o
obtido pela levedura, indicando maior taxa específica de consumo deste
açúcar, assim como maior produção de etanol pelo microrganismo. Segundo
Torres (1987), concentrações superiores a 156,0 g/L de glicose provocam
inibição no crescimento da linhagem Z. mobilis (ZAP) na temperatura de
35°C. Na medida em que a temperatura se eleva, a mesma torna-se inibitória
para o crescimento.
Segundo Zhang et al. (2008), a presença de solutos compatíveis na
produção de etanol por Z. mobilis diminui relativamente a inibição pelo
substrato em altas concentrações. Os autores avaliaram a fermentação a
partir de 200 g/L de glicose, atingindo concentrações de etanol acima de 70
g/L; no entanto, a partir de 250 g/L deste açúcar, a produção decai para 66
g/L, devido à hiper osmolaridade causada pelas altas concentrações de
substrato no meio, associadas à presença de um soluto compatível, a ectoina,
composto natural que serve como uma substância protetora em algumas
células bacterianas.
Hermans (1992) avaliaram a fermentação contínua por Zymomonas
mobilis ATCC 29191 através da adição de diferentes concentrações de
glicose, 150,0; 170,0; 200,0 g/L, obtendo 4 g/L.h de produtividade volumétrica,
com rendimentos em etanol de 98% e taxa específica de 1,1 h-1. Costa et al.
(2001) também avaliaram a fermentação contínua de sacarose, 20% (m/v),
atingindo cerca de 65 g/L de etanol através da fermentação por Z. mobilis,
que apresentou oscilação em seu crescimento, devido às elevadas
concentrações desse açúcar.
Estudos pioneiros de Rogers et al. (1979) também constataram que
10% (v/v) de inoculo, crescido por até 25 horas, na temperatura de 30oC, era
o mais apropriado para a fermentação por Zymomonas mobilis, pois apesar
da produção de etanol ter aumentado juntamente com a adição de inóculo
acima desta proporção estabelecida, o tempo de processo não sofreu
alteração.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
50
Adicionalmente, a produtividade volumétrica e a produção de etanol
podem ser afetadas pela presença de altos níveis de oxigênio, principalmente
em elevadas concentrações de substrato, assim como o dióxido de carbono
pode promover redução ou inibição do crescimento de biomassa, aumentando
a concentração de glicose residual do processo (BARATTI & BU´LOCK,
1986).
2.7. ESTRATÉGIAS DE PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE
ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO
Após os pré-tratamentos (ácido e alcalino) dos materiais
lignocelulósicos, que visam o fracionamento da hemicelulose e a
deslignificação do resíduo sólido (celulignina), é possível hidrolisar a celulose
através de concepções modernas, que incluem processos enzimáticos para a
obtenção de glicose, que, por sua vez, poderá ser fermentada a etanol (LYND
et al., 2002). Diferentes configurações de processos podem ser definidas com
base nesses eventos e de acordo com a integração dos mesmos, que se
seguem detalhadas.
2.7.1. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEPARADA DA FERMENTAÇÃO (SHF)
Nesta concepção, como o próprio nome indica os materiais pré-
tratados são hidrolisados enzimaticamente para obtenção da glicose, a qual é
subsequentemente fermentada a etanol. Os eventos acontecem em unidades
separadas fisicamente (Figura 2.16).
A grande vantagem desse método é que o mesmo permite que tanto a
hidrólise quanto a fermentação sejam conduzidas em condições ótimas para
cada etapa. A temperatura ótima para as celulases está entre 45 e 50oC e a
temperatura ideal para a fermentação está entre 30 e 37oC (OLSSON et al.,
2006).
No entanto, cabe ressaltar que a maior desvantagem deste processo
está relacionada à inibição das enzimas do complexo celulásico pelos seus
produtos finais de hidrólise (glicose e celobiose); assim como a possibilidade
de contaminação, pois o tempo envolvido na etapa de hidrólise é longo, e a
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
51
solução de açúcares formada torna-se uma fonte disponível ao ataque de
microrganismos indesejados. Além disso, as próprias enzimas podem ser
uma fonte potencial de contaminação (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
Figura 2.16. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática separada da fermentação (SHF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).
2.7.2. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS (SSF)
Esta concepção combina a hidrólise enzimática dos materiais pré-
tratados e a fermentação em um único evento (Figura 2.17).
Figura 2.17. Diagrama de blocos do processo de hidrólise enzimática e fermentação simultâneas (SSF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
52
Sua maior vantagem é que a glicose produzida através da atividade
das celulases é imediatamente consumida pelo microrganismo fermentador,
minimizando os efeitos inibitórios causados pela glicose, que se apresenta em
baixas concentrações. Além disso, há um aumento de produtividade em
etanol, pois menores cargas enzimáticas são utilizadas no processo; assim
como há redução do risco de contaminação, pois a presença de etanol reduz
essa possibilidade (McMILLAN et al., 1999).
Entretanto, estes processos são conduzidos fora das condições ótimas
de operação das enzimas, de modo que um ganho de rendimento devido à
menor inibição enzimática pode ser contrabalançado por uma menor atividade
das enzimas em razão das condições operacionais menos apropriadas à
atividade catalítica. Microrganismos termotolerantes têm sido propostos para
serem usados neste processo, dessa forma, seria possível aproximar a
temperatura do processo à temperatura ótima de atividade das celulases
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
Embora exerça um menor efeito inibitório que a glicose ou a celobiose
sobre a taxa de hidrólise, a presença de etanol na celulignina pré-tratada
provoca um acentuado decréscimo da atividade enzimática durante o
processo hidrolítico. Há registros de que concentrações de etanol de 30 g/L
reduziriam a atividade enzimática em 25% (WU & LEE, 1997).
Apesar de algumas desvantagens, este tem sido o método preferido
tanto em estudos de laboratório quanto em escala piloto. Da mesma forma
que na concepção anterior, os açúcares provenientes da hemicelulose após o
pré-tratamento podem ser convertidos a etanol em um fermentador separado
(TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
2.7.3. HIDRÓLISE ENZIMÁTICA E CO-FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS
(SSCF)
Esta concepção refere-se à co-fermentação de ambos os açúcares,
pentoses e hexoses, em uma mesma etapa (Figura 2.18). Neste sentido, o
hidrolisado hemicelulósico e a celulose não são separados após a etapa de
pré-tratamento, permitindo que os açúcares da hemicelulose sejam
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
53
convertidos a etanol juntamente com a sacarificação e fermentação da
celulose (TEIXEIRA et al., 2000).
É necessária a intervenção da Biologia Molecular, visando conferir a
um único microrganismo as características necessárias para fermentar ambos
os açúcares. Existem vários exemplos na literatura de microrganismos
engenheirados com essa finalidade, dentre os quais se encontra Zymomonas
mobilis (LAWFORD & ROUSSEAU, 1998; McMILLAN et al., 1999; TEIXEIRA
et al., 2000; AGRAWAL et al., 2011; ZHOU, et al., 2011).
Figura 2.18. Diagrama de blocos do processo de sacarificação e co-fermentação simultâneas (SSCF). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).
2.7.4. BIOPROCESSO CONSOLIDADO (BPC)
Esta concepção de processo une em uma mesma etapa a produção de
celulases, a hidrólise enzimática de celulose e a fermentação de pentoses e
hexoses por um mesmo microrganismo (Figura 2.19).
Figura 2.19. Diagrama de blocos do processo consolidado para a produção
de etanol de segunda geração (BPC). Fonte: PEREIRA JR et al. apud WINGREEN (2008).
A adoção desta estratégia tecnológica permitiria uma significativa
redução nos custos de produção, além de representar uma alternativa à
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
54
estratégia convencional de produção de celulases em uma etapa, com o uso
das enzimas resultantes para a hidrólise da celulose em uma segunda etapa.
Em termos de custos e de desenvolvimento tecnológico, a estratégia
do Bioprocesso Consolidado (BPC) apresenta-se como a ideal a ser atingida.
Contudo, esse tipo de processo ainda não pode ser desenvolvido à nível
industrial com os microrganismos disponíveis atualmente, tais como
Clostridium thermocellum e Clostridium cellulolyticum, necessitando-se do
desenvolvimento de contínuas técnicas de engenharia genética para a
construção de linhagens que possuam maiores níveis de expressão tanto de
atividade enzimática quanto de fermentação (OLSON et al., 2012).
2.7.5. PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO POR Z. mobilis
Nas últimas décadas, diversos estudos têm sido realizados visando à
utilização de biomassa residual como matéria-prima para produção de
bioetanol. A bactéria Z. mobilis vem sendo empregada em alguns trabalhos,
devido à sua alta capacidade de produzir etanol em condições anaeróbicas.
A tabela 2.5 sumariza os resultados mais proeminentes reportados na
literatura utilizando linhagens de Zymomonas mobilis nativa ou engenheirada
geneticamente, visando à produção de etanol de segunda geração.
Yamashita et al. (2008) avaliaram a utilização de altas concentrações
de “lodo de papel” na produção de etanol através do processo SSF, por
células de Z. mobilis inicialmente livres, não havendo nenhuma produção de
etanol através desta estratégia de operação do processo. O resultado foi
atribuído à grande quantidade de íons metálicos presentes no hidrolisado de
papel. Sendo assim, as bactérias foram imobilizadas em alginato de cálcio,
resultando na produção de etanol de 18 g/L em 4 corridas.
Recentemente, alguns autores avaliam a fermentação a partir do
bagaço de cana. Velmurugan et al. (2012) estudaram o processo SSF a partir
deste resíduo por Z. mobilis MTCC89, alcançando 91,2% de eficiência de
produção de etanol em 36 horas. Kuo & Lee (2008) avaliaram o pré-
tratamento desta matéria-prima através de óxido de n-metilmorfolina e, em
seguida, também empregaram o processo SSF, atingindo a concentração
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
55
14,5 g/L de etanol por tal bactéria. Fu et al. (2009) analisaram a fermentação
do hidrolisado ácido do bagaço por células de Z. mobilis imobilizadas em
alginato de cálcio, associadas a células de Pichia stipitis, atingindo cerca de
28 g/L de etanol.
Tabela 2.5. Resultados relatados na literatura para a produção de etanol de
segunda geração por Zymomonas mobilis.
Onde: MP: matéria-prima; xil: xilose; gli: glicose; fru: frutose; sac: sacarose; gal:
galactose; cel: celobiose; ART: açúcares redutores totais; SR: sistema reacional; FA: frascos agitados; BR: biorreator; QP: produtividade volumétrica em etanol; X0: concentração inicial de células, P: etanol (g/L). Referências Bibliográficas: 1. FU et al. (2009); 2. DAVIS et al. (2005); 3. YAMASHITA et al. (2008); 4. KUO & LEE (2008); 5.YANASE et al. (2005); 6. MOHAGHEGHI et al. (2004); 7. VELMURUGAN et al. (2012).
Wirawan et al. (2012) compararam a imobilização de Z. mobilis em
alginato de cálcio e em álcool polivinílico, onde os melhores resultados
obtidos foram de 6,24 g/L e 5,52 g/L de etanol, eficiência de fermentação de
79,09% e 69,96%, produtividade volumétrica de 3,04 g.L/h e 2,37 g.L/h,
utilizando o processo SHF e de 5,53 g/L e 5,44 g/L de etanol, eficiência de
fermentação de 70,09% e 68,95%, produtividade volumétrica de 1,31 g.L/h e
1,27 g.L/h, utilizando o processo SSF para a produção de etanol,
respectivamente. Os estudos mostraram boa estabilidade e possibilidade de
MP/Meio Substrato Xo SR P (g/L) QP (g/L.h) Ref.
Hidrolisado de bagaço de cana
32 g/L de gli;
21 g/L de xil
1x108
CFU/mL BR 28 0,7 1
Vinhoto de trigo Hidrolisado ácido, suplementado com
40 g/L de gli 0,2 g/L FA 28 g/L 1,55 2
Lodo de Papel 200 g/L de resíduo
de papel 0,01 g BR 18 0,372 3
Bagaço de cana 15 g/L de gli 1,5 g/L BR 14,5 0,29 4
Materiais lignocelulósicos
10% de gli e 20 g/L de cel
107/ml-1 FA 10,7 0,22 5
Hidrolisado ácido do milho
75 g/L de gli;
52 g/L de xil 0,06 g/L BR 53 0,073 6
Bagaço de cana 38,4 g/L de gli 0,1 g - 17,9 0,497 7
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
56
reutilização das células nas fermentações em batelada simples e alimentada,
tanto para a imobilização em alginato de cálcio quanto em álcool polivinílico.
Estudos prévios sobre a co-imobilização de diferentes microrganismos
foram desenvolvidos recentemente por Liu et al. (2012). Os autores
empregaram fungos da espécie Trichoderma reesei e Aspergillus niger,
produtores de celulases, juntamente com a bactéria Zymomonas mobilis,
produtora de etanol. Desta forma, o material celulósico foi convertido a
açúcares através das enzimas do complexo celulásico e, posteriormente,
fermentado pela bactéria. Após 96 horas de co-cultivo das duas espécies dos
fungos filamentosos na proporção 1/1, inóculo de 18% (m/v), os mesmos
obtiveram uma taxa de produção de açúcar redutor e de eficiência de hidrólise
de 2,57 g/L e 46,27%, respectivamente. A concentração de etanol alcançada
foi de 0,56 g/L a partir de carboximetilcelulose (CMC), promovendo uma
eficiência de fermentação de 11,2% após o período de 24 horas.
2.8. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE PENTOSES POR
LINHAGENS RECOMBINANTES DE Zymomonas mobilis
Para viabilizar a produção comercial do etanol lignocelulósico faz-se
necessária a eficiente e integral conversão dos carboidratos potenciais em
bioetanol. Embora a fermentação da glicose seja realizada com eficiência pela
bactéria Zymomonas mobilis, bem como por Saccharomyces cerevisiae, o
mesmo não ocorre com as pentoses, principais componentes da fração
hemicelulósica. Segundo Zhang & Lynd (2010), o emprego de
microrganismos fermentadores de glicose e xilose aumentou em 19% a
produção de etanol através do processo SSCF de resíduos de papel, quando
comparada à produção apenas da glicose oriunda da fração celulósica.
2.8.1. METABOLIZAÇÃO DA XILOSE
A busca de microrganismos fermentadores de xilose é, pois, um dos
maiores desafios da Biotecnologia moderna. Conforme citado nos itens 2.6 e
2.7, a bactéria gram-negativa Zymomonas mobilis apresenta diversas
características interessantes para este propósito, contudo, a mesma só é
capaz de fermentar um pequeno espectro de açúcares, glicose, sacarose e
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
57
frutose. Além disso, tal microrganismo não possui algumas enzimas-chave da
via das pentoses, que permitem o metabolismo da xilose. Desta forma, a
engenharia metabólica em Z. mobilis apresenta-se como alternativa para
tornar esta bactéria capaz de fermentar pentoses, além de hexoses.
A figura 2.20 ilustra a inserção da via das pentoses na via de Entner-
Doudoroff, após a adição de genes que codificam para as enzimas xilose
isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase na bactéria Z.
mobilis (ZHANG et al., 1995).
Figura 2.20. Metabolismo da xilose, inserido na via Entner-Doudoroff do microrganismo Z. mobilis. Fonte: AGRAWAL et al. (2011).
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
58
Neste contexto, o rendimento teórico ocorre em 0,51 g de etanol/ g de
xilose (1,67 mol/mol), havendo formação de 1 mol ATP/mol de pentose.
Aristidou & Penttilä (2000) indicaram que a nova via metabólica promove a
conversão de 5 moles de etanol a partir de 3 moles de xilose, conforme a
seguinte equação estequiométrica:
3 xilose + 3ADP + 3 Pi 5 etanol + 5CO2+ 3ATP + 3H2O.
2.8.1.1. Breve Histórico
Os trabalhos pioneiros de Liu et al. (1988) e Feldman et al. (1992), que
introduziram os genes da xilose isomerase (XI) e xiluloquinase (XK),
provenientes de Xanthomonas capestris e Klebsiella pneumoniae em Z.
mobilis tiveram pouco sucesso. Tais enzimas são responsáveis pela
assimilação da xilose, no entanto, as enzimas transaldolase (TAL) e
transquetolase (TKT) promovem a metabolização da mesma, sendo
essenciais para a produção de etanol (MATSUSHIKA et al., 2012).
Os mesmos genes codificadores destas enzimas, provenientes de E.
coli, também foram introduzidos na bactéria Zymobacter palmae. Após
adaptação metabólica em meio contendo xilose, o microrganismo atingiu 95%
de eficiência de fermentação a partir de glicose e xilose (YANASE et al.,
2007), resultado superior ao reportado por Mohagheghi et al. (2006), que
alcançaram 76% de eficiência, com o consumo de 75% (m/v) da pentose
proveniente de hidrolisado hemicelulósico por Z. mobilis. Desta forma, Zhang
et al. (1995) demonstraram que a co-expressão de XI, XK, TAL e TKT,
oriundas de Escherichia coli, permitiram que Z. mobilis co-fermentasse xilose
e glicose, atingindo 11 g/L de etanol e conversão em produto de 0,44 g/g
xilose, correspondendo à uma eficiência de fermentação de 86%. Já a partir
de glicose, e de hexose/ pentose, a linhagem recombinante CP4 (pZB5)
atingiu 94% e 95% de eficiência, durante 16 e 30 horas, respectivamente.
Posteriormente, estudos avaliaram o emprego de diferentes linhagens
de Zymomonas mobilis quanto à produção de etanol e ao crescimento celular.
O grupo de pesquisa do NREL empregou a linhagem ATCC31821 (pZB5), no
intuito de alcançar maiores rendimentos, comparativamente a estudos
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
59
utilizando a linhagem CP4 (pZB5). Os resultados indicaram que a linhagem
ATCC31821 fermentou 1,5% (m/v) de glicose e 3,5% (m/v) de xilose, sem
controle de pH, nas temperaturas de 30 e 37oC, respectivamente, alcançando
99 e 96% (m/v) de consumo dos açúcares (12 e 18% a mais do que a
linhagem CP4); 20 e 18% de aumento nos valores de produtividade
volumétrica, assim como 49 e 40% de aumento na taxa de conversão destes
carboidratos frente à linhagem CP4, durante 69 horas (ZHANG et al., 1995;
ZHANG et al., 2003).
Recentemente, estudos de Zhang & Lynd (2010) indicaram que o
microrganismo Z. mobilis 8b (derivada da 31821-pZB5) apresentou melhor
desempenho frente à levedura S. cerevisiae RWB222, quanto à hidrólise e co-
fermentação simultâneas de resíduos do papel, onde ambas as espécies
atingiram 40 g/L de etanol na temperatura de 37oC. Contudo, a bactéria e a
levedura reduziram a viabilidade celular após 44 e 25 horas de processo, em
concentrações de 29 e 23 g/L de etanol, atingindo 0,47 e 0,40 g/ produto/g
açúcares consumido, respectivamente.
Diversos artigos reportam sobre a fermentação da xilose presente na
fração hemicelulósica de resíduos agro-industriais. Mohagheghi et al. (2004)
utilizaram o hidrolisado ácido de resíduos do processamento do milho, cuja
fermentação resultou na concentração de etanol de 53 g/L. Davis et al. (2006)
compararam o desempenho de Z. mobilis e de S. cerevisiae em hidrolisado
de amido, apresentando produtividades de 4,90 e 3,25 g/L.h,
respectivamente, mostrando que tal bactéria recombinante apresentou-se
mais promissora do que a levedura quanto à produtividade em etanol. Davis
et al. (2005) também fizeram uso do hidrolisado hemicelulósico proveniente
de grãos de trigo, composto por 6 g/L de glicose e 16 g/L de xilose, sendo
adicionado de 10 g/L desta hexose, alcançando 11 g/L de etanol e 12 g/L de
xilose residual pela linhagem ZM4 (pZB5). Em estudos posteriores, os autores
suplementaram o meio com 5 g/L de extrato de levedura e 40 g/L de glicose,
obtendo 28 g/L de etanol e 2,6 g/L de xilose residual após o período de 18
horas. Adicionalmente, Joachimshtal & Rogers (1999) também ressaltaram a
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
60
importância da adição desta fonte de nitrogênio, assim como da glicose na
fermentação por Z. mobilis recombinante.
A figura 2.21 mostra o mapa do plasmídeo pZMETX, desenvolvido pelo
grupo de pesquisa de Agrawal et al. (2011), os quais empregaram dois
operons para a assimilação da xilose, sob o controle do promotor de Z.
mobilis piruvato decarboxilase (Ppdc), e, para a metabolização desta pentose,
o promotor enolase (Peno).
Figura 2.21 Mapa do plasmídeo pZMETX. Onde: Ppdc, promotor piruvato
decarboxilase; Peno, promotor enolase; xylA, xilose isomerase; xylB, xilulokinase; talB, transaldolase; tklB/tktA, transquetolase; CmR, gene de resistência ao clorofenicol; ZM27, origem de replicação de Z. mobilis; p15a, origem de replicação de E. coli. Fonte: AGRAWAL et al. (2011).
2.8.2. METABOLIZAÇÃO DA ARABINOSE
Conforme observado no item 2.4.3, a hemicelulose é principalmente
composta por pentoses, em maior proporção a xilose, na maioria dos
materiais lignocelulósicos, no entanto, a arabinose também se apresenta em
níveis significativos. Parker et al. (1995) transformaram a linhagem
ATCC39676 (pZB206), inserindo genes de metabolização desta pentose,
alcançando 25 g/L de etanol; contudo relataram dificuldades na
metabolização deste carboidrato, relacionando-as à baixa afinidade da
proteína transportadora com os mesmos. Na tabela 2.6 observa-se a
comparação do desempenho de diferentes linhagens recombinantes de Z.
mobilis para a produção de etanol a partir da xilose e arabinose.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
61
Tabela 2.6. Comparação do desempenho de diferentes linhagens recombinantes de Z. mobilis para a produção de etanol.
Linhagem Objetivo da T.G. Genes inseridos Fonte de Carbono Condições Etanol Referência
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Metabolização
da xilose XI, XK, TAL, TKT
Hidrolisado de trigo
(6 g/L de glicose,
16 g/L de xilose)
+ 10 g/L de glicose
Temperatura: 30oC
pH: 5
Tempo: 11 h
11 g/L DAVIS
et al. (2005)
Z. mobilis
CP4 (pZB5)
Metabolização
da xilose XI, XK, TAL, TKT
15 g/L de glicose
35 g/L de xilose
Temperatura: 30oC
pH: sem ajuste
Tempo: 69 h
24 g/L ZHANG
et al. (2003)
Z. mobilis
ZW801-4
Metabolização
da xilose XI, XK, TAL, TKT
100 g/L de glicose
80 g/L de xilose
Temperatura: 33oC
pH: 5,8
Tempo: 67 h
7 g/L de acetato
70 g/L CAIMI
et al. (2011)
Z. mobilis
ZM4
Metabolização
da xilose XI, XK, TAL, TKT
45 g/L de xilose
Temperatura: 30oC
pH: 5
Tempo: 40 h
1,2% ácido acético
24 g/L CHEN
et al. (2009)
Z. mobilis
8 b
Metabolização
da xilose XI, XK, TAL, TKT
170 g/L de resíduo de
papel + 1% (v/v) de
hidrolisado de milho
Temperatura: 37oC
pH: 4,8
Tempo: 5 dias
C. E.: 10 FPU/g
40 g/L ZHANG
et al. (2010)
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Metabolização
da xilose XI, XK, TAL, TKT
65 g/L de glicose
65 g/L de xilose
Temperatura: 30oC
pH: 5
Tempo: 48 h
60 g/L JOACHIMSTHAL
et al. (1999)
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
62
Linhagem Objetivo da T.G. Genes inseridos Fonte de Carbono Condições Etanol Referência
Z. mobilis
ZM4 (pZB5)
Metabolização
da xilose XI, XK, TAL, TKT
100 g/L de glicose
100 g/L de xilose
Temperatura: 30oC
pH: 5,75
Tempo: 48 h
90 g/L AGRAWALL
et al. (2011)
Z. mobilis
ATCC 39676
Metabolização de
xilose/
arabinose
XI, XK, TAL e TKT
+
araA, araB, araD
25 g/L de arabinose
25 g/L de glicose
Temperatura: 37oC
pH: -
Tempo: 48 h
20 g/L DEANDA
et al. (1996)
Z. mobilis
206 C (pZB301)
Metabolização de
xilose/
Arabinose
XI, XK, TAL, TKT +
araA, araB, araD
20 g/L de xilose
20 g/L de arabinose
20 g/L glicose
Temperatura: 30oC
pH: -
Tempo: 48 h
19,8 g/L ZHANG
et al. (1998)
Z. mobilis
ZM4/Acr(pZB5)
Metabolização
de xilose/
Resistência ao
acetato
XI, XK, TAL, TKT +
Acr
40 g/L de glicose
40 g/L de xilose
Temperatura: 30oC
pH: 5
Tempo: 53 h
12g/L de acetato
38,6 g/L JEON
et al. (2002)
Z. mobilis
206C (pZB301)
Metabolização de
xilose/
arabinose
XI, XK, TAL e TKT
+
araA, araB, araD
40 g/L de xilose
20 g/L de arabinose
40 g/L de glicose
Temperatura: 37oC
pH: -
Tempo: 48 h
42 g/L MOHAGHEGHI
et al. (2002)
Z. mobilis
ZW705-ara354A7
Metabolização de
xilose/
Arabinose
XI, XK, TAL e TKT
+
araA, araB, araD
50 g/L de glicose
30 g/L de xilose
30 g/L de arabinose
Temperatura: 30-35oC
pH: -
Tempo: 96 h
45 g/L YANG
(2011)
Z. mobilis
MTCC 92
Produção de
endoglucanases pET 20b
4% de bagaço de cana
pré-tratado
Temperatura: 30oC
pH: 7
Tempo: 3 dias
40 g/L VASAN
et al. (2011)
Onde: T.G: Transformação genética; XI: xilose isomerase; XK: xiluloquinase; TAL: transaldolase; TKT: transquetolase; araA: L-
arabionose isomerase; araB: L-ribuloquinase; ara D: L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase; Acr: Mutante tolerante ao acetato.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
63
Posteriormente, Zhang et al. (1998) desenvolveram uma linhagem
recombinante através da adição de genes responsáveis pelo metabolismo de
xilose e de arabinose, tais como: xilose isomerase, xiluloquinase, L-arabionose
isomerase (araA), L-ribuloquinase (araB), L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase (ara
D), transaldolase (talB) e transquetolase (tktA). A produção de etanol ocorreu
em 96 horas (exceto em 47 horas para a xilose), atingindo 91, 55 e 79% de
eficiência de fermentação a partir de 2% (m/v) das seguintes combinações de
açúcares: xilose, arabinose, e xilose/arabinose, respectivamente. Na presença
de xilose, arabinose e glicose, a bactéria recombinante atingiu 79% de
eficiência de fermentação em etanol, durante 48 horas.
Estudos sobre o desenvolvimento da linhagem Z. mobilis ATCC39767,
fermentadora de arabinose e glicose foram realizados por Deanda et al. (1996),
através da inserção dos seguintes genes: L-arabionose isomerase (araA), L-
ribuloquinase (araB), L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase (ara D), transaldolase
(talB) e transquetolase (tktA). Foi alcançado cerca de 20 g/L de etanol, a partir
de 2,5% (m/v) de L-arabinose e 2,5 % (m/v) de glicose. Todavia, 40% das
células perderam sua habilidade após crescimento em meio complexo (KUHAD
et al., 2011). Empregando a mesma linhagem, ATCC39767, Chou et al. (1997)
obtiveram etanol em uma concentração de 33,5 g/L, em meio contendo 30, 30
e 20 g/L de glicose, xilose e arabinose, respectivamente.
Mohagheghi et al. (2002) empregaram a linhagem AX101, que resultou
em uma eficiência de fermentação de 84%, atingindo 42 g/L de etanol a partir
de 100 g/L em meio contendo glicose, xilose e arabinose, durante 48 horas. A
presença de até 4,5 g/L de ácido acético não afetou a fermentação, no entanto,
acima destas concentrações houve acúmulo de xilose, aumento de xilitol,
subproduto na fermentação de xilose, bem como redução da produção de
etanol pela bactéria Zymomonas mobilis.
Cabe ressaltar que, segundo Mohagheghi et al. (2002), o maior
crescimento bacteriano ocorre na presença de glicose, não havendo aumento
significativo na presença de xilose e arabinose, devido à inibição pelo etanol
produzido anteriormente ao consumo dos mesmos. Deanda et al. (1996) já
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
64
haviam reportado sobre tal comportamento, relatando ainda que linhagens
fermentadoras de arabinose e xilose apresentam lentidão em seu crescimento,
assim como utilização incompleta destes carboidratos; todavia, a produção de
biomassa obtida a partir de arabinose apresentou-se semelhante à obtida pela
hexose. Neste contexto, na nova via metabólica há a conversão de 5 moles de
etanol, a partir de 3 moles de L-arabinose, conforme a seguinte equação
estequiométrica:
3 L-arabinose + 3 ADP + 3 Pi 5 etanol + 5 CO2+ 3 ATP + 3 H2O.
2.8.3. PROBLEMÁTICAS
Alguns problemas estão relacionados à transformação genética do
microrganismo Z. mobilis, tais como a resistência a alguns antibióticos (como
estreptomicina e gentamicina), o que pode influenciar quanto à inserção de
marcas de seleção que promovem resistência a tais composto (YANG et al.,
2010), a presença de plasmídeos nativos no citoplasma celular, dificultando a
estabilidade de plasmídeos recombinantes, a não ocorrência de bacteriófagos,
dificultando a transformação através dessa técnica, e, principalmente, o
eficiente mecanismo de reparo deste microrganismo (ZOU et al., 2012).
Adicionalmente, após o desenvolvimento da transformação genética, tal
bactéria também possui algumas dificuldades de metabolização das pentoses,
assim como inibição por algumas substâncias presentes nos meios
hidrolisados, conforme descrito nos itens a seguir.
2.8.3.1. Estabilidade
A estabilidade dos plasmídeos recombinantes é um fator preocupante,
uma vez que estes podem ser perdidos ao longo das inúmeras divisões
celulares, o que proporciona baixa expressão dos genes transformantes
(NORDSTROM, 1985).
Desta forma, Song et al. (2005) avaliaram a estabilidade do
microrganismo Z. mobilis 31821 (pZB5) recombinante, o qual fermenta xilose e
glicose, relatando que após 12 horas de fermentação, os açúcares foram
consumidos em cerca de 90% (m/v), sendo que o consumo exclusivamente da
pentose ocorreu na proporção de 81,9% (m/v). Através da ferramenta de
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
65
simulação, a fração de plasmídeo recombinante (calculada de acordo com
razão entre a taxa de crescimento máximo do plasmídeo original e do
recombinante) foi de 81,0%, após 23 gerações em meio sintético, bem como de
90,3% em meio contendo 20% de hidrolisado hemicelulósico, apresentando
taxa de crescimento máximo de 0,185 h-1. Já após a 26o geração, a taxa de
utilização da xilose, a taxa de consumo dos açúcares totais, o rendimento de
etanol, bem como o consumo de xilose foram reduzidos em 30, 40, 6 e 44%,
respectivamente.
2.8.3.2. Proteína Transportadora
A proteína facilitadora (glf) é responsável pelo transporte de açúcares no
interior das células através de um sistema de difusão facilitada, baixa afinidade
e alta velocidade (WEISSER et al., 1995). Neste contexto, Kim et al. (2010) e
Agrawal et al. (2011), dentre outros pesquisadores reportaram sobre a
problemática da inserção da xilose em células Z. mobilis, afirmando que uma
das soluções para avanços no seu metabolismo seria o desenvolvimento de
genes que codificam para o transporte desta pentose. Cabe ressaltar que
estudos sobre a incorporação dos genes de metabolização deste açúcar na
levedura S. cerevisiae, a qual também não possui transportador específico para
a xilose, demonstraram que tal microrganismo apresenta as mesmas
dificuldades de fermentação que a bactéria em estudo (SEDLAK & HO, 2004).
Provavelmente, após a transformação genética em Z. mobilis, a xilose
dentre outros compostos são transportados pelo fato de serem relativamente
semelhantes à estrutura da glicose e frutose (WEISSER et al., 1996). Tal
fenômeno ainda não foi profundamente estudado, no entanto, pesquisas
apontam por uma competição pela única via de transporte, comum para os dois
carboidratos. Porém, Weisser et al. (1996) inseriram o gene que codifica para a
enzima responsável pelo transporte de glicose e xilose (glf) de Z. mobilis, em
uma colônia mutante de E. coli, a qual possuía deficiência no transporte de
açúcares e diferentemente do reportado com a bactéria em estudo, E. coli
apresentou o transporte eficiente para tal pentose. Chen et al. (2009) também
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
66
reproduziram este experimento, promovendo um aumento de 28 e 42 % no
consumo de glicose e de pentose, respectivamente.
Adicionalmente, estudos de modelagem indicam que uma das causas
relacionadas à dificuldade de metabolização desta pentose está relacionada à
constante de saturação pelo substrato para o crescimento de biomassa, a qual
apresenta-se cerca de 3 vezes maior para o consumo de xilose do que para a
glicose, similar ao comportamento de outros microrganismos recombinantes,
como Saccharomyces cerevisiae (KRISHNAN et al., 1999) e Klebsiella oxytoca
(TURNER et al., 1988), de 3 a 6 vezes maior.
2.8.3.3. Xilose X Glicose
Conforme sinalizado na literatura por Zhang et al. (1995), Krishnan et al.
(2000) e Lawford & Rousseau (2000), a maior produção de etanol ocorre
durante o consumo de glicose e, posteriormente, o consumo de xilose ocorre
mais lentamente. Embora Zhang et al. (1995) tenham engenheirado a linhagem
CP4 de Z. mobilis (pZB5), tornando-a capaz de co-fermentar a xilose e a
glicose, a hexose ainda permanece como açúcar prioritário, promovendo uma
possível repressão catabólica sobre a pentose, diferentemente do metabolismo
de E. coli (LAWFORD et al., 2000).
Este fato ocorre, pois à medida em que os dois carboidratos são
consumidos sequencialmente, a xilose ou fontes não preferenciais de carbono
permanecem inalterados no meio de cultura até a metabolização completa da
glicose, gerando elevadas concentrações de inibidores, como o etanol e ácido
lático, reduzindo a taxa de utilização da xilose. Dessa forma, segundo relatos
de Supple et al. (2000), Joachimshtal & Rogers (1999), Lawford & Rousseau
(1999) e Lawford et al. (1996), no que tange à melhorias na metabolização da
xilose, visando um processo de co-fermentação em escala industrial, tal
pentose deveria ser metabolizada anteriormente à glicose; uma vez que o
etanol promove maior inibição na metabolização da pentose do que quando
comparado à metabolização desta hexose pela bactéria Zymomonas mobilis
recombinante.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
67
Neste contexto, Supple et al. (2000) buscaram pelo isolamento de um
mutante que demonstrasse alteração na fonte de carbono preferencial pela
bactéria Z. mobilis, sendo capaz de metabolizar a xilose anteriormente à
glicose. O mutante CP4 (pZB5) M1-2 apresentou alteração genética nos genes
da glucoquinase (glK) e da proteína facilitadora do transporte de glicose (glf),
atingindo 90% de eficiência de produção de etanol.
A proporção ideal de glicose e xilose utilizadas em um processo
fermentativo por Z. mobilis recombinante varia de acordo com as linhagens
empregadas, uma vez que alguns autores, como Kim et al. (2010) afirmaram
que quando há concentrações semelhantes desses açúcares na fermentação
por tal microrganismo há baixo consumo da pentose (apenas 10%), enquanto a
hexose é completamente consumida. Lau & Dale (2009) também notaram que,
na fermentação empregando estas duas fontes de carbono, apenas de 10 a
20% (m/v) da pentose foi metabolizada por Saccharomyces cerevisiae 424A
(LNH-ST). Os pesquisadores ainda relataram que o transporte de xilose
aumentou em até 85% quando a concentração de glicose era baixa, contudo,
enfatizaram que sem a presença de hexose no meio de cultura não houve
consumo da pentose.
Entretanto, contraditoriamente, Joachimsthal et al. (1999), Rogers et al.
(1997) e Zhang et al. (1995) reportaram que a adição de concentrações
equimolares de glicose e xilose, empregando linhagens de Z. mobilis CP4
(pZB5) e ZM4 (pZB5), CP4(pZB5) e CP4(pZB5), respectivamente, são
favoráveis ao crescimento celular e à produção de etanol por tais linhagens.
Estes acontecimentos podem ser decorrentes de diferenças adaptativas nas
linhagens, pois Lau & Dale (2009) empregaram Saccharomyces cerevisiae
424A (LNH-ST), ao passo que Joachimsthal et al. (1999), Rogers et al. (1997) e
Zhang et al. (1995) utilizaram as linhagens CP4 e ZM4, conforme descrito
anteriormente.
Cabe ressaltar que as células se tornam mais sensíveis com a presença
de etanol quando os dois carboidratos estão presentes no meio do que quando
há apenas a hexose (LEKSAWASDI et al., 2001), o que pode ser causado pela
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
68
formação de subprodutos, ou mesmo pela dificuldade no transporte de xilose.
Outra hipótese para essa problemática seria a possível repressão catabólica da
glicose sobre a pentose, o que torna a rota metabólica mais lenta, afetando
também a produtividade do processo (DiMARCO& ROMANO, 1985; PARKER
et al. 1995; ROGERS & LAWFORD, 1999; LAWFORD et al., 2000;
LEKSAWASDI et al., 2001; MOHAGHEGHI et al. 2002; KIM et al., 2010).
2.8.3.4. Atividades enzimáticas
Estudos recentes de Caimi et al. (2012) reportaram o acúmulo de
ribulose em colônias de Z. mobilis crescidas em xilose. Desta forma, os autores
modificaram geneticamente tal microrganismo, visando aumentar a atividade
de ribose-5-fosfato isomerase, reduzindo o acúmulo deste composto. A
produção de biomassa e de etanol aumentou em 15 e 5% (m/v),
respectivamente, durante 60 horas, empregando 100 g/L de xilose.
De Graaf et al. (1999) alegaram que a baixa expressão de xiluloquinase
poderia justificar a dificuldade de fermentação de xilose pelo microrganismo em
tese, uma vez que a taxa de captação da pentose é de 2 a 3 vezes menor do
que a da glicose. Visando aumentar a conversão deste monossacarídeo em
etanol, Jeon et al. (2005) buscaram por melhorias genéticas através da super-
expressão desta enzima na linhagem ZM4/Acr (pZB5), porém, tal
transformação não promoveu maior conversão em produto. Jim et al. (2003)
citaram que a super-expressão de xiluloquinase em Saccharomyces cerevisiae
promoveu redução do crescimento celular, assim como da produção de etanol.
Já Gao et al.(2002) e Chou et al. (2002) reportaram que as baixas
concentrações de xilose isomerase detectadas na linhagens ATCC 39676
(pZB4L) são os fatores responsáveis pelo lento consumo de xilose. De Graaf et
al. (1999) também sugeriram que XI e XK, provenientes de Klebsiella
pneumoniae, possuem pouca afinidade pela pentose no microrganismo Z.
mobilis. Foi constatado, ainda, que as mesmas enzimas mantinham-se em
baixas concentrações, ao contrário da TKL e TAL, exógenas de E.coli. Neste
contexto, Kahsay et al. (2011) expressaram a xilose isomerase a partir de A.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
69
missouriensis, relatando que a bactéria em estudo apresentou melhores
resultados do que utilizando genes de E. coli, atingindo 26,3 g/L de etanol.
2.8.3.5. Produção de Xilitol
Recentemente, diversos autores relatam a produção de xilitol por Z.
mobilis recombinante, a qual contém genes de metabolização e assimilação da
xilose (KIM et al., 2000; MOHAGHEGHI et al., 2002; JEON et al., 2005;
ZHANG & CHEN, 2009). Viitanem et al. (2008) e Smith et al. (1999) também
afirmaram que a xilose isomerase é inibida pela presença de xilitol em
linhagens de Arthrobacter e de E. coli.
Feldmann et al. (1992) foram os primeiros autores a identificar que a
formação de xilitol durante o metabolismo da xilose por Z. mobilis é um fator
limitante para a produção de etanol. Os estudos detectaram a atividade de
NADPH dependente aldose redutase, capaz de reduzir xilose a xilitol no
presente microrganismo. Segundo Zhang & Chen (2009), a enzima
periplasmática glicose-frutose oxirredutase (GFOR), responsável pela produção
de sorbitol, catalisa também tal reação juntamente com o cofator NADPH,
todavia, pouco se sabe sobre as causas do desvio da rota metabólica.
A enzima GFOR catalisa a redução de xilose através do mecanismo
ping-pong, o qual é inibido na presença de elevadas concentrações de glicose.
Comparativamente, a produção de sorbitol inicia-se em cerca de 2 horas a
partir de frutose/glicose, enquanto que a de xilitol ocorre em 30 horas de
processo a partir da pentose. Devido a menor atividade específica e afinidade
desta enzima no que tange à síntese de xilitol, os níveis alcançados do mesmo
são inferiores aos de sorbitol, porém, o cofator não desassocia-se do produto,
mantendo-se fortemente ligado (Zhang & Chen, 2009).
Adicionalmente, pesquisas recentes de Agrawal & Chen (2011) indicam
a existência da enzima xilose redutase na bacteria Z. mobilis, exibindo 150
vezes mais afinidade com o benzaldeído do que com a xilose. Neste contexto,
o xilitol dá origem ao xilitol-fosfato, dificultando a fermentação mesmo quando
apresenta-se em baixas concentrações (JEON et al., 2005). A produção e o
acúmulo deste resulta na inibição do crescimento microbiano, bem como do
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
70
rendimento em etanol pelas linhagens consumidoras desta pentose (ZHANG &
CHEN, 2009).
2.8.3.6. Inibição pelo Substrato/ Produto
Leksawasdi et al. (2001) desenvolveram um modelo matemático
baseado na cinética de Monod, o qual avalia a produção de etanol a partir de
xilose e glicose em meio sintético, indicando as concentrações limitantes e
inibitórias de substrato e produto. Os autores utilizaram concentrações de 25
g/L, 50 g/L e 65 g/L de glicose e xilose, a partir de resultados reportados por
Lee & Rogers (1983), constatando que o etanol se torna inibitório para o
crescimento celular de Z. mobilis recombinante (linhagem ZM4, pZB5) em
concentrações de glicose e xilose de 57,2 g/L e 56,3 g/L, e para a síntese de tal
produto em concentrações de 75,4 g/L e 81,2 g/L, respectivamente. Segundo
estes estudos teóricos, os substratos promovem interrupção da produção de
biomassa e de etanol nas concentrações de 200 g/L e 186 g/L de glicose,
assim como nas concentrações de 600 g/L e 600 g/L de xilose,
respectivamente. Adicionalmente, Jeon et al. (2002) relataram que 160 g/L é a
tolerância máxima ao etanol por tal linhagem, produzindo 2 moles de
produto/mol substrato.
2.8.3.7. Inibição por Compostos Tóxicos
A eficiência da produção de etanol pelos microrganismos pode ser
afetada devido à presença de substâncias tóxicas presentes na fração
hemicelulósica pré-tratada, assim como em substratos sólidos, conforme
descrito no item 2.7.
Através de análise microscópica foi constatado que concentrações
inibitórias de aldeídos provocam modificações morfológicas na fase de
crescimento exponencial de Z. mobilis. Diferentemente das células normais, as
mesmas apresentaram-se alongadas ou formaram cadeias curtas após o
período de 6 horas. Em 24 horas, as células expostas a concentrações
inibitórias de aldeído se tornam arredondadas (ZALDIVAR et al., 1999). SONG
et al. (2005) também notaram modificações morfológicas na linhagem de Z.
mobilis 31821 após um longo período de adaptação em até 50% (v/v) de
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
71
hidrolisado ácido de madeira. Empregando 20% (v/v) deste material, as
colônias do início do processo adaptativo apresentam-se translúcidas,
mucóides, planas e cilíndricas, ao passo que as aclimatadas possuem
coloração leitosa e superfície curvilínea.
Shahab & Hadi (1995) já haviam demonstrado que o furfural reage com
os pares de base (A-T) nas seqüências de DNA de cadeia dupla, promovendo
ruptura dos filamentos. A redução da taxa de crescimento, da produtividade em
etanol, assim como da síntese de biomassa estão entre os efeitos negativos
produzidos pelo furfural e pelo HMF sobre os microrganismos (TAHEZRADEH,
1999). Conforme observado por diversos autores, a bactéria em estudo possui
baixa tolerância a esses compostos, os quais dificultam a fermentação da
xilose presente no hidrolisado hemicelulósico.
Padilla et al. (2005) investigaram a toxicidade do furfural frente à
produção de etanol e ao crescimento da linhagem CP4 (pZB5) de Z. mobilis
modificada, através da adição de 0,475 g/L e 1,9 g/L deste aldeído no meio de
fermentação. Na primeira condição, os açúcares foram consumidos
integralmente, entretanto, a metabolização dos mesmos foi prejudicada com a
presença de altas concentrações de furfural no meio. Os autores observaram
que os efeitos inibitórios reduziram a produção de biomassa em 30 e 60% e a
produção de etanol em 19 a 76%, respectivamente. Ranatunga et al. (1997)
fizeram avaliação semelhante através da fermentação do hidrolisado ácido de
carvalho, indicando que 0,9 g/L de hidroximetil furfural provoca inibição de 40%
na produção de etanol.
Adicionalmente, estudos realizados por Yang et al. (2010) indicaram que
dentre as diferentes formas de acetato, o acetato de sódio é o mais prejudicial
à bactéria em questão, seguido do acetato de potássio, do acetato de amônio e
do cloreto de sódio. Segundo Kim et al. (2000) e Jeon et al. (2002), elevadas
concentrações destes sais alteram o pH intracelular, modificando o
metabolismo devido à redução dos níveis de nucleosídeos trifosfatos presentes
nas células. Desta forma, apesar de alguns autores, como Lawford et al.
(2001), terem atingido elevada conversão em etanol por linhagens
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
72
recombinantes de Z. mobilis a partir de pentoses, as mesmas ainda
apresentam pouca tolerância frente ao ácido acético e ao etanol (DION et al.,
2003).
2.8.4. ALTERNATIVAS
Visando minimizar o efeito da toxicidade destes compostos inibitórios
nas células, muitos estudos utilizam diferentes linhagens para se obterem
maiores rendimentos em etanol e produtividade volumétrica. Além disso, no
que tange à melhoria do processo metabólico da xilose, existem algumas linhas
de pesquisa que almejam contornar à problemática de conversão deste açúcar
a etanol, conforme detalhado nos itens a seguir.
2.8.4.1. Linhagens adaptadas à toxicidade
Técnicas de engenharia genética também vêm sendo utilizadas para a
obtenção de microrganismos tolerantes a compostos inibitórios presentes no
hidrolisado ácido, como furfural, acetato e lactato. A linhagem Z. mobilis ZM4,
originada da ATCC31821 (JOACHIMSTHAL et al., 1998; YANG et al., 2009),
assim como a CP4, foram isoladas do caldo de cana-de-açúcar; no entanto,
comparativamente, a linhagem ZM4 apresenta melhor performance em etanol
(ZOU et al., 2011). Joachimshtal & Rogers (2000) já haviam comparado a
performance da linhagem ZM4 (pZB5) com a CP4 (pZB5), a partir de 65 g/L de
xilose e 65 g/L de glicose, produzindo 62 g/L e 52 g/L de etanol, em 48 h e 60
h, respectivamente. Contudo, quando as concentrações de carboidratos se
elevam para 75 g/L, a produção mantêm-se em 67 g/L pela linhagem ZM4.
A espécie Z. mobilis ZM4 possui genes com importantes funções
fisiológicas e metabólicas, dentre elas, a tolerância ao acetato de sódio na
concentração de 12 g/L, em temperatura de 30oC e pH (YANG et al., 2010), ao
passo que a linhagem CP4 (pZB5) de Z. mobilis tolera até 9,3 g/L deste sal
(RANATUNGA et al., 1997). Já Kim et al. (2000) reportaram que concentrações
de 10,9 g/L de acetato de sódio afetaram significativamente a fermentação por
tal espécie. Dentre outros compostos inibitórios, o crescimento de Z. mobilis
ZM4 foi mais influenciado negativamente pela presença de vanilina, seguida de
furfural e do HMF, atingindo completo crescimento (até a fase estacionária) em
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
73
21, 19 e 16 horas, respectivamente, ao passo que na ausência destes, a
linhagem cresce em 11 h de fermentação (YANG et al., 2010).
Lawford et al. (2000) avaliaram a co-fermentação através de processo
contínuo por uma linhagem recombinante de Z. mobilis (39676/ pZB4L), que
apresenta boa performance no hidrolisado ácido de madeira. Os pesquisadores
mostraram que 4 g/L de ácido acético não afetou o crescimento celular, que
ocorreu com um fator de rendimento em biomassa de 0,030 g células/g dos
açúcares, promovendo também um aumento do coeficiente de manutenção
energética variando de 0,46-1,0 g carboidratos/g células.h. Por tolerar maiores
concentrações deste composto, a conversão em produto por substrato
consumido foi de 0,47 g/g, a partir de alterações na alimentação do processo
de 4 a 3% (m/v) de xilose e de 0,8 a 1,8% (m/v) de glicose, assim como
reportado por Lawford et al. (1999). Entretanto, quando houve variação do pH 6
para 5, a concentração de biomassa e a produtividade volumétrica reduziram
em 12 e 32%, respectivamente, contudo, a conversão em etanol e a produção
final foram inalteradas, atingindo a concentração de 24 g/L de etanol e 5 g/L de
xilose residual, após 24 horas de fermentação.
Estudos empregando a linhagem ZM4 transformada geneticamente
através da inserção do gene AcR, que a atribui maior resistência ao acetato,
apontam para a tolerância a este inibidor em concentrações de 20 g/L
(JOACHIMSTHAL et al., 1998). Posteriormente, Jeon et al. (2002) empregaram
esta linhagem recombinante (ZM4/Acr), inserindo, também, os genes de
metabolização da xilose (pZB5). A nova bactéria recombinante passou a tolerar
a presença de 12 g/L de acetato, a partir de 40 g/L de glicose e 40 g/L de
xilose, atingindo 38,6 g/L de etanol e 7 g/L de xilose residual após 53 horas de
processo. Recentemente, Zhang & Lynd (2011) reportam que a linhagem 8b
tolera maiores concentrações deste inibidor, em até 16 g/L de ácido acético,
atingindo 87 e 85% de eficiência de fermentação em etanol, em pH 6, nas
temperaturas de 30oC e 37oC, respectivamente, a partir de meio contendo
glicose, xilose e hidrolisado ácido do milho.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
74
2.8.4.2. Redução de cargas enzimáticas no processo SSCF
Visando contornar as questões inibitórias do transporte de pentoses
através do processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas
frente ao microrganismo Zymomonas mobilis recombinante, Olofsson et al.
(2010) desenvolveram uma estratégia simplificada, que se baseava na adição
de baixos níveis de celulases. Dessa forma, ocorria a liberação de baixas
concentrações de glicose ao longo da fermentação, reduzindo a repressão
catabólica por tal açúcar e possibilitando, assim, que o consumo de xilose
aumentasse de 40 a 80%.
2.8.4.3. Modificação genética da glf
Conforme relatado no item 2.8.3, Weisser et al. (1995), Kim et al. (2010),
Agrawal et al. (2011), dentre outros autores, indicaram que células de Z.
mobilis geneticamente transformadas possuem dificuldades metabólicas de
consumir a xilose, sendo uma das hipóteses relacionada à possível competição
entre esta pentose e a glicose frente à uma única proteína transportadora
desses carboidratos. Neste contexto, algumas pesquisas investigam a
transformação genética dos genes que codificam para as proteínas
transportadoras, visando otimizar o desempenho de tal bactéria frente à
inserção e fermentação da xilose. Recentemente, Ren et al. (2009)
modificaram geneticamente o microrganismo E. coli, inserindo o gene
codificador da proteína facilitadora do transporte dos carboidratos (glf) em Z.
mobilis. Os autores inativaram genes responsáveis pela repressão catabólica
em E. coli, promovendo o consumo de 42% de xilose.
2.8.4.4. Inativação da GFOR
Viitanem et al. (2008) desenvolveram a linhagem ZW800, a qual possui
reduzida produção de xilitol, através da inativação do gene que codifica para a
GFOR, um dos mecanismos responsáveis pela síntese deste composto. Os
autores obtiveram a produção de 73,3 g/L de etanol, a partir de 92 g/L de
glicose e 97 g/L de xilose, na presença de 7,2 g/L de acetato, bem como 10
mM de sorbitol. No entanto, apenas 30 g/L de xilose foram consumidas durante
o período de 50 horas.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
75
2.8.4.5. Adaptação Metabólica
Diversos autores reportaram a técnica de adaptação metabólica, Fong et
al. (2003), Kuyper et al. (2005), Rosemberg, (2001), Meijnem et al. (2008),
dente outros. Segundo Portnoy et al. (2011), o processo de adaptação
metabólica promove aclimatação a diferentes condições ambientais, ativação
das vias metabólicas, melhorias na utilização de substratos, eleva as
concentrações de produto, proporciona maiores valores de produtividade e
rendimento em produto, dentre outros benefícios.
Nghuyem et al. (1996) realizaram esta técnica adaptativa através de um
longo período de cultivo contínuo da bactéria Z. mobilis no hidrolisado ácido de
madeira, o que proporcionou redução da sensibilidade celular a componentes
inibitórios presentes no meio hidrolisado. Recentemente, Yanase et al. (2007)
também reportaram melhorias na espécie Zymobacter palmae após
aclimatações sucessivas, reduzindo o tempo de processo de 5 dias a 8 horas,
a partir de 40 g/L de glicose e 40 g/L de xilose.
Kim et al. (2010) e Agrawal et al. (2011) também sugeriram a utilização
da adaptação metabólica sequencial, na qual houve adição de xilose e glicose
em diferentes concentrações. Através desta técnica, Agrawal et al. (2011)
contornaram o desvio da via das pentoses para xilitol, elevando a produção de
etanol pela linhagem ZM4 (ATCC 31821) em até 90 g/L, a partir de 100 g/L da
pentose e 100 g/L da hexose, no período de 48 horas.
2.8.4.6. Integração Cromossomal
A integração cromossomal de genes responsáveis pela metabolização
de xilose é outra questão a ser avaliada, a qual promove maior estabilidade às
células (MATSUSHIKA et al., 2009). Desta forma, a construção do transposon
pXt contendo os genes XI, XK, TAL, TKL, bem como a integração destes no
genoma da bactéria Zymomonas mobilis ZM-mtc9xt foi investigada por Zhou et
al. (2011). Os pesquisadores relatam a produção de etanol em 98, 3 g/L e 24,1
g/L a partir de 23% (m/v) de glicose e 6% (m/v) de xilose, respectivamente;
misturas de pentose e hexose nas concentrações de 6% (m/v) 17% (m/v),
respectivamente, reduziram a produção para 88,9 g/L de etanol.
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
76
2.8.5. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA PARA DIFERENTES FINALIDADES
Além da incorporação de genes que codificam para a atividade de XI,
XK, TAL e TKL em Z. mobilis, pesquisas reportam a modificação genética para
outras finalidades.
São vários os relatos de melhoria da bioconversão da celulose através
de microrganismos procariotos geneticamente modificados. Yanase et al.
(2005) estudaram a inserção de genes que codificam a enzima β-glucosidase
de Ruminococcus albus em Z. mobilis, transferindo-lhe a habilidade de
fermentar a celobiose proveniente de materiais lignocelulósicos, atingindo
cerca de 10 g/L de etanol.
Linger et al. (2010) avaliaram a inserção de genes responsáveis pela
síntese de celulases heterólogas, e sugeriram que a bactéria Z. mobilis seria
capaz de expressar e excretar altos níveis dessas enzimas, podendo
futuramente ser empregada na concepção tecnológica do Bioprocesso
Consolidado. Vasan et al. (2011) também realizaram tais estudos, alcançando
0,134 FPU/mL de celulases e 5,79 IU/mL de endoglucanases, no entanto, as
mesmas armazenaram-se, em sua maior proporção, no espaço periplasmático
das células. Os autores realizaram experimentos utilizando a linhagem
recombinante MTCC92, produzindo 12% (m/v), 5,5% (m/v) e 4% (m/v) de
etanol, a partir de glicose, CMC e 4% de bagaço de cana pré-tratado,
respectivamente.
Kaczowka et al. (2005) estudaram sobre a incorporação do gene que
codifica para a enzima piruvato descarboxilase proveniente de Z. mobilis, no
microrganismo Haloferaz volcanii, pertencente ao grupo Archaea. Tal grupo
possui características e propriedades fisiológicas que permitem o crescimento
em altas concentrações de sal, temperatura e pH, tornando-o hábil para a
produção de etanol sob condições extremas.
Kazuyoshi et al. (1991) transformaram o microrganismo Klebsiella
oxytoca, inserindo-lhes genes responsáveis pela codificação da enzima
piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase da bactéria Zymomonas
mobilis, alcançando 40 g/L de etanol e rendimento de 0,48 g produto/ g de
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
77
xilose, assim como de 0,50 g produto/ g glicose. Wood & Ingram (1992)
também empregaram a bactéria Klebsiella oxytoca, previamente engenheirada
com os genes de Zymomonas mobilis, bem como genes de C. thermocellumm,
responsáveis pela síntese de etanol e codificação de endoglucanases
(permitindo a degradação de celulose), respectivamente, atingindo 45,2 g/L de
etanol e produtividade volumétrica de 1,5 g/L.h a partir de 1% (m/v) de
celobiose.
2.9. CONSIDERAÇÕES GERAIS
A bactéria Zymomonas mobilis possui características únicas dentre os
microrganismos fermentativos, apresentando crescimento, produção de energia
e resposta às condições de cultura extremamente peculiares, causando um
grande interesse no mundo científico, biotecnológico e industrial. O excêntrico
comportamento desta bactéria, que possui habilidade em acoplar e desacoplar
a produção de energia a favor da formação do produto, além de possuir
comportamentos oscilatórios, permitindo a interação entre a taxa de
crescimento celular e a produção de etanol; capacidade de responder a
alterações físicas e químicas do meio ambiente, bem como sua diversidade na
formação de produtos, torna-a um microrganismo ideal para o estudo e
desenvolvimento de processos levados a cabo por agentes microbianos
(ELNASHAINE et al., 2006).
No entanto, o potencial de utilização industrial de Z. mobilis declinou
após a constatação de que o rendimento desta bactéria era inferior ao
apresentado pela levedura Saccharomyces cerevisiae quando a fermentação
ocorria em melaço e caldo de cana. Na presença de sacarose, a bactéria
sintetiza dois subprodutos, a levana e o sorbitol, diminuindo significativamente
a produção de etanol. Concluiu-se que a utilização da bactéria Z.mobilis não
era vantajosa quando o substrato era a sacarose, embora, visando melhorias
na produção de etanol, o uso de invertase para a hidrólise deste substrato vem
sendo estudado (LEE & HUANG, 2000). Atualmente, a levedura S. cerevisiae é
o microrganismo mais utilizado industrialmente para a produção de etanol,
contudo, a questão da escolha de tecnologias mais apropriadas necessite de
CAPÍTULO 2: Revisão Bibliográfica
Danielle da Silveira dos Santos
78
maiores análises, uma vez que há muitas divergências em relação ao
microrganismo adequado para a produção de etanol.
Quando o substrato é a glicose, Zymomonas mobilis apresenta
vantagens competitivas em relação à levedura, pois a bactéria possui elevadas
taxas de produção, facilidade de manipulação genética, dentre outras
vantagens, tornando relevante o estudo deste microrganismo como uma
alternativa promissora na cadeia produtiva do bioetanol. Visando promover
também a conversão da xilose proveniente da fração hemicelulósica a etanol,
Zhang et al. (1995) iniciaram importantes avanços na engenharia genética de
Z. mobilis, uma vez que tal bactéria, naturalmente ocorrente, não possui a
habilidade de fermentar esta pentose. Todavia, conforme relatado por diversos
autores, o mecanismo gênico desta bactéria não regula corretamente a
expressão dos genes inseridos, XI, XK, TAL e TKT. Desta forma, a
fermentação deste carboidrato ainda é o foco de diversas pesquisas, pois a
habilidade de metabolização da xilose é considerada baixa quando comparada
com a da glicose (GAO et al., 2002; JEON et al., 2005).
Sumariamente, a estratégia concebida para a elaboração do presente
trabalho foi realizar o pré-tratamento químico no bagaço de cana-de-açúcar,
sob condições moderadas, seguido do desenvolvimento de diferentes
processos de bioconversão, denominados de processo SSF (Simultaneous
Saccharification and Fermentation) e SSCF (Simultaneous Saccharification and
Co-Fermentation). A bactéria Z. mobilis apresenta resultados promissores no
que tange à conversão de glicose oriunda da fração celulósica, através do
processo SSF, no entanto, poucos estudos reportaram sobre o emprego do
bagaço de cana como matéria-prima para a produção de etanol por tal bactéria
através dessa tecnologia. O processo de SSCF, considerado um
aperfeiçoamento do processo anterior, necessita de um microrganismo capaz
de consumir ambos os açúcares presentes neste material lignocelulósico.
Neste contexto, com o intuito de conferir ao microrganismo Z. mobilis as
características necessárias para fermentar ambos açúcares, a xilose oriunda
da fração hemicelulósica e a glicose oriunda da fração celulósica, é necessária
a intervenção da engenharia genética e metabólica.
CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos
Danielle da Silveira dos Santos
79
_____________________CAPÍTULO 3
JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
3.1. JUSTIFICATIVAS
A cana-de-açúcar é largamente produzida no Brasil e fornece a principal
fonte de carboidratos fermentáveis para produção de etanol, embora apenas
um terço da biomassa contida no vegetal é, atualmente, empregado para a
produção deste biocombustível. A utilização de materiais lignocelulósicos como
a palha da cana e o bagaço, um dos principais resíduos agroindustriais
gerados em nosso país, desponta como solução para se aumentar o
rendimento da produção de álcool em relação à matéria-prima, sem que haja a
necessidade de se expandir a área de plantio, favorecendo toda a cadeia
produtiva e preservando o meio ambiente.
O novo conceito de produção de etanol está associado a sua obtenção a
partir da biomassa lignocelulósica, após hidrólise completa das frações
polissacarídicas. Neste panorama, faz-se evidente a importância de
desenvolvimentos de estratégias para a produção de etanol do bagaço de
cana, visto que este resíduo possui alto conteúdo de celulose, que pode ser
CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos
Danielle da Silveira dos Santos
80
hidrolisada para a produção de glicose e, posteriormente, possa ser
fermentada, através do processo de hidrólise enzimática simultânea à
fermentação.
O gênero bacteriano Zymomonas possui uma especial habilidade para a
produção de etanol, apresentando-se como uma alternativa atraente à atual
demanda mundial por petróleo. Quando este microrganismo é comparado com
a tradicional levedura, Saccharomyces cerevisiae, verifica-se uma maior taxa
especifica de produção de etanol, facilidade de manipulação genética, e menor
produção de biomassa. Conforme observado em trabalhos anteriores, a
bactéria Zymomonas mobilis mostra-se extremamente atraente para a
produção de etanol combustível de segunda geração a partir de glicose
proveniente da fração celulósica, em virtude de sua elevada capacidade de
absorção de glicose, altas taxas específicas de produção de etanol, resultando
em elevados valores de produtividade. No entanto, as linhagens naturalmente
ocorrentes mostraram-se incapazes de metabolizar um outro açúcar importante
encontrado nas biomassas de composição lignocelulósica, a xilose oriunda da
fração hemicelulósica.
A experiência aliada à grande competência instalada na produção de
bioetanol de segunda e terceira gerações pelos Laboratórios de
Desenvolvimento de Bioprocessos da Escola de Química da UFRJ, com
colaboração do Laboratório de Biologia Molecular da UnB, especializado em
estudos de engenharia genética, criam o ambiente favorável para a realização
de experimentos, empregando o microrganismo Z. mobilis, naturalmente
ocorrente e recombinante, como agente de processo. Consequentemente,
ampliam-se as possibilidades para que, no futuro, o país fabrique em larga
escala produtos biotecnológicos de grande interesse industrial.
Neste contexto, buscando pelo aproveitamento integral bagaço de cana-
de-açúcar, o presente trabalho visa investigar a construção de uma linhagem
recombinante de Z. mobilis, através da incorporação de genes responsáveis
pela metabolização desta pentose; assim como avaliar o desempenho da
linhagem nativa quanto à conversão da glicose oriunda da fração celulósica.
CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos
Danielle da Silveira dos Santos
81
Portanto, faz-se evidente a importância do desenvolvimento de um
projeto sobre esta temática, envolvendo baixos custos e altas produtividades. A
seguir, o objetivo geral e objetivos específicos foram traçados:
3.1. OBJETIVO GERAL
Dentro do contexto apresentado acima, o objetivo geral do presente
trabalho consiste em investigar a produção de etanol de segunda geração por
Zymomonas mobilis CP4 naturalmente ocorrente e recombinante, a partir da
fermentação do bagaço de cana-de-açúcar, através da conversão de xilose
(hemicelulose) e glicose (celulose), respectivamente.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o desempenho de duas linhagens naturalmente ocorrentes de
Zymomonas mobilis, AG11 e CP4, face à utilização de dois açúcares
abundantes (glicose e xilose) no bagaço de cana;
Otimizar o processo de hidrólise enzimática com preparados comerciais,
simultânea à fermentação com a linhagem selecionada a partir de bagaço de
cana-de-açúcar (SSF), através de análise de superfície de resposta mediante
experimentos multivariados;
Avaliar a adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico
do bagaço de cana para a produção de etanol por Z. mobilis através de
planejamento experimental;
Reproduzir os resultados obtidos no planejamento experimental em
biorreator instrumentado, com as variáveis significativamente mais favoráveis à
produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar (SSF) segundo os
experimentos conduzidos em frascos agitados;
Otimizar o processo de hidrólise enzimática com preparados comerciais
simultânea à fermentação com a linhagem selecionada a partir de resíduos da
indústria de celulose através de análise de superfície de resposta mediante
experimentos multivariados;
Avaliar a adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico
CAPÍTULO 3: Justificativas e Objetivos
Danielle da Silveira dos Santos
82
de resíduos da indústria de celulose para a produção de etanol por Z. mobilis
através de planejamento experimental;
Reproduzir os resultados obtidos no planejamento experimental em
biorreator instrumentado, com as variáveis significativamente mais favoráveis à
produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose, segundo os
experimentos conduzidos em frascos agitados;
Construir uma linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4 com
habilidade de fermentar pentoses (C5), através da incorporação de genes que
codificam a atividade de xilose isomerase, xiluloquinase, transquetolase e
transaldolase;
Selecionar clones que apresentassem maior produção de etanol, bem
como crescimento de biomassa celular a partir de glicose e xilose;
Estudar uma estratégia de adaptação metabólica para propagação celular
em meio sintético contendo diferentes concentrações de glicose e xilose;
Estudar uma estratégia para propagação celular em meio contendo
hidrolisado com alto teor de xilose (aclimatação celular);
Investigar a viabilidade da realização de um processo simultâneo de
hidrólise enzimática de celulose e co-fermentação (SSCF), abordando o
desempenho da linhagem face à utilização de diferentes concentrações de
celulignina e de hidrolisado ácido provenientes do bagaço de cana, através de
análise de superfície de resposta mediante experimentos multivariados;
Reproduzir os resultados obtidos no planejamento experimental em
biorreator instrumentado, com as variáveis significativamente mais favoráveis à
produção de etanol a partir de bagaço de cana-de-açúcar, bem como do
hidrolisado hemicelósico (SSCF), segundo os experimentos conduzidos em
frascos agitados.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
83
_____________________CAPÍTULO 4
MATERIAIS E MÉTODOS
Neste capítulo são apresentados os materiais e as metodologias
utilizadas para a execução do presente trabalho. Foram estabelecidos:
crescimento e manipulação do microrganismo naturalmente ocorrente e
recombinante. A metodologia experimental utilizada para obtenção de etanol foi
desenvolvida, inicialmente, através de frascos agitados com posterior
reprodução das condições ótimas em biorreator instrumentado, através das
tecnologias SSF e SSCF. Para a otimização do processo foram empregados
planejamentos experimentais, através de análise de superfície de resposta
mediante experimentos multivariados.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
84
4.1. MATÉRIA-PRIMA
4.1.1. BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
O bagaço de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), utilizado no presente
trabalho, foi gentilmente cedido pela Destilaria Costa Pinto (SP-Brasil). Esta
biomassa de composição lignocelulósica foi inicialmente secada a 60oC em
estufa ventilada por 12 horas. Em seguida, a mesma foi cominuída e
acondicionada em sistemas herméticos para posterior uso.
4.1.2. RESÍDUO DA INDÚSTRIA DE CELULOSE
O resíduo de papel, utilizado no presente trabalho, consiste na polpa
coletada após a deslignificação na indústria de celulose. Nesta etapa do
processamento, a polpa proveniente do cozimento é submetida a uma
deslignificação com oxigênio a fim de remover o conteúdo de lignina da polpa
que alimenta a planta de branqueamento e enviar a lignina dissolvida de volta ao
sistema de recuperação.
A biomassa residual da indústria de celulose foi gentilmente cedida pela
empresa ARACRUZ Celulose e codificada como PM2, a qual contém 79,4% de
celulose, 15,1% de hemicelulose e 1,8% de lignina (SILVA, 2009). Dessa forma,
diferentemente do bagaço, não foram necessárias execuções de pré-
tratamentos químicos, apenas lavagens em água destilada e ajuste do pH para 5
(adição de H2SO4, 1M; ou NaOH, 1M, se necessário).
4.2. PRÉ-TRATAMENTOS DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
4.2.1. PRÉ-TRATAMENTO ÁCIDO
O pré-tratamento ácido foi realizado para desorganizar a matriz
lignocelulósica e remover a fração hemicelulósica. As condições para a
realização do pré-tratamento ácido foram as preconizada por Betancur (2010) e
detalhadas a seguir: concentração de H2SO4, 1,09% (v/v); relação sólido-líquido
1:2.8 (g/ml); temperatura de 121oC e tempo de exposição de 27 minutos em
autoclave. A hemicelulose (fase aquosa) foi retirada utilizando uma prensa
hidráulica, através de um procedimento de filtração simples do meio pré-tratado;
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
85
sendo a fase sólida denominada de celulignina, em função da sua composição
majoritária em celulose e lignina. As etapas descritas para a obtenção do
hidrolisado hemicelulósico podem ser visualizadas na figura 4.1.
Figura 4.1. Etapas do pré-tratamento ácido: bagaço in natura (a), peneiração do
bagaço (b), exposição do bagaço ao ácido (c), distribuição em frascos (d), tratamento térmico em autoclave (e), distribuição em prensa hidráulica (f), prensagem para separação do bagaço acidificado (celulignina) (g).
A figura 4.2 ilustra o bagaço de cana-de-açúcar in natura e após remoção
da fração hemicelulósica. A lignina manteve-se mais concentrada após a etapa
de pré-tratamento ácido, fazendo com que a coloração do sólido residual
passasse a ser mais escura, quando comparada ao bagaço in natura (Figura
4.2. A).
Figura 4.2. Bagaço de cana-de-açúcar in natura (A); Bagaço de cana-de-açúcar
após pré- tratamento ácido (Celulignina) (B). O hidrolisado, licor resultante deste processo (hemicelulose), teve seu pH
corrigido para 5 mediante a adição de Ca(OH)2 sob banho de água e gelo, para
evitar o aquecimento gerado em excesso durante este procedimento. Em
A B C
D E F G
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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86
seguida, a solução contendo cerca de 80 g/L de xilose, foi filtrada a vácuo,
buscando retirar o precipitado formado, resultando no material desejado para ser
utilizado como base do meio de fermentação (FOGEL, 2005).
4.2.2. PRÉ-TRATAMENTO ALCALINO
Este pré-tratamento alcalino se faz necessário para aumentar a
acessibilidade das enzimas às fibras celulósicas (BARCELOS et al., 2012).
Dessa forma, a celulignina foi submetida à deslignificação com uso de solução
de NaOH a 4% (m/v), na relação sólido-líquido de 1:20 (VÁSQUEZ, 2007) e
submetida a tratamento térmico (121oC por 30 minutos) em autoclave (Figura
4.3).
Figura 4.3. Etapas do tratamento alcalino: celulignina de bagaço de cana após pesagem (a), tratamento alcalino com NaOH diluído (b), separação em prensa hidráulica após tratamento em autoclave (c), celulignina obtida/licor alcalino (d).
Posteriormente, sequências de lavagens com água destilada foram feitas,
no que tange à remoção da alcalinidade intersticial na matriz sólida e extração
da lignina residual, até que a água descartada fosse clara, constatando-se a
máxima remoção da lignina nas condições impostas (Figura 4.4).
Figura 4.4. Fração líquida após pré-tratamento alcalino do bagaço de cana (A), sequência de lavagens com água destilada para a remoção da lignina residual (B- E).
A B C D
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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87
4.2.3. PRÉ-HIDRÓLISE ENZIMÁTICA
Após os pré-tratamentos químicos com ácido e base diluídos, foi realizada
a etapa de pré-hidrólise enzimática, na qual a celulose pôde ser convertida a
açúcares fermentáveis. Dessa forma, a celulignina pré-tratada alcalinamente e
lavada com água destilada foi submetida à hidrólise enzimática com uso de um
preparado celulásico comercial (Multifect, Genencor, USA), que continha
atividade FPásica de 100 FPU/mL. A atividade enzimática foi determinada em
papel de filtro, como recomendado por Ghose (1987) e expressa como FPU
(Filter Paper Units) por mililitro da mistura. O experimento foi desenvolvido
utilizando-se diferentes valores de cargas enzimáticas, que estão apresentados
nas tabelas 4.4 e 4.5, do item 4.3.3.2. A temperatura foi mantida em 50oC,
durante 12 horas para o bagaço de cana e para o resíduo da indústria de
celulose.
Na figura 4.5, observa-se um cromatograma típico da pré-hidrólise
enzimática, no qual se percebe a alta concentração de glicose (tempo de
retenção de 11,07 min), resultante da ação das enzimas do complexo celulásico.
Em menor proporção, observa-se, ainda, a presença de celobiose (tempo de
retenção de 9,536 min) e de outras substâncias que não foram identificadas,
mas que, provavelmente, referem-se à presença de celo-oligosacarídeos.
Figura 4.5. Perfil cromatográfico típico do hidrolisado celulósico pré-tratado
enzimaticamente.
4.3. A BACTÉRIA Zymomonas mobilis NATIVA
Neste trabalho foram empregadas duas linhagens nativas de Zymomonas
mobilis, AG11 e CP4, as quais foram gentilmente cedidas pelo Departamento de
Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco. Posteriormente, no item
8,1
67
8,1
97
9,2
47
celu
bio
se -
9,5
36
10,3
28
glic
ose -
11,6
76
12,6
69
37,0
08
mV
20,00
40,00
60,00
80,00
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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88
4.4, foram empregadas técnicas de biologia molecular no que tange à
transformação da linhagem CP4, seguidas de ensaios de fermentação.
Após o crescimento bacteriano nos meios de cultura foram retiradas
amostras assepticamente com auxílio de uma alça de platina e, então, foram
preparados esfregaços em lâminas para posterior coloração, segundo o método
Gram. As lâminas com material microbiano foram analisadas em microscópio
binocular com aumento de 1000x. Na figura 4.6 (A e B) observa-se a diferença
entre as duas linhagens nativas, ressaltando o caráter floculante da linhagem
CP4 (Fig. 4.6 A e Fig. 4.7).
Figura 4.6. Microscopia das linhagens de Z. mobilis (aumento de 1000x). As lâminas foram coradas pelo método Gram, mostrando que a bactéria apresenta-se como gram negativa. (A) Linhagem CP4 e (B) Linhagem AG11.
Figura 4.7. Linhagem floculante de Zymomonas mobilis CP4 crescida por 24
horas em meio de cultura.
4.3.1. MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE Z. mobilis
As culturas foram preservadas a 4°C, após crescimento em tubos tipo
Falcon, incubados em estufa a 30°C por 24 horas em meio líquido, contendo
glicose (20 g/L) e extrato de levedura (5 g/L) (SWING & DE LEY, 1977). As
linhagens de Z. mobilis foram repicadas mensalmente.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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89
O microrganismo também foi mantido em ágar inclinado e em placa de
petri, empregando o meio Swing & De Ley (SDL), e armazenado a 4ºC, após ser
incubado em estufa com temperatura controlada de 30oC durante
aproximadamente 48h (SWING & DE LEY, 1977). A composição do meio
agarizado está descrita na tabela 4.1. Com a finalidade de manter as células
ativas para a realização dos diferentes experimentos, repiques periódicos a partir
do cultivo original foram realizados a cada três meses em câmara asséptica.
Tabela 4.1. Meio de manutenção de Z. mobilis.
Nutrientes Concentração (g/L)
Glicose 20
Extrato de levedura 2,5
Agar 20
4.3.2. PRÉ- INÓCULO E INÓCULO: COMPOSIÇÃO DE MEIO E CONDIÇÕES DE CULTIVO
A tabela 4.2 apresenta a composição do meio de cultivo, adaptado de
Neto et al. (2005), o qual foi utilizado no preparo do pré-inóculo e do inóculo
para os ensaios de fermentação com as linhagens nativas.
Tabela 4.2. Meio de crescimento de Z. mobilis.
Nutrientes Concentração (g/L)
Glicose 20
Extrato de levedura 2,5
(NH4)SO4 1
KH2PO4 0,5
MgSO4. 7H20 0,5
Os meios de cultura foram autoclavados por 15 min., sob pressão de 0.5
kgf/cm2 e temperatura de 120ºC. A solução de glicose foi esterilizada
separadamente dos outros componentes, de modo que esta representasse 50%
do volume total e a solução de glicose os 50% restantes. Cabe ressaltar que
toda vidraria utilizada nos experimentos também foi esterilizada em autoclave
durante 20 minutos, sob pressão de 1 kgf/cm2 e temperatura de 120ºC, seguida
de secagem em estufa de esterilização Mod. FIC. 05. FAMO (50 a 60 ºC).
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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90
O pré-inóculo foi preparado em tubos tipo Falcon de 50 mL com 20 mL de
volume de meio de crescimento, acrescentado de 2 mL de meio líquido de
manutenção cultivado com a bactéria. Os meios foram incubados a 30oC por 20
horas, sem agitação.
No preparo do inóculo foram utilizados frascos cônicos de 500 mL. O
volume de trabalho foi de 200 mL de meio de crescimento, adicionado do volume
total de cada tubo Falcon (20 mL) do pré-inóculo. O inóculo foi incubado na
temperatura de 30oC, por 20 horas, sem agitação. Ao final da etapa de
propagação, procedeu-se à quantificação de células e posterior cálculo do
volume a ser centrifugado, visando obter as concentrações celulares pretendidas
para se inocular nos posteriores experimentos de fermentação (item 4.4.3.2).
4.4.3. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO
A tabela 4.3 apresenta um esquema geral, visando facilitar a
compreensão das etapas definidas para frascos agitados no que tange à
produção de etanol por Z. mobilis AG11 e CP4 nativas.
Inicialmente, foram desenvolvidos experimentos preliminares, nas etapas
1 e 2; nas etapas 3 e 4 foram avaliadas diferentes condições do processo SSF a
partir de bagaço de cana e resíduos da indústria de celulose como substrato
para a produção de etanol, através de planejamentos de superfície de resposta.
Tabela 4.3. Experimentos sequenciais avaliando a bactéria Zymomonas mobilis
naturalmente ocorrente frente à produção de etanol.
Experimentos preliminares
1 Desempenho das linhagens AG11 e CP4 nativas utilizando glicose e xilose
Otimização através de Planejamentos de Superfície de resposta
2 Otimização do SSF através de análise de superfície de resposta
3 Avaliação da adição de nutrientes complementares ao hidrolisado celulósico
Onde: meio sintético (1), bagaço de cana e resíduo da indústria de celulose (2-3); S:L= sólido: líquido.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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91
4.4.3.1. Desempenho das linhagens nativas frente à utilização de glicose e xilose
Inicialmente, para se verificar/avaliar a capacidade de utilização de glicose
e xilose, foram realizados experimentos em meios quimicamente definidos com
as linhagens nativas de Z. mobilis AG11 e CP4, analisando-se o consumo de
substrato, produção de etanol e crescimento celular, bem como as variáveis de
resposta dos cultivos (produtividade volumétrica em etanol e taxa específica de
crescimento). Esses experimentos foram realizados em frascos cônicos de 500
mL com 200 mL de meio contendo glicose e xilose, separadamente, nas
concentrações de 20 g/L, sendo as concentrações dos outros nutrientes e as
condições operacionais as mesmas daquelas utilizadas no preparo do inóculo,
descritas anteriormente (item 4.3.2).
Este ensaio foi de fundamental importância, pois em função dos
resultados se poderia inferir em relação à estratégia mais adequada para a
produção de etanol com as linhagens bacterianas. Isto é, caso se constatasse a
capacidade das linhagens nativas em consumir ambos os açúcares, o
aproveitamento da fração hemicelulósica (rica em xilose) seria incorporado em
nosso planejamento experimental; no caso de não haver metabolização desse
açúcar, a transformação genética seria recomendada para posteriores ensaios
envolvendo misturas de xilose e glicose pela linhagem recombinante ( item
4.4.2).
4.4.3.2. Produção de etanol a partir do bagaço de cana e resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis nativa através do processo SSF
A fração sólida residual dos pré-tratamentos do bagaço de cana, assim
como os resíduos da indústria de celulose (PM2) possuem um alto conteúdo de
celulose, que pode ser utilizada para a obtenção de etanol por fermentação
mediante técnicas que possibilitem o aproveitamento de glicose contida nos
resíduos. Entre as técnicas que poderiam ser avaliadas encontram-se a hidrólise
enzimática e a aplicação do processo SSF (Simultaneous Saccharification and
Fermentation).
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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92
Após 12 horas de pré-hidrólise enzimática do bagaço de cana de PM2
(VÁSQUEZ, 2007), a cinética do processo SSF foi avaliada em frascos cônicos
de 500 mL contendo 200 mL de meio de fermentação, que apresentava a
mesma composição do meio de propagação, com exceção da adição de glicose,
que foi substituída pelo pré-hidrolisado da celulose, rico neste açúcar. A
fermentação ocorreu por aproximadamente 48 horas, com diferentes
concentrações de inóculo (relatado a seguir), na temperatura de 30oC,
velocidade de agitação de 150 rpm, com amostragens de 2 mL a cada 3 horas.
O consumo de substrato e a formação de produto foram acompanhados durante
o tempo necessário, para verificar o esgotamento da fonte de carbono.
Sumariamente, os experimentos de hidrólise e sacarificação simultâneas
foram desenvolvidos através da construção de três planejamentos experimentais
empregando-se o bagaço de cana. No primeiro ensaio visou-se as condições
ótimas do processo SSF e no segundo avaliou-se a adição de diferentes
nutrientes no meio hidrolisado celulósico do bagaço. Foram desenvolvidos dois
planejamentos experimentais empregando-se o PM2, referentes à determinação
das condições ótimas do SSF, assim como a avaliação da adição de diferentes
nutrientes no meio hidrolisado celulósico.
III. Otimização da produção de etanol a partir de bagaço de cana e PM2 por Z. mobilis CP4 nativa
No presente trabalho, os planejamentos experimentais que aplicaram os
princípios da metodologia estatística de superfície de resposta objetivaram
avaliar os efeitos agregados de variáveis com a finalidade de determinar as
condições ótimas para sistemas com multivariáveis (BOX, 1978). Nesta etapa,
além dos níveis inferiores e superiores apresentados na matriz usada no
Planejamento anterior, foram feitos o acréscimo dos pontos axiais para obtenção
da curvatura de máximo absoluto.
Desta forma, foi construído um planejamento experimental completo 23,
com 6 pontos axiais e 6 repetições do ponto central, totalizando 20
experimentos. Os parâmetros analisados foram a relação sólido:líquido
(celulignina pré-tratada alcalinamente:meio), carga enzimática e concentração
celular, conforme a matriz apresentada nas tabelas 4.4 e 4.5. As variáveis de
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
93
respostas escolhidas foram: glicose inicial do SSF, concentração final de etanol
e produtividade volumétrica.
Tabela 4.4. Variáveis independentes do planejamento experimental central composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e concentração celular (g/L), avaliando a produção de etanol, produtividade volumétrica, bem como a glicose inicial do processo SSF utilizando o bagaço de cana.
Tabela 4.5. Variáveis independentes do planejamento experimental central
composto: relação sólido:líquido (g:mL), carga enzimática (FPU/g) e concentração celular (%), avaliando a produção de etanol a partir do processo SSF utilizando o resíduo da indústria de celulose.
Uma vez que ensaios prévios utilizando as mesmas concentrações de
células empregadas no planejamento utilizando o bagaço de cana não
resultaram em bom desempenho do microrganismo frente à utilização do resíduo
da indústria de celulose; posteriormente, ao estruturarmos o planejamento
referente ao resíduo da indústria de celulose, as células não foram adicionadas
no processo através de centrifugação.
IV. Análise da adição de diferentes componentes do meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e PM2 frente à produção de etanol a partir por Z. mobilis CP4 nativa
Foram desenvolvidos planejamentos sequenciais no intuito de verificar o
efeito estimado dos seguintes componentes do meio de fermentação, extrato de
levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, para obtenção de etanol a partir
do processo SSF por Z. mobilis. Inicialmente, foi realizado um Planejamento
Experimental Fatorial 24 empregando o bagaço de cana, o qual promoveu o total
de 19 experimentos (16 experimentos e 3 pontos centrais) (Tabela 4.6).
PARÂMETROS Níveis
- - 0 + +
A Relação Sólido:líquido (g:mL) 0,32:10 1:10 2:10 3:10 3,68:10
B Carga Enzimática (FPU/g) 4,89 10 17,5 25 30,11
C Concentração Celular (g/L) 0,02 1 2,5 4 5,02
PARÂMETROS
Níveis
- - 0 + +
A Relação Sólido:líquido (g:mL) 0,32:10 1:10 2:10 3:10 3,68:10 B Carga Enzimática (FPU/g) 4,89 10 17,5 25 30,11
C Concentração Celular (g/L) 1,59 5,80 10 14,21 18,41
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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94
O planejamento fatorial geralmente foi escolhido por ser o mais
apropriado na determinação dos efeitos lineares das variáveis, sendo os efeitos
da curvatura e das possíveis interações excluídos da análise estatística. Porém,
a redução do número de experimentos realizados acarreta perdas quanto à
análise da influência de interações entre as variáveis de estudo sobre a resposta
de interesse (BRUNS, 1995). Dessa forma, em uma segunda estratégia, o
planejamento experimental composto central foi necessário para visualização da
curvatura com valor de máximo absoluto.
Tabela 4.6. Parâmetros e níveis usados no Planejamento Experimental Fatorial
24: extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L), adicionados no hidrolisado celulósico do bagaço de cana.
Parâmetros (g/L) Níveis
- 0 +
Extrato de Levedura 0,0 1,25 2,5
KH2PO4 0,0 0,5 1,0
(NH4)2SO4 0,0 0,25 0,5
MgSO4.7H2O 0,0 0,25 0,5
Nesse sentido, visando avaliar a superfície de resposta frente à adição de
diferentes componentes do meio no hidrolisado celulósico do bagaço de cana e
no resíduo da indústria de celulose no que tange à produção de etanol a partir
por Z. mobilis CP4 nativa, posteriormente, foi desenvolvido o planejamento
composto central, onde os parâmetros analisados foram mantidos. Tais
nutrientes adicionados à biomassa celulósica no início da hidrólise enzimática,
juntamente com a glicose gerada, permitiram a execução da técnica SSF
(Tabela 4.7).
Tabela 4.7. Variáveis independentes do planejamento central composto avaliando a adição de extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) no hidrolisado celulósico do bagaço e de PM2 frente à produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 nativa.
PARÂMETROS
Níveis
- - 0 + +
A Extrato de Levedura (g/L) 0,0 6,25 12,5 18,75 25,0
B KH2PO4 (g/L) 0,0 1,25 2,5 3,75 5,0
C (NH4)2SO4 (g/L) 0,0 0,75 1,5 2,25 3,0
D MgSO4.7H2O(g/L) 0,0 0,75 1,5 2,25 3,0
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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95
4.5. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis
4.4.1. APLICAÇÃO DA ENGENHARIA GENÉTICA EM Z. mobilis
Objetivando-se tornar a produção de etanol de segunda geração mais
eficiente foram sintetizados os genes responsáveis pela metabolização da xilose
(XI, XK, TAL e TKT), os quais foram inseridos na linhagem CP4 do
microrganismo Zymomonas mobilis, segundo a metodologia adaptada de Zhang
et al. (1995), Liang et al. (1998) e Agrawal et al. (2011).
4.4.1.1. Desenho dos genes
Os genes sintéticos que codificam para xilose isomerase, xiluloquinase,
transaldolase e transquetolase, assim como dois operons, cada um sob o
controle do forte promotor constitutivo Pgap de Z. mobilis, foram construídos
através de síntese química na empresa Life Sciences Advanced Technologies,
Inc., a partir de dados do genoma de E. coli e Z. mobilis. O plasmídio pZMO1
(1565 kb) de Z. mobilis (ARVANITIS et al., 2000), que demonstrou estabilidade
nesta bactéria, também foi sintetizado quimicamente e clonado em um vetor
sintético bifuncional para Z. mobilis e E. coli. Este vetor apresenta a origem de
replicação de E. coli, bem como a marca de seleção de resistência a tetraciclina.
Neste contexto, os segmentos bem definidos de E. coli facilitam a manutenção
dos plasmídeos, enquanto os de Z. mobilis inclui sequências genéticas
responsáveis pela replicação.
Adicionalmente, foi desenvolvido um controle contendo um plasmídeo que
possui apenas os genes de origem de replicação de Zymomonas mobilis e E.
coli, bem como a resistência à tetraciclina, sendo nomeado de ORI; o plasmídeo
contendo todos os genes descritos, além dos genes de metabolização da xilose
(XI, XK, TAL e TKT) foi nomeado de ORI ZYMO. A seguir, a figura 4.8 mostra a
organização do sistema de operon duplo (em média ~3,2 kb) para os genes de
assimilação e metabolização da xilose, sob o controle do promotor Pgap,
inseridos no plasmídeo pZMO1.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
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96
Figura 4.8. Mapa do plasmídeo pZM01, o qual apresenta o sistema de operon duplo para os genes do metabolismo de xilose. Onde: Pgap, promotor gliceraldeído-3-fosfato; XI, xilose isomerase; XK, xilulokinase; TAL, transaldolase; TKT, transquetolase; Tc, gene de resistência à tetraciclina (4,2 kb); ZM22, origem de replicação de Zymomonas mobilis (5,9 kb). 4.4.1.2. Amplificação gênica em E. coli
Para a amplificação dos genes através de transformação genética em E.
coli DH5α foram utilizados 1 µl de pZM01 (50 ng). O plasmídeo foi adicionado
para cada alíquota de célula competente e incubado no gelo por 45 minutos.
Posteriormente, o choque térmico foi realizado na temperatura de 42°C, durante
90 segundos; seguido de incubação a 37°C por 45 minutos, agitação de 200
rpm, empregando 1mL de meio LB. Em seguida, as células foram plaqueadas
em meio LB na presença do antibiótico (tetraciclina, 10 mg/L) sob 37°C de
temperatura, durante 24 horas. Este método, adaptado de Sambrook & Russel
(2001), tem sido frequentemente utilizado por não prescindir equipamentos
sofisticados (AZEVEDO et al., 2003).
4.4.1.3. Extração do DNA
Inicialmente, dois inóculos das culturas transformadas de E. coli foram
cultivados em 200 mL de meio LB, contendo 10 mg/L de tetraciclina, na
temperatura de 37°C, durante 24 h. A extração de DNA em larga escala
(maxipreparação), desenvolvida segundo metodologia de Azevedo et al. (2003),
ocorreu após o procedimento de transformação em E. coli (citado no item
anterior).
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
97
Adicionalmente, a lise das membranas plasmáticas é solubilizada por
agentes que rompem associações hidrofóbicas e destroem a bicamada lipídica.
Assim sendo, bactérias gram-negativas necessitam de detergentes iônicos e
substâncias alcalinas para o rompimento da parede celular (AZEVEDO et al.,
2003).
4.4.1.3. Transformação em Zymomonas mobilis
O processo de introdução de um DNA exógeno em uma célula hospedeira
pode ser desenvolvido através da conjugação, transdução e transformação. No
presente trabalho, a transformação do microrganismo Z. mobilis foi desenvolvida
através da eletroporação, baseada em estudos de Zou et al. (2012); Liang &
Lee (1998); e Zhang et al. (1995).
Cabe ressaltar que a eficiência desta técnica é afetada por alguns fatores,
como origem e tamanho do plasmídeo, fase de crescimento das células,
intensidade da corrente elétrica e tempo de crescimento após transformação
(ZOU et al., 2012).
Neste contexto, alguns pesquisadores, tais como Carey et al. (1983) e
Dally et al. (1982) realizaram a conjugação para este procedimento; porém há
controvérsias sobre a sua eficácia, pois o crescimento da bactéria é reduzido no
meio mineral utilizado para a seleção, bem como a produção de substâncias
anti-bactericidas podem provocar a morte do microrganismo doador dos genes
(GOODMAN et al., 1982). A eletroporação apresenta-se, portanto, como o
método mais conveniente para a transformação genética (LIANG & LEE, 1998).
I. Células competentes de Z. mobilis
No que tange à inserção de genes através da transformação faz-se
necessário tornar as células competentes para viabilizar a introdução do DNA
exógeno no hospedeiro selecionado. Assim sendo, o protocolo de células
competentes de Zymomonas mobilis desenvolvido no presente trabalho foi
baseado na metodologia de Liang & Lee (1998).
Após atingir a Abs600 de 0,36, o inóculo (100 mL) foi centrifugado a 4000
rpm por 5 minutos a 4oC, sendo o sobrenadante descartado e o pellet
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
98
ressuspendido em 10 mL de solução contendo água destilada estéril (adicionada
de 10% de glicerol, suplementado com 0,85% de NaCl). A etapa de
centrifugação foi repetida nas mesmas condições, seguida da adição de solução
contendo 2 mL de água destilada (10% de glicerol).
II. Plasmídeo exógeno
O plasmídeo extraído, descrito no item 4.4.1.3, foi concentrado após
liofilização e, posteriormente, teve o volume ajustado para 30 µl. Após medição
de absorbância (260-280 nm), a sua concentração foi calculada em 10 mg/µL
para ORI ZYMO e 23 mg/µL para ORI.
III. Eletroporação
No seguinte, células de Z. mobilis foram transformadas por eletroporação,
através do equipamento BioRad GenePulser Xcell™. As colônias foram
transferidas para a cubeta de eletroporação (0,2 cm), mantida em baixas
temperaturas e, então, transformadas nas seguintes condições: 1,5KV por cm3,
75KV/cm, 25µF e 200Ω.
4.4.1.4. Etapa pós-transformação
Imediatamente após diferentes culturas de Z. mobilis [ORI, ORI ZYMO e o
controle sem plasmídeo] serem transformadas por eletroporação, as mesmas
foram incubadas em meio RMG durante 16 horas, conforme descrito por
Picataggio et al. (1996). Posteriormente, as três culturas foram plaqueadas (100
µl de cada) em meio RMG agarizado (20 g/L), na temperatura de 30°C, durante
7 dias. Desta forma, clones transformantes resistentes ao antibiótico foram
crescidos em meio RM, adicionado de xilose e glicose em diferentes
concentrações, no intuito de avaliar e aperfeiçoar o crescimento bacteriano,
conforme indicado no item 4.4.2 ao 4.5.
No seguinte, as colônias isoladas que apresentaram maior produção de
biomassa e rápido crescimento nestes substratos foram testadas quanto à
produção de etanol (item 4.4.2.1). Na figura 4.9 observa-se a linhagem CP4
após transformação genética, sob o aumento de 1000x.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
99
Figura 4.9. Microscopia da linhagem de Zymomonas mobilis CP4 recombinante
(aumento de 1000x).
4.4.1.5. Meio de crescimento e manutenção
O meio sintético RM (rich medium) foi utilizado nos ensaios de
fermentação com a linhagem recombinante, bem como para produção do
inóculo, conforme descrito por Mohagheghi et al. (2002), Zhang (2003) e Jeon et
al. (2005). Os meios RMG, RMX e RMGX foram utilizados quando a glicose, a
xilose e a combinação dos dois açúcares foram empregadas como fonte de
carbono, respectivamente, nas concentrações de 20 g/L para cada açúcar
(Tabela 4.8).
Tabela 4.8. Composição do meio RM empregado na linhagem recombinante de
Zymomonas mobilis CP4. Onde: RMG: meio RM adicionado de 20 g/L de glicose; RMX: meio RM adicionado de 20 g/L de xilose; RMGX: meio RM adicionado de 20 g/L de glicose e 20 g/L de xilose; gli: glicose; xil: xilose.
Componente Concentração
Tetraciclina 10 mg/L
Extrato de Levedura 10 g/L
KH2PO4 2 g/L
Adição de glicose (RMG) 20 g/L
Adição de xilose (RMX) 20 g/L
Adição de glicose e xilose (RMGX) 20 g/L de gli, 20 g/L de xil
Adicionalmente, as colônias recombinantes foram preservadas de forma
semelhante às linhagens nativas, no entanto, o meio SDL foi substituído pelo
meio RMGX. Conforme já sinalizado na literatura, Lawford et al. (2000), Song et
al (2005) e Zou et al. (2012) empregaram, de forma semelhante, 10 mg/L de
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
100
tetraciclina, assim como utilizaram o meio RM para repiques e conservação do
microrganismo.
4.4.2. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO
A tabela 4.9 apresenta um esquema geral, visando facilitar a
compreensão das etapas definidas para frascos agitados no que tange à
produção de etanol por Z. mobilis CP4 recombinante. As etapas de 1-3
representam os ensaios avaliando o consumo de glicose e xilose, a seleção de
clones, bem como o processo de adaptação metabólica em meio sintético; nas
etapas 4 e 5 foram desenvolvidas estratégias de aclimatação celular e os
experimentos utilizando o bagaço de cana como substrato para a produção de
etanol através do processo SSCF.
Tabela 4.9. Experimentos sequenciais avaliando o desempenho da bactéria
Zymomonas mobilis recombinante frente à produção de etanol.
Meio Sintético
1 Ensaios preliminares avaliando o consumo de glicose e xilose;
2 Seleção de clones que apresentassem maior produção de etanol, bem como
crescimento de biomassa celular a partir de glicose e xilose;
3 Estratégia de adaptação metabólica para propagação celular em meio sintético contendo diferentes concentrações de glicose e xilose;
SSCF
4 Estratégia para propagação celular em meio contendo hidrolisado ácido
oriundo do bagaço de cana (aclimatação celular);
5 Desenvolvimento de um processo simultâneo de hidrólise enzimática de celulose e co-fermentação (SSCF);
Onde: meio sintético (1-3); bagaço de cana (4-5)
4.4.2.1. Ensaios preliminares para avaliar o consumo de glicose e xilose em meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada
Para se verificar/avaliar a capacidade de utilização de glicose e xilose,
foram realizados experimentos em meios quimicamente definidos com a
linhagem recombinante de Z. mobilis, analisando-se o consumo de substrato,
produção de etanol e crescimento celular, bem como as variáveis de resposta
dos cultivos.
Estes experimentos foram realizados em frascos cônicos de 500 mL com
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
101
200 mL, na temperatura de 30oC, sem agitação orbital, em meio sintético
contendo glicose e xilose, separadamente e associadamente, nas concentrações
de 1,3 a 20 g/L, sendo as concentrações dos outros nutrientes descritas
anteriormente na tabela 4.9.
A tabela 4.10 apresenta o planejamento experimental de superfície de
resposta 22, com 5 repetições do ponto central, totalizando 13 experimentos,
onde as concentrações de glicose e xilose, em meio sintético, foram os
parâmetros analisados. Adicionalmente, os valores dos demais nutrientes,
extrato de levedura e KH2PO
4, juntamente com a tetraciclina, foram fixados em
10 g/L, 2g/L e 10 mg/L, respectivamente.
Tabela 4.10. Variáveis independentes do planejamento experimental, avaliando
diferentes concentrações de glicose e xilose, em g/L, quanto à produção de etanol por Z. mobilis recombinante.
I. Seleção de clones
Após a realização de ensaios em estado estacionário (sem agitação),
priorizando o crescimento celular, diferentes clones foram testados quanto à
produção de etanol e de biomassa a partir do meio RMGX, em frascos agitados,
sob 150 rpm de agitação e temperatura de 30C.
II. Adaptação Metabólica
O processo de adaptação metabólica para otimizar a fermentação de
xilose foi empregado por diversos autores, tais como Zhang et al. (2002),
Viitanen et al. (2008) e Agrawal et al. (2011), uma vez que linhagens
recombinantes de Zymomonas mobilis apresentam dificuldades de
metabolização deste açúcar. Desta forma, essa técnica consiste na aclimatação
do microrganismo à xilose através de repiques sucessivos em meios contendo,
inicialmente, elevadas concentrações de glicose e reduzidas de xilose; na
PARÂMETROS
Níveis
- - 0 + +
A Glicose (g/L) 1,3 4 10,5 17 19,7
B Xilose (g/L) 1,3 4 10,5 17 19,7
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
102
medida em que os ciclos de repiques são realizados, as concentrações da
pentose se elevam e da hexose são reduzidas. A tabela 4.11 indica que foram
realizados 50 ciclos, no total de 160 dias, a partir de combinações variando de
1,5 a 15 g/L de glicose e 5 a 18,5 g/L de xilose; sendo que o KH2PO4 e o extrato
de levedura, componentes do meio RM, assim como a tetraciclina, mantinham-
se em 2 g/L, 10 g/L e 10 mg/L, respectivamente .
Tabela 4.11. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos sucessivos, variando as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.
Ciclos Tempo (Dias) Glicose (g/L) Xilose (g/L)
1-10 70 15 5
11-19 30 10 10
20-25 20 7,5 13,5
26-30 15 5 15
31-40 15 2,5 17,5
41-50 10 1,5 18,5
4.4.2.2. Ensaios para produção de etanol a partir de bagaço de cana através do processo SSCF
Após etapa de pré-hidrólise enzimática, as células bacterianas foram
inoculadas no meio de fermentação (hidrolisado hemicelulósico e celulósico)
para produção de etanol através do processo SSCF (Simultaneous
Saccharification and Co-Fermentation).
I. Adaptação Metabólica
A tabela 4.12 indica que foram realizados 25 ciclos adaptativos sucessivos,
no total de 90 dias, a partir de 2,5 a 10% de hidrolisado ácido do bagaço de cana
adicionado no meio RMG, no intuito de tornar a bactéria recombinante mais
resistente a inibidores resultantes dos pré-tratamentos (descritos no item 2.5.3).
Tabela 4.12. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente do bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L.
Ciclos Tempo (Dias) Hidrolisado (%)
1-5 14 2,5
6-10 20 5
11-15 25 10
16-20 20 15
21-25 20 20
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
103
Conforme descrito por Nghuyem et al. (1996), citado no item 2.8.4.5; na
medida em que os ciclos de repiques sucessivos são realizados, as
concentrações de hidrolisado ácido se elevam e as de glicose são mantidas de
acordo com o meio RMG.
II. Processo de propagação mediante diferentes estratégias de
aclimatação celular
Com o objetivo de investigar o efeito da aclimatação celular durante a
conversão de glicose e xilose oriundas das frações celulósicas e hemicelulósicas
em etanol, respectivamente, foram utilizadas quatro diferentes estratégias de
propagação celular para obtenção do inoculo a ser adicionado nos frascos e
posterior execução do processo SSCF.
Cabe ressaltar que ensaios prévios avaliando a adição de diferentes
concentrações de hidrolisado (5%, 10%, 20%, 30%, 40%) em meio sintético
complementar, baseados nos estudos de Borges (2011) levaram-nos a
estabelecer as concentrações empregadas no processo de aclimatação. Todo
processo de aclimatação foi desenvolvido a partir de um pré-inóculo inicial,
crescido em meio RMGX; sendo que todas as etapas posteriores, descritas a
seguir, foram realizadas em meio RMG, uma vez que a xilose presente no meio
sintético foi substituída pela xilose oriunda da fração hemicelulósica.
a. Sem aclimatação: a propagação celular ocorreu usando meio sintético
RMGX sem aclimatação; em seguida, 10% (v/v) do meio fermentado
anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio RMG contendo
10% de hidrolisado. As três etapas seguintes referem-se ao procedimento de
aclimatação celular em meio contendo hidrolisado;
b. Duas etapas (Estratégia 1- aclimatação de 5% a 10% de hidrolisado): a
propagação celular ocorreu em um frasco cônico com 200 mL de meio
contendo 5% de hidrolisado; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado
anteriormente durante 48 h foram transferidos para o meio contendo 10% de
hidrolisado;
c. Duas etapas (Estratégia 2- aclimatação de 5% a 20% de hidrolisado): a
propagação ocorreu em um frasco cônico contendo 5% de hidrolisado em
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
104
meio; posteriormente 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente durante 48
h foram transferidos para o meio contendo 20% de hidrolisado;
d. Três etapas (Estratégia 3- aclimatação inicial de 5% e 10%, seguida da
propagação em 20% de hidrolisado e posterior centrifugação): esta estratégia
foi desenvolvida após as aclimatações descritas anteriormente, ou seja, dois
diferentes frascos cônicos contendo 200 mL de meio RMG com diferentes
concentrações de hidrolisado, 5% e 10%, foram inoculados em meio contendo
20% de hidrolisado, com 10% (v/v) do meio fermentado anteriormente.
Porém, em seguida, as culturas foram centrifugadas (4000 rpm/10 min),
atingindo a concentração de aproximadamente 4,0 g/L e, então, ressuspensas
no meio de fermentação contendo 20% de hidrolisado (Figura 4.10).
Figura 4.10. Diagrama de blocos indicando a estratégia empregada para aclimatação celular, a qual envolve 3 etapas: inóculos em meio RMG adicionado de 5% e 10% de hidrolisado hemicelulósico; seguidos de crescimento em meio RMG adicionado de 20% de hidrolisado hemicelulósico; e posterior concentração de células através de centrifugação, a serem inoculadas na proporção definida de RMG adicionado de 20% de hidrolisado hemicelulósico. Onde: (a) pré-inóculo crescido em meio RMGX; (b) inóculo crescido em meio RMG, contendo 5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico; (c) inóculo crescido em meio RMG, contendo 10% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico; (d) concentração de células (4000 rpm, 10 minutos), atingindo 4 g/L; (f) ressuspensão em
meio RMG, contendo 20% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico.
III. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos experimentais sequenciais
O processo foi desenvolvido em frascos cônicos de 500 mL contendo 200
mL de meio de fermentação, que apresentava a mesma composição do meio de
propagação, com exceção da adição de glicose e xilose, que foram substituídas
pelo hidrolisado da celulose e da hemicelulose provenientes do bagaço de cana,
respectivamente, ricos nestes açúcares.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
105
As fermentações ocorreram nas seguintes condições: 12 horas de pré-
hidrólise enzimática, 10% (v/v) de inoculo (aclimatado segundo a estratégia
citada anteriormente que resultou em melhores resultados de produção de
biomassa celular), temperatura de 30oC, agitação de 150 rpm, suplementação
com meio RM, bem como diferentes concentrações de sólidos e hidrolisado
hemicelulósico do bagaço de cana. Tais concentrações foram avaliadas de
acordo com a execução de dois planejamentos experimentais compostos
centrais 22, visando buscar por valores ótimos de produção de etanol através do
processo SSCF (Tabelas 4.13 e 4.14).
Tabela 4.13. Variáveis independentes do primeiro planejamento experimental: percentual de hidrolisado hemicelulósico e relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana, avaliando a produção de etanol pelo processo SSCF 1.
PARÂMETROS
Níveis
- - 0 + +
A Hidrolisado (%) 9,6 20 45 70 80,4
B Sólido:líquido (g/mL) 0,8 1 1,5 2 2,2
Tabela 4.14. Variáveis independentes do segundo planejamento experimental
avaliando o percentual de hidrolisado ácido, bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana no que tange à produção de etanol pelo processo SSCF 2.
PARÂMETROS
Níveis
- - 0 + +
A Hidrolisado (%) 0,7 6,5 20,5 34,5 40,3
B Sólido:líquido (g/mL) 1,01:10 1,3:10 2:10 2,7:10 2,99:10
4.5. PRODUÇÃO DE ETANOL EM BIORREATOR INSTRUMENTADO ATRAVÉS DOS PROCESSOS SSF E SSCF
Os ensaios em biorreator (BIOFLO III, New Brunswick) foram realizados
após a determinação das melhores condições estabelecidas nos experimentos
em frascos agitados, utilizando-se células crescidas (No processo SSF, as
células foram centrifugadas; no SSCF, as células foram adicionadas na
proporção de 10% v/v) (Figura 4.11).
O volume nominal e de trabalho do biorreator instrumentado é de 1,5 litros
e 500 mL, respectivamente, velocidade de agitação de 150 rpm, temperatura de
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
106
30°C e pH 5, sendo monitorado através de um eletrodo de pH esterilizado e
controlado pela adição de KOH 1M.
Figura 4.11. Experimento em biorreator BIOFLO III (New .Brunswick).
4.6. MÉTODOS ANALÍTICOS
4.6.1. DETERMINAÇÃO DE ETANOL E AÇÚCARES POR CLAE
Em todos os experimentos foram retiradas alíquotas de 2 mL, com rigor
asséptico, em média, a cada três horas. No decorrer dos experimentos, tais
amostras foram devidamente tratadas através de centrifugação (11300 g por 10
minutos), filtradas em membrana de acetato de celulose 0,22 µm e
adequadamente diluídas para quantificação por CLAE (Figura 4.12).
Figura 4.12. Sistema cromatrográfico CLAE com detecção por índice refração.
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
107
Foram determinadas as concentrações de glicose, celobiose e etanol,
utilizando o sistema cromatográfico (WATERS) composto por uma coluna HPX-
87P (Bio-Rad), operante a 80°C com fluxo de 0,6 mL/min de fase móvel (água
MILLIQ), bomba WATERS 510, detector de índice de refração WATERS 410
com software Empower. Os padrões de glicose, celobiose e etanol foram
utilizados nas concentrações de 5 g/L, 10 g/L e 15 g/L, respectivamente.
4.6.2. QUANTIFICAÇÃO DO MICRORGANISMO
O meio contendo a massa celular, após centrifugação em microcentrífuga
(UNIVERSAR IGR HETTICH) a 11.300g/min, foi separado da massa celular. O
sedimentado foi posteriormente ressuspendido em água destilada e as células
quantificadas pela medida da absorbância em espectrofotômetro
(SPECTRUMLAB 22PC) a 600 nm, segundo Leal (1998). As absorbâncias
medidas foram correlacionadas com os valores de massa seca de células
através das curvas-padrão apresentadas na tabela 4.15. A determinação da
massa seca de células foi feita após filtração em membrana Millipore (0,22 m),
seguida de secagem em balança de infravermelho (Sartorius- LJ16) e pesagem
até massa constante.
Tabela 4.15. Curvas padrão de absorbância versus concentração da massa
celular para as linhagens de Z. mobilis. LINHAGEM CORRELAÇÃO
Z. mobilis AG11 nativa Abs = 2,875 * concentração celular (R²= 0,992)
Z. mobilis CP4 nativa Abs = 1,959 * concentração celular (R²= 0,994)
Z. mobilis CP4 Recombinante1 Abs = 4,016 * concentração celular (R²= 0,923)
Z. mobilis CP4 Recombinante2 Abs = 2,608* concentração celular (R²= 0,923)
Onde: 1. Sem adaptação metabólica; 2. Após 26 ciclos adaptativos.
4.7. ANÁLISE DOS RESULTADOS
4.7.1. ESTATÍSTICA
Os efeitos estimados das variáveis e condições de processo sobre a
concentração final de etanol (variável de resposta) foram analisados em um
intervalo de 90% de confiança, mediante a Análise de Variância (ANOVA) e
Metodologia de Superfície de Resposta, através do Software Design Expert
Software (versão 7.1.6. Stat-Ease, Inc., Minneapolis, EUA).
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
108
4.7.2. CÁLCULO DE EFICIÊNCIA
A eficiência de produção de etanol é medida de acordo com a quantidade
de etanol produzido/1 g de substrato consumido (expressos em porcentagem), a
partir do valor de Yp/s teórico.
Cálculo de eficiência:
100)(
)(
/
/x
teóricoY
processoYE
SP
SP
f
4.7.3. TAXA INSTANTÂNEA ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO
Durante o intervalo de tempo (dt), o aumento de números de
microrganismos (dx), na fase exponencial, onde as células absorvem os
nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando, pode ser
representado por:
Xμdt
dX dt
dX.
X
1μ T
dt
LnXd.μ (Equação 4.2)
Onde: μ é a taxa específica de crescimento por unidade de tempo = μ x
(taxa específica de crescimento, na fase exponencial). Ao plotar o gráfico Ln X
versus Tempo, a tangente a cada ponto da curva obtida fornece o valor de μ ,
durante a fase exponencial de crescimento. Analogamente, as taxas específicas
para formação de produto e consumo de substrato, em g/g.h, são representados
por:
dt
dP.
Xq p
1 e
dt
dS.
Xqs
1 (Equação 4.3)
Os valores das taxas de crescimento celular (rx), de consumo de substrato
(rg), formação de produto (rp) foram obtidas plotando-se a concentração celular,
substrato ou produto com o tempo.
(Equação 4.1)
CAPÍTULO 4: Materiais e Métodos
Danielle da Silveira dos Santos
109
4.7.4. TEMPO DE DUPLICAÇÃO
Tempo de geração (tg) que é o tempo de duplicação da massa celular pode ser representado por:
Ln 2X0/X0 = x tg tg = Ln 2 /x td = 0,693/ x
(Equação 4.4)
4.7.5. VARIÁVEIS DE RESPOSTA
Os parâmetros próprios de processos de fermentação foram considerados
da seguinte forma:
a) Fator de rendimento de produção de etanol (g/g)
Sendo: P: Concentração final de etanol (g/L)
Po: Concentração inicial de etanol (g/L)
S: Concentração final de substrato (g/L)
So: Concentração inicial de substrato (g/L)
b) Fator de rendimento para crescimento celular (g/g)
Sendo: X: Concentração final de biomassa (g/L)
Xo: Concentração inicial de biomassa (g/L)
S: Concentração final de substrato (g/L)
So: Concentração inicial de substrato (g/L)
c) Produtividade volumétrica (g/L.h)
Sendo: P: Concentração final de etanol (g/L)
Po: Concentração inicial de etanol (g/L)
tf: Tempo de fermentação (h)
(Equação 4.7) foP tPPQ
(Equação 4.6) SSXXSXY ooSX /
SSPPSPY ooSP /
(Equação 4.5)
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
110
_____________________CAPÍTULO 5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente capítulo foi destinado à exposição e discussão dos
resultados referentes às linhagens de Zymomonas mobilis naturalmente
ocorrentes, assim como a modificada geneticamente. Tais resultados foram
obtidos a partir da conclusão dos experimentos planejados para elaboração da
tese. Nos estudos sobre a otimização dos parâmetros operacionais foram
desenvolvidos planejamentos experimentais sequenciais e os efeitos de
impacto sobre a variável de resposta foram analisados a partir de metodologias
de superfície de resposta, definindo as condições ótimas para a condução do
processo.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
111
5.1. ENSAIOS DE FERMENTAÇÃO EMPREGANDO A BACTÉRIA
Zymomonas mobilis NATURALMENTE OCORRENTE
5.1.1. Desempenho das linhagens nativas frente à utilização de glicose e
xilose
Visando avaliar a capacidade de consumo dos principais açúcares
encontrados nas frações polissacarídicas de resíduos de composição
lignocelulósica, nomeadamente glicose e xilose, realizou-se um ensaio, em
meio sintético, com as duas linhagens de Z. mobilis.
Os perfis cinéticos que representam o desempenho de ambas as
linhagens estão apresentados nas figuras que se seguem. Analisando o gráfico
da cinética de Z. mobilis AG11 (Figura 5.1), observa-se que o substrato foi
consumido em um período de 15 horas. O desempenho da linhagem Z. mobilis
CP4 foi similar, no entanto, o tempo para o consumo total da glicose foi
ligeiramente superior (18 horas) (Figura 5.2).
Figura 5.1. Cinética de consumo de glicose, produção de etanol e crescimento celular pela linhagem de Z. mobilis AG11.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
112
Figura 5.2. Cinética de consumo de glicose, produção de etanol e crescimento celular pela linhagem de Z. mobilis CP4.
Conforme sinalizado pela literatura, células de Z. mobilis apresentam
reduzido crescimento, destinando grande parte do substrato para a síntese de
etanol; contudo, observa-se, em ambas as linhagens, uma associação do
crescimento celular com a produção de etanol. Rogers et al. (1982) já haviam
reportado que apenas 2% do carbono encontrado na molécula do substrato são
convertidos à plasticidade celular.
As variáveis medidas e calculadas desta série de experimentos foram
reunidas e estão apresentadas na tabela 5.1.
Tabela 5.1. Desempenho das linhagens AG11 e CP4 de Z.mobilis na
fermentação de glicose (concentração inicial de 20 g/L). Variáveis medidas e calculadas AG11 CP4
Etanol (g/L) 7,5 6,3
Células (g/L) 0,48 0,43
Produtividade (g/L.h) 0,50 0,33
Taxa específica de crescimento (h-1) 0,147 0,169
Fator de conversão em produto (YP/S), em g.g-1 0,255 0,106
Fator de conversão em células (YX/S), em g.g-1 0,024 0,019
Eficiência de fermentação (%) 54 22
Tempo de duplicação (h) 4,7 4,1
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
113
Pode-se constatar, que em meio sintético, ambas as linhagens
apresentaram resultados semelhantes quanto à produção de etanol e
crescimento celular. Embora, a linhagem AG11 tenha apresentado valores
ligeiramente superiores de produtividade volumétrica e fatores de conversão
tanto de células quanto de produto, a linhagem CP4 exibiu valor superior para a
taxa específica de crescimento.
Na Figura 5.3 observa-se um cromatograma típico de início de
fermentação por Z. mobilis CP4, no qual a glicose apresenta-se em altas
concentrações e a produção de etanol é iniciada, verificando-se, ainda, a
presença de alguns subprodutos.
Figura 5.3. Perfil cromatográfico típico da fermentação por Z.mobilis.
No tocante ao consumo de xilose, foi constatada a incapacidade de
ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose. Não houve
crescimento celular, assim como não houve produção de etanol, conforme
mostrado na figura 5.4.
Figura 5.4. Desempenho de Z. mobilis AG11 (A) e CP4 (B) em xilose.
glic
ose -
11,7
05
12,7
12
eta
nol -
15,9
07
18,9
62
23,7
15
36,9
46
37,0
67
37,1
50
mV
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
Minutes
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 26,00 28,00 30,00 32,00 34,00 36,00 38,00 40,00
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
114
Como colocado anteriormente, este ensaio se mostrou de suma
importância, pois permitiu definir a estratégia para a produção de etanol de
segunda geração; levando-se, inicialmente, a optar pelo aproveitamento
apenas da fração celulósica pelas linhagens nativas, através da concepção de
hidrólise enzimática simultânea à fermentação alcoólica.
5.1.2. Otimização do processo de hidrólise enzimática simultânea à
fermentação alcoólica por Zymomonas mobilis CP4
I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado
Visando-se definir uma condição que resultasse em elevadas
concentrações de etanol a partir do processo SSF, um planejamento
experimental 23, empregando o método de superfície de resposta, foi realizado.
A matriz experimental está apresentada na tabela 5.2, a qual contém os valores
das condições empregadas, avaliando a concentração de células, carga
enzimática e relação sólido:líquido do bagaço pré-tratado (g:mL); assim como
as respectivas respostas (concentração de etanol e produtividade volumétrica).
Os ensaios foram conduzidos de acordo com a metodologia descrita na
seção 4.3.3.2, empregando-se o processo de hidrólise enzimática da celulose
simultânea à fermentação, com um tempo de pré-hidrólise enzimática de 12 h.
Na figura 5.5 A, observa-se a celulignina de bagaço de cana-de-açúcar pré-
tratada e submetida a lavagens com água destilada e secagem, sem a adição
de meio e de enzimas, que se apresenta em estado sólido.
Na sequência, adicionou-se meio de cultivo, descrito no item 4.3.2, com
exceção da glicose, carga enzimática de 25 FPU/g, como preconizado por
Vásquez (2007), e relação sólido:líquido de 3:10 (g:mL) (Fig. 5.5. B). Após o
pré-tratamento enzimático o material sólido hidrolisado foi liquefeito, atingindo
cerca de 80 g/L de glicose, tornando-o próprio para a fermentação (Fig. 5.5. C).
Observa-se que as maiores concentrações de etanol foram obtidas para as
mais elevadas relações sólido:líquido, a exceção do experimento 4, no qual se
utilizou a carga enzimática em seu valor mínimo. Conforme reportado por
Vásquez (2007), a relação sólido: líquido e a carga enzimática são fatores
essenciais para a otimização do processo SSF, uma vez que o aumento no
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
115
teor de sólidos associado ao aumento da carga enzimática resultou em um
aumento nas concentrações de etanol.
Tabela 5.2. Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular frente à produção de etanol a partir do bagaço de cana pré-tratado através do processo SSF por Z. mobilis CP4.
Ex.
Condições Respostas
S:L (g:L)
CE (FPU/g)
Xo
(g/L) Glicose (g.L-1)
Etanol (g.L-1)
QP
(g/L.h)
1 0,32:10 17,5 2,5 12,3 6,5 0,23
2 2:10 17,5 5,02 70,7 35,2 1,49
3 2:10 17,5 2,5 69,9 33,8 1,42
4 3:10 10,0 4,0 33,8 13,7 0,5
5 2:10 17,5 2,5 69,9 33,8 1,45
6 3:10 10,0 1,0 35,5 14,9 0,5
7 1:10 10,0 1,0 17,2 5,9 0,2
8 3:10 25,0 4,0 80,3 60,7 1,52
9 2:10 17,5 2,5 70,5 30,6 1,38
10 2:10 17,5 2,5 69,5 33,4 1,42
11 1:10 10,0 4,0 20,1 13,4 0,41
12 1:10 25,0 1,0 26,3 14,7 0,85
13 1:10 25,0 4,0 33,8 17,9 0,88
14 2:10 30,11 2,5 76,6 36,8 0,94
15 3:10 25,0 1,0 80,7 48,7 0,98
16 2:10 17,5 0,02 50,5 6,9 0,06
17 3,68:10 17,5 2,5 10,6 6,2 0,42
18 2:10 17,5 2,5 70,6 29,1 1,41
19 2:10 4,89 2,5 12,8 5,4 0,21
20 2:10 17,5 2,5 70,6 34,9 1,39
Onde: S:L: relação sólido:líquido, CE: carga enzimática, QP= produtividade volumétrica, X0=concentração celular.
Figura 5.5. Material celulósico deslignificado (A), logo após a adição de
enzimas e meio (B) e após a pré-hidrólise enzimática (C).
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
116
A significância estatística das equações do respectivo modelo foi
verificada utilizando-se o teste de Fisher da análise de variância (ANOVA). No
tocante à concentração inicial de glicose, o modelo quadrático reduzido foi o
melhor modelo ajustado para o processo (após pré-hidrólise enzimática), pois
apresentou o maior valor de R2 (0,8884).
Na tabela 5.3, observa-se que o Lack of Fit é apresentado como
significativo (p<0,05), embora o modelo tenha permanecido significativo (p-
valor inferior a 0,0001), não sendo invalidado. O Parâmetro C (concentração
celular) e suas interações foram removidos do modelo, uma vez que não
apresentam influência na liberação de glicose, pois esta é produzida durante a
pré-hidrólise enzimática, ou seja, antes da inoculação da bactéria. Por este
motivo, provavelmente, o Lack of Fit mostrou-se significativo. O parâmetro B
(carga enzimática) foi o mais influente na liberação de glicose, pois apresentou
os maiores valores de soma dos quadrados e de média quadrática, seguido do
parâmetro A (relação sólido:líquido) e logo, da interação AB.
Tabela 5.3. Análise de variância da concentração de glicose inicial do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, através do Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.
SQ GL MQ F p >F
Modelo 1694,875 5 2338,97 22,29 < 0,0001 A 1313,64 1 1313,64 12,52 0,0033 B 3460,54 1 3460,54 32,98 < 0,0001 A2 5681,33 1 5681,33 54,15 < 0,0001 B2 944,23 1 944,23 9,00 0,0096 AB 662,48 1 662,48 6,31 0,0248 Resíduo 1468,91 14 104,92 Lack of Fit 1467,84 9 163,09 759,75 < 0,0001 Erro 1,07 5 0,21 Cor Total 13163,78 19
[Glicose]: [R2 = 0,8884, R2 Aj = 0,8486]
Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher. A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.
O modelo de glicose resultante após a pré-hidrólise enzimática é
representado pela seguinte equação (1):
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
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117
[Glicose] = -69.28050+67.60248 A+4.70742 B+1.21333 AB-19.75705 A2-
0.14319B2 (1)
Os gráficos 3-D de superfície de resposta representam as equações de
regressão, mostrando a interação entre relação sólido:líquido, carga enzimática
e concentração celular para a concentração final etanol, produtividade
volumétrica e concentração inicial de glicose do processo SSF. Na figura 5.6,
observa-se o contorno de superfície resposta para a otimização da
concentração inicial de glicose do SSF. Os efeitos da relação sólido:líquido (A)
e carga enzimática (B) indicam que a concentração de glicose do SSF é maior
nos maiores níveis de carga enzimática e na maior relação sólido:líquido,
obviamente, pois quanto maior for o conteúdo sólido e maior for a carga
enzimática, maiores concentrações de açúcares serão liberadas no processo.
Figura 5.6. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre a concentração inicial de glicose do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado.
No que concerne à concentração de etanol, o modelo utilizado para a
avaliação foi o Cúbico Reduzido, uma vez que apresentou maior valor para R2
(0,9926), indicando 99,2% de ajuste da resposta. Na tabela 5.4. observa-se
que o modelo manteve-se significativo, com valor de Fisher de 78,31 e Lack of
Fit não significativo (p>0,05). A probabilidade de p-valor inferior a 0,0001
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
118
indicou igualmente que o modelo foi altamente significativo e que os dados
experimentais obtidos estão em um bom ajuste com o modelo. Todos os três
parâmetros avaliados (relação sólido: líquido, carga enzimática e concentração
célular) foram significativos e foram mantidas no modelo. Embora, dentre as
três interações existentes, apenas a interação AB (relação sólido: líquido
associada a carga enzimática) foi mantida no modelo, apresentando-se muito
representativa (alto valor de Fisher).
A equação do modelo é apresentada na equação (2):
[Etanol] = +32.60 +16.70 A+13.09 B+ 808.35 C– 9.28 A2 – 4.07 B2 + 4.48 C 2 + 8.44AB - 5.93 A 3 – 1.33 B3 – 287.21 C3 – 516.46 A2 C + 2.19 ABC (2)
Analisando os valores de soma dos quadrados e média quadrática,
observa-se que a relação sólido:líquido (parâmetro A) teve o efeito mais
significativo, seguida pela carga enzimática (parâmetro B) e, finalmente, a
concentração celular (parâmetro C), que teve menor influência na concentração
Tabela 5.4. Análise de variância da concentração de etanol através do
processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular. SQ GL MQ F p >F
Modelo 4693,84 12 391,15 78,31 < 0,0001 A 792,07 1 792,07 158,58 < 0,0001 B 486,79 1 486,79 97,46 < 0,0001 C 44,36 1 244,36 48,92 0,0002 A2 1033,59 1 1033,59 206,94 < 0,0001 B2 198,37 1 198,37 39,72 0,0004 C2 76,08 1 76,08 15,23 0,0059 AB 569,53 1 569,53 114,03 < 0,0001 A3 390,22 1 390,22 78,13 < 0,0001 B3 19,52 1 19,52 3,91 0,0886 C3 239,23 1 239,23 47,90 0,0002 A2C 244,67 1 244,67 48,99 0,0002 ABC 38,28 1 38,28 7,66 0,0278 Resíduo 34,96 7 4,99 Lack of Fit 9,90 2 4,95 0,99 0,4350 Erro Puro 25,06 5 5,01 Cor Total 4728,80 19 [Etanol]: [R2 = 0,9926, Adj R2 = 0,9 799]
Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher. A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
119
de etanol. A interação entre carga enzimática e concentração celular (BC), bem
como a interação entre relação sólido:líquido e concentração celular (AC) não
tiveram influência significativa na presente análise, com valores de p>F
inferiores a 0,05, e, portanto, foram removidas do modelo.
O aumento da relação sólido:líquido associada ao aumento da carga
enzimática fez com que a eficiência de hidrólise fosse maior e,
consequentemente, gerado uma maior concentração inicial de glicose
disponível no meio. Kim et al. (2008) analisaram o processo de fermentação
SSF e, da mesma maneira, observou que a eficiência de fermentação depende
da concentração inicial de glicose produzida durante a hidrólise enzimática.
A figura 5.7 mostra que a máxima concentração de etanol ocorre quando
a relação sólido:líquido (A) e a carga enzimática (B) estão em seus maiores
níveis, aumentando-se significativamente a partir do ponto central dos dois
parâmetros analisados para os seus níveis mais elevados.
Figuras 5.7. Superfície de resposta mostrando os efeitos combinados da
relação sólido:líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B) sobre a concentração de etanol através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
120
Embora exista uma tendência para uma curvatura no gráfico de
superfície de resposta referente à concentração de etanol, o valor máximo é
claramente atingido, conforme plotado no gráfico de produtividade volumétrica,
em que a curvatura é muito evidente. Analisando os resultados desta série de
experimentos, constata-se que a hidrólise foi ineficiente quando a carga
enzimática e a relação sólido:líquido eram baixas, assim como quando haviam
altas concentrações de sólidos associados à baixos níveis de carga enzimática,
liberando baixas concentrações de glicose ao meio e, consequentemente,
produzindo baixas concentrações de etanol. Portanto, a carga enzimática deve
aumentar em associação à relação sólido:líquido.
No tocante à produtividade volumétrica, o melhor modelo ajustado
para a análise estatística desta variável de resposta também foi o modelo
cúbico reduzido, uma vez que resultou no melhor valor de R2 (0,8848).
Segundo a análise da soma dos quadrados e média quadrática, o parâmetro B
(carga enzimática) foi o mais influente, seguido do parâmetro C (concentração
celular). O parâmetro A (relação sólido:líquido) foi o menos influente no modelo
de produtividade volumétrica de etanol (Tabela 5.5).
O Lack of Fit foi mostrado como significativo (p<0,05), porém não
invalidou o modelo, uma vez que os valores preditos estão em conformidade
com os valores experimentais. O modelo hierárquico foi mantido, com os
respectivos parâmetros e interações, visando uma maior análise do decorrer da
fermentação através dos gráficos de superfície de resposta (Figura 5.8).
A figura 5.8 representa o modelo de superfície de resposta para a
otimização de produtividade volumétrica. O efeito da relação sólido:liquido (Fig.
5.8 A) e carga enzimática, mantendo-se a concentração celular no ponto
central, indica claramente que o ponto ótimo para a máxima produtividade
volumétrica é em torno do nível máximo de carga enzimática e do ponto central
da relação sólido liquido. No entanto, quando o processo SSF ocorre em níveis
elevados de sólidos, o tempo de fermentação e a concentração de etanol são
afetados, sendo reduzidos, conforme analisado nos experimentos 4, 6 e 17
(Tabela 5.2). Quando há um aumento no conteúdo de sólidos e a carga
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
121
enzimática não aumenta proporcionalmente, a hidrólise enzimática ocorre
lentamente e, assim, a liberação de glicose no processo é baixa, reduzindo-se
a concentração de etanol e a produtividade volumétrica, pois a taxa de
fermentação é limitada pela baixa concentração do substrato.
Tabela 5.5. Análise de variância da produtividade volumétrica de etanol
através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, utilizando o Planejamento Experimental de Superfície de Resposta 23, avaliando a relação sólido:líquido, carga enzimática e concentração celular.
Onde, SQ= Soma Quadrática, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, F= Fisher Calculado, p >F= Probabilidade de Fisher, A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.
O efeito das interações entre a relação sólido:liquido e a concentração
celular (AC), mantendo-se a carga enzimática em seu ponto central, indica que
a maior produtividade volumétrica ocorre nos níveis máximos de concentração
celular e em torno do ponto central para a relação sólido: líquido. Desta forma,
quando a relação sólido:líquido é baixa, a liberação de glicose no processo é
igualmente reduzida, fazendo com que baixas concentrações deste açúcar
sejam disponíveis no meio de fermentação e, consequentemente, com que a
concentração de etanol e de produtividade volumétrica diminuam. Além disso,
observou-se que quando haviam concentrações elevadas de sólidos, sem
proporcional aumento de carga enzimática, o mesmo não era hidrolisado por
completo, mantendo-se baixas as concentrações de glicose disponíveis no
SQ GL MQ F p >F
Modelo 4,63 10 0,46 6,92 0,0038 A 0,14 1 0,14 2,11 0,1800 B 1,14 1 1,14 16,97 0,0026 C 0,79 1 0,79 11,85 0,0074 A2 1,60 1 1,60 23,96 0,0009 B2 0,87 1 0,87 12,94 0,0058 C2 0,43 1 0,43 6,47 0,0315 AB 0,011 1 0,011 0,16 0,7011 AC 5,513E-003 1 5,513E-003 0,082 0,7806 BC 0,025 1 0,025 0,38 0,5538 ABC 0,050 1 0,050 0,74 0,4116 Resíduo 0,60 9 0,067 Lack of Fit 0,60 4 0,15 242,90 <0,0001 Erro Puro 3,083E-003 5 6,167E-004 Cor Total 5,23 19
Produtividade Volumétrica: [R2 = 0,8848, R2 Aj = 0,7569]
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
122
meio, conforme os experimentos 4, 6 e 17 (Tabela 5.2). A relação sólido:
líquido em seus níveis ótimos, quando associada a altas concentrações de
células, proporcionou aumento de produtividade volumétrica de etanol.
Figura 5.8. Superfícies de resposta mostrando os efeitos combinados da entre (A) relação sólido: líquido (parâmetro A) e carga enzimática (parâmetro B), (B) relação sólido: líquido (parâmetro A) e concentração celular (parâmetro C), (C)
carga enzimática (parâmetro B) e concentração celular (parâmetro C) sobre a produtividade volumétrica de etanol através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
123
A interação entre a carga enzimática (B) e a concentração celular (C),
mantendo-se a relação sólido:líquido no seu ponto central, indica que os
maiores valores de produtividade volumétrica ocorrem nos níveis máximos de
carga enzimática e de concentração de células (Fig. 5.8 C). Quando a carga
enzimática é baixa, a liberação de glicose no processo é muito lenta, fazendo
com que a concentração de etanol e a produtividade volumétrica diminuam.
Desta forma, quando eram aplicados altos níveis de carga enzimática, a glicose
era hidrolisada mais rapidamente, promovendo aumento da produtividade
volumétrica de etanol; uma vez que este carboidrato era simultaneamente
metabolizado pelas células bacterianas, as quais também estavam presentes
em altas concentrações.
O modelo resultante da produtividade volumétrica em etanol é
apresentado na equação (3):
Produtividade Volumétrica = - 3.17128 + 1.61333ª + 0.20374B + 0.67448C-
0.012667AB - 0.10500AC - 9.00000E-003BC - 0.33342A2 - 4.35605E-003B
2-
0.078147C2 +7.00000E-003ABC (3)
O melhor resultado do planejamento experimental apresenta-se a seguir:
concentração inicial de glicose do SSF (76 g/L), concentração final etanol (60
g/L) e produtividade volumétrica (1,5 g/L.h); a partir da relação sólido:líquido de
3:10, carga enzimática de 25 FPU/g e concentração celular de 4 g/L (Figura
5.9).
Observou-se que os resultados estão de acordo com as respostas
previsíveis pelo modelo. Neste experimento, realizado em frascos agitados, a
glicose foi convertida a etanol no período de 36 horas de fermentação, sem
controle pH, na temperatura de 30ºC e agitação orbital de 150 rpm. O tempo de
fermentação foi um fator decisivo na fermentação quando a glicose era gerada
em altas concentrações; segundo Cazetta et al. (2007), a concentração de
etanol pode aumentar em até 60% de 24 para 48 h.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
124
Figura 5.9. Cinética do processo de hidrólise enzimática de celulose e
fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado através do processo SSF por Z. mobilis CP4, em frascos agitados. Condições operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.
A reprodução da melhor condição alcançada no planejamento
experimental, o qual foi realizado em frascos agitados (Figura 5.9), ocorreu em
biorreator sob condições controladas, obtendo-se a concentração inicial de
glicose do SSF em 80 g/L, concentração final de etanol de 55 g/L e
produtividade volumétrica de 2,3 g/L.h, com um tempo de fermentação de
aproximadamente 24 horas, na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150
rpm e pH 5 (Fig. 5.10). Observa-se que os resultados de produção de etanol
obtidos em frascos agitados foram semelhantes aos obtidos em biorreator,
embora a produtividade volumétrica tenha sido maior no experimento em
biorreator.
O presente estudo apresentou os melhores resultados de produção de
etanol de lignocelulósicos por Zymomonas mobilis não recombinante
reportados na literatura, atingindo a concentração de etanol de 60 g/L, valor
próximo ao obtido por Vásquez (2007), que atingiu 70 g/L de etanol a partir de
P.H. SSF
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
125
processo SSF de bagaço de cana sob condições semelhantes, utilizando a
levedura Saccharomyces cerevisae.
Figura 5.10. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e
fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condições operacionais: relação sólido líquido 3:10 (g:mL), 25 FPU/g, 4 g/L de células. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.
As maiores diferenças entre os resultados da fermentação pela bactéria
Z. mobilis no presente estudo e pela levedura S. cerevisae, reportadas por
Vásquez (2007) foram: composição do meio, no qual foram utilizados meios de
fermentação com nutrientes e tampão-citrato, e temperatura de fermentação
em torno de 37°C e de 30°C, respectivamente, o que possibilitou uma hidrólise
mais eficiente no experimento com a levedura, pois a temperatura se mantinha
mais próxima da ótima para a atividade de celulases (50°C), além da presença
do tampão possibilitar uma maior estabilidade do pH.
P.H. SSF
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
126
II. Resíduos da indústria de celulose
Visando comparar a produção de etanol a partir de resíduos da indústria
de celulose com a utilização do bagaço de cana como matéria-prima através do
processo de fermentação por Zymomonas mobilis e sacarificação simultânea,
um planejamento experimental do tipo delineamento superfície de resposta 23
avaliando o processo SSF a partir de PM2 também foi utilizado, onde os
parâmetros analisados foram a relação de sólido:líquido (g:mL), carga
enzimática (FPU/g) e concentração células (%). Na sequência, na tabela 5.6,
são apresentados os experimentos referentes à utilização do resíduo PM2
como fonte de carbono para a produção de etanol por Z. mobilis.
Tabela 5.6. Planejamento Superfície de Resposta 24 investigando efeitos da Relação sólido:líquido (g:mL), Carga enzimática (FPU/g) e Concentração celular (%) na produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4.
Ex.
Condições Resposta
S:L (g:L) CE (FPU/g) Xo (%) Etanol (g/L)
1 0,32:10 17,5 10,00 3,7
2 2:10 17,5 18,41 29,2
3 2:10 17,5 10,00 29,7
4 3:10 10,0 14,21 5,5
5 2:10 17,5 10,00 31,1
6 3:10 10,0 5,80 5,5
7 1:10 10,0 5,80 4,0
8 3:10 25,0 14,21 19,4
9 2:10 17,5 10,00 28,3
10 2:10 17,5 10,00 28,3
11 1:10 10,0 14,21 7,2
12 1:10 25,0 5,80 4,3
13 1:10 25,0 14,21 2,5
14 2:10 30,1 10,00 2,1
15 3:10 25,0 5,80 20,7
16 2:10 17,5 1,59 53,9
17 3,68:10 17,5 10,00 12,8
18 2:10 17,5 10,00 29,8
19 2:10 25,0 10,00 9,6
20 2:10 4,89 10,00 29,8
Onde: S:L: relação sólido:líquido, CE: carga enzimática, QP= produtividade volumétrica, X0=concentração celular.
Observa-se que nos experimentos 1, 7, 11, 12 e 13, os quais
apresentaram baixas relações de sólidos (variável A), as concentrações de
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
127
etanol foram reduzidas quando comparados às outras condições, entretanto,
nos experimento 4, 6 e 17, que possuíam elevada relação sólido:líquido, a
produção de etanol foi inibida de forma semelhante. Contudo, analisando os
experimentos 8 e 15 nota-se que as variáveis A e B, quando duplamente
alteradas, não causam inibição no processo por apresentarem elevado grau de
sinergismo. Este fato também é observado nos experimentos 14 e 19, onde,
respectivamente, a carga enzimática manteve-se no nível + e no nível - e a
relação sólido:líquido manteve-se no ponto central.
Quando as 3 variáveis avaliadas estatisticamente encontravam-se em
seus pontos centrais, nos experimentos 3, 5, 9, 10, 18 e 20, a produção de
etanol ocorreu eu torno de 30 g/L, mostrando elevada reprodutibilidade no
processo. Ao compararmos os experimentos 2 e 16 nota-se que a elevada
concentração celular provocou inibição no processo, atingindo 29,2 g/L e 53,9
g/L de etanol, quando a mesma apresentava-se em seu nível inferior e superior,
respectivamente.
Na tabela 5.7 observa-se a análise de variância obtida pelo
planejamento experimental, o qual se mostrou significativo, permitindo a
avaliação preditiva dos valores gerados pelo método. O modelo quadrático foi o
escolhido para a análise estatística, por apresentar maior significância
(p<0,05), bem como maior valor de R2 observado para a produção de etanol,
em 0,8535. O parâmetro A (Relação sólido:líquido) apresentou a maior
influência, seguido do parâmetro C (Concentração celular), que, por sua vez foi
superior ao parâmetro B (Carga enzimática), que apresentou baixos valores de
Soma dos Quadrados. Apesar de apenas a variável A apresentar relevância
estatística, o modelo foi mantido hierárquico, ou seja, completo com seus
parâmetros e interações, se mantendo altamente significativo. Dentre as
interações duplas, a mais influente foi a AB (Relação sólido:líquido e Carga
enzimática), seguida de BC (Carga enzimática e Concentração celular), e AC
(Relação sólido:líquido e Concentração celular), apresentando-se pouco
significativa.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
128
A equação referente à concentração de etanol é apresentada na
equação (4).
[Etanol]= + 29,78 + 3,56A + 0,88B - 3,04C + 4,18AB - 0,33AC - 0,78BC -
9,47A2 - 10,32B2 + 2,30C2 (4)
Tabela 5.7. Análise de Variância da concentração de etanol através do
processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4, utilizando o Planejamento Superfície de Resposta 24, o qual avaliou os efeitos da Relação sólido:líquido (g:mL), Carga enzimática (FPU/g) e Concentração celular (%).
SQ GL MQ F-Valor p-valor
Modelo 3272,84 9 363,65 6,47 0,0037
A 173,22 1 173,22 3,08 0,1096
B 10,46 1 10,46 0,19 0,6753
C 125,95 1 125,95 2,24 0,1652
AB 139,86 1 139,86 2,49 0,1457
AC 0,88 1 0,88 0,016 0,9030
BC 4,88 1 4,88 0,087 0,7742
A2 1292,08 1 1292,08 23,00 0,0007
B2 1534,04 1 1534,04 27,30 0,0004
C2 76,54 1 76,54 1,36 0,2702
Residual 561,88 10 56,19
Lack of Fit 556,42 5 111,28 101,75 <0,0001
Erro Puro 5,47 5 1,09 6,47 0,0037
SQ= Soma dos Quadrados, GL= Grau de Liberdade, MQ= Média Quadrática, A= relação sólido:líquido, B= carga enzimática, C= concentração celular.
A figura 5.11 indica as interações entre Relação sólido:líquido e Carga
enzimática, mantendo-se a Concentração celular no Ponto Central. Nota-se
que a produção de etanol alcançada foi em torno de 25 g/L, quando ambos
parâmetros (A e B) estão em seus níveis médios. Experimentalmente, foram
alcançados 29,75 g/L quando todos os parâmetros mantinham-se em seus
pontos centrais, resultado próximo do teórico indicado pelo modelo.
No entanto, as condições ótimas obtidas para a produção de etanol
através do processo SSF a partir de PM2 ocorreram quando a Relação
sólido:líquido estava em seu nível médio (2:10 g/mL), a Carga enzimática
estava em seu nível médio (17,5 FPU/g) e a Concentração celular estava no
seu menor nível (1,59 % v/v), resultando na máxima concentração de etanol
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
129
em 58 g/L, a partir de 82 g/L de glicose inicial do processo e produtividade
volumétrica de 2,76 g/L.h, em biorreator instrumentado, na temperatura de
30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5 (Figura 5.12).
Figura 5.11. Superfície de resposta mostrando os efeitos da relação sólido:líquido, carga enzimática e suas interações na produção de etanol através do processo SSF a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4.
Figura 5.12. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e fermentação simultâneas a partir de resíduos da indústria de celulose por Z. mobilis CP4, em biorreator instrumentado. Condições operacionais: relação
P.H. SSF
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
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130
sólido:líquido (2:10 g/mL), carga enzimática (17,5 FPU/g) e concentração celular (1,59 %).
5.1.3. Análise da adição de diferentes componentes do meio no processo
SSF frente à produção de etanol a partir por Z. mobilis CP4 nativa
I. Bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado
Foram desenvolvidos planejamentos sequenciais objetivando-se avaliar
a influência dos nutrientes dos componentes complementares ao processo de
sacarificação e fermentação simultâneas, tais como extrato de levedura,
KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, para posterior produção de etanol por
Zymomonas mobilis.
Delineamento fatorial
Inicialmente, foi realizado um delineamento fatorial completo 24, o qual
gerou o de total de 19 experimentos, sendo 16 experimentos correspondentes
à distribuição fatorial e 3 réplicas do ponto central (Tabela 5.8). A maior
produção de etanol (53 g/L) foi atingida com as concentrações de 2,5 g/L de
extrato de levedura, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de (NH4)2SO4 e 0,5 g/L de
MgSO4.7H2O.
A presença de extrato de levedura promoveu um aumento na produção
de etanol, conforme observado nos experimentos 1 e 18, os quais possuem as
mesmas concentrações dos outros nutrientes (exceto de extrato de levedura).
Dessa forma, quando tal fonte de nitrogênio foi adicionada, a concentração de
etanol variou de 11 g/L para 53 g/L, respectivamente.
No experimento 10 não houve adição de nutrientes complementares, no
entanto, a produção de etanol ocorreu em 7 g/L, que pode ser explicada pela
presença de 44,6% de carbono, 5,8% de hidrogênio, 44,5% de oxigênio, 0,6%
de nitrogênio, 0,1% de enxofre e 4,4% de outros elementos no bagaço de cana
(SIMÕES et al., 2005). Embora, visando à obtenção de resultados mais
promissores, a bactéria Z. mobilis necessita de outros nutrientes que
contenham alguns elementos químicos, como o magnésio e o fósforo, no que
tange ao melhor funcionamento do metabolismo e à síntese celular
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
131
(OTHUMPANGAT et al., 1999). Portanto, como mostrado na literatura e
confirmado nos experimentos do presente estudo, os seguintes nutrientes,
extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, foram essenciais para
a produção de etanol nestes experimentos.
Tabela 5.8. Planejamento fatorial 24, avaliando efeitos da concentração de
extrato de levedura (g/L), KH2PO4(g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
Ex.
VARIÁVEIS RESPOSTA
E. L. (g/L)
KH2PO4 (g/L)
(NH4)2 SO4 (g/L)
MgSO4.7H2O (g/L)
Etanol (g/L)
1 0,00 1,0 0,50 0,50 11
2 0,00 1,0 0,50 0,00 6
3 2,50 0,0 0,50 0,50 38
4 2,50 0,0 0,50 0,00 38
5 0,00 1,0 0,00 0,00 15
6 0,00 0,0 0,50 0,00 11
7 1,25 0,5 0,25 0,25 40
8 2,50 1,0 0,50 0,00 14
9 2,50 1,0 0,00 0,00 13
10 0,00 0,0 0,00 0,00 7
11 0,00 0,0 0,50 0,50 12
12 2,50 0,0 0,00 0,00 12
13 1,25 0,5 0,25 0,25 43
14 0,00 0,0 0,00 0,50 15
15 2,50 0,0 0,00 0,50 34
16 2,50 1,0 0,00 0,50 9
17 1,25 0,5 0,25 0,25 45
18 2,50 1,0 0,50 0,50 53
19 0,00 1,0 0,00 0,50 13
Onde: E.L.= extrato de levedura.
A análise estatística da variância obtida pelo planejamento fatorial,
conforme indicada na tabela 5.9, mostra que o modelo foi significativo,
apresentando p<0,05, assim como o valor do coeficiente de determinação total
(R2) observado para a resposta de produção de etanol, em 0,995, sugerindo
um bom ajuste do modelo aos dados experimentais.
Além disso, o resíduo foi baixo, mostrando-se não significativo (p>0,05),
o que não invalidou o modelo para fins preditivos. As interações duplas entre
os nutrientes complementares apresentaram-se significativas, sendo a
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
132
interação AC (Extrato de levedura e (NH4)2SO4) a mais influente, seguida da
interação AD (Extrato de levedura e MgSO4.7H2O) e entre BD (KH2PO4 e
MgSO4.7H2O), mostrando-se mais significativas do que as variáveis
independentes. Dentre os influências individuais de cada variável avaliada, o
efeito linear do extrato de levedura (parâmetro A) se apresentou mais influente,
seguido do KH2PO4 (parâmetro B), que por sua vez foi mais significativo do que
o MgSO4.7H2O (parâmetro D) e, por fim, o (NH4)2SO4 (parâmetro C), que
possui baixos valores de Fisher. A interação entre as quatro variáveis também
apresentou elevados valores de Fisher, o que indica o grande sinergismo
existente entre os nutrientes na fermentação por Z. mobilis, proporcionando
maiores concentrações de etanol.
Tabela 5.9. Análise da variância da produção de etanol, empregando diferentes concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-tratado por Zymomonas mobilis CP4.
SQ GL MQ Fisher p>F
Modelo 3546,6 15 236,6 25,4 0,038
A 295,6 1 295,6 31,6 0,030 B 303,0 1 303,0 32,4 0,029
C 7,9 1 7,9 0,8 0,455
D 67,1 1 67,1 7,1 0,115
AB 13,9 1 12,91 1,3 0,360 AC 794,8 1 794,8 85,6 0,011
AD 449,1 1 449,1 48,1 0,020
BC 309,5 1 309,5 33,1 0,028 BD 383,8 1 383,9 41,1 0,023
CD 282,5 1 282,5 30,2 0,031 ABC 21,1 1 21,1 2,2 0,271
ABD 11,6 1 11,6 1,2 0,380 ACD 14,5 1 14,6 1,5 0,338
BCD 0,4 1 0,4 0,03 0,864 ABCD 595,7 1 595,7 63,8 0,015
Curvatura 1963,9 1 1963,9 210,4 0,004 Erro 18,7 2 9,3
Cor. Total 5532,1 18
SQ: Soma quadrática, GL: Grau de liberdade, MQ:Média quadrática, p>F: p-valor. A: Extrato de levedura, B: KH2PO4, C: (NH4)2 SO4, D: MgSO4.7H2O.
Os experimentos em frascos agitados foram reproduzidos em biorreator
sob condições controladas, nas seguintes condições operacionais: relação
sólido líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25 FPU/g de celulignina e
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
133
concentração inicial de células de 4 g/L (SANTOS et al., 2010) (Figura 5.13).
Após a pré-hidrólise enzimática, a bactéria foi inoculada, dando início ao
processo SSF, atingindo 53 g/L de etanol e produtividade volumétrica de 2,20
g/L.h.
Figura 5.13. Perfil cinético do processo de hidrólise enzimática de celulose e fermentação simultâneas a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis CP4, nas melhores condições preconizadas pelo modelo: 2,5 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de KH2PO4, 0,5 g/L de (NH4)2SO4 e 0,5 g/L de MgSO4.7H2O, atingindo 53 g/L de etanol, em biorreator instrumentado. Condições operacionais: relação sólido líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25 FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.
Através deste estudo preliminar foi possível constatar que os nutrientes
analisados: KH2PO4 (g/L), MgSO4.7H2O(g/L), (NH4)2SO4 e extrato de levedura
(g/L) promoveram maiores concentrações de etanol quando estavam em seus
maiores níveis: 1 g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. No entanto,
houve a necessidade de ser feito um planejamento experimental completo
visando à otimização da produção de etanol, uma vez que a curvatura
apresentou-se significativa (p<0,05). Desta forma, foram adicionados pontos
axiais, promovendo os graus de liberdade necessários para a elaboração de
um modelo quadrático que permita maximizar a concentração de etanol.
SSF P.H.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
134
Planejamento Composto Central Rotacional
Conforme descrito anteriormente, um planejamento fatorial 24 foi
realizado; no entanto, foi recomendado empregar o método de Superfície de
Resposta, adequado para identificar o efeito de variáveis individuais, buscando
então por melhores condições para um sistema multivariável eficiente,
conforme demonstrado na tabela 5.10 (YU et al., 2009).
Tabela 5.10. Planejamento Composto Central 24, avaliando efeitos da adição de extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) na produção de etanol através do processo SSF a partir de bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
Exp.
Variáveis Resposta
E. L. (g/L)
KH2PO4
(g/L) (NH4)2SO4
(g/L) MgS04.7H20
(g/L) Etanol (g/L)
1 6,25 1,25 0,75 0,75 54,2
2 18,75 1,25 0,75 0,75 62,6 3 6,25 3,75 0,75 0,75 45,7 4 18,75 3,75 0,75 0,75 59,3 5 6,25 1,25 2,25 0,75 38,1 6 18,75 1,25 2,25 0,75 60,3 7 6,25 3,75 2,25 0,75 34,8
8 18,75 3,75 2,25 0,75 52,4 9 6,25 1,25 0,75 2,25 32,9 10 18,75 1,25 0,75 2,25 57,8 11 6,25 3,75 0,75 2,25 33,2 12 18,75 3,75 0,75 2,25 56,4
13 6,25 1,25 2,25 2,25 28,5 14 18,75 1,25 2,25 2,25 54,7 15 6,25 3,75 2,25 2,25 48,1 16 18,75 3,75 2,25 2,25 63,0 17 0,0 2,5 1,5 1,5 30,4 18 25,0 2,5 1,5 1,5 65,4
19 12,5 0,0 1,5 1,5 33,6 20 12,5 5,0 1,5 1,5 38,2 21 12,5 2,5 0,0 1,5 34,9 22 12,5 2,5 3,0 1,5 37,3 23 12,5 2,5 1,5 0,0 34,1
24 12,5 2,5 1,5 3,0 62,7 25 12,5 2,5 1,5 1,5 65,2
26 12,5 2,5 1,5 1,5 63,4 27 12,5 2,5 1,5 1,5 62,6 28 12,5 2,5 1,5 1,5 61,3 29 12,5 2,5 1,5 1,5 62,8
30 12,5 2,5 1,5 1,5 60,0 Onde: E.L.: extrato de levedura.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
135
Os parâmetros analisados foram os mesmos do Planejamento Fatorial,
concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O,
adicionados à celulignina pré-tratada no início da hidrólise, que junto com a
glicose gerada, permitiu a implementação do processo de sacarificação e
fermentação simultâneas. A maior concentração de etanol obtida foi de 65 g/L,
com 12,5 g/L de extrato de levedura, 2,25 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L (NH4)2SO4 e
1,5 g/L de MgSO4.7H2O. A presença de maiores concentrações de extrato de
levedura, rico em nitrogênio, aumentou significativamente a produção de
etanol, como indicado pela comparação dos experimentos 9 e 10. Estes
possuem as mesmas concentrações de nutrientes, entretanto, quando o extrato
de levedura foi acrescentado, a produção de etanol aumentou de 18 g/L a 40
g/L.
Nos experimentos de 17, 19, 21 e 23, os quais não foram adicionados de
extrato de levedura (g/L), KH2PO4 (g/L), (NH4)2SO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L), o
etanol foi produzido nas concentrações de 11, 37, 26 e 26 g/L,
respectivamente. Adicionalmente, comparando os resultados entre os
experimentos 1 e 15, nota-se que o efeito sinérgico entre os parâmetros
analisados faz-se necessário, uma vez que foram empregadas baixas
concentrações de todos os nutrientes adicionados, assim como elevadas
concentrações dos mesmos, com exceção de extrato de levedura, atingindo 38
g/L e 15 g/L de etanol, respectivamente.
A análise estatística de variância obtida pelo Planejamento Composto
Central Rotacional, indicado na tabela 5.11, mostra que o modelo foi muito
significativo, com p<0,05, apresentando elevado coeficiente de determinação
total (R2) observado para a resposta ao etanol, em 0,995. Além disso, o resíduo
foi baixo e não significativo (p>0,05), o que não invalidou o modelo para fins de
preditivos.
O modelo da concentração de etanol é apresentado na equação (5).
[Etanol]=+52.17+131,29A+3,05B+2,50C+6,59D1,00AB+0,38AC+2,00AD+1,50B
C+3,63BD+3,50CD+8,65A2-5,07B2-5,04C2-59D2-0,88ABC-1,25ABD-
1,88ACD+1,50BCD-2,43A2B-3,50A2C-8,96A2D-85,12AB2-36,42A3 (5)
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
136
Tabela 5.11. Análise de variância da produção de etanol, empregando diferentes
concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, através do processo SSF a partir do bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
SQ GL MQ F-Valor p > F
Modelo 4892,51 22 222,39 69,32 < 0,0001 A 481,44 1 481,44 150,06 < 0,0001 B 749,55 1 749,55 233,62 < 0,0001 C 72,52 1 72,52 22,60 0,0021 D 301,53 1 301,53 93,98 < 0,0001
AC 7,56 1 7,56 2,36 0,1686 AD 45,56 1 45,56 14,20 0,0070 BC 52,56 1 52,56 16,38 0,0049 BD 175,56 1 175,56 54,72 0,0001 CD 162,56 1 162,56 50,67 0,0002
A2 360,80 1 360,80 112,46 < 0,0001
B2 174,42 1 174,42 54,37 0,0002
C2 1046,50 1 1046,50 326,18 < 0,0001
D2 534.53 1 534.53 166.61 < 0.0001
ABC 22.56 1 22.56 7.03 0.0329 ABD 14.06 1 14.06 4.38 0.0746 ACD 39.06 1 39.06 12.18 0.0101 BCD 52.56 1 52.56 16.38 0.0049
A2B 749.31 1 749.31 233.55 < 0.0001
A3 13.48 1 13,48 4,20 0,0795
B3 726,28 1 726,28 226,37 < 0,0001
C3 103,83 1 103,83 32,36 0,0007
D3 567,00 1 567,00 176,73 < 0,0001
Resíduo 22,46 7 3,21 Lack of Fit 7,62 2 3,81 1,29 0,3545 Erro Puro 14,83 5 2,97 Cor Total 4914,97 29
SQ= Soma dos Quadrados, GL=Grau de Liberdade, MQ=Média Quadrática, A: Extrato de levedura, B: KH2PO4, C: (NH4)2 SO4, D: MgSO4.7H2O.
A variável B (KH2PO4) apresentou maior influência no modelo, seguida
da A (extrato de levedura), por sua vez a D (MgSO4.7H2O) e, finalmente, a C
([NH4]2SO4), que possui baixos valores de Soma dos Quadrados. A interação
das variáveis também resultou em altos valores de Fisher, o que aponta para
um elevado sinergismo entre os nutrientes na fermentação por Z. mobilis,
promovendo maior produção de etanol. A interação entre B e D (KH2PO4 e
MgSO4.7H2O) mostrou-se a mais significativa estatisticamente, seguida da
interação entre C e D ([NH4]2SO4 e MgSO4.7H2O) e entre B e C (KH2PO4 e
[NH4]2SO4). As interações duplas entre os nutrientes analisados para a
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
137
produção de etanol indicam que a interação entre KH2PO4 (g/L) e extrato de
levedura (g/L) é reduzida, sendo retirada do modelo. No entanto, o KH2PO4,
possui elevadas interações entre as variáveis representadas por (NH4)2SO4
(g/L) e MgSO4.7H2O (g/L).
A Figura 5.14 mostra os gráficos de superfície de resposta,
apresentando a interação entre os parâmetros A, B, C e D, que representam o
extrato de levedura, o KH2PO4, o (NH4)2SO4, assim como o MgSO4.7H2O,
respectivamente.
Figura 5.14. Superfície de resposta mostrando efeitos de MgSO4.7H2O (g/L) e (NH4)2SO4 (A), KH2PO4 (g/L) e MgSO4.7H2O (g/L) (B), KH2PO4 (g/L) e (NH4)2SO4
(C)e suas interações para a produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir do bagaço de cana pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
138
Na figuras 5.14 (A) (interação entre o MgSO4.7H2O e o (NH4)2SO4) e
5.14 (B) (interação entre o MgSO4 e o KH2PO4), a produção de etanol
encontra-se em seu nível ótimo quando os mesmos encontram-se dos seus
níveis mínimos aos pontos centrais, mantendo os outros parâmetros nos níveis
médios. Já a figura 5.14 (C) mostra que a produção de etanol está em seu nível
ótimo quando as variáveis B e C, KH2PO4 (g/L) e (NH4)2SO4, respectivamente,
estão nos seus pontos centrais.
Os resultados obtidos nos presentes experimentos são semelhantes aos
relatados por Yu et al. (2009), que otimizaram as concentrações de nutrientes
em meio sintético e notaram um efeito significativo do extrato de levedura sobre
a biomassa, quando o mesmo está associado à fonte de carbono. Os autores
observaram que o aumento da concentração de sulfato de amônio resulta em
um aumento na produção de etanol; entretanto, em níveis elevados podem
causar inibição. Assim como tais pesquisadores, nenhuma variação
significativa foi observada com a adição de fontes de fosfato e nitrogênio,
tornando o fosfato de potássio, bem como o sulfato de amônio estatisticamente
insignificantes. Provavelmente, o excesso de nitrogênio pode promover maior
produção de biomassa em relação à produção de etanol.
A reprodução das melhores condições estabelecidas pelo planejamento
experimental, relação de sólido:líquido de 3:10 (g:mL), carga enzimática de 25
FPU/g e concentração celular de 4 g/L, foi realizada em biorreator
instrumentado, atingindo 65 g/L de concentração de etanol, e produtividade
final de 2,70 g/L.h, a partir de 85 g/L de glicose inicial do processo, na
temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150 rpm e pH 5 (Figura 5.15).
Os resultados obtidos mostraram que foi possível otimizar a produção de
etanol através da análise da adição de nutrientes no meio de fermentação,
após a execução de planejamentos experimentais sequenciais. Foi constatado
que o aumento da concentração de KH2PO4, o qual possui fósforo, utilizado
nas vias metabólicas do mecanismo energético das células, foi o principal
responsável pelo aumento da concentração de etanol, seguido do extrato de
levedura, MgSO4.7H2O e (NH4)2SO4. Dessa forma, as condições ótimas obtidas
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
139
para o processo SSF a partir do bagaço de cana foram as seguintes: extrato de
levedura (12,5 g/L), KH2PO4 (2,5 g/L), (NH4)2SO4 (1,5 g/L) e MgSO4 (1,5 g/L),
resultando na concentração máxima de etanol em 65 g/L, com 85 g/L de
concentração inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumétrica de
2,63 g/L.h, na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150rpm e pH 5 em
biorreator instrumentado.
Figura 5.15. Perfil cinético da produção de etanol a partir de bagaço de cana
pré-tratado, na relação sólido:líquido 3:10 (g:mL) e carga enzimática de 25 FPU/ g, através do processo SSF por Z. mobilis CP4, utilizando 12,5 g/L de extrato de levedura, 2,5 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L de (NH4)2SO4 e 1,5 g/L MgSO4.7H2O no meio fermentativo. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.
II. Resíduo da indústria de celulose
O mesmo planejamento experimental utilizado anteriormente, para a
avaliação da adição de nutrientes adicionados na fermentação a partir do
bagaço de cana pré-tratado, foi empregado no processo SSF a partir de
resíduo da indústria de celulose, avaliando diferentes concentrações de
nutrientes adicionais, extrato de levedura, KH2PO
4, (NH
4)2SO
4 e MgSO
4.7H
2O
(Tabela 5.12).
P.H. SSF
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
140
Tabela 5.12. Planejamento Superfície de Resposta 24 investigando efeitos da
adição de extrato de levedura, KH2PO
4, (NH4)
2SO
4 e MgSO
4.7H
2O na
produção de etanol a partir de resíduos da indústria de celulose, na relação sólido:líquido 2:10 (g:mL) e carga enzimática de 17,5 FPU/ g, por Z. mobilis CP4.
Ex.
Variáveis Resposta
E. L.
(g/L)
KH2PO4
(g/L)
(NH4)2 SO4
(g/L)
MgS04.7H20
(g/L)
Etanol
(g/L)
1 6,25 1,25 0,75 0,75 38,1
2 18,75 1,25 0,75 0,75 33,5
3 6,25 3,75 0,75 0,75 18,6
4 18,75 3,75 0,75 0,75 14,3
5 6,25 1,25 2,25 0,75 39,3
6 18,75 1,25 2,25 0,75 44,0
7 6,25 3,75 2,25 0,75 37,7
8 18,75 3,75 2,25 0,75 40,6
9 6,25 1,25 0,75 2,25 18,2
10 18,75 1,25 0,75 2,25 40,8
11 6,25 3,75 0,75 2,25 32,5
12 18,75 3,75 0,75 2,25 32,6
13 6,25 1,25 2,25 2,25 45,4
14 18,75 1,25 2,25 2,25 29,3
15 6,25 3,75 2,25 2,25 19,1
16 18,75 3,75 2,25 2,25 35,0
17 0,0 2,5 1,5 1,5 11,7
18 25,00 2,5 1,5 1,5 34,8
19 12,5 0,0 1,5 1,5 37,9
20 12,5 5,0 1,5 1,5 24,1
21 12,5 2,5 0,0 1,5 26,3
22 12,5 2,5 3,0 1,5 3,2
23 12,5 2,5 1,5 0,0 26,9
24 12,5 2,5 1,5 3,0 37,0
25 12,5 2,5 1,5 1,5 13,3
26 12,5 2,5 1,5 1,5 34,5
27 12,5 2,5 1,5 1,5 35,6
28 12,5 2,5 1,5 1,5 23,1
29 12,5 2,5 1,5 1,5 34,7
30 12,5 2,5 1,5 1,5 38,2
Onde: E.L.= extrato de levedura
Os resultados obtidos nestes experimentos mostram que as
concentrações dos nutrientes precisam ser alteradas proporcionalmente, pois,
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
141
em geral, quando ocorre um aumento excessivo de apenas um componente do
meio, observa-se um decréscimo na produção de etanol. Como exemplo, nos
experimentos 21 e 22, as concentrações de etanol foram alteradas de 26 g/L
para 3 g/L quando (NH4)2SO
4 teve a sua concentração aumentada e a dos
outros nutrientes mantiveram-se constantes, respectivamente.
Nos experimentos 6 e 13 nota-se que maiores proporções de MgSO4 e
menores proporções de extrato de levedura resultaram em altas concentrações
de etanol, uma vez que os melhores resultados foram obtidos quando estas
variáveis encontravam-se nos seus níveis (+) e (-), alcançando 44 e 45 g/L,
respectivamente.
A análise estatística de variância obtida pelo planejamento experimental,
apresentada na tabela 5.13, indica que o modelo quadrático foi o mais
adequado, por apresentar maior significância (p<0,05) e maior valor de R2
(0,770) para a produção de etanol. O Lack of fit mostrou-se significativo, pois
apenas o parâmetro A (extrato de levedura) teve elevada influência
individualmente, embora as interações duplas também tenham se apresentado
significativas (com exceção da AD, entre extrato de levedura e MgSO4).
Portando, o modelo foi mantido hierárquico, ou seja, completo com seus
parâmetros e interações, apresentando-se significativo.
A equação referente à concentração de etanol é apresentada na
equação (6).
[Etanol] = +37,42+4,81 A + 0,81B -1,52C +2,70D -0,22AB-3,28AC+5,00AD
+3,42BC-1,56BD+5,16CD -2,81A2-1,81B
2- 2,19C
2 -2 44D2 (6)
Dentre os nutrientes analisados do Planejamento Composto Central, a
variável A (extrato de levedura) apresentou a maior influência, seguida da
variável D (MgSO4.7H2O), que, por sua vez foi superior à variável C
((NH4)2SO4) e, finalmente, à variável B (KH2PO4), a qual apresentou baixos
valores de Soma dos Quadrados (SQ). Dentre as interações duplas, a mais
influente foi entre C e D ([NH4]2SO4), seguida da interação entre A e D (extrato
de levedura e MgSO4.7H2O), entre B e C (KH2PO4 e (NH4)2SO4), A e C (extrato
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
142
de levedura e (NH4)2SO4), B e D (KH2PO4 e (NH4)2SO4) e, por fim, entre A e B
(extrato de levedura e KH2PO4), apresentando-se pouco significativa.
Tabela 5.13. Análise de variância da produção de etanol, empregando
diferentes concentrações de extrato de levedura, KH2PO4, (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O, através do processo SSF por Zymomonas mobilis CP4 a partir de resíduo da indústria de celulose.
SQ GL MQ F-Valor p-valor
Modelo 2452,78 14 175,20 3,59 0,0097
A 554,25 1 554,25 11,34 0,0042
B 15,71 1 15,71 0,32 0,5791
C 55,11 1 55,11 1,13 0,3051
D 175,22 1 175,22 3,59 0,0777
AB 0,76 1 0,76 0,016 0,9025
AC 171,66 1 171,66 3,51 0,0805
AD 399,90 1 399,90 8,18 0,0119
BC 186,98 1 186,98 3,83 0,0693
BD 39,18 1 39,18 0,80 0,3847
CD 426,66 1 426,66 8,73 0,0098
A2 216,81 1 216,81 4,44 0,0524
B2 90,01 1 90,01 1,84 0,1948
C2 131,13 1 131,13 2,68 0,1222
D2 162,83 1 162,83 3,33 0,0879
Resíduo 732,97 15 48,86
Lack of Fit 712,08 10 71,21 17,04 0,0030
Erro Puro 20,90 5 4,18
Cor. Total 3185,75 29
SQ= Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Média Quadrática A: Extrato de levedura; B: KH2PO4; C: (NH4)2 SO4; D: MgSO4.7H2O.
De acordo com a análise de superfície de resposta, na figura 5.16 (A) é
possível observar as interações entre extrato de levedura e MgSO4.7H2O
(mantendo (NH4)2SO
4 e KH2PO
4 em seus pontos centrais), constatando que a
maior produção de etanol ocorre quando AD estão em seus níveis máximos, o
que aponta para a ampliação das faixas de estudo deste planejamento. A figura
5.16 (B) indica para a redução das concentrações de KH2PO4 e de (NH4)2SO4
(g/L); assim como a figura 5.16 (C) avalia as interações entre (NH4)2SO4 e
MgSO4.7H2O e indica que a maior produção de etanol ocorre na faixa dos
pontos centrais.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
143
Figura 5.16. Superfícies de resposta mostrando efeitos de extrato de levedura e MgSO4.7H2O (A); KH2PO4 e (NH4)2SO4 (B); (NH4)2SO4 e MgSO4.7H2O (C) e
suas interações na produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de resíduo da indústria de celulose.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
144
As condições ótimas obtidas para a produção de etanol através do
processo SSF a partir de PM2 foram: extrato de levedura (6,25 g/L), KH2PO
4
(1,25 g/L), (NH4)2SO
4 (2,25 g/L) e MgSO
4 (2,25 g/L), resultando na máxima
concentração de etanol (54 g/L), a partir de 91 g/L de glicose inicial do
processo, após pré-hidrólise enzimática de 12 horas, na temperatura de 50ºC,
relação sólido:líquido de 2:10 g/mL e carga enzimática de 17,5 FPU/g; seguida
de posterior adição de 1,59% (v/v) de células (após 20 h de crescimento
celular), na temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5, em biorreator
instrumentado (Figura 5.17).
Figura 5.17. Perfil cinético da melhor condição obtida (extrato de levedura, 6,25
g/L; KH2PO4, 1,25 g/L; (NH4)2SO4, 2,25 g/L e MgSO4, 2,25 g/L) para a produção de etanol através do processo SSF por Z. mobilis CP4 a partir de resíduo da indústria de celulose, em biorreator instrumentado. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSF: fermentação e sacarificação simultâneas.
Neste contexto, conclui-se que a presença de todos os nutrientes
analisados (extrato de levedura, (NH4)2SO
4, KH2PO
4 e MgSO
4) são de extrema
importância para o crescimento bacteriano nestes experimentos, assim como
para a produção de etanol. Nota-se que a produção de etanol a partir de PM2
foi inferior à alcançada por Silva et al. (2009), de aproximadamente 78 g/L,
SSF P.H.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
145
contudo, estes autores reportaram o valor de produtividade volumétrica de 1,23
g/L.h, ao passo este parâmetro foi de 3,6 g/L.h no presente trabalho.
5.1.4. Análise Comparativa
Os resultados deste trabalho foram superiores aos alcançados por
diversos autores que empregaram a levedura Saccharomyces cerevisiae no
que tange à produção de etanol através do processo SSF. Kang et al. (2010)
utilizaram lama de cal proveniente da indústria de celulose como matéria-prima,
tendo sido atingido 45 g/L de etanol após 150 h. Já Ruiz et al. (2010) utilizaram
madeira de oliva e caule de girassol, alcançando apenas 29,4 g/L e 20,9 g/L de
etanol, respectivamente, após 72 h. Linde et al. (2006) reportaram a
concentração de 25 g/L de etanol após 120 h de processo realizado com palha
de cevada. E, Martin et al. (2002) obtiveram apenas 12 g/L de etanol a partir de
bagaço de cana, após 48 h; enquanto Zhu et al. (2010) atingiram 41,8 g/L de
etanol a partir de cavaco de pinus.
A tabela 5.14 compara os resultados obtidos no presente trabalho com
outros reportados na literatura empregando linhagens nativas da bactéria
Zymomonas mobilis, em termos de produtividade e produção de etanol 2G,
para o processo utilizando materiais de composição lignocelulósica.
Tabela 5.14. Principais resultados relatados na literatura para o processo a partir
de matéria-prima lignocelulósica com linhagens nativas de Z. mobilis.
Onde: MP: matéria-prima; S: substrato; P: produto; Qp: produtividade
volumétrica; gli: glicose; sig: sigmacell; ART: acúcares redutores totais; SR: sistema reacional; FA: frascos agitados; BR: biorreator. Referência Bibliográfica: 1. Golias et al. (2002); 2. Eklund & Zachi (1995); 3. Ma et al. (2009); 4. este trabalho.
MP/Meio S (g/L) Xo SR P (g/L) Qp (g/L.h) Ref.
Sigmacell 100 sig 0,3 g/L FA 36 0,3 1
Salgueiro 61 gli 3 g/L FA e BR 29 0,6 2
Lixo de Cozinha 70 ART 10% (v/v) FA 52 1,44 3
Bagaço de cana 80 gli 4 g/L FA e BR 60 1,66 4
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
146
No experimento realizado por Golias et al. (2002), em que foi utilizada
uma associação de Z. mobilis com K. oxytoca P2 termotolerante, foi obtida uma
concentração de etanol de 36 g/L, em 120 horas de processo, possivelmente
porque a cargas enzimática e as concentrações celulares foram baixas (15
FPU/g e 0.320 g/L, respectivamente), além da temperatura de 35°C não ser a
ideal para linhagens da bactéria Z. mobilis, o que pode ter causado lentidão no
processo, conforme sinalizado anteriormente. Os autores também analisaram o
desempenho de Saccharomyces pastorianus e de Z. mobilis separadamente, e
o resultado de produção de etanol foi semelhante, em torno de 37 g/L e 40 g/L
respectivamente.
O trabalho de Eklund & Zachi (1995) foi o mais semelhante ao presente
estudo em relação às condições operacionais do processo fermentativo, pois
foi utilizado um resíduo lignocelulósico (Salgueiro, espécie Salix caprea),
empregando Z. mobilis sem a associação com outros microrganismos. Os
autores visaram otimizar o processo através de um planejamento experimental,
no qual as melhores condições alcançadas foram as seguintes: carga
enzimática (18 FPU/g), concentração celular (3 g/L) e nutrientes adicionais ao
meio, extrato de levedura (2,5 g/L), (NH4)2HPO4 (0,25 g/L), MgSO4.7H20 (0,025
g/L) e 0,1 M de tampão fosfato (pH 5).
Ainda segundo Eklund & Zachi (1995), foram feitas comparações entre o
processo SSF e SHF, e, embora os autores tenham alcançado concentrações
de etanol de 29 g/L, em 48 horas de fermentação, o processo SSF reduziu a
formação de subprodutos em relação ao processo SHF. Além deste estudo, foi
feita uma comparação entre o desempenho da bactéria Zymomonas mobilis
com a levedura Saccharomyces cerevisae, apresentando resultados
semelhantes nas mesmas condições operacionais. Adicionalmente, estes
autores verificaram que um aumento na concentração celular da levedura de 4
para 10 g/L resultava em um acréscimo na produção de etanol de 29 para a 39
g/L. Contudo, o mesmo não foi observado quando a bactéria Z. mobilis foi
utilizada, uma vez que o aumento na concentração celular para 10 g/L não
apresentou influência significativa na concentração final de etanol, a qual
manteve-se em torno de 29 g/L. Cabe ressaltar que a temperatura de 37°C
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
147
pode ter promovido uma redução na produção de etanol, uma vez que 30°C é a
temperatura ideal ótima para o metabolismo de Zymomonas mobilis. De forma
semelhante, no presente trabalho, quando concentrações elevadas de células
eram empregadas na fermentação por PM2, os resultados de produção de
etanol alcançados também se mostraram reduzidos.
Ma et al. (2009) empregaram lixo de cozinha, que continha resíduos de
celulose, amido, gordura, proteína e glicose, e, empregando a estratégia SSF,
atingiram resultados semelhantes aos obtidos no presente estudo (Tabela
5.10). Os autores também avaliaram a utilização de uma linhagem ácido-
tolerante (Z. mobilis GZNS1), sob condições estéreis e não estéreis,
apresentando resultados semelhantes aos obtidos com a linhagem selvagem,
atingindo-se concentrações de etanol de 48 g/L e 46 g/L, respectivamente, em
36 h de processo, na temperatura de 30°C.
O bagaço de cana de açúcar pré-tratado e o resíduo da indústria de
celulose (PM2) apresentaram grande potencial para a produção de etanol de
segunda geração por Z. mobilis, obtendo a maior produção de etanol em 65 g/L
e 58 g/L; assim como 2,70 e 3,6 g/L.h de produtividade volumétrica,
respectivamente (Tabela 5.15).
Tabela 5.15. Resultados obtidos pela linhagem nativa de Zymomonas mobilis
CP4 a partir do processo SSF e a partir da fermentação em meio sintético.
Experimentos Condições Valores máximos
So (g/L) tf (h) Xo P (g/L) QP (g/L.h)
Ensaios prévios
Meio sintético 17 19 10% (v/v) 6,3 0,33
Bagaço de cana-de-açúcar
1 80,3 40 4 g/L 60,7 1,52
2 85 24 4 g/L 65 2,70
Resíduo da indústria de celulose
3 82 21 1,59% (v/v) 58 2,76
4 91 15 1,59% (v/v) 54 3,6
Onde: S0: concentração inicial de glicose, tf (h): tempo de fermentação, X0: concentração inicial de células, P: concentração final de etanol, Qp: produtividade volumétrica. 1 e 3: avaliação da concentração inicial de células, carga enzimática e relação sólido:líquido (g:mL) no processo a partir do bagaço de cana e de PM2, respectivamente; 2 e 4: avaliação da adição de extrato de levedura, KH
2PO
4,
(NH4)2SO
4 e MgSO
4 no meio pré-hidrolisado a partir do bagaço de cana e de
PM2, respectivamente.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
148
Analisando-se comparativamente os resultados do presente trabalho no
que tange ao processo SSF empregando o microrganismo Z. mobilis
naturalmente ocorrente, após o pré-tratamento enzimático de 12 horas, as
concentrações iniciais de glicose a partir do bagaço de cana foram inferiores às
alcançadas a partir de PM2, obtendo-se 85 e 91 g/L deste açúcar,
respectivamente, embora as concentrações de etanol tenham sido ligeiramente
superiores às atingidas a partir do resíduo de celulose. O fato do PM2 ter
apresentado valores superiores de glicose inicial pode ter sido o motivo pelo
qual a produtividade volumétrica foi superior à obtida a partir do bagaço, em
torno de 3,6 g/L.h e 2,7 g/L.h, respectivamente.
Os níveis de celobiose permaneceram praticamente inalterados ao longo
do processo SSF empregando resíduos da indústria de celulose, ao passo que
utilizando o bagaço de cana, tais níveis apresentaram uma pequena redução,
mostrando que a enzima -glucosidase manteve boa atividade, uma vez que as
concentrações de celobiose encontraram-se próximas de zero ao final do SSF.
A glicose foi consumida de forma integral ao final do processo, o que mostra
que este açúcar foi facilmente fermentado pela bactéria.
Através dos resultados obtidos no presente estudo e dos experimentos
reportados na literatura conclui-se que Z. mobilis tem o potencial de
revolucionar a indústria de etanol combustível comercialmente no que tange ao
aproveitamento da fração celulósica, não só em escala laboratorial, mas
também piloto e industrial, pois a bactéria pode gerar um rendimento próximo
ao máximo teórico a partir de várias matérias-primas, incluindo a cana-de-
açúcar (RODRIGUEZ et al., 1986), mandioca; sagu (LEE et al., 1986) e
hidrolisados enzimáticos de derivados de celulose de madeira (PARK et al.,
1993; PAREKH et al., 1989). No entanto, uma limitação ao potencial da
bactéria Z. mobilis naturalmente ocorrente para a produção industrial de etanol
é a sua capacidade de utilizar apenas glicose, frutose ou sacarose como fonte
de energia, como descrito no capítulo de Revisão Bibliográfica, além de não
fermentar a xilose (açúcar abundante na fração hemicelulósica do bagaço de
cana), conforme observado no item 5.1.1, a menos que seja geneticamente
modificada (LAWFORD et al., 1997 e YANASE et al., 2005).
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
149
5.2. LINHAGEM RECOMBINANTE DE Zymomonas mobilis
Devido ao limitado espectro de açúcares fermentáveis pela bactéria Z.
mobilis nativa, buscamos pela construção de uma linhagem recombinante
deste microrganismo, através da incorporação de genes responsáveis pela
metabolização da xilose, açúcar mais abundante da fração hemicelulósica do
bagaço de cana-de-açúcar.
5.2.1. Etapa pós-transformação
Após a alteração genética do microrganismo Z. mobilis notou-se que o
mesmo apresentou crescimento em glicose (20 g/L) adicionada ao meio RM,
incluindo 10 mg/L de tetraciclina, conforme se observa na figura 5.18.
A linhagem naturalmente ocorrente apresentou crescimento
praticamente nulo, diferentemente das linhagens geneticamente modificadas,
ORI e ORI ZYMO, que apresentaram crescimento de diversas colônias,
mostrando estarem devidamente transformadas para a resistência à
tetraciclina. Uma vez que o gene de resistência ao antibiótico está associado
ao gene de metabolização da xilose, a linhagem ORI ZYMO aparentemente
também seria modificada de forma simultânea, conforme observado nos
próximos experimentos.
Figura 5.18. Crescimento de diferentes linhagens de Z. mobilis após 168 h de crescimento frente à utilização de meio RMG, contendo glicose (20 g/L), KH2PO4 (2 g/L), extrato de levedura (10 g/L), ágar (20 g/L) e tetraciclina (10 mg/L), na temperatura de 30C. (A) Z. mobilis naturalmente ocorrente; (B) ORI:
bactéria cujo plasmídeo contém apenas o gene de resistência ao antibiótico; (C) ORI ZYMO: bactéria cujo plasmídeo contém o gene de resistência ao
antibiótico, assim como o gene da metabolização de xilose.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
150
5.2.2. Adaptação Metabólica em meio sintético
Yanase et al. (2007) já haviam afirmado sobre a necessidade de
aclimatações sucessivas na espécie recombinante Zymobarcter palmae no que
se refere a maiores rendimentos em etanol. Após tal procedimento, os autores
obtiveram aumento de 91% a 95% na eficiência da produção de etanol, bem
como redução de 5 a 8 horas de processo, quando as células eram crescidas
em xilose. Contudo, utilizando misturas de glicose e xilose, os resultados não
apresentaram alterações significativas. Visando otimizar a metabolização desta
pentose, buscando pela redução da produção de xilitol, Zhang et al. (2002) e
Viitanem et al. (2008) constataram que as linhagens de Zymomonas mobilis,
transformadas geneticamente, necessitam de um processo de adaptação para
posterior conversão da pentose.
A produção de 90 g/L de etanol, alcançada por Agrawal et al. (2011) foi
obtida após a aplicação do processo de adaptação metabólica, durante 80 dias,
através de 30 ciclos de aclimatações. As primeiras colônias foram crescidas no
meio RMGX e, posteriormente, os autores realizaram um aumento gradual da
concentração da pentose. Posteriormente, as culturas selecionadas
apresentaram maiores valores de atividade da enzima xilose isomerase, a qual
promoveu maior conversão a etanol e menor produção de xilitol pela pentose;
todavia, a atividade de XI ainda se apresentou baixa quando comparada às
outras três enzimas, XK, TAL, TKL. Adicionalmente, as colônias adaptadas e
as originais foram sequenciadas, porém nenhuma diferença genética pôde ser
comprovada. Os autores relataram sobre uma possível mutação envolvendo a
transcrição de XI das duas culturas. No entanto, tal fato não foi confirmado
através da técnica de SDS-PAGE, devido aos baixos níveis enzimáticos.
Dessa forma, os primeiros ciclos adaptativos desenvolvidos no presente
trabalho continham glicose em altas concentrações e baixas concentrações de
xilose; na medida em que os repiques eram realizados, as concentrações de
glicose eram reduzidas e as de xilose eram elevadas (Tabela 5.16). Conforme
relatado anteriormente, imediatamente após a transformação genética, o
microrganismo apresentava crescimento lento, em cerca de 170 horas, quando
comparado com os resultados desenvolvidos pela linhagem nativa, que cresciam
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
151
e fermentavam em até 48 horas. Após o 20o ciclo de repiques, o tempo de
crescimento bacteriano reduziu para cerca de 72 horas, aumentando lentamente
o consumo de xilose e acelerando o crescimento celular.
Tabela 5.16. Processo de adaptação metabólica mediante 50 ciclos, variando as concentrações de glicose e xilose em meio sintético.
Ciclos Tempo
(Dias)
Glicose inicial
(g/L)
Xilose inicial
(g/L)
Etanol*
(g/L)
Biomassa*
(g/L)
1-10 70 15 5 2,3 0,05
11-19 30 10 10 4,1 0,08
20-25 20 7,5 13,5 3,9 0,100
26-30 15 5 15 4,6 0,166
31-40 15 2,5 17,5 4,1 0,159
41-50 10 1,5 18,5 4,2 0,158
*Ao final do último ciclo.
A fase exponencial celular se estendeu após o 25o ciclo, atingindo 0,17 g/L
em cerca de 70 horas, nas concentrações de 15 g/L de xilose e 5 g/L de glicose,
adicionados do meio RM líquido. Por outro lado, as culturas dos primeiros ciclos
adaptativos atingiram valores de 0,05 g/L de células, durante 96 horas, nas
mesmas condições de processo, adicionadas de 15 g/L de glicose e 5 g/L de
xilose, concentrações favoráveis ao crescimento. Portanto, apesar de serem
necessárias melhorias na fermentação por Zymomonas mobilis geneticamente
modificada, o tempo de fermentação, assim como a tolerância à pentose foram
alterados.
Adicionalmente, a tabela 5.17 compara as variáveis de resposta deste
processo, avaliando diferentes etapas da adaptação metabólica em meio
sintético. Através destes cálculos foi confirmado que essa técnica tende a
promover melhores resultados de crescimento bacteriano, produção de etanol e
produtividade volumétrica, indicando que as colônias adaptadas (ciclo 40 a 50)
obtiveram em torno de duas vezes os valores alcançado nos primeiros ciclos (1
ao 10), em 0,05 g/L e 0,158 g/L de crescimento bacteriano; 2,3 g/L e 4,2 g/L de
produção de etanol; assim como 0,02 g/L.h e 0,04 g/L.h de produtividade
volumétrica para as colônias dos ciclos 1 a 10 e dos ciclos 40 a 50,
respectivamente.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
152
Tabela 5.17. Comparação das variáveis de resposta entre diferentes etapas de
adaptação metabólica.
Variáveis medidas e calculadas Ciclo 1-10 Ciclo 40- 50
Etanol (g/L)* 2,3 4,2
Células (g/L)* 0,05 0,158
Produtividade (g/L.h)* 0,02 0,04
*Ao final do último ciclo
A figura 5.19 sumariza o processo de adaptação metabólica em meio
sintético, indicando que as colônias de Z. mobilis recombinante aumentaram os
níveis de produção de etanol nos ciclos iniciais (1-30), porém mantiveram tais
níveis nos ciclos posteriores (31-50). Entretanto, cabe ressaltar que a técnica
aplicada nesta linhagem necessita de adaptações posteriores, no intuito de
reduzir integralmente as concentrações de glicose e aumentar a de xilose,
reduzindo o tempo de crescimento e de fermentação do microrganismo em
questão.
Figura 5.19. Histograma representando os 50 ciclos de adaptação metabólica, empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis em meio sintético.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
153
5.2.3. Ensaios preliminares avaliando o consumo de glicose e xilose em
meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada
I. Planejamento Experimental
O intuito desta série experimental foi promover maior crescimento de
biomassa, portanto, os experimentos foram desenvolvidos em cultivo
estacionário (sem agitação), assim como em baixas concentrações de
substrato. Dessa forma, foi desenvolvido um planejamento experimental de
superfície de resposta avaliando a produção de etanol e o crescimento de
biomassa frente ao consumo de glicose e xilose em diferentes concentrações.
Os ensaios foram realizados após a execução de 10 ciclos de adaptação
metabólica e os resultados estão apresentados na tabela 5.18. Adicionalmente,
a tabela 5.19 indica outras condições empregadas de concentrações destes
açúcares, baseados nos estudos de Agrawal et al. (2011).
Aparentemente, nota-se que tal microrganismo utiliza os açúcares, em
sua maior proporção para o crescimento celular, atingindo 0,180 g/L. A maior
produção de etanol (7,5 g/L) ocorreu no experimento 13, a partir de 20 g/L de
glicose, 20 g/L de xilose, 2 g/L de KH2PO4, 10 g/L de extrato de levedura, e 10
mg/L de tetraciclina, no período de 72 horas. Cabe ressaltar que todos os
experimentos apresentaram consumo de xilose e glicose, assim como
produção de etanol e crescimento de biomassa; exceto o experimento 7
(Tabelas 5.18 e 5.19), cujo substrato era apenas a xilose e os nutrientes
complementares do meio RM. A dificuldade de crescimento exclusivamente em
xilose foi também relatada por Agrawal et al. (2011), sendo relacionada ao
deficiente transporte deste açúcar por Z. mobilis, dentre outras justificativas
relatadas na Revisão Bibliográfica.
Observa-se em todos os experimentos desenvolvidos, exceto no
experimento 3 da tabela 5.19, a presença de elevadas concentrações de xilose
residual, variando de 70 a 60% em relação à concentração inicial. Jeon et al.
(2002), Yanase et al. (2007), Zhang & Lynd (2010), Davis et al. (2005) e
Joachimsthal et al. (1999) também reportaram a presença de xilose residual no
processo de conversão de pentoses a etanol, em 21 g/L, 20 g/L, 2,5 g/L, 2,6
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
154
g/L,12 g/L, respectivamente. Adicionalmente, Lawford & Rousseau (2002)
reportam que apenas 50% da xilose foi consumida em meio com concentração
inicial de 30 g/L desta pentose (DIEN & COTTA, 2003).
Neste contexto, os experimentos empregando glicose e xilose em
concentrações variando de 0 a 20 g/L de cada açúcar pela linhagem
recombinante, comparativamente aos experimentos empregando apenas a
fração da glicose pela linhagem naturalmente ocorrente CP4 (item 5.1.1),
constatando-se diferenças significativas no crescimento celular e na
produtividade volumétrica de etanol, respectivamente, em 0,43 g/L e 0,33 g/L.h
para a linhagem nativa, assim como 0,180 g/L e 0,107 g/L.h para a linhagem
recombinante. Leksawasdi et al. (2001) já haviam reportado que a limitação
pelo substrato para o crescimento de biomassa é cerca de 3 vezes maior para
o consumo de xilose do que para a glicose.
Tabela 5.18. Planejamento experimental preliminar avaliando diferentes concentrações de glicose e xilose no meio RM frente à produção de etanol e crescimento de biomassa a partir de meio sintético pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, realizado após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.
Ex.
Glicose (g/L) Xilose (g/L) Respostas
Inicial Final Inicial Final Etanol (g/L)
Biomassa (g/L)
1 10,5 0,0 10,5 6,0 5,0 0,080
2 1,3 0,0 10,5 6,2 1,9 0,046
3 10,5 0,0 10,5 5,8 4,3 0,112
4 10,5 0,0 10,5 6,7 3,4 0,116
5 4,0 0,0 4,0 2,5 2,7 0,065
6 17,0 0,0 17,0 11,3 6,9 0,165
7 4,0 0,0 17,0 10,8 2,5 0,073
8 10,5 0,0 19,7 13,2 3,6 0,062
9 10,5 0,0 10,5 6,9 4,9 0,123
10 17,0 0,0 4,0 2,7 6,8 0,166
11 10,5 0,0 1,3 1,0 5,4 0,127
12 10,5 0,0 10,5 9,2 3,8 0,102
13 19,7 0,0 10,5 7,5 8,6 0,090
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
155
Tabela 5.19. Avaliação de diferentes concentrações de glicose e xilose na
produção de etanol a partir de meio sintético pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.
Ex.
Glicose (g/L) Xilose (g/L) Respostas
Inicial Final Inicial Final Etanol
(g/L)
Biomassa
(g/L)
1 1,0 0,0 20,0 13,5 1,7 0,044
2 2,5 0,0 20,0 13,5 2,3 0,064
3 5,0 0,0 20,0 0,1 2,1 0,096
4 10,0 0,0 20,0 13,7 4,6 0,133
5 15,0 0,0 20,0 12,6 3,4 0,155
6 20,0 0,0 20,0 11,6 7,5 0,180
7 0,0 0,0 20,6 20,6 0,0 0,044
O baixo rendimento em etanol a partir de misturas de glicose e xilose,
conforme descrito na Revisão Bibliográfica, pode ser justificado pela posterior
metabolização da pentose frente à hexose, gerando maiores concentrações de
inibidores nesta etapa, como o etanol e ácido lático, reduzindo a taxa de
utilização da pentose (LEKSAWASDI et al., 2001). Outra justificativa está
relacionada à competição pela única via de transporte de açúcares, causando
lentidão do processo, havendo uma repressão do consumo de xilose pela
glicose (DiMARCO & ROMANO, 1985; PARKER et al., 1995; ROGERS &
LAWFORD, 1999; LAWFORD et al., 2000; LEKSAWASDI et al., 2001;
MOHAGHEGHI et al., 2002; KIM et al., 2010).
De acordo com a análise de variância (Tabela 5.20) nota-se que o
modelo linear foi significativo, apresentando um ajuste adequado aos
resultados experimentais para este tipo de planejamento, com um coeficiente
de correlação R2 de 0,9069; um baixo erro puro (média quadrática de 0,48) e,
uma falta de ajuste (média quadrática de 0,39) sem significância para o
intervalo de confiança de 90% (p-level 0,1).
A equação referente à concentração de etanol é apresentada na
equação (7).
[Etanol] =+1,32556 +0,36200A-0,050877B (7)
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
156
Tabela 5.20. Análise de Variância da concentração de etanol a partir de
diferentes concentrações de glicose e xilose pela linhagem recombinante de Z. mobilis CP4, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.
SQ GL MQ F-Valor p-valor
Modelo 41,26 2 20,63 48,70 <0,0001
A 40,39 1 40,39 95,33 <0,0001
B 0,87 1 0,87 2,07 0,1812
Resíduo 4,24 10 0,42
Lack of Fit 2,33 6 0,39 0,81 0,6093
Erro Puro 1,91 4 0,48
Cor. Total 45,50 12
Onde: A=glicose; B=xilose; SQ= soma dos quadrados; GL= grau de liberdade; MQ= média quadrática.
A glicose apresentou maior efeito do que outra variável independente, a
xilose, sendo pouco significativa para o modelo. Adicionalmente, a figura 5.20
mostra a superfície de contorno, que representa as equações ajustadas para
concentração final de etanol a partir de xilose e glicose. Pode-se observar que
maiores concentrações de glicose, assim como menores concentrações de
xilose contribuem para o aumento da produção de etanol.
Figura 5.20. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre a glicose e a xilose sobre a produção de etanol por Z. mobilis recombinante, após a execução de 10 ciclos de adaptação metabólica.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
157
II. Comparação do desempenho de diferentes clones
Após o 20o ciclo de adaptação foram realizados ensaios em frascos
agitados, a 150 rpm e temperatura de 30C, nas melhores condições do
planejamento anterior: 20 g/L de glicose, 20 g/L de xilose, adicionados do meio
RM, conforme observa-se na tabela 5.21.
Tabela 5.21. Avaliações de diferentes clones frente ao consumo de glicose e
xilose provenientes no meio RMGX, assim como à produção de etanol por Zymomonas mobilis recombinante, após o 20o ciclo de adaptação metabólica.
A figura 5.21 representa a cinética de crescimento das colônias,
consumo de substratos e produto obtido, indicando que a pentose foi
metabolizada em cerca de 72 horas.
Nota-se que os clones se comportaram de forma semelhante,
apresentando cerca de 35% de consumo de xilose, consumo completo de
glicose, média de 0,16 g/L de crescimento de biomassa e cerca de 4 g/L de
etanol. Os gráficos observados apontam para a grande necessidade de
contínuas adaptações metabólicas visando à obtenção de resultados mais
promissores, assim como relatado por Jeon et al. (2002), indicando que o
crescimento inicial das colônias ocorria em até 5 dias, sendo reduzido após
repiques sucessivos. Adicionalmente, o etanol pode estar sendo consumido
para a manutenção das células, após a saturação do consumo da glicose.
Apesar de Kim et al. (2010) terem reportado que apenas 10% da xilose
foi consumida na presença de glicose em concentração equimolar, os melhores
resultados obtidos neste trabalho foram alcançados nestas condições,
semelhante ao relatado por Zhang et al. (1995), que utilizaram 2,5% (m/v) dos
dois carboidratos.
Glicose (g/L) Xilose (g/L) Respostas
Inicial Final Inicial Final Etanol (g/L) Biomassa (g/L)
20,0 0,0 20,0 12,99 3,25 0,158
20,0 0,0 20,0 13,25 4,80 0,136
20,0 0,0 20,0 13,33 3,66 0,193
20,0 0,0 20,0 13,70 4,93 0,153
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
158
Figura 5.21. Cinética comparativa de diferentes clones de Z. mobilis recombinante, selecionados após crescimento em meio RMGX durante 72 horas, em 30C de temperatura e agitação de 150 rpm, após o 20o ciclo de adaptação metabólica.
5.2.4. Produção de etanol através do processo SSCF por Zymomonas
mobilis recombinante
I. Adaptação metabólica em meio SSCF
Conforme sinalizado na Revisão Bibliográfica, Zaldivar et al. (1999) e
Song et al. (2005) relataram que a presença de compostos inibitórios presentes
no hidrolisado hemicelulósico, em concentrações elevadas, provocam
modificações morfológicas nas células de Z. mobilis, tornando-se
arredondadas, cilíndricas e translúcidas. Delgenes et al. (1996) indicaram que
na presença de 2 g/L de furfural, o crescimento e a produção de etanol por tal
microrganismo foi inibido em até 64 e 44%, respectivamente. Lawford &
Rousseau (2002) apontaram para a inibição através da adição de 2,5 g/L de
ácido acético, em pH 5,5, reportando também que apenas 50% da xilose foi
consumida, a qual possuía a concentração de 30 g/L (DIEN et al., 2003).
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
159
Desta forma, estudos desenvolvidos por Lawford et al. (2002) sugerem
uma adaptação gradual ao ácido acético por Z. mobilis, assim como descrito
por Song et al. (2005), indicando que após longo período de crescimento na
presença destes compostos, as células adaptadas apresentam modificações
em sua superfície, tornando-se mais alongadas, dentre outras características.
Tais alterações morfológicas não foram detectadas no presente trabalho, no
entanto, ao longo de alguns ciclos adaptativos notou-se que a linhagem
transformada de Z. mobilis apresentou melhor performance quanto à produção
de etanol e crescimento celular frente ao hidrolisado ácido (Tabela 5.22).
Nos ciclos de 1 a 5, o microrganismo apresentava baixa produção de
biomassa (0,086 g/L), assim como lentidão de crescimento, uma vez que foi
utilizado o meio complementar RM, contendo 20 g/L de glicose, adicionado de
2,5% v/v de hidrolisado hemicelulósico. Quando comparado aos resultados das
colônias adaptadas (ciclo 21-25), a concentração de células foi ligeiramente
superior, em 0,117 g/L, no entanto, o hidrolisado hemicelulósico apresentava-
se em uma maior concentração no último ciclo, em 20% v/v.
Tabela 5.22. Processo de adaptação metabólica mediante 25 ciclos fermentativos, variando as concentrações de hidrolisado ácido proveniente do bagaço de cana e mantendo a concentração de glicose em 20 g/L, após o 26o ciclo de adaptação metabólica em meio sintético.
Onde: H.H.=hidrolisado hemicelulósico; A.A.= Ácido acético.
Adicionalmente, a tabela 5.23 indica as variáveis de resposta calculadas
comparando-se os primeiros e os últimos ciclos, indicando que a técnica de
adaptação metabólica tende a promover melhores resultados de crescimento e
produção de etanol (5,2 g/L a 5,9 g/L), variando de diferentes proporções de
hidrolisado hemicelulósico, de 2,5 a 20% v/v, respectivamente; contudo, a
produtividade volumétrica foi inferior, variando de 0,074 g/L.h e 0,0614 g/L.h.
Ciclos Tempo (Dias)
H.H. (%) v/v
A.A. (g/L)
HMF (mg/L)
Furfural (mg/L)
Etanol (g/L)
Biomassa (g/L)
1-5 14 2,5 0,28 1,3 13,2 5,2 0,086
6-10 20 5 0,53 16,0 27,6 4,8 0,137
11-15 25 10 0,92 9,4 54,1 5,3 0,139
16-20 20 15 1,2 13,2 83,3 4,7 0,107
21-25 20 20 2,1 15,6 108,7 5,9 0,117
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
160
Tabela 5.23. Comparação das variáveis medidas e calculadas entre diferentes
etapas de adaptação metabólica.
Variáveis medidas e calculadas Ciclo 1-5 Ciclo 20-25
Etanol (g/L)* 5,2 5,9
Células (g/L)* 0,086 0,117
Produtividade (g/L.h)* 0,074 0,061
*Ao final do último ciclo
Observa-se que alguns fatores, como a inibição por compostos
presentes no hidrolisado e o tempo de crescimento foram superados; não
obstante, são necessárias melhorias na fermentação a partir do hidrolisado
ácido, através da continuação dos ciclos adaptativos, visando elevar os níveis
de tolerância dos inibidores, assim como os valores de produtividade
volumétrica.
II. Processo de propagação mediante diferentes estratégias de aclimatação celular
Segundo Betancur et al. (2010), os microrganismos consomem o
substrato de forma mais eficiente quanto maior o grau de aclimatação, a
exemplo de processos de fermentação por Pichia stipitis a partir de hidrolisado
hemicelulósico. Portanto, mesmo que as células estejam previamente
adaptadas com a presença de inibidores, faz-se necessária a aclimatação
anteriormente ao inóculo. No presente trabalho, foram desenvolvidas 4
diferentes estratégias, conforme descrito no item 4.4.2.2 (Capítulo 4), cujos
resultados são apresentados na tabela 5.24.
Tabela 5.24. Crescimento celular em diferentes estratégias de aclimatação.
Estratégias Tempo* (Dias)
H.H.* % (v/v)
A.A.* (mg/L)
HMF* (g/L)
Furfural* (mg/L)
Biomassa* (g/L)
A 5 10 0,85 7,0 52,7 0,058
B 3 10 0,91 9,6 47,2 0,145
C 2 20 1,88 17,8 97,1 0,109
D 2 20 1,96 20,4 101,3 0,129 E 2 20 2,06 17,5 105,6 0,115
Onde: H.H.= hidrolisado hemicelulósico; A.A.= ácido acético; A=sem aclimatação; B=aclimatação de 5% a 10% v/v de H.H.; C= aclimatação de 5% a 20%v/v de H.H.; D=aclimatação inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagação em H.H., 10% v/v e posterior centrifugação; E=aclimatação inicial de H.H., 5% v/v, seguida da propagação em H.H., 20% v/v, e posterior centrifugação. *Valores referentes à última etapa de
propagação.
O processo de aclimatação empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado
hemicelulósico adicionado do meio RMG apresentou o melhor resultado, com
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
161
uma concentração celular de 0,09 g/L, superior aos valores encontrados para
uma única etapa de aclimatação celular (0,03 g/L) ou mesmo através de
centrifugação empregando de 5% a 10% v/v de hidrolisado (D), assim como de
5% a 20% v/v de hidrolisado (D), promovendo 0,08 e 0,07 g/L. Dessa forma,
pode-se concluir que a inclusão de duas etapas de aclimatação, de 5% v/v a
10% v/v de hidrolisado hemicelulósico (B), apresentaram efeito positivo sobre a
produção de biomassa, sendo a condição escolhida para propagação celular
nos experimentos futuros.
III. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos experimentais sequenciais
Foram desenvolvidos dois Planejamentos Sequenciais de Superfície de
Resposta 22, avaliando a concentração de sólidos do bagaço de cana pré-
tratado (g:mL), assim como a proporção de hidrolisado hemicelulósico no
processo SSCF, atingindo a maior produção de etanol em 25,04 g/L, a partir de
2,21:10 g:mL e 20% v/v, respectivamente, no primeiro Planejamento (Tabela
5.25).
Tabela 5.25. Primeiro Planejamento 22 avaliando o percentual de hidrolisado
hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF 1 para a produção de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após o 25o ciclo de adaptação metabólica em meio sintético.
Ex.
Variáveis independentes Condições Resposta
H. H. (%) S:L (g:mL) Glicose inicial(g/L) Xilose inicial(g/L) Etanol (g/L)
1 45,00 2,21:10 67,3 24,5 7,5
2 20,00 2,0: 10 57,4 9,6 25,0
3 80,36 1,5: 10 38,9 61,1 0,0
4 70,00 2,0: 10 61,4 53,6 0,0
5 9,64 1,5: 10 36,5 5,3 7,4
6 45,00 1,5: 10 33,8 27,9 11,0
7 45,00 1,5: 10 39,2 30,1 2,2
8 45,00 1,5: 10 36,1 32,0 2,2
9 70,00 1,0: 10 25,0 51,7 1,5
10 45,00 1,5: 10 34,6 33,3 4,3
11 20,00 1,0: 10 23,3 10,1 7,6
12 45,00 0,79: 10 14,9 40,5 3,3
13 45,00 1,5: 10 37,5 35,0 4,0
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulósico; S:L= relação sólido:líquido.
Cabe ressaltar que no experimento 6 houve a segunda maior produção
de etanol, em 10 g/L, sob a presença do hidrolisado hemicelulósico (variável A)
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
162
em seu nível médio. Todavia, nota-se que os outros experimentos que
possuíam proporções deste licor acima de 45% v/v apresentaram baixa
produção de etanol, o que nos remete a uma inibição pela presença de HMF,
furfural e ácido acético.
Posteriormente, foi desenvolvido outro Planejamento Experimental
avaliando os mesmos parâmetros, porém em proporções inferiores para a
variável A (hidrolisado) e superiores para a variável B (relação sólido:líquido).
Observa-se, na tabela 5.26, que a maior concentração de etanol alcançada foi
de 27,32 g/L, nas seguintes condições: 2,99:10 de bagaço de cana pré-tratado
(g:mL), assim como a proporção de hidrolisado hemicelulósico de 20% v/v.
Quando a concentração de sólidos mantinha-se baixa, associadamente ao
percentual de hidrolisado ácido, as concentrações de etanol eram reduzidas,
como exemplo do experimento 10, contudo, nas condições contrárias
(experimento 6) foram alcançados 24 g/L.
Tabela 5.26. Segundo Planejamento 22 avaliando o percentual de hidrolisado hemicelulósico (%), bem como a relação sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado através do processo SSCF 2 para a produção de etanol pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis CP4, após o 25o ciclo de adaptação metabólica em meio sintético.
Ex.
Variáveis independentes Condições Resposta
H. H. (%) S:L (g:mL) Glicose inicial (g/L) Xilose inicial (g/L) Etanol (g/L)
1 20,50 2,0:10 59,3 12,5 18,2
2 6,50 1,3:10 34,0 5,1 1,6
3 20,50 2,99:10 48,9 11,0 27,3
4 34,50 1,3:10 36,1 18,7 5,1
5 20,50 2,0:10 57,8 14,2 15,2
6 0,70 2,0:10 62,6 0,6 24,0
7 40,30 2,0:10 65,2 23,4 5,70
8 20,50 2,0:10 63,7 8,0 15,6
9 6,50 2,7:10 51,3 3,9 23,3
10 20,50 1,0:10 23,5 7,7 4,5
11 34,50 2,7:10 73,0 21,3 5,2
12 20,50 2,0:10 62,1 8,2 17,0
13 20,50 2,0:10 60,4 12,6 8,8
Onde: H. H= hidrolisado hemicelulósico; S:L= relação sólido:líquido.
De acordo com a análise de variância do Planejamento SSCF 1 e do
Planejamento SSCF 2 (Tabelas 5.27 e 5.28) nota-se que o modelo linear (2FI:
two-factor interactions) e o modelo quadrático, respectivamente, apresentaram
um ajuste adequado aos resultados experimentais, com um coeficiente de
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
163
correlação R2 de 0,7 e 0,8; sendo o erro puro e a falta de ajuste insignificantes
para o intervalo de confiança de 90%.
Tabela 5.27. Análise de Variância da concentração de etanol alcançada no primeiro Planejamento Experimental do processo SSCF1 a partir do bagaço-de-cana por Z. mobilis recombinante.
SQ GL MQ F-Valor p-valor
Modelo 366,91 3 122,30 6,76 0,0111
A 217,04 1 217,04 12,00 0,0071
B 60,22 1 60,22 3,33 0,1013
AB 89,66 1 89,66 4,96 0,0530
Resíduo 162,73 9 18,08
Lack of Fit 109,96 5 21,99 1,67 0,3204
Erro Puro 52,77 4 13,19
Cor. Total 529,64 12
Tabela 5.28. Análise de Variância da concentração de etanol alcançada no
segundo Planejamento Experimental do processo SSCF2 a partir do bagaço-de-cana por Z. mobilis recombinante.
SQ GL MQ F-Valor p-valor
Modelo 700,29 5 140,06 5,71 0,0205
A 201,31 1 201,31 8,20 0,0242
B 360,93 1 360,93 14,71 0,0064
AB 114,43 1 114,43 4,66 0,0677
A2 18,21 1 18,21 0,74 0,4175
B2 8,19 1 8,19 0,33 0,5817
Resíduo 171,80 7 24,54
Lack of Fit 120,36 3 40,12 3,12 0,1502
Erro Puro 51,43 4 12,86
Cor. Total 872,08 12
Onde: A= hidrolisado hemicelulósico, B= relação sólido:líquido; SQ=
Soma dos Quadrados; GL= Grau de Liberdade; MQ= Média Quadrática.
Os modelos do processo SSCF1 e SSCF2 são representados pelas
equações (8) e (9), respectivamente:
[Etanol]: +5,84 - 5,21A + 2,74B - 4,73AB (8)
[Etanol]: +14,96 - 5,06A + 6,75B- 1,70A2 – 1,17 B2 – 5,42 AB (9)
Os modelos foram significativos, sendo que para o SSCF 1, o parâmetro
A (hidrolisado hemicelulósico) apresentou maior influência na concentração
final de etanol, seguido da interação AB e do parâmetro B (relação
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
164
sólido:líquido). Segundo o modelo referente ao SSCF 2, o parâmetro B (relação
sólido:líquido) foi o mais influente, seguido do parâmetro A (hidrolisado
hemicelulósico); somado a isso, as combinações que apresentaram maior
influência foram entre AB, seguido de A2 e B2.
Adicionalmente, a figura 5.22 mostra a superfície de contorno, avaliando
o percentual de hidrolisado hemicelulósico (%), bem como a relação
sólido:líquido (g:mL) do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado através do
processo SSCF 1, no que tange à produção de etanol pela linhagem
recombinante de Zymomonas mobilis CP4. Observa-se que o gráfico aponta
para a redução do parâmetro A (hidrolisado hemicelulósico) e ao aumento das
concentrações do parâmetro B (relação sólido:líquido), sendo necessária a
execução de outro planejamento para que os experimentos sejam otimizados.
Figura 5.22. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre os
parâmetros sobre a produção de etanol a partir do primeiro Planejamento Experimental referente ao processo SSCF 1 pela linhagem recombinante de Zymomonas mobilis.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
165
Desta forma, após execução do segundo Planejamento, a figura 5.23
mostra a superfície de contorno avaliando o hidrolisado hemicelulósico (%) v/v,
bem como a relação sólido:líquido (g:mL); os mesmos parâmetros utilizados no
Planejamento anterior, embora em maiores concentrações de sólidos e
menores proporções de hidrolisado ácido. Segundo o gráfico de contorno, a
região ótima (em vermelho) foi alcançada através destes experimentos,
alcançando a maior produção de etanol em cerca de 25 g/L, valor próximo ao
máximo atingido experimentalmente, que ocorreu em 27 g/L.
Figura 5.23. Superfície de contorno avaliando efeitos combinados entre os
parâmetros sobre a produção de etanol a partir do segundo Planejamento referente ao processo SSCF 2 pela linhagem recombinante de Z. mobilis.
A reprodução da condição ótima do segundo Planejamento referente ao
processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas por
Zymomonas mobilis recombinante ocorreu em biorreator instrumento, na
temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação, pH 5, durante 52 horas totais;
resultando na máxima concentração de etanol em 25,3 g/L e produtividade
volumétrica de 0,63 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
166
e 2,99:10 (g:mL) da relação sólido:líquido do bagaço de cana de açúcar pré-
tratado (Figura 5.24). Constatou-se que a glicose foi inicialmente metabolizada,
seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%, havendo desvio da
via metabólica para a produção de xilitol. Viitanem et al. (2008) também
relataram sobre a problemática da formação deste subproduto, assim como à
lentidão do processo SSCF, constatando que 30 g/L desta pentose foi
consumida durante o período de 50 h. Conforme detalhado na Revisão
Bibliográfica, o xilitol é produzido através de aldose redutases inespecíficas,
presente no citoplasma de Zymomonas mobilis, entretanto pouco se sabe as
causas do desvio da via metabólica. Já segundo Zhang & Chen (2009), a
enzima periplasmática GFOR, responsável pela produção de sorbitol, catalisa
também tal reação juntamente com o cofator NADPH.
Figura 5.24. Processo SSCF 2 a partir de bagaço de cana pré-tratado por Z. mobilis geneticamente modificada em biorreator instrumentado, empregando 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico e 2,99:10 (g:mL) de relação sólido:líquido. P.H.= pré-hidrólise enzimática, SSCF: co-fermentação e sacarificação simultâneas.
P.H. SSCF
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
167
A tabela 5.29 representa a evolução dos ensaios de fermentação
empregando a linhagem recombinante através de planejamentos sequenciais.
Inicialmente, em meio sintético, a produção de etanol foi 7,5 g/L e produtividade
volumétrica correspondente de 0,180 g/L.h. Nos planejamentos sequenciais
avaliando o processo SSCF foram produzidos 25 g/L e 0,347 g/L.h (primeiro
planejamento), assim como 27 g/L e 0,683 g/L.h (segundo planejamento) de
produção de etanol e produtividade volumétrica, respectivamente.
Tabela 5.29. Evolução dos resultados obtidos pela linhagem recombinante de Z.mobilis a partir da fermentação em meio sintético e do processo SSCF com bagaço de cana pré-tratado.
Experimentos Condições Valores máximos
So (g/L) tf (h) Xo (%) v/v P (g/L) QP (g/L.h)
Ensaios prévios
1. RMGX 20 g/L gli 20 g/L xil
70 10 7,5 0,107
Bagaço de cana-de-açúcar
2. SSCF 1 57 g/L gli 9 g/L xil
72 10 25 0,347
3. SSCF 2 22 g/L gli 6,4 g/L xil
40 10 27 0,683
Onde: S0: concentração inicial de glicose; tf (h): tempo de fermentação; Xo:
concentração inicial de células; P: concentração final de etanol; Qp: produtividade volumétrica; RMG: Meio contendo glicose (20 g/L), xilose (20 g/L), extrato de levedura (10 g/L), KH2PO4 (2 g/L) e tetraciclina (10 mg/L); SSCF: hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas; xil: xilose inicial; gli: glicose inicial. 1. Avaliação do consumo de glicose e xilose em meio sintético por Z. mobilis geneticamente modificada; 2 e 3. Avaliação da produção de etanol a partir do processo SSCF através de planejamentos
experimentais sequenciais.
Apesar dos resultados não se mostrarem tão promissores quanto os
alcançados através da fermentação da glicose oriunda da fração celulósica
pelas linhagens naturalmente ocorrentes, atingindo 65 g/L de etanol, a bactéria
recombinante apresenta melhores resultados na medida em que os ciclos de
adaptação metabólica são efetuados. Cabe ressaltar que, conforme descrito na
Revisão Bibliográfica, outros pesquisadores também constataram dificuldades
na fermentação a partir de pentoses, gerando xilose residual e baixas
concentrações de etanol, conforme descrito por Davis et al. (2005), que
atingiram 11 g/L deste biocombustível, frente à 6 g/L de glicose e 16 g/L de
xilose, e posterior adição de 10 g/L de glicose, gerando 12 g/L de xilose
residual, durante 11 horas de processo.
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
168
Segundo Kim et al. (2000), as células de Zymomonas mobilis
recombinantes que metabolizam a xilose demonstram lento e incompleto
consumo da mesma. As possíveis causas relacionadas para tal deficiência
remetem ao microrganismo não possui transportador específico para a xilose, o
que prejudica a sua metabolização devido à repressão catabólica pelo
monossacarídeo preferencial, a glicose. Adicionalmente, estudos de
modelagem indicam que a captação de glicose e xilose ocorre em 65% e 35%,
respectivamente, quando estes carboidratos estão presentes na proporção de
1:1 (LEKSAWASDI et al., 2001). Jeon et al. (2005); Zhang & Chen (2009) e
Agrawal et al (2011) também afirmam que a maior problemática da
fermentação de pentoses está relacionada à produção e acumulação de xilitol,
mesmo em concentrações reduzidas, promovendo o desvio da via das
pentoses em linhagens recombinantes de Z. mobilis. Segundo Kim et al.
(2000), apenas 1 g/L de xilitol presente no meio pode provocar redução de 50%
do crescimento de biomassa.
Agrawall et al. (2011) reportaram sobre a importância da adaptação
metabólica frente à produção de etanol por Z. mobilis ZM4 (pZB5), visando à
obtenção de resultados mais promissores. Adicionalmente, tal linhagem tem
sido apontada como uma das mais indicadas para a metabolização da xilose,
além de possuir maior resistência ao etanol, ao ácido acético e furfural. Zhang
(2003) indicaram que a linhagem CP4, a qual produziu 24 g/L de etanol a partir
de 15 g/L de glicose e 35 g/L de xilose, não seria tão eficiente quanto à
linhagem 8b (ZHANG et al., 2010), a qual atingiu 40 g/L de etanol a partir de
resíduo de papel, um dos motivos pelos quais os resultados da presente tese
podem não estar atingindo elevados níveis de etanol.
Neste contexto, as dificuldades de metabolização de xilose pela
linhagem recombinante de Z. mobilis CP4, desenvolvida neste trabalho, podem
também estar relacionadas à inibição do crescimento microbiano pela produção
de xilitol, uma vez que tal composto foi detectado nos ensaios de fermentação
do presente trabalho. Portanto, conforme indicado por diversos autores e
comprovado neste trabalho, os processos de adaptação metabólica, assim
como otimizações empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis devem
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
169
ser contínuos no que tange à maximização da produção de etanol e de
biomassa microbiana, assim como à redução da produção de xilitol.
5.3. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Através de estudos realizados neste trabalho, assim como o
levantamento bibliográfico de diversas pesquisas científicas sobre a biologia
molecular e bioquímica do microrganismo Zymomonas mobilis, conclui-se que
a engenharia genética e a metabólica ainda apresentam-se como as melhores
e possivelmente as únicas alternativas para tornar esta bactéria capaz de
fermentar a níveis industriais. No entanto, a tecnologia de fermentação a partir
de materiais lignocelulósicos ainda não superou alguns fatores inibitórios
responsáveis pela redução do rendimento do processo; dentre eles,
temperaturas elevadas, estresse osmótico, elevados níveis de etanol, bem
como a limitada gama de substratos fermentáveis, juntamente com a
problemática de metabolização de pentoses.
Contudo, uma vez que a bactéria Zymomonas mobilis desponta como
um dos microrganismos mais promissores para a produção de etanol, diversos
pesquisadores tentam contornar algumas dificuldades relacionadas à
fermentação na presença de compostos inibitórios, dentre outros estresses
fisiológicos. Neste contexto, o grupo de pesquisa NREL (EUA), o qual estuda
há cerca de duas décadas a fermentação por Z. mobilis é um dos pioneiros no
desenvolvimento e aprimoramento de diversas tecnologias utilizando tal
microrganismo. Buscando superar as dificuldades metabólicas citadas
anteriormente, no intuito de que a fermentação por Z. mobilis atinja níveis cada
vez mais elevados, pesquisadores avaliam o emprego de diferentes linhagens,
o isolamento de diferentes colônias, assim como o aprimoramento das
tecnologias de adaptação metabólica e engenharia genética. Pesquisas
preliminares realizadas por Yang et al. (2010) avaliaram a adição do gene Hfq,
o qual coordena diversas respostas ao estresse fisiológico de alguns
microrganismos. Zhou et al. (2011) avaliaram a integração XI, XK, TAL, TKL no
genoma de Z. mobilis ZM-mtc9xt, obtendo resultados promissores, assim como
outros grupos de pesquisa apontaram para a otimização do processo sem que
CAPÍTULO 5: Resultados e Discussões
Danielle da Silveira dos Santos
170
houvesse outra intervenção genética, através da utilização do processo SSCF
empregando-se baixos níveis de carga enzimática, conforme relatado por
Olofsson et al. (2010). No Brasil, estudos empregando técnicas de biologia
molecular neste microrganismo são muito recentes. O centro de pesquisa
LADEBIO é pioneiro nesta temática, empregando tal bactéria, transformando-a
e desenvolvendo otimizações do processo de hidrólise enzimática e co-
fermentação simultâneas (SSCF) a partir de um resíduo agro-industrial, o
bagaço de cana-de-açúcar. Desta forma, almeja-se que em um futuro próximo
se possam empregar recursos renováveis no que tange à bioconversão de
açúcares a etanol por tal microrganismo.
Sumariamente, o objetivo e o desenho experimental adotado para a
execução do presente trabalho, pautaram-se, fundamentalmente, no
desenvolvimento de tecnologias para a otimização da produção de etanol a
partir de resíduos lignocelulósicos, mediante o uso de linhagens nativas (AG11
e CP4), através do processo SSF e da linhagem recombinante CP4, a qual é
capaz de fermentar a xilose e a glicose simultaneamente, através do processo
SSCF. Baseado no teste de fermentabilidade empregando as linhagens nativas
de Z. mobilis, realizado com o bagaço de cana-de-açúcar e com resíduos da
indústria de celulose, conclui-se que estas matérias-primas apresentaram
significativos potenciais para a produção de etanol 2G, sendo facilmente
fermentados. Constatou-se, portanto, que a celulose constitui uma excelente
fonte de carboidratos para a execução do processo de hidrólise enzimática e
fermentação simultâneas por Zymomonas mobilis, que se apresentou
promissora para a produção deste biocombustível, em virtude de sua elevada
capacidade de absorção de glicose, altas taxas específicas de produção de
etanol, resultando em altos valores de produtividade. Os resultados alcançados
com o presente trabalho foram satisfatórios, no entanto, são necessárias
continuações no que tange à elaboração de novas estratégias para que as
questões inibitórias e insatisfatórias colocadas ao longo do texto sejam
contornadas, assim como o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular
para a comprovação da transformação genética, gerando oportunidades para
futuros e interessantes desenvolvimentos tecnológicos.
CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões
Danielle da Silveira dos Santos
171
_____________________CAPÍTULO 6
CONCLUSÕES
6.1. CONCLUSÕES
Após análise da capacidade de utilização de glicose em meio sintético
pelas linhagens de Z. mobilis AG11 e CP4, observou-se que o substrato foi
consumido eficientemente em um período de 15 e 18 horas,
respectivamente. No tocante ao consumo de xilose, foi constatada a
incapacidade de ambas as linhagens nativas em metabolizar esta pentose.
Através de técnicas de planejamento experimental foi possível constatar
que o uso do tampão-citrato (1M, pH 5, 50% v/v) adicionado à celulignina
de bagaço de cana pré-tratada alcalinamente, influenciou negativamente a
produção de etanol pelas linhagens de Zymomonas mobilis. Neste
planejamento, as linhagens de Z.mobilis AG11 e CP4 atingiram
concentrações de etanol de 25 e 34 g/L, correspondendo a valores de
produtividade volumétrica de 1,04 e 1,25 g/L.h, respectivamente. Tendo em
vista que os melhores resultados foram alcançados com a linhagem CP4,
os estudos posteriores foram realizados com esta linhagem.
Foi construído um novo planejamento experimental, otimizando-se a
concentração de glicose inicial do SSF, a produção etanol e a
produtividade volumétrica do processo SSF com bagaço de cana pré-
tratado. As melhores condições experimentais, apontadas pelo
planejamento experimental foram: relação sólido:líquido de 3:10 (g:mL),
CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões
Danielle da Silveira dos Santos
172
carga enzimática de 25 FPU/g e concentração inicial de células de 4 g/L.
As concentrações máximas atingidas foram de 76 g/L de glicose inicial, 60
g/L de etanol, e produtividade volumétrica de 1,52 g/L.h, na temperatura de
30ºC e velocidade de agitação de 150 rpm, em frascos agitados. A
validação em biorreator instrumentado resultou em uma concentração de
etanol de 55 g/L, iniciando-se o processo SSF com a concentração de
glicose de 80 g/L (após etapa de pré-hidrólise enzimática). O valor de
produtividade volumétrica atingido nesta escala foi de 2,29 g/L.h, em
temperatura de 30ºC, velocidade de agitação de 150 rpm e pH 5.
Através da execução de um Planejamento Fatorial 24 foi possível constatar
que os nutrientes analisados: KH2PO4 (g/L), MgSO4.7H2O(g/L) e (NH4)2SO4
e extrato de levedura (g/L), adicionados no processo SSF, promoveram
maiores concentrações de etanol quando estavam em seus maiores níveis:
1 g/L, 0,5 g/L, 0,5 g/L e 2,5 g/L, respectivamente. Posteriormente, foi
desenvolvido um Planejamento Experimental de Superfície de Resposta,
aumentando-se a faixa de estudo dos nutrientes, além da adição dos níveis
axiais. As condições ótimas foram: extrato de levedura (12,5 g/L), KH2PO4
(2,5 g/L), (NH4)2SO4 (1,5 g/L) e MgSO4 (1,5 g/L), resultando na
concentração máxima de etanol de 65 g/L, com 85 g/L de concentração
inicial de glicose, atingindo a maior produtividade volumétrica de 2,70 g/L.h,
na temperatura de 30ºC, agitação orbital de 150 rpm, pH 5 em biorreator.
O resíduo da indústria de celulose, PM2, foi avaliado quanto à produção de
etanol a partir do processo SSF, sendo as condições ótimas as seguintes:
relação sólido:líquido (2:10 g/mL), carga enzimática (17,5 FPU/g) e
concentração celular (1,59% v/v), resultando na máxima concentração de
etanol em 58 g/L, a partir de 82 g/L de glicose inicial e produtividade
volumétrica de 2,76 g/L.h. As condições ótimas obtidas através da análise
da adição de nutrientes no meio SSF para a produção de etanol a partir
dos resíduos da indústria de celulose, foram: extrato de levedura (6,25 g/L),
KH2PO
4 (1,25 g/L), (NH
4)2SO
4 (2,25 g/L) e MgSO4 (2,25 g/L), resultando na
máxima concentração de etanol de 54 g/L, a partir de 91 g/L de glicose
CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões
Danielle da Silveira dos Santos
173
inicial e produtividade volumétrica de 3,6 g/L.h, em biorreator
instrumentado, na temperatura de 30ºC, 150 rpm de agitação e pH 5.
No que tange à transformação genética no microrganismo em estudo,
observou-se que após tal procedimento, o mesmo apresentou crescimento
em meio RMG (20 g/L de glicose, 2 g/L de KH2PO4 e 10 g/L de extrato de
levedura) adicionado de tetraciclina (10 mg/L). A adaptação metabólica em
meio sintético foi desenvolvida com o intuito de promover resultados mais
promissores de crescimento e produção de etanol. Este procedimento
constituiu de 50 ciclos nos quais aumentava progressivamente a
concentração de xilose e reduzia-se proporcionalmente a de glicose. Após
o 20o ciclo de repiques, o tempo de crescimento bacteriano reduziu para
cerca de 70 horas, aumentando lentamente o consumo de xilose e
acelerando o crescimento celular. Após a realização de 50 ciclos de
adaptação metabólica, a bactéria apresentou maiores valores de
crescimento de biomassa, produção de etanol e produtividade volumétrica,
indicando que as colônias adaptadas (ciclo 40 a 50) apresentaram melhor
desempenho do que aquelas cultivadas nos primeiros ciclos, com valores
destes parâmetros aumentando no mínimo em 2 vezes. Através de
experimentos avaliando diferentes concentrações de glicose e xilose foram
alcançados 7,5 g/L de etanol após 72 horas, a partir de 20 g/L de glicose,
20 g/L de xilose, em meio RMGX na temperatura de 30oC, sem agitação.
O processo de hidrólise enzimática e co-fermentação simultâneas foi
avaliado segundo Planejamentos Experimentais seqüenciais 22,
empregando a bactéria Zymomonas mobilis recombinante, na temperatura
de 30ºC, 150 rpm de agitação, pH 5, durante 52 horas totais, resultando na
máxima concentração de etanol de 25,3 g/L e produtividade volumétrica de
0,65 g/L.h, a partir de 20,5% (v/v) de hidrolisado hemicelulósico, 2,99:10
(g:mL) de relação sólido:líquido de bagaço de cana de açúcar pré-tratado,
em biorreator instrumento. Constatou-se que a glicose foi inicialmente
metabolizada, seguida da xilose, a qual foi consumida em cerca de 50%,
havendo desvio da rota para a produção de xilitol.
CAPÍTULO 6: Conclusões e Sugestões
Danielle da Silveira dos Santos
174
6.2. SUGESTÕES
I. Processo SSF empregando a linhagem nativa de Z. mobilis
As concentrações ótimas de hidrolisado celulósico do bagaço de cana,
bem como do resíduo da indústria de celulose podem ser selecionadas para
alimentar um processo de fermentação contínuo ou em batelada alimentada.
Esta forma de condução permitiria estender a fase exponencial de crescimento
e controlar os níveis de substrato, evitando assim, os efeitos repressores sobre
o metabolismo da bactéria.
II. Processo SSCF empregando a linhagem recombinante de Z. mobilis
Conforme descrito anteriormente, o mecanismo gênico de tal bactéria
não regula corretamente a expressão dos genes inseridos. Visando contornar
esta problemática, as sugestões abaixo visam à superação dos resultados
obtidos pela linhagem recombinante de Z. mobilis desenvolvida no
LADEBIO/UFRJ, em colaboração com o Laboratório de Biologia
Molecular/UnB.
Quantificar níveis enzimáticos através de análise química das atividades de
xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transquetolase;
Caracterização das proteínas heterólogas inseridas na linhagem parental,
através de Cromotografia Eletroforética;
Sequenciar o DNA da linhagem recombinante, bem como da linhagem
nativa, com a finalidade de comprovar a inserção dos genes no
microrganismo e de detectar possíveis mutações;
Desenvolver uma linhagem recombinante que possua, além dos genes de
metabolização da xilose, os genes que codificam o transporte específico da
pentose;
Investigar a integração cromossomal de genes responsáveis pela
metabolização de xilose e arabinose.
CAPÍTULO 8: Referências Bibliográficas 175
Danielle da Silveira dos Santos
_____________________CAPÍTULO 7
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