LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

“SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES”

Aluno: Gustavo Vitti MoroOrientador: Prof. Dr. Cláudio Lopes de Souza Jr.

2

• Introdução– Seleção Assistida por Marcadores Moleculares (SAM)– Vantagens– Procedimentos

• Aplicações SAM – Exemplos (sucesso)– Retrocruzamento Assistido– Piramidação– Seleção Característica de Interesse– Seleção Combinada

• Fatores que dificultam utilização da SAM (alternati vas)

• Perspectiva: Genome-Wide-Selection

• Considerações Finais

TÓPICOS

3

• Melhoramento Convencional - seleção dos genótipos superiores é realizada com base no fenótipo

• Muito tempo e resultados bastantes significativos

• Fatores que dificultam:

– Grande influência ambiental (caracteres quantitativos)

– Precisão das avaliações fenotípicas

– Dependente do ambiente para as avaliações

� FENÓTIPO GENÓTIPO

INTRODUÇÃO

≠

4

• Advento dos marcadores moleculares – década de 80

• Utilização desses marcadores para auxiliar na seleç ão

• Marcadores Moleculares:

– Não sofrem influência ambiental

– São herdados mendelianamente

– Apresentam herdabilidade igual a um

• Aumento na eficiência do processo de seleção

INTRODUÇÃO

5

• Piramidação de genes – combinações gênicas/alélicas de interesse (um ou vários caracteres)

• Genes em homozigose (dominância) – elimina etapa de autofecundação

• Determinação do fenótipo é complexa (organolépticas, destruição da planta, ambientes específicos) ou apresenta custo elevado

• Caracteres de baixa herdabilidade (influência ambie ntal)

• Seleção precoce – estágios iniciais (antes da manifestação do caráter e antes do florescimento)

INTRODUÇÃO

6

• Eficiência Relativa da SAM em relação a SF:(Lande e Thompson, 1990)

• h2 – herdabilidade do caráter em sentido restrito

• p – proporção da variância genética aditiva do caráter que é explicada pelos marcadores

ph

p

h

pER

2

2

2 1

)1(

−−+=

31090

190102

2

≅⇒==≅⇒==

ER,he,pSe

ER,he,pSe

Valores extremos – hipotético

ASSISTIDA vs FENOTÍPICA

7

• 1º - Seleção dos marcadores genéticos

• 2º - Associação dos marcadores com características fenotípicas

• 3º - Aplicação dessas informações na seleção

PROCEDIMENTOS

8

• 1º - Seleção dos marcadores genéticos

• 2º - Associação dos marcadores com características fenotípicas

• 3º - Aplicação dessas informações na seleção

PROCEDIMENTOS

MAPA GENÉTICO

10

• 1º - Seleção dos marcadores genéticos

• 2º - Associação dos marcadores com características fenotípicas

• 3º - Aplicação dessas informações na seleção

PROCEDIMENTOS

11

L-08-05F2.91-0.18bnlg1607-bnlg18238Ph8b

L-08-05F11.86 -0.31phi420701-phi01198Ph8a

L-08-05F5.40 -0.20umc1520-bnlg17596Ph6

L-08-05F6.49 -0.30bnlg2162-umc10864Ph4

L-08-05F5.77 -0.25umc1659-umc13203Ph3

L-08-05F5.77-0.25 umc1073-umc10211Ph1

DireçãoR2aditivomarcascromoQTL

Tabela 1. Localização e estimativa dos efeitos gené ticos dos QTLs(resistência a Phaeosphaeria maydis)

Moreira, Tese ESALQ, 2004

MAPEAMENTO DE QTLs

Moreira, Tese ESALQ, 2004

MAPEAMENTO DE QTLs

13

• 1º - Seleção dos marcadores genéticos

• 2º - Associação dos marcadores com características fenotípicas

• 3º - Aplicação dessas informações na seleção

PROCEDIMENTOS

14

-50AB+5AA-10BB5

-15-10AA-5BB0AB4

-50AB-5BB0AB3

+25+10BB+5AA+10AA2

+5-10AA+5AA+10AA1

ValorGenótipoValorGenótipoValorGenótipo

Valor Genotípico

Loco 3Loco 2Loco 1Genótipo

Tabela 2. Valores Genotípicos – exemplo hipotético

Baseado nesses marcadores, o genótipo dois é o melho r.

APLICAÇÃO NA SELEÇÃO

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Número de artigos com o termo QTLs e SAM de 1984-20 05.

Xu e Crouch, Crop Science, 2008

SAM

QTLs vs SAM

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Retrocruzamento assistido por Marcadores Moleculares

– Introdução de um ou poucos alelos favoráveis de genótipos não adaptados, em genótipos elites

�Seleção genótipos contendo os marcadores associados a esses alelos

� Identificação, dentre as plantas selecionadas para os alelos de interesse, aquelas com maior proporção do genoma recorrente

– Diminuição do tempo para recuperação do genoma recorrente (três gerações)

– Diminui o linkage-drag

ALGUMAS APLICAÇÕES

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• Introgressão de QTLs para aumento de produtividade presentes em materiais não cultivados, em materiais elites

• Ocorrência de progênies transgressivas é RARA (introdução dos QTLs – ganhos significativos)

• Detecção prévia de marcadores ligados aos QTLs de produtividade

• Retrocruzamento e seleção para presença desses marcadores

• Obtenção das linhagens recorrentes contendo esses QTLs

EXEMPLO-RETROCRUZAMENTO

18

Objetivo: Introgredir QTLs nas linhagens elites B73 e Mo17 e melhorar o híbrido B73 x Mo17

EXEMPLO-RETROCRUZAMENTO

19

• Detecção de 6 QTLs (Tx303) e 4 QTLs (Oh43) complementares a B73 e Mo17, e introgressão via retrocruzamento

• B73 melhorada x Mo17 melhorada – 93 híbridos avaliad os em experimentos com repetição

Grupo Heterótico I Grupo Hete rótico IIB73 x Tx303 Mo17 x Oh 43

F1 F1

F2 QTLs F 2 QTLs

Presentes na Tx303 Presentes na Oh43

20

9.716,8B73 x Mo17

Testemunha

10.601,96

10.727,45

10.689,74

10.890,63

11.179,32

11.217,01

ProduçãoGenótipo Selecionado

Tabela 3. Produção de grãos (Kg ha-1) dos genótipos selecionados e do genótipo original.

Somente 4 dos 93 híbridos obtidos foram inferiores ao híbrido original

21

Objetivo: Introgredir QTLs para aumento de produtivi dade presentes em uma linhagem selvagem de arroz, em uma linhagem cultivada, através de retrocruzamento assi stido

EXEMPLO-RETROCRUZAMENTO

22

O. rufipogon (QTLs) x “9311” (cultivada)

F1 x “9311”

RC1

RC1-S x “9311”

RC2

RC2 -S x “9311”

RC3

RC3 -S

Seleção para microssatélitesligados aos QTLs de produtividade

Seleção para microssatélitesligados aos QTLs de produtividade

Seleção para microssatélitesligados aos QTLs de produtividade

23

23,35,7144,59311

original

31.16,5165,19311

melhorada

Produção (g pl -1)Panículas/PlantaGrãos/PanículaGenótipo

Tabela 4. Comparação dos genótipos selecionados con tendo os QTLs de produtividade, com a linhagem original.

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• A introgressão de QTLs favoráveis presentes em materiais não elites, em materiais elites, através da SAM, foi eficiente em “melhorar” os materiais elites

• Elimina efeitos ambientais envolvidos na seleção fenotípica

• Explora QTLs de materiais não elites que dificilmen te seriam utilizados em programas convencionais de melhoramento

EXEMPLO-RETROCRUZAMENTO

25

Piramidação de Genes

– Combinação de diferentes genes/alelos em um único genótipo

– Resistência a doenças (obtenção de um genótipo resistente a diferentes raças de um patógeno ou a diferentes patógenos)

– Obtenção de um genótipo contendo QTLs favoráveis para diferentes caracteres

ALGUMAS APLICAÇÕES

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Objetivos: Utilização de marcadores microssatélites na piramidação de três genes de resistência ( Rv1, Rv3 e Rv4) em uma única linhagem de soja ( Essex), para criar uma forma de resistência durável e ampla ao vírus do mo saico da soja.

EXEMPLO-PIRAMIDAÇÃO

27

Rsv1Rsv1Rsv3Rsv3Rsv4Rsv4

três genótipo

Obtenção de populações segregando para os três gene s resistência

Seleção–marcas associadas a resistência ao vírus mosaico da

soja (VMS)

3 isolinhas de Essex, contendo cada um dos genes em homozigose dominantes

Rsv1Rsv1rsv3rsv3rsv4rsv4 rsv1rsv1rsv3rsv3Rsv4Rsv4rsv1rsv1Rsv3Rsv3rsv4rsv4

RRRRRRRsv1Rsv3Rsv42

RRRRRRRsv1Rsv3Rsv43

RRRRRRRsv1Rsv3Rsv41

Isolinhas piramidadas – 3 genes de resistência (homozi gose)

RRSRSRRsv4C

RSSSSSRsv3B

SRRRRRRsv1A

Isolinhas – 1 dos genes de resistência (homozigose)

SSSSSSrsv1Essex

SMVG7

SMVG6

SMVG5

SMVG3

SMVG2

SMVG1

Reação Observada

GeneGenótipo

Tabela 5. Resistência de genótipos contendo diferen tes genes de resistência ao vírus do Mosaico da Soja.

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• Combinação dos três genes de resistência em uma úni ca linhagem, em apenas dois ciclos de cruzamento.

• Marcadores não mascaram os efeitos dos outros marcadores (epistasia - Rsv1Rsv3 e Rsv1Rsv4)

• Obtenção de indivíduos resistentes sem necessidade de inoculação ou teste de progênies

EXEMPLO-PIRAMIDAÇÃO

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Seleção Assistida para a Característica de Interess e

– Identificação prévia do(s) gene/QTLs que afetam a característica de interesse

– Existência de marcadores que permitam monitorar a presença dos alelos favoráveis

– Seleção na população, dos genótipos que contém esses marcadores

– Natureza genética da característica, modo de ação gênica, efeito do gene na expressão do fenótipo, complexidade da avaliação fenotípica e eficiência c om que o marcador discrimina a característica

ALGUMAS APLICAÇÕES

31

Objetivos: Avaliar a eficiência da SAM em fornecer resistência ao mofo branco, em duas populações de R ILsde feijão, desenvolvidas utilizando o parental resi stente Bunsi.

EXEMPLO-CARÁTER DE INTERESSE

Mapeamento em uma população e seleção em outras duas populações

32

Bunsi (R) x Midland (S)

96 RILs (F 4:7)

seleção marcadores (resistência)

20 RILs

Controle – selecionados para ausência dos marcadores

associados aos QTL de resistência

POPULAÇÃO 1

33

72,441,4Controle

62,133,9Assistida

Incidência (%) (2001 e 2002)

Severidade (%)(2001 e 2002)

Genótipos

Tabela 6. Comparação da resistência ao mofo branco entre as RILsselecionadas com base nos marcadores e o grupo cont role

34

Bunsi (R) x Raven (S)

98 RILs (F4:7)

28 RILs

(somente marcadores)

18 RILs

(componente de arquitetura)

10 RILs

(considerando produção)

Controle – selecionados para ausência dos marcadores associados aos QTL de

resistência

POPULAÇÃO 2

35

4192477545174484Produtividade

(Kg/ha)

72,552,559,559,9Incidência (%)

40,427,733,033,2Severidade (%)

ControleGrupo M+A+P

Grupo M+AGrupo MCaráter

Tabela 7. Comparação dos genótipos selecionados com base nos marcadores (M), marcadores e arquitetura (fenotípic a) (M+A), marcadores arquitetura e produtividade (fenotípica ) (M+A+Y) e controle.

36

• Confirmação da SAM para ganhos em diferentes background genéticos

• SAM pode ser utilizada na ausência de patógenos e e m estágios iniciais

• Como a contribuição individual dos QTLs é pequena, informações de diferentes QTLs é crucial para ganho s significativos de resistência ao mofo branco atravé s da SAM

EXEMPLO-CARÁTER DE INTERESSE

37

Objetivo: Estimar Respostas à Seleção para diferente s esquemas de seleção (seleção fenotípica e com base em marcadores moleculares)

ASSISTIDA vs FENOTÍPICA

38

P1(r) x P2(s) x P3(r) x P4(s)

1200 F1 (CD)

135 genótipos 26 genótipos

Seleção Fenotípica

Seleção Baseada nos marcadores

39

4,428,826Baseada nos Marcadores

3,2412,6135Fenotípica

Ganho de Seleção por

Ano

Tempo para um ciclo

Ganho Total de Seleção

N

Caráter FHB (% espiguetas infectadas)

Seleção

Tabela 8. Ganho de seleção obtido através da seleçã o fenotípica e com base nos marcadores moleculares, para “ Fusarium head blight” (FHB).

40

• Embora a resposta a seleção para a seleção fenotípi ca tenha sido maior, a introgressão de QTLs de resistên cia em materiais elites utilizados em programas de melhoramento convencional, através da SAM, podem resultar em substancial aumento na resistência em u m menor tempo.

ASSISTIDA vs FENOTÍPICA

41

Caracteres complexos

• Lande e Thompson (1990)

onde: b p é o peso dado a informação fenotípica

P é a informação fenotípica

bm é o peso dado a informação genotípica

M é a informação genotípica

e:

MbPbI mp .. +=

( )[ ] ( )phbm −−= 1/1/1 2

SELEÇÃO COMBINADA

42

igual00001

total1.330.670.440.370.75

total421.331.110.5

total12643.330.25

total361812100.1

10.750.50.250.1h2

p

Tabela 9. Pesos da informação genotípica em relação ao peso 1 dado a informação fenotípica, em função da herdabilidade ( h2) e proporção da variância aditiva explicada pelas marcas ( p)

SELEÇÃO COMBINADA

43

Mapas genéticos com baixa saturação (GAPS)

• diminuição do poder e da precisão das estimativas d e posição e efeito dos QTLs

FATORES QUE DIFICULTAM

44

Mapas genéticos com baixa saturação (GAPS)

• ADIÇÃO DE NOVOS MARCADORES (SATURAÇÃO DOS MAPAS) - TENTAR COBRIR REGIÕES COM GRANDE INTERVALO ENTRE MARCADORES ADJACENTES

FATORES QUE DIFICULTAM

45

Modelos de mapeamento consideram apenas um QTL por intervalo

• Viés na estimativa dos efeitos dos QTLs/não detecçã o do QTL

QTL mapeado

0.62

1.81

1.21

aQTLs existentes

FATORES QUE DIFICULTAM

46

Modelos de mapeamento consideram apenas um QTL por intervalo

• SATURAÇÃO DOS MAPAS – DIMINUIR O INTERVALO ENTRE MARCADORES ADJACENTES

• DESENVOLVIMENTO DE MODELOS QUE CONSIDEREM MAIS DE UM QTL POR INTERVALO

FATORES QUE DIFICULTAM

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Interação QTLs por ambiente

• função do caráter, geralmente efeito é acentuado

• busca por QTLs estáveis

FATORES QUE DIFICULTAM

X21

X22

XXXX23

XXXX20

XXX19

XXX24

XXXXXXX18

XXXXXX17

XXXX16

X15

X14

X13

XXX12

XX11

XXX10

XXXX9

XX8

X7

XX6

XXX5

XXX4

XXX3

X2

XX1

IHGFEDCBA

AmbienteQTL

Tabela 10. Mapeamento de QTLs para produção de grão s (9 ambientes).Bento, tese ESALQ, 2006

49

FATORES QUE DIFICULTAM

Interação QTLs por ambiente

– ESTRATÍFICAÇÃO DAS ÁREAS AGRÍCOLAS

– AGRUPAMENTO REGIÕES BAIXA/AUSÊNCIA DE INTERAÇÃO G x A

– MANIPULAÇÃO DE GRUPOS ESPECÍFICOS DE QTLs PARA CADA REGIÃO, AUMENTANDO EFICIÊNCIA DA SAM

Epistasia

L-08-05F3.41 D x D0.56Efeito dominante =8Ph8axPh8b

L-08-05F2.91 -0.18bnlg1607-bnlg18238Ph8b

L-08-05F11.86 -0.31phi420701-phi01198Ph8a

L-08-05F5.40 -0.20umc1520-bnlg17596Ph6

L-08-05F6.49 -0.30bnlg2162-umc10864Ph4

L-08-05F5.77 -0.25umc1659-umc13203Ph3

L-08-05F5.77 -0.25 umc1073-umc10211Ph1

DireçãoR2aditivomarcascromoQTL

Tabela 11. Efeito espistático (resistência a Phaeosphaeria maydis)

FATORES QUE DIFICULTAM

51

Epistasia

• DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS PARA ESTIMAÇÃO PRECISA DA EPISTASIA (efeito e direção)

• ESTRATÉGIAS ADEQUADAS PARA “MANIPULAÇÃO”DOS EFEITOS DE EPISTASIA

FATORES QUE DIFICULTAM

52

Pequena proporção da variação fenotípica explicada por cada QTLs

2.31-0.20-2.12bnlg18638Qoil8

1.72-0.83-1.74umc14077Qoil7

2.040.989-1.87phi01266Qoil6

1.75-0.23-1.85BNLG17115Qoil5c

3.40-0.42-2.57phi01285Qoil5b

2.86-0.212.36BNLG18925Qoil5a

0.770.271.21umc10514Qoil4e

3.24-0.562.49bnlg21624Qoil4d

6.58-1.663.39bnlg22444Qoil4c

0.280.100.74dupssr344Qoil4b

1.121.48-1.05bnlg22914Qoil4a

0.170.08-0.57bnlg14523Qoil3

0.30-0.94-0.39umc14642Qoil2

2.15-0.53-2.02umc11061Qoil1c

2.18-0.28-2.06bnlg10141Qoil1b

1.95-1.46-1.66umc11771Qoil1a

daMarcaCromoQTL 2FenR

Mapeamento de QTLs para teor de óleo em milho, dados não publicados

FATORES QUE DIFICULTAM

53

GENOME-WIDE-SELECTION

• Foi possível devido ao baixo custo dos marcadores

• Marcadores abundantes no genoma (SNPs) – aumenta a probabilidade de estar ligado a algum gene de inter esse

• Informação de todos os marcadores do genoma, não apenas aqueles associados com o caráter por meio d e mapeamento de QTLs

• Elimina etapa de construção de mapas genéticos e mapeamento de QTLs (diminui tempo e custo)

• O valor genético de cada marcador é estimado (maior associação do marcador, maior valor genético do marcador)

• Só resultados de simulação

PERSPECTIVA - SAM

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Os marcadores moleculares podem trazer grandes benefícios para os programas de melhoramento genéti co

– Seleção estágios iniciais

– Caracteres difícil/alto custo para avaliação

– Seleção caracteres correlacionados (pleiotropia)

– Auxílio na “manipulação” dos efeitos de epistasia

– Introgressão de genes/QTLs detectados em materiais não elites (dificilmente seriam explorados nos programas convencionais) – PROGÊNIES TRANSGRESSIVAS

CONSIDERAÇÕES FINAIS

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Na literatura, a SAM apresenta resultados de sucesso e insucesso de sua aplicação. No entanto, para a maioria dos casos, ela

se mostra como uma importante ferramenta a ser implementada nos

programas convencionais de melhoramento, não como uma alternativa

aos programas convencionais de melhoramento!

OBRIGADO !

Gustavo Vitti Moro – gvmoro@esalq.usp.br