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KiKiKiKit t t t Genomic Genomic Genomic Genomic de de de de QuantificaçãoQuantificaçãoQuantificaçãoQuantificação de DNA de DNA de DNA de DNA
Manual TécnicoManual TécnicoManual TécnicoManual Técnico
PPPPara ara ara ara qqqquantificação de DNAuantificação de DNAuantificação de DNAuantificação de DNA
humano humano humano humano em análises forensesem análises forensesem análises forensesem análises forenses
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Kit para Kit para Kit para Kit para Quantificação de DNA humano Quantificação de DNA humano Quantificação de DNA humano Quantificação de DNA humano
1111. . . . IntroduçãoIntroduçãoIntroduçãoIntrodução
Na maioria dos casos forenses, as amostras recebidas apresentam-se com
alto grau de degradação, além de serem freqüentemente contaminadas com
microorganismos. A metodologia empregada na extração dessas amostras não
permite a distinção do DNA proveniente das células do material humano daquele
oriundo dos contaminantes. O mesmo ocorre com o procedimento utilizado na
quantificação do material extraído, que detecta ácido desoxirribonucléico,
independentemente de sua origem. Devido a esses fatores, a qualidade do DNA
humano e a quantidade do mesmo nas amostras forenses não podem ser aferidas
com alto grau de precisão.
O kit Genomic de Quantificação de DNA humano da baseia-se na utilização
de PCR em tempo real para amplificar de forma específica, e no mesmo tubo,
seqüências presentes nos cromossomos autossômico e Y humanos (Tabela 1). O kit
também conta com um controle interno, constituído por uma seqüência de DNA
sintético, com objetivo principal de analisar a presença de possíveis inibidores da
reação presentes nas amostras forenses extraídas. Os três pares de primers
sintetizados para os alvos descritos resultam em um sistema triplex.
Tabela 1Tabela 1Tabela 1Tabela 1:::: Alvos do kit de quantificação humana da Genomic.
AlvoAlvoAlvoAlvo Gene AlvoGene AlvoGene AlvoGene Alvo FluorófFluorófFluorófFluoróforooroorooro Tamanho Tamanho Tamanho Tamanho
do do do do
ampliconampliconampliconamplicon
PloidiaPloidiaPloidiaPloidia
Autossômico Retinoblastoma 1 FAM 110 pb Diplóide
Cromossomo Y DAZ Texas Red 110 pb Haplóide
IPC DNA sintético Cy5 110 pb -------
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Kit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humano
O kit é indicado para confirmar se a quantidade de DNA humano existente
em uma dada amostra é viável para posterior utilização nos sistemas de
identificação humana, tais como análises de STRs, SNPs e DIPs, e além disso, para
indicar se a amostra possui inibidores para as análises citadas.
Princípios do Princípios do Princípios do Princípios do kitkitkitkit
A química utilizada no sistema baseia-se na utilização de “quenchers” BHQ
ligados covalentemente a um oligonucleotídeo genérico (antiprimer), capaz de
parear com os primers fluorescentes de cada um dos alvos (Tabela 1) e inibir a
fluorescência dos mesmos. A fluorescência aumenta à medida que os produtos são
amplificados, possibilitando a captação do sinal pelo equipamento (Figura 1).
Figura 1:Figura 1:Figura 1:Figura 1: A cada final de ciclo, a temperatura da reação é diminuída para permitir a ligação
do antiprimer aos oligonucleotídeos marcados livres. O antiprimer não é capaz de ligar aos
produtos de PCR dupla-fita, permitindo com que a amplificação dos produtos com primers
marcados com FAM ou Texas Red resulte em um aumento exponencial da fluorescência..
Figura retirada de Li, J. et al., 2006.
Ciclo 1: Síntese da primeira fita do “template”.
Ciclo 2: Síntese da fita complementar, incluindo a região
contendo a sequência genérica.
Diminuição da temperatura para ligação do antiprimer aos primers livres e captação da fluorescência das duplas-fitas
geradas.
Repetição por 40 ciclos. A captação da fluorescência aumenta à medida que os produtos são gerados.
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Kit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humano
O sistema mostra acurácia para soluções contendo concentrações de DNA
acima de 32 pg/µL, onde a curva padrão mostra linearidade.
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Kit para QuaKit para QuaKit para QuaKit para Quantificação de DNA humano ntificação de DNA humano ntificação de DNA humano ntificação de DNA humano
2222.... ComposiçãoComposiçãoComposiçãoComposição ddddo kito kito kito kit
Componentes fornecidosComponentes fornecidosComponentes fornecidosComponentes fornecidos
Todos os reagentes necessários para a amplificação dos 3 alvos são
fornecidos com o kit em uma série de 3 tubos (Tabela 2).
TabelaTabelaTabelaTabela 2:2:2:2: Componentes do kit e suas respectivas quantidades para 200 reações.
ComponenteComponenteComponenteComponente DescriçãoDescriçãoDescriçãoDescrição VolumeVolumeVolumeVolume
PCR Mix
Quatro tubos contendo
uma mistura de MgCl2,
desoxirribonucleotídeos
trifosfatos e Taq DNA
polimerase em solução
tampão apropriada.
1,25 mL/tubo
Primer Mix
Dois tubos contendo
primers fluorescentes
Foward e Reverse para
amplificação dos 3 alvos,
Antiprimer contendo o
quencher BHQ-2 e a
referência passiva Cy3.
0,55 mL/tubo
DNA genômico controle
Um tubo contendo DNA
genômico masculino a
50 ng/µL.
50 µL/tubo
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Kit para QuantiKit para QuantiKit para QuantiKit para Quantificação de DNA humano ficação de DNA humano ficação de DNA humano ficação de DNA humano
Armazenamento dos ComponentesArmazenamento dos ComponentesArmazenamento dos ComponentesArmazenamento dos Componentes
Os fluoróforos ligados aos primers são sensíveis à luz. Portanto, devem ser
protegidos quando não estiverem em uso. Todos os componentes são entregues
congelados. Após o primeiro descongelamento, armazená-los a temperatura de
2ºC a 8ºC.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
3333. . . . Reação de PCRReação de PCRReação de PCRReação de PCR
Preparo Preparo Preparo Preparo das diluições seriadasdas diluições seriadasdas diluições seriadasdas diluições seriadas para para para para a curva a curva a curva a curva padrãopadrãopadrãopadrão
Vortexar o DNA controle por 15 segundos antes de iniciar as diluições
(Tabela 3).
TaTaTaTabela 3bela 3bela 3bela 3:::: Diluições seriadas do DNA controle para composição da curva padrão.
TuboTuboTuboTubo
VolumeVolumeVolumeVolume
do DNAdo DNAdo DNAdo DNA
BufferBufferBufferBuffer TE TE TE TE Concentração FinalConcentração FinalConcentração FinalConcentração Final
1 Não diluído ------ 50 ng/µL
2 8uL tubo 1 32 µL 10 ng/µL
3 8uL tubo 2 32 µL 2 ng/µL
4 8uL tubo 3 32 µL 0,4 ng/µL
5 8uL tubo 4 32 µL 0,08 ng/µL
As diluições se mantém estáveis por até 2 semanas, desde que armazenadas
a temperatura entre 2 a 8ºC.
Preparo Preparo Preparo Preparo da Reaçãoda Reaçãoda Reaçãoda Reação
1. Preparar todas as reações em duplicata e um volume de master mix 10% maior
que o total requerido. Lembre-se de considerar os controles positivos e negativos
(Tabela 4). Vortexar os tubos por 5 segundos antes de efetuar a mistura.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
Tabela 4Tabela 4Tabela 4Tabela 4:::: Volumes necessários para o preparo do master mix para uma reação.
ComponenteComponenteComponenteComponente VolumeVolumeVolumeVolume
PCR Mix 23,0 µL
Primer Mix 5,0 µL
2. Homogeinize a mistura gentilmente e dispense 28 µL em cada tubo.
3. Adicione 2 µL de Buffer TE aos tubos do controle negativo (NTC).
4. Adicione 2 µL das diluições seriadas (Tabela 5) ou 2 µL da amostra
desconhecida individualmente em cada tubo.
5. Feche os tubos, centrifugue por 20 segundos a 3500 r.p.m. e coloque as reações
em um equipamento de Real-time PCR.
Protocolo para utilizaçãoProtocolo para utilizaçãoProtocolo para utilizaçãoProtocolo para utilização do sistemado sistemado sistemado sistema Applied Real Applied Real Applied Real Applied Real----time time time time
PCR 7500PCR 7500PCR 7500PCR 7500
1. Na tela inicial, clique em “Advanced Setup”.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
2. Nomeie o experimento e mantenha as demais condições.
3. Clique em “Plate Setup” e “Add new target” para inserir os três alvos. Em
seguida clique “Add new samples” para definir o número de amostras a serem
quantificadas.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
4. Na mesma tela, clique na aba “Assign Targets and Samples”.
5. Selecione os poços para o controle negativo e marque-os como NTC para os
alvos autossômico e Y e desconhecido (U) para o IPC.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
6. Clique em “Define Set Up Standards” e preencha os campos conforme abaixo.
7. Clique “apply” e “close”.
8. Selecione os poços referentes aos pontos da curva e marque-os como
“Standards” para os alvos autossômico e Y e desconhecido para o IPC. Verifique
se a concentração de cada ponto está corretamente indicada para os 2 alvos.
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KiKiKiKit para Quantificação de DNA humano t para Quantificação de DNA humano t para Quantificação de DNA humano t para Quantificação de DNA humano
9. Selecione o número de poços referente às amostras e marque-as como
desconhecido para os 3 alvos. Lembre-se se adicionar duplicatas para cada
amostra. Selecione também Cy3 em “Passive Reference”.
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11. Clique em “Run Method” e configure o ciclo conforme descrito abaixo.
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12. Após salvar o método, clique em “Run” e depois “Start Run”.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
4444. . . . Análise das reaçõesAnálise das reaçõesAnálise das reaçõesAnálise das reações
1. Em “Analisys”, clique em “Amplification Plot” e selecione os poços referentes
aos pontos da curva.
2. Em “options”,selecione um dos alvos e marque o campo referente ao
“Threshould automático”. O “threshould” também poderá ser modificado
manualmente quando for conveniente.
3. Clique em “Analyze”. Os gráficos esperados para cada alvo são mostrados na
figura 2.
Figura 2: Figura 2: Figura 2: Figura 2: Gráficos esperados para as reações triplex feitas com os pontos da curva padrão.
As linhas nos gráficos autossômico e Y representam, respectivamente, os pontos de 50
ng/µL, 10 ng/µL, 2 ng/µL, , , , 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL e NTC.
Autossômico Y
IPC
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4. Para ver a curva padrão, clique em “Standard curve”. Checar o coeficiente de
regressão linear e a eficiência da reação. Os valores considerados satisfatórios
são mostrados na tabela 5.
Tabela 5Tabela 5Tabela 5Tabela 5:::: Valores do coeficiente de regressão linear e eficiência da reação
esperados para a curva padrão.
ParâmetroParâmetroParâmetroParâmetro Valores de referênciaValores de referênciaValores de referênciaValores de referência
Coeficiente de regressão linear (R2) Acima de 0,990
Eficiência da reação Entre 80% e 110 %
As curvas padrão esperadas para cada alvo são mostradas na figura 3.
FiguraFiguraFiguraFigura 3 3 3 3: : : : Curvas padrão esperadas as reações triplex. Os pontos em vermelho referem-se,
respectivamente, às concentrações de 50 ng/µL, 10 ng/µL, 2 ng/µL, , , , 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL.
Autossômico Y
R2= 0,999
Ef = 95%
R2= 0,999
Ef = 94%
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
Acessando as concentrações das amostras Acessando as concentrações das amostras Acessando as concentrações das amostras Acessando as concentrações das amostras quantificadasquantificadasquantificadasquantificadas
Em “Amplification Plot”, selecione a aba “View Well Table”. A planilha
informará a quantidade de DNA detectada para cada alvo dentro de uma mesma
amostra. As unidades serão as mesmas utilizadas para as amostras da curva
padrão, ou seja, ng/µL.
Interpretação do resultado de amplificação do controle Interpretação do resultado de amplificação do controle Interpretação do resultado de amplificação do controle Interpretação do resultado de amplificação do controle
interno.interno.interno.interno.
O uso do controle interno IPC é útil na determinação de falhas no
equipamento ou de falhas humanas, bem como na indicação da presença de
possíveis inibidores da reação de PCR.
A kit Genomic de quantificação de DNA foi desenvolvido para que a
amplificação do controle interno gere em condições padrão um Ct de
aproximadamente 27. No entanto, uma variação no valor do 1,5 Ct acima ou abaixo
dos pontos da curva poderão ser observados e deverão ser considerados normais.
Além disso, amostras com concentrações maiores que 50 ng/µL podem gerar Ct
mais alto do que os citados acima. As situações possíveis para o sistema são
descritas na tabela 6.
Tabela 6Tabela 6Tabela 6Tabela 6:::: Interpretações com base na amplificação do controle interno da reação.
Alvos Alvos Alvos Alvos YYYY ou ou ou ou Autossômico Autossômico Autossômico Autossômico IPCIPCIPCIPC InterpretaçãoInterpretaçãoInterpretaçãoInterpretação
Sem amplificação Amplificação Resultado negativo- DNA
humano não encontrado
Sem amplificação Sem amplificação Resultado inválido
Amplificação com baixo Ct
e alto ∆Rn
Sem amplificação ou Ct alto (>29) Resultado do IPC
inconclusivo
Amplificação com alto Ct Sem amplificação ou Ct alto (>29) Presença de inibidores na
reação
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Kit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humanoKit para Quantificação de DNA humano
5555. . . . Validação do kitValidação do kitValidação do kitValidação do kit
Para validação do kit, um total de 7 amostras extraídas pela GENOMIC
foram quantificadas por espectrofotômetro e nanodrop. Outras 3 amostras foram
adquiridas através do “National Institute of Standards & Technology” (NIST). As
amostras e suas respectivas concentrações estão descritas na tabela 7.
Tabela 7Tabela 7Tabela 7Tabela 7:::: Amostras usadas como template nas reações de validação do kit.
NomeNomeNomeNome DescriçãoDescriçãoDescriçãoDescrição ConcentraçãoConcentraçãoConcentraçãoConcentração
Amostra 1 DNA masculino 0,1 ng/µL
Amostra 2 DNA masculino 0,29 ng/µL
Amostra 3 DNA de múltiplos homens
e mulheres.
2 ng/µL
Amostra 4 DNA masculino 2 ng/µL
Amostra 5 DNA feminino 13,5 ng/µL
Amostra 6 DNA masculino 16 ng/µL
Amostra 7 DNA feminino 22 ng/µL
Amostra NIST A DNA masculino de um
único indivíduo.
5 ng/µL
Amostra NIST B DNA de múltiplas
mulheres.
5 ng/µL
Amostra NIST C DNA de múltiplos homens
e mulheres.
5 ng/µL
As amostras foram usadas como template em reações de PCR em tempo real
dos kits de Quantificação da Genomic, Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit
(Applied Biosystems) e Investigator® Quantiplex (Qiagen). Os resultados das
quantificações apresentaram mesmo grau de magnitude em todos os casos testados
(Tabela 8).
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
Tabela 8Tabela 8Tabela 8Tabela 8:::: Quantificação de 10 amostras de concentrações conhecidas utilizando o
kit de quantificação da Genomic e Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit (Applied
Biosystems) e Investigator® Quantiplex (Qiagen). Um volume de 2 µL de cada
amostra foi usado nas reações em duplicata em todos os kits.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
6666. . . . Efeito dos inibidores noEfeito dos inibidores noEfeito dos inibidores noEfeito dos inibidores no sistema sistema sistema sistema
O efeito dos inibidores hematina e ácido húmico nas reações de
quantificação foram observados através de reações contendo quantidades
crescentes de cada inibidor. Os resultados mostraram que o Ct do controle interno
aumenta à medida que a concentração de inibidor aumenta na reação. Além disso, o
aumento do Ct para o controle interno é acompanhado pelo aumento do Ct dos
alvos autossômico e Y (Figuras 4 e 5).
IPC - Hematina
0
10
20
30
40
50
0 µM 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM 35µM
Ct
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 µM 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM 35µM
Hematina
Ct
Y
Autossômico
IPC
A.
B.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
Figura 4Figura 4Figura 4Figura 4:::: Amostras de concentração 1 ng/µL de DNA genômico masculino humano
foram geradas com diferentes concentrações do inibidor hematina. A) Cts
observados para os alvos autossômico, Y e IPC. B) Variação do Ct para o alvo IPC.
C) Quantificação obtida das amostras em cada situação de inibição.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Hematina
DN
A (
ng
/µL
)
Y
Autossômico
Y 0,775 0,565 0,42 0,175 0,023 0
Autossômico 0,82 0,725 0,37 0 0 0
0µM 10µM 15µM 20µM 25µM 30µM
C.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 ng/µL 5 ng/µL 10 ng/µL 15 ng/µL 20 ng/µL 25 ng/µL 30 ng/µL
Ácido Húmico
Ct
Y
Autossômico
IPC
IPC - Ácido Húmico
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 ng/µL 5 ng/µL 10 ng/µL 15 ng/µL 20 ng/µL 25 ng/µL 30 ng/µL
Ct
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Ácido Húmico
DN
A (
ng
/µL
)
Y 0,988 0,643 0,378 0,233 0,019 0
Autossômico 1,038 0,419 0,258 0,008 0 0
0
ng/µL
5
ng/µL
10
ng/µL
15
ng/µL
20
ng/µL
25
ng/µL
Figura Figura Figura Figura 5555:::: Amostras de concentração 1ng/uL de DNA genômico masculino humano
foram geradas com diferentes concentrações do inibidor ácido húmico. A) Cts
observados para os alvos autossômico, Y e IPC. B) Variação do Ct para o alvo IPC.
C) Quantificação obtida das amostras em cada situação de inibição.
A.
B.
C.
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Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
7777. . . . MMMMistura de DNA masculino e istura de DNA masculino e istura de DNA masculino e istura de DNA masculino e
femininofemininofemininofeminino O comportamento do sistema foi avaliado em situações de misturas de DNA
masculino e feminino. Uma quantidade fixa de 0,2 ng/µL de DNA masculino foi
misturada a DNA feminino em diferentes proporções. Um volume de 2 µL de cada
mistura foi usado para avaliar o limite de detecção do sistema para o alvo do
cromossomo Y. As quantificações obtidas do DNA masculino ficaram dentro do
esperado, mesmo em “background” 1000 vezes maior de DNA feminino.
0,01
0,1
1
10
100
1:0
1:1
1:2
1:5
1:1
0 1
:20
1:5
0
1:1
00
1:5
00
1:1
000 0:1
Proporção (DNA masculino:DNA feminino)
DN
A (n
g/u
L)
Y
Autossômico
24
Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano Kit para Quantificação de DNA humano
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