Sequenciamento de DNASequenciamento de DNA

19771977• Max & Gilbert (Harvard – USA)Max & Gilbert (Harvard – USA)• Fred Sanger (Cambridge – Inglaterra)Fred Sanger (Cambridge – Inglaterra)

Método para determinar a sequência de Método para determinar a sequência de nucleotídeos em um fragmento de DNAnucleotídeos em um fragmento de DNApela síntese dessa molécula pela síntese dessa molécula in vitroin vitro

Método de SangerMétodo de Sanger(enzimático ou de terminação de cadeia)(enzimático ou de terminação de cadeia)

DNA em fita simples (molde)DNA em fita simples (molde)

PrimerPrimer (iniciador da síntese) (iniciador da síntese)

Desoxinucleotídeos (dNTP – A, T, G, C – marcados Desoxinucleotídeos (dNTP – A, T, G, C – marcados radioativamente)radioativamente)

Dideoxinucleotídeo (ddNTP)Dideoxinucleotídeo (ddNTP)

Enzima polimeraseEnzima polimerase

Componentes do sequenciamento Componentes do sequenciamento

Desoxi

Permite extensão da fita no final 3’ Previne a extensão da fita no final 3’

rribonucleosídeo trifosfato didesoxi rribonucleosídeo trifosfato

HHHHHHHH

HH

Método enzimático para sequenciamento de DNA

(Sanger e col., 1977)GCATATGTCAGTCCAG

CGTATACAGTCAGGTC

5’5’3’

3’DNA

fita dupla

CGTATACAGTCAGGTC3’ 5’DNA

fita simplesGCAT5’ 3’Iniciador + DNA polimerase

+ excesso de dATP, dTTP, dGTP, dCTP

GCAT AATGTCAATGTCAGTCCA ATGTCAGT

ATGTAT

ATGTCAGTCCATGTCAGTCATGTC

ATGTCAGTCCAGGCATGCAT

GCATGCATGCAT

GCATGCATGCAT

GCATGCATGCAT

ATGTCAGATG

+ddATP +ddTTP +ddCTP +ddGTP

Método de sequenciamentoenzimático (manual)

Método enzimático para sequenciamento de DNA

(Sanger e col., 1977)

A T C G GACCTGACTGTA

3’

5’

GGTTGGCCAACC GGGGCCCCTTCCCCCCTTGG

Sequenciamento direto de DNA (gene Sequenciamento direto de DNA (gene 22) de portador da) de portador da Hb Westmead (Hb Westmead (122 122 HisHisGln)Gln)

His His GlnGln

GG AA CC TT

Sequenciamento automáticoSequenciamento automático

Permite a análise simultânea de diversos segmentos de Permite a análise simultânea de diversos segmentos de DNADNA

Utilizado para sequenciamento de larga escalaUtilizado para sequenciamento de larga escala

Nucleotídeos marcados com fluorocromo (quatro Nucleotídeos marcados com fluorocromo (quatro corantes diferentes)corantes diferentes)

Emitem luz em diferentes comprimentos de ondas Emitem luz em diferentes comprimentos de ondas quando excitados por um quando excitados por um laserlaser

SequenciamentoSequenciamentoautomático de automático de

DNADNA

DNA de fita simplescom o inserto clonadoa ser sequenciado

Adição deconstituintes dasreações desequenciamento

Terminadores didesoxi

Primer universal doM13 com marcadorfluorescente

Fitas de DNA sintetizadomarcadas

Mistura dasquatro reações

Processamento dos por um computador

Detecção com fotomultiplicador

Excitação do marcador fluorescente com laser

Sequenciamento de DNA automático

GCATATGAGCGTATACTC

5’3’ 5’

3’ DNAfita dupla

ddATP ddCTP ddTTP ddGTP Terminadoresdideoxi+ + + +

CGTATACTC CGTATACTC CGTATACTC CGTATACTCGCAT GCAT GCAT GCAT

Primer com marcadores fluorescentes

Sequenciamento de DNA automático

Gel de sequenciamentoLaserFotomultiplicador

Resultados processados em um

computador

Mistura das 4 reaçõesde sequenciamento

TiminaTimina

AdeninaAdenina

GuaninaGuanina

CitosinaCitosina

Sequenciamentode DNA

C T C G A A A C A A A A A A G G A A T T A G G T C

GGA nt 30.864, aa248, ArgA nt 30.864, aa248, Arg Gln Gln

11 22

11 22 33 44

11 CCGGA A CCAAAA

22

G (normal)G (normal)

11

11 22 33 44

11

G/A (heterozigota)G/A (heterozigota)

RR

11 22

11 22 33 44

11