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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... 9
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................... 11
ABSTRACT ............................................................................................................................ 13
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 14
1.1 Agente Etiológico e ciclo biológico .............................................................................................. 14
1.2 Epidemiologia e Fatores de risco ................................................................................................ 18
1.3 Manifestações clínicas................................................................................................................. 20
1.4 Os diferentes tipos de toxocaríase .............................................................................................. 21
1.5 Diagnóstico .................................................................................................................................. 22
1.6 Tratamento e controle ................................................................................................................ 26
2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................... 27
3. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 28
3.1 Objetivo Geral ............................................................................................................................. 28
3.2 Objetivos Específicos ................................................................................................................... 28
4. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 29
4.1 Aspectos éticos ............................................................................................................................ 29
4.2 Soroteca de camundongos .......................................................................................................... 29
4.3 Sorotecas de humanos ................................................................................................................ 30
4.4 .Identificação direta por bioinformática (HelmCop e Nematode.net) de epítopos lineares de
célula B específicos de T. canis e sua síntese. ................................................................................... 30
4.5 Lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 .................................................................................................... 32
4.6 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) .......................................................................... 32
4.6.1 ELISA anti-IgG em soros de camundongos com peptídeos sintetizados .............................. 33
4.6.1 ELISA anti-IgG de camundongos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-CTL1 e rTC-
CTL-2 .............................................................................................................................................. 34
8
4.6.2 ELISA anti-IgG e anti-IgA em soros humanos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-
CTL1 e rTC-CTL-2............................................................................................................................ 34
4.6.3 ELISA anti-IgG1 e anti-IgG4 em soros humanos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-
CTL1 e rTC-CTL-2............................................................................................................................ 35
4.7 Análise Estatística ........................................................................................................................ 36
5. RESULTADOS .................................................................................................................. 37
5.1 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com peptídeos .............................. 37
5.2 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com lectinas recombinantes rTC-
CTL-1 e rTC-CTL-2. ............................................................................................................................. 46
5.3 Resultados do ELISA anti-IgG, -IgA, -IgG1 e -IgG4 de humanos com lectinas recombinantes rTC-
CTL-1 e rTC-CTL-2. ............................................................................................................................. 48
6. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 55
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 62
8. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 63
9. ANEXOS ............................................................................................................................. 72
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Machos e fêmeas de Toxocara canis ....................................................................... 14
Figura 2: Ovos contendo larvas L3 de Toxocara canis. .......................................................... 16
Figura 3: Larva L3 de Toxocara canis. ................................................................................... 17
Figura 4: Ciclo biológico Toxocara canis ............................................................................... 17
Figura 5: Reatividade do peptídeo 1 (EGGGGKKKG: miosina Toxocara canis) com soros de
camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG....... 38
Figura 6: Reatividade do peptídeo 2 (GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293)) com
soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-
IgG. ........................................................................................................................................... 39
Figura 7: Reatividade do peptídeo 3 (GGSKGFPPAPY: canal de potássio Toxocara canis)
com soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA
anti-IgG. .................................................................................................................................... 40
Figura 8: Reatividade do peptídeo 4 (PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo c E/S TES 32
Toxocara canis) com soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em
experimento de ELISA anti-IgG............................................................................................... 41
Figura 9: Reatividade do peptídeo 5 (YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293)) com
soros de camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-
IgG. ........................................................................................................................................... 42
Figura 10: Reatividade do peptídeo 6 (KSDPDPKK: miosina Toxocara canis) com soros de
camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG....... 43
Figura 11: Curvas ROC das ELISAs utilizando os peptídeos como antígeno com os soros de
camundongos infectados por diferentes helmintoses. .............................................................. 44
Figura 12: Reatividade da lectina TC-CTL-1 com soros de camundongos infectados com
diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ...................................................... 46
Figura 13: Reatividade da lectina TC-CTL-2 com soros de camundongos infectados com
diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ...................................................... 47
Figura 14: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG utilizando as lectinas recombinantes como
antígeno com os soros de camundongos infectados por diferentes helmintoses. ..................... 48
Figura 15: Reatividade das lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 com soros de
humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. ............. 49
10
Figura 16: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG utilizando as lectinas recombinantes como
antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. ............................. 50
Figura 17: Reatividade das lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 com soros de
humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgA. ............. 51
Figura 18: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgA utilizando as lectinas recombinantes como
antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. ............................. 52
Figura 19: Reatividade das lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 com soros de
humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG4. ........... 53
Figura 20: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG4 utilizando as lectinas recombinantes como
antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. ............................. 54
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LISTA DE ABREVIATURAS
rTC-CTL-1: (recombinante) Toxocara canis – lectina tipo C -1.
rTC-CTL-2: : (recombinante) Toxocara canis – lectina tipo C -2.
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay.
ICB: Instituto de Ciências Biológicas.
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais.
L3: Larva estágio 3.
ROC: Receiver Operator Curve.
cDNA: Ácido Desoxirribonucleico complementar.
DECIT: Departamento de Ciência e Tecnologia.
TES: Antígeno de excreção/secreção de larvas de Toxocara.
PCR: Reação em cadeia da polimerase.
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RESUMO
A toxocaríase humana é uma zoonose ocasionada pela ingestão acidental de ovos
embrionados de nematódeos do gênero Toxocara, e em especial de Toxocara canis. No cão, é
uma parasitose intestinal crônica com distribuição mundial, com maiores prevalências em
países em desenvolvimento e de clima tropical. Nos seres humanos, Toxocara não completa
seu ciclo biológico, ocasionando em um quadro de larva migrans. O diagnóstico clínico da
toxocaríase humana é difícil devido à sintomatologia inespecífica e o diagnóstico laboratorial
geralmente é realizado por testes sorológicos indiretos e comercializado em kits (ELISA
NOVUM®, ELISA PU®; Toxocara CHEK®). Além disso, existe uma alta reação cruzada
com outras helmintoses e ao poliparasitismo em geral, diminuindo ainda mais a eficácia do
diagnóstico da toxocaríase. Devido a estes problemas, este estudo tem como objetivo avaliar o
desempenho de novos antígenos recombinantes e peptídeos de T. canis para o diagnóstico
sorológico da toxocaríase humana. Para predição de epitopos lineares para linfócitos B, o
programa BEPIPRED 1.0 foi usado e seis peptídeos sintetizados foram testados. Além disso,
duas sequências imunodominantes (rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2) do antígeno excretado e
secretado de T. canis foram selecionadas por screening em um banco de cDNA de larvas
deste helminto. Estas foram subclonadas, expressas em células BL21(DE3) e purificadas. Em
ensaios de ELISA, os peptídeos e as lectinas recombinates foram testados com soros de
camundongos (como pré-seleção para as mais promissoras) e humanos infectados por
diferentes helmintoses, para verificar o reconhecimento específico dos antígenos de T. canis.
Cálculos sobre especificidade e sensitividade de cada antígeno testado foram feitos, utilizando
análises das curvas ROC (Receiver Operator Curve) de cada ensaio. As lectinas do tipo C
recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 obtiveram 100% de sensibilidade e 100% de
especificidade no ensaio de ELISA anti-IgG com soros de camundongos. Porém, ao serem
testadas com soros humanos, observou-se uma alta reatividade cruzada com outras infecções
helmínticas, com melhor desempenho para rTC-CTL-1 em anticorpos anti-IgA e anti-IgG4,
com sensitividade de 72% e 96% e especificidade de 88.24% e 78.43%, respectivamente. Dos
6 peptídeos testados em ELISA anti-IgG com soros de camundongos, os peptídeos 1, 2 e 4
apresentaram 100% de sensitividade, e uma média de 58% de especificidade, obtendo grande
reatividade cruzada com a infecção por A. suum. Sugerimos novos testes com epítopos e
antígenos recombinantes modificados, para melhorar o desempenho para um diagnóstico mais
específico da toxocaríase humana.
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ABSTRACT
Toxocariasis is a zoonosis that affects humans by the accidential infection of
embryonated eggs of the nematode genus Toxocara and especially from T. canis. In the dog,
it causes chronic intestinal infection. Toxocara has a worldwide distribution with elevated
prevalences in underdeveloped countries and regions with tropical climate. In humans, the
parasite does not complete its life cycle, which causes a clinical picture of larva migrans. The
clinical diagnosis of human toxocariasis is difficult due to its unspecific symptoms and
diagnosis generally relies on indirect serological tests, which are commercially available
(ELISA NOVUM®, ELISA PU®; Toxocara CHEK®). Furthermore, there is a high cross-
reactivity with other helminths and polyparasitism in general, further decreasing the
efficiency of diagnosis of toxocariasis. For prediction linear epitopes for B-lymphocytes , the
BEPIPRED 1.0 was used and six synthesized peptides were tested . In addition, two
immunodominant sequences (rTC- CTL-1 and rTC-CT -2) secreted antigen and secreted T.
canis were selected for screening in a cDNA library larvae of the helminth. These were
subcloned, expressed in BL21 (DE3) cells and purified. In ELISA assays , the peptides and
lectins recombinates were tested in mice sera ( pre - selection as the most promising ) and
humans infected by different helminthiasis , to verify the specific recognition of antigens T.
canis. In each assay, sensitivity and specificity was calculated by performing a ROC
(Receiver Operator Curve) analysis. The anti-IgG ELISA with mouse sera revealed 100% of
sensitivity and specificity for the tested recombinant lectins. However, when tested with
human serum samples, a high cross-reactivity with other helminth infections resulted. The
best performance was achieved in anti-IgA and anti-IgG4 assays against rTC-CTL-1,
resulting in a sensitivity of 72,0% and 96,0% and specificity of 88,2% and 78,4%,
respectively. Out of the six peptides tested with mouse sera in anti-IgG ELISAs, peptides
number 1, 2 and 4 presented with a 100% sensitivity, but only a mean specificity o 58,0%.
Especially sera from mice infected with A. suum showed strong cross-reactivity. In order to
further improve the specific diagnosis of human toxocariasis, we suggest additional studies
with new and/or modified peptides or recombinant antigens.
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1. INTRODUÇÃO
A toxocaríase humana é uma zoonose ocasionada pela ingestão acidental de ovos
embrionados de nematódeos do gênero Toxocara, especialmente Toxocara canis, cujo
hospedeiro definitivo é o cão (Barriga, 1991). Dentre as diferentes espécies, vale destacar o
Toxocara cati, que parasita gatos e o Toxocara vitulorum (parasito de ruminantes) que
possuem grande importância para a saúde pública (Rubinsky-Elefant et al., 2010). A
toxocaríase é uma parasitose crônica com distribuição mundial de maior prevalência em
países em desenvolvimento e de clima tropical. No entanto, a prevalência desta doença e seu
impacto na saúde pública são subestimados, mesmo em países desenvolvidos (Torgeson e
Budke 2006).
1.1 Agente Etiológico e ciclo biológico
O Toxocara é um nematódeo de grande importância para a saúde humana e animal. Ele
pertence ao filo Nemathelmintes, classe Nematoda, ordem Ascaroidea, família Ascaridae e
subfamília Ascarinae, sendo que o macho possui aproximadamente 4 a 10 centímetros, e a
fêmea entre 6 a 18 centímetros de comprimento (Figura 1), cujo hospedeiro definitivo é o cão
(Foreyt 2005).
Figura 1: Machos e fêmeas de Toxocara canis
O cão se infecta ao ingerir ovos embrionados de T. canis contendo larvas do terceiro
estágio (Schnieder et al., 2011). Os ovos ingeridos pelo cão sofrem ação do suco gástrico e as
larvas eclodem no intestino delgado, atravessa a parede intestinal, seguindo pela veia porta ou
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vasos linfáticos até o fígado, coração e então para os pulmões. Nos pulmões, as larvas
rompem os bronquíolos, alcançando a traquéia, quando são deglutidas e retornam ao intestino
delgado, onde se desenvolvem até a sua forma adulta. Após cerca de 4 a 5 semanas da
ingestão dos ovos, as fêmeas adultas de T. canis são capazes de produzir diariamente até
200.000 ovos, que serão eliminados juntamente com as fezes dos animais, tornando-se
infectante em duas a cinco semanas, sob condições ambientais adequadas de temperatura e
umidade (Schantz, 1989). A segunda rota de migração é a somática. Neste caso, quando as
larvas chegam aos pulmões há o retorno das mesmas para o coração, pelas veias pulmonares,
e assim sua migração é facilitada para qualquer parte do organismo seguindo a circulação
sanguínea. As larvas ainda podem passar por um estágio de hipobiose em tecidos ou órgãos
como fígado, rins, olhos e cérebro (Barriga 1988).
A idade do hospedeiro definitivo é determinante para o tipo de migração. Filhotes com
menos de cinco meses ainda não possuem resposta imunológica eficiente. Por isso, nesses
animais, as larvas migram pela via hepato-traqueal, retornando ao intestino delgado, onde
evoluem para as formas adultas. Aos seis meses, os cães montam uma resposta imunológica
adquirida contra o parasito. Dessa forma, as larvas que passam pelos pulmões retornam ao
coração, evadindo para os tecidos, onde permanecem em estado de hipobiose (Glickman et
al., 1978).
Os cães podem adquirir a infecção de outras maneiras que não a ingestão de ovos: a
migração transplacentária ocorre quando a cadela gestante possui larvas em hipobiose nos
tecidos, que são ativadas, provavelmente por alterações hormonais no terço final de gestação,
e alcançam o fígado dos fetos pela placenta. Os filhotes nascem com as larvas nos pulmões e,
a partir da segunda semana de vida, os parasitos adultos são aptos a produzir ovos. Além
dessa via, as larvas podem alcançar as glândulas mamárias e serem transmitidas pela via
lactogênica, desde a ingestão do colostro até 45 dias da lactação, com pico máximo de
eliminação na segunda semana. Nesse caso, a presença de ovos nas fezes dos filhotes se dá
duas semanas após a ingestão da larva pelo leite (Barriga, 1988).
As cadelas em puerpério são capazes de se infectar pela ingestão de parasitos adultos
contidos em vômitos e ovos nas fezes dos filhotes, durante a higienização da ninhada. Os cães
também podem ingerir as larvas infectantes em hipobiose dos tecidos de hospedeiros
paratênicos, como roedores e aves. Nestes animais, após a ingestão dos ovos embrionados,
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ocorre migração somática e as larvas permanecem em hipobiose sem concluir o ciclo
(Magnaval et al., 2001).
Uma vez expelidos, os ovos de T. canis (Figura 2) necessitam cerca de duas a seis
semanas sob condições favoráveis de temperatura (10-30ºC) e humidade para completar o
embrionamento e transformarem em larvas L3, da qual é o estágio da larva infectante para a
infecção. O aumento da temperatura pode acelerar o desenvolvimento dos ovos enquanto que
temperaturas abaixo de 10ºC e acima de 30ºC são hostis à maturação e sobrevivência destes.
Os ovos são muito resistentes e sobrevivem bem sobre a maioria dos invernos e climas
temperados, sobrevivendo por seis a doze meses. Alguns ovos podem ser capazes de
sobreviver em local fresco e úmido por dois a quatro anos ou mais (Gamboa 2005).
Nos seres humanos, que se comportam como hospedeiros paratênicos, a infecção por
Toxocara spp. é ocasionada pela ingestão de ovos embrionados deste nematódeo. A ingestão
de carne crua também tem sido apontada como fator de risco para aquisição de toxocaríase.
Estudos observaram que em adultos a prevalência foi de 7,8 vezes maior em pacientes com
histórico de ingestão de carne crua em relação àqueles que não possuíam esse hábito
(Morimatsu et al., 2006).
Figura 2: Ovos contendo larvas L3 de Toxocara canis.
17
Figura 3: Larva L3 de Toxocara canis. Fonte: www.cdc.gov
Ao serem ingeridos pelo homem, as larvas de T. canis (Figura 3) eclodem e
atravessam a parede do intestino delgado e ganham a circulação pela via hepática, migrando
por diversos órgãos como fígado, pulmão, coração e cérebro. Essa doença foi inicialmente
denominada de larva migrans visceral. Posteriormente, os casos com comprometimento
oftálmico receberam a denominação de larva migrans ocular, e atualmente essas síndromes
causadas por larvas de Toxocara spp. são conhecidas como toxocaríase visceral (TV) e
toxocaríase ocular (TO) (Magnaval et al., 2001).
Figura 4: Ciclo biológico Toxocara canis.
Fonte: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Toxocariasis.htm
18
1.2 Epidemiologia e Fatores de risco
A toxocaríase é uma zoonose de ampla distribuição mundial e possui uma grande
importância na saúde pública, visto que possui hospedeiros definitivos domésticos como cães
e gatos, e também hospedeiros selvagens como, por exemplo, raposas (Glickman et al., 1978).
O toxocara canis é um dos mais importantes helmintos gastrointestinais em cães, com
relatos de infecções de todas as partes do mundo. Estudos apontam que alguns países como
Nigéria, China e Itália possuem cerca de 50, 45 e 33% de cães positivos para este helminto.
No Brasil, os valores de positividade atingem de 45% até 99% em filhotes de cães
(Sowemimo, 2007; Dai et al., 2009; Habluetzel et al., 2003; Chieffi e Muller, 1976; Barriga
1988).
Esta zoonose é particularmente prevalente nos trópicos e sub-trópicos, em países menos
industrializados, onde o tratamento de cães e controle populacional é limitado. A infecção por
T. canis é uma importante causa de morbidade também em países ricos e industrializados,
especialmente em crianças e nas populações socioeconomicamente desfavorecidas (Torgerson
e Budke, 2006).
Outras espécies de Toxocara contribuem para a carga global de toxocaríase, mas sua
importância é bem menos entendida e definida, porém é importante lembrar que o T. cati
possui semelhante distribuição global como T. canis, e sua importância não pode ser ignorada.
Outras espécies como T. malaysiensis, que ocorre em gatos na Malásia e China, T. vitulorum,
que ocorre em ruminante, T. pteropodis (morcegos), e T. leonina, que ocorre em cães, gatos e
outros caninos e felinos, possuem certo potencial para causarem zoonose, porém sua
importância é muito mais limitada (Morgan, 2013).
Muitos fatores biológicos inerentes ao ciclo de vida do parasito contribuem para a
perpetuação dessa espécie. Entre esses, incluem-se as inúmeras vantagens da transmissão
vertical no hospedeiro definitivo jovem, garantido o início precoce da produção de ovos de
vermes adultos nestes. Além disso, a alta fecundidade, a sobrevivência prolongada de ovos no
ambiente, e a alta diversidade de hospedeiros definitivos e paratênicos, também são
fundamentais para o sucesso da espécie, resultando o Toxocara como um dos parasitos mais
difundidos e causando uma das zoonoses predominante em todo o mundo (Mcpherson, 2013).
19
A prevalência global de Toxocara spp. em seres humanos é influenciada por um grande e
complexo número de variáveis que estão ligados ao nível de desenvolvimento populacional,
geográfica, cultural e socioeconômico do local. Além disso, deve-se considerar também o
nível de heterogeneidade de susceptibilidade genética individual à infecção relacionado à
imunidade, co-infecção, genética, idade, sexo, nutrição e comportamento dos hospedeiros
definitivos e paratênicos como os cães e humanos (Viney e Graham, 2013).
Esses fatores, juntamente com o aumento da população humana e o alto índice de
migração global da população rural para a urbana (mais de 50% da população mundial agora
reside em áreas urbanas), aumentam ainda mais a interação entre os hospedeiros definitivos e
o homem, sugerindo que no mundo inteiro a importância da toxocaríase na saúde pública seja
cada vez maior (Macpherson, 2013). Entretanto, os fatores de risco para a transmissão da
doença variam consideravelmente em diferentes partes do mundo: a pobreza, a baixa
educação e problemas com descontrole e falta de tratamento dos hospedeiros definitivos
levará a ambientes altamente contaminados que em climas quentes e condições favoráveis irá
proporcionar oportunidade de transmissão ideal, principalmente se associada à falta de
higiene. Esses fatores de risco são observados em muitas partes do mundo (Dunsmore et al.,
1984).
Crianças, devido ao seu comportamento e seu contato próximo com animais domésticos,
principalmente cães, possuem mais contato com terra, colocam objetos em suas bocas e
associados à falta de higiene possuem um maior risco para contrair a doença. Em muitas
cidades, ambientes públicos como parques e playgrounds representam áreas de grande risco
para exposição humana aos ovos (Deplazes et al., 2011).
Estudos epidemiológicos na América Latina indicaram alta exposição de crianças por
Toxocara, resultando em uma prevalência de 28.8 a 62.3%. Áreas rurais, onde pessoas
possuem maior contato com solo e animais, tendem a uma maior prevalência, cerca de 35 a
42%, enquanto áreas semi-rurais possuem cerca de 15 a 20% e áreas urbanas por volta de 2 a
5%, principalmente em parques e playgrounds (Magnaval et al., 2001; Mendonca et al., 2012;
Maraghi et al., 2014). Em países industrializados, estudos sorológicos conduzidos em sua
maioria em crianças, apontam que a prevalência da toxocaríase varia de 0,7% na Nova
Zelândia, 1,6% no Japão, 2,4% na Dinamarca, 7,5% na Austrália, 14% nos Estados Unidos e
15% na Polônia (Fan et al., 2013). Em contrapartida, maior soroprevalência foi constatada em
20
países menos industrializados e tropicais como na África: 30% na Nigéria, 45% na
Suazilândia e 93% em La Reunion (África), 81% no Nepal, 63,2% na Indonésia e 58% na
Malásia (Ásia) e 36% no Brasil e 37% no Peru (América Do Sul) (Macpherson, 2013).
A alta soroprevalência de Toxocara reportada (14%) nos Estados Unidos, estima que
cerca de 1,3 a 2,8 milhões de pessoas possuem a infecção. Isso é um exemplo de que mesmo
em países ricos, a toxocaríase é uma zoonose de grande importância na sociedade, e junto
com outras helmintoses, são consideradas doenças negligenciadas e que não afetam somente
populações empobrecidas (Hotez, 2008).
1.3 Manifestações clínicas
No cão, os sinais da toxocaríase incluem diarreia, flatulência, distensão abdominal,
desidratação e atraso no desenvolvimento. A passagem das larvas pelos pulmões pode resultar
em tosse e quadro de pneumonia. Em migrações aberrantes, a migração larval pode ocasionar
alterações como celulite orbital e em infecções massivas, a morte do animal. A eosinofilia é
considerada a principal alteração hematológica na toxocaríase canina (Santarém et al., 2009).
Os sintomas clínicos da toxocaríase humana são causados pela migração da L3 de
Toxocara spp. através da corrente sanguínea para o interior de órgãos, incluindo músculo,
fígado, cérebro e olho. Essas migrações podem ser assintomáticas ou pode conduzir uma
ampla variedade de sintomas, dependendo do órgão invadido, a duração da migração,
intensidade da infecção, idade e resposta imunológica do hospedeiro (Despommier, 2003). A
sobrevivência de longo prazo das larvas de T. canis foi atribuída a duas estratégias
moleculares evoluídas pelo parasito: a larva libera substâncias de excreção-secreção que
incluem lectinas, mucinas e enzimas que interagem e modulam a imunidade do hospedeiro, e
secundariamente, a larva produz uma mucina de revestimento de superfície frouxamente
ligada na epicutícula do parasito. Esse revestimento permite o parasito escapar quando os
anticorpos e as células do hospedeiro aderem no mesmo, porém, esse processo resulta em uma
reação inflamatória em torno do local recém-desocupado (Maizels, 2013).
Em seres humanos a toxocaríase raramente é fatal, mas as respostas inflamatórias devido à
migração das larvas geralmente são associadas com linfadenopatia generalizada, hepatite
21
granulomatosa, endomiocardite, endoftalmite, asma e leucocitose, incluindo alta eosinofilia.
Muitos pacientes possuem hipergamaglobulinemia de IgG e IgE, manifestações cutâneas, e
raramente, meningoencefalite pode ocorrer. As infecções são geralmente autolimitadas e as
larvas ficam encapsuladas na musculatura e no fígado, e assim os sintomas desaparecem. As
síndromes da infecção por Toxocara spp. são relacionadas com a migração das larvas e da
resposta imune do hospedeiro em relação a isso (Despommier, 2003).
A toxocaríase humana possui duas classificações, que foram definidas originariamente: a
toxocaríase visceral e toxocaríase ocular. O entendimento da variedade clínica e dos sinais e
sintomas da toxocaríase evoluíram ao longo dos últimos 30 anos, e com a introdução de testes
de diagnósticos melhorados e de triagem soroepidemiológico, há uma maior compreensão da
base molecular e imunológica da evasão. Com isso, síndromes adicionais principais têm sido
descritas, como a toxocaríase comum ou disseminada, e a neurotoxocaríase (Fan et al., 2013;
Taylor et al., 1988; Smith et al., 2009).
1.4 Os diferentes tipos de toxocaríase
A toxocaríase visceral é a mais comum diagnosticada em crianças menores que oito anos
de idade, e está associada com a alta intensidade ou repetidas infecções larvais por T. canis,
das quais podem persistir por semanas ou meses. Os sintomas clássicos incluem febre,
hepatoesplenomegalia, dor abdominal, vômitos, diarreia, sintomas respiratórios como tosse e
chiados, asma, anorexia, perda de peso, fatiga, manifestações neurológicas, palidez e
ocasionalmente, urticária (Despommier, 2003).
A toxocaríase ocular é considerada rara em comparação a toxocaríase visceral, e acredita-
se que é resultado de uma baixa intensidade de infecção por T. canis, e também é mais
frequente em crianças. Casos de TO são normalmente unioculares e são causados pela
migração da L3 para o olho e resultante da reação imunológica neste. A deficiência visual
ocorre ao longo de dias ou semanas, e o nível de prejuízo depende da localização da larva.
Tardiamente, uma eosinofilia e um granuloma fibroso podem criar uma distorção e até mesmo
um descolamento da mácula, o que pode resultar em cegueira. Os impactos visuais dependem
da área específica envolvida. A toxocaríase ocular pode causar endoftalmite difusa ou papilite
(inflamação da extremidade do nervo óptico que entra no olho). Infecções em longo prazo por
22
Toxocara spp. podem levar até mesmo a uma corioretinite da membrana neovascular coroidal
(Despommier, 2003; CDC, 2011).
A toxocaríase comum ou disseminada é caracterizada pelo quadro de sintomas não
específicos da doença, sintomas leves ou assintomáticos. Inquéritos soroepidemiológicos
muitas vezes detectam anticorpos específicos anti-Toxocara em pessoas, porém o quadro
clínico não é claro, ou até mesmo é assintomático. Esses achados são caracterizados como a
toxocaríase comum e são as mais comuns, ou seja, a maioria das infecções por Toxocara
comportam desta maneira, principalmente em adultos saudáveis, o que de certa maneira
contribui para negligência e subnotificação da doença (Taylor et al., 1988).
A neurotoxocaríase, uma outra possível síndrome decorrente da infecção, surge a partir da
invasão de L3 de Toxocara no cérebro e cordão espinhal, causando meningite, encefalite,
mielite, vasculite cerebral e convulsões (Ruttinger et al., 1991).
1.5 Diagnóstico
O diagnóstico da toxocaríase humana pode ser realizado por meio direto e indireto
(exames sorológicos). O exame direto por meio de microscópio (exame histopatológico) de
Toxocara spp. em seres humanos é difícil e raramente feito, pois consiste na procura de larvas
no tecido por meio de biópsia. Além disso, as biópsias realizadas em tecidos humanos permite
a identificação do helminto por meio de PCR baseada em sequências ITS-1 e ITS-2 de rDNA
nuclear, porém este procedimento também raramente é feito e geralmente é realizado em
casos extremos da doença (Jacobs et al., 1997).
O imunodiagnóstico, que é um meio indireto de diagnóstico, é realizado por meio de
exames sorológicos que, na maioria dos testes, detectam anticoporpos circulantes no soro de
pacientes com alguma possível infecção por algum patógeno. Estes anticorpos, que são
denominados como imunoglobulinas, podem ser usados para revelar diagnóstico de várias
doenças (Abbas, 2013).
23
As imunoglobulinas constituem um grupo de glicoproteínas presentes no soro e fluidos
teciduais de todos os mamíferos e podem estar presentes na superfície celular onde funcionam
como receptores, ou também podem estar livres no sangue ou na linfa funcionando como
anticorpos. Quando a célula B entra em contato com o antígeno ela é ativada e é capaz de
liberar anticorpos, que passam a ser chamadas de plasmócitos. No ser humano existem cinco
classes de imunoglobulinas designadas como IgG, IgE, IgD, IgM e IgA.
O uso de subclasses de IgG em ensaios sorológicos podem ainda aumentar a
especificidade dos testes diagnósticos. Cada subclasse de IgG possui uma diferença biológica
e físico-químicas, e portanto, podem ser preferencialmente produzidas em resposta a
diferentes antígenos e condições patológicas (Watthanakulpanich et. al., 2008).
A IgA é a segunda imunoglobulina mais abundante no sangue. Ela é a predominante nas
secreções dos tratos gastrointestinal e respiratório, como também no colostro e leite humanos.
A IgA promove imunidade mucosa local contra vírus e parasitos e limita o crescimento
bacteriano nas superfícies mucosas. A IgA também funciona no trato gastrointestinal e mostra
uma resistência maior a enzimas proteolítica que outras classes de anticorpos (Abbas, 2013).
Na toxocaríase, esta possui grande importância devido a migração das larvas e estimulação da
ativação destes anticorpos pelas mucosas (Elefant et al., 2006).
O IgE embora presente em quantidades ínfimas no soro, é encontrada nas membranas
superficiais dos mastócitos e basófilos, possuindo peso molecular de 188.000. Ela é capaz de
sensibilizar as células nas superfícies das mucosas e ainda possui papel importante contra
helmintos, estando também associada a reações alérgicas (Abbas, 2013). Estas são
importantes na patologia da toxocaríase, que é caracterizada pela reação alérgica da migração
das larvas no homem, porém, será mais abundante na fase aguda da doença (Elefant et al.,
2006).
Em geral, o diagnóstico da toxocaríase possui vários problemas, especialmente em países
tropicais, onde o poliparasitismo é comum. O diagnóstico é feito com base na apresentação
clínica, anamnese do paciente, e principalmente pelo teste sorológico de ELISA (Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay), utilizando antígeno de excreção/secreção de larvas de
Toxocara (TES) comercializado em kits (ELISA NOVUM®, ELISA PU® and Toxocara
CHEK®) disponíveis e amplamente utilizados para diagnósticos e estudos sorológicos.
24
Porém, a diferença na qualidade dos antígenos utilizados e a falta de padronização de
resultados, juntamente com as diferenças populacionais de exposição ao poliparasitismo e
outros patógenos, reatividade cruzada, alimentação e condições sócio econômicas, dificultam
e tornam cada vez mais difícil o diagnóstico correto e a comparação de resultados e pesquisa
(Smith e Noordin, 2006).
O antígeno TES é um grupo de glicoproteínas secretadas pelo resultado do metabolismo
da larva do parasito durante seu desenvolvimento. Ele consiste em uma diversidade de
proteínas entre 30 a 400 kDa juntamente com grandes quantidades de carboidratos. Esta
mistura de substâncias e antígenos é altamente imunogênico durante a infecção, por isso é o
alvo principal de estudos envolvendo diagnóstico (Badley et al., 1987).
Durante o passar dos anos, vários estudos sobre o TES vem sendo realizado usando
técnicas de biologia molecular para classificar mais precisamente os componentes deste
antígeno. Com isso, uma combinação de sequências de peptídeos, anticorpos monoclonais e
técnicas de DNAs recombinantes, caracterizaram três conjuntos de proteínas e glicoproteínas
do antígeno TES, nomeados como: TES-26, TES-32/70 e TES-120. Dos quais possuem
grande importância na reação parasito-hospedeiro na toxocaríase (Maizels, 2013).
O uso de antígenos TES do parasita resultou num aumento da sensibilidade e
especificidade dos testes comerciais citados, porém como ainda existe uma reatividade
cruzada com antígenos de outras helmintoses, este teste deve ser usado com muito critério
para evitar resultados falsos positivos quando aplicado em áreas endêmicas (Turrientes et al.,
2011). Mesmo usando subclasses de IgG (Watthanakulpanich et al., 2008) ou antígenos
recombinantes do parasita (Mohamad et al., 2009), o problema da reatividade cruzada com
antígenos de outras helmintoses ainda continua. O poliparasitismo, principalmente por
helmintos gastrointestinais, podem reduzir a especificidade em cerca de 50% nos testes de
ELISA na detecção de anticorpos IgG e suas subclasses (Watthanakulpanich, 2008).
Devido ao problema da reatividade, soros de pacientes que forem positivos para Toxocara
spp. em testes de ELISA, devem ser confirmados por „western blotting‟ (WB) baseado no
reconhecimento de antígenos TES fracionados e nativos de larvas de T. canis, das quais vêm
demonstrando um aumento significante da especificidade da reatividade de bandas de baixo
25
peso molecular (24-32 kDa), anteriormente propostas como específicas deste helminto (Smith
et al., 2009).
Além dos antígenos providos diretamente dos parasitas, a bioinformática proporciona
informações sobre genomas, transcriptomas e proteomas que podem ser usadas para buscar
sequencias específicas em bancos de dados, resultando na previsão de candidatos para novas
vacinas, predição de antígenos/epítopos para diagnóstico ou de novas drogas (Albubacker et
al., 2011; Pinheiro et al., 2011).
Mais recentemente um novo banco de dados, HelmCoP, foi criado para helmintos que
já contem informações sobre várias espécies de helmintos e com a expectativa de incluir
genomas de mais 20 espécies em breve (Abubucker et al., 2011). Outro banco de dados,
Nematode.net, já contem informações sobre sequencias de ESTs/cDNA de 30 espécies de
nematódeos parasíticos (Martin et al., 2009). No caso do T. canis ainda não existe o genoma
completo disponível nos bancos de dados, porém, dispomos de publicação de sequencias
expressas deste, o que permite na utilização dessas técnicas de bioinformática para a predição
de epítopos específicos para diagnóstico (Zhou et al., 2011).
Em outra via do diagnóstico, as técnicas de imagem podem ser úteis para auxiliar este em
pacientes com toxocaríase. No caso da visceral, com um quadro mail definido, lesões
hepáticas ovais com cerca de 1.0 a 1.5 cm de diâmetro, características deste tipo de infecção,
podem ser detectadas em tomografia computadorizada, ressonância magnética e
ultrassonografia, ajudando na confirmação do diagnóstico. As lesões de Toxocara spp. são
diferentes de nódulos metastáticos pois estes tem margens difusas, tamanhos uniformes e
formas não esféricas (Lim, 2008).
Em relação aos diferentes tipos da doença, o diagnóstico da neurotoxocaríase também é
complicado e inclui os exames sorológicos para detectar a presença de anticorpos anti-
Toxocara, porém estes podem estar baixos ou até mesmo ausentes. Portanto a realização de
tomografia computadorizada e outros exames de imagens para possível visualização da larva
são cruciais para o diagnóstico correto (Finsterer e Auer, 2007). Nessa mesma linha, o
diagnóstico da TO também é complicado devido à ausência ou baixa presença de anticorpos
sanguíneos, e comparado a NT, difere-se apenas pelas técnicas de imagens que são
oftalmológicas, como a tomografia de coerência óptica (Arevalo et al., 2013).
26
1.6 Tratamento e controle
O tratamento quimioterápico em pacientes com toxocaríase varia de acordo com a
severidade e a localização dos sintomas. Pacientes com sintomas de toxocaríase visceral e
neurotoxocaríase são administrados anti-helmínticos como Albendazol, Tiabendazol e
Mebendazol juntamente com anti-inflamatórios corticoides para aliviar os sintomas causados
pela severa resposta inflamatória do sistema imune. No caso da toxocaríase ocular, o
tratamento é realizado com corticoides e procedimentos oftalmológicos delicados para
retirada da larva (Despommier, 2003; Magnaval e Glickman, 2006).
A grande variedade doméstica e selvagem de hospedeiros definitivos e paratênicos assim
como suas formas de transmissão de Toxocara spp. tornam o controle deste helminto
complicado. Dentro dos principais reservatórios e vias de transmissão do parasito como a
infecção intestinal do hospedeiro definitivo, ovos no ambiente, larvas nos hospedeiros
paratênicos e larvas somáticas nos hospedeiros, a população de mais fácil controle da
toxocaríase são os animais de estimação como os gatos e os cães (Schnieder, 2001). Existem
excelentes tratamentos para estes animais, e se estes forem feitos de forma correta, ocorre
uma considerável redução da contaminação ambiental por estes reservatórios do toxocara
(Palmer et al., 2010).
A educação da população também exerce importante papel para o controle deste helminto,
pois é fundamental para a redução da infecção humana. Os veterinários desempenham um
importante papel na educação dos donos dos animais domésticos, orientando quanto ao perigo
da zoonose, e alertando principalmente os pais das crianças e elas mesmas, para uma boa
educação higiênica ao se envolver com os animais (Palmer et al., 2010).
Outra medida crucial para a redução de Toxocara canis. no ambiente, é o controle do
número de cães errantes principalmente nas cidades onde as áreas de lazer são compartilhados
com estes animais por muitas pessoas e crianças. Esta medida foi alcançada em certo ponto
pela América do Norte, Europa e Austrália em cerca de 30 anos atrás, mostrando que é
possível tal medida (Beck, 1979).
27
Um costume importante educacional por parte dos donos, e que também contribui para a
diminuição da zoonose, é a coleta das fezes realizadas por seu cão em áreas públicas. Isto
pode permitir que as pessoas e os cães possam compartilhar áreas públicas com seus donos
nas grandes cidades. Restringir os cães em playgrounds, parques e jardins pode ser a medida
mais efetiva de controle, porém mais difícil de ser implantada além de causar transtornos nos
donos que podem fazer questão da companhia de seus animais de estimação (Kirchheimer e
Jacobs, 2008).
Uma boa higiene e o cozimento adequado dos alimentos pode impedir a ingestão acidental
de ovos encontrados no ambiente pelos homens. Infelizmente tais medidas de higiene, a
princípio são simples e fáceis de serem implementadas, porém na prática não é dessa forma,
especialmente devido ao grande contato do homem com o cão e às crianças que têm maior
dificuldade. Além disso, é relevante considerar a grande resistência dos ovos a produtos que
podem destruir o Toxocara spp. no ambiente, e o aumento da tendência global de comer carne
e vegetais cru ou mal cozidos, que facilita a transmissão deste helminto (Macpherson, 2005).
2. JUSTIFICATIVA
Devido à grande frequência de cães infectados por Toxocara canis e ao grande potencial
destes contaminarem o ambiente domiciliar, peridomiciliar e lugares públicos, como praças e
parques, a toxocaríase humana torna-se uma zoonose de importância para a saúde pública
(Hotez, 2008). As áreas rurais tendem a apresentar maior prevalência (35-42%) comparada a
semi-rural (15-20%), e urbana (2-5%). No entanto, as áreas urbanas, particularmente em
parques e praças, foram mostradas um elevado número de ovos de Toxocara acarretando em
um grande risco de infecçãonos seres humanos. Sendo assim, a toxocaríase é considerada uma
das importantes doenças negligenciadas, principalmente nas Américas (Macpherson, 2013).
O diagnóstico da infecção humana geralmente está sendo feito por testes indiretos,
aplicando testes de ELISA ou WB. Entretanto, mesmo os testes descritos com antígenos
fragmentados ou antígenos recombinantes demostram reatividades cruzadas com outras
helmintoses comumente encontradas em países tropicais e em desenvolvimento como o Brasil
(Turrientes et al., 2011). Dentre estas helmintoses, têm-se o Schistosoma mansoni,
28
Angiostrongylus, Strongyloides e ainda, a que possui maior reatividade cruzada, as espécies
de Ascaris (Smith et al., 1983).
Portanto, o presente estudo se justifica pela necessidade da busca por novos antígenos
para o diagnóstico da toxocaríase com uma sensitividade e especificidade efetiva,
principalmente tentando eliminar a reatividade cruzada no diagnóstico com outros helmintos,
especialmente com Ascaris lumbricoides, visto que ao contrário dos testes comerciais, que
ainda podem apresentar uma grande reatividade cruzada, usaremos lectinas recombinantes
imunodominantes (rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2) para o estudo.
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar o desempenho de novos antígenos e peptídeos por meio de ensaios de ELISA
indireta com soros de camundongos e humanos infectados por diferentes espécies de
helmintos.
3.2 Objetivos Específicos
- Identificar novos antígenos e/ou epítopos de T. canis por meio da busca em bancos de
dados com genomas completos ou sequências de ESTs, como HelmCoP e
Nematode.net e selecionar sequências de peptídeos específicas para linfócitos B.
- Testar e avaliar peptídeos promissores em ensaios de ELISA anti-IgG com soros de
camundongos infectados por diferentes helmintoses.
- Testar e avaliar as lectinas recombinantes TC-CTL-1 e TC-CTL-2 em ensaios de
ELISA anti-IgG com soros de camundongos infectados com diferentes helmintoses.
- Testar e avaliar as lectinas TC-CTL-1 e TC-CTL-2 em ensaios de ELISA anti-IgG,-
IgG1,-IgG4 e -IgA com soros de humanos infectados por diferentes helmintos.
29
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Aspectos éticos
O presente projeto é uma continuação do projeto de pesquisa intitulado “Identificação de
proteínas específicas para o imunodiagnóstico da larva migrans humana” (ETIC 223/02,
Parecer n° 124/02) e do projeto “Novo diagnóstico para toxocaríase humana” (Parecer CAEE
– 05548512.5.0000.5149) do Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas
da UFMG.
4.2 Soros de camundongos
Para os testes de ELISA com soros de camundongos infectados, foram utilizados
sorotecas do Laboratório de Helmintoses Intestinais do departamento de Parasitologia e
Laboratório de Esquistossomose e Imunohelmintologia localizado no ICB-UFMG. Sendo
assim, usou-se:
- Nove soros de camundongos C57BL/6 infectados 3 vezes com 500 ovos de T. canis,
sendo um intervalo de duas semanas em cada infecção: o soro foi coletado com 50 dias
pós infecção.
- Nove soros de camundongos C57BL/6 infectados 3 vezes com 500 ovos de Ascaris
suum, sendo um intervalo de duas semanas em cada infecção: o soro foi coletado com 50
dias pós-infecção.
- Oito soros de camundongos Swiss coinfectados por Schistosoma mansoni (infecção
injetada contendo 25 cercárias) e Angiostrongylus costaricensis (infecção realizada por
gavagem contendo 8 larvas L3). O soro foi coletado quando o camundongo possuía 125
dias pós-infecção de S. mansoni e 21 dias de infecção por Angiostrongylus, totalizando 3
semanas de co-infecção.
- Cinco soros de camundongos BALB/C infectados por meio subcutâneo contendo 25
cercarias de Schistosoma mansoni. O soro foi coletado com 50 dias pós-infecção.
30
- Seis soros de camundongos BALB/C infectados por meio subcutâneo contendo 700
larvas L3 de Strongyloides venezuelensis. O soro foi coletado com 14 dias pós-infecção.
- Quatro soros de camundongos BALB/C não infectados como controle negativo.
Em cada momento das infecções experimentais, os animais de cada grupo foram
anestesiados com injeção intraperitoneal de solução de ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10
mg/kg). Para cada 12-15 g foram aplicados 100 ml da solução e, quando necessário, aplicar
depois mais ¼ a ½ da dose inicial. Após confirmação da anestesia coletou-se a amostra de
sangue por punção cardíaca ou plexo braquial dos animais anestesiados. Posteriormente, cada
animal será eutanasiado por sobredose de ketamina e xilazina para realização de necropsia.
4.3 Soros de humanos
Os soros humanos de pacientes com exames de fezes positivos para Schistosoma mansoni,
Ascaris summ (infecção experimental em humanos, 70 dias pós-infecção), negativos e de
pacientes com toxocaríase confirmados por Western blot, que em parte já foram usados em
ensaios anteriores por Peixoto et al., 2011, foram obtidos pelas sorotecas do Laboratório de
Imunologia e Genômica de Parasitos e do Laboratório de Helmintoses Intestinais (ambos
ICB-UFMG). Cinco soros positivos por teste comercial de ELISA (RIDASCREEN®
Toxocara IgG, R-Biopharm, Alemanha) e com suspeita de toxocaríase por anamnese foram
fornecidos pelo Instituto Evandro Chagas de Belém, e acrescentados nos testes. Soros de
pacientes positivos para exames de fezes por ancilostomídeos também foram utilizados no
estudo, e fornecidos pelo Instituto Evandro Chagas do Pará.
Sendo assim, no total foram usados 25 soros de pacientes com Toxocara, 5 com Ascaris
suum (projeto Ascaris humano, Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos, CAAE:
26945814.1.0000.5149), 20 com ancilostomídeos (projeto DECIT, Pará), 16 com Schistosoma
mansoni (projeto DECIT, Januária) e 10 negativos (projeto DECIT, Januária).
4.4 .Identificação direta por bioinformática (HelmCop e Nematode.net) de epítopos lineares
de célula B específicos de T. canis e sua síntese.
31
Os epítopos lineares para linfócitos B foram preditos usando o programa BEPIPRED
1.0 („B cell epitope prediction‟) (Larsen et al., 2006). O programa avalia todos os
aminoácidos da sequência dando uma pontuação baseado na hidrofilicidade (Parker, 1989) e
no método de cadeia de Markov. Vários aminoácidos seguidos com pontuação igual ou maior
que 1.3 formam um epítopo linear. O programa não apresenta limitações para o número
mínimo de aminoácidos para formar um epítopo. Para limitar esse tamanho, um script PERL
(filtro) do grupo da Profa. Daniella Bartholomeu foi criado para selecionar somente os
epítopos com tamanho igual ou maior que quinze aminoácidos (Freitas et al., 2011). Peptídeos
com alta similaridade com proteinas de de A. lumbricoides foram eliminados.
Após a busca, identificou-se um total de 154 proteínas de T. canis depositada no NCBI
(National Center for Biotechnology Information) na data de acesso em 24/07/2013, das quais
foram recuperadas para análise. Epítopos lineares de células B foram preditos utilizando o
programa Bepipred 1.0, considerando um valor de corte de 1.3, que representa 96% de
especificidade e 13% de sensibilidade.
Foram identificados 18 peptídeos não redundantes com alto potencial de ser um
epítopo. Para identificar potenciais epítopos específicos de T. canis, foi utilizado o algoritmo
BLASTP para alinhar os peptídeos não redundantes com o proteoma predito baseado no
genoma de A. summ versão 1.0 (contendo 18542 proteínas). Sendo assim, foram considerados
específicos epítopos com identidade e cobertura menor de 70%.
Um total de 15 epítopos foram considerados específicos para T. canis:
EAKNQDSTT; EGGGGKKKG; EIPTPDTTVSDD; ENGDPSDA; ESKPQPKAPAK;
GGRAPPKHDNP; GGSKGFPPAPY; KNRKPGDKSSE; KPETDSLAT; KQKGQNAT;
KSDPDPKK; NPADSMQA; PAATTTAAPGVTTT; SSKSKPQPKVP; YGPGAAAS.
Destes epítopos promissores, seis foram selecionados de acordo com sua origem e
sintetizados (JPT Peptide Technologies, Berlim, Alemanha):
1) EGGGGKKKG: miosina de T. canis.
2) GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293): fungo.
3) GGSKGFPPAPY: canal de potássio T. canis.
4) PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo E/S TES 32 T. canis.
32
5) YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293): fungo.
6) KSDPDPKK: miosina T. canis.
Os peptídeos foram recebidos liofilizados em uma concentração de 10 mg. Cada um deles
foi reconstituído em 1 mL de água bidestilada, resultando em uma concentração de 10
mg/mL. Estes foram aliquotados a 100 µL por tubo (10 tubos para cada peptídeo) e
armazenados em freezer -20ºC.
4.5 Lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2
As lectinas recombinantes TC-TCL-1 e TC-TCL-2 foram produzidas pelo grupo de
Dr. Bin Zhan da Escola de Medicina do Baylor College, localizada em Houston, Texas, EUA.
Estas lectinas foram selecionadas a partir de proteínas imunodominantes selecionadas por
screening em bancos de dados cDNA de larvas de T. canis, a partir do antígeno TES-32, e
após a seleção, foram subclonadas, expressas em células BL21(DE3) de Escherichia coli e
purificadas para os ensaios de ELISA.
4.6 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Ensaios de ELISA indireto foram utilizados para dosagem de anticorpos específicos
em soros de camundongos e de seres humanos, contra os peptídeos sintetizados e as lectinas
TC-CTL-1 e TC-CTL-2. No caso do ELISA de camundongos, foi usado como anticorpo
secundário anti-IgG (Anti-camundongo IgG peroxidase, anticorpo produzido em coelho,
SIGMA-ALDRICH®, EUA). Em ensaios com soros humanos, foram usados anti-IgG-AP
(Anti-Humano IgG, específico para cadeia y e conjugado de fosfatase alcalina, SIGMA-
ALDRICH®, EUA), anti-IgG1(Anti-Humano IgG1, Clone 8c/6-39, biotinilado, SIGMA-
ALDRICH®, EUA), anti-IgG4 (Anti-Humano IgG4-Biotinilado, clone HP-6025, biotinilado,
33
SIGMA – ALDRICH®, EUA) e anti-IgA-AP (Anti-Humano IgA,específico para cadeia α,
conjugado de fosfatase alcalina, SIGMA-ALDRICH®, EUA) como anticorpos secundários.
4.6.1 ELISA anti-IgG em soros de camundongos com peptídeos sintetizados
Para este teste foi usada a placa de 96 poços (COSTAR®, EUA, 96 poços, Nº2595,
vinil; para ensaios com proteínas). O ELISA indireto foi realizado em três etapas:
1) Sensibilização;
2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário;
3) Diluição e aplicação do anticorpo secundário e revelação.
Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em água bidestilada
acrescida do peptídeo testado, em uma concentração de 10 µg/mL e volume total de 100 µl
por poço, incubados durante a noite à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda
etapa, da qual foi realizado o bloqueio com solução de PBS a 2% de albumina de soro bovina
(BSA, SIGMA-ALDRICH®, EUA) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o bloqueio, foi feito
duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e aplicado o
anticorpo primário (soros) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween 0,05%, incubado
durante a noite em geladeira 4-8 ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a lavagem das
placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco vezes, e então
aplicado o anticorpo secundário IgG-peroxidase (SIGMA-ALDRICH®,USA) em uma
diluição de 1:5000 em PBS Tween 0,05%, 100 µl em cada poço, e incubado durante duas
horas à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita lavagem das placas com 200 µl em cada poço
de PBS Tween 0,05% por cinco vezes e feita a adição de 100 µl de substrato OPD (o-
phenylenediamine dihydrochloride, Thermo Scientific®, EUA) na concentração de 0,05
gramas diluído em 30 ml de tampão citrato-fosfato (Na2HPO4.12 H2O). A reação
colorimétrica em temperatura ambiente foi interrompida após 20 minutos pela adição de 50 µl
em cada poço de solução de parada (H2SO4 2M), e levada para leitura no leitor de ELISA
(Versa Max, Molecular Devices®) a 490 nm.
34
4.6.1 ELISA anti-IgG de camundongos com lectinas recombinantes de T.canis: rTC-CTL1
e rTC-CTL-2
Para este teste, foi usada uma placa de 96 poços com poliestireno com alta capacidade
de ligação de proteínas (COSTAR®, EUA). O ELISA indireto foi realizado em três etapas:
1) Sensibilização;
2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário;
3) Diluição e aplicação do anticorpo secundário e revelação.
Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em tampão de carbonato (pH
9,6) acrescido das lectinas rTC-CTL-1 ou rTC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL,
incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. A segunda e a terceira etapa foram realizadas
de acordo com o protocolo descrito no item 4.6.1.
4.6.2 ELISA anti-IgG e anti-IgA em soros humanos com lectinas recombinantes de
T.canis: rTC-CTL1 e rTC-CTL-2
Para este teste, foi usada uma placa de 96 poços com poliestireno com alta capacidade
de ligação de proteínas (COSTAR®, EUA). O ELISA indireto foi realizado em três etapas:
1) Sensibilização;
2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário;
3) Diluição e aplicação do anticorpo secundário e revelação.
Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em tampão de carbonato (pH
9,6) acrescido da lectina TC-CTL-1 ou TC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL,
incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda
etapa, da qual foi realizado o bloqueio com solução de PBS a 2% de albumina de soro bovina
(BSA, SIGMA-ALDRICH®, EUA) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o bloqueio, foi feito
duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e aplicado o
anticorpo primário (soros humanos) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween 0,05%,
incubado durante a noite em geladeira 2ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a lavagem
das placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco vezes, e
35
então aplicado o anticorpo secundário IgG fosfatase alcalina (SIGMA-ALDRICH®, EUA) ou
IgA fosfatase alcalina (SIGMA-ALDRICH®, EUA) em uma diluição de 1:5000 em PBS
Tween 0,05%, 100 µl em cada poço, e incubado durante duas horas à 37ºC. Após o tempo de
espera, foi feita lavagem das placas com 200 µl em cada poço de PBS Tween 0,05% por cinco
vezes e feita a adição de 100 µl de um par de comprimidos diluídos em água bidestilada de
substrato pNPP e tampão (SIGMAFAST™ p-Nitrophenyl Phosphate Tablets, SIGMA®,
EUA). Foi esperado 20 minutos em temperatura ambiente e sob abrigo da luz para a reação
colorimétrica e levada para leitura no leitor de ELISA (Versa Max, Molecular Devices®,
EUA) a 405 nm.
4.6.3 ELISA anti-IgG1 e anti-IgG4 em soros humanos com lectinas recombinantes de
T.canis: rTC-CTL1 e rTC-CTL-2
Para este teste, foi usada uma placa de 96 poços com poliestireno com alta capacidade
de ligação de proteínas (COSTAR®, EUA). O ELISA indireto foi realizado em três etapas:
1) Sensibilização;
2) Bloqueio, diluição e aplicação do anticorpo primário;
3) Diluição e adição do anticorpo secundário, aplicação da streptavidina ligada a
fosfatase alcalina e revelação.
Na primeira etapa do teste, a sensibilização da placa foi feita em tampão de carbonato (pH
9,6) acrescido da lectina rTC-CTL-1 ou rTC-CTL-2, em uma concentração de 5 g/mL,
incubados durante a noite em geladeira à 4ºC. Após o tempo de espera, foi feita a segunda
etapa, da qual foi realizado o bloqueio com 200 µl por poço de solução de PBS caseína
(Casein, Bovine Milk da marca CALBIOCHEM®) a 2% por duas horas a 37ºC. Após o
bloqueio, foi feita duas lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS Tween 0,05%, e
aplicado o anticorpo primário (soros humanos) em uma diluição de 1:400 em PBS Tween
0,05%, incubado durante a noite em geladeira 2ºC. Na terceira e última etapa, foi realizada a
lavagem das placas com 200 µl em cada poço de solução de PBS Tween 0,05% por cinco
36
vezes, o anticorpo secundário IgG1 ou IgG4 biotinilados (ambos SIGMA-ALDRICH®, EUA)
em uma diluição de 1:5000 em PBS Tween 0,05%, 100 µg/mL em cada poço, e incubado
durante duas horas à 37ºC. Feito cinco lavagens de 200 µl em cada poço com solução PBS
Tween 0,05% e aplicado 100 µl de Streptavidina-AP (Streptavidin-Alkaline Phosphatase from
Streptomyces avidinii (SIGMA®, USA) na proporção de 1:2000 em tampão de bloqueio de
caseína 0,25% por uma hora e meia à 37ºC. Após o tempo de espera, foi feita lavagem das
placas com 200 µl em cada poço de PBS Tween 0,05% por cinco vezes e feita a adição de 100
µl de um par de comprimidos diluídos em água bidestilada de substrato pNPP e tampão
(SIGMAFAST™ p-Nitrophenyl Phosphate Tablets, SIGMA®, EUA). Foi esperado 40
minutos em temperatura ambiente para a reação colorimétrica e levada para leitura no leitor
de ELISA (Versa Max, Molecular Devices®) a 405 nm.
4.7 Análise Estatística
Os resultados da sorologia foram expressos em média ± desvio padrão. Utilizou-se o
teste de Kolmogorov-Smirnov, para verificar a normalidade das amostras e para comparação
entre os grupos com diferentes helmintoses. Para os valores que seguiram um padrão de
normalidade, foi utilizada análise variância ANOVA com ajuste pós-teste Tukey, e então
aplicado o Teste t de Student. Para aqueles que não seguiram padrão de normalidade, foi
utilizada como análise de variância o Kruskal-Wallis com ajuste de pós-teste Dunn`s, e então
aplicado o U-test de Mann-Whitney. Todos os testes e análises foram realizados pelo software
GraphPad Prism® 5 (GraphPad Software Inc.), considerando-se um nível de significância de
5% (p < 0,05).
Para fins de cálculo de porcentagens de especificidade e sensitividade dos peptídeos e
lectinas testados, foi utilizado a linha de corte definida pela curva ROC (Receiver Operator
Curve), que segundo Martinez et al. 2003, é uma função contínua da sensibilidade e
especificidade para diversos valores obtidos dentro do espaço amostral ligados por linha reta.
37
5. RESULTADOS
5.1 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com peptídeos
No total foram testados seis peptídeos, como referido antes na metodologia. O
Peptídeo 1 (Figura 5), refere-se a sequência EGGGGKKKG com origem de miosina de T.
canis. De acordo com o teste de Kolmogorov-Smirnov, as amostras seguem padrão de
normalidade e verifica-se uma diferença significativa entre a média dos soros negativos e a
média dos soros com infecção de T. canis (p ≤ 0.001). A sensibilidade do ensaio resultou em
100% dos soros com infecção de T. canis reconhecidos, porém, houve reatividade cruzada,
especialmente com soros de animas infectados com A. suum e com animais co-infectados com
S. mansoni e A. costaricensis, resultando em uma especificidade total do ensaio sorológico em
62,5%.
38
Peptídeo 1
Toxoca
ra
A. s
uum
Sch
isto
/Angio
Sch
isto
som
a
Strongyl
oides
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0100%
37,5%100%
Ab
sorb
ân
cia
[4
90
nm
]
0%0% 0%
Soros camundongos
Figura 5: Reatividade do peptídeo 1 (EGGGGKKKG: miosina T. canis) com soros de
camundongos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG.
Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio
em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais:
Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por
Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8);
Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S.
venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha
pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor relação de
sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é
indicado.
O peptídeo 2 (Figura 6), refere-se a sequência GGRAPPKHDNP, depositado no banco
de dados com origem do fungo Aspergillus fumigatus (Af293). Na reação de ELISA, esse
peptídeo mostrou uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 53,13% (menor em
relação ao peptídeo 1). As amostras seguem um padrão de normalidade e verifica-se uma
diferença significativa entre a média dos soros negativos com a média dos soros com infecção
de T. canis (P=0.0166). Apesar da sensibilidade satisfatória de 100% de reconhecimento dos
soros de T. canis, novamente verificou-se uma reatividade cruzada principalmente com soros
de animais infectados por A. suum e animais co-infectados com S. mansoni e A. costaricensis,
o que resulta em uma especificidade de 53,13%.
39
Peptídeo 2
Toxoca
ra
A. s
uum
Sch
isto
/Angi
o
Sch
isto
som
a
Strongyl
oides
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
Ab
sorb
ân
cia
[4
90
nm
]
0%
100%
77,3%
0% 0%
100%
Soros camundongos
Figura 6: Reatividade do peptídeo 2 (GGRAPPKHDNP: Aspergillus fumigatus (Af293))
com soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de
ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto
com o valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos
experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos
infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A.
costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides:
infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados
(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor
relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada
grupo é indicado.
O peptídeo 3 (Figura 7) corresponde a sequência GGSKGFPPAPY, tendo como
origem parte do canal de potássio de T. canis. Em geral, foi observada uma reatividade menor
a este peptídeo. Na performance do teste para o grupo infectado com T. canis, resultou uma
sensitividade mais baixa que nos testes anteriores, de 77,78%, e uma especificidade de
62,50%. O teste segue padrão de normalidade e possui diferença significante entre a média
dos soros negativos e a média dos soros infectados por T. canis (P= 0.0049). Mesmo
apresentando esta diferença significante, o não reconhecimento de todos os soros infectados
40
por T. canis, o que não foi observado nos peptídeos anteriores, diminui sua sensibilidade,
porém o padrão de especificidade mantém o mesmo que os demais. De novo, soros de animais
infectados com A. suum demonstraram uma reatividade maior (p= 0.0080) quando
comparados com a infecção por T. canis.
Toxo
cara
A. s
uum
Sch
isto
/Ang
io
Sch
isto
som
a
Stron
gylo
ides
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
Peptídeo 3
0%
100%
50%
0%
0%
75%
Ab
so
rb
ân
cia
[4
90
nm
]
Soros Camundongos
Figura 7: Reatividade do peptídeo 3 (GGSKGFPPAPY: canal de potássio T. canis) com
soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA
anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o
valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos
experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos
infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A.
costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides:
infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados
(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor
relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada
grupo é indicado.
O peptídeo 4 (Figura 8), é a sequência PAATTTAAPGVTTT e tem como origem na
lectina tipo E/S TES 32 de T. canis. Como observado nos dois primeiros peptídeos, este
mostrou uma sensibilidade de 100% e novamente seguiu um padrão de especificidade de
41
59,38%. De acordo com o teste de Kolmogorov-Smirnov, as amostras seguem padrão de
normalidade e novamente os valores da média dos soros negativos e os soros infectados por T.
canis possuem diferença significativa (P= 0.0025). Sua sensibilidade é satisfatória, porém
como observados em todos os outros peptídeos, também possui reatividade cruzada com A.
suum e os soros co-infectados.
Peptídeo 4
Toxoca
ra
A. s
uum
Sch
isto
/Angio
Sch
isto
Strongyl
oides
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
Ab
sorb
ân
cia
[4
90
nm
]
0%
100%
50%
0%100%
0%
Soros camundongos
Figura 8: Reatividade do peptídeo 4 (PAATTTAAPGVTTT: lectina tipo c E/S TES 32 T.
canis) com soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento
de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto
com o valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos
experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos
infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A.
costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides:
infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados
(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor
relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada
grupo é indicado.
O peptídeo 5 (Figura 9) e o peptídeo 6 (Figura 10) correspondem as sequências
YGPGAAAS (origem do fungo Aspergillus fumigatus (Af293)) e KSDPDPKK (origem da
42
miosina de T. canis) respectivamente. Estes peptídeos, alcançaram resultados menos
promissores, sendo o Peptídeo 5 mostrando uma sensibilidade de 100%, porém baixa
especificidade de 34,38%, com reatividade em todos os grupos, inclusive os negativos (Figura
5). O Peptídeo 6, alcançou uma sensibilidade menor, de 88,89%, e uma especificidade de
40,63%, mostrando uma reatividade maior nos negativos do que nos soros infectados por T.
canis (Figura 6).
Peptídeo 5
Toxoca
ra
A. s
uum
Sch
isto
/Angio
Sch
isto
Strongyl
oides
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
Ab
sorb
ân
cia
[4
90
nm
]
33,3%
100%
75%
66,6%33,4%
100%
Soros camundongos
Figura 9: Reatividade do peptídeo 3 (YGPGAAAS: Aspergillus fumigatus (Af293)) com
soros de camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA
anti-IgG. Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o
valor médio em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos
experimentais: Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos
infectados por Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A.
costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides:
infecção com S. venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados
(n=4). A linha pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor
relação de sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada
grupo é indicado.
43
Peptídeo 6
Toxoca
ra
A. s
uum
Sch
isto
/Angio
Sch
isto
Strongyl
oides
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
Ab
sorb
ân
cia
[4
90
nm
]75%
72%
33%0% 20%11%
Soros camundongos
Figura 10: Reatividade do peptídeo 3 (KSDPDPKK: miosina T. canis) com soros de
camundongos infectados por diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG.
Estão indicados valores de absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio
em cada grupo (barra horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais:
Toxocara: camundongos infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por
Ascaris suum (n=9); Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8);
Schistosoma: mono-infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S.
venezuelensis (n=6); e Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha
pontilhada corresponde à linha de corte do experimento com base na melhor relação de
sensitividade e especificidade (análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é
indicado.
Com excessão do peptídeo 3 e 6, todos os soros de camundongos infectados por T.
canis apresentaram valores de absorbância acima do valor da linha de corte, resultando em
uma sensibilidade de 100% para estes soros, como se pode observar nos gráficos da curva
ROC (Figura 7).
Como em todos os peptídeos houve reatividade cruzada, principalmente com os soros
de camundongos infectados por A. suum, nenhum peptídeo atingiu 100% de especificidade.
As curvas ROC utilizadas na definição dos valores da linha de corte no ensaio de
ELISA com os peptídeos podem ser visualizados a seguir na Figura 11.
44
A) Curva ROC Peptídeo 1
0 50 100
150
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
B) Curva ROC Peptídeo 2
0 50 100
150
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
C) Curva ROC Peptídeo 3
0 50 100
150
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
D) Curva ROC Peptídeo 4
0 50 100
150
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
E) Curva ROC Peptídeo 5
0 20 40 60 80 100
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
F) Curva ROC Peptídeo 6
0 20 40 60 80 100
0
50
100
150
% S
en
sib
ilid
ad
e
% Especificidade
Figura 11: Curvas ROC das ELISAs utilizando os peptídeos como antígeno com os soros
de camundongos infectados por diferentes helmintoses. As curvas ROC foram utilizadas
no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA com os peptídeos, de forma
maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T. canis. A) Curva ROC do
peptídeo 1 utilizando soros de camundongos com diferentes helmintoses e assim
45
respectivamente: B) Curva ROC do peptídeo 2 C) Curva ROC do peptídeo 3 D) Curva ROC
do peptídeo E) Curva ROC do peptídeo 5 F) Curva ROC do peptídeo 6. No eixo da ordenada
está representada a sensibilidade alcançada nos ensaios, e no eixo das abscissas está
representada a especificidade alcançada também nestes.
46
5.2 Resultados do ELISA anti-IgG peroxidase de camundongos com lectinas
recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2.
As lectinas recombinantes rTC-CTL-1 (Figura 12) e rTC-CTL-2 (Figura 13),
apresentaram no ensaio uma sensibilidade e especificidade de 100%, baseadas na curva ROC.
As amostras seguem padrão de normalidade pelo teste de Kolmogorov-Smirnov, e os valores
da média dos resultados dos soros negativos e a média dos soros infectados por T.canis
possuem diferença significativa em ambas lectinas (P= 0.0001). Além disso, nestes ensaios,
pode-se constatar também uma diferença significativa entre a média dos valores dos soros
infectados por A. suum e a média dos valores dos soros infectados por T. canis, o que é um
resultado promissor devido à eliminação da reatividade cruzada (P= 0.0001).
Toxoca
ra
A. s
uum
Sch
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ngio
Sch
isto
som
a
Strongilo
ides
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Lectina rTC-CTL-1
100%
Ab
sorb
ãn
cia
[4
90
nm
]
Soros de Camundongos
Figura 12: Reatividade da lectina rTC-CTL-1 com soros de camundongos infectados por
diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de
absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio em cada grupo (barra
horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais: Toxocara: camundongos
infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por Ascaris suum (n=9);
Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-
infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S. venezuelensis (n=6); e
Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha pontilhada corresponde à
linha de corte do experimento com base na melhor relação de sensitividade e especificidade
(análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é indicado.
47
Lectina rTC-CTL-2
Toxoca
ra
A. s
uum
Sch
ist/A
ngio
Sch
isto
som
a
Strongilo
ides
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
100%
Ab
sorb
ân
cia
[4
90
nm
]
Soros de Camundongos
Figura 13: Reatividade da lectina rTC-CTL-2 com soros de camundongos infectados por
diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. Estão indicados valores de
absorbância ótica individual (490 nm), junto com o valor médio em cada grupo (barra
horizontal). A abscissa representa seguintes grupos experimentais: Toxocara: camundongos
infectados por T. canis (n=9); A. suum: camundongos infectados por Ascaris suum (n=9);
Schisto/Angio: co-infecção de S. mansoni e A. costaricensis (n=8); Schistosoma: mono-
infecção com S. mansoni (n=5); Strongyloides: infecção com S. venezuelensis (n=6); e
Negativos: controle de camundongos não infectados (n=4). A linha pontilhada corresponde à
linha de corte do experimento com base na melhor relação de sensitividade e especificidade
(análise ROC) e o valor da sensitividade em cada grupo é indicado.
Os camundongos infectados por T. canis, tanto para o antígeno rTC-CTL-1 e rTC-
CTL-2, apresentaram valores de absorbância acima do valor da linha de corte, resultando em
uma sensibilidade de 100%. Como nenhum dos soros infectados por outras helmintoses e
controle negativo apresentou valores acima da linha, a especificidade dos ensaios também
foram de 100%.
As curvas ROC utilizadas na definição dos valores da linha de corte no ensaio de
ELISA com as lectinas rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 com soros de camundongos podem ser
visualizados a seguir na Figura 14.
48
A) ROC rTC-TCL-1 Soros Camundongos
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
100% - Especificidade
10
0%
- S
en
sib
ilid
ad
e
B) ROC rTC-TCL-2 Soros Camundongos
0 50 100
150
0
50
100
150
100% - Especificidade
10
0%
- S
en
sib
ilid
ad
e
Figura 14: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG utilizando as lectinas recombinantes como
antígeno com os soros de camundongos infectados por diferentes helmintoses. As curvas
ROC foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA com as
lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T. canis. A)
Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de camundongos com diferentes
helmintoses. B) Curva ROC da lectina rTC-CTL-2 utilizando soros de camundongos com
diferentes helmintoses. No eixo da ordenada está representada a sensibilidade alcançada no
ensaio, e no eixo das abscissas está representada a especificidade alcançada neste.
5.3 Resultados do ELISA anti-IgG, -IgA, -IgG1 e -IgG4 de humanos com lectinas
recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2.
Os resultados a seguir demonstram os testes de ELISA contra diferentes anticorpos
realizados com as lectinas recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 em soros de humanos. O
ELISA anti-IgG rTC-CTL-1 (Gráfico A, Figura 15), apresentou uma sensibilidade de 92% e
uma especificidade de 66.67% na reação. Nota-se que os soros infectados por Toxocara
possuem maior reatividade (92%) e em seguida, os soros infectados por Ancilostomídeos,
apresentaram também reatividade significativa de 40%. As amostras seguem padrão de
normalidade, e possuem diferenças significativas entre as médias dos soros infectados por
Toxocara e Ascaris (p= 0.0008), e também entre a média dos valores dos soros infectados por
Toxocara e negativos (p= 0.0164).
49
O ELISA anti-IgG rTC-CTL-2 (Gráfico B, Figura 15), apresentou sensibilidade de
76% e especificidade de 64.71%. Neste teste, observa-se uma sensibilidade menor e uma
especificidade também um pouco abaixo comparada ao rTC-CTL-1, e nota-se uma maior
reatividade com os soros infectados por Ascaris (40%). O teste de padrão de normalidade das
amostras por Kolmogorov-Smirnov deu negativo e não há uma diferença significativa entre o
valor das médias dos soros infectados por Toxocara com os soros infectados por Ascaris, mas,
a média entre os soros infectados por Toxocara e a média dos soros negativos, existe uma
diferença significativa (p= 0.0247).
Toxoca
ra
Asc
aris
Anci
lost
om.
Sch
isto
som
a
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
A) ELISA anti-IgG: rTC-CTL-1
92%
20%
40%
37.5% 20%
Soros humanos
Ab
sorb
ân
cia
[4
05
nm
]
Toxoca
ra
Asc
aris
Anci
lost
om.
Sch
isto
som
a
Neg
ativ
os
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
B) ELISA anti-IgG: rTC-CTL-2
76%
40%30%
37,5%20%
Soros humanos
Ab
sorb
ân
cia
[4
05
nm
]
Figura 15: Reatividade das lectinas recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 com soros
de humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG. O
título do gráfico corresponde a lectina utilizado como antígeno no ensaio: A) Ensaio de
ELISA anti-IgG utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-1; B) Ensaio de ELISA anti-IgG
utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-2. No eixo da ordenada, está representada a
absorbância ótica individual (405 nm). No eixo das abscissas, a coluna Toxocara corresponde
aos soros de humanos infectados por T. canis (n= 25), e assim respectivamente em cada
coluna os soros de humanos infectados por A. suum (n= 5), Ancilostomídeos (n= 20), S.
mansoni (n= 16), e controle negativo (n= 10). A linha pontilhada corresponde a linha de corte
do experimento, com base na melhor relação de Sensibilidade e Especificidade utilizando a
cuva ROC (Receiver Operator Curve).
50
As curvas ROC do ensaio de ELISA anti-IgG das lectinas recombinantes em soros de
humanos, utilizadas na definição dos valores da linha de corte, podem ser visualizadas na
figura 16.
A) ROC Anti-IgG rTC-TCL-1 Soros Humanos
0 50 100
150
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
B) ROC Anti-IgG rTC-TCL-2 Soros Humanos
0 50 100
150
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
Figura 16: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG utilizando as lectinas recombinantes como
antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. As curvas ROC
foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA anti-IgG
com as lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T.
canis. A) Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de humanos com diferentes
helmintoses. B) Curva ROC da lectina rTC-CTL-2 utilizando soros de humanos com
diferentes helmintoses. No eixo da ordenada está representada a sensibilidade alcançada no
ensaio, e no eixo das abscissas está representada a especificidade alcançada neste.
Os resultados para o teste de ELISA anti-IgA foram mais satisfatórios em relação ao
IgG. O IgA rTC-CTL-1 (Gráfico A, Figura 17), apresentou uma sensibilidade de 72% e uma
especificidade de 88.24%. Observa-se que a reatividade para soros infectados por Toxocara
alcançou 72%, e o mais importante destacar, seria a reatividade zero por soros infectados por
Ascaris, dos quais geralmente é o mais reativo após o Toxocara, o que difere dos outros
resultados apresentados. Sendo assim, este teste apresentou uma maior especificidade, com
pouca reatividade cruzada. O ensaio possui padrão de normalidade e a média dos valores dos
soros infectados por Toxocara e soros negativos, apresentam uma diferença significativa (p=
0.0125). Em relação aos soros infectados por Toxocara e Ascaris, estes são negativos para o
padrão de normalidade e possuem diferença significativa de P= 0.0037.
51
O ensaio de IgA rTC-CTL-2 (Gráfico B, Figura 17), mostrou uma sensibilidade de
92% e uma especificidade de 70.59%. Houve uma reatividade significativa com os soros
infectados por Ascaris (60%). As amostras de soros infectados por Toxocara e negativos não
seguem um padrão de normalidade, e o teste de significância mostrou que estes possuem
diferenças significativas (p= 0.0026). A média dos valores dos soros infectados por Toxocara
e Ascaris também não seguem um padrão de normalidade, e não possuem diferença
significativa (p=0.2006), mostrando assim novamente uma grande reatividade cruzada entre
as duas helmintoses.
A) ELISA anti-IgA: rTC-CTL-1
Toxoca
ra
Asc
aris
Anci
lost
om.
Sch
isto
som
a
Neg
ativ
os
0
1
2
372%
0%
10%18.75%
10%
Soros humanos
Ab
sorb
ân
cia
[4
05
nm
]
B) ELISA anti-IgA: rTC-CTL-2
Toxoca
ra
Asc
aris
Anci
lost
om.
Sch
isto
som
a
Neg
ativ
os
0
1
2
3
92%
60%
10% 37,5% 40%
Soros humanos
Ab
sorb
ân
cia
[4
05
nm
]
Figura 17: Reatividade das lectinas recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 com soros
de humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgA. O
título do gráfico corresponde a lectina utilizado como antígeno no ensaio: A) Ensaio de
ELISA anti-IgA utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-1; B) Ensaio de ELISA anti-IgA
utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-2. No eixo da ordenada, está representada a
absorbância ótica individual (405 nm). No eixo das abscissas, a coluna Toxocara corresponde
aos soros de humanos infectados por T. canis (n= 25), e assim respectivamente em cada
coluna os soros de humanos infectados por A. suum (n= 5), Ancilostomídeos (n= 20), S.
mansoni (n= 16), e controle negativo (n= 10). A linha pontilhada corresponde a linha de corte
do experimento, com base na melhor relação de Sensibilidade e Especificidade utilizando a
cuva ROC (Receiver Operator Curve).
52
As curvas ROC do ensaio de ELISA anti-IgA das lectinas recombinantes em soros de
humanos, utilizadas na definição dos valores da linha de corte, podem ser visualizadas na
figura 18.
A) ROC Anti-IgA rTC-TCL-1 Soros Humanos
0 20 40 60 80
0
20
40
60
80
100
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
B) ROC Anti-IgA rTC-TCL-2 Soros Humanos
0 20 40 60 80 100
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
Figura 18: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgA utilizando as lectinas recombinantes como
antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. As curvas ROC
foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA anti-IgG
com as lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para T.
canis. A) Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de humanos com diferentes
helmintoses. B) Curva ROC da lectina rTC-CTL-2 utilizando soros de humanos com
diferentes helmintoses. No eixo da ordenada está representada a sensibilidade alcançada no
ensaio, e no eixo das abscissas está representada a especificidade alcançada neste.
O teste de ELISA anti-IgG1 não será incluído nos resultados devido à reatividade
insignificante apresentada nos testes de acordo com o protocolo seguido.
Para o ensaio de ELISA anti-IgG4 (Gráfico A, Figura 19), no antígeno rTC-CTL-1, foi
alcançada uma sensibilidade de 96%, e uma especificidade de 78.43%. Os testes de padrão de
normalidade das amostras deram negativos, e as diferenças são significativas entre a média
dos valores dos soros infectados por Toxocara e a média dos valores dos soros infectados por
Ascaris (p= 0.0011). Apesar de uma alta reatividade dos soros infectados por
Ancilostomídeos, houve também diferença significativa entre estes com os soros infectados
por Toxocara (p= 0.0081). Assim também se observa para os outros soros em relação ao
Toxocara.
53
No antígeno rTC-CTL-2 (Gráfico B, Figura 19), obteve-se uma sensibilidade de 64% e
uma especificidade de 66.67%. Os padrões de normalidade das amostras também deram
negativos, e observa-se diferença significativa entre a média dos valores dos soros de
Toxocara com a média dos valores dos soros infectados por Ascaris (p= 0.0050).
Diferentemente do rTC-CTL-1, não houve diferença estatisticamente significativa entre a
média dos valores dos soros infectados por Toxocara com a média dos valores dos soros
infectados por Anciolostomídeos, sugerindo uma alta reatividade cruzada entre os dois.
A) ELISA anti-IgG4: rTC-CTL-1
Toxoca
ra
Asc
aris
Anci
lost
om.
Sch
isto
som
a
Neg
ativ
os
0.01
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
0.99
96%
10%
45%
6%10%
Soros Humanos
Ab
sorb
ân
cia
[4
90
5n
m]
B) ELISA anti-IgG4: rTC-CTL-2
Toxoca
ra
Asc
aris
Anci
lost
om.
Sch
isto
som
a
Neg
ativ
os
0.01
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
0.99
Soros Humanos
64%
0%
65%
25%0%
Ab
sorb
ân
cia
[4
05
nm
]
Figura 19: Reatividade das lectinas recombinantes rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 com soros
de humanos infectados com diferentes helmintos em experimento de ELISA anti-IgG4.
O título do gráfico corresponde a lectina utilizado como antígeno no ensaio: A) Ensaio de
ELISA anti-IgG4 utilizando a lectina recombinante rTC-CTL-1; B) Ensaio de ELISA anti-
IgG4 utilizando a lectina rTC-CTL-2. No eixo da ordenada, está representada a absorbância
ótica individual (405 nm). No eixo das abscissas, a coluna Toxocara corresponde aos soros de
humanos infectados por T. canis (n= 25), e assim respectivamente em cada coluna os soros de
humanos infectados por A. suum (n= 5), Ancilostomídeos (n= 20), S. mansoni (n= 16), e
controle negativo (n= 10). A linha pontilhada corresponde a linha de corte do experimento,
com base na melhor relação de Sensibilidade e Especificidade utilizando a cuva ROC
(Receiver Operator Curve).
54
As curvas ROC dos ensaios de ELISA anti-IgG4 das lectinas recombinantes em soros
de humanos, utilizadas na definição dos valores da linha de corte, podem ser visualizadas na
figura 20.
A) ROC Anti-IgG4 rTC-TCL-1 Soros Humanos
0 20 40 60 80 100
0
50
100
150
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
B) ROC Anti-IgG4 rTC-TCL-2 Soros Humanos
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
% Especificidade
% S
en
sib
ilid
ad
e
Figura 20: Curvas ROC dos ELISAs anti-IgG4 utilizando as lectinas recombinantes
como antígeno com os soros de humanos infectados por diferentes helmintoses. As curvas
ROC foram utilizadas no cálculo da linha de corte para cada um dos ensaios de ELISA anti-
IgG com as lectinas, de forma a maximizar os valores de sensibilidade e especificidade para
T. canis. A) Curva ROC da lectina rTC-CTL-1 utilizando soros de humanos com diferentes
helmintoses. B) Curva ROC da lectina rTC-CTL-2 utilizando soros de humanos com
diferentes helmintoses. No eixo da ordenada está representada a sensibilidade alcançada no
ensaio, e no eixo das abscissas está representada a especificidade alcançada neste.
55
6. DISCUSSÃO
A toxocaríase humana é uma zoonose da qual o homem é hospedeiro acidental, devido
à ingestão de ovos contendo a larva infectante do terceiro estágio (L3). Esta eclode no
intestino delgado, penetra a parede intestinal e atinge a circulação, mas não consegue
completar seu ciclo biológico, causando um quadro clínico de larva migrans. Durante a
migração as larvas podem atingir qualquer órgão ou tecido onde causam inflamações locais,
infiltração eosinofílica e formação de granulomas (Lima, 2005).
Como o T. canis não completa o ciclo biológico em humanos, o diagnóstico
parasitológico da toxocaríase humana não pode ser feito por exame de fezes, mas depende de
outras técnicas diretas ou indiretas, e, além disso, possui difícil diagnóstico clínico devido à
sintomatologia inespecífica (Pawlowski, 2001). Também, o diagnóstico histopatológico com
detecção de larvas em material de biópsias é muitas vezes frustrada e sem sucesso (Jacobs et
al., 1997).
Frente aos problemas de diagnóstico clínico e parasitológico, a maioria dos
laboratórios clínicos usam testes imunológicos indiretos, detectando anticorpos anti-Toxocara
no soro ou no fluído ocular do paciente. Os testes mais aplicados são ensaios
imunoenzimáticos (ELISA) e Western blot (WB), usando antígenos solúveis de larvas e
vermes adultos, ou antígenos secretados de larvas infectantes (Chieffi et al., 2009).
Mesmo com a descrição de antígenos que podem ser aplicados num teste
imunodiagnóstico para toxocaríase humana, a grande maioria dos estudos em áreas endêmicas
mostraram uma boa sensitividade, mas ao mesmo tempo uma alta reatividade cruzada com
antígenos de outras helmintoses intestinais, tais como Ascaris lumbricoides, Trichuris
trichiura, ancilostomídeos e/ou Strongyloides stercoralis (Smith et al., 1983;
Watthanakulpanich et al., 2008) .
Nas últimas décadas, a biologia molecular alcançou grandes avanços que resultaram
na publicação de genomas completos de vários organismos multicelulares, como a publicação
completa do genoma de A. suum (Jex et al., 2011), e a publicação de sequencias expressas de
T. canis (Zhou et al., 2011). Estes avanços nos proporcionam o uso da bioinformática como
instrumento para pesquisa de novos antígenos e epítopos que poderão ser utilizados como
diagnóstico de várias infecções.
56
Este trabalho utilizou banco de dados com sequencias expressas de T. canis para
predição de epítopos com objetivo de encontrar um diagnóstico eficaz para a toxocaríase
humana, tentando eliminar o máximo a reatividade cruzada com outras helmintoses.
Para o teste dos peptídeos sintetizados, foi utilizado modelo experimental com
camundongos infectados por diferentes helmintoses. No total, foram testados 6 epítopos em
ELISAs com anti-IgG, porém, destes, apenas 3 apresentaram resultados promissores. Para a
nossa surpresa, todos os peptídeos mostraram uma reatividade maior para soros infectados por
A. suum do que para T. canis.
A alta reatividade em soros de camundongos infectados por A. suum, observada nos
peptídeos, pode estar relacionado ao modelo experimental usado. Tanto para A. suum quando
para T. canis, os camundongos foram submetidos a três subseqüentes infecções com 500 ovos
larvados. Essa hiperinfecção no modelo experimental provavelmente não reflete uma situação
normal em áreas endêmicas, onde poucos indivíduos tem uma carga alta e o grande resto
apresenta com carga parasitária média ou baixa, como já foi demonstrado para diferentes
espécies de helmintos (Anderson & Medley, 1985).
Em nosso experimento, a hiperinfecção resultou em níves maiores de IgG em
camundongos infectados por A. suum quando comparado com camundongos infectados com
Toxocara. Isso pode ter ocorrido por causa de uma maior imunogenicidade das larvas do
terceiro estágio de A. suum ao sistema imune no modelo experimental. Outra explicação seria
que ainda existem lacunas no conhecimento do genoma de T. canis (Chen et al., 2012), e na
hora da seleção dos epítopos o programa de predição não conseguiu eliminar completamente
sequências semelhantes das duas espécies.
O genoma completo de T. canis ainda não está disponível e existem poucas
informações sobre as sequencias expressas deste parasito devido a pouca informação sobre os
processos moleculares e bioquímicos fundamentais subjacentes ao desenvolvimento e
sobrevivência do parasito e da interação parasito-hospedeiro (Zhou et al., 2011). Sendo assim,
as proteínas poderiam estar localizadas morfologicamente em locais desfavoráveis para serem
reconhecidas por anticorpos, e desta maneira, uma reduzida antigenicidade destas iria
desqualificá-los para uso em ensaios diagnósticos.
57
Apesar deste achado não esperado, os peptídeos 1, 2 e 4 apresentaram 100% de
sensitividade e uma média de 58% de especificidade. Este fator é algo positivo, pois, mesmo
levando em conta que os soros infectados por A. suum tenham maior reatividade, todos os
soros infectados por T. canis também reagiram, o que sugere um reconhecimento a favor do
diagnóstico da toxocaríase. Talvez modificações dos três epítopos selecionados possam ser
testados em futuros experimentos.
Para o diagnóstico da toxocaríase humana ainda não existem trabalhos sobre a
predição de epítopos e o uso deles em ensaios sorológicos. Porém, em outras infecções
parasitárias, houve sucesso nesta metodologia: Mendes et al. (2013) propôs a identificação de
epítopos de células B lineares do Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, para
serem utilizados no diagnóstico da doença, utilizando o ELISA. Na predição dos epítopos,
eles excluíram sequencias que também podem ser encontradas nos diferentes tipos de
Leishmania, para diminuir a chance da reatividade cruzada com estes parasitos. No total, eles
testaram quatro peptídeos, e nos ensaios realizados, chegaram a encontrar 95.8% de
sensibilidade e 88.5% de especificidade para o mais promissor.
Além deste artifício, outras metodologias de encontrar peptídeos específicos e
imunogênicos para T. canis também poderão ser exploradas, tendo como exemplo um estudo
realizado por Faria et al. (2011), do qual testou-se em uma matriz de alta escala (360
peptídeos sintetizados em uma membrana de celulose), vários epítopos preditos em células B
de Leshmania infantum, para identificar e selecionar aqueles que apresentarem maior
reatividade e serem utilizados para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina.
A fim de identificar e testar o desempenho de novos antígenos, neste trabalho também
foram feitos testes de ELISA com lectinas recombinantes a partir do antígeno TES 32: o rTC-
CTL-1 e rTC-CTL-2. Os dois antígenos se diferem apenas devido a uma pequena variante de
aminoácidos em sua composição e são uma das principais proteínas da superfície de larvas de
T. canis, e sua localização do anticorpo monoclonal mostrou que é expressa na cutícula do
parasita (Yamasaki et al., 1998; Page et al., 1992).
Primeiramente foi testado em modelo experimental de camundongos infectados por
diferentes helmintoses. Nos resultados encontrados nestes ensaios, obtivemos 100% de
sensibilidade e 100% de especificidade para as duas lectinas recombiantes. A princípio, isto
58
significou que estas poderiam ser muito promissoras, apesar de que infecções de modelo
experimental, principalmente as utilizadas neste trabalho, induzem uma resposta bem
específica e imunogênica por parte dos camundongos.
A alta especificidade encontrada nestes ensaios são promissores e sugere que as
lectinas recombinantes realmente tenham melhor desempenho que o antígeno TES. Em um
estudo recente realizado por Lescano et al. (2012), em que se investigou o nível de anticorpos
IgG em camundongos BALB/C co-infectados por T. canis e outras helmintoses e
protozoários, utilizando o antígeno TES, encontrou-se baixa reatividade cruzada, com exceção
dos camundongos infectados por A. suum. Portanto, é de considerável destaque o desempenho
destas lectinas nos ensaios com camundongos.
Outro estudo realizado por Yamasaki et al. (2000), comparou o ELISA utilizando
antígeno TES e o ELISA utilizando a proteína TC-CTL-1 em soros humanos infectados por
diferentes helmintoses, e conseguiu diminuir a reatividade cruzada de 43% para 2% na
lectina. Esta, portanto, demonstra o alto potencial da lectina para um diagnóstico bem
específico da toxocaríase.
Neste estudo, além dos testes das lectinas recombinantes em soros de camundongos,
realizamos também testes em soros humanos com diferentes helmintoses, a fim de verificar o
seu desempenho em uma situação mais real, ou seja, em infecções naturais e de acordo com a
maioria dos cenários encontrados onde a doença prevalece, das quais, o homem possui grande
contato com outras parasitoses.
No Brasil, infecções por diferentes helmintos como S. mansoni, A. lumbricoides,
Trichuris trichiura, e outros vermes intestinais, ainda são comuns, especialmente em áreas
rurais de baixa renda. Esta prevalência ocorre devido a fatores como condições ambientais
favoráveis, boa disponibilidade de hospedeiros intermediários e a pobreza generalizada
acarretando em baixo nível educacional, gerando baixos níveis de higiene e saneamento
(Geiger, 2008). Visto esse cenário, utilizamos soros de pacientes infectados de áreas
endêmicas para diversas parasitoses, inclusive soros de indivíduos que foram negativos nos
exames de fezes.
Primeiramente, os antígenos rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2 foram testados por ELISA anti-
IgG total. Nos resultados, obtivemos uma sensibilidade satisfatória de 92% para rTC-CTL-1 e
59
76% para rTC-CTL-2, e uma especificidade de 66% e 64% respectivamente para T. canis.
Mais uma vez ocorreu reatividade cruzada. O rTC-CTL-1 mostrou melhor desempenho e
menor reatividade por Ascaris, porém, apresentou uma maior reatividade por soros humanos
infectados por ancilostomídeos.
A reatividade cruzada entre T. canis e outras helmintoses encontradas neste teste com
as lectinas pode ter uma explicação: Sabe-se que as lectinas do tipo C são receptores de
superfície de células com um papel central na ativação do sistema imunológico dos
vertebrados (Loukas & Maizels, 2000). Os genes que codificam C-TLs são amplamente
representados entre vários invertebrados, incluindo artrópodes e moluscos, no qual são
produzidos em resposta a lesão ou infecção (Takahashi et al., 1985). A clonagem e a
caracterização do TES-32 de T. canis revelaram as primeiras lectinas tipo C provido de um
parasito, e que essas proteínas possuem semelhança estrutural com as C-TLs do hospedeiro
vertebrado, talvez atuando na modulação da resposta imune ou ajudando na evasão do
parasito (Loukas & Maizels, 2000).
Apesar do TES-32 ser prevalentemente específico de T. canis, lectinas do tipo C
também foram identificadas em outros nematódeos, como Necator americanos (Doub et al.,
2000), Ancylostoma ceylanicum (L. Harrison, GenBank AF172652), A. suum (J. Daub e M.
Blaxter, Gen Bank AW165750), Haemonchus contortus (D. Jasmer, GenBank AI723481),
entre outros. Portanto, a reatividade cruzada em nosso estudo poderia ser explicada pela
presença e semelhança de lectinas em diferentes espécies de nematódeos.
Foi encontrada também uma elevada reatividade em soros de indivíduos infectados
por S. mansoni (37.5%). Apesar de serem de outra classe de helmintos (Trematoda), durante o
ciclo biológico desta parasitose ocorre migração de formas larvais entre tecidos atingindo
também os pulmões, acarretando uma grande resposta imunológica por parte do hospedeiro
(Jenkins et al., 2005). Em relação às lectinas do tipo C, trematódeos não possuem estas,
porém, como no caso do S. mansoni, elas podem reconhecer glicoproteínas que são
absorvidas no tegumento das larvas e adultos, e entre estas, anticorpos IgG (Loukas &
Maizels, 2000). Isso pode ter resultado no reconhecimento dos CTLs em soros de indivíduos
infectados com S. mansoni, especialmente por parte das lectinas recombinates rTC-CTL-1 e
rTC-CTL-2.
60
Ambas lectinas, apresentaram reatividade de 20% em soros de indivíduos negativos.
Este resultado pode estar ligado ao fato de que estes soros foram coletados de pessoas que
moram em áreas insalubres e com alta prevalência de outras parasitoses. Além disso, um
carboidrato trissacarídeo não metilado encontrado no antígeno TES, é idêntico ao encontrado
no sangue humano ABO, dos quais possuem o antígeno H (Loukas e Maizels, 2000). Essa
característica estrutural pode gerar o reconhecimento das lectinas recombinantes por parte dos
anticorpos do hospedeiro, o que pode explicar a reatividade encontrada nos indivíduos
negativos.
Além do teste anti-IgG, foram realizados também ensaios de ELISA anti-IgA,
utilizando os mesmos soros de humanos infectados por diferentes helmintoses, a fim de
avaliar e entender o desempenho das lectinas para estes anticorpos.
Ao contrário do que foi visto no ELISA anti-IgG, os resultados destes ensaios foram
mais específicos. O rTC-CTL-1 e o rTC-CTL-2 demonstrou sensitividade de 72% e 92%
respectivamente, e uma especificidade de 88.42% e 70.59% respectivamente. Apesar de
apresentar uma menor reatividade para soros de T. canis, a lectina rTC-CTL-1 não
demonstrou reatividade com soros de pacientes infectados por Ascaris, o que é um resultado
interessante devido à alta reatividade cruzada encontrada geralmente entre estas duas
helmintoses. Além disso, também atingiu menor reatividade para os outros soros, o que gerou
uma maior especificidade geral do teste. Já o contrário foi observado para rTC-CTL-2, que
apesar de maior reatividade para soros de T. canis, houve grande reconhecimento também por
soros infectados pelas outras infecções, e inclusive pelos soros negativos (40%).
Um estudo sorológico para diagnóstico da toxocaríase, utilizando o antígeno TES, em
pacientes de área rural no estado de São Paulo, encontrou cerca de 59% de reatividade para o
anticorpo IgA anti-Toxocara. Porém, o autor destaca que apenas cinco dos pacientes foram
positivos também para IgG e IgE específicos de Toxocara, ou seja, nem todos os pacientes
positivos para IgG anti-Toxocara no estudo obteve reatividade para o anticorpo IgA (Prestes-
Carneiro et al., 2008).
Elefant et al. (2006), sugerem que a presença dos anticorpos específicos IgA na
toxocaríase, usando como antígeno o TES, podem ser usados para o diagnóstico e
monitoramento da eficácia do tratamento da infecção. Em outro estudo, os mesmos
61
pesquisadores investigaram por imunoblot anticorpos IgA em pacientes com diferentes
manifestações de toxocaríase, antes, durante e após o tratamento. Eles constataram que o
reconhecimento em imunoblot por anticorpos anti-IgA caiu de 65.4% antes, para apenas
11.8% após tratamento (Elefant et al., 2011).
Portanto, os resultados encontrados referente ao anticorpo IgA nesse estudo, podem
condizer com a fase e o estado em que a infecção se encontra no paciente, sendo os soros de
maior reatividade estarem em uma fase mais aguda da doença, ou seja, uma fase de migração
de larvas.
Neste estudo foi feito ELISA anti-IgG1, também utilizando os soros humanos com
diferentes infecções a fim de verificar o desempenho das lecitinas recombinantes.
Infelizmente, os resultados deste ensaio tiveram uma reatividade insignificante em ambos os
grupos de indivíduos e, portanto, não foram demonstrados.
A importância do IgG1 no diagnóstico da toxocaríase é notável, mas somente foi
observada quando foi usado uma mistura de diferentes proteínas secretadas do parasito. Em
um estudo realizado com pacientes acometidos por diferentes tipos de toxocaríase, Obwaller
et al. (1998) utilizou o antígeno TES em ensaios de ELISA contra subclasses de IgG, e
reportou que a subclasse predominante nos pacientes com toxocaríase é IgG1. Além disso, ele
constatou que esta era significantemente maior em pacientes com a forma visceral da doença.
Em outro estudo com soros de humanos infectados por diferentes helmintos,
Watthanakulpanich et. al. (2008) mostraram que a subclasse IgG1 contra o antígeno TES
obteve maior sensitividade (60%) em relação ao IgG total (50%), e uma maior especificidade
(76% contra 73% de IgG), sugerindo assim, melhor desempenho para o diagnóstico da
toxocaríase.
Utilizando os mesmos soros de humanos infectados por diferentes helmintoses,
realizamos também ensaios de ELISA anti-IgG4. Mais uma vez, a lectina rTC-CTL-1
demonstrou o melhor desempenho, pois além de possuir grande reatividade para os soros
infectados por T. canis (96%), apresentou baixa reatividade para os outros soros. Apesar
disso, é importante destacar que a reatividade pelos soros de pacientes com ancilostomídeos
foram significativas em relação aos demais soros testados, atingindo 45% para rTC-CTL-1.
62
Noordin e colegas (2005) demonstraram em ELISAs anti-IgG4 com antígeno TES a
alta especificidade, porém, o ensaio foi menos sensível comparado ao anti-IgG total. Portanto,
os autores sugeriram uma combinação dos dois ensaios para aumentar tanto a sensibilidade
quando a especificidade dos testes diagnósticos para toxocaríase, principalmente quando os
resultados sorológicos foram correlacionados com sintomas clínicos e laboratoriais (Noordin
et al., 2005).
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A toxocaríase é um helminto de grande importância na saúde pública e possui
prevalências elevadas em todo o mundo. Seu diagnóstico específico em seres humanos baseia-
se, na maioria dos casos, em testes indiretos e é muito difícil. Especialmente o fato da elevada
reatividade cruzada com antígenos de outros helmintos tornam testes sorológicos um desafio
para o diagnóstico.
Com a intenção de descobrir e testar novos antígenos recombinantes e peptídeos
selecionados por bioinformática, nós fizemos ensaios iniciais com rTC-CTL-1 e rTC-CTL-2,
além de seis epítopos diferentes. Os ensaios com as lectinas recombinantes demonstraram um
excelente desempenho em camundongos para a detecção da infecção por T. canis. Porém, em
humanos o desempenho dos ensaios caiu consideravelmente devido as persistentes
reatividades cruzadas com outras infecções helmínticas.
Os ensaios de ELISA com os seis epítopos selecionados por bioinformática revelaram
em apenas dois epítopos um desempenho promissor para o diagnóstico da toxocaríase, porém,
com alta reatividade cruzada com a infecção por Ascaris em modelos experimentais.
Após este estudo, conclui-se que este foi um importante pontapé inicial e futuros testes
com antígenos e/ou epítopos modificados devem ser realizados devido ao persistente
problema da reatividade cruzada, principalmente em infecções com espécies de Ascaris.
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