Post on 07-Apr-2016
Termociclador
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Técnica que permite a amplificação da quantidade de DNA específico
utilizando a enzima Taq DNA polimerase, sequências iniciadoras específicas (primers) e variações de
temperatura controladas.
ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes
DNA
dATPdCTPdGTPdTTP
(nucleotideos)
ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes
DNA
Taq polimerasePrimers TampãoÁgua
ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes
DNAdATPdCTPdGTPdTTP
(nucleotideos)
Taq DNA polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.
Taq DNA polimerase
Termoestabilidade limitada
Temperatura T 1/2 (minuto)
92,5oC 130 95,0oC 40 97,5oC 5
Trata-se de uma enzima cuja atividade é mantida durante 45 minutos a 95°C.
• Sua quantificação é dada em Unidades (U), sendo que cada U é definida como a quantidade de enzima capaz de incorporar 10 nM de dNTP em cerca de 30 min a 72°C.
• Na maioria dos protocolos são utilizadas 2,0 a 2,5 U (0,5 l) de enzima em volume final de 100 l.
• É importante deixar claro que o excesso de enzima também pode prejudicar a eficiência da reação, podendo inclusive inibi-la.
Taq DNA polimerase
• Os primers (forward e reverse) devem ser construídos de acordo com a conveniência do investigador, de modo que esses possuam seqüências complementares a determinadas regiões do DNA que limitam os segmentos a serem amplificados.
Seqüências dos primers
Problemas comuns no Desenho de Primers
• Auto-complementariedade
• Complementariedade entre primers
Auto Complementariedade
• Formação de alça
GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT
HOTGACTTC Tm = 71oC ACTGAA
Complementariedade entre Primers
• Formação de “primer dimer”
5’ GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH3’5 ‘ CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH3’
3’OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTCGAACTACCATAGACACACTGAAGGOH3’
• São as bases nitrogenadas que constituirão as novas cadeias de DNA.
• Sua concentração numa reação pode variar de 20 a 200 uM sendo importante que as quatro
devam variar em concentrações equivalentes.
• Quando estão em excesso (um nucleotídeo ou todos) podem ocorrer erros de incorporação de bases, gerando cópias alteradas
Desoxinucleotídios trifosfatados (dNTP)
• O íon magnésio (Mg++) é um co-fator enzimático que desempenha um papel de extrema importância na atividade da enzima Taq DNA polimerase.
• Sua concentração em torno de 1,5 mM é aplicável a maioria das necessidades.
- Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou nenhum produto
- Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou “smear”.
Íon magnésio
Smear
PCR “Requerimentos”
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM
• Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polimerase: 1-2.5 units
• DNA Alvo: 1 µg
Taq polimerasePrimers TampãoÁgua
ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes
DNAdATPdCTPdGTPdTTP
(nucleotideos)
Taq polimerasePrimers TampãoÁgua
94ºC
DENATURAÇÃO
ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas(Termociclador)
DNAdATPdCTPdGTPdTTP
(nucleotideos)
Taq polimerasePrimers TampãoÁgua
94ºC
DENATURAÇÃO
57ºC
ANELAMENTO
ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas(Termociclador)
DNAdATPdCTPdGTPdTTP
(nucleotideos)
Taq polimerasePrimers TampãoÁgua
94ºC
DENATURAÇÃO
72ºC
EXTENSÃO
57ºC
ANELAMENTO
ETAPAS DO PCR1. Adição de reagentes
2. Alternância de temperaturas(Termociclador)
25-40 (35) CICLOS
DNAdATPdCTPdGTPdTTP
(nucleotideos)
http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamentos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-pcr/
94ºC
DENATURAÇÃO
57ºC
ANELAMENTO
Primer forward Primer reverse
72ºC
EXTENSÃO
Taq DNA polimerase
Essa temperatura está relacionada, por exemplo, com a quantidade das bases C e G, de modo que quanto maior for o número dessas bases, a temperatura de hibridização tende a aumentar.
• Normalmente primers de 18 a 25 nucleotídios contendo 50 a 60% de G + C são adequados. • Para se calcular a TM (temperatura média de hibridização) de primers com até 20 nucleotídios aplica-se a seguinte formula:
4 x (C + G) +2 x (A + T) = TM
Temperatura média (Tm) de Anelamento
Ponte de Hidrogêniofosfatopentose
Citosina
Guanina
Timidina
Adenina
Ponte de Hidrogêniofosfatopentose
Citosina
Guanina
Timidina
Adenina
• Esse fator depende do comprimento do segmento a ser amplificado e da concentração do DNA molde utilizado na reação.
• A temperatura ótima de extensão dos primers é de 72°C (temperatura ótima de atividade da
polimerase) e o tempo de extensão de 1 minuto é considerado suficiente para estender produtos de aproximadamente 1.250 pb (em condições ideais).
Tempo de extensão dos primers
• As condições de desnaturação utilizadas normalmente são de 95°C por 5 minutos (desnaturação inicial) e por 30 segundos (desnaturação na ciclagem), sendo que temperaturas mais altas podem ser utilizadas quando se trabalha com seqüências moldes
ricas em G+C.
• Temperaturas muito altas e tempos longos de desnaturação levam a perda de atividade da
enzima
Tempo e temperatura de denaturação
Amplificação de DNA(exponencial)
Log [DNA]Log [DNA]
X ciclosX ciclos
GeométricaGeométrica
PlateauPlateauLinearLinear
Gel EtBrGel EtBr
y = 2y = 2XX
Amplificação de DNA(Platô)
CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512
10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000
Número de cópias de 1 molécula de DNA após 34 ciclos: 1.580.000.000
Análisedos dados
Reação:DNA
Enzima TaqPrimer
NucleotídeosTampão
Água
Análisedos dados
Termociclador
Reação:DNA
Enzima TaqPrimer
NucleotídeosTampão
Água
Análisedos dados
Termociclador
Reação:DNA
Enzima TaqPrimer
NucleotídeosTampão
Água
Reaçãode PCR
+Tampão Corado
(Loading Buffer)
Análisedos dados
Eletroforeseem gel de agarose
+Brometo de Etídeo
Termociclador
Reação:DNA
Enzima TaqPrimer
NucleotídeosTampão
Água
Reaçãode PCR
+Tampão Corado
(Loading Buffer)
Análisedos dados
Luz Ultravioleta
Fotodocumentação
Termociclador
Reação:DNA
Enzima TaqPrimer
NucleotídeosTampão
Água
Eletroforeseem gel de agarose
+Brometo de EtídeoReação
de PCR+
Tampão Corado
(Loading Buffer)
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 2%REVELAÇÃO DO BROMETO DE ETÍDEO
COM LUZ ULTRAVIOLETA
Marcadorde paresde base
(pb)
300
200
100
400500600600
1400140013001300
FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb
Marcadorde paresde base
(pb)
300
200
100
400500600600
1400140013001300
400 400 400
600 600
100 100 100 100
FOTODOCUMENTAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 2%UTILIZANDO MARCADOR LADER 100 pb
TAMANHO ESTIMADO DOS FRAGMENTOS DE DNA AMPLIFICADOS
- Reverse Transcriptase -PCR (RT-PCR): amplifica RNAm,
construindo cópias complementares de DNA (cDNA).
- Real Time-PCR: PCR quantitativo utilizado para determinação
de carga viral.
- Nested-PCR: amplifica seqüências de DNA de baixa
frequência (exemplo: diagnóstico de parasitoses).
Variações da técnica de PCR
• A alta sensibilidade do método de PCR, bem como a sua especificidade, nos permite amplificar uma seqüência-alvo mesmo a partir de amostras com baixo grau de pureza e de quantidades mínimas de DNA, o que torna o método viável não só para a pesquisa básica mas também para a pesquisa aplicada.
Aplicações do PCR
Os produtos amplificados por PCR podem ter as seguintes utilidades/ aplicações:
1. Detecção de deleções / inserções determinadas pela geração de produtos amplificados que apresentam
alterações em seu tamanho.
2. Detecção de mutacões pontuais (substituição de bases), conhecidas ou não, que geram polimorfismos genéticos podem ser determinadas pela ação das enzimas de restrição ou através do seqüenciamento.
Aplicações do PCR
3. No diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional
(particularmente para doenças herdadas).
4. Na tipagem para transplantes de órgãos e
susceptibilidade para doenças auto-imunes específicas
(detecção de polimorfismo para HLA).
5. No diagnóstico e prognóstico de doenças de ordem
genética, como o câncer, através do estudo dos genes
relacionados a essas doenças.
6. Na medicina forense (DNA fingerprint).
7. No diagnóstico de doenças infecciosas por agentes
patogênicos diversos
Aplicações do PCR