Post on 20-May-2018
1
INTRODUÇÃO
Utilização das plantas como veículos para obtenção de proteínas heterólogas
As plantas transgênicas constituem uma das mais importantes aplicações da
tecnologia do DNA recombinante, partindo do princípio que a planta passa a possuir
novas características, as quais visam atender diversas finalidades. Dentre elas
podemos destacar: melhoramento das características agronômicas, das qualidades
nutricionais das plantas modificadas e, ainda, o uso dessas plantas como reatores
biológicos para a produção de biomoléculas de valor terapêutico e profilático, como
exemplo, biofármacos e vacinas (Firek et al., 1993; Borisjuk et al., 1999; Larrick et al.,
2001; da Silva et al., 2002; Tacket, 2004; Rigano and Walmsley, 2005; Almquist et al.,
2006).
No segundo caso, a administração oral da planta reduz possíveis custos de
purificação da proteína recombinante, uma vez que os veículos de apresentação das
proteínas de interesse são os próprios tecidos das plantas (folhas, raízes, caule)
(Tacket, 2004; Rigano and Walmsley, 2005; Kumar et al., 2006).
Há, essencialmente, duas diferentes estratégias para a produção de proteínas
heterólogas em plantas. Uma delas consiste na integração da seqüência codificadora
da proteína de interesse no genoma da planta, o que é mais comumente obtido através
de transformação via Agrobacterium tumefaciens. Outra estratégia baseia-se na
utilização de vírus que infectam naturalmente espécies vegetais. A região codificadora
da proteína de interesse é primeiramente inserida no genoma do vírus, e após infecção
mecânica na planta, o vírus modificado se replica e a seqüência codificadora da
proteína heteróloga é transcrita e traduzida pelo maquinário celular da planta
(Nicolaisen et al.,1992). Nesta estratégia a expressão é transitória e ocorre geralmente
em folhas, podendo ocorrer também de maneira sistêmica (Scholthof et al., 1996). Em
contrapartida, na transformação a integração no genoma da planta é permanente, fato
que permite o direcionamento da expressão para os diversos órgãos, tecidos e
compartimentos celulares. O direcionamento ocorre através da utilização de promotores
tecido-específicos e de sinais de direcionamento intracelulares (da Silva et al., 2002;
Lung et al., 2005).
2
A expressão e produção de proteínas recombinantes, em particular
imunoprofiláticos e imunoterápicos, em plantas transgênicas, são de singular relevância
para o avanço tecnológico e sócio-econômico dos países em vias de desenvolvimento,
onde medidas de prevenção e tratamento de doenças infecciosas são amplamente
requeridas, uma vez que o interesse da iniciativa privada é limitado (Arntzen et al.,
2005). Assim, as plantas geneticamente transformadas representarão uma nova e
importante função para o bem estar da sociedade, dado o seu potencial como
biorreatores na produção de substâncias de interesse.
A utilização de sistemas de expressão em bactérias e leveduras, embora
amplamente difundida, oferece em alguns casos uma alternativa pouco interessante ou
até mesmo inviável para a produção, em grande escala, de proteínas de interesse.
Como, por exemplo, na produção de anticorpos onde a glicosilação interfere na
imunogenicidade (Stoger et al., 2002), como também no fato desses sistemas
possuírem uma limitação intrínseca como sistemas seguros de apresentação para o
consumo animal ou humano. Essa limitação se deve ao risco de toxicidade e/ou
contaminação por bio-produtos, o que pode ser superado pela produção de vacinas a
partir de plantas transgênicas (Walmsley and Arntzen, 2000; Lauterslager and Hilgers,
2002; Arntzen et al., 2005; Rigano and Walmsley; 2005).
A relação custo/benefício dessa tecnologia ainda é discutível, pois é bem
relatado que o custo para obtenção de proteínas heterólogas em sistemas bacterianos
é alto quando comparado ao sistema utilizando em plantas (Fuchs et al., 2002; Tacket,
2004; Rigano and Walmsley; 2005). Um outro atrativo para a utilização de plantas como
reatores é o fato de muitas plantas que podem ser transformadas geneticamente
fazerem parte da dieta humana. Destarte, as plantas transformadas podem ser
utilizadas diretamente, dispensando o processamento do produto de interesse pós-
expressão. Além disso, as plantas oferecem a vantagem de promover alterações pós-
transcricionais, em muitos casos indispensáveis à conformação tridimensional e
funcionalidade das proteínas, enquanto os demais sistemas são limitados nesse sentido
(Mason et al., 1992; Mason and Arntzen, 1995; Mason et al., 1996; Arntzen, 1997;
Gómez et al., 1998; Stoger et al., 2002; Arntzen et al., 2005; Rigano and Walmsley;
2005).
3
No caso particular da produção de vacinas, a tecnologia das plantas
transgênicas oferece ainda outras vantagens como: a manutenção simples para a
produção em grande escala de proteínas recombinantes; possibilidade de desenvolver
vacinas polivalentes ou de múltiplos antígenos; produção em larga escala de forma
rápida (como no caso da cenoura, batata e tomate); possibilidade de administração
oral; segurança notória dos vegetais comestíveis; dispensa a necessidade de seringas
e de profissionais de saúde treinados para administração de vacinas; a parede da
célula vegetal protege potencialmente o antígeno da acidez do estômago; e
dependendo da formulação da vacina pode ser de fácil distribuição, sem a necessidade
dos sistemas de refrigeração necessários para as vacinas atuais (Larrick et al., 2001;
Tacket, 2004; Arntzen et al., 2005).
A determinação e identificação dos processos envolvidos na sensibilização do
sistema imune por administração oral (Kagnoff, 1996; Revillard et al., 1992) vêm
estimulando o desenvolvimento de biorreatores vegetais para a produção de vacinas
recombinantes em plantas comestíveis (Tacket, 2004; Arntzen et al., 2005; Rigano and
Walmsley; 2005). Antígenos imunoprotetores de diversos agentes infecciosos (vírus e
bactérias) têm sido expressos com a utilização da tecnologia do DNA recombinante
(Tacket et al., 1998; da Silva et al., 2002; Tacket et al., 2004). A imunização oral com
batata transgênica contendo a proteína exógena enterotoxina lábil (LT-B) de
Escherichia coli enterotoxigênica estimulou respostas imunológicas, tanto sistêmica
quanto mucosal, em animais de laboratório (Mason et al., 1998). Num outro trabalho, a
administração de meio de cultura contendo BfpA recombinante fitosecretada a
camundongos Balb/C resultou na presença de anticorpos fecais anti-BfpA (da Silva et
al., 2002). Tais resultados sugerem a grande possibilidade de se utilizar plantas como
possíveis veículos de imunização.
Nos últimos anos houve uma busca por diferentes plantas e sistemas de
expressão que produzam diversos antígenos de interesse. Como exemplos podemos
citar a expressão do antígeno de superfície do vírus da Hepatite B (HBsAg) em batata
(Smith et al., 2003; Kumar et al., 2006).
O uso de plantas, como produtores de vacinas, busca, ainda, solucionar doenças
como a peste, que é uma doença que rapidamente se desenvolve e chega a quase
100% de mortalidade dos indivíduos infectados. Alvarez e colaboradores (2006)
4
expressaram a proteína de fusão antigênica F1-V de Y.pestis em tomate e sua
imunogenicidade foi confirmada em camundongo. O Quadro 1 apresenta diferentes
exemplos de plantas, nas quais foram produzidos antígenos de interesse:
5
Doença Antígeno Planta transgênica Observações Referênc
ia
Hepatite B Antígeno de superfície da Hepate B (HBsAg)
Batata Resposta imune primária foi observada em camundongos
Richter et al. (2000)
HBsAg Tomate Imunização oral de camundongos disparada com vacina comercial induziu resposta imune significativa
Gao et al. (2003)
Hepatite E (HEV) HEV-E2 Tomate O gene HEV-E2 expressou-se corretamente e o antígeno apresentou imunogenicidade normal
Ma et al. (2003)
Cólera Subunidade B da Toxina do Cólera (CTB) fundida a um sinal de retenção no RE
Batata Propriedades imunológicas e bioquímicas foram idênticas à da proteína CTB nativa
Arakawa et al. (1997)
Subunidade CTB contendo o sinal de retenção no RE
Tomate CTB derivada de plantas ligou-se especificamente ao receptor G (M1)-gangliosideo
Jani et al. (2002)
Doença entérica viral
Subunidade CTB fusionada com a proteína NSP4 do rotavírus Batata
Foram observadas a sintese e a montagem de oligomeros biologicamente ativos
Kim and Langridge (2003)
Rotavirus Murino Proteína VP6 estrutural do capsídeo do rotavírus
Batata Imunização oral de camundongos induziu a produção de anticorpos humoral e intestinal detectáveis
Yu and Langridge (2003)
Diabetes autoimune
Fusão CTB::Insulina Batata Atraso no avanço do Diabetes em camundongos diabéticos alimentados com batata transgênica.
Arakawa et al. (1998b)
GAD65 humano Cenoura GAD65 foi imunoreativa e manteve atividade enzimática
Porceddu et al. (1999)
Sarampo Epitopo do formador da alça em células B (H386-400) da proteína hemaglutinina do vírus do sarampo
Cenoura Imunização peritoneal de camundongos com extratos de plantas de cenoura induziu alta titulação de anticorpos.
Bouche et al. (2003)
Partículas do papillomavirus-símile humano (HPV)
Proteína majoritária do capsídeo HPV tipo 11 (HPV11) L1
Batata Imunização oral induziu resposta imune anti-VLP em camundongos
Warzecha et al. (2003)
Vírus Respiratório Sincicial (RSV)
Proteína RSV-F Tomate Imunização oral de camundongos induziu a produção de anticorpos séricos e mucosais específicos anti RSV-F
Sandhu et al. (2000)
Vírus da Raiva Glicoproteína (proteína G) da superfície externa da linhagem ERA do vírus da raiva.
Tomate Proteína G acumulou-se no complexo de Golgi, vesículas, plasmalema, e parede celular de células do parênquima vascular
McGarvey et al. (1995)
Epítopos do vírus da raiva fundidos com o vírus do mosaico do fumo Espinafre
Camundongos imunizados mostraram resposta imune e proteção contra doses letais do vírus da raiva.
Modelska et al. (1998)
Glico e nucleoproteína do vírus fundida com proteína do capsídeo do AlMV
Espinafre Imunização oral de voluntários humanos induziu anticorpos neutralizadores.
Yusibov et al. (2002)
Anthrax Fator protéico letal (LF), ligado ao CTB Batata CTB-LF foram montados em pentâmeros
biologicamente ativos. Kim et al. (2004a)
Doença hemorrágica de coelhos
VP60 do vírus da doença hemorrágica
Batata Coelhos imunizados produziram anticorpos e foram protegidos contra a doença.
Castanon et al. (1999)
Bronquite infecciosa de galinhas
Proteina spike (S) integral do IBV Batata Galinhas imunizadas produziram níveis detectáveis de anticorpos séricos e foram protegidas contra o IBV virulento
Zhou et al. (2004)
Quadro 1. Produção de antígenos em plantas transgênicas, de acordo com Dalal e
colaboradores (2006).
6
Sistemas vegetais de expressão de proteínas heteról ogas
Um dos primeiros aspectos a ser considerado é o desenvolvimento de sistemas
vegetais de expressão, o que envolve inicialmente a escolha do sistema de
transformação genética. A produção de plantas transgênicas é considerada, hoje em
dia, uma prática de rotina em laboratórios de Biotecnologia Vegetal, sendo que a
transferência gênica mediada por Agrobacterium tumefaciens se destaca como a mais
freqüentemente utilizada (Mason et al., 1998; Borisjuk et al., 1999; Larrick et al., 2001;
da Silva, 2002; Alvarez et al., 2006; Kumar et al., 2006). Sendo que existem outros
métodos como a biobalística que utiliza microprojéteis de ouro ou tungstênio acelerados
a altas velocidades para carrear e introduzir ácidos nucléicos e outras moléculas em
células e tecidos. As micropartículas aceleradas penetram na parede e membrana
celular, localizando-se aleatoriamente nas organelas celulares. Em seguida, o DNA é
dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular, ocorrendo o processo de
integração do gene exógeno no genoma do organismo a ser modificado (Ma and Chen,
2005).
O método de transformação vegetal via Agrobacterium tumefaciens está
baseado no aproveitamento do maquinário desenvolvido ao longo da evolução. Esse
sistema natural de transformação garante a transferência dos genes de interesse para
os sistemas vegetais alvo por meio de infecção da planta pelo Agrobacterium
tumefaciens transformada. O uso de Agrobacterium tumefaciens pode ser aplicado a
uma grande variedade de espécies de dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas,
sendo geralmente o método mais adotado para sistemas específicos de expressão em
plantas (Birch, 1997).
Um outro sistema que tem sido utilizado mais recentemente consiste de
expressão de epítopos de proteínas animais ou humanas na superfície de vírus de
planta (Tobacco Mosaic Virus (TMV), Cowpea Mosaic Virus (CPMV) e Johnsongrass
Mosaic Virus (JMV) (Porta et al., 1996 e 2002; Dalsgaard et al., 1997).
O CPMV é um membro típico do grupo Comovirus (Lomonossoff and Hamilton,
1999), o qual infecta algumas espécies de leguminosas, e se prolifera, particularmente,
no hospedeiro natural feijão-de-corda (Vigna unguiculata). O grupo Comovírus é
facilmente transmitido pelo processo de inoculação mecânica e eficientemente
7
disseminado na natureza através de coleópteros. CPMV é um vírus icosaédrico, com
um genoma RNA simples fita bipartido no sentido positivo (Araújo and Watt, 1998; Porta
et al., 1996 e 2002; Mittmann, 2004; Gesualdi-Mesquita, 2006).
O cDNA do RNA-2 do CPMV foi desenvolvido como um vetor de replicação
autônoma, e a sua utilização resulta na formação de partículas virais quiméricas (CVPs)
geneticamente estáveis. As CVPs são obtidas pela inserção de oligonucleotídeos que
codificam para um curto epítopo linear da proteína de interesse em um dos cDNAs
infecciosos clonados do CPMV (Porta et al., 1996 e 2002; Mittmann, 2004; Moura,
2004; Liu et al., 2005; Gesualdi-Mesquita, 2006).
As plantas infectadas apresentam sintomas característicos tais como lesões
cloróticas nas folhas, formando um mosaico (Liu and Lomonossoff, 2002), sintomas
estes que indicam a expressão do gene de interesse. Atualmente, o método baseado
no CPMV está sendo considerado como um método adequado para a obtenção de
altos níveis de produção de proteínas heterólogas em plantas (Gopinath et. al., 2000).
Ao se pensar na utilização de plantas como veículos para obtenção de proteínas
de interesse é necessário também definir o tipo de sistema de expressão vegetal que
se deseja obter. Plantas transgênicas inteiras ou a cultura de tecidos e/ou células,
obtidas a partir das mesmas, podem ser utilizadas para a produção em grande escala
do bioproduto de interesse. A cultura de células (que consiste em aglomerados
celulares em meio liquido), tecidos e órgãos pode ser estabelecida a partir de
fragmentos de tecidos maduros (folhas, caules, raízes) (Mason et al., 1998; Borisjuk et
al., 1999; Larrick et al., 2001; Carvalho, 2003), bem como de tecidos meristemáticos,
formados por células com alta taxa de divisão e que estão localizados, geralmente, nos
ápices dos caules e raízes em crescimento. É sabido que tecidos e órgãos jovens são
mais suscetíveis à propagação clonal do que os maduros, o que significa que à medida
que a especialização celular progride durante o desenvolvimento do órgão e/ou da
planta, a desdiferenciação torna-se mais difícil. Assim, os ápices meristemáticos são
preferencialmente utilizados como principais fontes de explantes. Os explantes são
transferidos assepticamente para os meios de cultura, compostos de uma mistura
balanceada de macro e micronutrientes, aminoácidos, vitaminas, além de uma fonte de
carbono, e de uma auxina e uma citocinina em proporções adequadas às finalidades
8
desejadas, sob condições de temperatura, umidade, fotoperíodo e irradiância
controladas, em sala de crescimento (Cid, 1998; Hong et al., 2002; Doran, 2006).
Fitosecreção de proteínas heterólogas
Com o intuito de desenvolver um vetor de expressão e secreção de proteínas
heterólogas em plantas transgênicas, o Grupo de pesquisa Quorum-sensing,
Interferência Microbiana e Infecção, do Laboratório de Biotecnologia (LBT) da UENF,
engenhou um sistema baseado no sistema de expressão pIBT o qual resultou em 1%
de proteína recombinante na fração protéica total (Mason and Arntzen, 1995; Mason et
al., 1996). Para direcionar a secreção protéica, foi escolhida a seqüência peptídica sinal
de endereçamento da proteína calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia, baseando-se
nos trabalhos de Borisjuk e colaboradores (1999). A calreticulina é uma proteína
residente do retículo endoplasmático e possui dois peptídeos sinais. Um peptídeo de
endereçamento e um de retenção no retículo. A seqüência sinal de endereçamento da
calreticulina mostrou-se eficiente no encaminhamento de proteínas repórteres para o
meio extracelular (Borisjuk et al., 1999). Utilizando-se essa estratégia, a secreção
ocorre através da rota retículo endoplasmático – complexo de Golgi – vesículas – meio
extracelular (Boyko et al., 2000; Wales et al., 1992), podendo ser detectada em tecidos
de fumo transgênicos (Nicotiana tabacum), bem como no meio de cultura de
manutenção dos tecidos (da Silva et al; 2002). Nesse trabalho, para garantir altos níveis
de expressão, tomou-se o cuidado de combinar um promotor constitutivo (CaMV 35),
uma seqüência enhancer (TEV), a seqüência codificadora para o peptídeo sinal
(calreticulina), além da região terminadora (VSP).
da Silva e colaboradores (2002) demonstraram que a seqüência sinal da
calreticulina foi capaz de direcionar a secreção da proteína bacteriana BfpA para o meio
externo, e que a combinação de promotor e enhancer resultou em altos níveis de
expressão da proteína recombinante. O gene bfpA presente no Plasmídio do Fator de
Aderência Entérica (EAF) codifica a proteína BfpA (subunidade A do feixe de pili) que é
a proteína principal formadora da fímbria do tipo IV das bactérias enteropatogênicas
(Sohel et al., 1996). Estudos de seqüenciamento, mapeamento e mutagênese do
9
plasmídio EAF mostraram que existem 13 genes responsáveis pela biogênese da
fímbria, sendo que o gene bfpA codifica a subunidade principal, bfpB codifica uma
lipoproteína requerida para a exportação da proteína e bfpP codifica a peptidase da
seqüência sinal da prepilina (Sohel et al., 1996).
Através de imunodetecção em membrana, utilizando anticorpo policlonal anti-
BfpA, foi possível detectar a proteína recombinante, tanto nos tecidos transgênicos
quanto no meio de cultura de manutenção. Resultados de quantificação do produto
secretado demonstraram que o sistema foi capaz de dirigir a produção de cerca de 7%
da proteína total, como proteína recombinante, confirmando sua eficiência na
expressão e secreção em plantas transgênicas de fumo. A imunogenicidade oral da
proteína BfpA fitosecretada foi demonstrada em camundongos BALB/c pela indução
persistente de anticorpos fecais anti-BfpA (da Silva, et al., 2002).
Porém, devido a uma fatalidade, na qual o pesquisador Jeferson Vieira da Silva,
responsável pela construção do sistema pJVS, adoeceu e faleceu repentinamente,
ocorreu perda de parte dos dados protocolares, o que nos deixou sem as devidas
condições de prosseguir acertadamente nos passos de purificação e quantificação da
proteína de interesse.
Com isso, o presente trabalho buscou através de diversas tentativas resgatar o
sistema de expressão e fitosecreção pJVS, que demonstrou em trabalho anterior ser
um sistema viável na produção de proteínas heterólogas de interesse. Essa
recuperação é de suma importância para o nosso grupo de pesquisa que vem
trabalhando com a expressão e purificação das proteínas bacterianas BfpA, EspA e
EspB em sistema viral (CPMV) bem como em sistema bacteriano, sendo previsto para
trabalhos futuros a obtenção de possíveis formulações vacinais.
10
OBJETIVO
Recuperação do sistema de expressão e fitosecreção pJVS visando sua
utilização na produção de proteínas heterólogas.
11
MATERIAL E MÉTODOS
Material
Linhagem das Bactérias Utilizadas
Escherichia coli, linhagem DH5α, utilizada para a preparação de células
competentes para os ensaios de transformação feitos nos passo de clonagem.
Agrobacterium tumefaciens C58C1 RifR (Holsters et al., 1980), utilizada na
transformação de células em suspensão de cenoura.
Plasmídios Utilizados
Plasmídios de expressão vegetal pIBT110 e pIBT210 (Mason and Arntzen,
1995).
Plasmídios de expressão e fitosecreção pJVS0bfpA e pJVS+1bfpA,
desenvolvidos pelo Grupo de pesquisa Quorum-sensing, Interferência Microbiana e
Infecção, do Laboratório de Biotecnologia (LBT) da UENF (da Silva, et al., 2002),
conforme Figura 1.
Material Vegetal
Plantas de fumo (Nicotiana tabacum, var petit Havana, cv SR1), foram mantidas
em meio MS (Anexo I.2) (Murashige and Skoog, 1962), e em potes individuais, a 26oC,
sob fotoperíodo de 16h no claro e 8h no escuro. A cada 20 dias, as plantas foram
subclonadas e transferidas para potes individuais contendo meio de cultura fresco.
Sementes de cenoura (Daucus carota), cultivar comercial "CENOURA DE
VERÃO" (distribuído pela Horticeris sementes - Campinas/SP) e o cultivar
"ALVORADA" (distribuído pela EMBRAPA - Brasília/DF), foram germinadas em meio
MS (Anexo I.2) e acondicionadas em frascos mantidos nas mesmas condições das
plantas de fumo. Posteriormente, os calos de cenoura obtidos foram transformados via
Agrobacterium tumefaciens.
12
Figura 1. Esquema do vetor de expressão pJVS. sv, seqüência do vetor; T7 promotor
do vírus T7; bla, gene de resistência à ampicilina; ter, região terminadora do gene bla;
CaMV 35S, promotor constitutivo do vírus do mosaico da couve-flor; TEV, seqüência
enhancer; calSP, seqüência codificadora do peptídeo sinal de calreticulina; SMC, sítio
múltiplo de clonagem do vetor pSK∆; VSP, região terminadora da proteína de reserva
vegetativa; nas caixas estão indicados os sítios das enzimas de restrição.
ter bla
calSP+0 G 6xHis/bfpA pJVS +0bfpA
6xHis/bfpA calSP+1 G pJVS +1bfpA
CaMV 35S calSP+ N TEV MCS VSP vs T7 vs
pJVS +0,+1,+2
XbaI, BamHI, SmaI, PstI, ClaI, SalI, XhoI,DraI, ApaI, StuI, HindIII, BspMI, SphI, [PstI
(nt12)], [HincII (nt14)]
[XhoI (nt692)] [EcoRI (nt697)] EcoRV
vs
13
Métodos
Estabelecimento da cultura de células em suspensão de cenoura
Calos de cenoura (n=8) foram transferidos para frascos de 250 mL devidamente
esterilizados, contendo 30 mL de meio de indução de calo líquido (Anexo I.3),
suplementado com hormônio 2,4D (2,4-ácido diclorofenoxiacético). Os frascos foram
mantidos sob agitação constante de 30 rpm, na ausência de luz. Após um período de
30 dias, retirou-se uma alíquota de 8 mL para semear novas culturas.
Após 15 dias, a cultura foi novamente semeada em meio de cultura fresco (Anexo I.3) e
mantida a 26oC, sob agitação constante e posteriormente utilizada como material
vegetal para transformação por Agrobacterium tumefaciens.
Transformação de células em suspensão de cenoura ( Daucus carota ) com
Agrobacterium tumefaciens transconjugante
Cultura de células em suspensão de cenoura foi transformada com Agrobacterium
tumefaciens transconjugante, contendo o clone pJVS+1bfpA, que possui a região
codificadora da proteína de interesse na linha correta de leitura. Primeiramente foram
feitas alíquotas de 7mL de cultura em suspensão (Anexo I.3), em erlenmeyers de
250mL, e acrescentou-se 500µL da Agrobacterium tumefaciens transconjugante. Após
o período de 48 h de co-cultivo no escuro adicionou-se 250mg/L de antibiótico
cefotaxime (Kefoxin - BioChimico), para o controle da Agrobacterium tumefaciens.
As culturas foram plaqueadas em meio de cultura sólido (Anexo I.3) contendo o agente
seletivo canamicina e cefotaxime, como inibidor do crescimento bacteriano, a fim de
selecionar os possíveis calos transgênicos. Os calos foram mantidos nesse meio por
um período de 15 dias.
14
Ensaio de imunodetecção para verificar a presença d a proteína BfpA em tecidos
de plantas transgênicas de fumo
Plântulas de fumo transgênicas, com o sistema de expressão e fitosecreção
pJVS, previamente obtidas (Carvalho, 2003) foram macerados em nitrogênio líquido
para extração protéica e posterior ensaio de imunodetecção em membrana, a fim de
verificar se houve a expressão de BfpA. Após a separação das amostras protéicas de
interesse por eletroforese em gel desnaturante de acrilamida 12% (Anexo II.4)
(Laemmli, 1970), as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose
embebida em tampão fosfato 50 mM pH 7.4 (Anexo II.2) (Dr. Enrique Medina-Acosta
não publicado). Após este passo, o conjunto de transferência foi montado observando-
se o sentido de migração dos eletrodos. A transferência foi realizada por 2 horas a 10
volts. Após a transferência as membranas foram retiradas e lavadas por 5 minutos em
tampão TST 1X (Anexo II.3) sob agitação. Após a lavagem as membranas foram
incubadas, sob agitação constante, por um período de 12h, com a solução de bloqueio,
isto é, tampão TST1X suplementado com 5% de leite em pó desnatado (Nestlé),
posteriormente a solução de bloqueio foi decantada e então foi acrescentada a solução
do primeiro anticorpo, consistindo de 50 ml de tampão TST1X contendo 0,5% de leite
desnatado e 10 µl (diluição 1:5000) de anticorpo monoclonal anti-His
(Amersham/Pharmacia/USA). As membranas foram incubadas com o primeiro anticorpo
sob agitação moderada por 10 horas, após esse período foram lavadas 3 vezes, 5 min
cada, sob agitação em tampão TST1X. As membranas foram então incubadas por 2
horas na presença de proteína A (Sigma) ligada à peroxidase dissolvida em tampão
TST20 1X (Anexo II.3) + 0,5% de leite desnatado. Para as membranas contendo
material fitosecretado de fumo, o conjugado proteína A peroxidase (diluição 1:5000) em
tampão TST1X contendo 0,5% de leite desnatado foi utilizado. Após o período de 2h a
membrana foi lavada 3 vezes, 5 min cada, sob agitação em tampão TST1X. Utilizou-se
o sistema de revelação com DAB (Diaminobenzidina) de acordo com as modificações
descritas por da Silva e colaboradores (2002).
15
Preparo de células competentes de Escherichia coli
Células de Escherichia coli DH5α competentes foram preparadas de acordo com os
métodos descritos por Sambrook e colaboradores (2001), utilizando-se cloreto de
cálcio.
Amplificação da região codificadora da BfpA no veto r pJVS0bfpA e pJVS+1bfpA
As reações foram montadas contendo 50 ng de DNA das construções pJ17, pJ18 e
pJ19; 5 µL de tampão específico 10X; 0,4 µL de dNTP mix (25 mM); 3 µL de MgCl2
(25mM); 1 µL do iniciador 1 (TTACTTCATAAAATATGTAACTTT) (50 pmol/µL); 1,0µL do
iniciador 2 (CTGTCTTTGATTGAATCTGCA) (50 pmol/µL) específicos para a região
codificadora da proteína BfpA (Carvalho, 2003); 0,2 µL(1U) da enzima Taq polimerase.
Os volumes finais das reações foram ajustados para 50 µL com água deionizada, e
utilizado o termociclador Techo (Hybaid USA). A programação consistiu de 1 ciclo inicial
de desnaturação das fitas, com temperatura de 94oC e duração de 5 minutos; 35 ciclos
de amplificação com: passo 1, temperatura de 94oC e duração de 1 minuto, passo 2,
temperatura de 50oC e duração de 1 minuto e passo 3, temperatura de 72oC e duração
de 1minuto; e 1 ciclo final com: passo 1, temperatura de 72oC e duração de 15 minutos
e passo 2, temperatura de 8oC e duração 2 h, para manter a reação. Os produtos da
amplificação foram separados em eletroforese em gel de agarose 0,8%, contendo
brometo de etídeo.
Obtenção dos clones pJVS0bfpA e pJVS+1bfpA via transformação de células
competentes de E.coli
Os clones pJVS+0bfpA, que contém a região codificadora para o gene bfpA na linha
incorreta de leitura, e pJVS+1bfpA que contém a região codificadora para o gene bfpA
na linha correta de leitura, foram individualmente adicionados à 100 µL de células
competentes e incubados em gelo por 30 minutos. Em seguida submetidos a choque
térmico a 42oC por 90 segundos. Após o choque térmico, foram acrescentados 1mL de
16
meio LB líquido (Anexo I.1), as culturas transferidas para tubos de 15 mL estéreis e a
reação foi incubada a 37oC, sob agitação constante, por 2h e plaqueadas em meio LB
sólido (Anexo I.1) suplementado com 100 µg/mL do agente seletivo canamicina. Foram
feitas culturas das colônias obtidas na transformação e subseqüentes mini-preparações
para obtenção de DNA plasmidial.
Validação dos clones pJVS0bfpA e pJVS+1bfpA via seqüenciamento
Para confirmar a seqüência do clone pJVS+1bfpA, que é a construção em que o gene
bfpA está na linha correta de leitura, DNA dos clones obtidos no passo anterior,
denominados pJVS+0bfpA e pJVS+1bfpA, foram concentrados à 2ng/µL. O
seqüenciamento parcial foi feito por encomenda à empresa Genemed Synthesis Inc.,
(CA, USA), e ao longo desse seqüenciamento é possível se verificar a fusão da
seqüência codificadora para o peptídeo sinal (calreticulina), além da região codificadora
para o gene bfpA. O iniciador utilizado no seqüenciamento parcial foi o complementar à
região enhancer TEV (5’TCTCAAgCAATCAAgCATTCTAC3’), que compõe o sistema de
expressão pJVS (da Silva, et al., 2002).
Extração de DNA plasmidial
O fato de o vetor binário ser um plasmídio grande, e ainda, o fato do vetor pré-binário
contendo o cassete de expressão+1bfpA ter passos posteriores de digestões parciais
requer grandes quantidades de DNA de ambos os vetores. Além disso, em ambos os
casos houve a necessidade de garantir a não contaminação da preparação com DNA
genômico. Assim, lançou-se mão de um método eficiente de extração de DNA
plasmidial, o que precisou ser bem estabelecido. Utilizou-se o protocolo do Kit Max-
Prep da Qiagen, com modificações, seguindo como passos: 250mL da cultura obtida
após 16h de crescimento foi centrifugada a 2.800xg por 15 minutos, após centrifugação
o sobrenadante foi descartado, o cultivo decantado foi suspenso em 5mL de solução
contendo 50 mM Tris-HCl pH8,0; 10mM de EDTA pH8,0; 100µg/mL de RNAse A.
Posteriormente a amostra foi agitada no vortex. Então, adicionou-se 5mL de solução
17
contendo 0,2M NaOH; SDS 1%, e misturou-se por inversão, incubando-se a amostra
por 5 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se posteriormente 5mL de acetato de
potássio 3M pH 5,5 e misturou-se por inversão. Adicionou-se clorofórmio na proporção
de 1:1 e centrifugou-se a amostra a 4oC por 30 minutos a 20.300xg. Em seguida retirou-
se suavemente a fase superior. Adicionou-se isopropanol gelado na proporção de 1:1 e
centrifugou-se a 4oC por 20 minutos a 20.300xg. O sobrenadante foi então descartado e
o sedimento, lavado com etanol 70%, por 5 minutos a 20.300xg. Após serem secas na
estufa a 37oC, foram suspensas em 250µL de H2O deionizada.
O grande diferencial nesse método de extração foi no passo seguinte ao acréscimo de
acetato de sódio. As amostras sobre extração devem repousar à temperatura ambiente
por 5 minutos, isso facilitou a ação do acetato de sódio na eliminação do DNA
genômico. Outro passo importante, é que após esse período de 5 minutos há o
acréscimo do clorofórmio que resulta na partição da mistura em duas fases: superior
hidrofílica e inferior hidrofóbica, e como resultado as proteínas e lipídeos são
efetivamente extraídos.
Clonagem do cassete de expressão pBJVS+1bfpA no vetor binário pIBT110
O clone pJVS+1bfpA confirmado via seqüenciamento foi digerido parcialmente com as
enzimas EcoRI e HindIII. Na digestão parcial primeiramente utilizou-se uma quantidade
de enzima menor do que usualmente utilizado (0.3 u para cada µg de DNA), nesse caso
foi digerido 250ng de DNA, por período de tempo de 15 e 30 minutos em banho-maria,
a 37ºC. Após diversas tentativas notou-se a necessidade de utilizar uma quantidade
maior de DNA para execução da digestão parcial, visto que na digestão parcial a
enzima não age uniformemente no substrato o que requer grandes quantidades de
DNA alvo, a fim de que após as digestões as quantidades de DNA sejam suficientes
para as reações de ligação.
Assim, montou-se primeiramente uma reação de digestão parcial contendo: 1 µg
de DNA, 0.3 unidades de EcoRI, 5 µL de tampão específico, em 6 tubos
separadamente. O volume final das reações foi ajustado para 50 µL com água
deionizada e a digestão foi incubada a 37oC por 15’ e 30’. Os fragmentos de DNA foram
18
separados em gel de agarose 0,8% contendo brometo de etídeo e purificados utilizando
DEAE- celulose DE-81, de acordo com técnica descrita por Dretzen (1981) e Danner
(1982). Após a visualização do DNA em luz ultravioleta, duas incisões foram feitas no
gel com lâmina de bisturi, uma anterior e outra posterior à banda de DNA de interesse e
nestas foram inseridos os pedaços de papel DE-81 no tamanho mínimo referente à
largura da banda e altura do gel. A eletroforese foi, então, reiniciada até o DNA ser
totalmente transferido ao papel. Os fragmentos de papel foram retirados e lavados
cuidadosamente no tampão de corrida. O papel foi então depositado em tubo de 1,5 mL
e acrescido 400 µL de tampão de eluição(Anexo II.1). Os tubos foram mantidos por 30
minutos a 68oC e, então, centrifugados por 20 minutos a 4oC. O sobrenadante foi
transferido para outro tubo e a ele foram acrescidos 4 µL de MgCl2 (1M) e 1 mL de
etanol absoluto gelado para precipitação do DNA. Os tubos foram mantidos em freezer
a -70oC por 30 minutos, seguido de centrifugação por 20 minutos a 4oC. O
sobrenadante foi então descartado e o sedimento, lavado com etanol 70%, seco e
suspenso em 44 µL de água deionizada, de acordo com técnica descrita por Dretzen
(1981) e Danner (1982). Com esse fragmento de, aproximadamente, 4700pb obtido no
passo anterior foi montada a digestão parcial com a enzima HindIII: 0.3 unidades de
enzima foram acrescentadas a 5 µL de tampão específico. A digestão foi incubada a
37oC por 15’ e 30’. Após a clivagem, os fragmentos de DNA foram separados em um
gel de agarose 0,8% e purificados conforme descrito anteriormente.
Preparo do vetor binário pIBT110
O vetor binário pIBT110 (Mason et al., 1996) foi digerido com as enzimas EcoRI e
HindIII. Foram feitas reações contendo 500 ng de DNA, 5 unidades de EcoRI, 5 µL de
tampão específico. A digestão teve seu volume final ajustado para 50 µL com água
deionizada e foram incubadas a 37oC por 4 h. Após o tempo de incubação foi retirada
um alíquota de 5µL do tubo de digestão, e aplicado em gel de agarose 0,8%.
Confirmada a digestão pela visualização de um banda de aproximadamente 13Kb,
acrescentou-se ao tubo 10 µL de Acetato de Sódio (3M), 45 µL de água deionizada, e
500 µL de etanol absoluto gelado, e prosseguiu-se a precipitação do DNA, conforme
19
procedimento descrito acima. O DNA foi suspenso em 44 µL de água deionizada, por
conseguinte, foram acrescentados 5 unidades de HindIII e 5 µL de tampão específico. A
digestão teve seu volume final ajustado para 50 µL e foi incubada a 37oC por 4 h. Após
a clivagem, os fragmentos de DNA foram separados em gel de agarose 0,8% e
purificados conforme descrito acima, utilizando-se DEAE-celulose DE-81 conforme
técnica descrita por Dretzen (1981) e Danner (1982).
20
Ligação do cassete de expressão +1bfpA com o
21
veöööööööööööö öööö ööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
22
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
23
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
24
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
25
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööö öööööööööööö öööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööö
öööööööööööööö öööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
1 2 3 4 7 6 5
1 2 3 4
BfpA
A
26
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
27
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
28
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö öööö
öööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
29
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
30
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
31
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
32
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö öööö öööööö
ööööööö öööööööööööö ööö ööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööö
33
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
34
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
35
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
36
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
37
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
38
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
39
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
40
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
41
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
42
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
43
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
44
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
45
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
46
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööö öööö ööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
47
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
48
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
10000 pb
3500 pb
500 pb 600 pb
1 2 3 4 7 6 5 8
49
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
50
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööö öööööööööö öööööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
51
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
52
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
53
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
54
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
55
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
56
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
57
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
58
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
59
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
60
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööö ööööööööööö öööööööööööööööööö öööö ööö ööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
61
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
62
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 2 1
6500 pb
23000 pb
4.700 pb
1 2 3
4.300 pb
2.300 pb
63
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
64
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö ööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö2.500 pb
5 6 7 8 9 1 2 3 4
4300 pb
2300 pb
65
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
66
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
67
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
68
ööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
2300 pb
23000 pb
13.000 pb
800 pb
1 2 3
69
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
70
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
71
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
72
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
ööööööööööööööööööööööööööö öööööööööööö öööööööööööööööööööööö ööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
73
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
74
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööö�����
����������������������������������������������������
������������������������������������������������
����������������������������������������������������
���������������������������������������������
�������������������������������������öööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 2 1 17 18 16 15
2300 pb 23000 pb
75
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
76
ööööööööööööööööööö öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
77
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
78
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
79
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
80
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
81
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
82
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
83
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
84
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
85
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
86
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
87
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
88
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
89
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
90
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
91
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
92
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
93
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
94
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öö��������������������������������������������������
����������������������������������������������������
����������������������������������������������������
����������������������������������������������������
��������������������������������������������������ööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
95
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
96
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
97
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
98
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
99
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
100
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
101
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
102
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
103
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
104
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
105
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
106
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
107
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
108
ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
109
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
110
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
111
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
112
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
113
öööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
114
ööööööööööööööööööö ööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööööö
pode se concluir:
• O sistema de expressão e fitosecreção pJVS (pJVS+0, pJVS+1 e pJVS+2),
composto pelo cassete de expressão contendo somente a seqüência
codificadora do peptídeo sinal da calreticulina acrescida de 0, +1 e +2
nucleotídeos, foi recuperado.
• O clone pJVS+1bfpA (região codificadora da proteína BfpA fundida ao cassete
de expressão pJVS+1) foi recuperado, o que permitirá a validação do sistema
de fitosecreção utilizando-se a proteína BfpA em sistema de produção contínua.
• O clone pBJVS+1bfpA ainda não foi recuperado. Acredita-se que a limitação
esteja na necessidade de digestão parcial. Propõe-se, assim, a eliminação dos
sítios de restrição ambíguos (HindIII e EcoRI) no vetor de clonagem pEU84,
através de digestão com as enzimas e subseqüente preenchimento ou
degradação das extremidades. Essa estratégia permitirá que o sistema tenha
uma versatilidade ainda maior, pois continuará adicionado o hexâmero de
histidina e, ainda, não haverá mais a necessidade de digestão parcial.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
115
Almquist, K. C., McLean, M. D., Niu, Y., Byrne,G., Olea-Popelka, F. C., Murrant, C.,
Barclay, J. and Hall J. C. (2006) Expression of an anti-botulinum toxin A neutralizing
single-chain Fv recombinant antibody in transgenic tobacco. Vaccine. 24: 2079-2086.
Alvarez, M. L., Pinyerd, H. L., Crisantes, J. D., Rigano, M. M., Pinkhasov, J., Walmsley,
A M., Mason, H. S. and Cardineau G. A. (2006) Plant-made subunit vaccine against
pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice. Vaccine. 24: 2477-2490.
Arakawa, T., Chong, D.K.X., Merritt, J.L, Langridge,W.H.R. (1997) Expression of cholera
toxin-B subunit oligomers in transgenic potato plants. Transgenic Res. 6: 403–413.
Arakawa, T., Yu, J., Chong, D.K., Hough, J., Engen, P.C., Langridge, W.H.R. (1998) A
Plant-based cholera toxin B subunit-insulin fusion protein protects against the
development of autoimmune diabetes. Nat. Biotech. 16: 934–938.
Araújo, J. P. P. and Watt, E. E. (1988) Vírus que infectam a caupi no Brasil. O caupi no
Brasil. Brasília - D. F. Departamento de Publicações Embrapa – CNPAF: 507-545.
Arntzen, C.J. (1997) Edible vaccines. Public Health Rep. 112: 190-197.
Arntzen, C.J., Plotkin, S. and Dodet, B. (2005) Plant-derived vaccines and antibodies:
potencial and limitations. Vaccine. 23: 1753-1756.
Birch, R. G. (1997) Plant transformation: problems and strategies for practical aplication.
Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 297-326.
Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Logendra, S., Petersen, F., Gleba, Y., and Raskin, I.
(1999) Production of recombinant proteins in plant root exudates. Nature Biotech. 17:
466-469.
116
Bouche, F.B., Marquet-Blouin, E., Yanagi, Y., Steinmetz, A., Muller, C.P. (2003)
Neutralising immunogenicity of a polyepitope antigen expressed in a transgenic food
plant: a novel antigen to protect against measles. Vaccine 21: 2074–2081.
Boyko, V., van der Laak, J., Ferralli, J., Suslova, E., Kwon, M.O. and Heinlein, M. (2000)
Cellular targets of functional and dysfunctional mutants of tobacco mosaic virus
movement protein fused to green fluorescent protein. J Virol. 74: 11339-46.
Carvalho, A. R. B. (2003) Obtenção de cultura de células em suspensão de cenoura e
fumo transgênicos: uma plataforma experimental para obtenção de inóculos
biorreatores de proteínas recombinantes por fitosecreção. Monografia defendida no
Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes - RJ. 67p.
Castanon, S., Marý´n, M.S., Martý´n-Alonso, J.M., Boga, J.A., Casais, R., Humara, J.M.,
Orda´s, R.J., Parra, F. (1999) Immunization with potato plants expressing VP60 protein
protects against rabbit hemorrhagic disease virus. J. Virol. 73: 4452–4455.
Cid, L.P.B. (1998) Suspensão celular em Cultura de tecidos e transformação genética
de plantas. Vol I - Embrapa-SPI, Editores: Antônio Carlos Torres, Linda Styer Caldas e
José Amauri Buso.
Dalal, M., Dani, R. G. and Kumar, P. A. (2006) Current trends in the genetic engineering
of vegetable crops. Scientia Horticulturae. 107: 215-225.
Dalsgaard, K., Uttenthal, A., Jones, T. D., Xu, F., Merryweather, A., Hamilton, W. D. O.,
Langeveld, J. P. M., Boshuizen, R. S., Kamstrup, S., Lomonossoff, G. P., Porta, C.,
Vela, C., Casal, J. I., Meloen, R. H. and Rodgers, P. B. (1997) Plant-derived vaccine
protects target animals against a viral disease. Nat Biotechnol. 15: 248-252.
117
Danner, D.B. (1982) Recovery of DNA Fragments from gels by transfer to DEAE-paper
in eletrophoresis chamber. Anal Biochem. 125: 139-142.
da Silva (2001) Produção de um sistema de expressão e secreção de proteínas
recombinantes em plantas transgênicas. Tese de mestrado em Biociências e
Biotecnologia - Centro de Biociências e Biotecnologia - Laboratório de Biotecnologia,
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes -
RJ. 103p.
da Silva, J.V., Garcia, A.B., Flores, V.M.Q., Macedo, Z.S.M. and Medina-Acosta, E.
(2002) Phytosecretion of enteropathogenic Escherichia coli pilin subunit A in transgenic
tobacco and its suitability for early life vaccinology. Vaccine. 20: 2091-2101.
Doran, P. M. (2006) Loss of secreted antibody from transgenic plant tissue cultures due
to surface adsorption. Journal Biotechnol. 122: 39-54.
Dretzen, D.B., M.; Sassone-Corsi, P. and Chambon, P. A. (1981) Reliable method for
recovery of DNA fragments from agarose and acrilamide gels. Anal Biochem. 112: 295-
298.
Firek, S., Draper, J., Owen, M.R.L., Gandecha, A., Cockburn, B. and Whitelam, G.C.
(1993) Secretion of a functional single-chain Fv protein in transgenic tobacco plants and
cell supension cultures. Plant Molec. Biol. 23: 861-870.
Flores, V. M. Q., Fernandes, R. C. C. S., Macedo, Z. S. and , Medina-Acosta, E. (2002)
Expression and Purification of the Recombinant Enteropathogenic Escherichia coli
Vaccine Candidates BfpA and EspB. Prot. Expr. and Purif. 25: 16-22.
Fuchs, C., Köster, D., Wiebusch, S., Mahr, K., Eisbrenner, G. and Märkl, H. (2002)
Scale-up of dialysis fermentation for high cell density cultivation of Escherichia.coli.
Journal of Biotech. 93: 243-251.
118
Gao, Y., Ma, Y., Li, M., Cheng, T., Li, S.W., Zhang, J., Xia, N.S. (2003) Oral
immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg. World J.
Gastroenterol. 9: 996–1002.
Gesualdi-Mesquita, G. G. P. (2006) O vírus do mosaico do feijão-de-corda como vetor
para a expressão transiente de fatores de virulência em plantas via agroinfiltração. Tese
de mestrado em Biociências e Biotecnologia - Centro de Biociências e Biotecnologia -
Laboratório de Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, Campos dos Goytacazes - RJ. 105p.
Gómez, N., Carrilo, C., Salinas, J., Parra, F., Borca, M.V. and Escribano, J.M. (1998)
Expression of immunogenic glycoprotein S polypetidesfrom transmissible gastroenteritis
coronavirus in transgenic plants. Virology. 249: 352-358.
Gopinath, K., Wellink, J., Porta, C., Taylor, K. M., Lomonossoff, G. P. and Kammen, A.
(2000) Engineering Cowpea Mosaic Virus RNA-2 into a vector to express heterologous
proteins in plants. Virology. 267: 159-173.
Holsters, M., Silva, B., Van Vliet, F., Genetello, C., De Block, M., Dhaese, P., Depicker,
A., Inze, D., Engler, G., Villarroel, R. and (1980) The functional organization of the
nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid. 3: 212-30.
Hong, S., Kwon, T., Lee, J., Jang, Y. and Yang, M. (2002) Production of biologically
active hG-CSF by transgenic plant cell suspension culture. Enz. And Microb. Techn. 30:
763-767.
Jani, D., Meena, L.S., Rizwan-ul-Haq, Q.M., Singh, Y., Sharma, A.K., Tyagi, A.K. (2002)
Expression of cholera toxin B subunit in transgenic tomato plants. Transgenic Res. 11:
447–454.
Kagnoff, M.F. (1996) Oral tolerance: mechanisms and possible role in inflammatory joint
diseases. Baillieres Clin Rheumatol. 10: 41-54.
119
Kim, T.G., Langridge, W.H. (2003) Assembly of cholera toxin B subunit fulllength
rotavirus NSP4 fusion protein oligomers in transgenic potato. Plant Cell Rep. 21: 884–
890.
Kim, T.G., Galloway, D.R., Langridg, W.H. (2004) Synthesis and assembly of anthrax
lethal factor-cholera toxin B-subunit fusion protein in transgenic potato. Mol. Biotech. 28:
175–183.
Kumar, G. B. S., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J. and Bapat V. A. (2006)
Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170: 918-
925.
Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature. 227: 680-5.
Larrick, J.W., Yu, L., Naftzger, C., Jaiswal, S. and Wycoff, K. (2001) Production of
secretory IgA antibodies in plants. Biomol. Engineering. 18: 87-94.
Lauterslager, T.G.M. and Hilgers, L.A.Th. (2002) Efficacy of oral administration and oral
intake of edible vaccines. Immun. Letters. 84: 185-190.
Liu, L. and Lomonossoff, G.P. (2002) Agroinfection as a rapid method for propagating
Cowpea mosaic virus-based constructs. Journal of Virological Methods. 105: 343-348.
Liu, L., Cañizares, M. C., Monger, W., Perrin, Y., Tsakiris, E., Porta, C., Shariat, N.,
Nicholson, L. and Lomonossoff, G.P. (2005) Cowpea mosaic virus-based systems for
the production of antigens and antibodies in plants. Vaccine. 23: 1788-1792.
Lomonossoff, G.P. and Hamilton, W. P.(1999) Cowpea Mosaic Virus-based vaccines.
Curr. Top. Microbiol. Immunol. J. Hammond, P. McGarvey and V.Yusilov, Springer-
Verlag Berlin Heidelberg. 240: 177-189.
120
Lung, S., Chan, W., Yip, W., Wang, L., Yeung, E. C. and Lim, B. L. (2005) Secretion of
beta-propeller phytase from tobacco and Arabidopsis roots enhances phosphorus
utilization. Plant science. 169: 341-349.
Ma, Y., Lin, S.Q., Gao, Y., Li, M., Luo, W.X., Zhang, J., Xia, N.S. (2003) Expression of
ORF2 partial gene of hepatitis E virus in tomatoes and immunoactivity of expression
products. World J. Gastroenterol. 9: 2211– 2215.
Ma, H. and Chen, G. (2005) Gene transfer technique. Nature and Science. 3(1): 25-31.
McGarvey, P.B., Hammond, J., Dienelt, M.M., Hooper, D.C., Fu, Z.F., Dietzschold, B.,
Koprowski, H., Michael, F.H. (1995) Expression of the rabies virus glycoprotein in
transgenic tomatoes. Bio/Tech. 13: 1484–1487.
Mason, H.S., Lam, D.M. and Arntzen, C.J. (1992) Expression of hepatitis B surface
antigen in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci USA . 89: 11745-9.
Mason, H.S. and Arntzen, C.J. (1995) Transgenic plants as vaccine production systems.
Trends Biotechnol. 13: 388-92.
Mason, H.S., Ball, J.M., Shi, J.J., Jiang, X., Estes, M.K. and Arntzen, C.J. (1996)
Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral
immunogenicity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A . 93: 5335-40.
Mason, H.S., Haq, T. A., Clements, J. D. and Arntzen, C.J. (1998) Edible vaccine
protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing
a synthetic LT-B gene. Vaccine. 16: 1336-1343.
Mittmann, J. (2004) Obtenção e produção de partículas virais quiméricas do vírus do
mosaico do feijão-de-corda que expressam epitopos das proteínas gp63, LACK e
LDP23 de Leishmania chagasi. Tese de Doutorado em Biociências e Biotecnologia -
121
Centro de Biociências e Biotecnologia - Laboratório de Biotecnologia, Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes - RJ. 150p.
Modelska, A., Dietzschold, B., Sleysh, N., Fu, Z.F., Steplewski, K., Hooper, D.C.,
Koprowski, H., Yusibov, V. (1998) Immunization against rabies with plant-derived
antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 2481–2485.
Moura, R. S. (2004) Produção de partículas quiméricas do vírus do feijão-de-corda
expressando o peptídeo sinal de transcitose da enterotoxina estafilocócica tipo B.
Trabalho de Conclusão de Curso - Centro de Biociências e Biotecnologia - Laboratório
de Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Campos
dos Goytacazes - RJ. 74p.
Murashige, T. and. Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays
with tobacco tissue culture. Plant Physiol. 15: 562-568.
Nicolaisen, M., Johansen, E., Poulsen, G.B. and Borkhardt, B. (1992) The 5'
untranslated region from pea seedborne mosaic potyvirus RNA as a translational
enhancer in pea and tobacco protoplasts. Elsevier Science Publishers B.V. 303: 169-
172.
Porceddu, A., Falorni, A., Ferradini, N., Cosentino, A., Calcinaro, P., Faleri, C., Cresti,
M., Lorenzetti, F., Brunettiand, P., Pezzotti, M. (1999) Transgenic plants expressing
human glutamic acid decarboxylase (GAD65), a major autoantigen in insulin-dependent
diabetes mellitus. Mol. Breed. 5: 553–560.
Porta, C., Spall, V. E., Lin, T., Johnson, J. E. and Lomonossoff, G.P. (1996) The
development of Cowpea Mosaic Virus as a potencial source of novel vaccines.
Intervirology. 39: 79-84.
Porta, C., and Lomonossoff, G.P. (2002) Viroses as vectors for the expression of foreign
sequences in plants. Biotech. and Genetic Engin. Reviews. 19: 245-291.
122
Revillard, J.P., Cozon, G. and Czerkinsky, C. (1992) Oral administration of
immunomodulators and the mucosal immune system. Dev Biol Stand. 77: 31-7.
Richter, L.J., Thanavala, Y., Arntzen, C.J., Mason, H.S. (2000) Production of hepatitis B
surface antigen in transgenic plants for oral immunization. Nat. Biotech. 18: 1167–1171.
Rigano, M. M. and Walmsley, A. M. (2005) Expression systems and developments in
plant-made vaccines. Immun. And Cell Biol. 83: 271-277.
Sambrook and Russel. (2001) Molecular cloning. A laboratory manual. Vol.1, 3. Ed.
Edition Cold Spring Harbor, NY. 1:112-1.115.
Sandhu, J.S., Krasnyanski, S.F., Domier, L.L., Korban, S.S., Osadjan, M.D., Buetow,
D.E.(2000) Oral immunization of mice with transgenic tomato fruit expressing respiratory
syncytial virus-F protein induces a systemic immune response. Transgenic Res. 9: 127–
135.
Scholthof, H.B., Scholthof, K.G., and Jackson, A, O. (1996) Plant virus gene vectors for
transient expression of foreign proteins in plants. Annual Reviews of Phytopahology. 34:
299-323.
Smith, M. L., Richter, L., Arntzen, C. J., Shuler, M. L. and Mason, H. S. (2003) Structural
characterization of plant-derived hepatitis B surface antigen employed in oral
immunization studies. Vaccine. 21: 4011-4021.
Sohel, I., Puente, J. L., Ramer, S. W., Bieber, D., Wu, C. Y.and Schoolnik, G. K. (1996)
Enteropathogenic Escherichia coli: identification of a gene cluster coding for bundle-
forming pilus morphogenesis. Journal Bacteriol. 178: 2613-2628.
Stoger, E., Sack, M., Fischer, R. and Christou, P. (2002) Plantbodies: applications,
advantages and bottlenecks. Curr. Opin. In Biotec. 13: 161-6.
123
Tacket, C.O., Mason, H.S., Losonsky, G., Clements, J.D., Levine, M.M. and Arntzen,
C.J. (1998) Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a
transgenic potato. Nat Med. 4: 607-9.
Tacket, C.O., Pasetti, M.F., Edelman, R., Howard, J.A., and Streatfield, S. (2004)
Immunogenicity of recombinant LT-B delivered orally to humans in transgenic corn.
Vaccine. 23: 1866-1869.
Wales, R., Chaddock, J.A., Roberts, L.M. and Lord, J.M. (1992) Addition of an ER
retention signal to the ricin A chain increases the cytotoxicity of the holotoxin. Exp Cell
Res. 203: 1-4.
Walmsley, A. M. and Arntzen, C.J. (2000) Plants for delivery of edible vaccines. Plant
Biotechnology. 11: 126-129.
Warzecha, H., Mason, H.S., Lane, C., Tryggvesson, A., Rybicki, E., Williamson, A.L.,
Clements, J.D., Rose, R.C.J. (2003) Oral immunogenicity of human papillomavirus-like
particles expressed in potato. Virology 77: 8702–8711.
Yu, J., Langridge, W.H. (2003) Expression of rotavirus capsid protein VP6 in transgenic
potato and its oral immunogenicity in mice. Transgenic Res. 12: 163–169.
Yusibov, V., Hooper, D.C., Spitsin, S.V., Fleysh, N., Kean, R.B., Mikheeva, T., Deka, D.,
Karasev, A., Cox, S., Randall, J., Koprowski, H. (2002) Expression in plants and
immunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine. Vaccine 20: 3155–
3164.
Zhou, J.Y., Cheng, L.Q., Zheng, X.J., Wu, J.X., Shang, S.B., Wang, J.Y., Chen, J.G.
(2004) Generation of the transgenic potato expressing full-length spike protein of
infectious bronchitis virus. J. Biotech. 111: 121–130.
124
ANEXO I
125
MEIOS DE CULTURA
1. LB (Meio Luria-Bertani)
Triptona ..............................................................................10,0 g
Extrato de Levedo .............................................................. 5,0 g
NaCl ...................................................................................10,0 g
H2O .....................................................................................800 ml
Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 2 N
Acrescentar água para 1000 ml.
Meio sólido - agar ...............................................................15,0 g
Esterilizar por autoclavagem por 20 minutos
2. Meio de germinação e manutenção de plantas de fu mo e cenoura (MS)
Macro e micro elementos MS (Sigma) ................................2,2 g/l
Sacarose .............................................................................10 g/l
Ajustar o pH para 5,7 com NaOH
Ágar.....................................................................................8 g/l
Esterelizar por autoclavagem
3. Meio de indução de calos de cenoura (MS)
Sais MS (Sigma) .................................................................4,4 g/l
Sacarose .............................................................................30g/l
Ajustar o pH para 5,7 com NaOH
Ágar.....................................................................................8 g/l
2,4D.....................................................................................1 mg/l
Esterelizar por autoclavagem
Após a autoclavagem acrescentar
Canamicina .......................................................................75 mg/l
Cefotaxime ........................................................................250 mg/l
126
ANEXO II
127
TAMPÕES
1) Tampão de eluição
Tris-HCl 1M pH8,0..................................... 400µL
EDTA 0,5M pH8,0 ..................................... 80µL
NaCl 5M .................................................... 8mL
2) Tampão fosfato 0,5 M pH 7,4
3.1. Soluções estoque
200 ml NaHPO4 ......................................... 1 M
200 ml Na2HPO4........................................ 1 M
3.2. Preparo
200 ml da solução 1
59,2 ml da solução 2
Ajustar o volume para 400 ml com água ultra pura
3) Tampão TST-20 (10X)
Tris-HCl pH 7.4(12,11 g/l) ......................... 100 mM
NaCl (87,1 g/l) ........................................... 1,5 M
Tween-20 (5 ml/l) ...................................... .0,5 %
4) Soluções para preparo de géis de acrilamida
5.1. Tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
Dissolver 27,23 g de Tris-base em aproximadamente 100 ml de água bidestilada;
ajustar o pH a 8,8 com HCl 6 N; completar volume para 150 ml e guardar a 4oC
5.2.Tampão Tris -HCl 0,5 M pH 6,8
Dissolver 6 g de Tris-base em aproximadamente 60 ml de água bidestilada, ajustar o pH
a 6,8 com HCl 6 N; completar o volume para 100 ml e guardar a 4oC.
5.3. Tampão de amostra (desnaturante 4 X concentrado)
- SDS 10%................................................. 1,6 ml
- Tris-HCl (1M pH 6,8) ............................... 1,0 ml
- Glicerol .................................................... 10 %
128
- Azul de bromo fenol ............................... 0,5 %
- Água ultra pura........................................ 3,8 ml
5.4. Tampão para o gel de resolução
-Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8
5.5. Tampão para o gel concentrador
- Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
5.6. Preparo dos Géis (Cálculo para 10 ml)
Concentração final
de acrilamida
Água
bidestilada(ml)
Solução
tampão(ml)
Solução(ml)
estoque
4 % 6,15 2,50 1,33
5 % 5,80 2,50 1,67
6 % 5,45 2,50 2,00
7 % 5,15 2,50 2,33
8 % 4,80 2,50 2,67
9 % 4,45 2,50 3,00
10 % 4,15 2,50 3,33
11 % 3,80 2,50 3,67
12% 3,45 2,50 4,00
13% 3,15 2,50 4,30
14% 2,80 2,50 4,67
15% 2,45 2,50 5,00
16% 2,15 2,50 5,33
17% 1,80 2,50 5,67
5.7. Catalisadores (para 10 ml de gel)
50µl APS 10% e 5 µl TEMED