Post on 13-Nov-2018
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos Área de Produção e Controle Farmacêuticos
Desenvolvimento de método de análise e estudo de estabilidade do
ácido kójico associado ou não ao ácido glicólico em formulações tópicas
Rosa Fernanda Ignácio
Tese para obtenção do grau de
DOUTOR
Orientador:
Prafa. Ora. Erika Rosa Maria Kedor
Hackmann
São Paulo 2005
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Fármaco e Medicamentos Área de Produção e Controle Farmacêuticos
Desenvolvimento de método de análise e estudo de estabilidade do
ácido kójico associado ou não ao ácido glicólico em formulações tópicas
Rosa Fernanda Ignácio
Tese para obtenção do grau de
DOUTOR
Orientador:
Prafa. Ora. Erika Rosa Maria Kedor
Hackmann
São Paulo 2005
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DEDAlUS - Acervo - CQ
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Ficha Cata log rá fica
E laborada pela Di v isào de Bibli o teca e Doc um ent açào d o Co njunto das Quím icas da US P.
Ign ác io. Rosa F e r na nda
12 4d D e" ': nvo lv im e nt o de mé t o d o de a ná l ise e es tud o d e es tab ilid ade
de áci d o kój ico assoc iado ou nào a ác ido g li có li co em formu lações
tó pic as / Rosa Fern a nda Ig náci o -- São Paulo , 200 5 .
228p.
T ese (do ut oraclo) f ac ul dad e de C i ê nc ias Farmacê uti ca s da
U ni versidade d e São Paul o. Departamen to de Farmácia.
O ri e ntador: K e d or- H ack m a nn , E rik a Ros a M a ria
I . Cos méti cos: Co ntro le d e qua l idad e 2. Es pec tro fotom etri a
3. C r o m a t ografia em l íquido d e a lt o desemp enho : Q uím ica an a l ític a
4. Es tabilidad e Medi ca m ento: A ná li se far macê utica I. T. 11.
Ke d or- H ac kmann . E rik a Ro sa M a ri a, o ri e nt ado r .
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AGRADECIMENTOS
À Profa. Ora. Maria Inês Rocha Miritello Santoro, pela amizade, incentivo e por ter
me recebido no Laboratório de Controle Físico-Químico de Qualidade de
Medicamentos e Cosméticos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP.
À Profa. Ora. Valentina Porta, à Farm. Chefe Eunice Kazue Kano e à Farm. Simone
Schramm Andrade, do BIOFAR, pelo uso do cromatógrafo líquido e apoio técnico
prestado.
À funcionária Leila Aparecida Bonadio, da Biblioteca do Conjunto das Químicas, pela
conferência das referências bibliográficas utilizadas neste trabalho.
À Farm. Kátia Cirlene Alves Botelho, do Laboratório de Química Farmacêutica, pelo
auxílio na análise dos espectros de infravermelho.
Aos colegas de laboratório Elizângela, Andréia Peraro, Nájla, Tatiane, Helena,
Pedro, Ricardo, Renata, Ivani, Joyce, Angel, Carla, Fábio e Alexandre, pela amizade,
ajuda e apoio em todos os momentos.
Aos meus irmãos Rita e Renato e aos meus queridos sobrinhos Gabriela e Leandro,
por compreenderem tantas ausências e pelo amor incondicional.
Aos professores Jorge Luiz Seferin Martins e Anil Kumar Singh e às funcionárias Iria
Raimunda da Silva e Regina Maura Rojas, pela colaboração e amizade.
À acadêmica Larissa Maria Hilsdorf Bernardi, pela colaboração técnica no início
desse trabalho, por sua dedicação e amizade.
Às distribuidoras farmacêuticas Galena, lonquímica, Purifarma, Pharma-Special, ISP
e Merck, por gentilmente terem cedido parte das matérias-primas usadas nesse
trabalho.
RESUMO
o desenvolvimento de métodos analíticos e o estudo de estabilidade de
formulações cosméticas e farmacêuticas fazem parte do processo de garantia de
qualidade, o qual tem por objetivo assegurar a eficácia e segurança no uso de tais
produtos pelo consumidor. O ácido kójico é um agente despigmentante que pode
estar associado ao ácido glicólico, um agente esfoliante, a fim de ter sua ação
potencializada. O objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um método
analítico para determinação do ácido kójico a 1 % associado ou não ao ácido
glicólico a 5% em formulações tópicas na forma creme e gel, a base de excipientes
comumente utilizados em farmácias de manipulação, e a realização de um estudo
acelerado para avaliar a estabilidade das mesmas. Para a determinação do ácido
kójico isolado empregou-se a espectrofotometria derivada de 1 a ordem no
ultravioleta (UVD), usando-se o método "zero crossing" a 256,8 nm, onde a
interferência dos excipientes da matriz foi anulada. Para a determinação dos dois
ativos associados, foi validado um método por CLAE em fase reversa, com
pareamento iônico, empregando-se coluna Synergi Hidro® C18, fase móvel tampão
NH4H2POJH3P04 30 mM pH 3,0 com TBA (brometo de tetrabutilamônio) 2 mM :
acetonitrila (95:5), vazão 0,7 mLlmin e detector PDA fixado em 220 nm. As amostras
foram extraídas sem grande complexidade e os ativos puderam ser determinados
em 12 mino As mesmas condições experimentais foram usadas para o
desenvolvimento de um método para a determinação do ácido kójico isolado nas
formulações creme e gel por CLAE, sendo que a comparação com o método UVD
não mostrou diferença estatisticamente significante para p = 95% quanto à precisão
e exatidão. As amostras submetidas ao estudo de estabilidade acelerado, com
duração de 90 dias, foram armazenadas em estufa a 40±2°C e luz a 25±2°C e
também acompanhadas em armário fechado à temperatura ambiente, sendo
avaliadas quanto aos caracteres organolépticos, pH, doseamento e comportamento
reológico. As formulações submetidas ao estudo mostraram-se estáveis fisicamente,
mas as amostras apresentaram decaimento do teor de ácido kójico acima de 5%
quando armazenadas em estufa a 40±2°C. Considerada a condição normal de
armazenagem as formulações mantiveram-se dentro da faixa de 90% do teor inicial,
podendo o prazo de validade de 90 dias ser considerado como referência para
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wa sepepJen6 anb apsap 'wa6eleqwa a o~!sodwoo wa salueLuawas saQóelnWJoJ
ABSTRACT
The development of analytical methods and the stability study of cosmetics
and pharmaceuticals are part of the quality assurance, which has for objective to
guarantee the effectiveness and security in the use of such products for the
consumer. Kojic acid is a depigmentant agent that can be used in association with
glycolic acid, an exfoliant agent, in order to have its action maximized. The aim of this
work was the development of an analytical method to assay kojic acid 1 % associated
or not with 5% glycolic acid in cream and gel form, based on excipients normally
used in compounding formulations, and carried out an accelerated study to evaluate
its stability. To determine kojic acid in such formulations it was employed an UV first
derivative spectrophotometric method (UVD), with "zero crossing" set in 256,8 nm,
where the excipients interference could be annulled. To assay both acids in
association it was validated a reversed phase HPLC method with ion pairing,
employed a Synergi Hidro® C18 column, mobile phase NH4H2POJH3P04 buffer 30
mmor1 pH 3,0 plus TBA (tetrabutylammonium bromide) 2 mM : acetonitrila (95:5),
flow rate of 0,7 mUmin and detector PDA set in 220 nm. The samples were easily
extracted and the run time was 12 mino The same experimental conditions were used
to the development of a HPLC method in order to determine the kojic acid isolated in
cream and gel formulations. The UVD e HPLC methods were not statistically different
in terms of accuracy and precision (p = 95%). The samples submiUed to the
accelerated stability study, for 90 days, were stored at 40±2°C and light 25±2°C. Ali
samples were also stored at room temperature protected from light. Appearance, pH,
rheology and amount of kojic and glycolic acids (by HPLC) were evaluated. At the
end of the study, ali the samples showed physical stability, but presented decline in
kojic acid above 5% at 40±2°C. Samples stored at not accelerated conditions
preserved 90% of kojic acid concentration. Therefore, a 90 days expiration date may
be considered for formulations with similar composition and packing, when stored at
room temperature and protected from light.
Tabela 1
Tabela 2
Tabela 3
Tabela 4
Tabela 5
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
Tabela 9
Tabela 10
LISTA DE TABELAS
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e
ácido glicólico associados, usando como excipiente creme não iônico,
armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem
plástica (polipropileno) .
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e
ácido glicólico associados, usando como excipiente creme aniônico,
armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem
plástica (polipropileno) .
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e
ácido glicólico associados, usando como excipiente gel de natrosol®,
armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem
plástica (polipropileno).
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e
ácido glicólico associados, usando como excipiente gel de amigel®,
armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem
plástica (polipropileno) .
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e
ácido glicólico associados, usando como excipiente creme não iônico,
expostas à luz (temperatura ambiente) em embalagem de vidro incolor.
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e
ácido glicólico associados, usando como excipiente gel de natrosol®,
expostas à luz (temperatura ambiente) em embalagem de vidro incolor.
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico,
usando como excipiente creme não iônico, armazenadas à temperatura
de 45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico,
usando como excipiente o creme aniônico, armazenadas à temperatura
de 45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico,
usando como excipiente gel de natrosol®, armazenadas à temperatura
de 45±2°C em estufa em embalagem plástica (polipropileno).
Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico,
94
95
96
97
97
98
99
100
100
101
Tabela 11
Tabela 12
Tabela 13
Tabela 14
Tabela 15
Tabela 16
Tabela 17
Tabela 18
Tabela 19
usando como excipiente gel de amigel®, annazenadas à temperatura
de 45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).
Resultados da avaliação das fonnulações contendo ácido kójico
usando como excipiente creme não iônico, expostas à luz (temperatura
ambiente) em embalagem de vidro incolor.
Resultados da avaliação das fonnulações contendo ácido kójico
usando como excipiente gel de natrosol®, expostas à luz (temperatura
ambiente) em embalagem de vidro incolor.
Absorbâncias e llA/l1A obtidas na construção da curva de calibração
do ácido kójico em metanol, nas concentrações de 2 a 18 J.Jg/mL.
Resultados obtidos no teste de recuperação para amostra ácido kójico
1 % creme, por espectrofotometria derivada de primeira ordem no
ultravioleta, método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente
metanol.
Resultados obtidos no teste de recuperação para amostra ácido kójico
1 % gel , por espectrofotometria derivada de primeira ordem no
ultravioleta, método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente
metano!.
Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico na amostra
ácido kójico 1 % creme por espectrofotometria derivada de primeira
ordem, método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente
metano!.
Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico na amostra
ácido kójico 1 % gel por espectrofotometria derivada de primeira ordem,
método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente metano!.
Sistemas cromatográficos testados no desenvolvimento do método.
Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro® RP Phenomenex,
vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm;
temperatura ambiente.
Valores do fator de retenção (k) nos diferentes sistemas
cromatográficos testados no desenvolvimento do método. Condições
cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, vazão 0,7
mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
101
102
106
114
115
116
117
118
120
Tabela 20
Tabela 21
Tabela 22
Tabela 23
Tabela 24
Tabela 25
Tabela 26
Áreas obtidas na construção da curva de calibração do ácido kójico
(intervalo de concentração de 08 a 48 ~g/mL) associado a ácido
glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240 ~g/mL) por CLAE, fase
móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN
(95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220 nm;
temperatura ambiente.
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido glicólico na
amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase
móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :
ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220
nm; temperatura ambiente.
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase móvel
18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN
(95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220 nm;
temperatura ambiente.
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido glicólico na
amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase
móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :
ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220
nm; temperatura ambiente.
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase móvel 18:
Tampão NH4H2P04/H3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) ,
vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a 220 nm;
temperatura ambiente.
Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 J.Lg/mL)
na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE,
fase móvel 18: Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00
: ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção a
220 nm; temperatura ambiente.
Resultados obtidos na determinação do teor de ácido glicólico (160
J.Lg/mL) na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por
CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM
pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL,
detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
127
138
139
139
140
141
141
Tabela 27
Tabela 28
Tabela 29
Tabela 30
Tabela 31
Tabela 32
Tabela 33
Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 Ilg/mL)
na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase
móvel 18: Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :
ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220
nm; temperatura ambiente.
Resultados obtidos na determinação do teor de ácido glicólico (160
Ilg/mL) na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por
CLAE, fase móvel 18: Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM
pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL,
detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido glicólico na
amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase
móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :
ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220
nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente.
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase móvel
18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN
(95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm
(detector UV-VIS); temperatura ambiente.
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase móvel 18:
tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) ,
vazão 0,7 mUmin ; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector
UV-VIS); temperatura ambiente.
Resultados obtidos no teste de precisão na determinação do ácido
kójico (K) e do ácido glicólico (G) na amostra ácido kójico 1 %
associado a ácido glicólico 5% creme e gel por CLAE, fase móvel 18:
tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05),
vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector
UV-VIS); temperatura ambiente.
Áreas obtidas na construção da curva de calibração do ácido kójico
(intervalo de concentração de 08 a 48 IJg/mL), fase móvel: tampão
NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV
VIS) ; temperatura ambiente.
142
142
145
145
146
147
148
Tabela 34
Tabela 35
Tabela 36
Tabela 37
Tabela 38
Tabela 39
Tabela 40
Tabela 41
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2PO,JH3P04
30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 j.!L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura
ambiente.
Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2PO,JH3P04 30
mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 j.!L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura
ambiente.
Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 j.!g/mL)
na amostra ácido kójico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 j.!L, detecção a 220 nm (detector UV
VIS); temperatura ambiente.
Resultados obtidos na detenminação do teor de ácido kójico (32 j.!g/mL)
na amostra ácido kójico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 j.!L, detecção a 220 nm (detector UV
VIS); temperatura ambiente.
Resultados obtidos na comparação da precisão e exatidão dos
métodos propostos (EDUV e CLAE) para determinação de ácido kójico
nas amostras creme e gelo
Resultados da avaliação macroscópica das fonmulações contendo
ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando como
excipiente creme não iônico, embaladas em pote plástico
(polipropileno), nas diferentes condições de anmazenamento.
Resultados da avaliação macroscópica das fonmulações contendo
ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando como
excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno),
nas diferentes condições de armazenamento.
Resultados da avaliação macroscópica das formulações contendo
ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas
em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de
armazenamento.
151
152
153
153
154
155
156
156
Tabela 42
Tabela 43
Tabela 44
Tabela 45
Tabela 46
Tabela 47
Tabela 48
Tabela 49
Tabela 50
Tabela 51
Resultados da avaliação macroscoplca das formulações contendo
ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas
em pote plástico (polipropileno) , nas diferentes condições de
armazenamento.
Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em pote plástico (polipropileno) , nas diferentes
condições de armazenamento.
Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de
natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno) , nas diferentes
condições de armazenamento.
Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido kójico
1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em pote
plástico (polipropileno) , nas diferentes condições de armazenamento.
Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido kójico
1%, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote
plástico (polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.
Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações
contendo ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando como
excipiente creme não iônico, embaladas em pote plástico
(polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.
Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações
contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% , usando como
excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno),
nas diferentes condições de armazenamento.
Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações
contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico,
embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições
de armazenamento.
Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações
contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®,
embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições
de armazenamento . .
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %
157
158
158
159
159
160
161
162
163
164
Tabela 52
Tabela 53
Tabela 54
Tabela 55
Tabela 56
Tabela 57
Tabela 58
Tabela 59
associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em
estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %
associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a
25±2°C, nos diferentes tempos de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %
associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em
armário à temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %
associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de
natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas
em estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %
associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de
natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz
a 25±2°C, nos diferentes tempos de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %
associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de
natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas
em armário à temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %,
usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes
plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos
diferentes tempos de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %,
usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes
plásticos (poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos
de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %,
usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes
plásticos (poliestireno), armazenadas em armário à temperatura
ambiente, nos diferentes tempos de leitura.
166
168
170
172
174
176
178
180
Tabela 60
Tabela 61
Tabela 62
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %,
usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes
plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos
diferentes tempos de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %,
usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes
plásticos (poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos
de leitura.
Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico 1 %,
usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes
plásticos (poliestireno), armazenadas em armário à temperatura
ambiente, nos diferentes tempos de leitura.
182
184
186
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
LISTA DE FIGURAS
Espectro do ácido kójico matéria-prima na região do infravermelho
(pastilha de KBr) . Bandas principais (comprimento de onda cm-1) :
1579 (-C-O-C aromático); 1609 (-C=O); 2852 (-CH alifático); 2922 (
CH aromático) ; 3172 (-OH) .
Espectro do ácido kójico substância de referência na região do
infravermelho (pastilha de KBr). Bandas principais (comprimento de
onda cm-1): 1579 (-C-O-C aromático); 1609 (-C=O); 2852 (-CH
alifático) ; 2922 (-CH aromático); 3175 (-OH).
Espectro do ácido glicólico matéria-prima na região do infravermelho
(filme líquido). Bandas principais (comprimento de onda cm-1): 1732
(-C=O de ácido carboxílico), 3200-3600 (-OH).
Espectro do ácido glicólico substância de referência do
infravermelho (pastilha de KBr). Bandas principais (comprimento de
onda cm-\ 1721 (-C=O de ácido carboxílico), 3200-3600 (-OH) .
Espectro do ácido kójico matéria-prima na região do UV,
concentração de 10 ~g/mL, tendo como solvente água destilada.
Picos em 216,4 e 268,6 nm.
Espectro do ácido kój ico substância de referência na região do UV,
concentração de 1 O ~g/mL, tendo como solvente água destilada.
Picos em 216,2 e 268,6 nm.
Espectro do ácido glicólico substância de referência na região do
UV, na concentração de 1 00 ~g/mL , tendo como solvente água
destilada.
Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico substância
de referência , razão de aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente
a 550°C.
Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico matéria
prima, razão de aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a
550°C.
Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido glicólico
substância de referência, razão de aquecimento 5°C/min,
temperatura ambiente a 550°C.
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86
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Figura 19
Figura 20
Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC da mistura do ácido
glicólico/ácido kójico 1:1 substâncias de referência, razão de
aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a 400°C.
Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC da mistura do ácido
glicólico/ácido kójico 5:1 substâncias de referência, razão de
aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a 400°C.
Sobreposição das curvas DTG do ácido glicólico substância de
referência, ácido kójico substância de referência , da mistura do
ácido glicólico/ácido kójico 1:1 substâncias de referência e da
mistura do ácido glicólico/ácido kójico 5:1 substâncias de referência,
aproximadamente 5 mg de amostra, razão de aquecimento 5°C/min.,
temperatura ambiente a 400°C, obtidas sob atmosfera dinâmica de
ar de 50 mUmin, em cadinho de platina.
Sobreposição das curvas DSC do ácido glicólico substância de
referência, ácido kójico substância de referência, da mistura do
ácido glicólico/ácido kójico 1:1 substâncias de referência e da
mistura do ácido glicólico/ácido kójico 5:1 substâncias de referência,
aproximadamente 2 mg de amostra, razão de aquecimento 5°C/min.,
temperatura ambiente a 400°C, obtidas sob atmosfera dinâmica de
N2 de 100 mUmin, em cadinho de alumínio.
Sobreposição das curvas TG isotérmicas da mistura ácido
glicólico/ácido kójico 5:1 substâncias de referência, razão de
aquecimento 5°C/min. (temperatura ambiente a Tiso-10°C) seguida
de 2°C/min. até ocorrência de 10% de perda de massa , obtidas sob
atmosfera dinâmica de ar de 50 mUmin, em cadinho de platina.
Gráfico de Arrhenius (y = a + bx) da mistura ácido glicólico/ácido
kójico 5:1 substâncias de referência .
Espectro de absorção direto e de primeira derivada do ácido kójico
substância de referência (1 O ~g/mL) em metano!.
Espectro de absorção direto da curva de calibração do ácido kójico
em metanol, intervalo de concentração de 2 a 18 IJg/mL.
Espectro de absorção em derivada de primeira ordem da curva de
calibração do ácido kójico em metanol, intervalo de concentração de
2 a 18 IJg/mL.
Curva de calibração do ácido kójico em metanol, obtida por
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Figura 21
Figura 22
Figura 23
Figura 24
Figura 25
Figura 26
Figura 27
Figura 28
espectrofotometria derivada de primeira ordem no ultravioleta a
256,8 nm.
Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido kójico em metanol a 256,8 nm, obtida pelo método dos
mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente
angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado (teste de
significância de a) .
Espectros de absorção direto do padrão de ácido kójico a 10 J.l.g/mL,
da amostra ácido kójico creme 10 J.l.g/mL e do creme base, em
metanol , com intervalo de leitura de 200 a 320 nm.
Espectros de absorção em derivada de primeira ordem do padrão de
ácido kójico a 10 J.l.g/mL, da amostra ácido kójico creme 10 J.l.g/mL e
do creme base, em metanol, com intervalo de leitura de 200 a 320
nm. Ponto de anulação do creme base a 256,8 nm (método
quantitativo "zero crossing") .
Espectros de absorção direto do padrão de ácido kójico a 10 J.l.g/mL,
da amostra ácido kójico gel 10 J.l.g/mL e do gel base, em metanol,
com intervalo de leitura de 200 a 320 nm.
Espectros de absorção em derivada de primeira ordem do padrão de
ácido kójico a 10 J.l.g/mL, da amostra ácido kójico gel 10 J.l.g/mL e do
gel base, em metanol, com intervalo de leitura de 200 a 320 nm.
Ponto de anulação do gel base a 256,8 nm (método quantitativo
"zero crossing").
Espectro direto, em metanol, da amostra ácido kójico creme a 10
J.l.g/mL, da amostra ácido kójico creme a 10 J.l.g/mL submetido a
envelhecimento acelerado e da solução padrão de ácido kójico a 10
J.l.g/mL.
Espectro de absorção em primeira derivada, em metanol, da
amostra ácido kójico creme a 10 J.l.g/mL, da amostra ácido kójico
creme a 10 J.l.g/mL submetido a envelhecimento acelerado e da
solução padrão a 10 J.l.g/mL.
Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160
J.l.g/mL). Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP
Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +
TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume
107
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111
112
113
122
Figura 29
Figura 30
Figura 31
Figura 32
Figura 33
Figura 34
injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
Perfil cromatográfico do ácido glicólico matéria-prima (160 Ilg/mL).
Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®,
fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH
3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL,
detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
Perfil cromatográfico do ácido kójico substância de referência (32
Ilg/mL). Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP
Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +
TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
Perfil cromatográfico do ácido kójico matéria-prima (32 Ilg/mL).
Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®,
fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH
3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL,
detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160
f.!g/mL) com tR a 4,56 min - e do ácido kójico substância de
referência (32 Ilg/mL) - tR a 5,99 mino Condições cromatográficas:
coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão
NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00: ACN (95:05) , vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 f.!L, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
Curva de calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 8
a 48j..1g/mL) obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04
30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin;
volume injetado 20 f.!L, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido kójico (intervalo de concentração de 8 a 48 j..Ig/mL) obtida
por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2
mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20
f.!L, detecção a 220 nm; temperatura ambiente, obtida pelo método
dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta , b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado
(teste de significância de a).
123
124
125
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128
129
Figura 35
Figura 36
Figura 37
Figura 38
Figura 39
Figura 40
Figura 41
Curva de calibração do ácido glicólico (intervalo de concentração de
40 a 240 IJg/mL) obtida por CLAE, fase móvel : tampão
NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão
0,7 mUmin ; volume injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 2401Jg/mL)
obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM +
TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente, obtida
pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta ,
b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t
calculado (teste de significância de a).
Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 fl9/mL) associado
a ácido glicólico (160 flg/mL) creme. Condições cromatográficas:
coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 flL , detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
Perfil cromatográfico do creme base. Condições cromatográficas:
coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 flg/mL) associado
a ácido glicólico (160 fl9/mL) gel. Condições cromatográficas: coluna
Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
Perfil cromatográfico do gel base. Condições cromatográficas:
coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão
0,7 mUmin ; volume injetado 20 flL, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 fl9/mL) associado
130
131
132
133
134
135
137
Figura 42
Figura 43
Figura 44
Figura 45
Figura 46
a ácido glicólico (160 ~g/mL) creme, submetida a envelhecimento
acelerado em estufa a 45°C por 30 dias. Condições cromatográficas:
coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão
NH4H2P04/H3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 ~L, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160
~g/mL) com tR a 4,56 min - e do ácido kójico substância de
referência (32 ~g/mL) - tR a 5,99 mino Condições cromatográficas:
coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão
NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 ~L, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido kójico (intervalo de concentração de 8 a 48 IJg/mL) obtida
por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2
mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20
~L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS) ; temperatura ambiente,
obtida pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção
da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado (teste de significância de a).
Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240 IJg/mL)
obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +
TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 ~L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura
ambiente, obtida pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de
correlação e te = t calculado (teste de significância de a).
Curva de calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 8
a 48 IJg/mL) obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04
30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin;
volume injetado 20 ~L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);
temperatura ambiente.
Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido kójico (intervalo de concentração de 8 a 48 IJg/mL) obtida
por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2
137
143
144
149
150
Figura 47
Figura 48
Figura 49
Figura 50
Figura 51
Figura 52
mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20
J..lL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente,
obtida pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção
da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t
calculado (teste de significância de a).
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando
como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos
(poli estireno) , armazenadas em estufa a 40±2°C, nos diferentes
tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e
Tgo.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando
como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos
(poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de
leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando
como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos
(poliestireno) , armazenadas em armário fechado à temperatura
ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque
(abaixo) apenas os To e T go.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando
como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos
(poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos diferentes
tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e
Tgo.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando
como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos
(poliestireno) , expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de
leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando
como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos
(poliestireno), armazenadas em armário fechado a temperatura
165
167
169
171
173
175
Figura 53
Figura 54
Figura 55
Figura 56
Figura 57
Figura 58
ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque
(abaixo) apenas os To e Tgo.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas
em estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em
destaque (abaixo) apenas os To e T go.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a
25±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque
(abaixo) apenas os To e Tgo.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas
em armário fechado à temperatura ambiente, nos diferentes tempos
de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e T 90.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1%, usando como excipiente gel de natrosol®,
embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em
estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em
destaque (abaixo) apenas os To e T 90.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®,
embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a
25±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque
(abaixo) apenas os To e Tgo.
Representação gráfica das medidas reológicas das formulações
contendo ácido kójico 1 % , usando como excipiente gel de natrosol®,
embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em
armário fechado à temperatura ambiente, nos diferentes tempos de
leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.
177
179
181
183
185
187
1. INTRODUÇÃO
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 . Distúrbios hiperpigmentares
SUMÁRIO
2.2. Melanogênese e substâncias despigmentantes
2.3. Ácido kójico
2.4. Ácido glicólico
2.5. Desenvolvimento de formulações contendo ácido kójico
2.6. Métodos de quantificação do ácido kójico
2.7. Métodos de quantificação do ácido glicólico
2.8. Métodos utilizados no presente trabalho
2.8.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
2.8.2. Espectrofotometria derivada no ultravioleta (UVD)
3. OBJETIVO
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 . Material
4.1.1. Substâncias de referência
4.1.2. Matérias-primas farmacêuticas
4.1.3. Reagentes, solventes e materiais
4.1.4. Equipamentos e acessórios
4.1.5. Formulações utilizadas como excipientes
4.2. Métodos
4.2.1 . Caracterização do ácido kójico e ácido glicólico matéria-prima
4.2.1.1. Espectroscopia no infravermelho
4.2.1.2. Espectrofotometria no ultravioleta (UV)
4.2.2. Análise térmica do ácido kójico e do ácido glicólico
4.2.2.1. Estudo termogravimétrico
4.2.2.2. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
4.2.3. Estudo preliminar de estabilidade das formulações
1
3
3
7
11
16
18
20
22
25
25
27
30
31
31
31
31
32
33
34
36
36
36
36
36
36
38
39
4.2.3.1. Obtenção dos excipientes creme e gel 29
4.2.3.2. Obtenção das formulações para o estudo preliminar de estabilidade 39
4.2.3.3. Condições de armazenamento 47
4.2.3.4. Avaliação das formulações 47
4.2.4. Validação do método de determinação do ác. kójico por espectrofotometria UV 48
4.2.4.1.
4.2.4.2.
4.2.4.3.
Amostra ácido kójico 1 % creme e gel
Ensaios espectrofotométricos preliminares
Padronização das condições experimentais
4.2.4.4. Construção da curva de calibração
4.2.4.5. Especificidade
4.2.4.5.1. Interferência dos excipientes
4.2.4.5.2. Interferência dos produtos de degradação
4.2.2.6. Exatidão (Recuperação)
4.2.2.7. Precisão
48
49
50
50
51
51
52
53
54
4.2.5. Validação do método de determinação dos ácidos associados por CLAE 55
4.2.5.1. Amostras contendo ácido kójico 1 % e ácido glicólico 5% 55
4.2.5.2. Ensaios cromatográficos preliminares 56
4.2.5.2.1. Condições gerais 56
4.2.5.2.2. Preparo da fase móvel
4.2.5.2.3. Sistemas testados
4.2.5.3. Padronização das condições experimentais
4.2.5.4. Construção da curva de calibração
4.2.5.5. Especificidade
4.2.5.5.1. Interferência dos excipientes
4.2.5.5.2. Interferência dos produtos de degradação
4.2.5.6. Exatidão (Recuperação)
4.2.5.7. Precisão
4.2.5.8. Robustez
4.2.6. Validação do método de determinação do ácido kójico por CLAE
4.2.6.1. Construção da curva de calibração
4.2.6.2. Exatidão (Recuperação)
4.2.6.3. Precisão
4.2.7
4.2.8.
Comparação dos métodos analíticos UVD e CLAE
Estudo de estabilidade acelerado
4.2.8.1. Preparo das formulações
4.2.8.2. Condições de armazenamento
4.2.8.3. Freqüência de análise
4.2.8.4. Análises realizadas
5. RESULTADOS
5.1. Caracterização do ácido kójico e ácido glicólico matéria-prima
57
57
59
60
60
60
61
62
64
66
66
66
67
69
70
70
71
74
74
75
77
77
5.1.1. Espectroscopia no infravermelho 77
5.1.2. Espectrofotometria no UV 80
5.1.3. Análise térmica do ácido kójico e do ácido glicólico 84
5.2. Estudo preliminar de estabilidade das formulações 93
5.2.1. Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico 93
5.2.2. Formulações contendo ácido kójico 98
5.3. Validação do método de determinação do ác. kójico por espectrofotometria UVD 103
5.3.1. Espectro de absorção do ácido kójico 103
5.3.2. Curva de calibração do ac. kójico por espectrofotometria derivada de 1 a ordem 104
5.3.3. Especificidade
5.3.3.1 . Interferência dos excipientes
5.3.3.2. Interferência dos produtos de degradação
5.3.4. Exatidão (Recuperação)
5.3.5. Precisão
5.4. Validação do método de determinação dos ácidos associados por CLAE
108
108
112
113
115
117
5.4.1. Ensaios cromatográficos preliminares 117
5.4.2. Perfil cromatográfico do ác. kójico e ác. glicólico na fase móvel selecionada 121
5.4.3. Curva de calibração do ácido kójico associado a ácido glicólico por CLAE 127
5.4.4. Especificidade 131
5.4.4.1. Interferência dos excipientes
5.4.4.2. Interferência dos produtos de degradação
5.4.5. Exatidão (Recuperação)
5.4.6. Precisão
5.4.7. Robustez
5.5. Validação do método de determinação do ácido kójico por CLAE
5.5.1. Curva de calibração do ácido kójico por CLAE
5.5.2. Exatidão (Recuperação)
5.5.3. Precisão
5.6. Comparação dos métodos de determinação do ác. kójico por UVD e CLAE
5.7. Estudo de estabilidade acelerado
5.7.1. Caracteres organolépticos
5.7.2. Análise de pH
5.7.3. Doseamento
5.7.4. Comportamento reológico
6. DISCUSSÃO
131
136
138
140
143
148
148
151
152
154
155
155
157
160
164
188
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1. INTRODUÇÃO
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" Universidade de São Paulo 1
o desenvolvimento e a formulação apropriados de uma forma farmacêutica
requerem a consideração das características físicas, químicas, físico-químicas e
biológicas de todos os princípios ativos e de todas as matérias-primas usadas na
elaboração do produto, assim como o conhecimento anatômico e fisiológico do local
de administração e absorção. O produto deve ser manufaturado de acordo com as
medidas apropriadas de garantia de qualidade, e acondicionados em recipientes que
contribuam para a estabilidade. O produto deve ser rotulado de modo a promover o
seu uso correto, e ser armazenado sob condições que contribuam para um prazo
máximo de validade (ANSEL et aI., 2000).
A qualidade final do produto farmacêutico já começa na sua pré-formulação.
Os estudos de pré-formulação e a prática de GMP ("Good Manufacturing Practices")
colaboram para a máxima eficácia e segurança do produto. A garantia de qualidade
é extremamente importante para assegurar ao consumidor a confiabilidade do
produto acabado (ANSEL et aI., 2000).
O fabricante é o maior responsável pela qualidade do medicamento que
produz, mediante vigilância intensa de seus processos de fabricação e controle.
Porém, cabe ao governo de cada país a proteção de seus cidadãos. No que diz
respeito à proteção à vida, deve garantir a cada um o direito à saúde, sendo
encarregado de fazer cumprir esse dever constitucional de assegurar o consumo de
medicamentos com qualidade, segurança e adequação aos fins a que se destinam.
No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), criada em
1999 pelo Ministério da Saúde, com modelo semelhante ao das agências européias
e americanas, constitui-se numa autarquia com a missão de proteger a saúde da
população, mediante controle de produtos, bens e serviços submetidos à vigilância
sanitária, bem como de processos, insumos e tecnologias a eles relacionados. Com
a finalidade de fixar uma referência para a inspeção de instalações dos
estabelecimentos farmacêuticos, processos de produção e controle de qualidade, a
ANVISA publicou, em 19/04/00, um regulamento técnico importante para o setor de
2
medicamentos, a Resolução da Diretoria Colegiada nº 33, denominada RDC-33.
Dentre outros, o referido instrumento legal estabelece que as farmácias de
manipulação deverão estabelecer o prazo de validade dos produtos manipulados
com base em estudos de estabilidade de formulações, o que representa a
necessidade de tais estabelecimentos criarem condições para a realização dos
mesmos, ou basear-se em estudos técnico-científicos que reflitam as condições e
características do setor.
A instabilidade das formulações farmacêuticas pode ser detectada em alguns
casos por uma mudança na aparência física, na cor, no odor, no gosto ou na textura;
em outros casos podem ocorrer alterações químicas que não são evidentes e que só
podem ser verificadas por análise química. Os dados científicos que fazem parte do
estudo da estabilidade do produto levam à previsão do prazo de validade para o
mesmo e, se necessário para a reformulação de sua forma farmacêutica (ANSEL et
aI. , 2000; LACHMAN et aI. , 2001 ; VADAS, 1998).
O ácido kójico, associado ou não a substâncias esfoliantes como o ácido
glicólico, é amplamente utilizado no tratamento de hiperpigmentações cutâneas. No
Brasil , a prescrição médica de medicamentos a base deste princípio ativo implica,
para o estabelecimento farmacêutico que o manipula, na necessidade de cuidados
especiais referentes à seleção de bases galênicas e adjuvantes farmacotécnicos
específicos, a fim de se garantir a estabilidade da formulação e conseqüentemente,
a eficácia e segurança do produto. Uma vez que o produto manipulado representa
no país uma forma mais acessível à terapia medicamentosa, em função do menor
custo, torna-se importante que tais estabelecimentos baseiem-se em estudos
científicos de estabilidade de formulações a fim de perseguir a reconhecida
qualidade dos produtos industrializados.
Assim o objetivo do presente trabalho é a determinação da estabilidade físico
química de formulações tópicas a base de ácido kójico, associado ou não ao ácido
glicólico, mediante o desenvolvimento de metodologia analítica que possibilite sua
quantificação.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Distúrbios hiperpigmentares
Os pacientes com alterações pigmentares na pele procuram tratamento
principalmente por razões estéticas. As alterações pigmentares são geralmente
assintomáticas e podem ser classificadas em hipopigmentares e hiperpigmentares. A
produção aumentada de melanina caracteriza um grande número de doenças da
pele, que podem se manifestar na epiderme, derme ou ambas (ARNDT, 1990;
HALDER; RICHARDS, 2004; STRA TIGOS; KA TSAMBAS, 2004).
As desordens hiperpigmentares da pele são comuns e se manifestam sob
diferentes formas. Por causa da natureza visível das doenças dermatológicas, elas
têm um considerável efeito psicológico nos pacientes. Lesões faciais desfigurantes
podem afetar significantemente o estado emocional de uma pessoa, podendo
contribuir para a diminuição de sua inserção social, produtividade no trabalho e na
escola e prejudicar a auto-estima. Como resultado de sua localização prevalente em
áreas expostas ao sol, a hiperpigmentação adquirida tem relevância psicossocial e
cosmética (BRIGANTI et aI., 2003; CAYCE et aI., 2004; RICHARDS, 2004;
STRATIGOS; KATSAMBAS, 2004).
As desordens de hiperpigmentação mais comuns são melasma (ou cloasma),
lentigos, hiperpigmentação pós-inflamatória e as efélides ou sardas (BRIGANTI et
aI., 2003; CAYCE et aI., 2004; RICHARDS, 2004; STRATIGOS; KATSAMBAS,
2004).
A luz ultravioleta, inflamação crônica, fricção da pele, tanto quanto uma
liberação anormal de hormônio estimulador de melanócito (MSH), são fatores
desencadeantes desses distúrbios (BRIGANTI et aI., 2003).
A hiperpigmentação dérmica ou epidérmica pode ser dependente do número
aumentado de melanócitos ou de uma maior atividade das enzimas melanogênicas,
ou seja, da produção aumentada de melanina (BRIGANTI et aI., 2003). A maioria
das hipermelanoses ocorre como resultado da produção aumentada de melanina na
4
presença de um número normal de melanócitos. Entretanto, nos lentigos simples
ocorre proliferação de melanócitos ativos (CAYCE et aI., 2004).
o melas ma é uma desordem comum de hiperpigmentação macular adquirida
que ocorre na maior parte das vezes em áreas da face e colo expostas ao sol.
Múltiplos fatores têm sido postulados na etiologia e patogenia, incluindo fatores
genéticos, altos níveis estrogênicos (gravidez, uso de contraceptivos orais), uso de
cosméticos, de medicamentos anticonvulsivantes e de drogas fototóxicas, raça e
doença auto-imune da tireóide. A influência genética e em especial a exposição ao
sol parecem ser fundamentais para seu desenvolvimento, na medida em que
aparece exclusivamente nas áreas expostas à radiação solar (GRIMES, 1995;
LAWRENCE et aI., 1997; KAUH; ZACHIAN,1999; PÉREZ-BERNAL et aI., 2000;
VICTOR et aI., 2004; CAYCE et aI., 2004).
Esta hipermelanose simétrica é caracterizada por manchas irregulares claras
a cinza amarronzadas, em locais envolvendo áreas expostas ao sol. Os três
padrões de melasma reconhecidos são centro facial, malar e mandibular, que
acometem regiões da testa, bochechas, nariz, queixo e sobre os lábios. Existem três
subtipos histológicos: epidérmico, com predominância de pigmento na epiderme
basal, suprabasal e na camada córnea, o qual é intensificado pelo exame à luz de
Wood1; dérmico, com macrófagos ou melanófagos carregadores de melanina numa
distribuição perivascular (na derme superficial ou profunda), o qual não é
intensificado com a luz de Wood, e o melasma misto. A classificação clínica dos
subtipos de melasma corresponde à classificação histológica, com o acréscimo do
melasma indeterminado, que é descrito em indivíduos de pele tipo VI (Quadro 1), no
qual o exame com a luz de Wood não é de nenhum auxílio. O melasma epidérmico
responde melhor à terapia tópica (GRIMES, 1995; LAWRENCE et aI., 1997; VICTOR
et aI., 2004).
Em comparação à pele normal, a pele com melasma apresenta um conteúdo
aumentado de melanina em todas as camadas da epiderme e na derme,
dependendo do tipo de melasma. Em adição, o número de melanócitos é maior e
1 Lâmpada ultravioleta, com pico em 365 nm, que permite realçar áreas pigmentadas da pele, bem como determinar a profundidade da lesão (PARASKEVAS et ai, 2005).
5
contém uma maior quantidade de melanossomos em estágio IV, em contraste com
os da pele normal (somente os melanossomos em estágio 111 e IV são capazes de
sintetizar melanina). As lesões de melasma apresentam melanócitos com um
número aumentado de organelas (mitocôndrias, complexo de golgi , retículo
endoplasmático rugoso, ribossomos, etc.) sugerindo uma maior capacidade de
produção dessas células. Além de uma maior síntese de melanossomos, parece
ocorrer também um aumento na transferência para os queratinócitos. A síntese de
tirosinase e de proteínas relacionadas é maior nas lesões de melasma (VICTOR et
aI., 2004).
Melasma é difícil de tratar (L1M, 1999). É uma doença terapeuticamente
desafiante, que afeta principalmente as mulheres, em especial a asiática; os homens
representam apenas 10% dos casos. Todos os grupos raciais são afetados, mas sua
prevalência é maior em indivíduos de compleição mais escura (tipos de pele de IV a
VI), e em mulheres de descendência hispânica que vivem em áreas de intensa
radiação ultravioleta. Dentre os negros, um estudo revelou que desordens de
pigmentação, como hiperpigmentação pós-inflamatória e melasma, são a terceira
causa de problemas de pele. No caso dos fatores desencadeantes, como gravidez e
uso de anticoncepcionais orais, o parto ou a descontinuidade do uso de tais
medicações pode não representar a solução do problema (GRIMES, 1995).
Quadro 1 - Classificação dos tipos de pele segundo Fitzpatrick (SCHMITT, 1992)
Tipo de pele classificação Reação ao sol
I Sensível Queima facilmente , nunca bronzeia
II Sensível Queima facilmente, bronzeia minimamente
111 Normal Queima moderadamente, bronzeia gradualmente
IV Normal Queima minimamente, sempre bronzeia
V Não sensível Raramente queima, bronzeia intensamente
VI Não sensível Nunca queima, profundamente pigmentada -
6
o tratamento é geralmente insatisfatório. Os tratamentos correntes envolvem
o uso de hipopigmentantes, "peelings" químicos e laser (GRIMES, 1995;
LAWRENCE et aI. , 1997; UM; THAM, 1997; CAYCE et aI. , 2004; VICTOR, et aI.,
2004).
Lentigos são distúrbios hiperpigmentares que compreendem uma vasta gama
de lesões como o lentigo simples, o lentigo maligno, nevus e o lentigo solar. Em
geral são lesões de cor marrom, circunscritas, e embora todas as formas de lentigo
apresentem algum grau de conteúdo aumentado de melanócito na epiderme,
apenas no lentigo simples esse aumento é característico. Por outro lado, os lentigos
solares são tipificados pela produção aumentada de melanina, por um leve aumento
do número de melanócitos e por não apresentarem qualquer tipo de atipia celular
(CAYCE et aI. , 2004).
Os lentigos solares são mais prevalentes com o aumento da idade e são
considerados um sinal da pele que sofreu dano solar. O sol, mais do que a idade, é
o agente causador, na medida em que tais lesões não aparecem na pele protegida
da exposição solar. Diferentes denominações têm sido dadas para essas manchas,
de aproximadamente 1 cm de diâmetro, refletindo sua relação com a idade e a
exposição crônica ao sol: sardas induzidas pelo sol, sardas de adulto, manchas de
idade, lentigos senis e lentigos actínicos (BAUMANN, 2002; BASTIAENS et aI. ,
2004).
Cerca de 90% dos pacientes com idade de 65 anos ou mais terão lentigo
solar. Os homens parecem ser mais atingidos. As costas da mão e a face são áreas
tipicamente afetadas, mas prevalecem no tronco. Lentigo solar nas costas parece
estar associado ao efeito cumulativo e intermitente da exposição ao sol e à
queimadura solar sofrida antes dos 20 anos e na infância. Na face, está associado
aos sinais cutâneos do fotoenvelhecimento, como elastose e queratose actínica. O
desenvolvimento de lentigo após terapia com psoralen UVA (PUVA) sugere um
papel para a luz ultravioleta A na etiologia do lentigo solar (BASTIAENS et aI. , 1999;
BAUMANN, 2002; BASTIAENS et aI., 2004).
As efélides ou sardas e os lentigos solares são tipos diferentes de lesões
pigmentares da pele. Ambas as lesões são indicadores de risco para câncer de pele
7
do tipo melanoma ou não melanoma. A associação com o fator idade é fortemente
positiva no caso do lentigo solar, mas comprovou ser negativa para as efélides. Elas
são menos prevalentes que os lentigos solares e tornam-se igualmente distribuídas
na face, braços e tronco. Ocorrem mais freqüentemente no sexo feminino, aparecem
na infância e diminuem com a idade e estão intimamente relacionadas com o
fenótipo de cabelo ruivo, ou seja, são geneticamente determinadas e provavelmente
necessitam da ocorrência de queimadura solar na juventude para se tornarem
visíveis. As efélides do rosto parecem não estar associadas com as lesões comuns
ao dano solar, como elastose e queratose actínica (BASTIAENS et aI., 1999;
BASTIAENS et aI. , 2004).
A hiperpigmentação pós-inflamatória pode ser causada por trauma, cirurgias,
queimaduras, esfoliação química, laser, irritação da pele e dermatoses, estando
freqüentemente relacionada à acne, eczema e reações alérgicas. Embora seja mais
freqüente em indivíduos de pele mais escura, pode afligir indivíduos de qualquer tipo
de pele. As manchas escurecidas são irregulares e aparecem em áreas previamente
inflamadas. Pode ocorrer um aumento da produção e da transferência da melanina
para os queratinócitos e um acúmulo de melanófagos na derme superior causado
pela destruição da camada basal da pele inflamada, que poderia explicar a
hiperpigmentação. Muitos mediadores do processo inflamatório são conhecidos por
estimular o melanócito (BAUMANN, 2002; STULBERG et aI. , 2003; CAYCE et aI.,
2004).
Embora possa ocorrer em qualquer parte do corpo, a hiperpigmentação pós
inflamatória causa estresse ao paciente quando surge na face. Com a resolução do
processo inflamatório a alteração pigmentar tende a normalizar. O tratamento, por
processos químicos ou físicos, é difícil em função de que tais agentes podem piorar
o quadro inflamatório (BAUMANN, 2002; STULBERG et aI., 2003).
2.2. Melanogênese e substâncias despigmentantes
A pigmentação nos mamíferos é importante em numerosos processos, mas
muito permanece desconhecido a respeito da função da melanina em certas partes
do cérebro, olhos e ouvidos, sua natureza foto protetora e sua determinação
8
fenotípica. A cor da pele e do cabelo depende da quantidade, tamanho e tipo da
melanina produzida pelos melanócitos (VIRADOR et aI., 1999).
A tirosinase ou polifenoloxidase, complexo de proteína ferro bifuncional,
largamente distribuído na escala filogenética, é responsável pela melanização em
animais e produção de pigmentos marrons em plantas. Três diferentes formas de
cobre binuclear no sítio ativo são envolvidos nas reações de hidroxilação de
monofenóis a o-difenóis (atividade creolase) e a oxidação de o-difenóis a o-quinonas
(atividade catecolase) (CABANES et aI., 1994; SEO et aI., 1999).
A tirosinase dos mamíferos catalisa os passos limitantes na biosíntese de
melanina, a hidroxilação do aminoácido L-tirosina a 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L
dopa) e a subsequente oxidação a dopaquinona. A dopaquinona formada passa por
um rápido e espontâneo rearranjo, levando a dopacroma e, finalmente ao polímero
de melanina. Ao menos duas outras enzimas melanossomiais estão envolvidas na
via de produção da eumelanina, que produz pigmento marron e preto, as quais são
DHICA-oxidase e a DOPAcromo tautomerase. A incorporação de reagentes
contendo enxofre, como cisteína ou glutationa, promove diferenciação da via de
produção para formação de eumelanina (pigmento marrom) ou feomelanina
(pigmento vermelho), ou ambas, conforme mostra o esquema na página a seguir
(BAUMANN, 2002; SLOMINSKI et aI. , 2004) .
A produção de melanina ocorre nos melanossomas, uma organela similar aos
lisossomos, sendo depois transferida dos melanócitos (células encontradas na
junção derme-epiderme) para os queratinócitos, e eventualmente desaparecendo
com a descamação da pele (CURTO et aI., 1999; SEO et aI., 1999; VIRADOR et aI.,
1999; SLOMINSKI et aI., 2004).
Várias desordens dermatológicas resultam no acúmulo de níveis excessivos
de pigmentação epidérmica. Essas hiperpigmentações incluem hiperpigmentação
pós-inflamatória, melasma, efélides e lentigos (CURTO et aI., 1999; SEO et aI.,
1999; VIRADOR et aI., 1999; BAUMANN, 2002; HALDER; RICHARDS, 2004;
CAYCE et aI., 2004).
o
HO ~ .... OH
~ I 'IH,
tirosinase ~ ~0
HO
L-OOPA (3,4-dihidroxi-L-fenilalanina)
L-tirosina 1 tims;" ...
/ o ~HOyO
HO ~/OH
>lill'"'-\~ o ~ OH
leucoOOPA croma
1 O
~ O N
: OH
O
I OOPA croma \ DOPA croma tautomerase
o~ OOPAquinona
HO~,~'õ
HO~ Hü& " o ~ N,
~) ~ II OH
OHI (dihidroxi indol)
I tirosinase e/ou -.lt peroxidase
OHICA (ácido carboxílico OHI)
1 DHICA oxidase
NH,
glutationa ou ~ cisteína
H." 4!~ 1 '"~ 1.," ::"... '$ - T
HH:OH
o
cisteinilOOPA
1 intermediários benzotiazínicos
1 FEOMELANINAS
Indol-5,6-quinona Indol-5,6-hidroquinona-2-ácido carboxílico
~ / EUMELANINAS
9
Esquema: síntese de melanina (adaptado de BAUMANN, 2002; SLOMINSKI et aI. ,
2004).
10
Complexos mecanismos genéticos, bioquímicos e hormonais estão
envolvidos na pigmentação da pele, os quais compreendem o controle
transcripcional da expressão da tirosinase, ativação da enzima, síntese e
transferência para os queratinócitos e taxa de renovação da pele (BRIGANTI et aI.,
2003; SLOMINSKI et aI., 2004; AGAR; YOUNG, 2005). Embora a literatura relate a
possibilidade de controle da pigmentação pelo uso de agentes que possam atuar em
qualquer um dos mecanismos envolvidos, a maior parte dos agentes
despigmentantes propostos atualmente agem por inibição (competitiva ou não
competitiva) da tirosinase, como substratos alternativos ou como quelantes de cobre,
co-fator da enzima (BRIGANTI et aI., 2003).
Vários agentes químicos como hidroquinona, arbutin, ácido kójico, tretinoína e
ácido azeláico, associados ou não a substâncias como ácido glicólico, ácido
salicílico, ácido tricloroacético, ou a corticosteróides, são usados correntemente no
tratamento de hiperpigmentações cutâneas (CABANES et aI., 1994; GRIMES, 1995;
LAWRENCE et aI., 1997; KAKITA; LOWE, 1998; COTELLESSA et aI., 1999; UM,
1999; CURTO et aI., 1999; VIRADOR et aI., 1999; GLADSTONE et aI., 2000;
PÉREZ-BERNAL et aI., 2000; HURLEY et aI., 2002; SARKAR et aI., 2002;
GUEVARA; PANDYA, 2003; COLEMAN; BRODY, 2003; BRIGANTI et aI., 2003;
HALDER; RICHARDS, 2004; STRATIGOS; KATSAMBAS, 2004; VICTOR et aI.,
2004; CAYCE et aI., 2004).
A hidroquinona, um derivado fenólico, inibe a conversão de dopa a melanina
por inibição da enzima tirosinase, atuando como substrato alternativo. É o mais
popular agente despigmentante, introduzido na clinica médica desde 1961. Vários
estudos têm demonstrado sua eficácia terapêutica sozinha ou em combinação com
outros compostos. Exerce sue efeito principalmente sobre melanócitos com intensa
atividade tirosinase, como os epidérmicos e é considerada um padrão de referência
para avaliação de outros agentes despigmentantes. Sob a forma de cremes
clareadores em concentrações de 2 a 4% ou superiores, é o produto mais
comumente utilizado para terapia do melasma e imperfeições pigmentares
caracterizadas por hiperpigmentação. Outros mecanismos de ação propostos para
este despigmentante são inibição da síntese de DNA e RNA, degradação dos
melanossomas, e destruição dos melanócitos. A eficácia da hidroquinona pode ser
aumentada quando usada em combinação com outros agentes como tretinoína 0,05
11
a 0,1%, por exemplo. Reações adversas associadas ao uso de hidroquinona incluem
complicações agudas e crônicas como irritação e dermatite de contato alérgica,
descoloração da unha, hiperpigmentação pós-inflamatória, hipopigmentação e,
raramente, despigmentação da área tratada e das regiões adjacentes. Mais
recentemente, tem sido atribuído ao uso crônico e em altas doses de hidroquinona o
surgimento de ocronose, um distúrbio desfigurante caracterizado pelo
desenvolvimento de lesões onduladas e acinzentadas na testa, bochechas e região
periorbital (GRIMES, 1995; HALDER; BRIGANTI et aI., 2003; RICHARDS, 2004).
Em função da toxicidade da hidroquinona (citotoxicidade frente aos
melanócitos, potencial mutagênico em células de mamíferos, e possível atividade
carcinogênica), outros compostos têm sido propostos para tratamento de
hiperpigmentações cutâneas, como exemplo o ácido kójico (GRIMES, 1995; CURTO
et aI., 1999; BRIGANTI et aI., 2003; STULBERG et aI., 2003; VICTOR et aI., 2004;
CAYCE et aI., 2004).
2.3. Ácido Kójico
O ácido kójico (5-hidroxi-2-hidroximetil-8-pirona), cujas características físico
químicas são apresentadas no Quadro 2, foi isolado do "koji", ou arroz maltado, no
início de 1900. Desde então tem sido conhecido por suas características
antibacterianas, como seqüestrador de metais pesados que aceleram reações de
oxidação, para tratamento do melanismo e inibição das enzimas que deterioram
produtos alimentícios.
Utilizado na indústria farmacêutica, cosmética e alimentícia, é produzido, por
mecanismos ainda não totalmente esclarecidos, pelo Aspergíllus flavus. Diferentes
espécies de Aspergillus são conhecidas por produzirem grandes quantidades de
ácido kójico. Acredita-se que sua fermentação ocorra por biotransformação direta da
glicose (EL SHARKAWY, 1995).
12
Quadro 2 - Características físico-químicas do ácido kójico (BUDAVARI, 1996).
substância Ácido kójico (5-hidroxi-2-(hidroximetil)-4H-pirano-4-ona
fórmula molecular C6 H6 0 4
fórmula estrutural
~OH HO I
o
massa molecular 142,11
ponto de fusão 153-154°C
solubilidade facilmente solúvel em água, etanol e acetona
pKa 7,9; 8,03
Usando tirosinase de cogumelo, Kahn (1995) verificou in vitro que o ácido
kójico inibe efetivamente a formação de pigmento e a incorporação de oxigênio
quando L-dopa, norepinefrina e dopamina são oxidadas pela enzima. O ácido kójico
também tem seu espectro UV-VIS alterado, devido à habilidade das o-qui nonas
destes substratos a oxidar o ácido kójico a um produto amarelo.
Curto et aI. (1999) estudaram in vitro a ação do ácido kójico sobre a enzima
tirosinase e encontraram IC50 (concentração responsável por 50% de inibição) de 6
Ilg/mL, contra 72 e 149 Ilg/mL para hidroquinona e arbutin, respectivamente,
demonstrando ser um potente inibidor. Entretanto, o ácido kójico não exerceu
inibição de pigmentação em cultura de melanócitos intactos, em concentrações
superiores a 200 Ilg/mL. No mesmo estudo, hidroquinona apresentou IC50 de 3,1
Ilg/mL para citoxicidade de melanócito, demonstrando ser altamente tóxica, sendo
que o ácido kójico apresentou IC50 maior que 200 Ilg/mL, confirmando sua baixa
13
toxicidade. Os autores especularam que o ácido kójico, um quelante de cobre, tem
atividade inibitória enzimática contra a enzima livre, mas pode falhar em atravessar
as membranas celulares existentes para inibir a enzima dentro do melanócito.
Virador et aI. (1999), estudaram a ação do ácido kójico, arbutin e hidroquinona
(0,04 a 0,1 mg/mL) em cultura de melanócitos. Todos os agentes tiveram significante
efeito inibitório na viabilidade e proliferação do melanócito, particularmente a altas
concentrações. Todos os três compostos diminuíram o conteúdo de melanina total e
inibiram a atividade enzimática melanogênica, embora os dados não tenham sido
correlacionados com o conteúdo de proteína, o que deve ser considerado em função
do crescimento dos melanócitos.
Nakajima et aI. (1998) verificaram o efeito do ácido kójico na pigmentação de
cultura de melanócitos normais humanos. O ácido kójico, em concentrações de 0,5 a
4 mmol. L-1, diminuiu a pigmentação.
Usando epiderme humana reconstruída, Bessou et aI. (1997), estudaram ex
vivo a ação do ácido kójico a 0,1 % e encontraram uma diminuição da pigmentação,
quando comparado com o controle. Os melanócitos apresentaram-se não
dendríticos, com uma diminuição do conteúdo de melanina.
Cabanes et aI. (1994) demonstraram que a inibição da atividade catecolase
da tirosinase pelo ácido kójico ocorre de uma maneira não clássica. Uma diminuição
na velocidade inicial, a um estado de inibição constante da velocidade, pode ser
observada após alguns minutos. Essa inibição tempo dependente, que é inalterada
pela incubação prévia da enzima com o inibidor, é compatível com uma transição de
primeira ordem. Os dados obtidos sugerem um mecanismo que envolve a formação
rápida de um complexo inibidor, que passa posteriormente a uma reação lentamente
reversível.
A inibição da atividade catecolase (oxidação de L-dopa a dopaquinona exibida
pelos três complexos di nucleares de cobre 11) pelo ácido kójico foi estudada por
BaUani et aI. (2000). O mecanismo de ação da atividade catecolase ocorre em duas
etapas e para ambas a inibição pelo ácido kójico se dá de modo competitivo. O
inibidor se liga fortemente ao complexo di-cobre II da enzima em uma primeira etapa
e, após, ao complexo di-cobre/di-oxigênio em uma segunda etapa, prevenindo em
14
ambos os casos a ligação do substrato catecol. Os autores concluíram que o ácido
kójico atua fazendo "pontes" como ligante entre os centros metálicos do complexo di
cobre" na enzima.
Moon et aI. (2001) e Ahn et aI. (2003) estudaram a ação do ácido kójico sobre
o fator nuclear kappaB (NF-kappaB) em cultura de queratinócitos modificados. A
exposição das células da pele, particularmente os queratinócitos, a vários
ativadores como interleucina-1 , lipopolissacárides, fator alfa de necrose de tumor e
luz ultravioleta, levam à degradação da proteína inibitória IkappaB. O NF-kappaB
liberado é translocado ao núcleo onde pode mudar ou alterar a expressão de genes
alvos, resultando na secreção de sinalizadores extracelulares melanotróficos que
alteram a atividade do melanócito. Os autores incubaram inibidores de
melanogênese como ácido kójico, ácido glicólico, arbutin, hidroquinona e outros com
os queratinócitos modificados, os quais foram posteriormente irradiados com luz
ultravioleta B (UVB). A ativação do NF-kappaB foi medida por método de detecção
por fluorescência. O ácido kójico foi o inibidor mais potente da ativação do NF
kappaB mediada pela regulação UVB e inibiu a síntese de um dos fatores
melanotróficos ativados. Os resultados sugeriram que a ação despigmentante do
mesmo não está apenas relacionada à sua capacidade de inibição da tirosinase.
Garcia e Fulton (1996) relataram que 39 pacientes com melasma foram
tratados com ácido kójicolácido glicólico de um lado da face e com
hidroquinona/ácido glicólico, em um veículo similar, do outro lado. Os resultados
foram documentados por exame à luz de Wood combinado com fotografia com luz
ultravioleta. Responderam igualmente a hidroquinona e ácido kójico 51 % dos
pacientes; 28% dos pacientes tiveram uma maior redução na pigmentação no lado
tratado com o ácido kójico, enquanto 21 % obtiveram uma melhora mais dramática
com a hidroquinona (diferença estatisticamente não significativa). A preparação
contendo ácido kójico foi mais irritante. Os autores concluíram que ambos os
tratamentos foram altamente efetivos.
Com o propósito de avaliar a eficácia de "peelings" de ácido tricloroacético e
de ácido glicólico associado a ácido kójico, no tratamento de hiperpigmentações
cutâneas, Cotellessa et aI. (1999) trataram 20 pacientes com melasma difuso com
uma solução composta de 50% de ácido glicólico e 10% de ácido kójico, enquanto
15
20 pacientes com hiperpigmentação localizada (Ientigos) foram tratados com 15-25%
de ácido tricloroacético. Completa regressão do melasma difuso foi observada em
30% dos pacientes, regressão parcial em 60% dos pacientes e nenhuma regressão
em 10% dos pacientes tratados com a solução ácido glicólico/ácido kójico. Completa
regressão dos lentigos foi observada em 40% dos pacientes, regressão parcial em
50% dos pacientes e nenhuma regressão em 10% dos pacientes tratados com ácido
tricloroacético, tendo os autores concluído que ambos os "peelings" podem ser
considerados efetivos.
Lim (1999) avaliou, em 40 mulheres chinesas com melasma epidérmico, a
ação de um gel contendo 2% de ácido kójico, 10% de ácido glicólico e 2% de
hidroquinona, usados em um lado da face, quando comparada à mesma formulação,
mas sem o ácido kójico, aplicada no outro lado da face. A partir de dados clínicos,
obtidos até 12 semanas de tratamento, os autores verificaram que o lado que
recebeu o ácido kójico foi melhor. O melasma clareou em 60% dos pacientes que
usaram a formulação contendo o ácido kójico, contra 47,5% dos pacientes que
usaram a fórmula sem o ácido kójico. Os efeitos colaterais, vermelhidão, ardência e
esfoliação se manifestaram em ambos os lados da face, mas regrediram na terceira
semana.
Dessa maneira, o ácido kójico, associado ou não a agentes esfoliantes, tem
sido proposto para o tratamento de hiperpigmentações cutâneas, em função da
eficácia apresentada e por apresentar-se mais estável quimicamente do que a
hidroquinona (BRAVO; PABLO, 1997).
Produtos contendo ácido kójico constituem diversas patentes de companhias
asiáticas e européias. Os produtos mencionam o uso do ácido kójico em
concentrações de 0,01 , 0,05, 0,1, 0,5, 0,6, 1, 2, 3, 4 e 6%, na forma de soluções
aquosas, loções, cremes, emulsões múltiplas, gel, base para maquiagem,
antitranspirantes, dentifrícios, adesivos clareadores para os dentes e enxaguatórios
bucais (IZUMIDA et aI. , 1990; KAMEYAMA et aI., 1991 ; ONIZUKA, 1995; ARNAUD
SEBILLOTTE; SEGOT, 1995; YOKOGAWA et aI., 1997; HIKIMA, 1997; FURUYA,
1989; GERNY, 1998; SUZUKI; ONO, 1998; INOUE et aI., 1990; SANO; WATANABE,
1999; HAYASHI; TAKEI, 1999a; HAYASHI; TAKEI, 1999b; WATANABE; OHSATO,
1999; MAEDA; NAGANUMA, 2000; HONDA, 2000a; HONDA, 2000b).
16
Diversos autores têm estudado a toxicidade do ácido kójico. Camundongos ou
ratos submetidos à dieta contendo ácido kójico (em concentrações de até 4%)
sofrem um aumento do peso da tireóide (com formação de adenomas), redução dos
níveis de T3 e T4 e aumento do TSH sangüíneo. A função tireoideana é interrompida
primariamente pela inibição da incorporação de iodo pela glândula, causando uma
diminuição de T3 e T4 no soro, sendo o aumento dos níveis de TSH responsáveis
pela hiperplasia da glândula, efeito reversível com a suspensão da dieta (FUJIMOTO
et aI. , 1998; FUJIMOTO et aI. , 1999; MITSUMORI et aI., 1999; TAMURA et aI.,
1999).
Nohynek et aI. (2004) realizaram um amplo estudo sobre a genotoxicidade do
ácido kójico usando cepas de bactérias (E. coli, S. typhimurium e Salmonella ssp.),
células de mamíferos, queratinócitos e hepatócitos humanos, para avaliar sua
mutagenicidade, capacidade de provocar aberrações cromossômicas ou alterações
dos componentes do sangue, além de determinar a toxicidade sub crônica após
administração por via oral a 1 % em ratos ou tópica a 0,5%. Os autores também
realizaram estudo in vitro de absorção percutânea em pele humana e
farmacocinético (absorção, metabolismo, distribuição e excreção) em ratos, após
dose única oral , subcutânea ou dérmica (creme a 1 %). A partir dos resultados foi
sugerido que os níveis de exposição sistêmica no homem após aplicação tópica são
da ordem de 0,03-0,06 mg/kg/dia. Os autores concluíram que o uso tópico do ácido
kójico como agente clareador resulta em negligenciável ou nenhum risco de
genotoxicidade ou toxicidade para o consumidor.
O ácido kójico é comercializado como cosmético de venda livre em países da
América do Norte, sob a forma de cremes, géis e loções tópicas clareadoras da pele.
2.4. Ácido Glicólico
O ácido glicólico, cujas características físico-químicas estão relacionadas no
Quadro 3, é o menor de um grupo de ácidos orgânicos naturais, conhecidos como
alfa-hidroxi ácidos (THIBAULT et aI., 1998). É o mais popular dos ácidos extraídos
de frutas, usado em concentrações que variam de 5 a 15%. Concentrações
superiores são usadas em "peelings" químicos (MANALOTO; ALSTER, 1999).
17
É usado topicamente, em baixas concentrações, para reduzir a espessura do
extrato córneo hiperqueratinizado, mediada pela diminuição da coesão dos
corneócitos. Tal propriedade permite seu uso clínico no controle da pele seca, da
icitiose, da hiperqueratose folicular e outras condições que afetam essa estrutura da
pele. Quando aplicado em altas concentrações, acima de 12-15%, causa
epidermólise, podendo ser usado profissionalmente para o tratamento de queratoses
seborrêicas, manchas de idade, queratoses actínicas, verrugas vulgares, condições
estas associadas tanto à hiperplasia epidérmica quanto à retenção do extrato córneo
(VAN SCOTT; YU, 1989; MANALOTO; ALSTER, 1999).
Quadro 3 - Características físico-químicas do ácido glicólico (BUDAVARI, 1996;
POURCHET, 1975).
Substância ácido glicólico (ácido hidróxi acético)
fórmula molecular C2H403
fórmula estrutural HOII
OH
° massa molecular 76,05
ponto de fusão 77-79°C
solubilidade facilmente solúvel em água, metanol , etanol e acetona
pKa 3,83
pH sol. aquosa 2% = 2,16/ sol. aquosa 5% = 1,91 - - ----- -
18
Estudos in vitro mostraram que o ácido glicólico causa um aumento da
produção de colágeno pelos fibroblastos (THIBAULT et aI., 1998), de
glicosaminoglicanos e possivelmente, de elastina (MANALOTO; ALSTER, 1999).
o uso de creme contendo ácido glicólico a 5%, não neutralizado, por 3
meses, promoveu significativa redução de lentigos e hipermelamose induzida pelo
sol. Os autores creditam os resultados a diversos fatores como: a possibilidade de o
ácido glicólico remover a pigmentação excessiva pela maior proliferação de células
normais abaixo da lesão, pelos queratinócitos conterem menos melanossomas em
uma epiderme hiperproliferativa, pelo afinamento do extrato córneo, que
indiretamente clareia a pele uma vez que cada camada de corneócitos contém
melanina, pelo aumento da dispersão do pigmento e ainda, por uma possível ação
direta do ácido glicólico sobre a tirosinase, inibindo a formação de melanina
(THIBAUL T et aI., 1998; MANOLO; ALSTER, 1999; USUKI et aI., 2003;
STRATIGOS; KATSAMBAS, 2004).
Em 1996 o "Cosmetic Ingredient Review Expert Panel" concluiu que os alfa
hidroxi ácidos são seguros para uso em cosméticos a concentrações que não
excedam os 10%, com pH não inferior a 3,5, a fim de se evitar maior sensibilidade
da pele ao sol (BERGFELD et aI., 1998; JOHNSON et aI. , 2000).
2.5. Desenvolvimento de formulações contendo ácido kójico
A estabilidade de uma formulação farmacêutica está relacionada não só à
estabilidade intrínseca do fármaco (estabilidade química), como também à forma
farmacêutica que o veicula (estabilidade física). Além disso, a interação entre os
constituintes de uma formulação pode levar ao aparecimento de incompatibilidades,
que resultam em perda da eficácia ou segurança do produto.
Segundo Ha et aI. (1998), o ácido kójico possui instabilidade sob luz, pH e
temperatura. É incompatível com agentes oxidantes fortes, sofre degradação em pH
9,0-10,0, sendo estável em pH 3,0 e 5,0 (SHINSHI et aI., 1984).
19
Lan (1998), propôs, sob a forma de patente, que a oxidação de cosméticos
clareadores pode ser inibida acondicionando-se o ácido kójico e o creme base em
embalagens separadas, sendo as preparações estáveis por dois anos.
Patente de autoria de Yamamoto (1988), registra que o uso de ácido kójico
purificado pelo método de sublimação, quando formulado em creme, não mostrou
alteração de cor por 20 dias, enquanto um creme controle contendo ácido kójico
purificado pelo método padrão escureceu em 5 dias.
A patente de Onizuka (1995), menciona o desenvolvimento de uma emulsão
múltipla óleo/água/óleo incorporada de ácido kójico e/ou seus derivados na fase
aquosa, com a finalidade de melhorar a estabilidade da emulsão.
Patente de autoria de Inoue et aI. (1997), menciona a formulação de
cosméticos clareadores contendo ácido ascórbico ou seus derivados, hidroquinona
glucosídeo ou seus derivados e/ou ácido kójico e seus derivados, além de outros
constituintes, adicionados de agentes estabilizadores como quelantes de metal ,
sulfitos, bissulfitos, tiossulfatos ou pirossulfitos. As preparações foram resistentes à
luz.
Um creme contendo ácido kójico e uma triazina que absorve na região UV-B
usada como estabilizante, foi armazenado a 50°C por dois meses e quase não
mostrou descoloração e precipitação da triazina, segundo patente de autoria de
Honda (1997).
Uma solução aquosa tópica contendo ácido kójico 1 %, ácido salicílico 1,5%, e
dietilenoglicol monoetil éter 25%, como solvente do ácido salicílico e para aumentar
a penetração do ácido kójico pela pele, foi adicionada ainda de citrato de sódio
4,5%, ácido cítrico 6%, Na2S20s 0,25%, com pH final de 3,4, segundo patente de
Sakoda e Toyama (1998).
De acordo com Su et aI. (1999), a adição de bissulfito de sódio a um creme
contendo ácido kójico preveniu sua instabilidade.
No Brasil, não há produtos farmacêuticos ou cosméticos industrializados a
base de ácido kójico, associado ou não a ácido glicólico. O seu uso se dá a partir de
prescrições dermatológicas, preparadas em farmácias de manipulação.
20
Não há relatos na literatura a respeito da estabilidade do ácido kójico
associado a ácido glicólico, quando veiculado nas bases farmacêuticas
habitualmente usadas no Brasil para incorporá-los, como base autoemulsionante
aniônica (álcoois graxos superiores associados a lauril sulfato de sódio), base
autoemulsionante não iônica (álcoois graxos superiores associados a álcool
etoxilado) ou géis não iônicos.
Em função do caráter ácido de ambos, que pode representar existência de
incompatibilidade com constituintes do veículo, em especial com agentes emulsivos
e outras substâncias sujeitas à degradação ou perda de atividade em pH ácido (por
exemplo, ésteres emolientes), e da necessidade de selecionar adjuvantes
adequados, torna-se relevante o desenvolvimento e a determinação da estabilidade
de formulações contendo ácido kójico, associado ou não a ácido glicólico.
2.6. Métodos de quantificação do ácido Kójico
Majmudar et aI. (1998), usando uma coluna octil dodecil silanol (OOS) 150 x
4,5 mm (Metachem® 0297), dosaram ácido kójico em preparações aquosas ou
anidras, por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando detector de
fotodiodo a 254 nm. As amostras foram diluídas com água:acetonitrila (50:50 v/v) e a
fase móvel consistiu de água:acetonitrila (20:80 v/v).
Kimura et aI. (2000) desenvolveram um método para dosagem de ácido kójico
em alimentos. O ácido foi extraído com metanol 50% e filtrado, após centrifugação,
em uma membrana de 0,45 I-lm. A separação foi realizada por cromatografia líquida,
usando-se uma coluna OOS, tendo como fase móvel fosfato monobásico de sódio
0,1 moI. L-1 : metanol (97:3 v/v) e detector de fotodiodo. As taxas de recuperação de
ácido kójico inoculado em alimentos ao nível de 0,10 g/kg foram de 73-96% e o limite
de detecção foi de 0,005 g/kg.
Sottofattori e Anzoldi (2000) dosaram ácido kójico por CLAE em um creme
contendo parabenos, triclosan e gama-orizanol, separados em uma coluna
cianopropil (20 cm x 4,6 mm) por gradiente de eluição com metano I até 90% e
detector de fotodiodo em comprimento de onda de 220 a 240 nm. Separações
21
satisfatórias foram também alcançadas usando uma coluna LiChroCART -CN® (25
cm x 4 mm). Para separação da amostra, o creme foi misturado com THF/tampão
fosfato 25 mmol. L-1 pH 3,5 (3:7 v/v) e a suspensão homogênea foi analisada
satisfatoriamente sem posterior pré-tratamento.
Ácido kójico extraído de alimentos com Na2S04 e acetona foi analisado por
cromatografia líquida em coluna OOS (25 cm x 4,6 mm), operada a 40°C em
gradiente linear (1 mLlmin) com 0,1% de ácido propiônico (100 a 20%) e metanol,
com detecção a 270 nm. O método mostrou linearidade para a faixa de
concentração de 1 a 50 jJg/mL. Usando o método de adição de padrão, a taxa de
recuperação foi de 78,S a 90,4% (SATO et aI., 2000).
Masse et aI. (2001) analisaram cosméticos contendo ácido kójico e arbutin por
cromatografia líquida, usando coluna diol (fase normal) 250 x 4,6 mm, tendo como
fase móvel acetonitrila : KH2P0450 mmol. L-1 pH 2,5 (70:30 v/v). A amostra foi
extraída com acetonitrila, dispersada em ultra-som e filtrada em membrana de 0,45
I-lm ou centrifugada a 4.000 rpm por 20 minutos. A detecção (detector de fotodiodo)
ocorreu a 270 nm para o ácido kójico. O tempo de retenção foi de 3,4 minutos. A
curva de calibração foi construída com concentrações de 9,375 jJg/mL a 150 I-lg/mL,
mostrando desvio padrão relativo (OPR) de 0,09 a 1,85% e coeficiente de
determinação (~) igual a 0,998. A precisão do método em amostras comerciais
apresentou OPR de 0,4% e 6,77%.
Usando uma coluna Intertsil® OOS 150 x 1, O mm Shih (2001) quantificou
ácido kójico e fosfato de ascorbil magnésio em cosméticos clareadores. A detecção
do ácido kójico ocorreu a 254 nm (detector de fotodiodo), em eluição isocrática. A
mistura tampão Na2HPOJH3P04 50 mmol. L-1 pH 5,0 com brometo de
tetrabutilamônio (TBABr) 0,5 mmol. L-1 : metanol (95:5) foi usada como fase móvel. A
amostra foi extraída com água destilada e filtrada em membrana de 0,22 I-lm. A
curva de calibração foi construída com concentrações de 0,05 a 100 I-lg/mL, com
coeficiente de regressão linear (r) de 0,999. A precisão do método apresentou OPR
de 2,19, 0,38 e 0,31% para concentrações de 1, 10 e 100 ppm de ácido kójico,
respectivamente. A precisão em amostra comercial creme foi de 0,62% OPR e as
taxas de recuperação variaram de 95,18 ± 0,99 a 101,82 ± 2,10% para creme e de
97,65 ± 0,52 a 103,80 ± 1,59% para loção.
22
Outros métodos, como análise por voltametria (SHIH; ZEN, 1999),
cromatografia gasosa com detector de captura de elétrons (MANABE et aI., 1988) e
cromatografia de exclusão em gel (YAMAMOTO et aI., 1997) são mencionados.
A revisão da literatura mostrou não haver, até o presente momento,
metodologia validada de doseamento do ácido kójico por espectrofotometria UV-VIS.
2.7. Métodos de quantificação do ácido glicólico
Para avaliar a estabilidade de ácido glicólico e ácido láctico em sistemas
aquosos, De Villiers et aI. (1997) usaram análise por CLAE em uma coluna Micro
Bondapack® ODS 25 x 3,9 mm com fase móvel NH4H2P04 3 mmol. L-1 : acetonitrila
(60:40) e detecção a 214 nm. Concentrações de 200 a 1000 IJg/mL de ácido glicólico
foram usadas para a curva de calibração que teve coeficiente de correlação de
0,9999.
Scalia et aI. (1998) desenvolveram um método para determinação de ácido
glicólico em produtos cosméticos por CLAE de fase reversa, usando pareamento
iônico. Após dissolução em THF-H20 (90:10 v/v) as amostras foram extraídas em
fase sólida (cartucho SAX) e analisadas diretamente em uma coluna Ultrasphere®
ODS 150 x 4,6 mm. A detecção ocorreu a 210 nm, e a fase móvel usada foi tampão
fosfato de sódio 25 mmol. L-1 pH 7,2: metanol (98:2 vlv) contendo iodeto de
tetrabutilamônio (TBAI) 2 mmol. L-1. O ácido glicólico eluiu em 4,1 minutos. A curva
de calibração, com concentrações de 15 a 500 IJg/mL de ácido glicólico foi linear
com coeficiente de correlação linear de 0,998. O método foi considerado preciso em
níveis que variaram de 1,5 a 5,4% de DPR para amostras comerciais. A taxa de
recuperação de ácido glicólico em creme e gel variou de 92,4 a 96,2%.
Um método de determinação de alfa hidróxiácidos em cosméticos por CLAE
foi proposto por Hempel (1998). O autor usou coluna LiChrospher® 100 C-8
capeada, 250 x 4 mm, e gradiente de eluição de 10 a 100% de KH2POJH3P04 10
mmol. L-1 adicionado de 1,5 mLlL de TBA 1 moI. L-1, pH 2,3 (solvente B) em solvente
A (mesmo sistema com pH ajustado para 2,7), em temperatura de 40°C. A detecção
foi a 210 nm.
23
Usando coluna OOS Micro Bondapack® 25 x 3,9 mm, Oe Villiers et aI. (1998)
determinaram ácido glicólico em cremes não iônicos por CLAE, usando como fase
móvel KH2POJH3P04 0,01 mmol. L-1 pH 2,25 : acetonitrila (60:40). A detecção
ocorreu a 214 nm, com tempo de retenção de 11 minutos. O coeficiente de
correlação (r) do método foi de 0,9998 para a faixa de concentração de 50 a 100
f.Jg/mL e de 0,9999 para 200 a 1000 j.Jg/mL. A recuperação de amostra sintética
adicionada de padrão foi de 99,6% (0,6% OPR). Amostras do creme foram
analisadas quanto à precisão do método e mostraram OPR de 0,42%.
Yates e Havery (1999) descreveram um método para determinação de ácido
glicólico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido salicílico, fenol , resorcinol , ácido alfa
hidroxioctanóico e ácido alfa hidroxidecanóico em cremes e loções cosméticas. Os
componentes foram extraídos em fase sólida, filtrados e submetidos à cromatografia
líquida em coluna Prodigy® Ca com capeamento, 250 x 4,6 mm. A análise foi feita a
210 nm, usando NH40H/H3P04 100 mmol. L-1 pH 2,5 como fase móvel. A taxa de
recuperação de ácido glicólico em uma formulação de creme foi da ordem de 93%.
NicoleUi et aI. (1999a) descreveram um método para determinação por CLAE
de ácidos glicólico, láctico e tartárico em cosméticos, empregando uma coluna OOS
Alltech Altima® 250 x 2,1 mm, usando como fase móvel tampão fosfato 10 mmol. L-1
adicionado de cloreto de tetrabutilamônio (TBACI) 10 mmol. L-1, pH 2,2. A detecção
foi a 210 nm. As amostras foram extraídas com metanol, dispersas em ultra-som e
filtradas em membrana de 0,22 j.Jm. O tempo de retenção do ácido glicólico foi de
4,31 minutos com OPR de 0,64%. A curva de calibração foi obtida com
concentrações de 92 a 736 f.Jg/mL demonstrando linearidade (coeficiente de
correlação igual a 0,99996). Concentrações conhecidas de padrão foram
recuperadas da amostra em níveis de 98,21 a 101,51 %.
NicoleUi et aI. (1999b) descreveram um método para determinação por CLAE
de ácidos glicólico, láctico e tartárico em cosméticos, empregando uma coluna OOS
Alltech Altima®, usando como fase móvel tampão fosfato 10 mmol. L-1 adicionado de
TBACI 5 mmol. L-1, pH 2,2.
Usando coluna OOS Capcell® PAK UG 120S 250 x 4,6 nm, Huang et aI.
(2002) propuseram um método para determinação de alfa hidróxiácidos em
24
cosméticos. A fase móvel consistiu de H3P04 2% pH 2,0 ajustado com NH40H e a
detecção se deu a 210 nm. As amostras foram extraídas em água, sonicadas,
centrifugadas e filtradas em membrana de 0,45 I-Im. A curva de calibração foi
construída com concentrações na faixa de 25 a 500 I-Ig/mL usando padrão interno
(ácido malêico) a 2 I-Ig/mL, com r de 0,9994 para o ácido glicólico. O tempo de
retenção foi de 6,4 minutos. A taxa de recuperação em amostra sintética contendo
ácido glicólico foi da ordem de 98,2 a 100,0%, (0,95% OPR).
Couch e Howard (2002) desenvolveram um método de quantificação de ácido
glicólico por CLAE de fase reversa, usando uma coluna OOS Prodigy® 250 x 4,6
mm. A fase móvel consistiu de tampão NH4H2P04 50 mmol. L-1 pH 3,0 em gradiente
de eluição até a proporção de 1: 1 com acetonitrila. Um creme contendo ácido
glicólico a 10% foi extraído em fase sólida (cartuchos SAX) e submetido à análise. O
tempo de retenção do ácido glicólico, detectado a 210 nm, foi de 11 minutos. O
método foi linear na faixa de 23,1 a 462 I-Ig/mL, com coeficiente de correlação de
0,998. A recuperação de padrão em amostra sintética foi de 100,1 a 109,8% (média
de 104,2 ± 4,1%).
Chang e Chang (2003) propuseram a determinação de agentes
branqueadores hidrofílicos em cosméticos por CLAE, usando coluna OOS Mightysil®
GP 250 x 4,6 mm e fase móvel KH2P04 5 mmol. L-1 adicionada de hidróxido de
tetrabutilamônio (TBAH) 10 mmol. L-1 pH 2,5 : metano I (90:10). O tempo de retenção
do ácido glicólico a 220 nm foi de aproximadamente 3 minutos. O coeficiente de
correlação da curva de calibração (8 a 36 mg/mL) foi de 0,9974. A precisão para
amostra comercial contendo o ácido foi de 2,2% OPR. A taxa de recuperação de
padrão adicionado a amostra sintética variou de 99,6 a 100,1 %.
Outros métodos de determinação de ácido glicólico por CLAE em alimentos e
amostras biológicas são mencionados (ACCORSI; BLO, 1991; BUENO et al.,1997;
DEL NOZAL et aI., 1998; NARAYANAN et aI., 1999) além dos que reportam o uso de
eletroforese capilar, cromatografia gasosa-espectrometria de massas ou outros
métodos para sua determinação em soro, alimentos ou bebidas alcoólicas (PORTER
et aI., 1999; NG et aI., 2000; TSIAFOULlS et aI., 2002; VORARAT et aI., 2002; VAN
HEE et aI., 2004; SHAO; GIESE, 2004).
25
2.8. Métodos utilizados no presente trabalho
2.8.1. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A cromatografia pode ser conceituada como um "método físico-químico de
separação, no qual os constituintes da amostra a serem separados são
particionados entre duas fases, uma estacionária, geralmente de grande área, e a
outra um fluído insolúvel na fase estacionária, que percorre a primeira". A fase
estacionária, ou adsorvente, tem tomado várias formas no decorrer do tempo,
incluindo papel, camada delgada de sólidos sobre placa de vidro, líquidos
imobilizados, géis e partículas sólidas empacotadas em colunas. O componente que
flui, ou fase móvel, é um líquido ou um gás (WESTON; BROWN, 1997; CIOlA,
1998).
A separação cromatográfica é o resultado de interações específicas entre as
moléculas da amostra e as fases móvel e estacionária. Uma vez que a migração
diferencial é dinâmica e depende do equilíbrio de distribuição de cada componente
entre a fase móvel e a fase estacionária, a composição de ambas as fases e a
temperatura de separação serão as variáveis que afetarão o processo. A mobilidade
exibida pelo soluto dar-se-á em função de diferenças na adsorção, partição,
solubilidade, pressão de vapor, tamanho da molécula ou densidade de carga iônica
(CASS; DEGANI, 2001; USP 2005).
Na cromatografia líquida de alta eficiência, surgida na década de 60, a
enorme variedade de fases estacionárias disponíveis (colunas) e a ampla faixa de
temperatura utilizada permitem uma grande variação no tipo de interação específica,
multiplicando as possibilidades de separação. O método permite o uso de vários
tipos de detectores (UV-VIS, PDA, eletroquímico, fluorescência, índice de refração,
espectrometria de massas, etc) e a amostra pode ser facilmente recuperada. O uso
da alta pressão, necessária em função do tamanho das micropartículas utilizadas (3-
5 IJ), menos permeáveis em comparação com as usadas na cromatografia líquida
clássica, permite separações melhores e mais rápidas (SNYDER et aI., 1997).
A sílica-gel é a matéria-prima mais importante das fases estacionárias usadas
na ClAE. É um material versátil , podendo ter sua superfície alterada por derivação
química dos grupos silanóis, possibilitando o surgimento das fases ligadas polares
26
(ciano, diol e amino, etc.) ou apoiares (butila, octila ou Cs, octadecila ou C1S, etc.).
Tradicionalmente as fases ligadas não polares são conhecidas por fases reversas. A
cromatografia de fase reversa é o modo mais largamente empregado e envolve a
separação de compostos com base na sua hidrofobicidade, por meio do uso de uma
fase estacionária não polar e de uma fase móvel polar. Assim, a diminuição da
polaridade da fase móvel é acompanhada da diminuição da retenção do soluto
(WESTON; BROWN, 1997).
A derivação química, por razões estéricas, não atinge todos os grupos
silanóis. Os silanóis livres restantes ou silanóis residuais, com carga negativa,
podem interferir com a separação de compostos de caráter básico, promovendo o
rabeamento dos picos. Além disso, fases móveis acima de pH 8 podem reagir com
os silanóis residuais o que provoca a dissolução da sílica. Atualmente já existem no
mercado colunas cujos silanóis residuais sofreram um processo de capeamento
químico com grupos polares menores ("end-capping"), que permitiu seu uso numa
ampla faixa de pH e conferiu considerável estabilidade química (CASS; DEGANI,
2001; SILVA, et aI., 2004).
Separações de compostos iônicos tendem a ser mais complexas que a de
moléculas neutras. A maior parte das substâncias farmacêuticas e cosméticas
contém funções ionizáveis como ácidos carboxílicos e amino grupos. A separação
de compostos ionizáveis pode ser conseguida por supressão iônica (uso de tampão
na fase móvel e controle do pH a fim de deslocar o equilíbrio da dissociação da
espécie para a forma não dissociada ou mais hidrofóbica, aumentando assim a
retenção nas colunas de fase reversa), por pareamento iônico ou usando-se colunas
de troca iônica (WESTON; BROWN, 1997; CASS; DEGANI, 2001).
No caso de substâncias de caráter ácido, como as usadas no presente
trabalho, a supressão iônica só é possível usando-se um pH na fase móvel inferior
ao valor do pKa dos compostos envolvidos na separação, ou seja, tampão com pH
ácido, muitas vezes agressivo, o que pode restringir a técnica dependendo do tipo
de coluna utilizada (HEINISCH; ROCCA, 2004).
Na cromatografia de pareamento iônico o pH da fase móvel é ajustado de
forma a "encorajar" a ionização da amostra. A retenção é alcançada pela introdução
27
de um reagente de pareamento iônico no eluente, uma molécula orgânica dotada de
carga positiva (separação de ácidos) ou de carga negativa (separação de bases). A
amostra interage com o contra-íon do pareador e o par iônico formado terá maior
afinidade pela coluna de fase reversa em função da hidrofobicidade da cadeia
carbônica do reagente pareador (SNYDER et aI. , 1997).
Alguns mecanismos são postulados na tentativa de explicar a forma como
ocorre a interação entre pareador, analito e fase estacionária. Além de outros mais
complexos (formação de micelas, complexação), os mecanismos fundamentais
envolveriam a interação do pareador com o analíto ionizado já na fase móvel e a
posterior partição do par não carregado com a fase estacionária elou então a
interação do pareador com a fase estacionária, expondo sua carga para a superfície
e a posterior interação do analíto de carga oposta que passa pela coluna, o que se
assemelharia com o mecanismo da cromatografia de troca iônica (GLOOR;
JOHNSON, 1977; SNYDER et aI. , 1997; WAKSMUNDZKA-HAJNOS, 1998).
Na cromatografia de pareamento iônico a retenção e separação são
influenciadas pelo pH e concentração do tampão, tamanho e concentração do
reagente de pareamento, tipo e concentração do solvente orgânico e fase
estacionária utilizada (GLOOR; JOHNSON, 1977; SNYDER et aI. , 1997).
2.8.2. Espectrofotometria derivada no ultravioleta (UVO)
A espectroscopia na região do ultravioleta e visível (UV-VIS) compreende o
espectro eletromagnético que vai de 160 a 780 nm. A absorção molecular
espectroscópica está baseada na medida da transmitância T ou da absorbância A
de uma solução, contida em uma célula transparente, tendo um caminho óptico de b
centímetros. A concentração de um analito absorvente c é linearmente relacionada à
absorbância, como dado pela equação que representa matematicamente a lei de
Beer (SKOOG et aI., 2002):
A = - log T = ebc
A medida da absorção baseada na radiação UV-VIS encontra larga aplicação
na determinação quantitativa de uma grande variedade de compostos orgânicos e
28
inorgânicos. As variáveis que influenciam o espectro de absorção de uma substância
incluem a natureza do solvente empregado, o pH da solução, a temperatura, a
concentração de eletrólitos e os componentes da amostra (SKOOG et aI. , 2002).
Embora tenha grande aplicação na química analítica, por se tratar de um
método instrumental de relativa simplicidade e baixo custo, a maior parte dos
métodos espectrofotométricos UV-VIS refere-se à determinação de amostras
contendo um único componente. A análise de sistemas multicomponentes é uma
limitação da técnica, que tem sido contornada pelo uso de métodos de separação,
em especial os cromatográficos, os quais consomem mais tempo e são mais
dispendiosos (THOMAS, 1996).
Com o desenvolvimento da espectroscopia acoplada a computadores, foi
possível o desenvolvimento de técnicas que permitiram a análise direta de misturas,
dentre as quais pode-se citar a espectrofotometria derivada.
A espectrofotometria derivada UV-VIS envolve a transformação matemática
da curva espectral promovendo uma abordagem alternativa à análise de amostras
mais complexas como medicamentos, cosméticos e matrizes biológicas
(KARPINSKA, 2004).
o termo espectrofotometria derivada se refere à técnica de medida espectral
na qual a inclinação do espectro, isto é, a taxa de alteração da absorbância que
ocorre com a mudança do comprimento de onda durante a varredura, é medida em
função do comprimento de onda. A derivação do espectro original (zero-ordem) dá
origem ao espectro de primeira derivada, que após derivação originará o de segunda
derivada e assim, sucessivamente (PERKAMPUS, 1992):
dAldÀ, d2A1dÀ2, d3A1dÀ3, ... f (À); onde dAldÀ = A2 - A1//À2 -1À1 .
Se a diferença de absorbância for calculada em vários pontos para um
intervalo dado de À (~À usualmente igual a 2, 4 ou 8 nm), obtém-se o espectro
derivado. Os máximos de absorbância do espectro original corresponderão a zero no
29
espectro derivado. Se a medida da altura de um pico derivado for realizada no
comprimento de onda no qual o espectro dos demais componentes cruza a linha do
zero, a medida é proporcional somente à concentração do composto analisado. Tal
abordagem de determinação quantitativa é denominada de método "zero-crossing"
ou ponto de anulação (THOMAS, 1996; KARPINSKA, 2004).
A informação contida no espectro derivado é apresentada de uma forma mais
útil , tornando possível resolver muitas das diferentes dificuldades analíticas por
meio do aumento dos detalhes espectrais, como a resolução de sistemas
multicomponentes, remoção de interferências da matriz ou turbidez da amostra
(BERZEAS et aI. , 1997; RODENAS et aI., 2000; KARPINSKA, 2004).
30
3. OBJETIVO
Este trabalho de pesquisa foi planejado para ser desenvolvido nas seguintes
etapas:
1. Desenvolver e validar métodos analíticos para a quantificação do ácido
kójico a 1 %, associado ou não ao ácido glicólico a 5% em formulações
tópicas.
2. Desenvolver formulações contendo ácido kójico associado ou não a ácido
glicólico, nas formas creme e gel, utilizando excipientes e adjuvantes
farmacotécnicos habitualmente empregados por farmácias de
manipulação no Brasil.
3. Selecionar as formulações contendo ácido kójico associado ou não a
ácido glicólico desenvolvidas mediante a realização de estudo preliminar
de estabilidade (curto prazo), com a finalidade de submetê-Ias
posteriormente ao estudo acelerado de estabilidade.
4. Avaliar a estabilidade das formulações pré - selecionadas por meio de
estudo acelerado de estabilidade, quanto à influência da temperatura e da
luz, usando-se como parâmetros: caracteres organolépticos, pH,
comportamento reológico e doseamento.
31
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Material
Os reagentes e matérias-primas utilizados foram de grau analítico, reagente,
cromatográfico ou farmacêutico de pureza e, conforme o caso, acompanhados do
respectivo certificado de análise.
4.1.1. Substâncias de referência
- Ácido glicólico teor 99% (Sigma Aldrich®)
- Ácido kójico teor 100,0% (Sigma Aldrich®)
4.1.2. Matérias-primas farmacêuticas
- Ácido ascórbico - grau p.a ACS (Synth)
- Ácido cítrico anidro (MercK)
- Ácido glicólico 70% (Ionquímica)
- Ácido kójico 99,4% (Galena)
- Água destilada
- Amigel® "sclerotium gum"(Pharma Special)
Butilidroxitolueno - BHT (Ali Chemistry)
Cera autoemulsionante aniônica (Galena)
Cera Polawax NF® (Croda/Galena)
Citrato de sódio 3 H20 - grau p.a. ACS - (Synth)
Dióxido de titânio (ISP)
EDTA dissódico - grau p.a. ACS (Synth)
Escalol 577® - benzofenona - 4 (ISP)
Escalol UVAB Liquid® - associação de metoxicinamato de octila,
benzofenona - 3, benzoato de 2 feniletil, salicilato de octila e copolímero
PVP hexadeceno (ISP)
Eusolex 4360® - benzofenona -3 (Merck)
Fluído de Silicone 1214 GE® - ciclometicone dimeticone (Galena)
Glicerina - grau p.a. ACS - (Synth)
Goma xantana (Via Farma)
Hidróxido de amônia 25% (MercK)
Hidróxido de sódio (Reagen)
Metabissulfito de sódio - grau p.a. ACS (Synth)
Meti Iparabeno (Via F arma)
Natrosol 250 HHR® - hidroxietilcelulose (Galena)
Propilenoglicol (Galena)
Propilparabeno (Via Farma)
Sulfito de sódio - grau p.a. ACS (Synth)
- Vaselina líquida (Galena)
4.1.3. Reagentes, solventes e materiais
- Acetonitrila grau cromatográfico (Merck)
- Ácido fosfórico 85% (MercK)
- Água purificada Milli Q
Brometo de tetrabutilamônio (Sigma Aldrich)
Filtro de papel qualitativo grau 104 (Millipore)
Fosfato de amônia monobásico (Merck)
Fosfato de potássio monobásico (Merck)
Membrana filtrante HV Millex 0,45 I-lm 47 mm (Millipore)
Metanol grau cromatográfico (Merck)
Potes de vidro incolor 30 g
Potes plásticos de poliestireno 30 g
Seringa de vidro 100 I-lL (Hamilton)
- Trietilamina (Merck)
32
Unidade filtrante HV em PE com membrana Durapore 0,45 I-lm 13 mm,
não estéril (Millipore)
- Vidraria volumétrica classe A
4.1.4. Equipamentos e acessórios
- Agitador mecânico de hélice Nova Ética®
- Aparelho de ultrassom UNIQUE® - USC 1450
Balança analítica AG 200 Gehaka®
Balança analítica OHAUS®
Célula OSC Shimadzu® modelo OSC-50
33
Coluna cromatográfica Synergi Hidro® RP Phenomenex 25 x 0,46 cm,
partícula de 41-1,80 A de poro, C18 com capeamento polar
Cromatógrafo líquido modelo CG® 480C, loop de 20 ~L, detector UV CG®
435 e integrador CG® 200
Cromatógrafo líquido Shimadzu® LC-10 AO VP com detector POA ("photo
diode array detector"), sistema controlador SLC-10A VP, injeção
automática e sistema desgaseificador OGU-14A, acoplado ao software
Class VP®
Cromatógrafo líquido Shimadzu® LC-10 AO VP com detector UV-VIS,
sistema controlador SLC-10A VP, injeção automática e sistema
desgaseificador OGU-14A, acoplado ao software Class VP®
Cromatógrafo líquido Varian® 5000, loop de 20 ~L, detector UV-100 e
integrador Varian® 4400
Espectrofotômetro Shimadzu® UV 1601 - PC, duplo feixe, acoplado a
computador e impressora, com cubeta de quartzo com 1 cm de caminho
ótico
Espectrômetro infravermelho Bomem MB-100
Estufa Biolabor® com fotoperíodo modo 131 FC
Estufa Nova Ética®
Potenciômetro OIGIMEO® OM 21
Termobalança Shimadzu® modelo TGA-50
- Viscosímetro Brookfield® modelo RVT
34
4.1.5. Formulações utilizadas como excipientes
Creme Aniônico
Substância % função
Fase Oleosa
Cera autoemulsionante aniônica 12,0 ag.consistência/ag. emulsivo
Vaselina líquida 10,0 emoliente
Fluído de silicone 2,0 emoliente
Propilparabeno 0,1 conservante
Fase Aquosa
Meti Iparabeno 0,2 conservante
Propilenoglicol 10,0 umectante
Goma xantana ou HEC* 0,2 espessante
Água destilada q.s.p 100,0 veículo
* hidroxietilcelulose
Creme Não Iônico
Substância % função
Fase Oleosa
Cera polawax® 12,0 ag.consistência/ag. emulsivo
Vaselina líquida 10,0 emoliente
Fluído de silicone 2,0 emoliente
Propilparabeno 0,1 conservante
Fase Aquosa
Meti Iparabeno 0,2 conservante
Goma xantana ou HEC* 0,2 espessante
Propilenoglicol 10,0 umectante
Água destilada q.s.p 100,0 veículo
* hidroxietilcelulose
35
Gel de Natrosol®
Substância % função
hidroxietilcelulose (Natrosol®) 2,0 polímero espessante
Meti Iparabeno 0,2 conservante
Glicerina 40,0 umectante
água destilada q.s.p 100,0 veículo
Gel de Amigel®
Substância % função
Amigel® 2,0 polímero espessante
Metilparabeno 0,2 conservante
Glicerina 40,0 umectante
água destilada q.s.p 100,0 veículo
36
4.2. MÉTODOS
4.2.1. Caracterização do ácido kójico e ácido glicólico matéria-prima
4.2.1.1. Espectrofotometria no infravermelho
A matéria-prima ácido kójico foi identificada por análise em espectrofotômetro
de infravermelho, em pastilha de KBr, sendo o espectro obtido comparado ao
espectro da substância de referência obtido da mesma maneira. Os espectros
referentes à matéria-prima e à substância de referência também foram comparados
ao espectro relatado na literatura.
Ácido glicólico substância de referência foi analisado da mesma forma, sendo
a matéria-prima, por tratar-se de solução aquosa do ácido glicólico a 70%, preparada
em filme. Os espectros obtidos foram comparados entre si e ao espectro relatado na
literatura.
As análises foram realizadas pela Central Analítica do Instituto de Química da
USP.
4.2.1.2. Espectrofotometria no ultravioleta (UV)
As substâncias de referência e matérias-primas dos ácidos kójico e glicólico
foram analisadas por espectrofotometria no ultravioleta (UV) na faixa de
comprimento de onda de 200 a 320 nm, tendo água destilada como veículo. A
velocidade de varredura utilizada foi de 370 nm/min, intervalo de leitura de 0,2 nm,
usando-se cubeta de quartzo de 1 cm de caminho ótico.
4.2.2. Análise térmica do ácido kójico e do ácido glicólico
4.2.2.1. Estudo termogravimétrico
O estudo termogravimétrico foi realizado nas seguintes condições:
amostra: em torno de 5 mg
razão de aquecimento: 5°C/min (temperatura ambiente a 400°C)
atmosfera: ar (50 mLlmin)
cadinho: platina
37
As curvas em branco para os ensaios foram obtidas nas mesmas condições e
utilizando um cadinho vazio.
As amostras estudadas foram:
ácido glicólico (substância de referência)
ácido kójico (substância de referência)
ácido kójico matéria-prima
ácido glicólico (substância de referência) I ácido kójico (substância de
referência) mistura 5 : 1
ácido glicólico (substância de referência) I ácido kójico (substância de
referência) mistura 1 : 1
Com o objetivo de estudar o comportamento cinético da degradação dos dois
ácidos associados foram realizadas curvas isotermas nas temperaturas de 65, 70,
75, 80, e 90°C para a amostra ácido glicólico (substância de referência) I ácido
kójico (substância de referência) mistura 5 : 1, usando-se as seguintes condições:
amostra: 4,9 - 5,1 mg
razão de aquecimento: 5°C/min (temperatura ambiente) a 10°C abaixo da
Tiso, seguido de 2°C/min até a T iso e mantendo-se o tempo necessário
para ocorrência de 10% de perda de massa
atmosfera: ar (50 mLlmin)
cadinho: platina
38
Foram registrados os tempos em que a perda de massa correspondeu a 10%,
utilizados posteriormente para construção do gráfico de Arrhenius (In t vs 1fT K1) a
fim de se obter o tempo de vida útil extrapolado a 25°C.
Todas as amostras foram pulverizadas em almofariz de ágata antes da
pesagem. As misturas de ácido glicólico e kójico foram obtidas por simples mistura
física através de pulverização conjunta das substâncias no almofariz.
vazio.
4.2.2.2. Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
o estudo de calorimetria exploratória diferencial foi realizado nas seguintes
condições:
amostra: em torno de 2 mg
razão de aquecimento: 5°C/min (temperatura ambiente a 400°C)
atmosfera: N2 (100 mLlmin)
cadinho: alumínio
o branco das análises foi obtido nas mesmas condições, com o cadinho
Antes dos ensaios foram verificados os parâmetros de calibração da
instrumentação, empregando-se índio metálico (Tfusão 156,6°C e ilHfusão = 28,4 J/g) e
zinco metálico (Tfusão 419,4°C).
As amostras estudadas foram:
ácido glicólico (substância de referência)
ácido kójico (substância de referência)
ácido kójico matéria-prima
ácido glicólico (substância de referência) I ácido kójico (substância de
referência) mistura 5 : 1
ácido glicólico (substância de referência) I ácido kójico (substância de
referência) mistura 1 : 1
39
4.2.3. Estudo preliminar da estabilidade das formulações
4.2.3.1. Obtenção das formulações base creme e gel
As formulações na forma creme apresentadas no item 4.1.5. foram obtidas
por pesagem dos componentes e posterior aquecimento, a 75°C, das fases aquosa
e oleosa, separadamente. A fase aquosa foi vertida sobre a fase oleosa (método de
emulsificação por inversão de fases) e a emulsão foi agitada manualmente até o
resfriamento. Os cremes assim obtidos foram armazenados em embalagem de
polietileno à temperatura ambiente (25±3°C).
As formulações na forma gel apresentadas no item 4.1 .5. foram obtidas por
pesagem dos componentes e posterior aquecimento a 60°C, mediante agitação
contínua. Os géis foram então armazenados em embalagem de polietileno à
temperatura ambiente (25±3°C).
4.2.3.2. Obtenção das formulações para o estudo preliminar de
estabilidade
Os excipientes nas formas creme e gel descritos anteriormente foram
acrescentados dos princípios ativos e de adjuvantes farmacotécnicos, em diferentes
combinações, como mostrado no Quadro 3.
Para as substâncias sólidas considerou-se % p/p. Para as substâncias
líquidas % v/p, sendo utilizada a densidade para conversão do volume obtido em
massa, a fim de que todos os constituintes pudessem ser pesados.
As formulações foram produzidas em gral. Os constituintes sólidos foram
triturados e a eles foi incorporada a formulação base, incorporando-se por último as
substâncias líquidas.
Os princípios ativos foram utilizados associados ou não (ácido kójico ou ácido
kójico associado a ácido glicól ico), iniciando-se os testes de seleção por formulações
com elevados teores de ácido glicólico e kójico (8% e 3%, respectivamente). À
medida que as formulações foram ajustadas, as concentrações passaram a 5% e
1 % de ácido glicólico e kójico, respectivamente, concentrações estas adotadas para
validação do método analítico e para o estudo acelerado de estabilidade.
40
Quadro 3: Lista geral das matérias-primas usadas no desenvolvimento
farmacotécnico das formulações através do estudo preliminar de
estabi I idade.
Substância função concentração
ácido kójico princípio ativo 3%; 1%
ácido glicólico princípio ativo 8%; 5%
ácido ascórbico antioxidante 0,1%
EDTA quelante 0,1%; 0,15%
metabissulfito de sódio antioxidante 0,3%; 0,5; 0,75%
BHT antioxidante 0,05%
sulfito de sódio antioxidante 0,3%
ác.cítrico/ citrato de sódio tampão 6%; 4%,3%; 2%
dióxido de titânio fotoestabilizador 1,5%
Benzofenona - 3 fotoestabilizador 2,5%
benzofenona - 4 fotoestabi I izador 2,5%
Escalol UVAB Liquid® fotoestabilizador 5%
tampão citrato pH 3,5 tampão 0,1 M/1 ,OM a 10%
tampão citrato pH 4,0 tampão 1,OM a 10%
NH40H (sol. 25%) alcalinizante q.s. pH 3,5 ou 4,0
_ NaOH (5 M) alcalinizante q.s. pH 3,5 - -
Os adjuvantes farmacotécnicos foram usados em conjunto ou isoladamente,
em diversas combinações. Foram produzidas também as formulações contendo os
diversos adjuvantes farmacotécnicos mas isentas dos ácidos kójico e glicólico, em
todas as situações possíveis.
Adjuvantes lipossolúveis como BHT, benzofenona - 3 e Escalol UVAB Liquid®
foram usados apenas nas formulações creme. A combinação ácido cítrico/citrato de
sódio a 6%/4% ou 3%/2% foi testada apenas nas formulações base gel, em função
da perda de estabilidade de emulsões na presença de altas concentrações de
eletrólitos.
41
Os alcalinizantes hidróxido de sódio ou hidróxido de amônio foram utilizados
para neutralização parcial das fórmulas apenas nos casos em que as mesmas
continham ácido glicólico, em função da necessidade de ajustar o pH a valores
recomendados internacionalmente (BERGFELD et aI. , 1998) para formulações de
uso não profissional, o qual corresponde a 3,5.
Emulsões formadas com lauril sulfato de sódio ou outros tensoativos
aniônicos não são habitualmente usadas para incorporação de princípios ativos
ácidos em função da incompatibilidade entre esse tipo de tensoativo e os íons H+.
Entretanto, uma vez que há relato na literatura (WADE; WELLER, 1994) de que tal
incompatibilidade ocorre apenas quando o valor de pH for abaixo de 2,5,
mantivemos o creme aniônico como base para as formulações, já que as mesmas
foram parcialmente neutralizadas a valores de pH acima dessa faixa.
Foi excluída a possibilidade de obtenção de formulações gel a base de
polímero carboxivinílico (Carbopol®) em função da sua incompatibilidade com pH
ácido.
a) Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico
Os quadros mostrados a seguir apresentam as formulações testadas no
estudo preliminar de estabilidade, considerando os excipientes creme não iônico,
creme aniônico, gel de natrosol® e gel de amigel®, contendo os princípios ativos
ácido kójico e ácido glicólico associados.
42
Quadro 4: Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico usando
como excipiente creme não iônico (valores em %).
F ak ag ed aa ms bt ss dt 83 es T3,5 T4,o ha* hs*
1 3 8 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5
2 3 8 0,1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5
3 3 8 0,1 0,1 -- -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5
4 3 8 0,1 -- 0,3 -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5
5 3 8 0,1 -- 0,5 -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5
6 3 8 0,1 -- 0,75 -- -- -- -- -- -- -- -- 3,5
7 3 8 0,1 -- -- 0,05 -- -- -- -- -- -- -- 3,5
8 3 8 0,1 -- 0,5 0,05 -- -- -- -- -- -- -- 3,5
9 1 5 0,15 -- 0,3 -- 0,3 -- -- -- 10 -- 3,5 --10 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- -- 10 -- 3,5 --11 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- -- -- 10 4,0 --12 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- 1,5 2,5 -- -- 10 4,0 --13 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- 5,0 10 -- -- 3,5
14 1 5 0,15 -- -- -- -- -- -- -- 10 -- -- 3,5
15+ 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- -- 10 -- -- 3,5
16 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- -- -- -- 10 -- -- 3,5 ~ ---
Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ag = ácido glicólico; ed = edta; aa = ácido
ascórbico; ms = metabissulfito de sódio; bt = butilhidroxitolueno; ss = sulfito de sódio; dt
= dióxido de titânio; B3 = benzofenona - 3; es = escalol UVAB liquid®; T 3,5 = tampão
citrato pH 3,50 1 M; T4 ,o = tampão citrato pH 4,00 1 M; ha = hidróxido de amônio; hs =
hidróxido de sódio; * = quantidade suficiente para valor de pH indicado; + = formulação
sem conservantes.
43
Quadro 5: Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico usando
como excipiente creme aniônico (valores em %)
F ak ag Ed aa ms T3,5 T4,o ha* hs*
17 3 8 -- -- -- -- -- -- 3,5
18 3 8 0,1 0,1 -- -- -- -- 3,5
19 3 8 0,1 -- 0,3 -- -- -- 3,5
20 3 8 0,1 -- 0,5 -- -- -- 3,5
21 1 5 0,15 -- 0,3 10 -- 3,5 --
22 1 5 0,15 -- 0,3 10 -- -- 3,5 -- - --- -
Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ag = ácido glicólico; ed = edta; aa = ácido
ascórbico; ms = metabissulfito de sódio; T3,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M; T4,o = tampão
citrato pH 4,00 1 M; ha = hidróxido de amônio; hs = hidróxido de sódio; * = quantidade
suficiente para valor de pH indicado
Quadro 6: Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico usando
como excipiente gel de natrosol® (valores em %)
F ak ag ed aa ms ac cs T3,5 ha* hs*
23 3 8 -- -- -- -- -- -- -- 3,5
24 3 8 0,1 0,1 -- -- -- 3,5
25 3 8 0,1 -- 0,3 -- -- 3,5
26 3 8 0,1 -- 0,5 -- -- 3,5
27 1 5 0,15 -- 0,3 10 3,5 --
28 1 5 0,15 -- 0,3 6,0 4,0 -- 3,5 --
29 1 5 0,15 -- 0,3 3,0 2,0 -- 3,5 --30 1 5 0,15 -- 0,3 -- -- 10 -- 3,5
--- _ ._-- - --
Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ag = ácido glicólico; ed = edta; aa = ácido
ascórbico; ms = metabissulfito de sódio; ac = ácido cítrico; cs = citrato de sódio; T 3 ,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M; ha = hidróxido de amônio; hs = hidróxido de sódio; * = quantidade suficiente para valor de pH indicado.
44
Quadro 7: Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico usando
como excipiente gel de amigel® (valores em %)
F ak ag ed aa ms T3,5 ha* hs*
31 3 8 3,5
32 3 8 0,1 0,1 3,5
33 3 8 0,1 0,3 3,5
34 3 8 0,1 0,5 3,5
35 1 5 0,15 0,3 10 3,5
Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ag = ácido glicólico; ed = edta; aa = ácido
ascórbico; ms = metabissulfito de sódio; T3,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M; ha = hidróxido
de amônio; hs = hidróxido de sódio; * = quantidade suficiente para valor de pH indicado.
b) Formulações contendo ácido kójico
A seguir são mostrados os quadros contendo as formulações testadas no
estudo preliminar de estabilidade, considerando os excipientes creme não iônico,
creme aniônico, gel de natrosol® e gel de amigel®, com apenas ácido kójico.
45
Quadro 8: Formulações contendo ácido kójico usando como excipiente creme não
iônico (valores em %)
F ak Ed ms 84 es T3,5
36 3 -- -- -- -- --
37 3 0,1 -- -- -- --38 3 0,1 0,5 -- -- --
39 1 0,15 -- -- -- 10
40 1 0,15 0,3 -- 5,0 10
41 1 0,15 0,3 2,5 -- 10
42 1 0,15 0,3 -- -- 10
Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ed = edta; ms = metabissulfito de sódio; B4
= benzofenona - 4; es = Escalol UVAB liquid®; T3,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M.
Quadro 9: Formulações contendo ácido kójico usando como excipiente creme
aniônico (valores em %).
F Ak ed ms T3,5
43 3
44 1 0,15 0,3 10 - ----
Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ed = edta; ms = metabissulfito de sódio;
T3,5 = tampão citrato pH 3,50 1 M.
46
Quadro 10: Formulações contendo ácido kójico usando como excipiente gel de
natrosol® (valores em %)
F ak ed ms T3,5
45 3
46 1 0,15 0,3 10
Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ed = edta; ms = metabissulfito de sódio; T3,5
= tampão citrato pH 3,50 1 M.
Quadro 11: Formulações contendo ácido kójico usando como excipiente gel de
amigel® (valores em %)
F ak ed ms T3,5
1 47 3
48 0,15 0,3 10
Legenda: F = formulação; ak = ácido kójico; ed = edta; ms = metabissulfito de sódio; T 3,5
= tampão citrato pH 3,50 1 M.
47
4.2.3.3. Condições de armazenamento
Foram obtidas 20 gramas de cada fórmula, divididas nas seguintes
embalagens e formas de armazenamento (BRASIL, 2004a):
- potes de poliestireno branco em estufa a 45°C, e
- embalagem de vidro incolor, exposta à luz artificial e natural indireta
(apenas para formulações selecionadas no teste da estufa ou contendo
fotoestabilizadores ).
De cada formulação foi mantida uma amostra armazenada em geladeira (8°-
1 QOC) para controle.
4.2.3.4. Avaliação das formulações
As formulações submetidas a 45°C em estufa foram avaliadas no tempo zero
(To) e após 30 dias (T30), quanto ao aspecto (cor, odor, consistência e
homogeneidade) e pH (BRASIL, 2004a). Os resultados foram compilados sob a
forma de tabela.
As formulações expostas à luz foram avaliadas no To e após 30 dias (T 30).
Para análise de pH pesou-se 1 g de cada formulação em tubo de ensaio,
acrescentando-se 9 mL de água destilada (PRISTA, 1996). Após dispersão da
mistura o pH foi determinado à temperatura ambiente.
48
4.2.4. Validação do método de determinação do ác. kójico por
espectrofotometria UV
A validação do método fo i conduzida experimentalmente de acordo com as
recomendações da ICH (International Conference on Harmonization) , instrumento
Q2A (ICH, 1994) e Q2B (ICH, 1996b) e da USP 28.
4.2.4.1. Amostra ácido kójico 1 % creme e gel
Após a realização do estudo preliminar de estabilidade foram selecionadas as
formulações 42 e 46 (descritas abaixo) para o desenvolvimento do método de
doseamento do ácido kójico por espectrofotometria no ultravioleta.
a) Ácido kójico 1 % creme
Substância % função
Ácido kójico 1,0 princípio ativo
Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante
EdtaNa2 0,15 quelante
Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão
Creme Polawax® com 0,2% HEC* q.s.p 100,0 excipiente
*hidroxietilcelulose
o creme base foi obtido da mesma forma, sem a adição do ácido kójico.
49
b) Ácido kójico 1 % gel
Substância % função
Ácido kójico 1,0 princípio ativo
Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante
EdtaNa2 0,15 quelante
Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão
Gel de Natrosol® q.s.p 100,0 excipiente
o gel base foi obtido da mesma forma, sem a adição do ácido kójico.
4.2.4.2. Ensaios espectrofotométricos preliminares
Para desenvolvimento do método de doseamento do ácido kójico por
espectrofotometria no ultravioleta foram usadas as seguintes condições iniciais:
velocidade de varredura: 370 nm/min
Intervalo de varredura: 200 - 320 nm
Intervalo de leitura: 0,2 nm
cubeta de quartzo de 1 cm
ordem do espectro: ordem zero e primeira derivada
solventes testados: água, etanol e metanol
50
4.2.4.3. Padronização das condições experimentais
Após realização dos ensaios preliminares, as seguintes condições foram
adotadas para validação do método:
intervalo de varredura: 200 a 320 nm
velocidade de varredura: 370 nm/min
solvente: metano I
ordem do espectro: primeira derivada
método: zero "crossing" a 256,8 nm
L1À: 2 nm
assentamento das ordenadas: +/- 0,08
o uso do metanol na extração das amostras foi necessário pelo fato de não
ter sido possível eliminar a interferência dos excipientes na curva derivada quando
se utilizou água destilada ou etanol como solvente.
Todas as leituras foram realizadas usando-se metanol como branco.
4.2.4.4. Construção da curva de calibração
Para o preparo da solução padrão estoque pesou-se 125,0 mg de ácido kójico
substância de referência em um balão volumétrico de 100 mL âmbar. O volume foi
completado com metano I. Do primeiro balão transferiu-se 10 mL, medidos
volumetricamente, para um segundo balão volumétrico de 250 mL, sendo o volume
completado com metanol (concentração final de 50 Ilg/mL).
Volumes de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 mL da solução padrão a 50 Ilg/mL foram
transferidos para balões âmbar de 25 mL. O volume final de cada balão foi
completado com metanol. As soluções nas concentrações de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,
16 e 18 Ilg/mL foram obtidas em triplicata.
51
Foram obtidas as leituras do conteúdo dos balões nas condições
experimentais mencionadas no item 4.2.4.3.
4.2.4.5. Especificidade
4.2.4.5.1. Interferência dos excipientes
a) Amostra ácido kójico 1 % creme
Para verificação da interferência dos excipientes no método pesou-se 0,5000
9 da amostra especificada no item 4.2.4.1 (ácido Kójico 1% creme) em béquer
plástico. O metanol foi adicionado aos poucos e a dispersão do creme foi feita com
auxílio de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão
volumétrico de 100 mL âmbar, completando-se o volume com metanol. A amostra foi
filtrada em funil de vidro usando-se papel de filtro e desprezando-se os 10 mL
iniciais. O filtrado obtido, na concentração de 50 ~g/mL, foi armazenado em vidro
âmbar.
Pipetou-se 5 mL do filtrado obtido em balão âmbar de 25 mL, completando-se
o volume com metanol, obtendo-se a concentração de 1 O ~g1mL de ácido kójico.
A amostra do creme base foi obtida da mesma forma.
A solução padrão foi preparada a partir da solução estoque a 50 ~g/mL obtida
conforme o item 4.2.4.4, transferindo-se 5 mL para balão de 25 mL e completando
se o volume com metanol (concentração final de 1 O ~g/mL).
Foram obtidas as leituras das soluções nas condições experimentais
mencionadas no item 4.2.4.3.
b) Amostra ácido kójico 1% gel
Para verificação da interferência dos excipientes no método pesou-se 0,5000
9 da amostra especificada no item 4.2.4.1 (ácido kójico 1 % gel) em béquer plástico.
O metanol foi adicionado aos poucos e a dispersão do gel foi feita com auxílio de
bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico de
52
100 mL âmbar, completando-se o volume com metanol. A amostra foi filtrada em
funil de vidro usando-se papel de filtro e desprezando-se os 10 mL iniciais. O filtrado
obtido, na concentração de 50 !lg/mL, foi armazenado em vidro âmbar.
Pipetou-se 5 mL do filtrado obtido em balão âmbar de 25 mL, completando-se
o volume com metanol, obtendo-se a concentração de 10 f.lg/mL de ácido kójico.
A amostra do gel base foi obtida da mesma forma.
A solução padrão foi preparada a partir da solução estoque a 50 f.lg/mL obtida
conforme o item 4.2.4.4, transferindo-se 5 mL para balão de 25 mL e completando
se o volume com metanol (concentração final de 10 f.lg/mL).
Foram obtidas as leituras das soluções nas condições experimentais
mencionadas no item 4.2.4.3.
4.2.4.5.2. Interferência dos produtos de degradação
Para verificação da interferência dos produtos de degradação no método
pesou-se em béquer 0,5000 9 da amostra especificada no item 4.2.4.1 (ácido kójico
1 % creme) após o mesmo ter permanecido em estufa a 45°C pelo período de 30
dias. O metano I foi adicionado aos poucos e a dispersão do creme degradado foi
feita com auxílio de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um
balão volumétrico de 100 mL âmbar, completando-se o volume com metanol. A
amostra foi então filtrada em funil de vidro, usando-se papel de filtro e desprezando
se os 10 mL iniciais. O filtrado obtido, na concentração de 50 f.lg/mL, foi armazenado
em vidro âmbar.
Pipetou-se 5 mL do filtrado assim obtido em balão âmbar de 25 mL,
completando-se o volume com metanol.
A solução foi lida nas condições experimentais mencionadas no item 4.2.4.3.
A presença de interferentes na forma de produtos de degradação pode ser
observada por alterações no formato do pico, quando comparado à amostra não
53
envelhecida, em especial quando analisados por espectrofotometria derivada
(BAKSHI; SINGH, 2002).
4.2.4.6. Exatidão (Recuperação)
a) Amostra ácido kójico 1 % creme
Para o teste de recuperação usou-se a solução padrão a 50 /lg/mL, preparada
conforme descrito no item 4.2.4.4 e o filtrado da amostra creme a 1 %
(correspondendo à concentração de 50 /lg/mL) obtido conforme descrito no item
4.2.4.5.
Os volumes de ambas as soluções foram pipetados para balões volumétricos
âmbar de 25 mL (em triplicata) conforme segue, sendo o volume final completado
com metanol:
Sol. Padrão Amostra creme Concentração 50 /lg/mL (mL) 50 /lg/mL (ml) (J.lg/mL)
1 3,0 6,00
2 3,0 6,00
3 1,0 3,0 8,00
4 2,0 3,0 10,00
5 3,0 3,0 12,00
Foram obtidas as leituras das soluções nas mesmas condições experimentais
mencionadas no item 4.2.4.3.
b) Amostra ácido kójico 1 % gel
Para o teste de recuperação foram usados a solução padrão a 50 /lg/mL,
preparada conforme descrito no item 4.2.4.4 e o filtrado da amostra gel a 1 %
(correspondendo à concentração de 50 J.lg/mL) obtido conforme descrito no item
4.2.4.5.
54
Os volumes de ambas as soluções foram pipetados para balões volumétricos
âmbar de 25 mL (em triplicata) conforme segue, sendo o volume final completado
com metanol:
Sol. Padrão Amostra gel Concentração 50 J.lg/mL (mL) 50 J.lg/mL (ml) (J.lg/mL)
1 3,0 6,00
2 3,0 6,00
3 1,0 3,0 8,00
4 2,0 3,0 10,00
5 3,0 3,0 12,00
Foram obtidas as leituras das soluções nas mesmas condições experimentais
mencionadas no item 4.2.4.3.
4.2.4.7. Precisão
a) Amostra ácido kójico 1% creme
O preparo da amostra foi realizado nas mesmas condições do item 4.2.4.5.,
obtendo-se o filtrado na concentração de 50 J.lg/mL. Alíquotas de 5 mL do filtrado
foram transferidas para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com
metanol (concentração final de 10 J.lg/mL). As soluções foram obtidas em 10
replicatas.
b) Amostra ácido kójico 1% gel
O preparo da amostra foi realizado nas mesmas condições do item 4.2.4.5.,
obtendo-se o filtrado na concentração de 50 J.lg/mL. Alíquotas de 5 mL do filtrado
foram transferidas para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com
metanol (concentração final de 10 J.lg/mL). As soluções foram obtidas em 10
replicatas.
55
Para ambos os ensaios, o padrão foi obtido a partir da solução estoque a 50
~g/mL preparada conforme o item 4.2.4.4. Da solução estoque foram transferidos 5
mL para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com metanol
(concentração final de 10 ~g/mL) . As soluções foram obtidas em triplicata.
4.2.5. Validação do método de determinação dos ácidos associados por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A validação do método foi conduzida experimentalmente de acordo com as
recomendações da ICH (International Conference on Harmonization) , instrumentos
Q2A (ICH, 1994) e Q2B (ICH, 1996b) e da USP 28.
4.2.5.1. Amostras contendo ácido kójico 1% e ácido glicólico 5%
Após a realização do estudo preliminar de estabilidade das formulações foram
selecionadas as formulações 16 e 30 (descritas abaixo) para o desenvolvimento do
método de doseamento do ácido kójico associado ao ácido glicólico por CLAE:
a) Amostra ácido kójico 1% asociado a ácido glicólico 5% creme
Substância % função
Ácido kójico 1,0 princípio ativo
Ácido glicólico 5,0 princípio ativo
Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante
EdtaNa2 0,15 quelante
Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão
NaOH 5 M q.s. pH 3,50 7,5 alcalinizante
Creme Polawax® com 0,2% HEC* q.s.p 100,0 excipiente
*hidroxietilcelulose
56
o creme base foi obtido da mesma forma, sem a adição dos ácidos kójico e
glicólico e do agente alcalinizante (NaOH).
b) Amostra ácido kójico 1% asociado a ácido glicólico 5% gel
Substância % função
Ácido kójico 1,0 princípio ativo
Ácido glicólico 5,0 princípio ativo
Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante
EdtaNa2 0,15 quelante
Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão
NaOH 5 M q.s. pH 3,50 7,5 alcalinizante
Gel de Natrosol® q.s.p 100,0 excipiente
o gel base foi obtido da mesma forma, sem a adição dos ácidos kójico e
glicólico e do agente alcalinizante (NaOH).
4.2.5.2. Ensaios cromatográficos preliminares
4.2.5.2.1. Condições gerais
Para separação cromatográfica dos ácidos kójico e glicólico, foram usadas as
seguintes condições:
coluna Synergi Hidro® RP Phenomenex 25 x 0,46 cm, partícula de 411,80
A de poro, contendo fase ligada de octadecil silano (C1s) com capeamento
polar e faixa de pH de 1,5 a 7,5.
modo: fase reversa
fluxo de trabalho: 0,7 mLlmin
temperatura: ambiente
57
comprimentos de onda testados: 210 e 220 nm.
4.2.5.2.2. Preparo da fase móvel
As fases móveis testadas foram preparadas em balão volumétrico por
dissolução dos constituintes do tampão e dos aditivos brometo de tetrabutilamônio
(TBA) ou trietilamina (TEA) em água purificada Milli Q ®, sendo o pH ajustado
potenciometricamente a temperatura ambiente. A proporção de solvente orgânico foi
adicionada posteriormente e o pH ajustado novamente, exceto para o sistema 18,
cujo pH foi ajustado apenas inicialmente. O volume final foi filtrado a vácuo em
membrana filtrante de 0,45 !-Im. Procedeu-se a desgaseificação do sistema em
aparelho de ultra-som por 15 minutos.
4.2.5.2.2. Sistemas testados
Foram testados os seguintes sistemas (fases móveis):
58
Quadro 12: CLAE fase reversa - sistemas cromatográficos testados. Condições:
coluna Synergi Hidro RP Phenomenex® 25 x 0,46 cm, fluxo de trabalho
0,7 mLlmin.
FM A B AB pH
01 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 6,50
02 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 90:10 3,00
03 Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 90:10 3,00
04 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 2,30
05 Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 95:05 2,30
06 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 98:02 2,30
07 Tampão KH2POJH3P04 20 mM + 0,05% TEA ACN 98:02 2,30
08 Tampão KH2POJH3P04 10 mM ACN 95:05 2,00
09 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 2,00
10 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 3,00
11 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM -- -- 3,00
12 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 2,30 - -- --
Legenda: FM= fase móvel; A=conteúdo aquoso; B=fase orgânica; ACN= acetonitrila;
MET= metanol; TEA= trietilamina.
59
Quadro 13: CLAE fase reversa com pareamento iônico - sistemas cromatográficos
testados. Condições: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex® 25 x 0,46
cm, fluxo de trabalho 0,7 mLlmin.
FM A S AS pH
13 Tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM 2,20
14 Tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM ACN 98:02 2,20
15 Tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM ACN 98:02 3,00
16 Tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM ACN 95:05 3,00
17 Tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 4 mM ACN 95:05 3,00
18 Tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM ACN 95:05 3,00
Legenda: FM= fase móvel; A=conteúdo aquoso; B=fase orgânica; ACN= acetonitrila;
MET= metanol; TBA= brometo de tetrabutilamônio.
4.2.5.3. Padronização das condições experimentais
Após realização dos ensaios preliminares, as seguintes condições foram
adotadas para validação do método:
equipamento: cromatógrafo líquido Shimadzu®, descrito no item 4.1.4.
modo: fase reversa, com pareamento iônico
- fase móvel 18: tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TSA 2 mM pH
3,00/ACN (95:05)
fluxo de trabalho: 0,7 mLlmin
injeção: automática
60
volume injetado ("Ioop"): 20 IJL
detecção: POA ("photo diode array") a 220 nm
tempo de corrida: 12 minutos para amostras e 08 minutos para padrões
temperatura: ambiente
4.2.5.4. Construção da curva de calibração
Para o preparo da solução padrão pesou-se 100 mg de ácido kójico
substância de referência e 500 mg de ácido glicólico substância de referência em um
balão volumétrico de 50 mL âmbar. O volume foi completado com a fase móvel
descrita no item 4.2.5.3. Transferiu-se 10 mL, medidos volumetricamente, para um
segundo balão volumétrico de 100 mL, sendo o volume completado com fase móvel
(concentração final de 1000 !lg/mL de ácido glicólico e 200 !lg/mL de ácido kójico).
Volumes de 1, 2, 3, 4, 5, e 6 mL da solução anterior foram transferidos para
balões âmbar de 25 mL, em duplicata. O volume final de cada balão foi completado
com fase móvel, perfazendo concentrações de 40, 80, 120, 160, 200 e 240 Ilg/mL
de ácido glicólico e 8, 16, 24, 32, 40 e 48 Ilg/mL de ácido kójico. Após filtração em
seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com membrana de 0,45 Ilm (descrita no
item 4.1.3) as soluções foram transferidas para frascos próprios para injeção
automática.
4.2.5.5. Especificidade
4.2.5.5.1. Interferência dos excipientes
a) Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme
Para verificação da interferência dos excipientes no método pesou-se 0,8000
9 da amostra creme (especificada no item 4.2.5.1) em béquer plástico. A fase móvel
foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio de bastão de vidro.
Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico de 100 mL âmbar, o
qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O volume final foi
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completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de vidro com papel de
filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais. Do filtrado obtido 10 mL foram transferidos
para balão volumétrico de 25 mL, obtendo-se concentrações finais de 32 Ilg/mL e
160 Ilg/mL de ácido kójico e de ácido glicólico, respectivamente.
o mesmo procedimento foi realizado para a formulação creme base.
b) Amostra ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5% gel
Para verificação da interferência dos excipientes no método pesou-se 0,8000
9 da amostra gel (especificada no item 4.2.5.1) em béquer plástico. A fase móvel foi
adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio de bastão de vidro.
Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico de 100 mL âmbar, o
qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O volume final foi
completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de vidro com papel de
filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais. Do filtrado obtido 10 mL foram transferidos
para balão volumétrico de 25 mL, obtendo-se concentrações finais de 32 Ilg/mL e
160 Ilg/mL de ácido kójico e de ácido glicólico, respectivamente.
O mesmo procedimento foi realizado para a formulação gel base.
c) Solução Padrão
A solução padrão foi preparada a partir da solução estoque contendo 1000
Ilg/mL de ácido glicólico e 200 Ilg/mL de ácido kójico obtida conforme o item 4.2.5.4.
Transferiu-se 4 mL para balão volumétrico de 25 mL, completando-se o volume com
fase móvel (concentrações finais de 32 Ilg/mL e 160 Ilg/mL de ácido kójico e de
ácido glicólico, respectivamente) .
As soluções de amostras, creme e gel base e padrão foram filtradas em
seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com membrana de 0,45 Ilm (descrita no
item 4.1.3) e transferidas para frascos próprios para injeção automática.
4.2.5.5.2. Interferência do produto de degradação
Para verificação da interferência do produto de degradação no método pesou
se em béquer 0,8000 9 da amostra creme especificada no item 4.2.5.1 após o
62
mesmo ter permanecido em estufa a 45°C pelo período de 30 dias. A fase móvel foi
adicionada aos poucos e a dispersão do creme degradado foi feita com auxílio de
bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico de
100 mL âmbar, que foi colocado no aparelho de ultra-som por 15 minutos. O volume
final foi completado com fase móvel e a amostra foi filtrada em papel de filtro,
desprezando-se os 10 mL iniciais. Transferiu-se 10 mL do filtrado para balão
volumétrico de 25 mL, sendo o volume completado com fase móvel.
A amostra obtida a partir do creme degradado foi filtrada em seringa de vidro
acoplada a unidade filtrante com membrana de 0,45 11m (descrita no item 4.1.3) e
transferida para frasco próprio para injeção automática.
Após a análise, os picos obtidos no cromatograma foram analisados quanto à
sua pureza por meio do uso de ferramentas de software relacionadas ao detector
PDA ("photo diode array,,2).
4.2.5.6. Exatidão (Recuperação)
a) Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme
Pesou-se 1,0000 9 da amostra creme (especificada no item 4.2.5.1) em
béquer plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com
auxílio de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão
volumétrico de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15
minutos. O volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em
funil de vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se
concentrações finais de 500 Ilg/mL de ácido glicólico e 100 Ilg/mL de ácido kójico.
b) Amostra ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5% gel
Pesou-se 1,0000 9 da amostra gel (especificada no item 4.2.5.1) em béquer
plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio
de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico
2 A análise de pureza do pico ("peak puriry") por meio do detector PDA demonstra o grau de pureza de um pico cromatográfico ao comparar a similaridade de todo o espectro do pico com o espectro relativo ao ápice. O cálculo é feito a partir da porção pura dividido pela área total do pico.
63
de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O
volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de
vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se
concentrações finais de 500 ~g/mL de ácido glicólico e 1 00 ~g/mL de ácido kójico.
c) Solução Padrão
Para o preparo da solução padrão pesou-se 100,0 mg de ácido kójico
substância de referência e 500,0 mg de ácido glicólico substância de referência em
um balão volumétrico de 50 mL âmbar. O volume foi completado com a fase móvel
descrita no item 4.2.5.3. Transferiu-se 10 mL, medidos volumetricamente, para um
segundo balão volumétrico de 200 mL, sendo o volume completado com fase móvel
(concentração final de 500 ~g/mL de ácido glicólico e 1 00 ~g/mL de ácido kójico).
Alíquotas da solução padrão e dos filtrados das amostras foram transferidas
para balões volumétricos âmbar de 25 mL (em triplicata) conforme segue, sendo o
volume final completado com fase móvel:
Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme
Sol. Padrão Amostra creme [G] 1 [K]
G (500~g/mL) 1 K (1 OO~g/mL) G (500~g/mL) 1 K (1 00 ~g/mL) volume (mL) volume (mL) (~g/mL)
1 4,0 80/16
2 4,0 80/16
3 2,0 4,0 120/24
4 4,0 4,0 160/32
5 6,0 4,0 200/40
G= ácido glicólico, K= ácido kójico
64
Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% gel
Sol. Padrão Amostra gel [G] 1 [K]
G (500j.lg/mL) 1 K (1 OOj.lg/mL) G (500j.lg/mL) 1 K (100 j.lg/mL) volume (mL) volume (mL) (j.lg/mL)
1 4,0 80116
2 4,0 80/16
3 2,0 4,0 120/24
4 4,0 4,0 160/32
5 6,0 4,0 200/40
G= ácido glicólico, K= ácido kójico
Os conteúdos dos balões volumétricos de 25 mL contendo padrões e
amostras foram filtrados em seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com
membrana de 0,45 j.lm (descrita no item 4.1.3) e transferidos para frascos próprios
para injeção automática.
4.2.5.7. Precisão
Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme
Pesou-se 0,8000 9 da amostra creme (especificada no item 4.2.5.1) em
béquer plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com
auxílio de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão
volumétrico de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15
minutos. O volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em
funil de vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se
concentrações de 400 j.lg/mL de ácido glicólico e 80 j.lg/mL de ácido kójico.
Transferiu-se 10 mL do filtrado obtido para balão volumétrico âmbar de 25
mL, completando-se o volume com fase móvel. Foram obtidas 10 replicatas
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e sawped opuaTuoo iw 9z ap soopTewnion seopeq sop sopoaluod so
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e 00!190!15 opine ap 3£ e 1w/6r1 og ap S005EAUGOU00 se opuepuodsanoo
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oo!Apwnion oeieq wn eied Janbeq op opr3a;uoo o as-nuejsueu •oJp!A ap oelseq ep
offixne woo el!al !ol oesJadsup e a soonod soe epeuoppe !ol ianqw asei. v •oo!Tseid
Janbeq wa (1-•9•3•t7 waTi ou epeowoadsa) 106 allSOWe ep 6 0008'0 as-nosed
1e6 %g 03!193!16 oppe e opeposse %L. oogom opp? ensowv (e
•a}uawengoadsai 'oo!km opine
e oopoop6 opa? ap 1w/6r1 zg e 1w/6r1 091- ap sao5eAueouoo se opuepuodsanoo
99
66
4.2.5.8. Robustez
A robustez do método cromatográfico foi avaliada utilizando-se um outro
equipamento acoplado não de um detector PDA, mas sim de um detector UV-VIS
(cromatógrafo líquido Shimadzu® com detector UV-VIS indicado no item 4.1.4).
Foram realizados os testes de linearidade, precisão e exatidão para as amostras
creme e gel contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, nas mesmas
condições experimentais estabelecidas nos itens 4.2.5.3, 4.2.5.4,4.2.5.6 e 4.2.5.7.
4.2.6 Validação do método de determinação do ácido kójico por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
A partir do desenvolvimento do método cromatográfico para determinação dos
ácidos kójico e glicólico associados, as mesmas condições experimentais indicadas
no item 4.2.5.3 foram usadas para validação do método, quanto aos parâmetros de
linearidade, exatidão e precisão, para determinação do ácido kójico isoladamente
em formulações tópicas.
o equipamento utilizado foi o cromatógrafo líquido Shimadzu® acoplado de
detector UV-VIS.
As amostras contendo ácido kójico 1 % creme e gel utilizadas foram as
mesmas descritas no item 4.2.4.1, usadas no desenvolvimento do método
espectrofotométrico por derivada de 1a ordem.
4.2.6.1. Construção da curva de calibração
Para o preparo da solução padrão pesou-se 100 mg de ácido kójico
substância de referência em um balão volumétrico de 50 mL âmbar. O volume foi
completado com a fase móvel descrita no item 4.2.5.3. Transferiu-se 10 mL, medidos
volumetricamente, para um segundo balão volumétrico de 100 mL, sendo o volume
completado com fase móvel (concentração final de 1000 Ilg/mL de ácido glicólico).
67
Volumes de 1, 2, 3, 4, 5, e 6 mL da solução anterior foram transferidos para
balões âmbar de 25 mL, em duplicata. O volume final de cada balão foi completado
com fase móvel, perfazendo concentrações de 8, 16, 24, 32,40 e 48 Ilg/mL de ácido
kójico. Após filtração em seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com
membrana de 0,45 11m (descrita no item 4.1.3) as soluções foram transferidas para
frascos próprios para injeção automática.
4.2.6.2. Exatidão (Recuperação)
a) Amostra ácido kójico 1 % creme
Pesou-se 1,0000 9 da amostra creme especificada no item 4.2.4.1 em béquer
plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio
de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico
de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O
volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de
vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se
concentrações finais de 100 Ilg/mL de ácido kójico.
b) Amostra ácido kójico 1% gel
Pesou-se 1,0000 9 da amostra gel especificada no item 4.2.4.1 em béquer
plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio
de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico
de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O
volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de
vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se
concentrações finais de 100 Ilg/mL de ácido kójico.
c) Solução Padrão
Para o preparo da solução padrão pesou-se 100,0 mg de ácido kójico
substância de referência em um balão volumétrico de 50 mL âmbar. O volume foi
completado com a fase móvel descrita no item 4.2.5.3. Transferiu-se 10 mL, medidos
68
volumetricamente, para um segundo balão volumétrico de 200 mL, sendo o volume
completado com fase móvel (concentração final de 100 ~g/mL de ácido kójico).
Alíquotas da solução padrão e dos filtrados das amostras foram transferidas
para balões volumétricos âmbar de 25 mL (em triplicata) conforme segue, sendo o
volume final completado com fase móvel:
Amostra ácido kójico 1 % creme
Sol. Padrão Amostra creme [K]
K (100~g/mL) K (1 00 ~g/mL) volume (mL) volume (mL) (~g/mL)
1 4,0 16
2 4,0 16
3 2,0 4,0 24
4 4,0 4,0 32
5 6,0 4,0 40
K= ácido kójico
Amostra ácido kójico 1 % gel
Sol. Padrão Amostra gel [K]
K (100~g/mL) K (100 ~g/mL) volume (mL) volume (mL) (~g/mL)
1 4,0 16
2 4,0 16
3 2,0 4,0 24
4 4,0 4,0 32
5 6,0 4,0 40
K= ácido kójico
69
Os conteúdos dos balões volumétricos de 25 mL contendo padrões e
amostras foram filtrados em seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com
membrana de 0,45 Ilm (descrita no item 4.1.3) e transferidos para frascos próprios
para injeção automática.
4.2.6.3. Precisão
a) Amostra ácido kõjico 1 % creme
Pesou-se 0,8000 g da amostra creme especificada no item 4.2.4.1 em béquer
plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio
de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico
de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O
volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de
vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se
concentrações de 80 Ilg/mL de ácido kójico.
Transferiu-se 10 mL do filtrado obtido para balão volumétrico âmbar de 25
mL, completando-se o volume com fase móvel. Foram obtidas 10 replicatas
correspondendo à concentração de 32 Ilg/mL de ácido kójico.
b) Amostra ácido kõjico 1 % gel
Pesou-se 0,8000 9 da amostra gel especificada no item 4.2.4.1 em béquer
plástico. A fase móvel foi adicionada aos poucos e a dispersão foi feita com auxílio
de bastão de vidro. Transferiu-se o conteúdo do béquer para um balão volumétrico
de 100 mL âmbar, o qual foi colocado em aparelho de ultra-som por 15 minutos. O
volume final foi completado com fase móvel e posteriormente filtrado em funil de
vidro com papel de filtro, desprezando-se os 10 mL iniciais, obtendo-se
concentrações de 80 Ilg/mL de ácido kójico.
Transferiu-se 10 mL do filtrado obtido para balão volumétrico âmbar de 25
mL, completando-se o volume com fase móvel. Foram obtidas 10 replicatas
correspondendo à concentração de 32 Ilg/mL de ácido kójico.
c) Solução Padrão
70
Para o preparo da solução padrão estoque pesou-se 100,0 mg de ácido kójico
substância de referência em um balão volumétrico de 50 mL âmbar. O volume foi
completado com a fase móvel descrita no item 4.2.5.3. Transferiu-se 10 mL, medidos
volumetricamente, para um segundo balão volumétrico de 100 mL, sendo o volume
completado com fase móvel (concentração de 200 Jlg/mL de ácido kójico).
Da solução estoque preparada foram transferidos 4 mL para balão
volumétrico âmbar de 25 mL, completando-se o volume com fase móvel
(concentração final de 32 Jlg/mL de ácido kójico). As soluções foram obtidas em
triplicata.
Os conteúdos dos balões volumétricos de 25 mL contendo padrões e
amostras foram filtrados em seringa de vidro acoplada a unidade filtrante com
membrana de 0,45 Jlm (descrita no item 4.1.3) e transferidos para frascos próprios
para injeção automática.
4.2.7. Comparação dos métodos analíticos UVD e CLAE
O método de determinação do ácido kójico 1 % em formulações creme e gel
por espectrofotometria derivada de primeira ordem no ultravioleta (UVD) foi
estatisticamente comparado à cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) quanto
à exatidão por meio do teste t e quanto à precisão por meio do teste F3.
4.2.8. Estudo de estabilidade acelerado
As formulações selecionadas no estudo preliminar de estabilidade (16, 30, 42
e 46) foram submetidas ao estudo de estabilidade acelerado, com duração de 90
dias, tendo como base o Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos da ANVISA
3 Quando se pretende avaliar se 2 métodos (A e B) tem diferenças significativas entre si , em termos de precisão, pode-se recorrer ao teste F. Este baseia-se no cálculo da razão entre as variâncias dos 2 métodos (F cale = SA2/SS\ colocando-se a maior no numerador, de modo que a razão seja maior ou igual a 1. Em seguida, compara-se esse valor obtido com o valor tabelado de F. Se F cale::; F tab, os 2 métodos não apresentam diferenças significativas entre si , relativamente às suas precisões (INMETRO, 2003) . O teste t é utilizado para se comparar médias, portanto para se detectar erros sistemáticos, ou seja , aqueles relacionados à exatidão (MILLER; MILLER, 1993).
71
(BRASIL, 2004a), os instrumentos 01A (R2) (ICH, 2003) e 01 B (ICH, 1996a) e a
Resolução RE n° 398 da ANVISA (BRASIL, 2004b).
4.2.8.1. Preparo das formulações
Cada formulação selecionada para o estudo de estabilidade acelerado foi
preparada em lote de 1300g.
a) Amostra ácido kójico 1 % associada a ácido glicólico 5% creme
Substância % função
Ácido kójico 1,0 princípio ativo
Ácido glicólico 5,0 princípio ativo
Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante
EdtaNa2 0,15 quelante
Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão
NaOH 5 M q.s. pH 3,50 7,5 alcalinizante
Creme Polawax® com 0,2% HEC* q.s.p 100,0 excipiente
*hidroxietilcelulose
o excipiente creme polawax® com 0,2% HEC foi preparado usando-se um
agitador mecânico, pelo método de inversão de fases. O ácido glicólico (sol.
comercial 70%) foi neutralizado com ° NaOH, e acrescentado do tampão citrato,
edta (na forma de solução aquosa a 10%) e do metabissulfito de sódio, originando
uma solução límpida. O ácido kójico foi triturado em gral e incorporado
geometricamente da formulação creme polawax® anteriormente preparada. A
solução do ácido glicólico neutralizado foi vertida aos poucos sobre o gral e todo o
conteúdo homogeneizado.
72
b) Amostra ácido kójico 1 % associada a ácido glicólico 5% gel
Substância % função
Ácido kójico 1,0 princípio ativo
Ácido glicólico 5,0 princípio ativo
Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante
EdtaNa2 0,15 quelante
Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão
NaOH 5 M q.s. pH 3,50 7,5 alcalinizante
Gel de Natrosol® q.s.p 100,0 excipiente
o excipiente gel de natrosol® foi preparado usando-se um agitador mecânico,
a 60°C. O ácido glicólico (sol. comercial 70%) foi neutralizado com o NaOH, e
acrescentado do tampão citrato, edta (na forma de solução aquosa a 10%) e do
metabissulfito de sódio, originando uma solução límpida. O ácido kójico foi triturado
em gral e incorporado geometricamente da formulação gel de natrosol®
anteriormente preparada. A solução do ácido glicólico neutral izado foi vertida aos
poucos sobre o gral e todo o conteúdo homogeneizado.
c) Amostra ácido kójico 1 % creme
Substância % função
Ácido kójico 1,0 princípio ativo
Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante
EdtaNa2 0,15 quelante
Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão
Creme Polawax® com 0,2% HEC* q.s.p 100,0 excipiente
*hidroxietilcelulose
O excipiente creme polawax® com 0,2% HEC foi preparado usando-se um
agitador mecânico, pelo método de inversão de fases. Os adjuvantes tampão citrato,
73
edta (na forma de solução aquosa a 10%) e metabissulfito de sódio foram
misturados previamente, originando uma solução límpida. O ácido kójico foi triturado
em gral e incorporado geometricamente da formulação creme polawax®
anteriormente preparada. A solução dos adjuvantes foi vertida aos poucos sobre o
gral e todo o conteúdo homogeneizado.
d) Amostra ácido kójico 1 % gel
Substância % função
Ácido kójico 1,0 princípio ativo
Metabissulfito de sódio 0,3 antioxidante
EdtaNa2 0,15 quelante
Tampão citrato 1 M pH 3,50 10,0 tampão
Gel de Natrosol® q.s.p 100,0 excipiente
O excipiente gel de natrosol® foi preparado usando-se um agitador mecânico,
a 60°C. Os adjuvantes tampão citrato, edta (na forma de solução aquosa a 10%) e
metabissulfito de sódio foram misturados previamente, originando uma solução
límpida. O ácido kójico foi triturado em gral e incorporado geometricamente da
formulação creme polawax® anteriormente preparada. A solução dos adjuvantes foi
vertida aos poucos sobre o gral e todo o conteúdo homogeneizado.
Após o preparo, cada formulação foi distribuída em potes plásticos de
poliestireno branco com capacidade para 30 9 devidamente identificados. De cada
uma das quatro formulações foram produzidos potes em número suficiente para 3
condições de armazenagem e 6 tempos de leitura, em duplicatas denominadas "a" e
"b". Também foram produzidos o creme e o gel base das formulações (isentos dos
princípios ativos e do NaOH), os quais foram também expostos às 3 condições de
armazenamento. Todos os potes foram fechados com batoque e tampa e selados
•owpcoid eialovkamn op oçfflai e epueadwoo anb epedwei ewn woo (lanisvk op oçA6a0 euj eoueiq epedum ewn ap oçõeposse ep claw iod onoadsa owsew o ABuRe wa als!suoo anb `z oeódo e eu `opealaw ou JR.111109U0 ap spolip a (Asno ojie ap Qçs sepedwei sie} anb zan ewn "elaiovkawn a lanisin duoadsa o eumwoo anb (LL601 osi e woo opooe ep `e!P op zol leuopewaiu! offed) 59(31/59(3 ePeclwm ewn ap osn o ?naid H01 op 1 ocódo V g
"(VOOZ `1\13S-IIN) seroo sep oeõeuene ap oeó!puo0 Jouiaw e epmuuad ienb e ,e!p_opw oe 001.1.1? ieiod oinatio ou emitia zni ç apuodsoiioo m000çg ap (.soo ap ainieJadwai) op zni e oçóelai wa epu,apuodsauoo e a Jo!ew %001 ap owvoid spw ojuenb `elas no lainieu zni ep onoadsa o a epedwm elad opeie6 cupadsa o aflua epu?puodsauoo e znpaii (Joo ap oçõnpaidai ap ao!pul) odi
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epeo e seTsodxe waio4 1"2""j7 ww ou sepeuopuew seo5einauo4 .t7 se sapo'
.olueweuezeiwe
ap spiwou sao5!puoo we seo5eintewoi. sep apepffiqelse e Jequedwooe
ap a44 e `(00enj) aluamwe ainTaladwal ç opeqoa4 opçwN (o
.(e966 `HOI) HOI op epepumelsamod ap se sal
wed ein op SZ oOdo — (Moa e!u?AIÁS „AN 10e18„ ePedw?i) aleGU
zni e epeposse 17)i.0099 O_UT096 3 I `996/M 81, Cn1 sd!INd (AN
Áep„) ello op zni sawaosaiong sepedwa1 opualuoo 1003---Fg3 eInTs3 (q
"zni ap epuasne woo `OcZi 0i7 ens (e
olueweuazewie ap sao5!puo0
"eog.joadse 041.19W8UeZeWJC ap
oe5puoo ens eu epeooloo Jas ap saiue epesed !ol weBeieqwe epeo "adaio woo
iL
seei? sep iwed V "sin-An iopeiep woo onzpewms op!nbli oieJ69Tewon ou `c.g.z.17
wa;i ou seppaiaqeisa spluawpadxa segôipuoo se opunhas 3vi3 Jod `eleoudnp
we isepeu!wJapp a .L.g.3.17 Wel! o ~aluo° seplaiixe `alue!qwe emileJedwal
? sepeia6uoasep weJol sealsowe se (opnlse op oeõezneu4 e s9dv •aluewele!pew!
opeia6uoo a ond ap awg woo (magoo !ol Janinci o ..soai op °papo ou o?5a_uoo
Jopalsod eJed sopepue WeJOI sopesad samen so -opeowluap! aluewepnap
oo!is?id Janb9q es-opuesn 'com reue eõueieq we eAsowe ap 6 0002'0 ap caie° as
-nosad `(„e„ eleondnp) waBeieqwe ep opriewoo op oeõez!eue6owou sodv
oweweasop (o
•aluemwe einTeiedwal e Lopexineo oAaw9puelod
We opipew io4 Hd o a opeffie ioJ opr,-ialuoo o 19661, `VISIdd) epepsep enfie
ap 1w 6 ap opeuoppe aluaw.iopeisod `apn ap 00SeJj. wn we eJTSOW8 ep 61, es
-nosed („e„ eleondnp) wa6eleqwe ep opr,lawoo op oe5ez!eua6owou s9dv
Hd (q
.apepaueBowou e epu?Ts!suoo `Jopo `.100 eu seoõeJalle
e oiuenb leu!No wa6eieqwe ens eu sepenene weJol seAsowe sv
soo!Td9ioue6Jo saJapeleo (e
soloadse salupbas so opunhas
sepenene WCJOJ. SCASOWC se `011JeWeUeZeWJe ap opoped epeo ap ieu4 ov
sepez!leai saslieuy .v.g.z.v
eJed eJ!apeie6 we opeuazewie e aTuawenou °peias !q. eTod epeo 'esq?ue
eJed eleloo sodv •opeloue Joien o e epesed !ol weBeieqwe epeo einieJedwal ep
oe5ezumelse sodv .soppaieqese-9id sodwal sou („q„ e „e„ eleondnp) waBeuezewJe
ap oe5!puoo epeo ap sopainai WeJOI seTod so '01 oied oleox3
(061) se!p 06 odwal-
(o9i) sep 09 odwal -
SL
76
obtidas pela integração dos picos calculou-se o teor das amostras submetidas ao
estudo de estabilidade. Para cada amostra e condição de armazenagem foi
calculada a média do teor remanescente em relação ao T Q. OS resultados foram
submetidos à estatística descritiva e aval iados por ANOVA e teste de comparações
múltiplas de Bonferroni. O nível de significância pré-estabelecido foi de 5%.
d) Comportamento reológico
As amostras (duplicata "b") retiradas de cada condição de armazenagem
nos tempos pré-estabelecidos, foram colocadas em sala climatizada a 23±2°C e
deixadas estabilizar, ao abrigo da luz, por 24 horas. Após esse período as
embalagens foram abertas e, sem que fossem homogeneizadas, aproximadamente
13 g foram retirados e transferidos para um adaptador de pequena amostra ("small
adapter" SC4-45Y Brookfield®). As análises foram realizadas, em duplicata, no
viscosímetro rotacional Brookfield® RVT, utilizando-se a haste SC-2 29/13R Os
valores de torque foram registrados na faixa de velocidade de 0,5 a 100 rpm (curva
ascendente) e de 100 a 0,5 rpm (curva descendente), correspondendo a 0,125 - 25
(1/s) e 25 - 0,125 (1/s) de gradiente de velocidade ("shear rate"). Foi observado o
intervalo de 2 minutos entre cada faixa de velocidade. Usando-se o fator de
conversão especificado pelo fabricante para o "spindle" SC-4 29/13R, os valores de
torque foram convertidos em viscosidade expressada em cPs. Uma vez que a
amostra ácido kójico 1 % gel apresentou valores de viscosidade fora da faixa prevista
para a haste selecionada na faixa de 20 a 100 rpm (estouro de escala), foi analisada
apenas na faixa de 0,5 a 10 rpm (0,125 a 2,5 1/s) de gradiente de velocidade.
77
5. RESU L T ADOS
5.1. Caracterização do ácido kójico e ácido glicólico matéria-prima
5.1.1. Espectroscopia no infravermelho
As figuras a seguir apresentam os espectros na região do infravermelho das
natérias-primas ácido kójico e ácido glicólico e seus respectivos padrões
substâncias de referência).
a) Ácido Kójico
BOMEM MB-100 25/11/00 11 ;05 Arquivo= 1 0784 Descricão: H
100 I __
BO
60
40
T ransmittance rWaverunber (em"
'" o 'O m
'"
3000 2000
~
~~ 1 ~ .. ~ o-- ~
N .. '"
'" '" ""
~
Scens =20 ReS? 4 cm-1 Mode .; 2 (Mid-IR) Ap.od =-Cosine
~ r ~ -< - N
0-U>
1000
Figura 1: Espectro do ácido kójico matéria-prima na região do infravermelho
(pastilha de KBr) . Bandas principais (comprimento de onda cm-1) : 1579 (
C-O-C aromático); 1609 (-C=O); 2852 (-CH alifático); 2922 (-CH
aromático); 3172 (-OH).
BOMEM MB-l00 25/11/0010:54 Arq!Jivo,," 10783 Descri~o:G
ao
1>0
40
3000 . 2000
N ~
Si N .... ... '"
~ ~
1000
Scans = 20 Res = 4cm-l Mode =2 (MicHR)' Ap..od = Cosine '
Figura 2: Espectro do ácido kójico substância de referência na regiâo do
infravermelho (pastilha de KBr) . Bandas principais (comprimento de onda
cm-1): 1579 (-C-O-C aromático); 1609 (-C=O); 2852 (-CH alifático); 2922
(-CH aromático); 3175 (-OH).
78
b) Ácido Glicólico
8om~m. MB100 Arquivo:= 11850 IAmostra: R Scans = 20
100
98
96
94
92 g; ~
3000 2000
fd ~
02i03i05 15: 19 , Apod = Cosine
Mpdo = 2 (Mid-IR) Res = 4" cm-1 22 scanslmin
'" 1'; kl
Figura 3: Espectro do ácido glicólico matéria-prima na região do infravermelho (filme
líquido). Bandas principais (comprimento de onda cm-1): 1732 (-C=O de
ácido carboxílico), 3200-3600 (-OH).
79
BOMEM MB-flfO 25/11 /00 10:01 Arquivo· 10776 Descrição: A
98
96-
94
92
1T.~:»-----.. }' •. '.~. __ . -L..o..I~""
3000 2000 1000
Scans = 20 Res = '4 em-1 tylode = 2 (Mid-IR) t'eod = Cosine
Figura 4: Espectro do ácido glicólico substância de referência do infravermelho
(pastilha de KBr). Bandas principais (comprimento de onda cm-1): 1721 (
C=O de ácido carboxílico) , 3200-3600 (-OH).
5.1.2. Espectrofotometria no UV
80
Os espectros de absorção no UV dos padrões (substância de referência) e
matéria-prima do ácido kójico encontram-se ilustrados nas figuras 5,6 e 7.
a) ácido K6jico
1.000\-, --~---.--~---r---~---'---~---'---~-----,
A b 0,5
~~ ~ 200,0 260,0
Wavelength (nrn.) 320,0
Figura 5: Espectro do ácido kójico matéria-prima na região do UV, concentração
de 10 IJg/ mL, tendo como solvente água destilada. Picos em 216,4 e
268,6 nm.
81
A b
1.000'rl --~----"r---~---'---~-----.--~---r---~---'
0,5001
0,0001 ~ 200.0 260.0
Wavelenglh [nm.] 320.0
Figura 6: Espectro do ácido kójico substância de referência na região do UV,
concentração de 10 1-191 mL, tendo como solvente água destilada. Picos
em 216,2 e 268,6 nm.
82
A b
c) Ácido Glicólico
1,000;r, --~-----'---~--"---~----r---~---;r----~-----,
0,5001
O .OO~ 200,0 260,0
Wavelength (nm.) 320,0
Figura 7: Espectro do ácido glicólico substância de referência na região do UV, na
concentração de 100 jJg/mL, tendo como solvente água destilada,
83
84
5.1.3. Análise térmica (curvas TG/DTG e DSC) do ácido kójico e do ácido
glicólico
As figuras a seguir caracterizam o comportamento térmico dos ácidos kójico e
glicólico nas condições estudadas.
0.20 0.00 DSC
-c L ~ ·E 0.00 -o, ...... _- ............. - ... -'"' ........ .
til E -2.00 ' . ,"~"._ .................... _-.. -... .. _ ............. _ ............ _.-# ..... _ ..... I ....
E ~ . "'\ ~ DTG ~ .ê- \\ l ·ãi o E
. . ~ ~ .
m . Q) .:g -0.20 -o . ro , E . ro
'f: Q)
o
o ~ -4.00
,
u::: , , ,
: -- -l O · TG -0.40 ~
-6.00 ~ · · · , ,
H . , , , . , ',1 .1
-0.60l ti I I
o 100 200 300 400 500 Temp [Cl
Figura 8: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico substância
de referência, razão de aquecimento 5°C/min, temperatura
ambiente a 550°C.
~l::
'E Cl .s ~
'Qi E 'C C. 10
U 10 >
' C Q)
o
0.00
-0.10
-0.20
-0.30
-0.40
-0.50
0.00
b! -2.00 E
~ ... o
~ ~ -4.00 o ~ ü:
-6.00
o
.~ .. ... _.--- .. _- ...... - ... _~
100 200
.. ,
DSC :-.- ••••• •••••• _. o.' • • •• _._ •••• ~~~G ....
300 Temp ICI
400 500
"
H
Figura 9: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico matéria
prima, razão de aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a
550°C.
85
100
~ 50~
E
o
~l::::
'e
0.00
r -D.10
~ 'Cji E
' 1:: a.
~ ~ .;:: (J)
o -D.20
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~ -4.00 ::J Li:
-6.00
.
. .
I
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I , 1 , r
O 100 ---LUU
I
" I .... ~ .. .
;;UU Temp [Cl
• I
'.1
DSC
DTG
~l TG
I
400 500
Figura 10: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC do ácido glicólico
substância de referência, razão de aquecimento SOC/min,
temperatura ambiente a SSO°C.
100
;g e.... 50 ~
(\l
E
j O
86
DSC 0.00 100
".~ ........ ~ -'.",'" .. .... , ............ DTG
~C: ~ ·E ~b> j ~ '\J ~ Ó E
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, , CIl , -c , , o , , , ~ , , Li: -2 ...
',' -0.20
-3
100
, , ,
, , ,
200 Temp [Cl
H TG
300 400
Figura 11: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC da mistura do ácido
glicólico/ácido kójico 1: 1 substâncias de referência, razão de
aquecimento SOC/min, temperatura ambiente a 400°C.
O
87
~
c: 'E C> .s e! 'Qj E .~
m
" m .~ Q; O
1.00
-0.50
O> E
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1-11 \ ~t\ t 0.50
~l -1 .50
0.00 o -2.00t: I ! I I I
o 100 200 300 400 Temp [C)
Figura 12: Sobreposição das curvas TG/DTG e DSC da mistura do ácido
glicólico/ácido kójico 5:1 substâncias de referência (razão de
aquecimento 5°C/min, temperatura ambiente a 400°C).
88
~ U! f/l m E
C:: "E ti> .s « C!)
t o
100 200 Temp [C]
300
H
400
Figura 13: Sobreposição das curvas DTG do ácido glicólico substância de
referência (-), ácido kójico substância de referência (- ), da
mistura do ácido glicólico/ácido kójico 1: 1 substâncias de referência
(- ) e da mistura do ácido glicólico/ácido kójico 5: 1 substâncias de
referência (- ), aproximadamente 5 mg de amostra, razão de
aquecimento 5°e/min. (temperatura ambiente a 400°C), obtidas sob
atmosfera dinâmica de ar de 50 mUmin, em cadinho de platina.
89
~
-" 'E ci> .s ~ Cl
o 100 200 Temp [C]
300
~ 1 400
Figura 14: Sobreposição das curvas DSC do ácido glicólico substância de
referência (-), ácido kójico substância de referência (- ), da
mistura do ácido glicólico/ácido kójico 1: 1 substâncias de
referência (- ) e da mistura do ácido glicólico/ácido kójico 5: 1
substâncias de referência (- ), aproximadamente 2 mg de
amostra, razão de aquecimento 5°C/min. (temperatura ambiente a
400°C) , obtidas sob atmosfera dinâmica de N2 de 100 mUmin, em
cadinho de alumínio.
90
91
As curvas isotermas obtidas com a mistura ácido glicólico : ácido kójico 5: 1
são mostradas na figura 15.
A partir dos tlO% observados (descontado o tempo necessário para atingir a
Tiso) foi construído o gráfico de Arrhenius, apresentado na figura 16.
TG.A %
10
9
9
o
27 ,26 min 68,14 min 108,49
-10.022% -10.002% -10.012% 165,14 min -10.014%
249,84 min -10.000% ~W ___ ~_··· ___ • __ •• • •• _ _ · ···1 ___ __ _______ ___ ~ ________ ____ ____ __ ___ __ ~
, ,
50 100 150 Time [min]
65' C
70' C
75' C
80'C
90' C
200 250
Figura 15: Sobreposição das curvas TG isotérmicas da mistura ácido glicólico/ácido
kójico 5:1 substâncias de referência, razão de aquecimento 5°C/min.
(temperatura ambiente a T iso·1 O°C) seguida de 2°C/min. até ocorrência de
10% de perda de massa, obtidas sob atmosfera dinâmica de ar de 50
mUmin, em cadinho de platina.
92
5,5 In t = 10910,6 (1fT) - 26,7
5,0 r2= 0,9978
ê 4,5
E ........ -c 4,0
3,5
3,0 2 ,8x10-3 2,8x10-3 2,9x10-3 2,9x10-3 3,OX10-3
1fT (K1)
Figura 16: Gráfico de Arrhenius (y = a + bx) da mistura ácido glicólico/ácido kójico 5: 1
substâncias de referência.
93
A energia de ativação E, calculada pelo produto da inclinação da reta
(10910,6) pela constante molar dos gases (8,314 J. moI. K1) foi de 90,7 KJ. mor1.
A equação obtida foi usada a fim de se estimar o tempo necessário para se
verificar uma degradação de 10% à temperatura de 25°C. A extrapolação resultou
num tempo de vida útil a 25°C de 14,7 dias.
5.2. Estudo preliminar de estabilidade das formulações
5.2.1. Formulações contendo ácido kójico associado a ácido glicólico
Os resultados da avaliação das formulações creme e gel contendo ácido
kójico associado a ácido glicólico (1 a 35), após o estudo preliminar de estabilidade
encontram-se representados nas tabelas a seguir.
A avaliação foi feita considerando-se como referências as embalagens
armazenadas em geladeira e o creme e gel base de cada formulação.
94
a) armazenagem em estufa a 45±2°C
Tabela 1: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e ácido
glicólico associados, usando como excipiente creme não iônico,
armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem
plástica (polipropileno).
F COTo CO T30 pH To pH T30
1 branco +++ 3,77 3,72
2 branco +++ 3,73 3,69
3 branco +++ 3,85 3,66
4 branco ++ 3,83 3,70
5 branco ++ (s) 3,46 3,54
6 branco + (s) 3,23 3,45
7 branco +++ 3,79 3,84
8 branco ++ (s) 3,62 3,41
9 branco +++ 3,65 3,78
10 branco ++ 3,56 3,56
11 branco (c) (b) ++++ 4,27 4,02
12 bege claro (c) (b) ++++ (sp) 4,32 4,16
13 bege claro (c) +++ (sp) 3,65 3,61
14 branco ++ 3,65 3,59
15 branco ++ (b) 3,63 3,52
16 branco + 3,65 3,58
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); c = perda de consistência; b = formação de bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases.
95
Tabela 2: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e ácido
glicólico associados, usando como excipiente creme aniônico,
armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem
plástica (polipropileno).
F COTo CO T30 pH To pH T30
17 branco ++ 3,75 3,79
18 branco +++ 3,84 3,67
19 branco ++ 3,42 3,57
20 branco ++ (s) 3,16 3,23
21 branco ++ (b) 3,60 3,57
22 branco (c) + (b) 3,63 3,68
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (amarelo claro ao marrom escuro) ; c = perda de consistência; b = formação de bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases.
96
Tabela 3: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e ácido
glicólico associados, usando como excipiente gel de natrosol®,
armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem
plástica (polipropileno).
F COTo CO T30 pH To pH T3Q
23 incolor +++ 3,65 3,89
24 incolor +++ 3,72 3,68
25 incolor ++ 3,61 3,62
26 incolor (s) ++ 3,23 3,35
27 Incolor (b) ++++ 3,65 3,77
28 incolor (b) +++ 3,58 3,65
29 incolor (b) +++ 3,60 3,69
30 incolor + 3,66 3,76
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (laranja claro ao marrom escuro); b = formação de bolhas; s = odor de
sulfeto.
97
Tabela 4: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e ácido
glicólico associados, usando como excipiente gel de amigel®,
armazenadas à temperatura de 45±2°C em estufa, em embalagem
plástica (polipropileno).
F COTo COT30 pH To pH T30
31 incolor +++ 3,69 3,72
32 incolor +++ 3,70 3,68
33 incolor ++ (g) 3,49 3,60
34 incolor (s) +++ 3,21 3,35
35 incolor (c) ++++ 3,59 3,68
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (laranja claro ao marrom escuro); b = formação de bolhas; c = perda de
consistência; s = odor de sulfeto; g = aspecto gelatinoso.
b) exposto à luz em embalagem de vidro incolor
Tabela 5: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e ácido
glicólico associados, usando como excipiente creme não iônico, expostas
à luz (temperatura ambiente) em embalagem de vidro incolor.
F COTo CO T30
10 branco +
13 bege claro (c) + (b)
14 branco +
15 branco sd (b)
16 branco sd
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (bege claro ao marrom claro) ; c = perda de consistência; b = formação de
bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases; sd = sem degradação.
98
Tabela 6: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico e ácido
glicólico associados, usando como excipiente gel de natrosol®, expostas
à luz (temperatura ambiente) em embalagem de vidro incolor.
F COTo CO T30
30 incolor sd
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (amarelo claro a marrom claro) ; c = perda de consistência; b = formação
de bolhas; s = odor de sulfeto; sd = sem degradação.
5.2.2. Formulações contendo ácido kójico
As tabelas a seguir apresentam os resultados da avaliação das formulações
creme e gel contendo ácido kójico (36 a 48), após o estudo preliminar de
estabilidade.
A avaliação foi feita considerando-se como referências as embalagens
armazenadas em geladeira e o creme e gel base de cada formulação.
99
a) armazenagem em estufa a 45±2°C
Tabela 7: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico, usando
como excipiente creme não iônico, armazenadas à temperatura de
45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).
F COTo CO T30 pH To pH T30
36 branco ++ 3,80 3,54
37 branco ++ 3,96 4,27
38 branco (s) + 3,79 3,80
39 branco ++ 3,91 3,84
40 bege claro (c) ++ (sp) 3,92 3,84
41 bege claro (s) ++ (b) 3,10 3,00
42 branco sd 3,91 3,80
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); c = perda de consistência; b =
formação de bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases; sd = sem degradação
evidente.
./ BiB~I :~il ~C A
Faculdade de Ciências Farrnacêuticas , Universidade de São Paulo
100
Tabela 8: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico, usando
como excipiente creme aniônico, armazenadas à temperatura de
45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).
F COTo COT3Q pHTo pH T30
43 branco ++ 4,66 4,02
44 branco + (b) 3,85 4,09
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); c = perda de consistência; b = formação de bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases.
Tabela 9: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico, usando
como excipiente gel de natrosol®, armazenadas à temperatura de
45±2°C em estufa em embalagem plástica (polipropileno).
F COTo COT3Q pH To pH T3Q
45 incolor +++ 5,18 4,30
46 incolor + 4,17 4,20
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); b = formação de bolhas; s = odor de
sulfeto.
101
Tabela 10: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico,
usando como excipiente gel de amigel®, armazenadas à temperatura
de 45±2°C em estufa, em embalagem plástica (polipropileno).
F COTo CO T30 pH To pH T30
47 incolor +++ 4,55 4,09
48 incolor ++ (c) (g) 4,05 4,07
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (amarelo claro ao marrom escuro); b = formação de bolhas; c = perda da
consistência; s = odor de sulfeto; g = aspecto gelatinoso.
b) exposto à luz em embalagem de vidro incolor
Tabela 11: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico usando
como excipiente creme não iônico, expostas à luz (temperatura
ambiente) em embalagem de vidro incolor.
F COTo CO T30
39 branco +
40 bege claro (c) sd
41 bege claro (s) + (b)
42 branco sd
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (bege claro ao marrom claro); c = perda de consistência; b = formação de
bolhas; s = odor de sulfeto; sp = separação de fases; sd = sem degradação.
102
Tabela 12: Resultados da avaliação das formulações contendo ácido kójico usando
como excipiente gel de natrosol®, expostas à luz (temperatura
ambiente) em embalagem de vidro incolor.
F COTo CO T30
46 incolor sd
Legenda: F = formulação; CO = características organolépticas; + a ++++ intensidade
da degradação (amarelo claro a marrom claro); c = perda de consistência; b = formação
de bolhas; s = odor de sulfeto; sd = sem degradação.
103
5.3. Validação do método de determinação do ác. kójico por
espectrofotometria derivada no ultravioleta (UVD)
5.3.1. Espectro de absorção do ácido kójico
A figura 17 mostra o espectro de absorção direto e o de primeira derivada do
ácido kójico, obtidos conforme as condições experimentais estabelecidas no item
4.2.4.3.
A b
1,OOOrl ------,..-------,---------,,..-------r---------,
-0,100IL1 ___ ~ __ ....L... __ ~ ___ .l_ __ ~ __ ---.JL_ __ ~ __ __L ___ ~ __ ....J
200,0 260,0 Wavelength (nm.)
320,0
Figura 17: Espectro de absorção direto (--) e de primeira derivada (- ) do ácido kójico
substância de referência (10 IJg/mL) em metanol.
104
5.3.2. Curva de calibração do ácido k6jico por espectrofotometria
derivada de 1a ordem
o espectro de absorção direto da curva de calibração do ácido kójico, obtido
nas condições experimentais padronizadas no item 4.2.4.3 pode ser encontrado na
figura 18. A figura 19 mostra o mesmo espectro de absorção em 1 a derivada.
A b s
1.800..-, --~----'---------'---~--'----~---r---~--""
0.0001 --- ?:'? 200.0 260.0
Wavelength (nm.) 320.0
Figura 18: Espectro de absorção direto da curva de calibração do ácido kójico
em metanol , intervalo de concentração de 2 a 18 j.Jg/mL.
A b
.0.0801 I\\V/U
200.0 260.0 \\Iavelength (nm.)
320.0
105
Figura 19: Espectro de absorção em derivada de primeira ordem da curva de calibração
do ácido kójico em metanol, intervalo de concentração de 2 a 18 I-Ig/mL.
Os valores experimentais obtidos na construção da curva de calibração do
ácido kójico por espectrofotometria derivada estão descritos na tabela 13.
A regressão linear da curva, obtida pelo método dos mínimos quadrados, e os
dados estatísticos da regressão são mostrados nas figuras 20 e 21 ,
respectivamente.
106
Tabela 13: Absorbâncias e Mbs/I1À obtidas na construção da curva de calibração
do ácido kójico em metanol, nas concentrações de 2 a 18 I-Ig/mL.
Concentração Absorbância* DPR(%) I1Abs/ I1À * DPR(%) j..Jg/mL (270 nm) (270 nm) (256,8 nm) (256,8 nm)
2 0,1181 3,57 0,0030 3,81
4 0,2272 1,01 0,0066 1,74
6 0,3402 0,19 0,0100 0,58
8 0,4515 1,05 0,0131 1,16
10 0,5698 0,81 0,0170 0,90
12 0,6817 0,49 0,0205 0,75
14 0,7918 0,76 0,0234 0,74
16 0,9003 0,15 0,0267 0,22
18 1,0161 0,23 0,0305 0,50
* média de três determinações
107
0,035
y = -2,86.10.4 + 0,0017 x 0,030
0,025
c< 0,020 <l --Cf)
III 0,015 ~
0,010
0,005
0,000 O 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
concentração ~g/mL
Figura 20: Curva de calibração do ácido kójico (2 - 18 IJg/mL) em metanol, obtida por
espectrofotometria derivada de primeira ordem no ultravioleta a 256,8 nm.
Regressão linear: y = a + bx
Parâmetro
a b
r
0,9997
Valor
-2,86.10-4
0,0017
DP
2,32.10-4
Erro
1,69.10-4 1,50.10-5
N
9
(t., = 1,69)
P
<0.0001
Figura 21 : Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração do ácido
kójico em metanol a 256,8 nm, obtida pelo método dos mínimos quadrados,
onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de
correlação e t., = t calculado (teste de significância de a).
110
b) Amostra ácido kójico 1% gel
A figura 24 mostra os espectros diretos da amostra ácido kójico 1 % gel, gel
base e solução padrão, obtidos conforme o item 4.2.4.5.1, em metano/.
A b
tODO, I
0,500
/ :/ r v ~\
0,000' 2'=- ~
200,0 260,0 Wavelength (nm.)
320.0
Figura 24: Espectros de absorção direto do padrão de ácido kójico a 10 f..Lg/mL (- ),
da amostra ácido kójico gel 10 f..Lg/mL (- ) e do gel base (- ), em
metanol, com intervalo de leitura de 200 a 320 nm.
A análise dos espectros de absorção diretos apresentados permite concluir
que o uso do método direto não é aplicável, uma vez que ocorre sobreposição do
espectro do gel base com os espectros do padrão e da amostra. Tal sobreposição
evidencia que os excipientes usados na formulação absorvem na mesma região de
comprimento de onda que o analíto.
111
A figura 25, por sua vez, mostra os resultados obtidos a partir da derivação
dos espectros diretos, usando-se o método "zero crossing", no qual utiliza-se o
comprimento de onda onde o espectro derivado do gel base se anula.
A b
0,065" --~---.---~---.---~---r---~---r---~----'
0,0001 ' o \( l ' ? c::: l ? c=:==:: :=::...... \.. )( :::;;= ::::;:::::n
-0,065' ,~(
200,0
256,8 nm
260,0 Wavelength (nm,)
320,0
Figura 25: Espectros de absorção em derivada de primeira ordem do padrão
de ácido kójico a 10 Ilg/mL (- ), da amostra ácido kójico gel 10
Ilg/mL (-) e do gel base (- ), em metanol, com intervalo de leitura
de 200 a 320 nm. Ponto de anulação do gel base a 256,8 nm
(método quantitativo "zero crossing").
A obtenção dos espectros em derivada de primeira ordem permite identificar o
ponto de anulação onde é possível a quantificação do ácido kójico sem interferência
dos excipientes do gel base, o que ocorre a 256,8 nm.
112
5.3.3.2. Interferência dos produtos de degradação
o espectro direto e em derivada de primeira ordem da amostra ácido kójico
1 % creme submetido a envelhecimento acelerado a 45°C em estufa por 30 dias,
conforme o item 4.2.4.5.2., são mostrados nas figuras 26 e 27.
A b
0.0001 ~ 200.0 260.0
Wavelength (nm.) 320.0
Figura 26: Espectro direto, em metanol, da amostra ácido kójico creme a 10 fJ.g/mL (- ),
da amostra ácido kójico creme a 10 fJ.g/mL submetido a envelhecimento
acelerado (- ) e da solução padrão de ácido kójico a 10 fJ.g/mL (- ).
A b
0,065" --.....,....--__._--~--__._--~--__._--~--_,_--~-___,
.0,065' v 200,0 260,0
Wavelength (nm.) 320,0
113
Figura 27: Espectro de absorção em primeira derivada, em metanol, da amostra ácido
kójico creme a 10 ~g/mL (- ), da amostra ácido kójico creme a 10 ~g/mL
submetido a envelhecimento acelerado (- ) e da solução padrão a 10
~g/mL (- ).
5.3.4. Exatidão (Recuperação)
Os valores experimentais obtidos na recuperação de concentrações
conhecidas de padrão adicionadas à amostra, conforme especificado no item
4.2.4.6, são apresentados a seguir.
A porcentagem de recuperação foi calculada conforme segue:
[amostra adicionada de padrão] - [amostra não adicionada de padrão] %R= x 100
[padrão adicionado]
114
a) Amostra ácido kójico 1 % creme
Os resultados obtidos na recuperação de alíquotas de padrão adicionados à
amostra, conforme as condições experimentais estabelecidas no item 4.2.4.6,
usando o método espectrofotométrico derivado de primeira ordem a 256,8 nm,
podem ser observados na tabela 14.
Tabela 14: Resultados obtidos no teste de recuperação para amostra ácido kójico
1 % creme, por espectrofotometria derivada de primeira ordem no
ultravioleta, método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente
metanol.
Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR Ilg/mL Ilg/mL (%) (%)
2,00 2,06 103,00 0,00
4,00 4,12 103,00 0,00
6,00 6,18 103,00 0,57
* média de três determinações
a) Amostra ácido kójico 1 % gel
Os resultados obtidos na recuperação de alíquotas de padrão adicionados à
amostra, conforme as condições experimentais estabelecidas no item 4.2.4.6,
usando o método espectrofotométrico derivado de primeira ordem a 256,8 nm,
podem ser observados na tabela 15.
„BUISSOJO cuaz„
onevluenb opolaw `eiaio!negin ou wapio emewpd ap epenpap eplawolojapedse
iod 81110.10 00g9)1 oppe eAsowe eu oo![91 opp? ap _1091 op oebeugualep
eu sopgqo sopefinsai so agsuowep Anões e epeluesaide 91, v
OW0-13 %I, 03!!9 Opp? ensowv (e
oespaid 'T£'9
sao5eu!twaTep saJT ap ellnw
LZ`O 00'66 176'S 00'9
ZEL O 09'66 86`8 00'17
00'0 00'1,0 I- ZO`Z 00`Z
(%) HdCI
(%) oeõeJadnoau
1w1611 .opeiednow oeiped
lw/611 opeuoioipe oaped
111.1U g`99z e „6UISS010 0.1eZ„ onRepluenb opolaw celaio!naiiin
ou wapio ei!awpd ap epenpap eplawoloi.apadsa Jod %1,
0301 oppe eAsowe wed oeõeJadnoai ap alsal ou sopgio sopeinsau elege].
566
116
Tabela 16: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico na amostra
ácido kójico 1 % creme por espectrofotometria derivada de primeira
ordem, método quantitativo "zero crossing" a 256,8 nm, solvente
metano!.
Valor rotulado valor encontrado* teor DPR Intervalo de ácido kójico (%) confiança
(%) (%) (%) (p=95%)
1,0 0,9838 98,38 0,41 98,4 ± 0,3
* média de 10 determinações
b) Amostra ácido kójico 1 % gel
A tabela 17 apresentada a seguir ilustra os resultados obtidos na
determinação do teor de ácido kójico na amostra ácido kójico 1 % gel por
espectrofotometria derivada de primeira ordem no ultravioleta, método quantitativo
"zero crossing".
.opolaw op oluaumnionuasep eied lanow ase'.
ep oeõeies eu somo sopelinsai so ansow An6as e epeluesakle g 6 elegei V
saieugullaid sooggiBoiewon sowsu3 • I 9
3V13
iod sopeposse soppe sop oe5eugua;ap ap opovaw op oeSepHeA 'p•9
seo5eug.tualap 01, ap e!P9w .
E`O -T- Ç'L6 617'0 ES'L6 ESL6'0 0'1.
(cY0S6=d) (%) (%)
(%) eõue!juop (%)
oo!!.91 opp?
ap oielualui UdCI soe]. .opaquooua JOICA °perlai JoleA
"iouelaw aluemos `wu g'gg e „611ISS0.10 aleZ„ onnelnuenb opolaw
`wapio wiet.upd ap epenpap epiewolojapedse Jod 1a6 % I, 0301 oppe
ailsowe eu oogol opp? ap Joal op oeõeu!auelap eu sopicio sopefinsed :, eiaclei
L1.1.
118
Tabela 18: Sistemas cromatográficos testados no desenvolvimento do método.
Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro® RP Phenomenex,
vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 ~L, detecção a 220 nm;
temperatura ambiente.
FM A B A:B pH tR G tR K
01 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 6,50 3,21 5,14
02 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 90:10 3,00 3,59 4,79
03 Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 90:10 3,00 3,89 6,63
04 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 2,30 3,74 6,16
05 Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 95:05 2,30 4,01 8,79
06 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 98:02 2,30 3,92 8,89
07 Tampão KH2POJH3P04 20 mM + 0,05% TEA ACN 98:02 2,30 3,73 6,17
08 Tampão KH2POJH3P04 10 mM ACN 95:05 2,00 3,82
09 Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 2,00 3,80 6,70
10 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 3,00 3,69 6,29
11 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM 3,00 3,82
12 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 2,30 3,87 6,88
13 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM 2,20 4,35 11,3
14 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 98:02 2,20 4,42 8,86
15 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 98:02 3,00 4,91 8,69
16 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 95:05 3,00 4,52 6,37
17 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 4 mM ACN 95:05 3,00 4,66 6,13
18 Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 95:05 3,00 4,58 6,00
Legenda: FM= fase móvel; A = conteúdo aquoso; B = fase orgânica; ACN= acetonitrila;
MET= metanol; TBA = brometo de tetrabutilamônio; TEA = trietilamina; tR G = tempo de
retenção do ácido glicólico; ÍR K = tempo de retenção do ácido kójico.
119
A tabela a seguir mostra os valores de k (fator de retenção) calculados para o
ácido glicólico nos diversos sistemas cromatográficos testados, considerando que o
tempo morto da coluna (to) é de 3,69 minutos, calculado como segue:
tr - to k=
to t = o
Vo
fluxo
tr = tempo de retenção do analíto, to = tempo morto da coluna
Sendo Vo o volume morto da coluna, calculado de Vo = 0, 487.d2. L como
sendo 2,58 mL, e considerado o fluxo de 0,7 mUmin., o valor de to corresponde a
3,69 mino
120
Tabela 19: Valores do fator de retenção (k) nos diferentes sistemas cromatográficos
testados no desenvolvimento do método. Condições cromatográficas:
coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 J.lL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
FM
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
A B A:B pH tR G k<;
Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 6,50 3,21 < 0,0
Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 90:10 3,00 3,59 < 0,0
Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 90:10 3,00 3,89 0,05
Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 2,30 3,74 0,01
Tampão KH2POJH3P04 20 mM MET 95:05 2,30 4,01 0,09
Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 98:02 2,30 3,92 0,06
Tampão KH2POJH3P04 20 mM + 0,05% TEA ACN 98:02 2,30 3,73 0,01
Tampão KH2POJH3P04 10 mM ACN 95:05 2,00 3,82 0,04
Tampão KH2POJH3P04 20 mM ACN 95:05 2,00 3,80 0,03
Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 3,00 3,69 0,00
Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM 3,00 3,82 0,04
Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM ACN 95:05 2,30 3,87 0,05
Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM 2,20 4,35 0,19
Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 98:02 2,20 4,42 0,20
Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 98:02 3,00 4,91 0,33
Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 95:05 3,00 4,52 0,23
Tampão NH4H2P04/H3P04 30 mM + TBA 4 mM ACN 95:05 3,00 4,66 0,26
Tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM ACN 95:05 3,00 4,58 0,24
Legenda: FM= fase móvel; A =conteúdo aquoso; B=fase orgânica; ACN= acetonitrila;
MET= metanol; TBA= brometo de tetrabutilamônio; TEA= trietilamina; tR G = tempo de
retenção do ácido glicólico; KG = fator de retenção para o ácido glicólico.
121
5.4.2. Perfil cromatográfico do ác. kójico e do ác. glicólico na fase móvel
selecionada
Após a realização dos ensaios cromatográficos preliminares a fase móvel 18
foi selecionada para validação do método. As figuras a seguir mostram o perfil
cromatográfico do ácido kójico e do ácido glicólico (matéria-prima e substâncias de
referência) no sistema mencionado, segundo as condições experimentais
estabelecidas no item 4.2.5.3.
~
50 ,
j 40
30.
20
10
t :w ........ - ...... _ .
. RetentIonTme
..... 10 ~
I O +-------------~~ /
2 3 4 ..... _ ..
122
150
[ 40 .
30
~ 20
10
O ·
I ' ~ 5 6 7 8
Figura 28: Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160 J.1g/mL).
Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel
18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 J.1L, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
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o 1 2 3 4 S 8 . 7 " --
Figura 31 : Perfil cromatográfico do ácido kójico matéria-prima (32!-1g/mL). Condições
cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18:
tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão
0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura
ambiente.
126
250 '2S0 1:121 ...... II1II_ -.- . ~ -'-· $Wenlion Tme tri . .
200 t 200
\ . '
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150'
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1 \ 100 100· · .
I \ 50 ' \ 50 .·
~ JI ~ I O
/'...... \. O I
O 2 3 4 5 .8 7 8 9 10 11 12 • .MInUta • •
------ - -
Figura 32: Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160 Ilg/mL)
com tR a 4,56 min - e do ácido kójico substância de referência (32 Ilg/mL) - tR
a 5,99 mino Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP
Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM
pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a
220 nm; temperatura ambiente.
sao5eu!itualep senp ap e!paw
89'0 80980179 817
£6`0 L9631.1• 0173
09'0 09/170917 017
00' I- 1731796 003
1,8'0 OCOP89£ 3£
03'3 £9L9L 091-
36'0 L Lett 9Z .17
63'1- 99699 031-
03'0 99033L 6 91- 63'1- 1-86LE 08
E9'1. VLL1799 80 68'0 917E03 017
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LZ
128
6000000 y = -85776,4 + 114486,8 x
5000000
4000000
::> 'ª 3000000 CU Q) .....
,« 2000000
1000000
O O 10 20 30 40 50
concentração f-lg/mL
Figura 33: Curva de calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 08 a 48
I-Ig/mL) obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2
mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 JlL, detecção a
220 nm; temperatura ambiente.
Regressão linear: y = a + bx
Parâmetro
a b
r
0,9999
Valor
-85776,4 114486,8
DP
20200,68916
Erro
18805,82 603,61
N
6
(te = 4,56)
p
<0.0001
Figura 34: Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração do
ácido kójico (intervalo de concentração de 08 a 48 j..Ig/mL) obtida por
CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH
3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 J.LL, detecção
a 220 nm; temperatura ambiente, obtida pelo método dos mínimos
quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado (teste de significância de a) .
129
130
120000 y = 889,4 + 468,01 x
100000
80000 ::J « E
60000 CU Q) '--,«
40000
20000
O O 50 100 150 200 250
concentração J.Lg/mL
Figura 35: Curva de calibração do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240
I-Ig/mL) obtida por CLAE, fase móvel : tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2
mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção
a 220 nm; temperatura ambiente.
Regressão linear: y = a + bx
Parâmetro
a b
r
0,9998
Valor
889,4 468,01
OP
825,46
Erro
768,47 4,93
N
6
(te = 1,16)
P
<0.0001
Figura 36: Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240 IJg/mL)
obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2PO,JH3P04 30 mM +
TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado
20 f.lL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente, obtida pelo método
dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado
(teste de significância de a).
5.4.4. Especificidade
5.4.4.1. Interferência dos excipientes
a) Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme
131
As figuras 37 e 38 mostradas a seguir ilustram os cromatogramas da amostra
ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme e do creme base, obtidos
conforme o item 4.2.5.5.1.
132
250j ~ ~:_ [ 250
R~ 11 l
2001 Ii -200 -
:J
150
1 I \ t ". o
~ 100 \ l,001
501 I \ , 50
.I . t !~ ~ . o 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 ---
Figura 37: Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 f.lg/mL) associado a ácido
glicólico (160 f.lg/mL) creme. Condições cromatográficas: coluna Synergi
Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +
TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20
f.lL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
133
1
.250
200
250] .----:- ::=:l. -. -RetenIIon. TIme
200
150 '· 150 ··
~ ~ 100 100 ·· ·
50 - 50
01 -;:;':: -.=- lO O 2 4 8 11 10 12 14
. ~ .Mftwta.
Figura 38: Perfil cromatográfico do creme base. Condições cromatográficas: coluna
Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04
30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 !J.L, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
134
b) Amostra ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5% gel
As figuras 39 e 40 mostradas a seguir correspondem aos cromatogramas da
amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% gel e do gel base, obtidos
conforme o item 4.2.5.5.1.
250..- 1: 22a, .......... , 250
~-- 8 ...-.-. Retention Tune -,.;
200~ 1\ ~ 200
'~l 1I
150
\ ~ I, ~
100 \ 100 .
\ 50 1
~.. i \ ~ 50
, ~,jo o ' :';' ~,\ :;=::=; , , , .. o 2 3 " 5 8 7 8 9 10 11 12
Figura 39: Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 f.!g/mL) associado a ácido
glicólico (160 f.!g/mL) gel. Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP
Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM
pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 f.!L, detecção a
220 nm; temperatura ambiente.
135
250 I ,,:..,2JJl-. ........ 1250 ~ __ .T _T
.:-Retention· TIme
200 _200
150 150
~ 1 100 100
] :;::;::::::::: ~
[ D 2 4 8 8 .. 10 12 14 -
Figura 40: Perfil cromatográfico do gel base. Condições cromatográficas: coluna Synergi
Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM +
TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 flL,
detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
136
5.4.4.2. Interferência dos produtos de degradação
Os cromatogramas apresentados nas figuras 41 e 42 mostram o perfil
cromatográfico da amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme
submetido a envelhecimento acelerado a 45°C em estufa por 30 dias, e dos
respectivos padrões, conforme o item 4.2.5.5.2.
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100 ·
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14
Figura 41: Perfil cromatográfico da amostra ácido kójico (32 Ilg/mL) associado a ácido glicólico
(160 Ilg/mL) creme, submetida a envelhecimento acelerado em estufa a 45°C por 30
dias. Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel
18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7
mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
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200 - 1\ ~ 200 1\ \
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.... IaUIN. .
Figura 42: Perfil cromatográfico do ácido glicólico substância de referência (160 Ilg/mL) com tR a
4,56 min - e do ácido kójico substância de referência (32 Ilg/mL) - tR a 5,99 mino
Condições cromatográficas: coluna Synergi Hidro RP Phenomenex®, fase móvel 18:
tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7
mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm; temperatura ambiente.
138
A análise de pureza dos picos no detector PDA apresentou índices de pureza
de 99,9999% e 99,9997% para o ácido kójico e glicólico, respectivamente.
5.4.5. Exatidão (recuperação)
a) Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme
A partir das condições experimentais estabelecidas no item 4.2.5.6, as tabelas
abaixo demonstram a recuperação obtida para os ácidos kójico e glicólico na
amostra creme.
Tabela 21: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido glicólico na
amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase
móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00: ACN
(95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 J.lL, detecção a 220 nm;
temperatura ambiente.
Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR J.lg/mL J.lg/mL (%) (%)
40,00 39,77 99,43 1,46
80,00 80,05 100,06 0,99
120,00 120,26 100,22 2,26
* média de três determinações
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88'0 61:001- EZ`01-
1-9' 9£'86 89`8L 00'08
6£`0 817'86 6£'6£ 00'017
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61:0 1-L'301- 99'17 00`17Z
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1-1:0 8£'301- 61:8 00'8
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wlsowe eu op!f9)1 oppe op oeõelednow ap alsal ou sopNo sopefinsed :zz eioqn
6£6
140
Tabela 24: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase móvel 18:
tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05),
vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm;
temperatura ambiente.
Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação OPR Ilg/mL Ilg/mL (%) (%)
8,00 8,52 106,50 0,57
16,00 16,85 105,31 0,64
24,00 25,47 106,13 0,39
* média de três determinações
5.4.6. Precisão
a) Amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme
As tabelas 25 e 26 apresentadas a seguir ilustram os resultados obtidos na
determinação dos teores de ácido kójico e de ácido glicólico na amostra ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico a 5% creme por CLAE.
141
Tabela 25: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 Jlg/mL)
na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE,
fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :
ACN (95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 JlL, detecção a 220
nm; temperatura ambiente.
Valor rotulado valor teor DPR Intervalo de ácido kójico encontrado* confiança
(%) (%) (%) (%) (p=95%)
1,00 0,9869 98,69 0,77 98,69.± 0,54
* média de 10 determinações
Tabela 26: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido glicólico (160
Jlg/mL) na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico creme por
CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH
3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 JlL, detecção
a 220 nm; temperatura ambiente.
Valor rotulado valor teor DPR Intervalo de ácido glicólico encontrado * confiança
(%) (%) (%) (%) (p=95%)
5,00 5,3425 106,85 1,81 106,85.± 1,38
* média de 10 determinações
b) Amostra ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5% gel
As tabelas 27 e 28 ilustram os resultados obtidos na determinação dos
teores de ácido kójico e de ácido glicólico na amostra ácido kójico 1 % associado a
ácido glicólico a 5% gel por CLAE.
142
Tabela 27: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 J.1g/mL)
na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase
móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN
(95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 J.1L, detecção a 220 nm;
temperatura ambiente.
Valor rotulado valor encontrado* teor DPR Intervalo de ácido kójico (%) confiança
(%) (%) (%) (p=95%)
1,00 0,9860 98,60 1,30 98,60 ± 0,92
* média de 10 determinações
Tabela 28: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido glicólico (160
J.1g/mL) na amostra ácido kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE,
fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 :
ACN (95:05), vazão 0,7 mLlmin; volume injetado 20 J.1L, detecção a 220
nm; temperatura ambiente.
Valor rotulado valor encontrado* teor DPR Intervalo de ácido kójico (%) confiança
(%) (%) (%) (p=95%)
5,00 5,28 105,57 1,82 105,57 ± 1,38
* média de 10 determinações
143
5.4.7. Robustez
A robustez do método foi avaliada por meio da utilização de um outro
cromatógrafo líquido, especificado no item 4.2.5.8, equipado com detector UV-VIS.
a) Linearidade
As figuras 43 e 44, mostradas a seguir, apresentam os dados estatísticos da
regressão linear do ácido kójico associado a ácido glicólico, obtida pelo método dos
mínimos quadrados.
Regressão linear: y = a + bx
Parâmetro
a b
r
0,9999
Valor
-8903,5 126023,4
DP
14431 ,2
Erro
13434,7 431 ,2
N
6
te = 0,66
P
<0.0001
Figura 43: Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de
calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 08 a 48
I-lg/mL) obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2PO,JH3P04 30
mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 ~L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura
ambiente, obtida pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b = coeficiente angular, r = coeficiente de
correlação e te = t calculado (teste de significância de a).
Regressão linear: y = a + bx
Parâmetro
a b
r
0,9997
Valor
2449,7 476,6
DP
934,3
Erro
869,7 5,6
N
6
te= 2,8
P
<0.0001
Figura 44: Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido glicólico (intervalo de concentração de 40 a 240 I-Ig/mL) obtida
por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM
pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 /-lL,
detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente, obtida
pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta, b
= coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado
(teste de significância de a).
144
Os tempos de retenção do ácido glicólico e do ácido kójico, substâncias de
referência, foram de 5,02 e 6,79 min, respectivamente.
145
b) Exatidão
As tabelas 29 a 31 mostram os resultados obtidos na determinação da
exatidão (recuperação) do método aplicado às amostras ácido kójico 1 % associado
a ácido glicólico 5% nas formas creme e gel.
Tabela 29: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido glicólico na amostra ácido
kój ico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO.JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7
mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);
temperatura ambiente.
Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR !lg/mL !lg/mL (%) (%)
40,00 41,20 102,99 1,00
80,00 79,66 99,58 0,71
120,00 120,71 100,59 0,72
* média de três determinações
Tabela 30: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra ácido
kójico associado a ácido glicólico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO.JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7
mUmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);
temperatura ambiente.
Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR !lg/mL !lg/mL (%) (%)
8,00 8,24 102,95 0,17
16,00 16,58 103,64 0,32
24,00 25,1 4 104,75 0,25
* média de três determinações
146
Tabela 31 : Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra ácido
kójico associado a ácido glicólico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão
NH4H2PO,JH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7
mUmin; volume injetado 20 j..lL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);
temperatura ambiente.
Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR Ilg/mL Ilg/mL (%) (%)
8,00 8,03 100,32 0,99
16,00 16,44 102,76 1, 11
24,00 24,50 102,08 0,99
* média de três determinações
c) Precisão
Os resultados obtidos na determinação da precisão do método cromatográfico
nas amostras ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme e gel são
demonstrados na tabela 32.
147
Tabela 32: Resultados obtidos no teste de precisão na determinação do ácido kójico (K) e
do ácido glicólico (G) na amostra ácido kójico 1% associado a ácido glicólico
5% creme e gel por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2PO.JH3P04 30 mM +
TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 I-lL,
detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente.
KAmostra
Teor* (%) DPR(%) Teor* (%)
G
DPR (%)
creme
gel
95,0
97,3
0,45
0,43
110,0
107,26
1,34
1,14
* média de 10 determinações
148
5.5. Validação do método de determinação do ácido kójico por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Os resultados obtidos na validação do método de determinação do ácido
kójico isolado por CLAE em formulações na forma creme e gel, usando-se
cromatógrafo líquido acoplado de detector UV-VIS são apresentados a seguir.
5.5.1 Curva de calibração do ácido kójico por CLAE
Os valores experimentais obtidos na construção da curva de calibração do
ácido kójico por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), conforme descrito no
item 4.2.6.1, estão descritos na tabela 33.
A regressão linear das curvas, obtida pelo método dos mínimos quadrados, e
os dados estatísticos da regressão são mostrados nas figuras 45 e 46.
Tabela 33: Áreas obtidas na construção da curva de calibração do ácido kójico
(intervalo de concentração de 8 a 48 1-1gImL), fase móvel: tampão
NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00: ACN (95:05), vazão 0,7
mUmin; volume injetado 20 J.1L, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);
temperatura ambiente.
Ácido kójico
] I-Ig/mL
08
16
24
32
40
48
Área* (mAU)
1014291
2019069
3052006
4071265
5063699
6111792
DPR (%)
0,15
0,41
1,11
0,29
0,38
0,39
* média de duas determinações
149
7000000
6000000 y = -8712 + 127288 x
5000000
~ 4000000 « E m 3000000 .... ,«
2000000
1000000
O O 10 20 30 40 50
concentração I!g/mL
Figura 45: Curva de calibração do ácido kójico (intervalo de concentração de 8 a 48 IJg/mL)
obtida por CLAE, fase móvel: tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH
3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 ,....L, detecção a 220
nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente.
Regressão linear:
y = a + bx
Parâmetro
a b
r
0,9999
DP
Valor
-8711,7 127288,1
N
12831 ,9
Erro
11945,9 383,4
P
6
te= 0,73
<0.0001
Figura 46: Parâmetros estatísticos da regressão linear da curva de calibração
do ácido kój ico (intervalo de concentração de 8 a 48 \Jg/mL) obtida
por CLAE, fase móvel : tampão NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM
pH 3,00 : ACN (95:05) , vazão 0,7 mUmin; volume injetado 20 IlL,
detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura ambiente, obtida
pelo método dos mínimos quadrados, onde: a = intersecção da reta,
b = coeficiente angular, r = coeficiente de correlação e te = t calculado
(teste de significância de a).
150
151
5.5.2. Exatidão (recuperação)
c) Amostra ácido kójico 1% creme
A partir das condições experimentais estabelecidas no item 4.2.6.2, a tabela
abaixo demonstra a recuperação obtida para o ácido kójico na amostra creme.
Tabela 34: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2POJH3P04
30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 JlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura
ambiente.
Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR Jlg/mL Jlg/mL (%) (%)
8,00 8,2 102,5 0,11
16,00 16,33 102,1 0,23
24,00 24,85 103,5 0,63
* média de três determinações
d) Amostra ácido kójico 1 % gel
A partir das condições experimentais estabelecidas no item 4.2.6.2, a tabela
abaixo demonstra a recuperação obtida para o ácido kójico na amostra gel ,
determinada por CLAE.
152
Tabela 35: Resultados obtidos no teste de recuperação do ácido kójico na amostra
ácido kójico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão NH4H2PO,JH3P04 30
mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7 mUmin; volume
injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS); temperatura
ambiente.
Padrão adicionado Padrão recuperado* Recuperação DPR Ilg/mL Ilg/mL (%) (%)
8,00 8,15 101,8 0,52
16,00 16,48 102,9 0,43
24,00 40,30 102,0 0,42
* média de três determinações
5.5.3. Precisão
a) Amostra ácido kójico 1 % creme
A tabela 36 apresentada a seguir ilustra o resultado obtido na determinação
do teor de ácido kójico na amostra ácido kójico 1 % creme por CLAE.
153
Tabela 36: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 IlglmL)
na amostra ácido kójico creme por CLAE, fase móvel 18: tampão
NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7
mLlmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);
temperatura ambiente.
Valor rotulado valor teor OPR Intervalo de ácido kójico encontrado* confiança
(%) (%) (%) (%) (p=95%)
1,00 0,9740 97,40 0,56 97,4 ± 0,39
* média de 10 determinações
b) Amostra ácido kójico 1 % gel
A tabela 37 ilustra o resultado obtido na determinação do teor de ácido kójico
na amostra ácido kójico 1 % gel por CLAE.
Tabela 37: Resultados obtidos na determinação do teor de ácido kójico (32 Ilg/mL)
na amostra ácido kójico gel por CLAE, fase móvel 18: tampão
NH4H2POJH3P04 30 mM + TBA 2 mM pH 3,00 : ACN (95:05), vazão 0,7
mLlmin; volume injetado 20 IlL, detecção a 220 nm (detector UV-VIS);
temperatura ambiente.
Valor rotulado valor encontrado* teor OPR Intervalo de ácido kójico (%) confiança
(%) (%) (%) (p=95%)
1,00 0,9943 99,43 0,75 99,43 ± 0,54
* média de 10 determinações
154
5.6. Comparação dos métodos de determinação do ác. kójico por UVO e
CLAE
Na tabela 38 são mostrados os resultados da aplicação dos testes F e t para
comparação dos métodos cromatográfico (item 5.5.3) e espectrofotométrico (item
5.3.5) na determinação de ácido kójico a 1 % em formulações na forma creme e gel,
quanto aos parâmetros de precisão e exatidão, respectivamente.
Tabela 38: Resultados obtidos na comparação da precisão e exatidão dos
métodos propostos (EDUV e CLAE) para determinação de ácido kójico nas amostras
creme e gel.
Precisão
Amostra UVO (A) CLAE (8) Fcalc
Ácido kójico 1 % creme SA 2 = 0,1640 SB 2 = 0,3015 1,84
Ácido kójico 1 % gel SA 2 = 0,2240 SB 2 = 0,5588 2,50
Exatidão
Amostra )("d Sd tcalc
Ácido kójico 1 % creme 0,3 0,72 0,72
Ácido kójico 1 % gel -2,4 1,4 2,97
Uma vez que o valor de Fg,g na tabela de Snedecor (distribuição bilateral) de
4,026 (p=95%) é maior que os valores calculados de F para ambas as amostras,
pode se dizer que não há diferença entre os métodos quanto à precisão. Igualmente,
pode se dizer que não há diferença estatisticamente significante entre os métodos
quanto à sua exatidão uma vez que o valor crítico de t (p=95%) de 4,30 na tabela
também é maior que os valores calculados de t para ambas as amostras.
155
5.7. Estudo de estabilidade acelerado
5.7.1. Caracteres organolépticos
o resultado da avaliação macroscópica das formulações contendo ácido
kójico associado ou não a ácido glicólico, submetidas ao estudo de estabilidade
acelerado, encontram-se representados nas tabelas a seguir.
A avaliação foi feita considerando-se como referência as embalagens
correspondentes ao To, armazenadas em geladeira.
Tabela 39: Resultados da avaliação macroscópica das formulações contendo
ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de
armazenamento.
Tempo Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
To branco branco branco
T48 branco branco branco
T15 branco branco branco
T30 branco branco branco
T60 bege claro branco branco
T90 bege branco branco
Legenda: t.a = temperatura ambiente
156
Tabela 40: Resultados da avaliação macroscópica das formulações contendo
ácido kójico 1% associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de
natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de
armazenamento.
Tempo Estufa Luz Armário
4D±2°C 25±2°C (t.a)
To incolor incolor incolor
T48 incolor incolor incolor
T15 incolor incolor incolor
T30 amarelo claro incolor incolor
T6D amarelo claro incolor incolor-
Too amarelo incolor incolor
Legenda: t.a =temperatura ambiente
Tabela 41: Resultados da avaliação macroscópica das formulações contendo
ácido kójico 1%, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em pote
plástico (polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.
Tempo Estufa Luz Armário
4D±2°C 25±2°C (t.a)--
To branco branco branco
T48 branco branco branco
T15 branco branco branco
T30 branco branco branco
T60 Bege claro branco branco
Tgo bege branco branco
Legenda: t.a = temperatura ambiente
157
Tabela 42: Resultados da avaliação macroscópica das formulações contendo
ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote
plástico (polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.
Tempo Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
To incolor incolor incolor
T48 incolor incolor incolor
T15 incolor incolor incolor
T30 amarelo claro incolor incolor
T60 amarelo incolor incolor
T90 amarelo incolor incolor
Legenda: t.a = temperatura ambiente
Todas as formulações avaliadas não apresentaram sinais visíveis de perda de
homogeneidade, instabilidade física ou a presença de odores significativos.
5.7.2. Análise de pH
As tabelas a seguir ilustram os resultados obtidos da análise de pH das
formulações submetidas ao estudo acelerado de estabilidade, realizada de acordo
com o estabelecido no item 4.2.4.4.
158
Tabela 43: Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido
kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não iônico,
embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de
armazenamento.
Tempo Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
To 3,54 3,54 3,54
T48 3,51 3,55 3,56
T15 3,61 3,60 3,62
T30 3,58 3,58 3,59
T60 3,65 3,64 3,65
T90 3,59 3,61 3,62
Legenda: t.a = temperatura ambiente
Tabela 44: Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido
kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de natrosol®,
embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de
armazenamento.
Tempo Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
To 3,64 3,64 3,64
T48 3,65 3,66 3,65
T15 3,73 3,72 3,72
T30 3,73 3,71 3,71
T60 3,78 3,76 3,77
T90 3,77 3,75 3,75
Legenda: t.a = temperatura ambiente
159
Tabela 45: Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido
kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em pote plástico
(polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.
Tempo Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
To 3,61 3,61 3,61
T48 3,57 3,57 3,58
T15 3,56 3,59 3,65
T30 3,37 3,53 3,50
T60 3,46 3,41 3,48
T90 3,21 3,34 3,46
Legenda: t.a = temperatura ambiente
Tabela 46: Resultados da análise de pH das formulações contendo ácido
kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em pote plástico
(polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.
Tempo Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
To 4,56 4,56 4,56
T48 4,54 4,54 4,54
T15 4,59 4,61 4,65
T30 4,48 4,57 4,58
T60 4,46 4,47 4,64
T90 4,24 4,46 4,58
Legenda: t.a = temperatura ambiente
160
5.7.3. Doseamento
Os resultados da análise por CLAE do teor das formulações submetidas ao
estudo acelerado de estabilidade, realizada segundo as condições padronizadas no
item 4.2.8.4 (item c), são ilustrados nas tabelas a seguir.
Os teores apresentados foram corrigidos com a perda de umidade calculada
para cada embalagem. Para cada amostra e condição de armazenagem calculou-se
a média do teor remanescente de ácido kójico em relação ao To. Para o conjunto de
dados apresentados nas tabelas de 47 a 50 médias acompanhadas de letras iguais
não diferem entre si ao nível de 0,05 de significância.
Tabela 47: Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações
contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente
creme não iônico, embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes
condições de armazenamento.
Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
Tempo Kteor% * G teor% * Kteor% * G teor"h * Kteor% * G teor% *
To 101,0 108,4 101,0 108,4 101,0 108,4
T48 100,5 115,9 101,4 115,0 101,5 115,4
T15 95,9 122,4 97,5 121 ,0 98,7 120,2
T30 93,8 124,3 97,9 126,3 97,8 125,1
T60 90,6 125,1 94,2 124,6 96,7 128,5
T90 87,2 124,1 92,1 125,0 93,2 127,3
média** 93,9aA 96,4bA 97,2bA
Legenda: t.a = temperatura ambiente, K = ácido kójico, G = ácido glicólico.
*média de 2 determinações. **média do teor remanescente em relação ao To (médias
seguidas por letras iguais em minúsculo não diferem entre si para uma mesma amostra
em relação à condição de armazenamento; médias seguidas por letras maiúsculas não
diferem entre si quando as quatro amostras são comparadas dentro de uma mesma
condição de armazenamento; a = 0,05.)
161
Tabela 48: Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações
contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente
gel de natrosol®, embaladas em pote plástico (polipropileno), nas diferentes
condições de armazenamento.
Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
Tempo Kteor% * G teor% * Kteor% * Gteor"Á> * Kteor% * G teor%*
To 99,4 103,4 99,4 103,4 99,4 103,4
T48 99,4 107,6 99,1 104,4 99,9 108,2
T15 97,3 112,8 98,1 110,5 98,2 111 ,7
T30 95,1 110,1 98,0 115,3 97;9 115,1
T60 92,8 109,6 95,1 114,3 97,0 114,6
T90 89,8 112,1 95,4 120,3 96,3 120,2
média** 96,2aAB 98,1abAB 98,7bAB
Legenda: t.a = temperatura ambiente, K = ácido kójico, G = ácido glicólico.
*média de 2 determinações. **média do teor remanescente em relação ao To (médias
seguidas por letras iguais em minúsculo não diferem entre si para uma mesma amostra
em relação à condição de armazenamento; médias seguidas por letras maiúsculas não
diferem entre si quando as quatro amostras são comparadas dentro de uma mesma
condição de armazenamento; a = 0,05.)
162
Tabela 49: Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações
contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em
pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.
Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
Tempo Kteor% * Kteor% * Kteor% *
To 105,3 105,3 105,3
T48 103,1 104,3 106,9
T15 101,4 101 ,9 103,7
T30 98,0 103,9 103,3
T60 98,3 99,2 101,4
T90 86,6 92,7 96,0
média** 93,8aA 96,1abA 97,6bA
Legenda: t.a = temperatura ambiente, K = ácido kójico, G = ácido glicólico.
*média de 2 determinações. **média do teor remanescente em relação ao To (médias
seguidas por letras iguais em minúsculo não diferem entre si para uma mesma amostra
em relação à condição de armazenamento; médias seguidas por letras maiúsculas não
diferem entre si quando as quatro amostras são comparadas dentro de uma mesma
condição de armazenamento; a = 0,05.)
163
Tabela 50: Resultados da determinação de teor por CLAE das formulações
contendo ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em
pote plástico (polipropileno), nas diferentes condições de armazenamento.
Estufa Luz Armário
40±2°C 25±2°C (t.a)
Tempo Kteor% * Kteor% * Kteor% *
To 100,3 100,3 100,3
T48 101 ,0 101,4 101,3
T15 99,1 100,3 100,8
T30 98,2 101,5 101 ,0
T60 98,1 98,5 101,5
T90 93,9 97,6 101 ,3
média** 98,1aB 99,6abB 100,7bB
Legenda: La = temperatura ambiente, K = ácido kójico, G = ácido glicólico.
*média de 2 determinações. **média do teor remanescente em relação ao To (médias
seguidas por letras iguais em minúsculo não diferem entre si para uma mesma amostra
em relação à condição de armazenamento; médias seguidas por letras maiúsculas não
diferem entre si quando as quatro amostras são comparadas dentro de uma mesma
condição de armazenamento; a = 0,05.)
164
5.7.4. Comportamento reológico
As tabelas e figuras apresentadas a seguir demonstram os resultados da
análise reológica das formulações submetidas ao estudo de estabilidade acelerado,
conforme as condições experimentais indicadas no item 4.2.4.4.
Tabela 51 : Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não iônico,
embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos
diferentes tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(1/s) To T48 T15 T30 T60 T90
0,125 120000 150000 150000 155000 165000 150000
0,25 82500 102500 105000 105000 112500 100000
0,625 49000 59000 63000 62000 69000 64000
1,25 32500 37000 39500 39500 41500 40500
2,5 21250 22500 24000 25750 26500 26250
5 14125 14250 15875 17125 18875 19125
12,5 7650 8250 8750 9650 10800 10900
25 4675 4975 5675 6375 7375 7650
25 4825 5075 5900 6625 7425 7550
12,5 7650 7900 9100 9900 10300 10950
5 12750 13375 14875 15625 15875 16875
2,5 19000 20500 21250 23500 24000 24250
1,25 28000 30000 31500 34500 35000 35000
0,625 41000 43000 47000 50000 50000 50000
0,25 67500 72500 77500 82500 82500 80000
0,125 105000 105000 115000 115000 120000 115000
*média de 2 determinações
165
- - To
200000 -- T
48 -- T
15 180000 -- T3Q
-- Too -- T
90
r0 E 160000 --Z ........ 140000 a -c:: 120000 Q)
E ro 100000 .s= (ij IJ) 80000
·13 Q) 60000 "O ro C» 40000 .... a u. 20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/5)
--To 200000 --T
gO
180000 ",-
E 160000 --Z ......, 140000 a -c:: 120000 Q)
E ro
.s= 100000
tu IJ)
·13 80000
Q) 60000 "O ro c» 40000 .... a
U. 20000
O
O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/5)
Figura 47: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo ácido
kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a
40±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas
os To e Tgo.
166
Tabela 52: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não iônico,
embaladas em potes plásticos (poliestireno) , expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes
tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(1/s) To T48 T15 T30 T60 T90
0,125 120000 170000 165000 160000 150000 160000 0,25 82500 107500 107500 107500 100000 105000
0,625 49000 60000 62000 62000 59000 63000 1,25 32500 37000 37000 37000 35500 37500 2,5 21250 23250 24000 23750 23000 25000 5 14125 15375 15625 16000 16000 17250
12,5 7650 7800 8450 8600 9000 9950 25 4675 4825 5325 5525 5750 6425 25 4825 4750 5375 5675 5950 6650
12,5 7650 7750 8650 9100 9200 10550 5 12750 13500 15000 15375 15625 17000
2,5 19000 20500 21750 22500 22750 25000 1,25 28000 29500 31500 32000 32500 35500 0,625 41000 45000 46000 48000 48000 50000 0,25 67500 72500 80000 80000 75000 80000 0,125 105000 110000 110000 120000 110000 110000
*média de 2 determinações
--T 180000 -, o
--T48
160000 -l --T15
~ 140000j
--T30
--Tso --TgO 120000
O ....... C Q) 100000 E co .r: 80000
CO UJ '(3 60000 Q) "O CO 40000 e-O
LL 20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s) 180000..., - - T o
160000 ...J --TgO
-. N 140000 E --z -- 120000 O ....... C Q) 100000 E co .r: 80000 co UJ '(3 60000 Q) "O co u. 40000 ..... O
LL 20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 48: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo
ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente
creme não iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à
luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque
(abaixo) apenas os To e Tgo.
167
168
Tabela 53: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não iônico,
embaladas em potes plásticos (poliestireno ), armazenadas em armário à
temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(1/s) To T48 T15 T30 T60 Tso
0,125 120000 170000 160000 160000 160000 160000 0,25 82500 107500 105000 107500 102500 102500
0,625 49000 59000 60000 60000 59000 59000 1,25 32500 35500 36000 36500 36500 35000 2,5 21250 23000 23750 24500 24250 24000 5 14125 15250 15500 16250 16250 15500
12,5 7650 7750 8000 8450 8950 8650 25 4675 4825 5000 5400 5800 5700 25 4825 4775 5150 5525 5875 5875
12,5 7650 7500 8350 9050 9750 9500 5 12750 13250 14250 16000 16125 15750
2,5 19000 20000 21500 23000 24500 23750 1,25 28000 29000 32500 33000 36000 34000
0,625 41000 43000 49000 48000 51000 49000 0,25 67500 70000 80000 77500 85000 80000
0,125 105000 110000 115000 115000 125000 120000
*média de 2 determinações
--T 160000 -, o
--T48
140000~ --T
15
1120000
- - T30
- - T60
--T90
o 100000 ..... C Q)
E 80000 tU ~
tU (/) 60000 ·0 Q)
"O 40000 tU O-.... O 20000 u..
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
160000 -, --T o --T
90
140000
.--.. '" E 120000 -.. Z .......-o 100000 ..... c Q)
E 80000 tU ~
tU (/) 60000 ·0 Q)
"O 40000 tU O-.... O 20000 u..
o o 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 49: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo ácido
kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente creme não
iônico, embaladas em potes plásticos (poliestireno) , armazenadas em armário
fechado à temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e
em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.
169
170
Tabela 54: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de natrosol®,
embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos
diferentes tempos de leitura.
Gradiente de velocidade
Viscosidade (cPs)*
(1/s) To T48 T15 T30 T60 T90
0,125 290000 270000 210000 190000 125000 75000 0,25 202500 195000 175000 147500 102500 70000
0,625 113000 108000 100000 89000 67000 50000 1,25 69500 68000 64000 58000 46500 37000 2,5 49250 50000 42250 37000 30750 25750 5 28750 29000 28750 26750 20250 17500
12,5 14000 13800 13750 13300 10700 9700 25 7975 7900 8100 7750 6400 5900 25 7900 7725 7950 7675 6350 5850
12,5 13550 13250 13500 12850 10300 9250 5 27250 27125 27000 25375 19125 16500
2,5 45250 44750 44750 41250 29500 24250 1,25 74000 73000 70000 63500 43000 33500
0,625 116000 113000 107000 93000 60000 44000 0,25 197500 192500 172500 145000 87500 57500
0,125 285000 275000 240000 185000 110000 70000
*média de 2 determinações
--To
2roooo~ --T
48
200000 --T
15 --T
30
180000 --T60 rr
..§ 160000 --TgO
Z -;; 140000 -c:: 120000 Q)
E ctI 100000 .r:. (ij
80000 (J)
"u Q) 60000
"O ctI 40000 <> ..... O 20000 u..
O
O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/5)
220000 -, --To
2000001 --T
gO
____ 180000 N
E 160000 --Z '-"""
o 140000 -c::: Q) 120000 E ctI
100000 .r:. (ij li)
80000 "u Q)
60000 "O ctI o.. 40000 ..... o u..
20000
o o 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/5)
Figura 50: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo ácido
kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de
natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em
estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque
(abaixo) apenas os To e Tgo"
171
172
Tabela 55: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de natrosol®,
embaladas em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes
tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(1/5) To T48 T15 T30 T60 T90
0,125 290000 280000 270000 275000 240000 205000 0,25 202500 200000 202500 197500 180000 160000
0,625 113000 110000 112000 109000 103000 92000 1,25 69500 69000 70000 68500 65000 60000 2,5 49250 51250 50500 52250 47000 42000 5 28750 29000 29500 29375 27500 27875
12,5 14000 13900 14250 14300 13700 13250 25 7975 7900 7875 8125 7750 7775 25 7900 7825 8125 7925 7700 7925
12,5 13550 13450 13500 13650 13200 13100 5 27250 27250 28000 27500 26250 25875
2,5 45250 45500 47250 45750 42500 42000 1,25 74000 73500 73500 73000 67000 65000
0,625 116000 115000 117000 114000 103000 96000 0,25 197500 195000 192500 187500 167500 147500 0,125 285000 280000 265000 265000 225000 195000
*média de 2 determinações
--To 220000 -, -- T 48
200000 -i -- T15
-- T3Q _ 180000 ~ -- T
N 60
..ê 160000 -- T 90 Z '-"
O 140000 .-c Q) 120000 E C1l ..c 100000 (ij Cf)
80000 "u Q)
60000 "O C1l U< 40000 ... O U.
20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
220000 ..., --To
2000001 --T
gO
_ 180000 N
E 160000 ""-
Z '-' o 140000 -c:: Q) 120000 E C1l
100000 ..c (ij Cf)
80000 "u Q)
60000 "O C1l t)o 40000 ... o U.
20000
o o 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 51: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo ácido
kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de
natrosol®, embaladas · em potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a
25±2°C, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo)
apenas os To e T 90"
173
174
Tabela 56: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente gel de natrosol®,
embaladas em potes plásticos (poliestireno), armazenadas em armário à
temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(cm-1) To T48 T15 T30 T60 T90
--0,125 290000 280000 295000 295000 285000 295000 0,25 202500 205000 207500 212500 202500 212500 0,625 113000 112000 114000 115000 111000 114000 1,25 69500 70000 71500 72500 68000 70500 2,5 49250 50500 51250 53500 50500 53500 5 28750 29500 29750 30750 29000 31000
12,5 14000 14100 14000 14550 13650 14650 25 7975 8050 8100 8175 8025 8600
25 7900 8000 7800 8225 7875 8350 12,5 13550 13600 13250 14050 13600 14400
5 27250 27750 27375 28250 26875 28750
2,5 45250 47000 46250 47500 45500 48250
1,25 74000 75000 73000 77000 73000 77000
0,625 116000 116000 118000 121000 113000 121000
0,25 197500 195000 197500 205000 185000 197500
0,125 285000 280000 280000 290000 260000 290000
*média de 2 determinações
--To --T
48
220000~ --T
15
200000 --T
30
~ 180000 --T
60
--TgO
~ 160000 O - 140000 c: Q)
E C'II
120000 .c ro 100000 Cf)
"ü 80000 Q)
"O 60000 C'II O>
40000 ..... O LL
20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/5)
2200001 --To --T
gO 200000
~ 180000
--Z 160000 .......,. o
140000 -c: Q)
E 120000 C'II .c 100000 (ij Cf)
"ü 80000 Q) "O 60000 C'II o- 40000 L-
o LL
20000
o o 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 52: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo
ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%, usando como excipiente
gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos (poliestireno) ,
armazenadas em armário fechado à temperatura ambiente, nos diferentes
tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e T 90"
175
176
Tabela 57: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos
(poliestireno), armazenadas em estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(1Is) To T48 T15 T3Q T60 T90
0,125 180000 180000 165000 180000 175000 160000 0,25 120000 117500 115000 122500 122500 115000
0,625 71000 68000 69000 76000 78000 80000 1,25 43000 43500 44500 47000 48000 51000 2,5 25750 26250 27750 29250 31000 34000 5 18000 18625 19875 21000 22125 26125
12,5 9000 9950 10800 11850 12800 14700 25 5075 5725 6625 7600 8400 9775 25 5150 5800 6850 7825 8600 9950
12,5 8900 10100 11300 12300 13100 14300 5 16375 16875 17375 17875 19500 20125
2,5 23500 24250 23750 24750 27000 28250 1,25 34500 34500 34500 35500 39000 39500
0,625 47000 50000 48000 49000 56000 56000 0,25 77500 77500 77500 82500 92500 87500
0,125 105000 115000 120000 130000 125000 125000
*média de 2 determinações
260000 - - To --T
48 240000 --T
15 ---. 220000 --T
30 N
E 200000 --TSO --z
......... 180000 --TgO O
C 160000 Q)
E 140000 CIl ,f; 120000 CIl ,!!! 100000 u Q) 80000
"O
~ 60000 L-
O 40000 LL
20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
260000~ - -T o 240000 --T
gO
---. 220000 N
..§ 200000 Z ......... 180000 O - 160000 c: Q)
E 140000 CIl ,f; 120000 CIl til 100000 '13 Q)
"O 80000
CIl u. 60000 L-o 40000
LL 20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 53: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo
ácido kójico 1%, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em
potes plásticos (poliestireno) , armazenadas em estufa a 40±2°C, nos
diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e
Tgo,
177
178
Tabela 58: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos
(poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(1/s) To T48 T15 T30 T60 T90
0,125 180000 180000 180000 170000 170000 160000 0,25 120000 115000 115000 117500 112500 110000
0,625 71000 68000 68000 70000 71000 72000 1,25 43000 41500 42000 43500 44000 44500 2,5 25750 25500 27250 27000 27750 · 28250 5 18000 18375 19500 19750 20125 20625
12,5 9000 9100 10000 10550 11150 11850 25 5075 5350 6075 6575 7000 7500 25 5150 5325 6275 6750 7250 7775
12,5 8900 9550 10600 11300 11900 12250 5 16375 17000 16625 19000 18375 19125
2,5 23500 22250 23750 25000 25250 26500 1,25 34500 32000 35000 36500 36000 37000
0,625 47000 45000 50000 52000 51000 53000 0,25 77500 75000 82500 82500 82500 85000
0,125 105000 110000 120000 120000 125000 130000
*média de 2 determinações
200000 -I --TO --T
48
1~OOO~ --T15
«' --T30 ~ 160000
--TOO
'-'" 140000 --T90 O -c: 120000 Q)
E co :5
100000
CO fi) 80000 ·ü Q) 60000 "C CO e' 40000 O
U. 20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
200000 -I --To
180000 ' --TgO
",-
E 160000 --Z '-'" 140000 o ... c: 120000 Q)
E ca 100000
.I::. (ij fi) 80000 ·ü Q) 60000 "C
CO o- 40000 .... o
u.. 20000
O O 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 54: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo
ácido kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em
potes plásticos (poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes
tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.
179
180
Tabela 59: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1%, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes plásticos
(poliestireno), armazenadas em armário à temperatura ambiente, nos diferentes
tempos de leitura.
--Gradiente de Viscosidade (cPs)*velocidade
(1/s) To T48 T15 T30 T60 Too--0,125 180000 190000 170000 165000 165000 1600000,25 120000 120000 112500 112500 112500 110000
0,625 71000 69000 68000 69000 70000 700001,25 43000 43000 42000 43500 43000 425002,5 25750 26250 26000 27000 27250 277505 18000 18500 18875 19500 19500 19875
12,5 9000 9350 9750 10300 10700 1100025 5075 5475 5900 6350 6600 695025 5150 5275 5925 6575 6850 7125
12,5 8900 9600 10400 10950 11500 118505 16375 17125 17500 17625 18500 19250
2,5 23500 23250 23500 24250 25000 255001,25 34500 35000 33000 34000 36500 36000
0,625 47000 50000 46000 48000 52000 510000,25 77500 80000 75000 80000 85000 80000
0,125 105000 120000 115000 120000 125000 120000
*média de 2 determinações
200000 --, --TO
180000 -l --T
48 --T
15
160000 ~ --T30
O 140000
--T60 -C --TgO Q)
E 120000 CU .c CU U)
100000 ' (3 Q) 80000 'O
~ 60000 lo....
O lL.. 40000
20000
O O 5 10 15 20 25
200000.., Gradiente de velocidade (1/s) --T
1800001 o
--TgO ","'-'" 160000 E --Z 140000
'--'"
O - 120000 C Q)
E 100000 CU .c CU 80000 U)
'(3
Q) 60000 'O
~ 40000 lo.... O
lL.. 20000
o o 5 10 15 20 25
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 55: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo ácido
kójico 1 %, usando como excipiente creme não iônico, embaladas em potes
plásticos (poliestireno), armazenadas em armário fechado à temperatura
ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo)
apenas os To e T 90.
181
182
Tabela 60: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos
(poliestireno) , armazenadas em estufa a 40±2°C, nos diferentes tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(cm-1) To T48 T15 T30 T60 T90
--0,125 610000 625000 580000 555000 495000 295000 0,25 412500 425000 405000 400000 360000 227500
0,625 220000 226000 217000 215000 197000 140000
1,25 138000 159000 160000 160000 149000 93000 2,5 89000 91000 89000 93000 86000 63000 2,5 85000 90250 86250 87000 82500 65500 1,25 141000 154000 146500 150000 139000 106000
0,625 227000 252000 238000 238000 214000. 154000
0,25 437500 462500 432500 415000 385000 245000
0,125 660000 710000 645000 630000 565000 335000
*média de 2 determinações
- - To 240000 --T
48 220000 -- T
15
N- 200000 --T30
E T60 --- 180000 Z --T90
....... O 160000 -r= Cl> 140000 E co 120000 ~
ro 100000 CIl '(3
80000 Cl>
"O CO 60000 C» .... 40000 O
U. 20000
O 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Gradiente de velocidade (1/s)
240000
2200001 -- To --T
90 200000
~ 180000 Z ....... 160000
~~~ O -r= 140000 Cl> E 120000 CO ~
ro 100000 CIl
~ '(3
80000 Cl>
"O 60000 CO C» .... 40000 O U.
20000
O 0,0 0,5 1,0 1,5 2 ,0 2,5
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 56: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo
ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em
potes plásticos (poliestireno) , armazenadas em estufa a 40±2°C, nos
diferentes tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To
e T90 ,
183
184
Tabela 61: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1%, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos
(poliestireno), expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)*velocidade
(cm-1) To T48 T15 T3Q T60 Too
--0,125 610000 630000 580000 575000 580000 5700000,25 412500 435000 395000 412500 425000 397500
0,625 220000 229000 209000 223000 225000 2100001,25 138000 156000 152000 156500 166000 1405002,5 89000 89500 85500 87750 89250 887502,5 85000 87000 83750 87750 89750 875001,25 141000 149500 138000 146000 148000 146500
0,625 227000 248000 223000 241000 245000 2370000,25 437500 452500 400000 445000 445000 4125000,125 660000 700000 610000 670000 675000 625000
*média de 2 determinações
240000 --T
O
220000 --T
48 --T
15 200000 --T
30 ..--.. N
E 180000 - - T60 -Z --T90 '-" 180000
O .-c Q)
140000
E 120000 tU ..c tU 100000 (/) .(3
80000 Q)
""O 60000 ~ L.. 40000 O
I..L 20000
O
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Gradiente de velocidade (1/s)
240000
220000 1 --To
200000 --Too
..--.. N
E 180000 -Z '-" 160000 o .-c Q)
140000
E 120000 tU ..c cu 100000 (/) .(3
80000 Q)
""O tU
60000 t» ... 40000 o
I..L 20000
o 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 57: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo
ácido kójico 1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em
potes plásticos (poliestireno) , expostas à luz a 25±2°C, nos diferentes
tempos de leitura (acima) e em destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.
185
186
Tabela 62: Comportamento reológico das formulações contendo ácido kójico
1 %, usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em potes plásticos
(poliestireno) , armazenadas em armário à temperatura ambiente, nos diferentes
tempos de leitura.
Gradiente de Viscosidade (cPs)* velocidade
(1/s) To T48 T15 T30 Tao T90
0,125 610000 650000 580000 685000 695000 625000 0,25 412500 435000 400000 465000 477500 452500 0,625 220000 229000 212000 242000 248000 237000 1,25 138000 157000 149000 164000 168000 160000 2,5 89000 92000 83000 93000 93750 93500 2,5 85000 87500 84500 90500 95000 92000 1,25 141000 143000 142000 155000 159500 155000
0,625 227000 246000 231000 256000 258000 254000 0,25 437500 447500 420000 477500 482500 467500 0,125 660000 710000 630000 735000 770000 710000
*média de 2 determinações
240000
220000
N"' 200000 E -- 180000 Z -O 160000 ..... I::
140000 ai E ('tl 120000
..r:: (ii 100000 cn '(3
80000 -1 P ai
" ('tl 60000 (.)o> .... 40000 O ~
20000
O 0,0 0 ,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Gradiente de velocidade (lIs)
240000 ~ 220000
--To --T
gO N- 200000 E -- 180000 ~ O 160000 ..... I:: ai 140000 E ('tl 120000
..r:: (ii 100000 cn ' (3
80000 ai
" ('tl 60000 (.)o> .... 40000 O ~
20000
o 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Gradiente de velocidade (1/s)
Figura 58: Representação gráfica das medidas reológicas das formulações contendo
ácido kójico 1 % , usando como excipiente gel de natrosol®, embaladas em
potes plásticos (poliestireno) , armazenadas em armário fechado à
temperatura ambiente, nos diferentes tempos de leitura (acima) e em
destaque (abaixo) apenas os To e Tgo.
187
6. DISCUSSÃO
BIBLIOTECA Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Universidade de São Paulo
188
o objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de um método de
análise e estudo de estabilidade de ácido kójico associado ou não a ácido glicólico
em formulações tópicas.
o ácido kójico é um agente despigmentante usado em formulações tópicas no
tratamento de hiperpigmentações cutâneas (STULBERG et aI., 2003; VICTOR et aI.,
2004; CAYCE et aI., 2004). Vários métodos analíticos para dosagem do ácido kójico
foram relatados na revisão da literatura (MAJMUDAR et al.,1998; KIMURA et aI.,
2000; SOTIOFATIORI; ANZOLDI, 2000; SATO et aI., 2000; MASSE et aI., 2001;
SHIH, 2001; SHIH; ZEN, 1999; MANABE et aI., 1988; YAMAMOTO et aI., 1997)
entretanto, até o presente momento, nenhum se utilizou da espectrofotometria no
ultravioleta, método mais simples e acessível, para a sua determinação.
O ácido glicólico é um agente esfoliante (VAN SCOTI; YU, 1989;
MANALOTO; ALSTER, 1999; USUKI et aI., 2003; STRATIGOS; KATSAMBAS, 2004)
empregado em associação ao ácido kójico com o objetivo de potencializar sua ação,
sendo ele também inibidor direto da síntese de melanina.
Não há na literatura, até o presente momento relato de método analítico para
determinação dos ácidos kójico e glicólico associados.
O trabalho experimental foi iniciado pela caracterização físico-química das
substâncias de referência e matérias-primas, mediante o emprego de métodos
espectrométricos e de análise térmica.
Os espectros na região do infravermelho das matérias-primas e das
substâncias de referência (fig.1-4) apresentaram as bandas de absorção na região
de 4000 a 625 cm-1 (usada para identificação de estruturas) nos comprimentos de
onda característicos dos espectros relatados na literatura (POURCHET, 1975). O
ácido glicólico matéria-prima, por se apresentar comercialmente na forma de solução
aquosa 70%, mostrou um alargamento da banda na região de deformação de 3200-
3600, característica da função -OH, em razão da influência das moléculas de H20
presentes na matéria-prima, que apresentam deformação (banda) na mesma região.
189
Ao ser analisado por espectrofotometria no ultravioleta, o espectro do ácido
kójico substância de referência apresentou picos em 216,4 e 268,6 nm (fig.6). O
espectro do ácido kójico usado como matéria-prima (fig.5) revelou o mesmo perfil,
quando comparado ao da substância de referência.
O espectro do ácido glicólico não produziu um pico característico de
absorção, mesmo à concentração de 100 1-1 gIm L, revelando sua baixa absortividade
na região do ultravioleta (fig.7). Tal resultado frustrou a expectativa de
desenvolvimento de um método de análise das duas substâncias em conjunto por
espectrofotometria UV.
A partir das condições experimentais utilizadas, as curvas de análise térmica
do ácido glicólico substância de referência (fig.10) demonstraram que a espécie foi
termoestável até a temperatura de 80°C (curva TG/DTG), seguindo-se depois a
ocorrência de um evento de perda de massa, caracterizado na curva DSC como um
evento de decomposição endotérmica, com pico em 160,5°C. A existência de um
pico fino a 77,34°C na curva DSC, sem evento de perda de massa correspondente,
caracteriza a fusão da substância, valor este de acordo com o relatado na literatura
para o ácido glicólico (77-79°C). Não foram obtidas as curvas da matéria-prima em
solução a 70% em função da interferência da perda de massa da água a
temperatura inferior a 100°C.
Para o ácido kójico substância de referência (fig.8), observou-se que a
espécie é termoestável até aproximadamente 160°C, seguido de um evento de
decomposição endotérmica com pico a aproximadamente 240°C. A observação da
curva DSC também evidencia a fusão da substância a 152,62°C (pico fino
endotérmico sem evento de perda de massa correspondente na curva TG/DTG),
muito próximo à faixa encontrada para a substância na literatura (153-154°C). A
observação das curvas TG/DTG e DSC do ácido kójico matéria-prima (fig.9) revelou
similaridade quando comparadas às curvas da substância de referência, tendo a
fusão ocorrido a 152,75°C.
Com o objetivo de avaliar possíveis interações entre os ácidos kójico e
glicólico, foram obtidas curvas TG/DTG e DSC da mistura física de ambos, nas
proporções 1: 1 e também 5: 1, mesma proporção utilizada nas formulações (fig.11 e
190
12). Quando observadas em conjunto (fig.13 e 14) o perfil das curvas não mostrou
mudanças significativas, que pudessem indicar a presença de alguma interação
entre as espécies.
A cinética de degradação dos ácidos foi avaliada mediante a realização de
curvas isotermas por termogravimetria. A mistura física dos ácidos glicólico e kójico
na proporção de 5: 1 foi submetida a aquecimento à temperatura constante (65, 70,
75, 80 e 90°C) por período de tempo suficiente para ocorrência de perda de massa
de 10% (fig.15). Os dados de In t (min) e 1fT (OK1) obtidos foram usados para
construção do gráfico de Arrhenius (~ = 0,9978) ilustrado na fig.16. A partir do valor
de inclinação obtido (coeficiente b) a energia de ativação E foi calculada como sendo
de 90,7 KJ.mor1. O tempo de vida útil extrapolado a 25°C foi de 14,7 dias, sugerindo
a instabilidade da mistura nas condições experimentais utilizadas (temperatura
constante). Tais resultados confirmam a relatada instabilidade do ácido kójico e
podem explicar a dificuldade de obtenção de formulações estáveis contendo o ativo,
embora a cinética de degradação de substâncias puras pode diferir em muito do que
ocorre na matriz de uma formulação cosmética. A contribuição do ácido glicólico na
cinética de degradação da mistura merece ser objeto de futuras investigações.
A partir da caracterização das matérias-primas, diversas formulações
contendo ácido kójico associado ou não ao ácido glicólico foram preparadas e
avaliadas com a finalidade de selecionar as mais estáveis para o estudo de
estabilidade acelerada. Foram testadas formulações à base de creme não iônico e
aniônico e também na forma gel (gel de hidroxietilcelulose e gel de amigel®). A
literatura relata vasta mente a instabilidade do ácido kójico à temperatura, luz e pH.
Foram testados diferentes tipos de antioxidantes (ácido ascórbico, metabissulfito de
sódio, sulfito de sódio e BHT), em diferentes concentrações, alcalinizantes (hidróxido
de amônia e hidróxido de sódio), bem como substâncias fotoprotetoras (dióxido de
titânio, filtros solares UVA e UVB). Foram empregados ainda EDTA (agente
sequestrante), usando-se tampão citrato pH 3,5 com o objetivo de manter as
formulações dentro da faixa de pH na qual o ácido kójico se manteria mais estável
(3,0-5,0).
A análise dos caracteres organolépticos das formulações (tabelas 1-12)
mostrou que o creme não iônico e gel de hidroxietilcelulose são os excipientes mais
191
apropriados para a incorporação tanto do ácido kójico isolado como também
associado ao ácido glicólico, consideradas as duas formas de armazenagem usadas
no estudo preliminar (estufa a 45°C e exposto à luz à temperatura ambiente). EDTA,
metabissulfito de sódio e tampão citrato pH 3,5 foram os adjuvantes que
apresentaram os melhores resultados para ambas as formulações, creme e gel.
Ainda assim, as formulações selecionadas apresentaram algum grau de alteração na
cor, especialmente as submetidas à estufa a 45°C. A formulação contendo ácido
kójico a 1 % veiculado em gel de hidroxietilcelulose apresentou valores de pH mais
elevados, e em função da impossibilidade de mudança na concentração do tampão
para as demais formulações na forma creme (emulsões apresentam instabilidade
frente a altas concentrações de eletrólitos), foi mantida no estudo por ainda se
encontrar na faixa de pH de estabilidade do ácido kójico.
Os experimentos também demonstraram uma possível interação do hidróxido
de amônia com os demais constituintes da formulação, o que resultou na seleção do
hidróxido de sódio como agente alcalinizante.
A partir da seleção das formulações ácido kójico 1 % associado a ácido
glicólico 5% creme não iônico, ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% gel de
natrosol®, ácido kójico 1 % creme não iônico e ácido kójico 1 % gel de natrosol®,
passou-se ao desenvolvimento do método de análise.
A caracterização do ácido glicólico revelou que o mesmo não possui
absortividade significativa na região do ultravioleta, o que restringiu o
desenvolvimento de método analítico por espectrofotometria UV ao ácido kójico, cuja
varredura resultou no aparecimento de dois picos, a 216,2 e 268,6 nm.
O uso de espectrofotometria direta no UV para dosagem de ácido kójico nas
formulações propostas não foi possível em função dos excipientes usados
absorverem na mesma região do espectro que o analito (fig.22 e 24).
A obtenção dos espectros em derivada de primeira ordem, usando-se metanol
como solvente, permitiu escolher o ponto de anulação das formulações creme e gel
base (método "zero crossing") a 256,8 nm (fig.23 e 25). Posteriormente a
interferência foi identificada como sendo relativa aos parabenos presentes na
formulação. A observação do espectro produzido para a amostra submetida a 45°C
192
por 30 dias a fim de verificar a interferência de possíveis produtos de degradação,
não mostrou alteração na característica e formato do espectro obtido por derivada de
1 a ordem (fig.27). Embora não muito sensível, a análise do espectro derivado pode
ser usada como método indicativo da presença de produtos de degradação
(BAKSHI; SINGH, 2002).
A curva de calibração do ácido kójico obtida por espectrofotometria derivada
de primeira ordem (fig.18-21), na faixa de concentração de 2 a 18 1-1 gIm L,
apresentou coeficiente de correlação linear (r) de 0,9997.
o percentual de recuperação médio do ácido kójico na amostra creme a 1 %
por espectrofotometria derivada de primeira ordem foi de 103,00% com desvio
padrão relativo (DPR) médio de 0,19% (tabela 14). O teor de ácido kójico no creme
foi de 98,38 % com DPR médio de 0,41 % (tabela 16), revelando boa precisão do
método.
Para a amostra ácido kójico gel 1 % o percentual de recuperação variou de
99,00 a 101,00%, apresentando DPR médio de 0,20% (tabela 15). A precisão do
método para a amostra gel, com teor de 97,53%, foi de 0,49% de DPR (tabela 17).
A cromatografia líquida de alta eficiência foi proposta para quantificação dos
ácidos kójico e glicólico associados nas formulações descritas anteriormente.
Sendo o ácido glicólico substância altamente polar, o modo reverso foi o
adotado. Além disso, uma coluna C18 com capeamento polar foi selecionada em
função de proporcionar maior retentividade de compostos extremamente hidrofílicos.
O capeamento polar também permite a utilização de fases móveis com pouco ou
nenhum solvente orgânico, sem que haja risco para a integridade da coluna.
O ácido glicólico foi determinante na seleção do comprimento de onda de
detecção. Foi utilizado o comprimento de onda de 220 nm em função da região de
absorção do ácido glicólico compreender a faixa de 210 a 220 nm, coincidindo com o
primeiro dos dois picos de absorção do ácido kójico (216,2 nm) na região do
ultravioleta.
Muitos solventes e tampões absorvem na faixa de 205-230 nm, produzindo
interferência na detecção, traduzida pela eluição de picos espúrios na frente da fase
193
móvel (SNYDER et aI., 1997). Uma vez que a interferência é menor à medida que o
comprimento de onda aumenta, foi selecionado o valor de 220 nm. Em função da
acetonitrila apresentar um valor de "cutoff' (comprimento de onda abaixo do qual o
solvente absorve mais de 1,0 unidade de absorbância numa célula de 1 cm de
caminho óptico) maior que o do metanol, ela foi preferida como solvente orgânico.
Em função do caráter ácido dos analítos, a fase móvel foi preparada com
adição de tampão, a fim de manter estável o pH do sistema. Segundo SNYDER et
aI. (1997), a escolha do tampão deve considerar: capacidade tampão, valor de
"cutoff', solubilidade, estabilidade, interação com a amostra e com a coluna,
volatibilidade e corrosão do sistema entre outros.
o tampão fosfato (pKa1 = 2,1; pKa2= 7,2 e pKa3= 12,3) foi preferido em
relação aos tampões acetato e citrato também em função de apresentar um menor
valor de "cutoff' (fosfato < 200 nm; acetato 210 nm; citrato 230 nm). O tampão citrato
(pKa1 = 3,13; pKa2= 4,76 e pKa3= 6,40), apesar de não ser inorgânico e portanto
mais solúvel na presença de solventes orgânicos, e de possuir uma ampla faixa de
utilização em função de suas 3 faixas de pKa, foi evitado também pela possibilidade
de atacar as superfícies de aço inox do equipamento. Dos sais de fosfato, o de sódio
não é geralmente utilizado, em função de sua menor solubilidade (SNYDER et aI.,
1997; SCHELLlNGER; CARR, 2004). Uma vez que o tampão fosfato de potássio
apresentou sinais de precipitação durante o desenvolvimento do método, foi
substituído pelo sal de amônio.
A variação do pH da fase móvel foi usada para promover a seletividade e a
retenção, a partir do conhecimento dos valores de pKa dos compostos: 3,83 para o
ácido glicólico e 7,9 e 8,03 para o ácido kójico.
A elevada polaridade do ácido glicólico restringiu o método ao uso de fases
móveis com baixo pH (abaixo do pka de 3,83). Isso porque a forma não dissociada
do mesmo apresenta caráter mais apoiar, favorecendo a retenção na coluna de fase
reversa. O pH foi variado dentro da faixa de ± 1,0-1,5 unidades do valor do pKa do
tampão, faixa na qual os tampões são mais eficazes em manter o pH.
A baixa retentividade do ácido glicólico também implicou na adição de pouco
solvente orgânico na fase móvel. Entretanto, não foi possível o uso de um sistema
194
totalmente aquoso em função da característica menos polar do ácido kójico e sua
maior retentividade na coluna.
Os sistemas de 1 a 12 (tabela 18 e 19) não foram capazes de promover a
retenção satisfatória do ácido glicólico. O fator de retenção (k) foi menor que 0,1
nesses sistemas, mesmo a pH tão baixo quanto 2,00 e usando baixa concentração
de solvente orgânico. A eluição do ácido glicólico ocorreu próximo do tempo morto
da coluna, sofrendo interferência dos constituintes da fase móvel.
Apenas com o uso do reagente de pareamento iônico brometo de
tetrabutilamônio (TBA) foi possível aumentar o fator de retenção para valores da
ordem de 0,2.
Quando o pareador iônico foi usado a 2 mM em tampão fosfato de amônia 30
mM pH 2,20, fases móveis 13 e 14, os valores de k para o ácido glicólico foram de
0,19 e 0,20, respectivamente.
Na fase móvel 13, desprovida de solvente orgânico, o tempo de retenção do
ácido kójico foi muito elevado, da ordem de 11 ,3 minutos. Além disso, interferentes
das formulações como EDTA e ácido cítrico eluíram próximos do pico do ácido
kójico, em 11 ,76 e 11,92 minutos, respectivamente.
Na fase móvel 14, já com a adição de 2% de acetonitrila, a retenção do ácido
kójico baixou para 8,86 minutos, mas o pico ainda sofreu interferência do ácido
cítrico que eluiu em 8,97 minutos, tendo o EDTA eluído tardiamente (10,58 min.).
Com a finalidade de aumentar a retenção do ácido glicólico o pH do tampão
foi aumentado para 3,00 (fase móvel 15), pois quanto maior o grau de ionização do
analíto maior sua interação com o pareador iônico e conseqüentemente com a fase
estacionária. A estratégia teve como efeito positivo a elevação do fator de retenção
do ácido glicólico para 0,33 e a diminuição do tempo de retenção do ácido kójico
para 8,86 minutos.
Entretanto, a retenção dos interferentes foi aumentada em função do pH
escolhido se situar próximo ao valor do primeiro pKa do ácido cítrico (pKa1 = 3,1) e
do segundo pKa do EDTA (pKa1 = 2,07, PKa2 = 2,75, PKa3 = 6,24, PKa4 = 10,34).
195
Mais ionizados, apresentaram aumento do tempo de retenção para 12,32 minutos
(EDTA) e 13,79 minutos (ácido cítrico).
o aumento da concentração de acetonitrila de 2% para 5% levou o tempo de
retenção do ácido kójico a níveis mais adequados (6,0 minutos), mantendo o fator de
retenção do ácido glicólico em níveis aceitáveis (0,24) . EDTA e ácido cítrico tiveram
seus tempos de retenção diminuídos para 9,2 e 11,4 minutos, respectivamente,
resultando num tempo de corrida final para as amostras de 12 minutos.
o aumento da concentração de tetrabutilamônio de 2 mM para 4 mM (fase
móvel 17) não produziu melhora significativa na retenção do ácido glicólico.
Dessa maneira, a fase móvel 18 (tampão fosfato de amônio 30 mM
adicionado de TBA 2mM pH 3,OO/acetonitrila 95:5), foi selecionada para a validação
do método.
o tempo de corrida estabelecido de 12 minutos permitiu a eluição dos ácidos
glicólico (tR = 4,58 min) e kójico (tR = 6,00 min) e dos interferentes da matriz,
tornando viável sua aplicação em análises de rotina (fig.28-32).
As curvas de calibração obtidas por CLAE para o ácido glicólico (40 a 240
\-I9/mL) e para o ácido kójico (8 a 48 \-Ig/mL) a 220 nm apresentaram coeficientes de
correlação (r) de 0,9998 e 0,9999, respectivamente, demonstrando a boa linearidade
do método (tabela 20, fig.33-36). A revisão da literatura mostrou resultados de
0,9990 (9,375-150 \-Ig/mL a 270 nm) e 0,999 (0,05-100 \-Ig/mL a 270 nm) para os
trabalhos realizados por Masse et aI. (2001) e Shi (2001), respectivamente, na
determinação do ácido kójico por CLAE. Huang et aI. (2002) obtiveram para o ácido
glicólico "r" igual 0,9997 na faixa de 25-200 \-Ig/mL, Couch; Howard (2002) 0,998
entre 23,1-462 \-I gIm L, Scallia et aI. (1998) 0,998 entre 15-500 \-Ig/mL e Nicoletti et aI.
(1999a) 0,99996 para a faixa de 92-736 \-I gIm L, todos realizados com detecção a
210 nm, e Chang; Chang (2003) o valor de 0,9974 para concentrações de 8-36
\-Ig/mL a 220 nm. Trabalhando a 214 nm, De Villiers et aI. (1998) e De Villiers et aI.
(1997) encontraram valores de "r" para o ácido glicólico de 0,9998 na faixa de 50-
100 \-Ig/mL e 0,9999 na faixa de 200-1000 \-Ig/mL.
196
A análise do perfil cromatográfico das amostras ácido kójico 1 % associado a
ácido glicólico 5% creme e gel mostrou a especificidade do método, quando
comparados aos cromatogramas das formulações creme e gel base (fig.37 -40). O
cromatograma obtido da análise da amostra submetida a envelhecimento a 45°C por
30 dias não revelou a existência de outros picos (fig. 41 e 42). A pureza dos picos
analisada no detector PDA ("photo diode array detector") foi de 99,9999% para o
pico do ácido kójico e 99,9997% para o do ácido glicólico.
Para a amostra ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme os
percentuais de recuperação médios foram de 99,9 % (DPR médio = 1,57%) para o
ácido glicólico (tabela 21) e de 102,7% (DPR médio = 0,19%) para o ácido kójico
(tabela 22).
Os percentuais médios de recuperação para a amostra ácido kójico 1 %
associado a ácido glicólico 5% gel foram de 99% (DPR médio = 0,96%) para o ácido
glicólico (tabela 23) e de 106,0% (DPR médio = 0,53%) para o ácido kójico (tabela
24).
As taxas de recuperação obtidas por CLAE apresentadas na revisão de
literatura para o ácido kójico foram de 73-96% e de 78,5-90,4% nos estudos
realizados por Kimura et aI. (2000) e Sato et aI. (2000), respectivamente. Em ambos
os estudos os pesquisadores trabalharam com matriz de alimentos.
Usando matriz cosmética, Shih (2001) relatou taxas de recuperação da ordem
de 95,2±O,99 a 101,8±2,10% e de 97,65±O,52 a 103,8±1,59% para amostras
contendo ácido kójico na forma creme e loção, respectivamente.
Diversos estudos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência foram
realizados com o objetivo de testar a recuperação de ácido glicólico em amostras
cosméticas. Os autores encontraram taxas de recuperação de 92,4-96,2% (SCALLlA
et aI., 1998), 99,6% (DE VILLlERS et aI. 1998),93% (YATES; HAVERY, 1999),98,2-
101,5% (N ICOLETTI et aI., 1999a), 98,2-100% (HUANG et aI., 2002), 100,1-109,8%
(COUCH; HOWARD, 2002) e 99,6-100,1 (CHANG; CHANG, 2003).
Para o teste de precisão realizado por CLAE foram obtidos 0,77% de desvio
padrão relativo para a determinação do teor do ácido kójico (98,69%) e de 1,81%
197
para a determinação do teor (106,85%) do ácido glicólico na amostra ácido kójico
1 % associado a ácido glicólico 5% creme (tabelas 25 e 26).
Na amostra contendo ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% na
forma gel a determinação do ácido kójico mostrou precisão (OPR) de 1,30% (teor =
98,6%), enquanto a do ácido glicólico foi de 1,82% (teor = 105,57%), conforme
mostrado nas tabelas 27 e 28. O teor de 105,57% de ácido glicólico pode ser
explicado pelo fato da matéria-prima utilizada no preparo das amostras apresentar
se comercialmente na forma de solução a 70%, com possível concentração do teor
de ácido glicólico por evaporação da água, durante o armazenamento no laboratório.
Masse et aI. (2001) obtiveram precisão de 0,4% e 6,77% de OPR quando
testaram formulações contendo ácido kójico na forma creme por CLAE. Shih (2001)
encontrou OPR igual a 2,19%,0,38% e 0,31% para concentrações de 1, 10 e 100
ppm de ácido kójico, respectivamente, e de 0,62% em amostra comercial.
Analisando amostras comerciais Scallia et aI. (1998) e Chang; Chang (2003)
obtiveram OPR de 1,5-5,4% e de 2,2%, respectivamente, na determinação da
precisão do ácido glicólico por CLAE.
A robustez do método de cromatografia líquida de alta eficiência na
determinação dos ácidos kójico e glicólico foi também avaliada. Segundo o
instrumento Q2A do ICH (ICH, 1994) robustez de um procedimento analítico é a
capacidade de não ser afetado por pequenas, mas deliberativas, variações em
parâmetros do método, fornecendo uma indicação de sua confiabilidade durante o
seu uso rotineiro. Para tanto, em se tratando de métodos cromatográficos,
normalmente são usadas variações na temperatura, pH, tipo de coluna, parâmetros
do instrumento, etc. No presente estudo a robustez do método foi avaliada variando
se o detector POA ("photo diode array detector") para UV-VIS, em outro
equipamento.
Usando cromatógrafo líquido acoplado a detector UV-VIS, a linearidade
(coeficiente de correlação) do método foi de 0,9999 para o ácido kójico e de 0,9997
para o ácido glicólico (fig. 43 e 44). Os tempos de retenção dos analítos foram
ligeiramente maiores (tR ácido glicólico = 5,02; tR ácido kójico = 6,79), o que não
comprometeu a resolução do cromatograma.
198
As taxas de recuperação média foram de 101,05% (DPR de 0,71-1,0%) para
o ácido glicólico e de 103,78% (DPR= 0,17-0,32%) para o ácido kójico, na amostra
ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme (tabelas 29 e 30). A taxa de
recuperação média do ácido kójico na amostra ácido kójico 1 % associado a ácido
glicólico 5% gel foi de 101,72% (DPR = 0,99-1,11%), conforme mostra a tabela 31.
Para o teste de precisão foram encontrados valores de DPR de 0,45% e
0,43% na determinação do ácido kójico e de 1,34% e 1,14% para o ácido glicólico
nas amostras ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% creme e gel,
respectivamente (tabela 32).
Os resultados demonstram a robustez do método frente à variação do
detector PDA para UV-VIS.
Para a determinação de ácido kójico isolado em formulações tópicas também
foi desenvolvido um método por cromatografia líquida de alta eficiência,
empregando-se as mesmas condições experimentais utilizadas na determinação dos
ácidos associados.
O valor do coeficiente de correlação para o teste de lineàridade do ácido
kójico foi de 0,9999 (tabela 33, figo 45 e 46), demonstrando a boa linearidade do
método na faixa de concentração estudada.
A taxa de recuperação média de padrão de ácido kójico adicionado à amostra
foi de 102,7% (DPR= 0,11-0,63%) para a amostra ácido kójico 1% creme e de
102,2% (DPR= 0,42-0,52%) para a amostra ácido kójico 1 % gel (tabelas 34 e 35).
O desvio padrão relativo nas amostras creme e gel foi de 0,56% e 0,75%,
respectivamente, demonstrando a precisão do método (tabelas 36 e 37).
A comparação estatística entre os métodos desenvolvidos para a
determinação do ácido kójico isolado em formulações cosméticas foi feita quanto aos
parâmetros de precisão e exatidão, aplicando-se os testes F e t emparelhado,
respectivamente. Ao nível de 95% de confiança não houve diferença
estatisticamente significante entre a cromatografia líquida de alta eficiência e a
espectrofotometria derivada de primeira ordem quanto aos parâmetros avaliados
(tabela 38).
199
Com a finalidade de avaliar a estabilidade das formulações desenvolvidas
contendo ácido kójico associado ou não a ácido glicólico na forma creme e gel, um
estudo de estabilidade acelerado foi conduzido, sendo as formulações armazenadas
em estufa a 40±2°C e expostas à luz a 25±2°C. Uma vez que as formulações
testadas são formas semi-sólidas de base aquosa, acondicionadas em embalagem
semi-permeável, não foram submetidas à condição de 75% de umidade relativa
(UR). O controle de perda de umidade foi feito através da pesagem das embalagens
antes e depois do experimento, tendo sido considerada na correção dos cálculos de
teor das formulações.
O estudo foi conduzido por 90 dias, de acordo com as recomendações do
Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos da ANVISA (BRASIL, 2004a). As
análises de avaliação dos caracteres organolépticos, pH, doseamento e
comportamento reológico foram realizadas nos To, T 48, T15, T30, T 60 e Tgo.
Simultaneamente ao estudo acelerado, as amostras também foram
armazenadas em armário fechado, à temperatura ambiente, para avaliar o
comportamento das mesmas em condições normais de armazenamento.
Diferentemente do estudo preliminar de estabilidade que visa selecionar as
formulações, orientando desta maneira o pré-desenvolvimento da formulação, o
estudo de estabilidade acelerado pode ser usado de forma auxiliar na determinação
do prazo de validade da formulação, ou determiná-lo de forma provisória, até que o
estudo de longa duração (teste de prateleira) seja realizado. Segundo o Guia para
Realização de Estudo de Estabilidade da ANVISA (BRASIL, 2004b) o estudo é
projetado para acelerar a degradação química ou mudanças físicas de um produto
farmacêutico em condições forçadas de armazenamento. Os dados assim obtidos,
juntamente com aqueles derivados dos estudos de longa duração, podem ser
usados para avaliar efeitos químicos prolongados em condições não aceleradas e
para avaliar o impacto de curtas exposições a condições fora daquelas
estabelecidas no rótulo do produto, que podem ocorrer durante o transporte.
O mesmo guia estabelece um prazo de validade provisório de 24 meses
quando o estudo de estabilidade acelerado foi realizado e nenhuma mudança
significativa foi observada, condicionado à apresentação imediata dos resultados do
200
estudo de prateleira quando o mesmo for finalizado. Quando mudanças significativas
ocorrem no estudo de estabilidade acelerado, este deverá ser desconsiderado,
devendo prevalecer os dados do estudo de longa duração. Por mudança significativa
são definidos, entre outros, a perda de 5% em relação ao teor inicial do lote, pH do
produto fora do limite especificado, não atendimento às especificações para
aparência e propriedades físicas como cor, separação de fase, dureza, etc.
o Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos da ANVISA (BRASIL, 2004a)
menciona ainda que devido à natureza particular das formulações dos produtos
cosméticos, se aceita como regra geral, a impossibilidade da eleição de um
ingrediente isolado do restante da formulação, tornando difícil a aplicação da relação
entre constante cinética, temperatura e uma correlação direta dessas variáveis com
o prazo de validade estimado.
No caso de produtos manipulados, a RDC 33 da ANVISA (BRASIL, 2001)
estabelece que as farmácias de manipulação estimem o prazo de validade das
formulações a partir da realização de estudos de estabilidade ou com base em
estudos técnicos científicos já realizados.
Em função de razões econômicas, de disponibilidade do produto ou de
natureza técnico-científica, muitas vezes os médicos prescrevem formulações para
serem manipuladas extemporâneamente (VERMEULEN et aI., 1999). Os ácidos
kójico e glicólico são ativos freqüentemente encontrados em prescrições médicas
aviadas em farmácias de manipulação no Brasil. Em geral, os excipientes utilizados
para incorporá-los são os mesmos utilizados no presente estudo.
Quatro formulações foram selecionadas no estudo preliminar e submetidas
ao estudo acelerado de estabilidade: ácido kójico 1 % associado a ácido glicólico 5%
e ácido kójico 1 %, nas formas creme não iônico e gel de natrosol®.
Ao final dos 90 dias do estudo, a avaliação dos caracteres organolépticos
revelou que apenas as formulações armazenadas a 40±2°C apresentaram sinais
visíveis de degradação, com desenvolvimento de coloração bege a levemente
amarelada. As formulações expostas à luz a 25±2°C ou armazenadas em armário
fechado à temperatura ambiente mantiveram a coloração apresentada no início do
estudo (tabelas 39 a 42).
201
A análise de pH (tabelas 43 a 46) não mostrou mudanças significativas para a
maioria das formulações, nas 3 condições de armazenagem, quando se compara o
pH no To e ao final do estudo (T 90) . Em todos os casos as alterações não foram
maiores que ±0,4 unidades de pH. A formulação ácido kójico 1 % creme apresentou
valor de pH menor 3,5 pH quando armazenada em estufa a 40±2°C, o que ocorreu
também quando exposta à luz a 25±2°C (tabela 45). As formulações contendo ácido
glicólico mantiveram o pH acima de 3,5, em conformidade com as recomendações
internacionais. Os resultados também sugerem uma tendência de aumento do pH,
com o decorrer do tempo de armazenagem, para as formulações contendo os dois
ácidos associados e uma tendência de queda para aquelas contendo apenas o
ácido kójico (exceto para o gel armazenado em armário a temperatura ambiente).
A queda de pH em níveis menores que 3,5 na formulação ácido kójico 1 %
creme não iônico após 90 dias nas condições de envelhecimento acelerado
evidencia que o tampão citrato 1 M pH 3,5 usado a 10% na formulação, não foi
suficiente para impedir variações do pH de tal ordem.
A análise do teor das formulações usando o método de cromatografia líquida
de alta eficiência mostrou declínio no teor de ácido kójico em quase todas as
situações.
Os dados obtidos (tabelas 47 a 50) indicam que a degradação média do
ácido kójico armazenado em estufa a 40±2°C não foi estatisticamente diferente ao
nível de significância de 0,05 da que ocorreu em luz a 25°C, exceto para a amostra
creme contendo os 2 ácidos associados, que revelou queda importante do teor de
ácido kójico já no T15, sugerindo para essa amostra uma condição muito drástica de
armazenamento. Embora a diferença entre a média do teor remanescente de ácido
kójico entre duas condições aceleradas não tenha sido estatisticamente significante,
os resultados sugerem uma diferenciação, em termos de uma maior degradação das
amostras armazenadas em estufa, mais ao fim do experimento.
A média de teor remanescente do ácido kójico nas amostras não foi
estatisticamente diferente (o = 0,05) quando a condição exposição à luz é
comparada com armário à temperatura ambiente, o que sugere que a embalagem
202
utilizada para acondicionamento das formulações exerceu efeito protetor contra a
ação da luz.
Quando comparada à condição armário, a degradação do ácido kójico em
estufa resultou em médias de teores remanescentes estatisticamente menores,
evidenciando que a temperatura exerceu efeito importante sobre a degradação das
amostras.
Quando as quatro amostras foram comparadas entre si, não houve diferença
entre a média de teor remanescente de ácido kójico (o = 0,05) apresentada,
independente da condição de armazenagem, para as amostras contendo ácido
kójico 1 % associado a ácido glicólico 5% na forma creme e gel e ácido kójico 1 %
creme. A amostra ácido kójico 1 % gel (tabela 50) apresentou teor remanescente
médio acima das demais em todas as condições de armazenagem, mas não foi
estatisticamente diferente da amostra gel contendo os dois ácidos associados
(tabela 48) Tais resultados sugerem uma tendência de menor degradação média
para as formulações na forma gel.
Esse resultado talvez possa estar correlacionado ao pH das formulações uma
vez que as amostras na forma gel mantiveram uma faixa de pH ligeiramente superior
durante o estudo, especialmente a formulação ácido kójico 1 % gel, sugerindo que
um valor de pH mais elevado possa ser mais favorável quanto à manutenção da
estabilidade do ácido kójico.
Considerados os resultados apresentados ao final do T90 e o que dispõe a
legislação (BRASIL, 2004b), as formulações armazenadas a 40±2°C apresentaram
queda de teor acima dos 5% de tolerância em relação ao teor original, sendo 18,7%
para ácido kójico 1 % creme não iônico, 13,8 % para ácido kójico 1 % associado a
ácido glicólico 5% creme não iônico, 9,6% para ácido kójico 1 % associado a ácido
glicólico 5% gel de natrosol® e 6,4 % para ácido kójico 1 % gel de natrosol®. Ambas
as formulações na forma creme também mostraram redução de teor acima de 5%
quando expostas à luz a 25±2°C, sendo de 12,6% para o creme contendo apenas o
ácido kójico e de 8,9% para o creme contendo os dois ácidos associados. Nessa
condição de armazenagem, as duas formulações na forma gel mantiveram-se na
faixa de até 5% de perda de teor.
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oinT9i o opuenap `we6eleqwe e oeó!sodwoo wa saluetilawas seo5einupo4 wed anb
epsap loe5eindpew ap sep?wiel wed epu9Ja4w ewn owoo opwap!suoo Jes apod
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00g9)1 oppe wed oke`6 :oo0.91 oppç ap lep!u! Joal oe oe5eiw we o0epefflep
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ç °papal op?wie) weBeuezeume ap 'atuou oeóipuoo e epwap!suoo opueno
COZ
204
pudesse ter sido originado por um produto de degradação do ácido kójico não
detectado pela análise de pureza do pico realizada com o detector POA. A literatura
aponta que o detector POA não é muito sensível e pode ser incapaz de detectar
interferentes em concentração < 1 % (BAKSHI; SINGH, 2002). A temperatura de
45°C usada para o envelhecimento da formulação por 30 dias, submetida depois ao
teste de especificidade, pode também não ter sido suficiente para provocar o
surgimento dos produtos de degradação em concentrações detectáveis pelo
método. Entretanto, não parece serem essas as respostas para o aumento do teor
do ácido glicólico verificado no estudo de estabilidade. Isso porque, se observados
os resultados das tabelas 47 e 48, o aumento do teor do ácido glicólico ocorreu de
maneira expressiva mesmo nas condições de armazenagem onde a degradação do
ácido kójico foi mínima.
Uma outra questão pode estar relacionada com a forma como o ácido
glicólico é disponibilizado comercialmente. O laudo fornecido pela empresa que
cedeu a matéria-prima menciona teor de 70%-72% de ácidos totais e 64,1-66,7% de
ácidos livres. Segundo um dos fabricantes da matéria-prima (OUPONT, 2005) o
ácido glicólico pode reagir com ele mesmo para formar glicolídios diméricos,
poliglicolídeos e carboximetil-hidroxiacetatos, os quais podem hidrolisar
gradualmente em meio aquoso. Se a diferença entre o teor de ácidos totais e livres
se refere à forma polimerizada, isso talvez ajudasse a explicar o aumento do teor,
pois a hidrólise da forma cíclica poderia estar, com o tempo, levando à "liberação"
da forma livre.
A ocorrência desses fatos e a real implicância dos mesmos na elevação do
teor do ácido glicólico devem ser objeto de investigação futura.
A estabilidade física das formulações foi avaliada no estudo acelerado através
do comportamento reológico (tabelas 51 a 62) .
Reologia é a ciência que estuda o comportamento de fluxo, o qual pode ser
classificado em newtoniano, no qual a viscosidade é constante, e não newtoniano,
no qual a viscosidade se altera em função da força de cisalhamento aplicada (LABA,
1993).
205
Quando observadas no To, as quatro formulações avaliadas apresentaram
comportamento não newtoniano caracterizado como pseudoplástico, ou seja, aquele
no qual a viscosidade, que é a resistência ao fluxo, diminui à medida que a força de
cisalhamento aumenta.
A observação das curvas descendentes nos gráficos permite afirmar que as
quatro formulações mostraram-se tixotrópicas, ou seja, têm a recuperação de sua
estrutura dependente do tempo.
As formulações na forma gel apresentaram-se mais viscosas ou consistentes
no To quando comparadas às formulações na forma creme. Os valores iniciais de
"yield value" (força de cisalhamento mínima necessária para induzir o fluxo) também
foram aparentemente maiores para as formulações na forma gel quando
comparados aos cremes.
As formulações contendo ácido kójico associado ao ácido glicólico
apresentaram viscosidade ligeiramente menor no To, quando comparadas às
formulações contendo apenas o ácido kójico, provavelmente em função da maior
proporção de líquidos incorporados (o próprio ácido glicólico e a solução de NaOH
usada na sua neutralização).
Analisando-se nos gráficos ilustrados nas figuras de 47 a 58 as alterações
apresentadas no T 90, percebe-se que as formulações na forma creme tiveram um
aumento da viscosidade.
Embora emulsões possam ser consideradas sistemas termodinamicamente
instáveis, tais resultados podem ser explicados pelo fato de que sua estrutura sofre
alterações após o processo de fabricação, relacionados à maturação da formulação.
De maneira geral, a viscosidade das emulsões aumenta com o envelhecimento,
sendo que um aumento significativo da consistência pode ocorrer após 2 ou 3
meses de fabricação (LACHMAN et aI., 2001). Além disso, segundo Laba (1993)
tensoativos não iônicos a altas temperaturas podem sofrer mudanças moleculares,
tornando-se menos hidratados, com alteração do valor de EHL. Uma vez que o
tensoativo é fator determinante da viscosidade, emulsões expostas a essas
condições podem ser mais estáveis que à temperatura ambiente. Em adição, o
álcool cetoestearílico, presente na cera polawax® usada no creme não iônico,
206
possui uma tendência a aumentar de viscosidade com o envelhecimento da
formulação (DI MAMBRO et aI., 2003). O fato do aumento da viscosidade ter sido
maior para as formulações armazenadas a 40±2°C pode ser explicado pela maior
perda de água das mesmas nessa condição.
As formulações gel não apresentaram alterações significativas da viscosidade
ao final do estudo, quando armazenadas à temperatura ambiente ou expostas à luz
25±2°C, demonstrando boa estabilidade nessas condições. Entretanto, a 40±2°C a
viscosidade diminuiu. A hidroxietilcelulose (natrosol®) pode sofrer despolimerização
através da clivagem oxidativa das ligações glicosídeo, influenciada pela ação da luz
e temperatura (CARLOTTI et aI., 2004), o que pode explicar a diminuição da
consistência. Embora esse fato possa representar uma possível instabilidade dos
géis à temperatura, a diminuição das bolhas (presentes no gel devido ao processo
de fabricação) provocada pelo aumento da temperatura, pode ter contribuído para a
redução da viscosidade. Observadas visualmente ao final do estudo, as formulações
apresentavam ainda boa consistência (não se liquefizeram).
207
7. CONCLUSÕES
A partir dos resultados experimentais pode-se concluir que:
- as metodologias desenvolvidas para a determinação do ácido kójico isolado
por espectrofotometria derivada no ultravioleta e cromatografia líquida de alta
eficiência demonstraram boa precisão, exatidão, linearidade e especificidade,
podendo ambas ser utilizadas na análise de formulações tópicas na forma creme e
gel contendo o ativo;
- a metodologia desenvolvida para a determinação dos ácidos kójico e
glicólico associados demonstrou boa exatidão, linearidade, especificidade e
precisão, podendo ser usada na análise de formulações tópicas na forma creme e
gel contendo o ativo;
- o ácido kójico é uma substância instável e mesmo formulado na presença de
adjuvantes habitualmente relatados como estabilizadores para o ativo não suportou,
de forma geral, as condições aceleradas de armazenamento empregadas nesse
estudo. Além disso, quando associado em mistura física ao ácido glicólico, na
mesma proporção usada nas formulações, demonstrou tempo extrapolado de vida
útil a 25°C de apenas 14, 7 dias, e
- as formulações estudadas mantiveram suas características organolépticas,
estabilidade física e no mínimo 90% do teor de ácido kójico no estudo de
estabilidade quando armazenadas em condições normais, indicando que o prazo de
validade de 90 dias pode ser considerado para formulações semelhantes, em
composição e embalagem, desde que guardadas à temperatura ambiente e ao
abrigo da luz.
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