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UNIVERSIDADE DE UBERABA
GUILHERME CAETANO GARCIA
DESENVOLVIMENTO DE TESTE IMUNOENZIMÁTICO ELISA PARA DIAGNÓSTICO
DA TRIPANOSOMÍASE BOVINA UTILIZANDO PROTEÍNA RECOMBINANTE DE
Trypanosoma vivax
UBERABA, MG
2016
GUILHERME CAETANO GARCIA
DESENVOLVIMENTO DE TESTE IMUNOENZIMÁTICO ELISA PARA DIAGNÓSTICO
DA TRIPANOSOMÍASE BOVINA UTILIZANDO PROTEÍNA RECOMBINANTE DE
Trypanosoma vivax
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em Sanidade e Produção Animal nos Trópicos,
do Programa de Pós-Graduação em Medicina
Veterinária da Universidade de Uberaba.
Orientadora: Profa. Dra. Joely Ferreira
Figueiredo Bittar.
UBERABA, MG
2016
GUILHERME CAETANO GARCIA
DESENVOLVIMENTO DE TESTE IMUNOENZIMÁTICO ELISA PARA DIAGNÓSTICO
DA TRIPANOSOMÍASE BOVINA UTILIZANDO PROTEÍNA RECOMBINANTE DE
Trypanosoma vivax
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em Sanidade e Produção Animal nos Trópicos
da Universidade de Uberaba.
Área de concentração: Sanidade e Produção
Animal nos Trópicos
Aprovada em: 01/ 07/ 2016.
“Senhor,
Fazei-me instrumento de vossa paz.
Onde houver ódio, que eu leve o amor.
Onde houver ofensas, que eu leve o perdão.
Onde houver discórdia, que eu levea união.
Onde houver dúvidas, que eu leve a fé.
Onde houver erros, que eu leve a verdade.
Onde houver desespero, que eu leve a esperança.
Onde houver tristezas, que eu leve a alegria.
Onde houver trevas, que eu leve a luz.
Mestre, fazei que eu procure mais:
consolar que ser consolado,
compreender que ser compreendido,
amar que ser amado.
Pois é dando que se recebe,
é perdoando que se é perdoado,
e é morrendo que se vive para a vida eterna.”
S. Francisco de Assis
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus por todas as vitórias e por me dar a certeza de nunca estar
só, e Nossa Senhora da Medalha pela intercessão de mãe, sempre constante.
Aos meus amados pais, Antonio José Garcia e Sueli Maria Caetano Garcia, por tudo que
fazem por mim. Sem vocês, nada disso seria possível. Se hoje me torno mestre, é fruto da
educação virtuosa que vocês me deram. O mundo seria muito melhor se houvessem mais
pessoas como vocês. Minha eterna gratidão e amor.
À minha irmã Carolina Caetano Garcia e meu cunhado Savio Gonçalves dos Santos, pelos
bons momentos e ensinamentos.
Agradeço também a toda a minha família pelo apoio, amor, incentivo e pelas palavras sempre
gentis, e de modo singular à madrinha Marília Andréia Vaz, Hugo Leandro Pereira Vaz e
Mayara Vaz, que se tornaram minha segunda família em Belo Horizonte, dando a mim todo o
suporte, apoio e força que precisava durante minhas estadas e realização dos experimentos.
Aos professores que apoiaram a minha escalada até aqui. De modo particularmente especial à
professora Dra. Joely Ferreira Figueiredo Bittar, que mais que orientadora, tornou-se uma
amiga, mostrando-me diariamente como ser o tipo de profissional que queria me tornar,
preocupando-se não apenas em formar e orientar um aluno pós-graduando, mas me
estimulando a buscar o melhor também como pessoa. Não existem palavras para expressar
tamanha gratidão a tudo que fez por mim. Agradeço também ao professor Dr. Eustáquio
Resende Bittar pela exemplar conduta de líder, especialmente em relação aos que obstruem.
Desejo mais profissionais como vocês para a nossa profissão e para a comunidade acadêmica.
Ao professor Dr. Daniel Menezes Souza, pela grande ajuda durante a realização do trabalho,
também à sua equipe que não mediu esforços: Ana Maria Carvalho, Daniela Pagliara,
Fernanda Fonseca, Letícia Lage, Lourena Costa, Marcella Rezende, Mariana Costa e Vívian
Tamietti, contribuindo com a realização dos experimentos e proporcionando bons momentos
de convivência dentro do laboratório.
Agradeço também aos doutores Olindo Assis Martins Filho, Márcio Sobreira Silva Araújo,
Matheus Fernandes Costa e Silva e Thiago Antonio de Oliveira Mendes, pela contribuição de
grande valia neste trabalho.
Agradeço à Universidade de Uberaba, onde também sou formado, e ao programa de Mestrado
em Sanidade e Produção Animal nos Trópicos, pela significativa oportunidade de
crescimento.
Aos amigos que direta ou indiretamente colaboraram na realização deste trabalho, também
aos meus colegas mestrandos e mestres: Camila Cristina, Carlos Henrique Cavallari, Dênia
Monteiro, Francielle de Sousa, Luiz Fernando Vaz, Raphaela Ribeiro, Renata Teixeira, Marco
Aurélio Lima, Maritssa Caetano, Patrícia Peralta, Taís Maciel Afonso e a todos os
colaboradores do Hospital Veterinário de Uberaba, por toda ajuda durante o mestrado.
Aos alunos de Iniciação Científica: Daniela Paiva, Fernanda Faria, Guilherme Sousa, Lucas
Petsolt, Luciano Konrad, Maria Laura Teixeira, Natália Pinheiro e Otoniel Rodrigues.
À CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão da
bolsa, que foi de grande ajuda durante o percurso do mestrado.
Enfim, a todos que colaboraram com a minha caminhada até aqui, pelo convívio, pelos
ensinamentos, pela ajuda, pelas palavas, e por acreditarem. Do fundo do coração, meu muito
obrigado.
RESUMO
A tripanosomíase é causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma vivax e acomete
ungulados domésticos e selvagens. Estima-se que animais infectados contribuam com uma
perda anual de 160 milhões de dólares, devido a redução na produção de leite e carne, perda
de escore corporal, dificuldades na reprodução, abortos e em muitos casos, morte. O
patógeno causa sintomatologia clínica que pode ser similar a outras patologias que acometem
bovinos, portanto o diagnóstico deve ser preciso e não erroneamente diagnosticado como uma
doença com sintomatologia similar. O objetivo do presente trabalho foi obter proteína
recombinante do Trypanosoma vivax e padronizar um teste ELISA (Enzime linked
immunosorbent assay), para diagnóstico da tripanosomíase bovina com maior sensibilidade e
especificidade. Uma proteína foi selecionada por meio de análise por bioinformática,
produzida de forma recombinante, expressa, purificada e utilizada na padronização do ELISA.
Inicialmente, diferentes concentrações de proteína recombinante (1, 10, 100 e 1000
nanogramas) foram testadas, bem como diferentes diluições de pool de soros positivos de
animais experimentalmente infectados e negativos (1:100, 1:250 e 1:500) e diferentes
diluições de conjugado anti-IgG marcado com peroxidase (1:5000, 1:10000 e 1:20000). Após
a padronização, foi realizado o teste utilizando-se amostras de bovinos infectados
experimentalmente por T. vivax nos dias 0, 21, 24, 27 e 30 pós-infecção experimental. A
maior diferença de densidade ótica entre animais positivos e negativos foi observada
utilizando-se 1000 nanogramas de proteína recombinante, soro na diluição de 1:100 e
conjugado na diluição de 1:5000. Após analisar as densidades óticas, foi realizada a curva
ROC (Receiver Operating Characteristic) e estabelecido um ponto de corte de 0,04. O teste
apresentou acurácia de 98,6%, sensibilidade de 94,4% e especificidade de 100%. Valor
preditivo positivo e valor preditivo negativo foram 100% e 93,3%, respectivamente. A razão
de verossimilhança negativa e positiva foram de 0,06 e +∞, respectivamente. A padronização
se mostrou adequada com a quantidade utilizada de proteína recombinante de 1000
nanogramas, diluição de soros de 1:100 e diluição de conjugado de 1:5000. Sensibilidade e
especificidade obtidos com soro de animais infectados experimentalmente são promissores e
destacam o potencial da proteína recombinante para diagnóstico preciso da tripanosomíase
bovina.
Palavras-chaves: Trypanosoma vivax, proteína recombinante, diagnóstico
ABSTRACT
Tripanosomiasis is caused by the hemoflagellate protozoan Trypanosoma vivax and affects
domestic and wild ungulates. It is estimated that infected animals can contribute to an
estimated annual loss of 160 million dollars, due to decrease in milk and meat production,
loss of body condition, difficulties in reproduction, abortion, and in many cases death. The
pathogen causes clinical symptoms that can be similar to other pathologies that affect bovines,
therefore, the diagnosis must be precise and not misdiagnosed to a disease with similar
symptoms. The objective of this present study was to obtain recombinant protein from
Trypanosoma vivax and standardize an ELISA (Enzime linked immunosorbent assay), for the
diagnosis of bovine tripanosomiasis with higher sensitivity and specificity. A protein was
selected via bioinformatics analysis, recombinantly produced, expressed, purified and used in
ELISA padronization. Initially, different concentrations of recombinant protein (1, 10, 100
and 1000 nanograms) were tested, as well as different dilutions of sera pool of positive
animals experimentally infected and negative (1:100, 1:250 e 1:500), and different dilutions
of conjugate anti-IgG marked with peroxidase (1:5000, 1:10000 and 1:20000). After
padronization, the test was performed using samples from bovines experimentally infected
with T. vivax on days 0, 21, 24, 27 and 30 after experimental infection. The highest difference
of optical density among positive and negative animals was observed using 1000 nanograms
of recombinant protein, sera dilution of 1:100 and conjugate dilution of 1:5000. After optical
density analysis, a Receiver Operating Carachteristic (ROC) curve was done and a cut- off of
0,04 was stablished. The test showed accuracy of 98,6%, sensibility of 94,4% and specificity
of 100%. Predicted positive and negative values were respectively 100% e 93,3%. Negative
and positive likelihood ratio were respectively 0,06 e +∞. Standardization showed adequate
with the used amount of recombinant protein of 1000 nanograms, sera dilution of 1:100 and
conjugate dilution of 1:5000. Sensitivity and specificity results obtained using sera of
experimentally infected animals were promising and show the potential of the recombinant
protein for the precise diagnose of bovine tripanosomiasis.
Key-words: Trypanosoma vivax, recombinant protein, diagnosis
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Formas tripomastigotas de T. vivax detectadas pelo exame de Buffy coat.
Aumento de 100x............................................................................................................... 16
Figura 2: Ciclo biológico do T. vivax na mosca Tsé-tsé e nos ruminantes na África........ 17
Figura 3: Mapa do vetor PGE®T....................................................................................... 30
Figura 4: Mapa do vetor pET28a-TEV.............................................................................. 31
Figura 5: Distribuição de proteínas de T. vivax com potenciais epítopos lineares de
célula B, de superfície/secretadas e expressas em tripomastigotas.................................... 36
Figura 6: Proteína hipotética específica de T. vivax (TvY486_0012280) com epítopos
lineares de célula B e com potencial aplicação para o imunodiagnóstico......................... 36
Figura 7: Análise dos produtos de PCR gerados na etapa de clonagem............................ 37
Figura 8: Expressão e purificação da proteína recombinante separada por gel de
poliacrilamida SDS-PAGE 12,5%..................................................................................... 38
Figura 9: Perfil de absorbância do pool de soros de animais aos 30 dias pós-infecção
frente a diferentes concentrações de proteína recombinante TvY486_0012280,
diferentes diluições de soro e diferentes diluições do conjugado...................................... 39
Figura 10: Curva ROC da padronização de ELISA testando a proteína recombinante de
T. vivax TvY486_0012280 para diagnóstico da tripanosomíase bovina.......................... 40
Figura 11: Valores de densidade ótica dos animais ao dia 0 e dias 21, 24, 27 e 30 pós-
infecção.............................................................................................................................. 40
Figura 12: Desempenho do teste ELISA para T. vivax utilizando a proteína
recombinante TvY486_0012280....................................................................................... 41
Figura 13: Razão de verossimilhança entre animais positvos e negativos........................ 41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Valores obtidos com a proteína recombinante purificada TvY486_0012280
para padronização de ELISA............................................................................................ 42
LISTA DE ABREVIATURAS
BCT - Buffy Coat Technique
BSA - Bovine Serum Albumin
DNA - Ácido Desoxirribonucléico
DO - Densidade Ótica
DPI - Dias Pós-Infecção
E - Especificidade
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FN - Falso Negativo
FP - Falso Positivo
GC - Grupo Controle
GI - Grupo Infectado
IC - Intervalo de Confiança
IPTG - Isopropil β-D-1-thiogalactopiranosídeo
IR - Índice de Reatividade
KDa - Kilo Daltons
kg - Quilogramas
LVC - Leishmaniose visceral canina
MHCT - Microhaematocrit Centrifugation technique
M - Molar
mL - Mililitros
mM - Milimolar
ng - Nanogramas
NMWL - Nominal Molecular Weight Limit
PBS - Phosphate Buffered Saline
PG - Picogramas
RIFI - Reação de Imunofluorescência indireta
RNA - Ácido Ribonucléico
ROC - Receiver Operating Characteristic
RPM - Rotações por minuto
RVP - Razão de Verossimilhança Positiva
RVN - Razão de Verossimilhança Negativa
S - Sensibilidade
SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED - Tetramethylethylenediamine
VN - Verdadeiros Negativos
VP - Verdadeiros Positivos
VPN - Valor Preditivo Negativo
VPP - Valor Preditivo Positivo
μL - Microlitros
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 14
2. REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................... 16
2.1 PARASITO Trypanosoma vivax .................................................................................... 16
2.2 A DOENÇA: TRIPANOSOMÍASE BOVINA ............................................................ 18
2.3. DIAGNÓSTICO............................................................................................................ 19
2.3.1 Testes Diretos............................................................................................................. 19
2.3.2 Testes Sorológicos...................................................................................................... 21
2.3.3 Testes Moleculares .................................................................................................... 22
2.4 PROTEÍNAS RECOMBINANTES............................................................................... 23
3. OBJETIVOS.................................................................................................................... 26
3.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................................... 26
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................... 26
4. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 27
4.1 PRODUÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE DE T. vivax................................... 27
4.1.1 Obtenção dos dados de proteínas do parasito T. vivax........................................... 27
4.1.2 Predição de epítopos lineares de célula B................................................................ 27
4.1.3 Predição de proteínas de superfície/secretadas....................................................... 28
4.1.4 Identificação de proteínas altamente expresas em formas tripomastigotas
sanguíneas............................................................................................................................ 28
4.1.5 Extração de DNA e desenho dos iniciadores (primers) ......................................... 28
4.1.6 Amplificação e purificação da região codificadora................................................. 29
4.1.7 Clonagem dos genes purificados no vetor pET28a-TEV....................................... 29
4.2 EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE..................................................... 32
4.3 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE................................................. 32
4.4 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE............................. 33
4.5 ENSAIO E DOSAGEM DE PROTEÍNAS.................................................................... 33
4.6 BANCO DE SOROS .................................................................................................... 33
4.7 PADRONIZAÇÃO DO TESTE IMUNOENZIMÁTICO ELISA................................. 34
5. RESULTADOS............................................................................................................... 36
5.1 IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ANTIGÊNICAS, PREDIÇÃO DE EPÍTOPOS
E SELEÇÃO DE ALVOS.................................................................................................... 36
5.2 CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA
RECOMBINANTE (TvY486_0012280) EM E. coli BL-21 ARCTIC EXPRESS
(DE3)..................................................................................................................................... 37
5.3 EXPRESSÃO DE PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE DE T.
vivax (TvY486_0012280) EM E. coli BL-21 ARCTIC EXPRESS (DE3) E
PURIFICAÇÃO EM COLUNA CROMATOGRÁFICA His-Tag SEGUIDO DE GEL
FILTRAÇÃO EM COLUNA TM-200................................................................................
38
5.4 PADRONIZAÇÃO DO TESTE IMUNOENZIMÁTICO ELISA................................. 38
6. DISCUSSÃO.................................................................................................................... 43
7. CONCLUSÕES............................................................................................................... 47
8. PERSPECTIVAS FUTURAS........................................................................................ 48
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 49
ANEXO A – CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA ANIMAL (UNIUBE).......... 56
ANEXO B – COMPROVANTE DE DEPÓSITO DE PATENTE................................. 57
14
1 INTRODUÇÃO
A tripanosomíase é uma enfermidade causada pelo Trypanosoma (Dutonella) vivax
(Ziemann, 1905), um protozoário hemoflagelado de grande importância e responsável pela
doença em espécies de ungulados silvestres e domésticos, principalmente bovinos na África e
América Latina (OSÓRIO et al., 2008). Na América Latina, a transmissão ocorre por vetores
mecânicos como dípteros sugadores de sangue das famílias Tabanidae (Tabanus spp.),
Stomoxidinae (Stomoxys spp.) e Hippoboscidae (Hippobosca spp.), além de transmissão por
fômites como agulhas (HOARE, 1972; SERRA-FREIRE e REZENDE, 1988; GARDINER,
1989; SILVA et al., 2002; PAIVA, 2009).
Estudos envolvendo o T. vivax têm sido de grande interesse para o Brasil, devido ao
impacto negativo que o parasito tem provocado sobre a pecuária, gerando grandes perdas
econômicas devido à morte de cerca de três milhões de bovinos anualmente tanto nos países
africanos quanto nos países da América do Sul (SEKONI, 1994). Em animais subclínicos, o
impacto econômico também é significativo devido à diminuição da produção de carne, leite e
derivados, resultando em perda de aproximadamente cinco milhões de dólares/ano (OSÓRIO
et al., 2008; CUGLOVICCI et al., 2010).
A doença pode ocasionar em ruminantes infecções agudas, as quais podem resultar em
alterações hematológicas severas como leucopenia e anemia, além de sinais clínicos como
lacrimejamento, perda de escore corporal, fraqueza progressiva, conjuntivite, febre, letargia,
queda na produção de leite e carne, agalaxia e alterações na reprodução como abortos,
repetições de cio, nascimentos de crias fracas, anestro temporário ou permanente, e
eventualmente morte (GUERREIRO, 2005; OSÓRIO et al., 2008; BEZERRA et al., 2008;
CARVALHO et al., 2008; SILVA et al., 2009).
O diagnóstico consiste em exames diretos empregando as técnicas de
microhematócrito (WOO, 1970), buffy coat (MURRAY, 1977) com confirmação da presença
das formas tripomastigotas de T. vivax em esfregaços sanguíneos ou por meio de técnicas
moleculares (PCR) para a detecção de DNA de T. vivax (VENTURA et al., 2001;
DESQUESNES; DÁVILA, 2002), além de exames indiretos como testes sorológicos (ELISA,
RIFI) para pesquisa de anticorpos anti-T. vivax (MADRUGA et al., 2006, AQUINO et al.,
2010).
Como a ocorrência da doença crônica em bovinos no Brasil é considerada
assintomática, a detecção de tripomastigotas pelos métodos parasitológicos citados
anteriormente é dificultada (VENTURA et al., 2001). Por isso, a triagem sorológica e a
titulação de anticorpos fornecem informações úteis e complementares aos métodos
15
parasitológicos, além de avaliar com maior sensibilidade o estado dos rebanhos e os efeitos da
infecção sobre a saúde animal, a produtividade e o risco de doença (MATTIOLI; FAYE;
JAITNER, 2001). Dentre as dificuldades nos testes sorológicos está a obtenção dos antígenos
utilizados por exemplo na RIFI, visto que quase sempre, são antígenos brutos obtidos a partir
de sangue de ovinos experimentalmente infectados, o que promove baixa especificidade dos
testes devido a reações cruzadas com debris de hemácias, plaquetas e leucócitos presentes
(EISLER et al., 1998, REBESKI et al., 1999, SILVA et al., 2002, MAGONA et al., 2003,
PILLAY et al., 2013). Desta forma, a busca de novos antígenos do parasito, como por
exemplo, proteínas recombinantes, para serem utilizadas como antígeno em testes
diagnósticos mais específicos e sensíveis, faz-se necessário.
Neste contexto, o presente trabalho objetivou utilizar a proteína recombinante de T.
vivax identificada por meio de análise de bioinformática com potencial para uso em teste
diagnóstico sorológico, como antígeno na padronização de um novo teste imunoenzimático do
tipo ELISA. O desenvolvimento de um teste imunoenzimático de fácil execução, e
principalmente com elevada acurácia, irá contribuir na melhoria do diagnóstico da
tripanosomíase bovina e consequentemente, no controle e prevenção da doença em áreas
endêmicas.
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 PARASITO Trypanosoma vivax
O parasito T. vivax, descrito por Zieman (1905), pertence à secção salivaria, família
Trypanosomatidae que inclui tripanosomatídeos transmitidos pela saliva de moscas
contaminada com o parasito, (HOARE, 1972; STEPHEN, 1986) e ao subgênero Dutonella,
pois faz a transmissão do tipo inoculativa, ou seja, a transmissão ocorre pelas glândulas
salivares dos vetores. Nos vertebrados multiplica-se assexuadamente por fissão binária de
forma contínua como tripomastigotas (SILVA et al., 2002).
T. vivax trata-se de um protozoário pleomórfico, e as formas circulantes,
tripomastigotas, possuem forma lancetada com corpo alongado e achatado com extremidades
afiladas e um cinetoplasto grande pós-nuclear, que por ser maior comparado a outras espécies
torna-se uma característica marcante deste protozoário, sendo importante para diagnóstico,
facilitando a identificação em esfregaços de sangue periférico (HOARE, 1972). Como
organelas principais e identificáveis ao microscópio há ainda o núcleo, corpo basal e flagelo
livre, que está sempre presente (Figura 1) (DÁVILA et al., 1997; SILVA et al., 2002;
OSÓRIO et al., 2008). Ainda segundo Silva et al., (2002), é característica da movimentação
do parasito avançar-se pela extremidade anterior.
Figura 1: Formas tripomastigotas de T. vivax (setas), detectadas pelo
exame parasitológico (Buffy coat). Aumento de 100x. Coloração: Panótico Rápido.
Fonte: Arquivo pessoal, (2016).
μm
17
Foi introduzido nas Américas possivelmente durante o século XIX (LEVINE, 1973),
sendo o primeiro relato no Brasil nos anos 70 em búfalos do estado do Pará (SHAW;
LAINSON, 1972). A incidência de T. vivax no Brasil aumenta, corroborada pela falta de
conhecimento da enfermidade pelos proprietários e profissionais da área, além da falta de
controle e escassez de serviços de diagnóstico especializado (SILVA et al., 2004).
O ciclo biológico do T. vivax envolve um hospedeiro invertebrado (vetor), a mosca do
gênero Glossina spp. (Figura 2), ou vetor mecânico, e um hospedeiro vertebrado que
geralmente são os mamíferos ungulados (OSÓRIO et al., 2008). A espécie Glossina spp,
conhecida como mosca tsé-tsé estão restritas somente na África tropical e são responsáveis
pela forma cíclica de transmissão (MATTIOLI; WILSON, 1996).
Figura 2: Ciclo biológico do T. vivax na mosca Tsé-tsé e nos ruminantes na África.
Fonte: Baral, 2010 adaptado por Bassi, 2014.
A transmissão mecânica na África também pode ocorrer por outros dípteros sugadores
de sangue (HOARE, 1972; OSÓRIO et al., 2008), sendo associada à presença de T. vivax em
regiões onde não existe a mosca tsé-tsé. Por outro lado, na América Latina a transmissão é
estritamente mecânica, ou seja, os parasitos são transmitidos por hospedeiros invertebrados,
principalmente por moscas hematófagas dos gêneros Tabanus spp. (mutuca) e Stomoxys spp.
(mosca dos estábulos), sem que ocorra desenvolvimento cíclico nestes insetos (SILVA et al.,
2002; DESQUESNES, 2004). A transmissão mecânica envolve ainda uso de fômites
contaminados com sangue contendo o parasito, principalmente agulhas, usadas muitas vezes
para aplicação de medicamentos em vários animais, sem que haja troca. Destaca-se a
18
aplicação de ocitocina em bovinos de aptidão leiteira anteriormente à ordenha para facilitar a
descida de leite (HOARE, 1972; GARDINER, 1989; SILVA et al., 2002; CUGLOVICCI et
al., 2010).
É importante ressaltar que os tripanosomas têm mecanismos para evadir a resposta
imune do hospedeiro. Uma das características antigênicas dos tripanosomas é a presença das
glicoproteínas de superfície (VSGs), que cobrem praticamente toda a membrana e é o
antígeno de superfície predominante, que sofre mudanças antigênicas contínuas. Esta variação
é um dos mecanismos adaptativos exibidos pelos tripanosomas, que provavelmente protege os
parasitos da morte mediada pelo complemento e promove escape dos tripanosomas da
resposta imune do hospedeiro (BARAL, 2010).
O parasito tem a capacidade de alterar a expressão de uma VSG para outra, resultando
em mutação antigênica, o que faz com que a resposta de anticorpos do hospedeiro contra os
tripanosomas seja evitada ou nula em alguns casos. As VSGs são novamente reconhecidas
pela resposta imune, e tal mecanismo de escape acaba por provocar oscilações de alta e baixa
parasitemia, sendo considerado o principal mecanismo que impede a eliminação do parasito,
estabelecendo uma infecção crônica (BARAL, 2010). Além disso, estes parasitos são capazes
de internalizar os anticorpos que se ligaram à sua superfície (HILL et al., 2005).
2.2 A DOENÇA: TRIPANOSOMÍASE BOVINA
Trabalhos realizados no Brasil mostraram que a tripanosomíase bovina já é presente
nas regiões Sul (SILVA et al., 2009), Sudeste (CARVALHO et al., 2008; CUGLOVICI et al.,
2010; CADIOLI et al., 2012), Centro-oeste (SILVA et al., 1999; SILVA et al., 2004),
Nordeste (BATISTA et al., 2008; PIMENTEL et al., 2012) e Norte (LINHARES et al., 2006).
Pode ocasionar infecções agudas e crônicas, culminando em alterações hematológicas
severas, perda de condição corporal, queda da produtividade (OZÓRIO et al., 2008, SILVA et
al., 2009), alterações na reprodução. Sinais clínicos como lacrimejamento, anemia, perda de
peso, fraqueza progressiva (SILVA et al., 2009), conjuntivite (GUERREIRO, 2005), febre,
letargia, diminuição da produção de leite, agalaxia e morte (CARVALHO et al., 2008;
FRANGE, 2013).
Os hospedeiros vertebrados mais comuns nas tripanosomíases causadas por T. vivax
são os bovinos, bubalinos, ovinos e caprinos (GARDINER, 1989). A infecção por T. vivax
pode ser classificada em superaguda, aguda ou crônica. A infecção superaguda caracteriza-se
por parasitemia alta e persistente, levando o animal a óbito rapidamente dentro de três
19
semanas após infecção. Já a infecção aguda caracteriza-se por elevada parasitemia associada à
diminuição dos parâmetros eritrocitários, levando à anemia, podendo durar entre duas
semanas a dois meses após infecção. Na fase crônica, em animais que não morrem, os
parâmetros eritrocitários tendem a aumentar (ou até voltar aos parâmetros fisiológicos) em
torno de seis a oito semanas, porém ainda observa-se recorrência da parasitemia em baixas
concentrações podendo se estender por vários meses ou anos (TAYLOR; AUTHIÉ, 2004).
Estudo retrospectivo feito por Garcia e colaboradores (2016) constatou que a presença
da tripanosomíase ocorre mais em fêmeas comparado a machos, assim como em raças
leiteiras, fato explicado devido ao maior contato desses animais com agulhas compartilhadas
antes da ordenha. Como a relação ordenhador-animal é próxima, a queda na produção desses
animais é notada com maior facilidade.
2.3 DIAGNÓSTICO
O diagnóstico definitivo consiste em exames diretos: técnica microhematócrito (WOO,
1970), buffy coat (MURRAY, 1977) com confirmação da presença das formas
tripomastigotas de T. vivax em esfregaços sanguíneos, em exames indiretos como testes
sorológicos (ELISA, RIFI) para observação da presença de títulos de anticorpos anti-T. vivax
(MADRUGA et al., 2006, AQUINO et al., 2010), ou por meio de técnicas moleculares (PCR)
para a detecção de DNA/RNA de T. vivax (VENTURA et al., 2001, DESQUESNES;
DÁVILA, 2002).
2.3.1 Testes Diretos
Entre os testes parasitológicos, ou diretos, a técnica do microhematócrito (MHCT),
proposta por Woo (1970) é uma das amplamente utilizadas entre os métodos parasitológicos,
sendo um teste de fácil execução, consistindo em observar em microscópio óptico, ao
aumento de 10 vezes a motilidade das formas tripomastigotas entre a camada de leucócitos e a
de plasma, dentro do próprio microtubo hematócrito. Esta técnica permite a detecção de
tripanosomas de seis a dez dias pós-infecção. Porém, pesquisa de T. vivax pela técnica de
Buffy coat (BCT), que consiste em colocar a camada leucocitária do microtubo hematócrito
em esfregaço sanguíneo (MURRAY, 1977), possui vantagens sobre outras técnicas
convencionais utilizados para o diagnóstico da tripanosomíase (DESQUESNES; TRESSE,
1996; MATTIOLI; FAYE; JAITNER, 2001; DELAFOSSE et al., 2006). De acordo com
20
Murray (1977), esta técnica detectou 50% mais casos de infecção por tripanosoma quando
comparadas com a técnica MCHT.
Outra vantagem é a facilidade e rapidez do reconhecimento dos tripanosomas,
tornando os exames mais práticos, especialmente quando se avalia um grande número de
amostras (MURRAY, 1977). Além disso, ainda permite a identificação de outras espécies de
Trypanosoma spp. quando utilizadas técnicas de biometria em conjunto (MAGONA;
WALUBENGO; ODIMIN, 2008). A desvantagem desta metodologia é que as amostras
devem ser analisadas rapidamente, até 8 horas após a colheita, pois após esse tempo a
quantidade de tripomastigotas detectáveis na amostra reduz (GÓMEZ-PIÑERES; TAVARES-
MARQUES; REYNA-BELLO, 2009).
A ocorrência de doença crônica e assintomática em bovinos no Brasil dificulta a
detecção de T. vivax pelos métodos parasitológicos, uma vez que as formas tripomastigotas
não ficam na circulação (VENTURA et al., 2001). Por isso, a triagem sorológica e a titulação
de anticorpos podem ser úteis, fornecendo informações importantes e complementares às
obtidas pelos métodos parasitológicos, além de avaliar com mais sensibilidade o estado dos
rebanhos infectados por T. vivax e considerar os efeitos da infecção sobre a saúde animal e
produtividade (MATTIOLI; FAYE; JAITNER, 2001).
Como também ocorrem flutuações da parasitemia, o encontro de parasitos em
esfregaços sanguíneos em fases crônicas da doença se torna difícil (MURRAY, 1977). No
entanto, ambas as técnicas apresentadas anteriormente têm baixa sensibilidade quando
aplicada durante a fase crônica da doença, e a sensibilidade diminui consideravelmente
quando a parasitemia é inferior a 200 tripomastigotas/mL de sangue (DESQUESNES;
TRESSE, 1996).
A técnica de Buffy-Coat (BCT) é um teste bastante útil para avaliar a parasitemia em
estudos experimentais pela infecção por T. vivax em bovinos (ADAMU et al., 2007) e para
estudos epidemiológicos. Batista et al., (2012) avaliaram 158 vacas leiteiras e diagnosticadas
por BCT em animais de três fazendas, com prevalências de 13,3% a 46,6%, sendo associada
diretamente com as alterações clínicas como febre e diminuição do volume globular,
indicando animais em fase aguda da doença. Magona e colaboradores (2008), realizaram
estudos epidemiológicos utilizando as técnicas BCT e MHCT em conjunto, para avaliar a
positividade do rebanho e identificar as tripomastigotas, pois na África haviam encontrado
tripomastigotas de T. congolense nas amostras de sangue.
21
2.3.2 Testes Sorológicos
As técnicas sorológicas mais utilizadas para a detecção de anticorpos anti-T. vivax,
atualmente são a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e ensaio imunoenzimático
(ELISA). Ambos os testes podem ser utilizados para o diagnóstico de infecção e são úteis
para investigações epidemiológicas, especialmente para a determinação da distribuição de T.
vivax (MADRUGA et al., 2006).
Luckins (1977), avaliou o potencial de um ensaio imunoezimático (ELISA), utilizando
a cepa TREU1223 de T. vivax, para o diagnóstico de tripanosomíase bovina. Os antígenos
utilizados nos experimentos apresentados neste documento foram capazes de diagnosticar
animais com tripanosomíase, mas foram incapazes de distinguir se a infecção era causada por
T. brucei, T. congolense ou T. vivax.
Trabalho realizado por Madruga et al., (2006), descreve um ensaio de ELISA
utilizando um antígeno bruto, da cepa GCTvPPO1-CO a partir de um isolado T. vivax
brasileiro, obtidos através de técnicas de centrifugação e purificação. O teste realizado,
apresentou alta sensibilidade, porém apresentou reação cruzada com animais infectados com
T. evansi. As reações cruzadas eram esperadas neste caso, já que antigenos brutos de
tripanosomas possuem pouca especificidade quanto aos seus subgêneros.
Embora a presença de anticorpos não signifique necessariamente uma infecção ativa,
uma vez que essas moléculas persistem após a recuperação, as correlações positivas entre os
resultados parasitológicos por BCT e a presença sorológica de anticorpos anti-trypanosoma
vivax, tal como avaliado pelos diferentes sistemas de testes sorológicos, têm sido relatadas até
os 90 dias pós infecção (MATTIOLI; FAYE; JAITNER, 2001; DELAFOSSE et al., 2006;
BASSI, 2014).
Dellafosse et al., (2006) estudaram a prevalência em uma região da África sem a
presença do vetor cíclico, e pelo teste de ELISA, observaram que 42,3% dos bovinos eram
positivos para anticorpos anti-T.vivax, mesmo com BCT menor que 2%. A elevada
prevalência mesmo na ausência de tsé-tsé ocorreu devido à transmissão mecânica pela
presença de tabanídeos, e o clima favorável para o aumento da população de tais vetores,
verificando-se alta mortalidade devido à infecção. Também notou-se que o hematócrito nos
animais positivos era significativamente menor que nos não infectados. Foi observado ainda
que as infecções persistentes podem também ocorrer como resultado da utilização
indiscriminada de drogas tripanocidas ou com a subdosagem frequente em animais infectados,
levando a resistência do parasita ao medicamento.
22
Segundo estudos realizados por Cadioli et al., (2012), 98,36% (599/609) das amostras
de soro colhidas de vacas em uma fazenda em Lins-SP, apresentaram títulos positivos para
IgG anti-T. vivax pelo teste de ELISA e menos de 1% foi positivo para o MHCT. Grande
parte dos animais apresentaram sinais clínicos, ocorrendo 31 óbitos. A alta frequência de
anticorpos ocorreu devido à transmissão do hemoparasito por vetores mecânicos, mesmo com
o rebanho em bom estado nutricional. Os animais susceptíveis apresentavam doença grave e
de alta mortalidade.
Em contrapartida, trabalho realizado por Cuglovici et al., (2010) realizou um
levantamento epidemiológico na região de Igarapé-MG, utilizando testes parasitológicos
(MHCT), molecular como reação em cadeia da polimerase (PCR) e sorológico (RIFI). No
teste de RIFI para observar a soroprevalência verificou que, no período de setembro de 2007 a
fevereiro de 2009, houve aumento na soropositividade de 7,4% para 48%, indicando novos
casos no rebanho. Observou-se ainda que de fevereiro a outubro de 2008 a titulação de
anticorpos IgG anti-T. vivax aumentou, sugerindo aumento do caso de infecção ativa.
Entretanto, a maioria dos animais, no final do experimento, apresentaram títulos de anticorpos
mais baixos e MHCT negativo, indicando que os mesmos estavam na fase crônica da
infecção.
A triagem sorológica e a titulação de anticorpos de animais infectados fornecem
informações úteis complementares ao obtido pelos métodos parasitológicos diretos, além de
avaliar o estado de rebanhos infectados por T. vivax e os efeitos da infecção sobre a saúde
animal, a produtividade, dentre outros (MATTIOLI; FAYE; JAITNER, 2001). Os testes
sorológicos RIFI para anticorpos circulantes vêm sendo utilizados, mostrando boa
sensibilidade (AQUINO et al., 2010).
Porém, um dos obstáculos dos testes sorológicos se refere aos antígenos utilizados,
visto que são em sua maior parte antígenos brutos obtidos a partir de sangue de ovinos
experimentalmente infectados, o que promove baixa especificidade dos testes sorológicos
(EISLER, et al., 1998, REBESKI et al., 1999, SILVA et al., 2002, MAGONA et al., 2003,
PILLAY et al., 2013). Portanto, pode-se observar que o desenvolvimento de testes
diagnósticos mais específicos se faz necessário.
2.3.3 Testes Moleculares
Os métodos sorológicos são úteis em estudos epidemiológicos, porém, estes
usualmente não distinguem o curso da infecção, devido à avidez de IgG em infecções recentes
ou progressos nas tripanosomíases, e a sua detecção pela PCR, abre novas perspectivas neste
23
campo (VENTURA et al., 2001). A PCR teve uma considerável contribuição na identificação,
caracterização e diagnóstico molecular de tripanosomas em diversos níveis taxonômicos com
precisão e confiabilidade (DESQUESNES; DÁVILA, 2002). Para a identificação do T. vivax,
são utilizados primers direcionados no gene do mini-exon (spliced leader) e na região
intergênica, com amplificação produto de 210pb (VENTURA et al., 2001).
Embora tenham excelentes resultados, os testes por PCR não são satisfatórios quando
há baixa ou nenhuma parasitemia, além do uso em larga escala seja difícil a campo, uma vez
exige alto custo em laboratórios equipados, pessoal treinado e reagentes adequados (DÁVILA
et al., 2003; OSÓRIO et al., 2008).
2.4 PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Um grande empecilho no que diz respeito ao diagnóstico de diversas doenças está na
presença de reações cruzadas, pois nem sempre é possível ter alta especificidade e
sensibilidade simultaneamente. Nesse contexto, o uso de proteínas recombinantes pode ser
uma alternativa no diagnóstico de doenças endêmicas em testes, como por exemplo, o método
ELISA (TEIXEIRA; VEXENAT, 1996).
O emprego de antígenos quimicamente definidos e específicos do parasito, como
antígenos recombinantes tem sido proposto como uma alternativa aos antígenos naturais para
várias doenças, pois, possuem vantagens no seu uso, uma vez que as proteínas isoladas têm
significativo grau de homogeneidade, minimizam reações cruzadas com antígenos presentes
em parasitos responsáveis por outras doenças infecciosas (PILLAY et al., 2013).
Desde sua descoberta, a produção de proteínas recombinantes revolucionou a ciência
permitindo a obtenção de proteínas purificadas em maior escala, o que facilitou seu uso em
processos industriais ou na fabricação de bens comerciais (ROSANO, CECARELLI, 2014).
Apesar dos desafios encontrados, como obtenção de dados da proteína, identificação
de proteínas de interesse, dentre outros, estratégias eficientes na produção de proteínas
recombinantes têm progredido. Proteínas recombinantes em maiores quantidades e de
qualidade são importantes para o avanço tecnológico, além da obtenção de um produto final
confiável e que também seja de baixo custo (PALOMARES; ESTRADA-MONDACA;
RAMÍREZ, 2004). Algumas das vantagens da produção de proteínas em microorganismos
procariontes incluem crescimento rápido do microorganismo e com isso, alta produção de
proteínas desejadas (FONSECA, 2013).
A produção de proteínas recombinantes envolve a tecnologia do DNA recombinante.
Consiste em escolher um determinado gene de interesse, codificador da proteína de escolha,
24
clivá-lo e inserí-lo, com o auxílio de DNA ligase em um vetor, geralmente um plasmídeo,
molécula dupla de DNA geralmente presente em bactérias, formando assim uma molécula de
DNA recombinante. A molécula de DNA recombinante é então inserida em uma bactéria, que
irá expressar a proteína desejada. A expressão de proteínas através da tecnologia do DNA
recombinante, permite produzir proteínas recombinantes em larga escala. Várias bactérias,
fungos e leveduras podem ser utilizados para a produção de proteínas recombinantes. A
bactéria gram-negativa Escherichia coli foi a primeira a ser utilizada, ainda sendo largamente
escolhida para tal propósito, sendo fácil de ser mantida em meios de cultura acessíveis e
hábeis a produzir maiores quantidades de proteínas (PALOMARES; ESTRADA-
MONDACA; RAMÍREZ, 2004; FERNANDEZ-ROBLEDO; VASTA, 2010; TERPE, 2006;
ROSANO; CECARELLI, 2014).
Em trabalhos que visam o diagnóstico de doenças causadas por protozoários, tais
como leishmaniose, doença de Chagas e tripanosomíase, o uso de proteínas recombinantes é
de grande valia, podendo mostrar bons resultados. Grande parte dos genes dos protozoários
permanece desconhecida. Com isso, há o impedimento do conhecimento de parte dos seus
produtos, peça fundamental para que sejam desenvolvidos testes diagnósticos e mesmo
vacinas (FERNANDEZ-ROBLEDO; VASTA, 2010; ROSANO, CECARELLI, 2014).
Trabalho realizado por Fonseca (2013) testou duas proteínas recombinantes para uso
em diagnóstico da leishmaniose visceral canina em teste ELISA, obtendo com uma das
proteínas especificidade de 90% e em outra sensibilidade de 100% quando testadas com soros
caninos. Ao testar soros de pacientes positivos para doença de Chagas, utilizando ensaio
enzimático com proteínas recombinantes, Pastini et al., (1994) obteve bom diagnóstico de
doença de Chagas, havendo apenas reação cruzada com soros de pacientes que tinham
Leishmaniose visceral, e mostrando concordância com outros tipos de testes, o que indicou
boa purificação, servindo de auxílio para diagnóstico confirmatório de Chagas. Por outro lado,
Lanna (2015), ao testar proteínas de Trypanosoma cruzi para diagnóstico da doença de
Chagas observou que apesar de ter selecionado proteínas não presentes no proteoma de
espécies de Leishmania spp., houve reatividade cruzada, provavelmente causada por
peptídeos ortólogos entre os dois microorganismos, presentes na proteína, o que enaltece a
importância de alvos mais específicos que mantenham alta sensibilidade e especificidade.
A predição e caracterização de epítopos de células B, é um importante processo no que
diz respeito a produção de vacinas, desenvolvimento de testes diagnósticos e produção de
anticorpos. Com a crescente demanda para descoberta de epítopos, uma alternativa tem sido a
predição por técnicas computacionais, que oferecem rapidez, bom custo e eficácia na predição
25
de epítopos de células B com foco na investigação da interação antígeno-anticorpo (EL-
MANZALAWY; HONAVAR, 2010).
Estudos com predição de epítopos de célula B têm mostrado bons resultados e
potencial para uso diagnóstico, por exemplo, em doença de Chagas (MENDES et al., 2013).
Estudos com proteínas recombinantes utilizando peptídeo contendo epítopo de célula B feito
por Menezes-Souza e colaboradores (2015) mostraram boa sensibilidade, especificidade e
acurácia para diagnóstico da Leishmaniose visceral humana, mostrando-se bom para
diagnóstico da doença, além de dispensar a manipulação do parasita, procedimento requerido
em outros métodos de diagnóstico e que oferecem risco de infecção.
Não existem trabalhos na literatura descrevendo o uso de proteínas recombinantes para
diagnóstico da tripanosomíase bovina. Por este motivo, a identificação de alvos e validação de
suas respectivas proteínas recombinantes para utilização no diagnóstico da tripanosomíase
bovina, é de grande valia, aumentando a sensibilidade e a especificidade no diagnóstico de
animais infectados e assintomáticos e procurando desenvolver testes que sejam rápidos e de
baixo custo.
26
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Obter proteína recombinante do parasito T. vivax e desenvolver um teste
imunodiagnóstico do tipo ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) para o diagnóstico
da tripanosomíase bovina.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter proteína de T. vivax previamente predita e selecionada por meio de
imunoinformática, que apresentam em sua sequência de aminoácidos epítopos lineares de
linfócitos B;
Clonar, expressar e purificar a proteína recombinante de T. vivax;
Padronizar o ensaio ELISA indireto;
Avaliar o desempenho da ELISA empregando a proteína recombinante para identificar
animais experimentalmente infectados na fase crônica da doença.
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 PRODUÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE DE T. vivax:
As etapas referentes a obtenção da proteína recombinante de T. vivax foram
desenvolvidas no laboratório de bioinformática da UFMG pelo pesquisador Dr. Tiago
Antônio de Oliveira Mendes e estão apresentadas nos itens 4.1.1 a 4.1.7. Após essas estapas a
proteína foi expressa, purificada e utilizada na padronização do teste imunoenzimático
ELISA.
4.1.1 Obtenção dos dados de proteínas do parasito T. vivax
Sequências de proteínas preditas com base no genoma previamente sequenciado da
cepa Y486 de T. vivax contendo 11.885 proteínas foi obtida do banco de dados TritrypDB
versão 8.1 (ASLETT et al., 2010). Sequências de baixa qualidade, consideradas como
sequências protéicas com menos de 100 aminoácidos, contendo códon de parada interno ou
aminoácidos fora do padrão IUPAC foram removidas de ambos os conjuntos de dados
(MENDES et al., 2013). Um total de 10.750 (90,45% do proteoma) foram considerados de
alta qualidade.
4.1.2 Predição de epítopos lineares de célula B
Epítopos foram preditos para a proteína de T. vivax recuperada do banco de dados
TritrypDB versão 8.1 (ASLETT et al., 2010). Todos os epítopos foram identificados
utilizando uma abordagem conservativa para minimizar a seleção de epítopos falso-positivos.
Inicialmente, epítopos lineares de célula B foram preditos utilizando o programa BepiPred
versão 1.0 (LARSEN; LUND; NIELSEN, 2006) com valor de corte acima de 1,3. Este
programa atribui a cada aminoácido da sequência uma pontuação de predição que se
correlaciona positivamente com a probabilidade daquele aminoácido participar de um epitopo
linear de célula B. O valor de corte definido fornece 96% de especificidade e 13% de
sensibilidade (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/output.php). Regiões de desordem
foram preditas utilizando o programa IUPred (DOSZTÁNYI; CSIZMÓk et al., 2005)
utilizando ajustes padrões. Um total de 5590 (52% das proteínas de alta qualidade)
apresentam pelo menos um potencial epítopo linear de célula B.
28
4.1.3 Predição de proteínas de superfície/secretadas
Foram utilizados três programas para identificar potenciais proteínas da espécie de T.
vivax que são secretadas/excretada e/ou de superfície: SignalP 4.1 (PETERSEN et al., 2011),
TMHMM 2.0 (SONNHAMMER et al., 1998) e GPI-SOM (FANKHAUSER; MÄSER, 2005),
ambos com parâmetros padrões. SignalP é um programa que utiliza uma combinação de
diferentes redes neurais artificiais para predizer presença do peptídeo sinal na região amino
terminal e localização de sítio de clivagem do peptídeo sinal que medeia a translocação de
uma proteína do citoplasma para a membrana retículo endoplasmático, principal mecanismo
de exportação em eucariotos. O programa TMHMM identifica potenciais hélices
transmembrana em sequências proteicas utilizando um modelo oculto de Markov. GPI-SOM
utiliza abordagem de mapa auto-organizado de Kohonen (SOM) para predizer peptídeo sinal
na região carboxi-terminal de ligação ao glicosil-fosfatidil-inositol (GPI).
4.1.4 Identificação de proteínas altamente expresas em formas tripomastigotas
sanguíneas
Expressão de RNA mensageiro de formas tripomastigotas sanguíneas de T. vivax
foram recuperadas de Greif et al., (2013). Os 10% dos genes codificadores de proteínas
(1188) com maiores níveis de transcritos foram consideradas genes altamente expressos em
formas tripomastigotas sanguíneas.
4.1.5 Extração de DNA e desenho dos iniciadores (primers)
Formas tripomastigotas sanguíneas de Trypanosoma vivax foram utilizadas para
extração de DNA total para ser utilizado como template em reação de PCR para obter a região
codificadora dos genes de interesse a serem clonados em vetores para expressão heteróloga
das proteínas correspondentes. Nesta etapa, a extração de DNA total foi realizada utilizando
1x108 tripomastigotas e o kit “Genomic DNA from tissue” (Macherey-Nagel, Duren,
Germany) de acordo com as recomendações do fabricante. Os iniciadores foram desenhados
utilizando o software Gene Oligo Explorer (versão 1.5, 2010) e de forma a amplificar toda a
região codificadora. Nestes iniciadores foram adicionados sítios para enzimas de restrição nas
extremidades 5’ dos iniciadores para facilitar a transferência dos amplicons do vetor de
clonagem pGEM®-T (Promega, Madison, USA) para os vetores de expressão pET28a-TEV.
29
4.1.6 Amplificação e purificação da região codificadora
A amplificação da região codificadora referente às sequências de proteínas expressas em E.
coli foi realizada utilizando 100 nanogramas (ng) de DNA, 2 picogramas dos iniciadores
(Primer F: 5'-GCTAGCATGTGCATCTACGTCAACTC-3'; Primer R: 5'-
AAGCTTTCAGAAGGCGGAGGAAATAA-3') e a enzima “Platinum® Taq DNA
Polymerase High Fidelity” (Invitrogen, São Paulo, Brasil), perfazendo um volume final de 50
µL e utilizando os reagentes e as condições de termociclagem recomendados pelo fabricante.
Em seguida, ao sistema de amplificação obtido, foi adicionado o tampão de amostra “6x DNA
Loading Dye” (Thermo Scientific, Wilmington, EUA) e em seguida submetido à separação
em gel de agarose 1% a 100-120 volts em tampão TAE 1X, contendo 0,3 μg/μL de brometo
de etídio (Bio-Rad, Hercules, EUA). Após a separação em gel de agarose, as bandas de
tamanho esperado foram excisadas, utilizando uma lâmina de bisturi e o bloco de agarose
obtido foi submetido à purificação do DNA amplificado utilizando o kit “IllustraTM GFXTM
PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (GE Healthcare, Piscataway, EUA) para obtenção
do DNA purificado. As amostras de DNA purificadas foram dosadas utilizando o
equipamento “Nanodrop N2000” (Thermo Scientific, Waltham, EUA).
4.1.7 Clonagem dos genes purificados no vetor pET28a-TEV
Os amplicons purificados na etapa de amplificação e purificação foram inicialmente
inseridos no vetor de clonagem “p-GEM-T Vector Systems” (Figura 3) (Promega, Madison,
EUA). O plasmídeo utilizado continha uma 3`-Timina terminal em ambas as fitas de DNA
plasmidial no qual se liga a 3`-Adenina do amplicon introduzida pela Taq polimerase durante
a reação de PCR. Esse plasmídeo contém um gene de resistência à ampicilina e β-
galactosidase, além de sítios para enzimas de restrição. Para cada reação de ligação, foi
preparado um mix contendo 5 μL de “2X Rapid Ligation Buffer”, 1 μL de “p-GEM-T Easy
Vector” e 1 μL de “T4 DNA Ligase” e adicionado em um tubo de 0,2 mL contendo 3 μL de
produto de PCR purificado. Após ser homogeneizado, o tubo foi incubado à temperatura de
4ºC por 16 horas para ocorrer a reação de ligação e posteriormente armazenado em freezer a -
20ºC.
30
Figura 3: Mapa do vetor PGE®T
Na etapa de transformação, 5 μL do produto de ligação foi adicionado a 50 μL de
células competentes XL1-Blue (Phoneutria, Belo Horizonte, Brasil) previamente armazenadas
a -80ºC. Em seguida as amostras foram transferidas para cubetas de eletroporação
MicroPulser (Bio-Rad, Hercules, EUA) de 0,1 cm, e submetidas a um pulso de 2,50 kV no
equipamento de eletroporação MicroPulser (Bio-Rad, Hercules, EUA). Após a eletroporação,
foram adicionados 250 μL do meio de cultura 2xYT líquido, seguido por incubação durante
uma hora a 37ºC sob agitação em shaker a 200 rpm. Após este período, as amostras foram
plaqueadas em meio sólido 2xYT-ágar 1,5% contendo 50 μg/mL de ampicilina (EMS, São
Paulo, Brasil), 1 mM de IPTG e 50 μg/mL X-gal (Invitrogen, São Paulo, Brasil) e distribuídas
uniformemente pela placa utilizando uma alça de Drigalski. As placas foram incubadas
overnight a 37ºC e a visualização de colônias isoladas brancas indicou células recombinantes
que apresentaram o plasmídeo com o amplicon inserido. Estas colônias foram submetidas à
reação de PCR utilizando 2 picogramas (pg) de iniciadores específicos para a região M13 do
vetor e a “Taq DNA Polimerase” (Phoneutria, Belo Horizonte, Brasil), para confirmar a
presença do amplicon no sítio de clonagem, de acordo com recomendações do fabricante.
As colônias positivas foram então adicionadas a 3 mL de meio de cultura 2xYT
líquido contendo 50 μg/mL de ampicilina (EMS, São Paulo, Brasil) e incubadas overnight a
37ºC sob agitação em shaker a 200 rpm. A partir desta cultura foi realizada a extração do
DNA plasmidial utilizando o kit “Illustra Plasmid Mini Spin” (GE Healthcare, Piscataway,
EUA). Os plasmídeos contendo os insertos, assim como o vetor de expressão pET28a-TEV
(Figura 4) foram submetidos a dupla digestão com enzimas de restrição específicas (Thermo
31
Scientific, Waltham, EUA) de acordo com recomendações do fabricante. Em seguida, as
amostras digeridas foram submetidas à separação em gel de agarose, purificadas e dosadas.
Os insertos e o pET28a-TEV digeridos foram ligados utilizando a enzima “T4 DNA Ligase”
(Thermo Scientific, Waltham, EUA) de acordo com recomendações do fabricante. Na etapa
de transformação, 5 μL do produto de ligação foi adicionado a 50 μL de células competentes
E. coli Arctic Express (DE3) (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA), previamente
armazenadas a -80ºC. Em seguida, as amostras foram transferidas para “MicroPulser
Electroporation Cuvettes” (Bio-Rad, Hercules, EUA) de 0,1 cm, e submetidas a um pulso de
2,50 kV no equipamento “MicroPulser™ Electroporation Apparatus” (Bio-Rad, Hercules,
EUA). Após a eletroporação, foram adicionados 200 μL do meio de cultura 2xYT líquido a
cubeta, transferido para tubos de 1,5 mL e incubado durante uma hora a 37ºC sob agitação em
shaker a 200 rpm. Após este período, as amostras foram plaqueadas em meio sólido 2xYT-
ágar 1,5% contendo 50 μg/mL de Kanamicina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) e 20
μg/mL de Gentamicina (Neoquímica, Anápolis, Brasil). Estas colônias foram submetidas à
reação de PCR utilizando 2 pg de iniciadores específicos para a região T7 do vetor e a “Taq
DNA Polimerase” (Phoneutria, Belo Horizonte, Brasil) para confirmar a presença do
amplicon no sítio de clonagem, de acordo com recomendações do fabricante. Os clones
derivados da clonagem do gene foram sequenciados para confirmação da identidade do gene
clonado e verificação da correta fase de leitura.
Figura 4: Mapa do vetor pET28a-TEV
32
4.2 EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE
Para indução da expressão das proteínas recombinantes, colônias de bactérias isoladas
em cada sistema de clonagem foram inoculadas em dois Erlenmeyers de 100 mL cada
contendo 50 mL de meio de cultura 2xYT (Triptona/Peptona + Extrato de Levedura + NaCl +
Kanamicina 50 µg/mL e Gentamicina 20 µg/) e incubadas overnight a 37 °C sob agitação a
200 RPM em estufa. Em seguida, as 25 mL das culturas foram inoculadas em cada um dos
quatro Erlemeyer de 2000 mL contendo 500 mL de meio 2xYT e cultivadas até a densidade
ótica (DO600) de 0,6-0,8 a 30 °C, sob agitação, a 200 RPM, por três horas. Após atingir a DO
desejada, a expressão foi induzida com a adição de 0,1mM de Isopropil β-D-1-
thiogalactopiranosídeo (IPTG) (Invitrogen, São Paulo, Brasil) por 24 horas a 12 °C sob
agitação a 200 RPM. Após o período de indução, a cultura foi centrifugada por 7000 RPM,
por 40 minutos a 4ºC, na centrífuga “5804R” (Eppendorf®, Hamburg, Alemanha) e o
sobrenadante desprezado. Em seguida, os pellets foram armazenados a -80 °C. Alíquotas de 1
mL da cultura imediatamente antes da adição de IPTG, e após o período de indução da
expressão, foram também coletados em microtubos e centrifugadas por 5 minutos a 8.000
RPM e armazenado a -20ºC, para serem utilizadas como controle de expressão.
4.3 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE
O pellet contendo a cultura após a etapa de expressão foi ressuspendido em 100 mL de
PBS (Na2HPO4 + NaHPO4 + NaCl, pH 7,4) contendo 30 mM de Imizadol e lisozima 100
µg/mL (Sigma-Aldrich®, Saint Louis, EUA) e incubado por 30 min em gelo. Em seguida, o
extrato foi lisado no homogeneizador EmulsiFlex-C3 (Avestin®, Mannheim, Alemanha) após
cinco ciclos de homogeneização conforme recomendado pelo fabricante do equipamento. Em
seguida a amostra foi centrifugada por 5000 RPM por 30 min a 4 °C, o sobrenadante coletado
(fração solúvel) foi filtrado em filtro 0,45 µm, e as proteínas recombinantes foram purificadas
por cromatografia de afinidade no sistema “ÄKTAprime plus” (GE Healthcare®, Piscataway,
EUA). Nesta etapa a fração sobrenadante foi aplicada em uma coluna “HisTrap HP” de cinco
mL (GE Healthcare®, Piscataway, EUA). A coluna foi previamente lavada utilizando cinco
vezes o seu volume com o tampão A (PBS contendo imidazol 30 mM). A eluição foi realizada
através da adição do tampão B (PBS contendo imidazol 500 mM). Em seguida, as frações
eluídas contendo a proteína recombinante foram concentradas na coluna Amicon® ultra 15
33
Centrifugal Filters 10,000 NMWL (Millipore®, Darmstadt, Alemanha) e purificadas na coluna
de gel filtração SuperdexTM 200 (GE Healthcare®, Piscataway, EUA).
4.4 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE
Todas as frações obtidas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida
SDS-PAGE 12.5%. As amostras obtidas nos ensaios de expressão e purificação foram
submetidas à separação por eletroforese em gel de poliacrilamida, utilizando Bis-acrilamida
40%. O gel de separação 12,5% foi preparado utilizando tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, SDS
0,01%, persulfato de amônio 0,5% v/v e TEMED 0,05% v/v. O gel de concentração foi
preparado de modo semelhante ao de separação, mas utilizando o tampão Tris-HCl 1,5 M pH
6,8. As amostras obtidas da indução e teste de solubilidade foram adicionadas tampão de
amostra (SDS 10%, Tris-HCl 0,5 mM pH 6,8, azul de Bromofenol 1%, 2-β-mercaptoetanol
5% e glicerol 10%), pré-aquecidas a 100oC durante 10 minutos para desnaturação das
proteínas e posteriormente aplicadas no gel para separação eletroforética. A eletroforese foi
realizada em aparelho Mini Protean II Biorad®
, utilizando tampão de corrida (Tris-HCl 25
mM, glicina 192 mM, SDS 0,1% e pH 8,3) sob à voltagem constante de 120 volts. Após a
corrida, os géis foram corados por incubação por 12-16 horas com a solução de Coomassie
Blue (Coomassie Brilhant Blue G-250 0,25%, metanol 50% e ácido acético 10%) a
temperatura ambiente e em seguida descorados por uma hora em solução etanol 30% e ácido
acético 10% a temperatura ambiente.
4.5 ENSAIO E DOSAGEM DE PROTEÍNAS
As amostras de proteína recombinante purificadas foram dosadas pelo método
colorimétrico do Ácido Bicinconínico (BCA) utilizando o kit “BCA Protein Assay Reagent”
(Thermo Scientific®, Waltham, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante e a
leitura realizada em aparelho Versamax (Molecular Devices®, Sunnyvale, EUA) com
comprimento de onda de 562 nm.
4.6 BANCO DE SOROS
As amostras de soros foram obtidas de um banco de soro mantido aliquotados e
armazenados a -20 ºC pelo curso de Veterinária da Universidade de Uberaba (PAPE2013/17 e
CVZ - APQ-01660-13 FAPEMIG). Os soros eram provenientes de 10 bovinos machos, com
34
idade entre 12 e 18 meses e peso variando entre 180 a 200 kg, negativos para T. vivax em
quatro testes parasitológicos consecutivos (direto, MHCT e BCT), RIFI e PCR. Os animais
foram divididos aleatoriamente em dois grupos, sendo grupo experimentalmente infectado
(GI) por via sub cutânea e intra muscular com sangue de ovino contendo 2x106
tripomastigotas de T. vivax/mL de sangue (n=5) e o grupo não infectado (GC), inoculado por
via subcutânea e intramuscular com 2 mL de solução fisiológica estéril (n=5), (protocolo de
aprovação CEEA 001/2013 – Anexo A) (protocolo de aprovação CEEA 001/2013 – Anexo
A).
Os soros utilizados para a padronização do teste ELISA eram dos animais pertencentes
ao GI colhidos aos 0 (4 amostras), 21, 24, 27 e 30 (19 amostras), dias após infecção (DPI), e
apresentavam títulos de anticorpos IgG anti T. vivax na RIFI respectivamente de: 0 (0 – 0) 160
– 1280 (576 ± 461), 80 a 640 (464 ± 255,5), 160 a 2560 (992 ± 975,9) e 80 a 10240 (2480 ±
4364,2).
4.7 PADRONIZAÇÃO DO TESTE IMUNOENZIMÁTICO ELISA
Para a padronização do teste, foram utilizadas placas de ELISA 96 poços (Nalge Nunc
Intl®, Penfield, EUA), diferentes concentrações da proteína recombinante (1, 10, 100 e
1000ng), diluições de soros positivos (pool de amostras de soros dos animais infectados
experimentalmente com elevado titulo de IgG na RIFI – 30o DPI) e negativos (pool de
amostras de soros dos animais não infectados (dia zero) (1:100, 1:250 e 1:500) e de conjugado
anti-IgG marcado com peroxidase (Sigma-Aldrich®, Saint Louis, EUA) (1:5000, 1:10000 e
1:20000).
Para a sensibilização da placa, 100uL/poco da proteína recombinante diluída em
coating buffer (Na2CO3 0,16%, NaHCO3 0,24% e pH 9,6) foram pipetados. Após incubação
por 12-16 horas a 8ºC, a placa foi lavada uma vez com solução de lavagem (PBS + tween
0,05%) e bloqueada com 200 µL/poço de PBS acrescido de 1,0% de BSA (Invitrogen, São
Paulo, Brasil) durante uma hora a 37 ºC. Posteriormente, a placa foi lavada uma vez com
solução de lavagem, 100 µL do pool de soros postivios e negativos diluídos em PBS com 1%
de BSA foram adicionados e incubados a 37ºC por uma hora. Decorrido o tempo, a placa foi
lavada três vezes com solução de lavagem e 100 µL do anticorpo anti-IgG bovino marcado
com peroxidase e diluído em PBS-tween BSA 1% foram adicionados e incubados a 37 ºC por
uma hora. Apos lavagem da placa por três vezes com a solução de lavagem adicionou-se 100
µL da solução reveladora (Ácido cítrico 0,1M, Na2PO4 0,2 M, TMB 0,05% e H2O2 0,1%). Em
seguida a placa foi incubada a 37 ºC ao abrigo de luz por 15 minutos. A reação foi
35
interrompida pela adição de 50 µL de H2SO4 2M e a absorbância foi obtida em leitor de
ELISA a 450 nm no leitor de ELISA Versamax (Molecular Devices®, Sunnyvale, EUA).
Após a padronização da concentração da proteína recombinante, diluições do soro e
conjugado, amostras de soros dos animais experimentais dos dias zero, 21, 24, 27 e 30 DPI
foram testados individualmente, em duplicata, e os resultados expressos em densidade ótica.
Para a determinação do ponto de corte (cut-off), utilizou-se a curva ROC (Receiver Operating
Characteristic), uma ferramenta estatística que permite separar os positivos dos negativos. A
área sob a curva (ASC) também foi obtida objetivando avaliar a acurácia do teste, sendo
classificada em baixa (0,51-0,61), média (0,62-0,81) e alta (0,82-0,99). Essas análises foram
realizadas com auxílio do programa MedCalc 14.8.1.
Os parâmetros sensibilidade, especificidade e valores preditivos foram estimados de
acordo com Ferreira e Ávila (2001). A sensibilidade do teste foi dada pela porcentagem de
positivos detectados pelo teste entre os indivíduos sabidamente doentes (verdadeiros
positivos). A especificidade, pela percentagem de negativos, entre indivíduos não doentes
(verdadeiros negativos). O valor preditivo positivo (VPP) refere-se à probabilidade de ter a
doença se o resultado for positivo, enquanto que o valor preditivo negativo (VPN) refere-se à
probabilidade de não ter a doença quando o resultado for negativo (LIRA, 2005).
Foi calculada a razão de verossimilhança a fim de se observar a probabilidade de
encontrar um animal negativo entre os doentes (RVN) e de encontrar um positivo entre os
doentes (RVP), calculou-se a razão de verossimilhança negativa e positiva (FONSECA,
2013).
Esses parâmetros foram obtidos pelo programa computacional MedCalc e GraphPad
Prism versão 5.0 (Prism Software®, Irvine, EUA).
36
5 RESULTADOS
5.1 IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS ANTIGÊNICAS, PREDIÇÃO DE EPÍTOPOS E
SELEÇÃO DE ALVOS
Inicialmente, 76 proteínas foram selecionadas por apresentarem pelo menos um
epítopo linear de célula B predito, serem altamente expressas em tripomastigotas sanguíneas e
potencialmente serem secretadas ou estarem na superfície do parasito (Figura 5).
Figura 5: Distribuição de proteínas de T. vivax com potenciais epítopos lineares de célula B, de
superfície/secretadas e expressas em tripomastigotas (área em azul).
Proteínas com similaridade acima de 70% de identidade e 70% de cobertura com
diferentes tripanosomatídeos (T. brucei, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. grayi, L.
braziliensis, L. donovani, L. infantum, L. major, L. tarentolae, L. mexicana e L. tarentolae) e
diferentes patógenos de importância veterinária (A. marginale, B. bovis, B. bigemina, B. bovis
e B. abortus) foram eliminadas para minimizar reação cruzada no teste sorológico.
Inicialmente, optou-se por selecionar uma proteína (TvY486_0012280) com potencial
aplicação em testes imunodiagnóstico para ser clonada e expressa como pode ser observado
na Figura 6.
Figura 6: Proteína hipotética específica de T. vivax (TvY486_0012280) com epítopos lineares de célula B. A
régua com setas duplas representam as coordenadas de cada proteína com o identificador do gene codificador
37
acima. Barras amarelas representam epítopos lineares de célula B preditos com valor de predição representados
em vermelho. Barras pretas representam regiões não estruturadas da proteína que suportam a presença de regiões
com epítopos lineares acessíveis a anticorpos e os valores de predição são representados em vermelho.
5.2 CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE
(TvY486_0012280) EM E. coli BL-21 ARCTIC EXPRESS (DE3)
O gene foi inicialmente amplificado (Figura 7) utilizando a enzima Taq High-Fidelity
e os resultados das etapas de ligação destes amplicons aos vetores utilizados no estudo serão
apresentados. Na Figura 7 também estão demonstrados os amplicons gerados da reação de
PCR (813 PB) de colônia obtidas por meio da transformação das bactérias XL-1 Blue com o
sistema de ligação do vetor de clonagem “p-GEM-T Easy Vector Systems” e os amplicons
gerados da reação de PCR, utilizando primer T7 e colônias de bactérias BL-21 Star obtidas
por meio da transformação com o sistema de ligação do vetor de expressão pET28a-TEV.
Figura 7: Análise dos produtos de PCR gerados na etapa de clonagem. Na canaleta 1, encontra-se o padrão de
peso molecular, sendo evidenciados os pesos de 500 e 1000 pares de base (PB). Demais canaletas são referentes
a amplificação do gene com a enzima High-Fidelity (2), utilizando primer M13 no vetor de clonagem pGEM-T
Easy (3) e utilizando primer T7 no vetor de expressão pET28a-TEV (4).
1 2 3 4
1000 PB
500 PB
813 PB
38
5.3 – EXPRESSÃO DE PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE DE T. vivax
(TvY486_0012280) EM E. coli BL-21 ARCTIC EXPRESS (DE3) E PURIFICAÇÃO EM
COLUNA CROMATOGRÁFICA His-Tag SEGUIDO DE GEL FILTRAÇÃO EM COLUNA
TM-200
A expressão da proteína recombinante dos produtos gerados antes e após indução com
IPTG, e após a purificação por coluna de afinidade pode ser visualizada na figura 8. A
produção em laboratório, gerou 1.844,06ng proteína recombinante TvY486_0012280.
Figura 8: Expressão e purificação da proteína recombinante separada por gel de poliacrilamida SDS-PAGE
12,5%. (A) Padrão de peso molecular, lisado da cultura antes (B) e após (C) indução com IPTG e proteína
recombinante purificada TvY486_0012280 (KDa) (D) por gel filtração.
5.4 PADRONIZAÇÃO DO TESTE IMUNOENZIMÁTICO ELISA
A figura 9 representa a média dos valores de DO obtida nas diferentes concentrações
de antígeno e diluições de pool de soros e conjugado. Pode-se notar maior diferença na
absorbância entre animais positivos e negativos com 1000ng da proteína recombinante
(Figura 9A), soro controle positivo e controle negativo na diluição 1:100 (Figura 9B) e
conjugado na diluição 1:5000 (Figura 9C).
D C A A B
20 KDa
30 KDa
20 KDa
30 KDa 26,2 KDa 26,2 KDa
39
Figura 9: (A) Perfil de absorbância do pool de soros de animais aos 30 dias pós-infecção frente a diferentes
concentrações de proteína recombinante TvY486_0012280; (B) Perfil de absorbância do pool de soros de
animais aos 30 dias pós-infecção em diferentes diluições; (C) Perfil de absorbância do pool de soros de animais
aos 30 dias pós-infecção frente a diferentes diluições do conjugado.
A
1 10 100 10000.00
0.05
0.10
0.15
0.20
***
Quantidade de proteína recombinante (mg)
DO
450nm
1:100 1:250 1:5000.00
0.05
0.10
0.15
0.20
***
Controle negativo (CN)
Controle positivo (CP)
***
***
Diferença (CP - CN)
Diluição do soro
DO
450nm
B
1:5000 1:10000 1:200000.00
0.05
0.10
0.15
0.20
***
***
***
Diluição do conjugado
DO
450nm
C
40
A curva ROC (Figura 10) obtida das a partir das DO das amostras individuais permitiu
separar animais positivos dos negativos a partir da DO de 0,04 (ponto de corte) com elevada
acurácia do teste (ASC: 0,986).
Figura 10: Curva ROC da padronização de ELISA testando a proteína recombinante de T. vivax
TvY486_0012280 para diagnóstico da tripanosomíase bovina.
Os valores de DO individuais dos animais ao dia 0 variaram de 0,0223-0,0338 (0,0279
± 0,0057) e dos animais dos dias 21, 24, 27 e 30 pós-infecção variaram respectivamente de
0,0323 - 0,0888 (0,270 ± 0,026), 0,0563 - 0,1678 (0,461 ± 0,044), 0,0608 - 0,1178 (0,380 ±
0,024) e 0,0618 - 0,1058 (0,420 ± 0,019) (Figura 11). Com base no ponto de corte obtido,
pôde-se avaliar o desempenho do teste, sendo a sensibilidade de 94,4% (72,6–99,1),
especificidade de 100% (40,2–100) (Figura 12) e os valores VPP e VPN, respectivamente, de
100% e de 99,3%.
Figura 11: Valores de densidade ótica dos animais ao dia 0 (n=4) e dias 21 (n=4), 24 (n=5), 27 (n=5) e 30 (n=5)
pós-infecção.
NEG POS0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
100,0%
94,4%
De
nsi
da
de
Otic
a (4
05
nm)
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
Ponto de Corte = 0,04ASC = 0,986 (0,820-1,000)
Se
nsib
ilid
ad
e (
Se
n %
)
100-Especificidade (100-Esp %)
41
Figura 12: Desempenho do teste ELISA para T. vivax utilizando a proteína recombinante TvY486_0012280.
Na análise de verossimilhança pôde-se notar os valores de razão de verossimilhança
negativa de 0,06 e de razão de verossimilhança positiva de +∞ (Figura 13). Observa-se que
com o ponto de corte escolhido, a chance de obtenção de um resultado falso-negativo é
praticamente zero.
Figura 13: Razão de verossimilhança entre animais positvos e negativos
Os dados obtidos no presente trabalho estão descritos na tabela 1, e mostram uma
performance satisfatória do teste de ELISA.
RV
0,0
4
0,0
1
0,1
0
-5.0
-2.5
0.0
2.5
5.0RV+
RV-
Pro
ba
bilid
ad
e e
m C
ha
nce
s
Log10 do Ponto de Corte
0.0
0
0.0
5
0.1
0
0.1
5
0.2
0
0.0
4
0
20
40
60
80
100 Sen
Esp
De
se
mp
en
ho
(%
)
Ponto de Corte
42
Tabela 1: Desempenho do teste imunoenzimatico ELISA com a proteína recombinante
purificada TvY486_0012280.
Parâmetro Resultado
Acurácia 98,6%
Sensibilidade 94,4%
Especificidiade 100%
Valor Preditivo Positivo 100%
Valor Preditivo Negativo 99,3%
Razão de Verossimilhança positiva +∞
Razão de Verossimilhança negativa 0,06
A patente depositada, referente a fase de padronização de ELISA para diagnóstico da
tripanosomíase bovina está descrita no anexo B.
43
6. DISCUSSÃO
O diagnóstico para as mais diversas doenças que acometem os animais domésticos
sempre foi um desafio para a medicina veterinária. Seja no diagnóstico precoce da
enfermidade, seja na especificidade e sensibilidade do teste. No caso da tripanosomíase
bovina, os métodos diagnósticos parasitológico e sorológico desenvolvidos até o presente
momento apresentam entraves. O teste parasitológico permite detectar tripomastigota de T.
vivax na fase aguda da doença, mas em fases crônicas esse teste apresenta baixa sensibilidade
(MURRAY, 1977). Enquanto que no teste sorológico, a identificação de IgG em fase aguda
não é possível (SAMPAIO, 2013).
Frange (2013) ao relatar um surto de tripanosomíase, discorre sobre a dificuldade de
encontrar animais que tenham o parasito circulante, mostrando baixa sensibilidade dos testes
parasitológicos, uma vez que há migração do parasito para fora da circulação, conforme o
curso da doença se torna crônico. Daí, a importância de padronizar testes que sejam sensíveis
e específicos na pesquisa de anticorpos. Todavia, o sucesso do atual teste de pesquisa de
anticorpos (RIFI) depende dentre vários fatores, do olhar do profissional que examina a
lâmina de imunfluorescência, podendo o mesmo ser subjetivo, tempo de realização do exame,
dependendo do número de amostras a ser analisado e presença de reações cruzadas com
outros tripanosomatídeos (SILVA et al., 2002; ZANETTE, 2006). Uma vantagem dos testes
de ELISA em comparação com os testes de RIFI, diz respeito a praticidade, uma vez que no
ELISA é possível realizar o processamento de várias amostras de uma só vez e leitura é
realizada por espectrofotometria, enquanto a RIFI requer diluições seriadas, além de ter
número restrito de amostras processadas por lâmina (ZANETTE, 2006).
Com o avanço da doença, surge a necessidade de ter maneiras diagnósticas precisas, a
fim de realizar de maneira eficiente o controle e o tratamento da patologia. O uso de proteínas
recombinantes para diagnóstico da tripanosomíase bovina é uma tecnologia nova, havendo
poucos trabalhos na literatura que decrevam o uso das mesmas para o diagóstico da
tripanosomíase bovina, sendo o presente trabalho um dos pioneiros no assunto. Após
proteínas semelhantes a outros tripanosomatídeos e patógentos serem eliminados, visando
minimizar reação cruzada no teste sorológico, a proteína TvY486_0012280 foi selecionada
por apresentar potencial aplicação em testes imunodiagnóstico para ser clonada e expressa.
Para a obtenção das proteínas utilizadas no presente experimento, foi utilizado o
plasmídeo pET28a-TEV. O plasmídeo possui uma cauda de histidina, na qual a proteína
expressa é ligada, facilitando a purificação posterior com a coluna de níquel. Já para a
expressão, o microorganismo utilizado foi a E. coli, por crescer rapidamente, até altas
44
densidades e em meio de cultura acessível, produzindo grande quantidade de produto
recombinante (TERPE, 2006).
Como mencionado por Day e Schultz, (2011), para que resultados satisfatórios sejam
obtidos no teste de ELISA, deve-se ter o cuidado de, primeiramente, padronizar as diluições
de antígeno, soro e conjugado que serão utilizadas, bem como o uso de padrões ouro de soros
negativos e positivos. Comparando os resultados obtidos com os do trabalho realizado por
Madruga et al., (2006) que testou antígenos brutos de T. vivax em ELISA, percebeu-se que o
referido autor obteve sensibilidade de 97,6%, frente a 94,4% do presente trabalho. Isso pode
ser devido ao tipo de antígeno utilizado. O uso de antígenos brutos são considerados de menor
qualidade, uma vez que a especificidade aos subgêneros de Trypanosoma é limitada
(MAGONA, et al., 2003).
Alem disso, o uso de antígenos brutos, permitem reações cruzadas (MADRUGA et al.,
2006) e são de obtenção dificultosa, uma vez que é necessário protocolo de aprovação por
parte de um comitê de ética, para uso de animais para inoculação. Ademais, envolve
treinamento de equipe para acompanhamento dos animais no intervalo entre inoculação, até
que seja atingido o pico de parasitemia para obtenção do parasito. Em contraste, a obtenção de
proteínas recombinantes, assim como realizado no presente estudo, é uma tecnologia
inovadora e que é capaz de obter proteínas específicas em larga escala e de boa qualidade,
dispensando o uso de animais (FONSECA, 2013; ROSANO, CECARELLI, 2014).
A baixa densidade ótica observada nos testes de ELISA pode ser explicada pela
escolha de um único antígeno, onde há ligação de anticorpos a uma proteína antigênica
isolada, diferente do que é observado quando utiliza-se um pool de proteínas, havendo várias
moléculas antigênicas que promovem a ligação de vários anticorpos, e consequentemente uma
maior DO.
Trabalho realizado por Porrozzi et al., (2007) utilizando antígenos bruto e
recombinantes (rA2 de L. donovani, rK26 e rK39 de L. Infantum) para diagnóstico de
Leishmaniose Visceral Canina por ELISA foram comparados, e mostraram diferenças em
relação a sensibilidade. Nos protocolos de ELISA utilizando os antígenos rK26, rK39 e rA2
frente a soros de cães sintomáticos a sensibilidade foi de 94%, 100% e 70%, respectivamente,
enquanto que o ELISA com extrato bruto do parasito apresentou sensibilidade de 88%.
Quando utilizou-se soros de cães assintomáticos, a sensibilidade foi de 66% para os antígenos
rK26 e rK39, de 88% para rA2 e 30% para ELISA com extrato bruto de parasito.
Madruga et al., (2006) comentam que reações cruzadas com outros tripanosomatídeos
são esperadas (96,9% de especificidade), porém o presente estudo utilizou de pesquisa de
bioinformática, que descartou epítopos com maior similaridade a outros tripanosomatídeos,
45
sendo portanto um teste que evita reações cruzadas, o que justifica a especificidade de 100%.
Este resultado significativo é um importante parâmetro, uma vez que se trata da capacidade do
teste em indicar que um indivíduo não possui a doença quando ela não está presente, evitando
assim que hajam reações cruzadas (JEKEL; KATZ; ELMORE, 2005).
Outros trabalhos utilizando proteínas recombinantes para doença de Chagas e
leishmaniose visceral canina (LVC) foram realizados e também observaram sensibilidades e
especificidades diferentes. Como por exemplo o trabalho realizado por LANNA (2015), que
objetivou padronizar ELISA para diagnóstico de doença de Chagas utilizando proteína
recombinante e obteve uma sensibilidade de 25,64% e especificidade de 80% entre pacientes
chagásicos e pacientes com leishmaniose visceral, não sendo um alvo bom para o teste, além
de ter apresentado reações cruzadas com pacientes positivos para leishmaniose visceral.
Zanette (2006), ao testar ELISA para o diagnóstico da LVC, obteve uma sensibilidade
de 94% e especificidade de 84,4%. Ademais, observou reação cruzada com outras patologias
causadas por protozoários, tais como doença de Chagas, erliquiose, babesiose, toxoplasmose e
neosporose ao testar ELISA, RIFI e ensaio imunocromatográfico para diagnóstico da LVC.
As reações cruzadas podem ser explicadas no referido trabalho pelo uso de antígenos totais
nas técnicas de ELISA e RIFI.
Trabalho realizado por PILLAY e colaboradores (2013), demonstrou resultados
satisfatórios para detecção de T. vivax com ELISA, em animais entre 10 a 20 DPI. Os autores
isolaram uma proteína associada ao flagelo, quase idêntica a vários isolados de T. vivax para
padronização do teste, e obtiveram uma sensibilidade de 91,5% e especificidade de 91,3%,
quando comparado a outro teste que utilizou antígeno lisado para adsorção da placa. Todavia,
observou resultados falso-negativos antes dos 10 DPI em animais experimentais, além de
reação cruzada com soros de animais infectados por T. congolense.
Fonseca (2003), ao testar duas proteínas recombinantes para o diagnóstico de
Leishmaniose visceral, obteve sensibilidade de 75% e 80% para uma, e especificidade de 90%
e 60%, para a outra. Ao observar o valor preditivo positivo (proporção de verdadeiros
positivos entre todos os indivíduos com teste positivo) para as duas proteínas testadas, o
mesmo observou VPP de e 97% e 92%. O valor preditivo positivo do presente trabalho foi
100%, sendo então 100% de todos os indivíduos positivos detectados ao teste. Ao observao o
valor preditivo negativo (proporção de verdadeiros negativos entre todos os indivíduos com
teste negativo), o mesmo autor obteve VPN de 39% e 35%. O presente trabalho obteve VPN
de 99,3%, sendo portanto 99,3% dos indivíduos negativos detectados no teste. É importante
ressaltar que os bons valores obtidos no presente trabalho devem-se a escolha de soros bem
caracterizados do período de infecção.
46
A curva ROC trata-se de uma importante ferramenta na avaliação de métodos
diagnósticos. Nela é possível colocar valores de sensibilidade (eixo X) e especificidade (eixo
Y), sendo possível escolher um cut-off de acordo com maior ou menor especificidade e
sensibilidade. Ademais, a curva ROC fornece a área sob a curva (ASC), valor que é expresso
entre 0,0 a 1,0 e permite condensar as possíveis combinações de sensibilidade e
especificidade em um único valor (GREINER; PFEIFFER; SMITH, 2000)
Ao comparar os valores de ASC para as duas proteínas de Fonseca (2003), o autor
obteve 0,76 e 0,86 para duas proteínas testadas. O presente trabalho obteve 0,986. De acordo
com Luz e colaboradores (2016), valores preditivos refletem a contribuição de um teste para
condições clínicas. A acurácia total indicou que 98,6% dos resultados são corretos, reforçando
a boa performance da metodologia descrita. A área sobre a curva é capaz de mostrar a
performance de um teste, podendo ter qualquer valor de 0 a 1, onde quanto mais perto de 1,
melhor é a acurácia do teste (ZHOU; OBUCHOWSKI; MCCLISH; 2002; )
A razão de verossimilhança positiva (RVP), indica a probabilidade de encontrar
resultado positivo em indivíduos que sejam verdadeiramente positivos. A RVP do presente
trabalho foi de +∞, indicando portanto se tratar de um teste promissor, pois expressa que a
probabilidade de encontrar um indivíduo portador da doença, quando comparados a
indivíduos não doentes (FONSECA, 2013). Ainda segundo Fonseca (2013), a razão de
verossimilhança negativa (RVN), indica a probabilidade de encontrar resultado negativo em
indivíduos portadores da doença, portanto quanto mais próximo for de zero, melhor é o teste.
O VPN do presente trabalho foi de 0,06, mostrando-se também adequado.
Com o grande aumento dos casos de tripanosomíase bovina, espera-se que o
desenvolvimento de novas técnicas diagnósticas seja capaz de detectar a doença tanto em fase
aguda, quanto em fase crônica, visando também o uso de um diagnóstico prático, eficiente e
consequentemente um tratamento precoce, aspirando manter a sanidade dos rebanhos.
47
7. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que:
A padronização demonstra-se adequada com 1000 nanogramas de proteína
recombinante (TvY486_0012280) para sensibilização, soro na diluição de 1:100 e
conjugado na diluição de 1:5000;
A proteína recombinante permite padronizar o teste imunoenzimático ELISA com
elevada especificidade (100%) e sensibilidade (94,4%);
O teste imunoenzimático ELISA utilizando a proteína recombinante TvY486_0012280
é uma ferramenta promissora e alternativa para o diagnóstico da tripanosomíase bovina.
48
8. PERSPECTIVAS FUTURAS
Com o grande aumento dos casos de tripanosomíase bovina, o desenvolvimento de
novas técnicas diagnósticas é uma necessidade para que a detecção da doença tanto em fase
aguda, quanto em fase crônica.
As perspectivas futuras do presente trabalho incluem a realização e padronização de
ELISA utilizando a proteína recombinante e amostras de animais advindas do campo, e
posteriormente, criação de imunoensaio cromatográfico feito a campo para diagnóstico da
tripanosomíase bovina, tanto em fase aguda quanto em fase crônica.
49
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ANEXO A – CERTIFICADO DO COMITÊ DE ÉTICA ANIMAL (UNIUBE)
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ANEXO B – COMPROVANTE DE DEP´OSITO DE PATENTE
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60
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