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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES LEP, GH, IGF1, CAPN1
E CAST E ASSOCIAÇÃO COM CARACTERÍSTICAS DE QUALIDADE DE
CARNE E CARCAÇA EM OVINOS SANTA INÊS
ARIANA NASCIMENTO MEIRA
SALVADOR-BA
ABRIL-2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA – UFBA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES LEP, GH, IGF1, CAPN1
E CAST E ASSOCIAÇÃO COM CARACTERÍSTICAS DE QUALIDADE DE
CARNE E CARCAÇA EM OVINOS SANTA INÊS
ARIANA NASCIMENTO MEIRA
Zootecnista
SALVADOR-BA
ABRIL-2016
iii
ARIANA NASCIMENTO MEIRA
IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS NOS GENES LEP, GH, IGF1, CAPN1
E CAST E ASSOCIAÇÃO COM CARACTERÍSTICAS DE QUALIDADE DE
CARNE E CARCAÇA EM OVINOS SANTA INÊS
Tese apresentada ao Programa de pós-graduação em
Zootecnia, da Universidade Federal da Bahia, como
requisito parcial para obtenção do título de Doutor
em Zootecnia.
Área de Concentração: Produção Animal
Orientador: Prof. Dr. Luís Fernando Batista Pinto
Coorientador: Prof. Dr. Luiz Lehmann Coutinho
SALVADOR-BA
ABRIL-2016
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“Sua tarefa é descobrir o seu trabalho e,
então, com todo o coração, dedicar-se a ele.”
Buda
Dedico este trabalho a Deus e
aos meus familiares que sempre
me deram apoio em todos os
momentos da minha vida.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelas oportunidades que vem me proporcionando. A meus pais
Marilza e Marceliano por me orientarem e fazerem de mim o que sou hoje. Ao meu irmão
Mateus pelo apoio de todos estes anos. Aos meus queridos avós Ismênia e Batista por
todo apoio e carinho.
Agradeço aos grandes amigos que fiz durante estes quatro anos de doutorado, só
gratidão é pouco pelo que vocês representam para mim. Obrigada por todos os momentos
maravilhosos que passamos juntos. Por todos os momentos felizes e por que não os
tristes?
Gostaria de agradecer em especial a meu querido grupo Renew +30 e a Tassinha,
vocês foram meu maior presente neste doutorado, a minha força para levar o último ano,
obrigada por toda paciência, por aguentarem minhas lamentações e por me ajustarem nos
momentos mais difíceis de minha vida. Obrigada por me ajudarem a sorri quando estava
triste e a seguir em frente quando empacava, rsrs.
Agradeço a minha família baiana que fui achar em São Paulo, Tia Rita, Tio Luiz
e Ariane por terem me acolhido e me amarem como filha. Saibam que tenho um carinho
enorme por vocês e os amo demais.
Agradeço ao apoio canino de SNP, Théo, Nina e Rubéns que me deram muitas
lambeijocas nos momentos que sentia falta de minhas filhas.
Agradeço a meu grupo de pesquisa pelo apoio em especial a Carla, Geraldo,
Alessandro Caio e Adriana, amigos que pretendo levar para a vida inteira.
Agradeço ao grupo do laboratório de biotecnologia animal da ESALQ por todo o
apoio e estrutura durante todo o doutorado. Em especial ao professor Coutinho por ter
aceito me co-orientar e ter aberto um espaço em seu grupo de pesquisa durante o período
que passei lá.
Agradeço ao professor Gerson e sua esposa Luciana pelo apoio.
Agradeço ao programa de pôs graduação em zootecnia pela oportunidade e as
agências de fomento FAPESB e CNPq pelo apoio financeiro.
E por fim, mas tão especial quanto os outros, quero oferecer meus sinceros
agradecimentos ao meu orientador Luís Fernando, pelo apoio durante este tempo.
Obrigada a todos que torcem pelo meu sucesso.
Obrigada de coração, que Deus abençoe a todos.
viii
LISTA DE SIGLAS
A – Adenina
AOL – área de olho de lombo
ARCO – Associação Brasileira de Criadores de Ovinos
C – Citosina
CAPN1 – Gene da calpaína 1
CAST - Gene da calpastatina
Embrapa – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
G – Guanina
GH – Gene do hormônio do crescimento
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IGF1 - Gene do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1
KB – Quilobase
LEP – Gene da leptina
MAS – seleção assistida por marcadores
pb – pares de bases
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PROMOVI – Programa de Melhoramento Genético em Ovinos
SNP – polimorfismo de base única
T – Timina
ix
LISTA DE FIGURAS
Identificação de polimorfismos nos genes LEP, GH, IGF1, CAPN1 e CAST e associação com
características de qualidade de carne e carcaça em ovinos Santa Inês
Página
Figura 1. Ação e secreção da Leptina em ratos............................................................. 20
x
LISTA DE TABELAS
Capitulo 1 - Polimorfismos no gene LEP e associações com atributos da carne e da
carcaça de ovinos Santa Inês
Paginas
Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas ....... 39
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no
gene LEP ...................................................................................................
44
Tabela 3. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-
padrão (EP) nos testes de associação com polimorfismos no gene
LEP.............................................................................................................
47
Capítulo 2 - Polimorfismos nos genes GH e IGF1 e associações com atributos da carne
e da carcaça de ovinos Santa Inês
Paginas
Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas ....... 62
Tabela 2. Primers Forward (F) e reverse (R) e ciclos de amplificação das regiões
investigadas em cada gene ......................................................................
64
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no
gene IGF1 ...............................................................................................
68
Tabela 4. Frequências genotípica e alélica dos marcadores identificados no gene
GH ........................................................................................................... 72
Tabela 5. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-
padrão (EP) nos testes de associação ......................................................
75
Capítulo 3 - Polimorfismo nos genes CAPN1 e CAST e associações com atributos da
carne e da carcaça de ovinos Santa Inês
Paginas
Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas..... 92
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no
gene CAST ..............................................................................................
97
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no
gene CAPN1 ...........................................................................................
105
Tabela 4. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-
padrão (EP) nos testes de associação com polimorfismos no gene CAST
.....................................................................................................
112
Tabela 5. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-
padrão (EP) nos testes de associação com polimorfismos no gene
CAPN1 ...................................................................................................
117
xi
SUMÁRIO
Identificação de polimorfismos nos genes LEP, GH, IGF1, CAPN1 e CAST e
associação com características de qualidade de carne e carcaça em ovinos Santa Inês
......................................................................................................................................... 12
Resumo geral ................................................................................................................... 12
Abstract ........................................................................................................................... 13
Introdução geral ............................................................................................................... 14
Referencial teórico ........................................................................................................... 15
Referências bibliográficas .............................................................................................. 26
CAPÍTULO 1 ................................................................................................................. 32
Polimorfismos no gene LEP e associações com atributos da carne e da carcaça de
ovinos Santa Inês........................................................................................................... 32
Resumo ............................................................................................................................ 33
Abstract ............................................................................................................................ 34
Introdução ........................................................................................................................ 35
Material e Métodos .......................................................................................................... 36
Resultados e Discussão .................................................................................................... 42
Conclusões.......................................................................................................................50
Referências Bibliográficas ............................................................................................... 51
CAPÍTULO 2 ................................................................................................................. 55
Polimorfismos nos genes GH e IGF1 e associações com atributos da carne e da
carcaça de ovinos Santa Inês ....................................................................................... 55
Resumo ............................................................................................................................ 56
Abstract ............................................................................................................................ 57
Introdução ........................................................................................................................ 58
Material e Métodos .......................................................................................................... 59
Resultados e Discussão .................................................................................................... 66
Conclusões.......................................................................................................................80
Referências Bibliográficas ............................................................................................... 81
CAPÍTULO 3 ................................................................................................................. 85
Polimorfismo nos genes CAPN1 e CAST e associações com atributos da carne e da carcaça
de ovinos Santa Inês .................................................................................................... .....85
Resumo ............................................................................................................................ 86
Abstract ............................................................................................................................ 87
Introdução ........................................................................................................................ 88
Material e Métodos .......................................................................................................... 89
Resultados e Discussão .................................................................................................... 96
Conclusões.....................................................................................................................121
Referências Bibliográficas ............................................................................................. 122
Considerações Finais ................................................................................................... 125
12
Identificação de polimorfismos nos genes LEP, GH, IGF1, CAPN1 e CAST e
associação com características de qualidade de carne e carcaça em ovinos Santa
Inês
RESUMO GERAL
O objetivo desta pesquisa foi identificar, em ovinos Santa Inês, polimorfismos do tipo
SNP (Single Nucleotide Polymorphis) nos genes IGF1 (Insulin Like Growth Factor 1),
GH (Growth Hormone), LEP (Leptin), CAPN1 (Calpain 1) e CAST (calpastatin) e
verificar se estão associados a características que evidenciam qualidade de carne ou de
carcaça. Para tanto, foram sequenciados fragmentos destes genes em até 191 animais. Na
região estudada do IGF1, cerca de 4.550 pb (pares de base), foram detectados 18 SNPs
em região de intron. Nos 2.045 pb estudados do gene da leptina foram identificados 21
SNPs, sendo um em região de exon. No gene GH, onde 1.194 pb foram sequenciados, 21
polimorfismos foram identificados, sendo 3 localizados em exon. Nos 3.927 pb estudados
do gene CAPN1, foram identificados 45 SNPs, um deles localizado em exon. No gene
CAST, 4.108 pb foram sequenciados e 58 polimorfismos identificados, sendo um em
exon. Deste total de polimorfismos, 115 SPN apresentaram distribuição de frequência que
permitiu utilizá-los para estimar efeitos aditivo e de dominância, sendo 6 no IGF1, 16 no
LEP, 52 no CAST, 5 no GH e 36 no CAPN1. Para alguns marcadores as frequências
genotípicas e alélicas diferiram de forma expressiva entres os dois grupos de animais
estudados (Embrapa e UFBA). Isso indica que há variação nas frequências de alguns
marcadores dentro dos rebanhos da raça Santa Inês e a resposta ao processo de seleção
dependerá muito da frequência do alelo favorável no rebanho sob seleção. Vários
marcadores tiveram efeito aditivo significativo sobre atributos de carne e de carcaça e
podem ser boa fonte de informação para a seleção de ovinos da raça Santa Inês. Muitos
desses efeitos ainda não haviam sido reportados em ovinos, o que torna o presente estudo
uma fonte de referência para outros trabalhos com esta espécie.
Palavras-chave: biotecnologia, genética, marcadores moleculares, melhoramento
animal, sequenciamento
13
Identification of polymorphisms at the genes LEP, GH, IGF1, CAPN1 and CAST
and association with meat and carcass quality traits in Santa Ines sheep
ABSTRACT
This study aimed to identify single nucleotide polymorphisms (SNP) in the IGF1 (Insulin
Like Growth Factor 1), GH (Growth Hormone), LEP (Leptin), CAPN1 (Calpain 1) and
CAST (Calpastatin) genes and to test association with economic meat and carcass quality
traits. For this purpose, they were sequenced fragments of these genes in up to 191
animals. In the IGF1 gene, about 4,550 bp (base pairs) were sequenced and 18 SNPs were
found in intron region. In the Leptin gene were sequenced 2045 bp and 21 SNPs were
identified, only one in exon region. In the GH gene were sequenced 1,194 bp and 21
polymorphisms were identified, of which three in exon. For the CAPN1 gene were
sequenced 3,927 bp and 45 SNPs were found, one into exon. In the CAST gene were
sequenced 4,108 bp and 58 polymorphisms were identified, one in exon. Frequency
distribution of 115 polymorphisms allowed to estimate additive and dominance effects
for phenotypic traits (6 in IGF1, 16 in LEP, 52 in CAST, 5 in GH and 36 in CAPN1). For
some markers, the genotypic and allelic frequencies differed expressively between the
two groups of animals studied (Embrapa and UFBA). This indicates that there is variation
in the frequencies of some markers within the Santa Ines herds and the response to the
selection process will depend greatly on the frequency of the favorable allele in the herd
under selection. Several markers had a significant additive effect on meat and carcass
attributes and may be a good source of information for selection of Santa Ines sheep.
Many of these effects were not reported in sheep, which makes the present study a source
of reference for other research around this species.
Key words: biotechnology, genetics, molecular markers, animal breeding, sequencing
14
INTRODUÇÃO GERAL
Os ovinos da raça Santa Inês vêm sendo avaliados ao longo do tempo para pesos
e ganhos de pesos em vários estudos da área de melhoramento genético no Brasil, como
Sousa et al. (1999), Sarmento et al. (2006) e Carvalho et al. (2014). Pesos e ganhos de
pesos são bons critérios de seleção relacionado ao crescimento e para a ovinocultura de
corte a melhoria do crescimento é um objetivo de grande importância econômica.
Contudo, muitas características associadas a qualidade de carne e de carcaça, que também
são importantes para a ovinocultura de corte, vem sendo negligenciadas devido a
necessidade de abater os animais, pois, para ser realizado as análises relacionadas a
textura, cor, pH, rendimento de carcaça, dentre outras, torna-se necessário abater os
animais. Uma alternativa moderna que pode trazer bons resultados para a melhoria dessas
características complexas é a utilização de informações moleculares no processo de
seleção dos animais (Gao et al., 2007).
A abordagem de genes candidatos tem sido uma das principais estratégias para
identificar associação entre polimorfismos moleculares e características complexas na
ovinocultura. Como exemplo de aplicação desta estratégia têm-se os estudos envolvendo
qualidade de carne e carcaça (COCKETT et al., 2005); produção de leite (MOIOLI et al.,
2007); características reprodutivas (HUA e YANG, 2009); e a resistência a endoparasitas
(PERIASAMY et al., 2014). Um dos principais problemas dessa abordagem é a
necessidade de se conhecer a função dos genes, para que eles de fato sejam considerados
candidatos. Contudo, o sequenciamento do genoma ovino tem possibilitado ampliar o
conhecimento da função de vários genes em ovinos, como pode ser observado em Jiang
et al. (2014). Assim, a indisponibilidade de genes com função conhecida não é mais um
grande entrave para a abordagem de genes candidatos. Outro problema dessa estratégia é
a natureza poligênica das características complexas, o que leva ao fato dos polimorfismos
encontrados muitas vezes explicarem percentuais reduzidos da variação das
características. Isso pode ser um problema para fins de melhoramento genético, pois para
se obter um ganho efetivo no processo de seleção é necessário conhecer os efeitos dos
muitos genes que estão atuando no controle da expressão da característica de interesse.
No entanto, a busca do conhecimento de como polimorfismos podem alterar a estrutura
de proteínas e influenciar as características de interesse ainda é uma grande justificativa
para estudos dessa natureza, como pode ser visto em Bahrami et al., (2015).
15
Apesar do crescente interesse nas informações de marcadores moleculares em
ovinos, pouco se sabe sobre polimorfismos que estejam associados a características de
interesse econômico em raças naturalmente adaptadas no Brasil, como a raça Santa Inês.
O principal trabalho publicado com a raça Santa Inês refere-se ao gene GDF9 e seu efeito
sobre prolificidade, como pode ser observado em Silva et al., (2010). Assim, o presente
trabalho tem por objetivo sequenciar e identificar polimorfismos nos genes GH, IGF1,
LEP, CAST e CAPN1 (conhecidos candidatos para características de crescimento,
deposição de gordura e maciez da carne, dentre outras variáveis), para testar associações
com rendimentos de carcaça e de cortes nobres, bem como características que evidenciam
qualidade de carne.
REFERENCIAL TEÓRICO
Ovinocultura no Brasil
Os ovinos foram trazidos para o Brasil há cerca de 500 anos e suas criações eram
feitas por pequenos produtores como cultura complementar, para a produção de carne,
leite e lã (McMANUS, et al. 2010). Nos anos 90 houve a crise internacional da lã e a
ovinocultura sofreu muitas mudanças. Na época, as principais criações de ovinos no
Brasil tinham como principal objetivo a produção da lã, mas com a queda no preço das
fibras têxteis, muitos criadores de ovinos no sul do país desistiram da atividade. Assim,
ainda que de forma indireta, os programas de melhoramento em ovinos também foram
prejudicados (VIANA, 2008; MORAIS, 2012). Contudo, na década seguinte houve um
grande aumento na ovinocultura de corte nas regiões centro-oeste e sudeste do Brasil
(MORAIS, 2012). A carne passou a ser o principal produto na criação ovina, fazendo da
ovinocultura de corte uma atividade atraente e lucrativa, considerando a praticidade de
não precisar tosquiar e o preço pago pelo produto. Com isso, as raças deslanadas
tornaram-se as mais populares naquele momento (VIANA, 2008; MORAIS, 2012).
Muitos produtores redirecionaram suas criações para a produção de carne, criando um
panorama alternativo para a produção de carne ovina de qualidade (SILVEIRA, 2005).
Segundo o censo pecuário do IBGE, o rebanho ovino no Brasil no de 2014 era de
aproximadamente 17,6 milhões de cabeças. O Nordeste apresenta o maior rebanho efetivo
do Brasil, cerca de 57,5%. A Bahia é o segundo maior Estado na criação de ovinos, com
aproximadamente 2,8 milhões de cabeças, o que corresponde a 27,8% do rebanho
16
Nordestino e 16% do rebanho nacional. Esse quantitativo é inferior apenas ao Estado do
Rio Grande do Sul, com quase 4,2 milhões de cabeças e que representa aproximadamente
23,9% do rebanho efetivo nacional (IBGE, 2012).
A produção de carne ovina vem mostrando aumento significativo em todo território
nacional, atingindo a exigência do mercado em relação a qualidade do produto, mas a
carência de oferta de animais jovens para o abate inibe o avanço do setor (BARCHET et
al., 2011). Assim, a ovinocultura vem demostrando ser um mercado bastante promissor,
pois as pessoas estão adquirindo novos hábitos, favorecendo o consumo e a apreciação
da carne ovina, aumentando a demanda pelos cortes e seus derivados (LARA et al., 2009;
ÁVILA et al., 2013).
Viana (2008) cita que os ovinos (Ovis aries) são uma espécie bastante difundida em
todos os continentes e isso se deve especialmente ao seu poder de adaptação a diferentes
climas, relevos e vegetações. Essa capacidade de adaptação despertou o interesse de
criadores de ovinos na região Nordeste do Brasil, onde o sistema de criação de ovinos é
tradicionalmente de produção extensiva, caracterizada por pequenos produtores que
investem poucos recursos no sistema de criação. Assim, a ovinocaprinocultura no Brasil
pode ser dividida em duas partes, uma tradicional e com pouco investimento em
tecnologias e outra mais tecnificada. Ambas contribuem para o desenvolvimento
socioeconômico do Brasil e requerem novos conhecimentos técnicos para ampliar todo
seu potencial de produção (COSTA, et al., 2010; GOUVEIA, 2003, apud ALENCAR, et
al., 2010, p 132).
Melhoramento genético de ovino no Brasil
No início da domesticação das espécies começou-se a seleção instintiva dos
melhores fenótipos para a procriação, dando início ao que conhecemos por melhoramento
genético; onde as primeiras mudanças alélicas instintivas foram realizadas (BORÉM,
2009). Contudo, o melhoramento de ovinos ainda é uma atividade em crescimento, pois
a maioria dos produtores fazem seleção individual nos rebanhos, enquanto que bancos de
dados para fins de melhoramento genético de ovinos são escassos no Brasil (MCMANUS,
et al., 2010). Segundo Morais (2012) a ovinocultura tem um papel fundamental na
economia de muitos países, como na Nova Zelândia e Austrália, onde a realização do
melhoramento genético ocorre de forma sistemática e orientada.
17
Uma das primeiras inciativas de melhoramento de ovinos no Brasil foi a criação do
PROMOVI (Programa de Melhoramento Genético dos Ovinos), coordenado pela ARCO
(Associação Brasileira de Criadores de Ovinos). O objetivo era avaliar ovinos no Rio
Grande do Sul, para a produção de lã e carne entre o fim da década de 70 e meados da
década 90, porém apesar dos esforços, não houve ganho genético expressivo (MORAIS,
2012). O mesmo autor relata que após este período o programa não conseguiu convencer
os produtores e a associação a continuar, o que levou muitos produtores a abandoarem o
programa logo após a crise da lã.
Depois da crise, a ovinocultura de corte começou a ganhar impulso e os produtores
começaram a importar reprodutores para alavancar a produção de carne através da
geração de cordeiros meio sangue (cruzados) para o abate (LÔBO, 2002). O autor também
relata que a ARCO alterou o PROMOVI, que passou a incluir nas suas análises o teste de
velocidade de crescimento, próprio para as raças importadas e passou a atender não
apenas o Rio Grande do Sul, mas toda a região Sul e o Estado de São Paulo. Contudo,
atualmente o PROMOVI não tem gerado avaliações genéticas e mesmo outras iniciativas
que surgiram depois dele ligadas a associações de criadores regionais, como a ASCCO
(Associação Sergipana dos Criadores de Caprinos e Ovinos), ou a Embrapa (GENECOC
- Programa de melhoramento genético de caprinos e ovinos de corte) não tem feito
avaliações continuadas. Assim, o criador de ovinos no Brasil continua a encontrar
dificuldade na aquisição de reprodutores, devido à falta de avaliações genéticas.
Marcadores moleculares na seleção animal
Na década de 80 ocorreram grandes avanços no mapeamento de genes e no
conhecimento de regiões genômicas responsáveis por controlar características de
interesse econômico (GUIMARÃES et al., 2009). Isso foi possível devido aos avanços
nas tecnologias que geraram marcadores moleculares de diversos tipos. Os primeiros
marcadores moleculares foram os fragmentos de DNA gerados a partir da digestão usando
enzimas de restrição (BORÉM, 2009). Atualmente os marcadores moleculares estão mais
viáveis e avançados, graças a descobertas de inúmeros polimorfismos de base única
(SNP), identificados a partir de sequenciamento dos genomas e de transcriptomas
(GUIMARÃES et al., 2009).
18
As novas tecnologias utilizadas para a seleção assistida por marcadores moleculares
englobam o mapeamento de genes, estudos de expressão gênicas em tecidos-alvo, dados
de produção, ferramentas biotecnológicas como as sequências genômicas e ferramentas
de bioinformática aplicadas (McMANUS et al., 2010). Tais informações são usadas para
selecionar genótipos associados a características quantitativas, ou seja, que explicam as
variações de características de interesse econômico, como na produção e composição de
leite e carne (DODDS et al., 2007; McMANUS et al., 2010).
Os estudos com marcadores moleculares em programas de melhoramento genético
de ovinos encontram-se em acedência e abrangem resistência a doenças, prolificidade e
marcadores para produção e qualidade de carne na seleção de indivíduos que possa suprir
a necessidade do mercado (DODDS et al., 2007). Exemplos de gene usados em
programas de melhoramento de ovinos são: Booroola (aumentar a produção de ovócito
por ciclo), Inverdale (aumenta a prolificidade), Callipyge (aumento da massa muscular
da garupa), miostatina (musculatura dupla), scrapie (resistência e suscetibilidade)
(GALLOWAY et al., 2000; JOHNSON et al., 2005; McMANUS, et al., 2010). Contudo,
McManus et al. (2010) citam que para utilizar informações de marcadores moleculares
em programa de melhoramento de ovinos é preciso ter uma base confiável para a coleta
de dados, com gravações de dados genealógicos padronizados, pois sem este controle não
haverá impacto sobre a criação de ovinos no Brasil.
Genes Candidatos
Genes candidatos são aqueles que possuem algum impacto funcional, com ações
biologicamente conhecidas, ou seja, que estão diretamente relacionadas com o
desenvolvimento ou fisiologia de características de interesse (ROTHSCHILD et al.,
1997). Grande parte dos genes candidatos estão envolvidos em via metabólicas e uma
alteração na sequência pode causar variações genéticas, influenciando na resposta da via
metabólica podendo ocorrer, assim, alterações no fenótipo. A necessidade de se abordar
os genes candidatos está no conhecimento da importância da variação genética dentro de
um gene associado com um fenótipo quantitativo conhecido, podendo investigar a causa
de mutações e o funcionamento do gene investigado (ZHU et al., 2007).
A associação de genes com importantes características de produção advém de uma
relação estatística entre um loco e uma característica em particular. Polimorfismos em
genes que codificam substâncias como o hormônio da Leptina, o hormônio de
19
crescimento e hormônio de crescimento semelhante à insulina I – IGF1, foram associados
à composição corporal, taxas de crescimento, peso nascimento e peso ao abate, dentre
outras variáveis, exercendo um efeito em vários sistemas metabólicos e energético
fundamentais para a produção animal (HOSSNER, 2005).
Kadarmideen et al., (2006) citam algumas etapas antes de implementar a
abordagem de um gene candidato. Primeiro deve-se formar uma população de referência;
depois coletar dados das características (fenotípicos de interesse); então realizar a
genotipagem dos animais; e por fim analisar os dados para verificar se existe associação
entre os fenótipos e os genótipos obtidos. Porém, este tipo de abordagem requer um
conhecimento prévio da ação do gene de interesse, que algumas vezes não foram
totalmente elucidadas. Além disso, as principais características de interesse econômico
sofrem atuação de diversos genes, que contribuem de alguma forma para a sua expressão.
Assim, pode ser difícil encontrar um gene candidato que explique grande percentual da
variação da característica de interesse (ANDERSSON, 2001; BURT e HOCKING, 2002).
Gene da Leptina
O gene da Leptina, também conhecido como o gene da obesidade (ob), é
considerado um gene candidato para a associação com característica de deposição de
gordura corporal em animais de produção e está relacionado com a regulação do
metabolismo energético, consumo de ração e composição corporal (BOUCHER et al.,
2006; CAUVERI et al., 2014). Logo, também pode ser um bom gene candidato para
avaliar pesos e ganhos de peso, ou seja, crescimento de animais de interesse pecuário.
As vias metabólicas do gene da Leptina estão sendo estudadas detalhadamente em
várias espécies, incluindo os ruminantes. Observa-se que o metabolismo de lipídios está
associado e o balanço energético está diretamente relacionado com a expressão da Leptina
e seus receptores, os quais desempenham papel importante em diversas etapas
metabólicas (PASSOS, 2006).
O hormônio da Leptina, sintetizado e secretado nos tecidos adiposos, é uma
descoberta relativamente nova. Foi em 1994 que Friedman e colaboradores conseguiram
descobrir um sinal de adiposidade presente em ratos, usando ratos que não apresentavam
sinal de saciedade. Neste estudo, foi observado que uma mutação que interrompia a
transcrição dos exons do gene da Leptina resultava em um stop prematuro da molécula de
mRNA, levando ao aumento de gordura corporal nos ratos. Após alguns testes utilizando
20
o hormônio da Leptina como tratamento, foi observada uma diminuição na ingestão de
alimentos e da gordura corporal (HOSSNER, 2005). O gene da Leptina foi descrito em
vários animais domésticos, incluindo suínos, bovinos, ovinos e aves (HOSSNER, 2005).
A figura 1 ilustra a ação e secreção da Leptina em ratos e ela é similar em várias espécies.
Houseknecht et al. (1998) ilustram que a Leptina produzida é secretada pelos tecidos
adiposos na corrente sanguínea, até atingir os tecidos alvos e cérebro, causando a
estimulação ou inibição da libertação de neurotransmissores, como o neuropéptidio Y
(NPY), os quais agem sobre a inibição da ingestão de alimentos e estimulam a termogênese.
Figura 1. Ação e secreção da Leptina em ratos. Adaptado de Houseknecht et al., (1998)
Os níveis de Leptina no sangue de ruminantes estão associados ao aumento linear
da massa corporal gorda e ao aumento do balanço energético. Uma mutação neste gene
pode interferir na regulação da expressão genica e afetar o metabolismo e o ganho de peso,
podendo ser útil em programas de melhoramento genético, sobretudo no contexto de
variáveis como deposição de gordura na carcaça dos animais (BLACHE et al., 2000;
EHRHARDT et al., 2000; COUTINHO et al., 2010).
O gene da Leptina está entre os melhores marcadores biológicos que indicam a
deposição da gordura corporal em animais e humanos (NASSIRY, et al., 2007). Coutinho
et al., (2010) afirmaram que o marmoreio na carne é decorrente da deposição de gordura
intramuscular, responsável pelo sabor e suculência da carne. Este gene pode ser muito útil
na escolha de animais de maior valor econômico e na seleção de melhores reprodutores.
Tecidos Periféricos -Fígado -Pâncreas - Músculo, etc.
Célebro
Leptina
(+/-) (+)
Hormônios (-) Consumo de alimento (+) Gasto de energia (+) Atividade física
(+)
(-)
(-)
(+)
21
A Leptina está liga a regulação do apetite e metabolismo de energia, atuando em
núcleos hipotalâmicos, responsáveis por regular processos metabólicos e liberação de
hormônios (HOUSEKNECHT et al., 1998). O hipotálamo atua na sinalização da saciedade
e no aumento do metabolismo para a queima de gordura, fazendo com que a atuação do
hormônio da Leptina regule a ingestão de alimento (AUWERX e STAELS, 1998; BARSH
et al., 2000). Assim, a investigação do hormônio da Leptina trouxe melhor concepção do
controle da energia corporal, possibilitando o entendimento do funcionamento e do
potencial desde gene como marcador, na regulação do consumo de gorduras e a distribuição
e armazenamento desta no corpo dos animais (CAUVERI et al., 2014).
Outro papel importante da atuação do gene da Leptina é a regulação do
metabolismo da produção de insulina, da secreção do hormônio do crescimento e do
estímulo da glicogenólise (degradação do glicogênio), indicando que o hormônio da
Leptina pode influenciar diretamente o metabolismo de energia nos tecidos musculares
(HOUSEKNECHT, et al., 1998; BUCHANAN et al., 2002; CHILLIARD et al., 2005).
O gene da Leptina e seus receptores podem influenciar diretamente o ganho de
peso e a conformação da carcaça, através da deposição de gordura. Além disso, pode
influenciar diretamente o desempenho reprodutivo, pois é necessário o mínimo de condição
corporal para inicializar as atividades reprodutivas e manter o ciclo estral regular (SPICER,
2001; PASSOS, 2006). Muitas características fisiológicas do gene da Leptina e seus
receptores, principalmente a influência sobre a gordura na carcaça, torna-o forte candidato
para o estudo de associação com características de produção (LIEFERS, 2004).
Localizado no cromossomo 4 dos ovinos, com aproximadamente 16.000pb (pares
de base) de comprimento, o gene da Leptina possui 3 exons e 2 introns, e apenas 615pb
participam da transcrição do gene. He et al. (1995) afirmam que apesar do gene da Leptina
possuir três exons, apenas o segundo e o terceiro exons participam da transcrição do gene.
Muitos polimorfismos vêm sendo estudados no gene da Leptina e alguns estão
associados a características de interesse econômico. Robert et al. (1998) detectaram
associação de polimorfismo no gene da Leptina com peso vivo de suínos e também
informaram que níveis altos de RNA mensageiro da Leptina estavam relacionados com
maior espessura de gordura subcutânea. Silva et al. (2012) encontraram associação
significativa entre o marcador E2FB (C→T) no exon 2 do gene da Leptina e espessura de
gordura subcutânea na garupa, ganho de peso e área de olho de lombo em bovinos da raça
Nelore. O mesmo marcador foi estudado por Nkrumah et al. (2004), os quais encontraram
também associação significativa para as características de espessura de gordura e ganho
22
de peso diário em bovinos. Shojaei et al. (2010) em pesquisas com ovinos da raça
Kermani, observaram alta densidade de polimorfismos no gene da Leptina. Os autores
identificaram 10 perfis genotípicos distintos, onde 8 deles foram associados ao ganho de
peso e peso vivo aos 3 e 12 meses de idade. Contudo, há poucos estudos de associação
de polimorfismo do gene da Leptina com características de interesse econômico em
ovinos, evidenciando a necessidade de pesquisar mais a influência e o impacto dos
polimorfismos neste gene sobre fenótipos de interesse.
Gene GH
O gene do hormônio de crescimento (GH) também é um forte candidato para
estudos de associação com características de interesse econômico na ovinocultura. O GH,
membro da família somatotropina/prolactina, é sintetizado e secretado pelas células
somatotropos (células da hipófise) da glândula pituitária anterior, sendo formado por uma
proteína de cadeia simples, onde na maioria das espécies é constituído por 191
aminoácidos (HOSSNER, 2005). Nos ovinos, o gene GH está localizado no cromossomo
11 e tem aproximadamente 1800 pb de extensão, sendo dividido em cinco exons e quatro
introns. O GH em ovinos possui 98,7% de similaridade com o da espécie bovina.
A síntese do GH é ativada com a presença de mais dois hormônios: a grelina,
produzida no estômago e o hormônio de liberação do GH (GHRH), produzido no
hipotálamo, estimulando também a secreção do GH pelas glândulas pituitárias (KOJIMA
et al., 1999). Porém a liberação do hormônio de crescimento depende da espécie, sexo e
idade do animal (HOSSNER, 2005). Hossner (2005) também explica que a liberação do
GH pode ser estimulada pelos níveis de glicose no sangue, pois níveis elevados de
insulina, IGF1, ácidos graxos livres e Leptina inibem a secreção de GH.
O gene GH atua em vários órgãos e sistemas, agindo sobre o crescimento pós-
natal e desenvolvimento em mamíferos, na lactação, na reprodução, mudanças nas
proteínas, lipídios e metabolismo de carboidratos, destacando-se como gene candidato
para a melhoria de produção de carne e leite (GLUCKMAN, et al., 1981; MIN et al.,
2005; AYUK e SHEPPARD, 2006; AKERS, 2006; HAJIHOSSEINLO e
NEGAHDARY, 2013). Os efeitos do GH para o desenvolvimento muscular, são
regulados na sua maioria pelo fator de crescimento semelhante à insulina (IGF1),
podendo ser mediados também pelo hipotálamo e outros fatores como o estado
nutricional, hormônios sexuais e função hepática (LE-ROITH et al., 2001; ZULU et al.,
23
2002; AYUK e SHEPPARD, 2006). O efeito do gene GH no crescimento pode ser
observado em vários tecidos (musculares, esqueléticos e adiposo). O efeito direto do GH
sobre o metabolismo de lipídio e proteína apresenta-se similar ao da insulina na produção
de cortisol nas ações lipolíticas. Contudo, o GH também participa da multiplicação celular
e das ações metabólicas associadas a deposição de proteína (SILVA et al., 2006; BOYD
e BAUMAN, 1989, apud HAJIHOSSEINLO e NEGAHDARY, 2013).
Pesquisas recentes mostram que polimorfismos no gene GH e IGF1 tiveram
associação significativa com peso vivo em diferentes idades em bovinos da raça Canchim
(PEREIRA et al., 2005). Zhou et al. (2005a) encontram associação entre polimorfismo no
gene GH e produção de leite em vacas da raça Holandesa. Cheng et al. (2000) ao estudar
suínos das raças Duroc, Landrace e Tao-yuan observaram associações de polimorfismo
no GH com o ganho de peso médio diário e eficiência de ganho de peso. Contudo, estudos
de associação de polimorfismo no gene GH com características de carcaça em ovinos não
foram encontrados.
Gene IGF1
Localizado no cromossomo 3 em ovelhas, o gene IGF1 possui aproximadamente
74.000 pares de base (pb). Ele divide-se em quatro exons e três introns, onde 591pb fazem
parte da transcrição do gene. A família do gene IGF é composta por três genes: IGF1,
IGF2 e a insulina, encontrados na circulação e fluidos extracelular. O IGF1 e o IGF2 são
muito importantes na diferenciação celular, na embriogênese, no crescimento e na
regulação do metabolismo, pois o IGF1 atua como receptor de muitos efeitos biológicos,
como a absorção de glucose, estímulo a miogênese, ativação de genes do ciclo celular
que induzem a síntese de lipídeos, na intervenção na síntese de DNA, proteína e a
propagação da molécula de RNA (ETHERTON, 2004; SIADKOWSKA et al., 2006;
MORADIAN et al., 2013).
O IGF1 são pequenos peptídeos que regulam muitos dos efeitos do gene GH. Este
gene desempenha um papel importante no crescimento e desenvolvimento dos animais.
Hossner (2005) cita que a ação do gene IGF1 possui efeitos semelhantes aos da insulina
sobre o metabolismo, efeitos de GH no crescimento dos animais e os efeitos sobre a
divisão e diferenciação de células em tecidos derivados do mesoderme embrionário.
Logo, o IGF1 está diretamente relacionado com a taxa de crescimento e produção de
24
carne em animais domésticos (IMAM-GHALI et al., 1991), podendo ser destacado como
gene candidato para programas de melhoramento animal.
O IGF1 vêm sendo estudado como gene candidato para a associação com as
características de ganho de peso nas diferentes idades na espécie bovina no Brasil. O gene
IGF1 já foi associado ao peso ao nascer, mas não influenciou os pesos à desmana e ao
sobreano (SILVA et al., 2006). Já Andrade et al. (2008) identificaram uma associação
entre polimorfismo no gene IGF1 e os pesos ao nascer, à desmama ajustado a 240 dias
em bovinos. Zhou et al. (2005b) associaram polimorfismo no gene IGF1 com
características de crescimento, aumento da massa muscular de peito diminuição da
gordura abdominal, e integridade do esqueleto em frangos. Em ovinos não há muitos
relatos de associação com o IGF1. Contudo, He et al. (2012) estudaram o gene IGF1
como gene candidato para a alta prolificidade em ovelhas, observando que os
polimorfismos encontrados neste gene poderiam ser usados em seleção assistida por
marcadores moleculares (MAS) em programas de melhoramento de ovinos.
Genes CAPN1 e CAST
O CAPN1 (calpaína) em ovinos está localizado no cromossomo 21 e possui
aproximadamente 25.000 pares de base (pb) e está dividido em 21 exons e 22 introns.
Enquanto o gene CAST (calpastatina) está localizado no cromossomo 5 com
aproximadamente 90KB, com 27 exons e 26 introns.
O gene CAPN1 codifica enzima proteolítica μ-calpaína, é também conhecido
como o gene da protease neutra ativada por cálcio, que degrada as proteínas miofibrilares
do músculo no período post-mortem (KOOHMARAIE, 1996; SMITH et al., 2000).
Segundo Warriss, (2000), as calpaínas são ativadas por íons de cálcio e tem atividade
máxima em condições alcalinas (pH próximo de 5). As calpaínas são divididas em dois
grupos, as que são ativadas por níveis milimolar de Ca2+ (m-calpains) e as de nível
micromolar (µ-calpains). Ambas são inibidas por uma terceira proteína chamada de
calpastatina, codificada pelo gene CAST, que impede a ligação das calpaínas às
membranas (LAWRENCE e FOWLER, 2002).
As calpaínas degradam específicamente as proteínas musculares, tais como a
titina, desmina e troponina T, assim como pequenas proteínas do músculo esquelético
(HOSSNER, 2005). A miosina é degradada lentamente pelas calpaínas, já a actina não
sofre nenhum efeito desta enzima. Assim, a ação das calpainas é de enfraquecimento do
25
disco Z do músculo (LAWRENCE e FOWLER, 2002; HOSSNER, 2005). Segundo Page
et al. (2002) o CAPN1 trata-se de um gene candidato para maciez da carne. Por outro
lado, a calpastatina inibi a maciez da carne (WARRISS, 2000). Estudos associando a
maciez da carne com polimorfismo identificados no gene CAPN1 e CAST já estão sendo
avaliados a algum tempo como pode ser visto em Fortes (2007), Curi et al. (2009) e
Pereira et al. (2015). Mais recentemente trabalhos tentando associar genótipos nos genes
da CAPN1 e CAST à qualidade de carne ovina foram publicados por Ranjbari et al.,
(2012). Contudo, não há relatos de polimorfismos afetando caraterísticas de carcaça em
ovinos.
26
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32
Capítulo 1
Polimorfismos no gene LEP e associações com atributos da carne e da carcaça de
ovinos Santa Inês
33
Polimorfismos no gene LEP e associações com atributos da carne e da carcaça de
ovinos Santa Inês
RESUMO
O objetivo deste estudo foi identificar polimorfismos no gene LEP (Leptina) em ovinos
da raça Santa Inês e testar se estão associados ao pH pós-abate (pH0) e 24 horas post
mortem (pH24), área de olho de lombo do músculo, caracterização cromática da carne
(L*, a* e b*), força de cisalhamento, perda de peso por cocção, pesos e rendimentos de
carcaças quente e fria, pesos e rendimentos de pescoço, perna, costelas, paleta e lombo,
comprimentos externo e interno da carcaça, comprimento da perna, larguras da carcaça
nas regiões do peito e da garupa, além de escores de conformação e acabamento de
gordura da carcaça. Foi sequenciado um fragmento com 2.045pb localizado entre os
exons dois e três do gene da leptina, no qual foram identificados 21 polimorfismos, sendo
nove polimorfismos identificados pela primeira vez em ovinos. O SNP g.92501206C>T
foi o único localizado em exon e trata-se de uma mutação sinônima, pois a troca do
nucleotídeo não alterou o aminoácido na sequência da proteína. Um total de 16 SNP,
todos em intron, apresentaram boa distribuição de frequência genotípica e foram
utilizados nos testes de associação. Foram consideradas associações significativas
aquelas cujo P<0,001593 e associações sugestivas aquelas cujos P<0,05. O SNP
g.92501372G>A apresentou efeito aditivo significativo para rendimento de pescoço e
efeito aditivo sugestivo para peso do pescoço. O SNP g.92501543A>G apresentou efeito
aditivo sugestivo para os rendimentos de carcaça quente e fria, comprimento interno da
carcaça, rendimento biológico e rendimento de pernil. O SNP g.92502947A>C teve
efeito aditivo sugestivo para rendimento verdadeiro. O SNP g.92503024G>A apresentou
efeito aditivo sugestivo para escore de terminação de carcaça. Por fim, o marcador g.
92503044A>G teve efeito aditivo sugestivo para L* e b*. Portanto, existem
polimorfismos no gene da Leptina que podem fornecer informações para programas de
seleção visando melhorar atributos de carcaça e carne em ovinos da raça Santa Inês.
Palavras-chave: marcadores moleculares, melhoramento animal, ovinocultura,
sequenciamento
34
Polymorphisms in the LEP gene and association with meat and carcass traits in
Santa Ines sheep
ABSTRACT
this study aimed to identify single nucleotide polymorphisms in the LEP gene (Leptin) in
Santa Ines sheep and testing association with pH post-slaughter (pH0) and 24 hours
postmortem (pH24), loin eye area of the Longissimus muscle, L*, a* and b* color
parameters, shear force, weight loss by cooking, weights and yields of hot and cold
carcasses, weights and yields of neck, leg, ribs, shoulder and loin, external and internal
carcass length, leg length, carcass widths in the breast and croup regions, as well as
carcass conformation and carcass finishing score. A 2.045bp fragment located between
exons two and three of the leptin gene was sequenced, in which 21 mutations were found,
nine mutations were identified for the first time in sheep. The SNP g.92501206C>T was
the only mutation in exon and it is a synonymous mutation, since the nucleotide exchange
did not alter the amino acid in the protein sequence. Sixteen SNPs, all in intron, showed
good genotype frequency distribution and were used in association tests. Significant
associations were those whose P<0.001593 and suggestive associations were those whose
P <0.05. The SNP g.92501372G>A showed significant additive effect for neck yield and
suggestive additive effect for neck weight. The SNP g.92501543A>G presented a
suggestive additive effect for hot and cold carcass yields, internal carcass length,
biological yield and leg yield. The SNP g.92502947A>C had suggestive additive effect
for true yield. The SNP g.92503024G>A presented a suggestive additive effect to the
carcass finishing score. Finally, the marker g.92503044A>G had suggestive additive
effect on L* e b* color parameters. Therefore, there are polymorphisms in the Leptin
gene that can provide information for selection programs of Santa Ines sheep for
improving carcass and meat traits.
Key words: molecular markers, animal breeding, sheep farming, sequencing
35
INTRODUÇÃO
A raça Santa Inês é formada por animais deslanados e possui atributos de
crescimento (JUCÁ et al., 2014) e carcaça (JUCÁ et al., 2016) que permitem explorá-la
para produção de carne. O principal objetivo dos programas de melhoramento da raça
Santa Inês sempre foi o aumento dos pesos e ganhos de peso. Tal objetivo vem sendo
alcançado via seleção, pois as estimativas de herdabilidade para pesos e ganhos de peso
nesta raça são moderadas (SOUSA et al., 1999; SARMENTO et al., 2006; e
CARVALHO et al., 2014). No entanto, atributos de carcaça não foram objeto de seleção
devido a necessidade de abater os animais, o que tem inviabilizado a seleção em grande
escala.
Informações moleculares podem ajudar a contornar essa dificuldade (GAO et al.,
2007) e neste contexto a abordagem de genes candidatos tem sido uma das principais
ferramentas nos estudos com ovinos. O sequenciamento do genoma ovino permitiu
ampliar o conhecimento da sequência de vários genes em ovinos (JIANG et al., 2014) e
facilitou o uso da estratégia de genes candidatos nesta espécie. Dentre as muitas
possibilidades, tem-se o gene da leptina (LEP). A Leptina é um hormônio produzido pelo
tecido adiposo e tem um papel importante na regulação do peso vivo em mamíferos
(FRIEDMAN et al., 2002), pois atua no controle do balanço energético e por isso
influencia o consumo de alimento, o impacta o peso vivo e a composição deste peso em
mamíferos. Zhang et al. (2005) e Klok et al., (2007) citam que deficiência deste hormônio
estão associados a problemas como obesidade, diabetes e até infertilidade. Logo, trata-se
de um hormônio que pode estar direta ou indiretamente ligado a várias funções
fisiológicas do organismo e por isso o gene LEP é um bom candidato a estudos de
associação, apesar de Altmann e Von Borell (2007) ressaltarem a necessidade de validar
resultados de associação.
Polimorfismos no gene LEP vem sendo testados em estudos de associação com
características de interesse econômico em ruminantes. Nkrumah et al., (2004) e Schenkel
et al., (2005) reportaram associações com características de carcaça em bovinos de corte.
Estudos com ovinos também reportaram associações com características reprodutivas
(BAKHTIAR et al., 2017), consumo de alimento (JONAS et al., 2016), crescimento
(SHOJAEI et al., 2010; TAHMOORESPUR et al., 2010; HAJIHOSSEINLO et al., 2012)
e carcaça (BARZEHKAR et al., 2009). Contudo, não há relatos sobre a avaliação de
atributos como rendimentos de carcaça e de cortes nobres. Além disso, os polimorfismos
reportados em prévios estudos com ovinos podem não ser os mesmos que explicam a
36
variação na raça Santa Inês. Portanto o presente estudo teve como objetivo identificar
polimorfismo no gene LEP em ovinos Santa Inês e testar se eles estão associados a
atributos de carcaça e qualidade de carne.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e fenótipos avaliados
Foram avaliados 191 cordeiros Santa Inês com aproximadamente 240 dias de
idade; Destes, 105 nasceram entre 2010 e 2012 no campo experimental Pedro Arle, da
Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Frei Paulo / Sergipe. Enquanto que os
outros 86 cordeiros foram criados na fazenda experimental da Escola de Veterinária
Medicina e Zootecnia da UFBA, localizada em São Gonçalo dos Campos / Bahia, todos
nascidos em 2014. Todos os animais tiveram o peso vivo ao abate (PV) aferido após jejum
prévio de 16 horas. Após o abate foram mensurados os pesos do sangue, da cabeça, das
patas, do aparelho reprodutor e da carcaça quente (PCQ). As vísceras foram pesadas
individualmente cheias e vazias, para determinação do conteúdo do trato gastrointestinal
e do peso do corpo vazio (PCV). Além disso, foram calculados os rendimentos (%) de
carcaça quente (RCQ = PCQ/PV x 100), verdadeiro (RV = PCQ/PCV x 100) e biológico
(RB = PCV/PV x 100). As carcaças foram resfriadas em câmara fria por 24 horas a 2° C
e pesadas para obtenção do peso da carcaça fria (PCF) e cálculo do seu rendimento RCF
(%) = PCF/PV x 100.
Foi mensurado o pH da carcaça até 45 minutos pós-abate (pH0) e 24 horas post
mortem (pH24) com o auxílio de um peagâmetro digital. Foi feito um corte no músculo
Longissimus dorsi entre a 12ª e 13ª costelas para a introdução do eletrodo do peagâmetro,
e realizado 3 medidas sequenciadas. A média das triplicatas foram usadas como valor das
características.
A caracterização cromática da carne foi realizada após o descongelamento dos
músculos Longissimus dorsi (4° C por 12h e posteriormente exposto a temperatura
ambiente por 30 minutos). Utilizou-se o colorímetro MINOLTA CR-400 atuando no
sistema CIE/Lab com fonte D65, ângulo de 10° e calibrado no branco. Foram apurados
os valores das coordenadas cromáticas, sendo L* a luminosidade (com valores de 0 para
preto a 100 para branco); a* a intensidade da cor vermelha (com valores negativos para
a cor verde e positivos para a cor vermelha); e b* a intensidade da cor amarela (com
37
valores negativos para a cor azul e positivos para a cor amarela). Foram feitas medidas
para cada lombo, sendo a média das triplicatas o valor utilizado.
Depois do descongelamento dos músculos Longissimus dorsi, em temperatura
ambiente, foi realizada a avaliação da maciez pela força de cisalhamento via Warner
Bratzler Shear Force. Para tal, utilizou-se um vazador cilíndrico do próprio equipamento,
com a finalidade de retirar cinco fragmentos da parte central das porções com
aproximadamente 1,27 cm de diâmetro; o corte foi perpendicularmente as suas fibras e
livre de gorduras e nervos. O pico da força do cisalhamento (kgf) foi anotado, e a média
das cinco amostras de cada lombo foi considerada a força de cisalhamento.
A perda de peso por cocção foi aferida direto de cinco pedaços do lombo de
aproximadamente 2,0 cm cada. Os bifes foram pesados e expostos ao calor, usando um
grill até atingir uma temperatura interna do centro geométrico de aproximadamente 71°C,
controlado pelo termopar equipado com leitor digital. O valor da característica de perda
de peso por cocção foi medido pela diferença de peso inicial e final das amostras, após
serem submetidas ao tratamento térmico e expressa em porcentagem.
As medidas morfométricas foram aferidas na carcaça com auxílio de fita métrica
e compasso, sendo o comprimento interno (distância máxima entre a borda cranial do
púbis e a borda cranial da primeira costela em seu ponto médio); comprimento externo
(distância máxima entre a articulação cérvico-torácica e a primeira articulação
intercoccígea); comprimento da perna (distância máxima entre o trocânter maior do fêmur
e a borda lateral da articulação tarso-metatarsiana); largura do tórax (largura máxima
mensurada ao nível das costelas); profundidade do tórax (distância máxima entre o
esterno e a cernelha); largura da garupa (largura máxima entre os trocânteres dos
fêmures); perímetro da garupa (perímetro tomando como base os trocânteres dos
fêmures). O índice de compacidade da carcaça foi calculado como a razão entre o peso
da carcaça fria e o comprimento interno da carcaça, expresso em kg/cm.
Para classificação e tipificação das carcaças foram determinados escores de um a
cinco, por observação visual, para a conformação e o acabamento das mesmas. Para a
conformação os escores foram atribuídos de acordo com o perfil da musculatura da
carcaça, sendo: escore 1 (perfil côncavo – conformação ruim); escore 2 (perfil retilíneo –
conformação razoável); escore 3 (perfil subconvexo – conformação boa); escore 4 (perfil
convexo – conformação muito boa) e escore 5 (perfil hiperconvexo – conformação
excelente). Para o acabamento foram atribuídos escores de acordo com a quantidade de
gordura de cobertura, sendo escore 1 (muito baixa quantidade – carcaça muito magra);
38
escore 2 (baixa quantidade – carcaça magra); escore 3 (média quantidade – carcaça
média); escore 4 (quantidade elevada – carcaça gorda) e escore 5 (quantidade muito
elevada – carcaça muito gorda).
A carcaça foi seccionada ao meio e na meia carcaça esquerda foi efetuado um
corte transversal à altura da 12a e 13a costelas para mensuração da área de olho de lombo
do músculo Longissimus dorsi, com o contorno da porção cranial do referido músculo em
folhas de transparências com caneta apropriada, para cálculo da área após a digitalização
das imagens em software computacional. A espessura de gordura subcutânea foi
mensurada acima do referido músculo com paquímetro. A espessura de gordura máxima
foi aferida a 11 cm da linha mediana do corpo com auxílio de fita métrica e paquímetro.
A meia carcaça esquerda foi subdividida em cinco cortes cárneos: paleta (base
óssea: escápula, úmero, rádio e ulna); pescoço (entre a primeira e a sétima vértebra
cervical); costela (entre a primeira e a 13a vértebra torácica); pernil (secção entre a última
vértebra lombar e a primeira sacra); e lombo (vértebras lombares e músculos desta
região). Foram calculados os rendimentos dos cortes cárneos em função do peso vivo ao
abate. Os lombos direito e esquerdo de cada animal foram dissecados e pesados. Os
rendimentos destes cortes foram calculados em função do peso da meia-carcaça. Os
valores médios e respectivos desvios-padrão de todas as variáveis analisadas no presente
estudo podem ser observados na Tabela 1.
Extração de DNA genômico e reação em cadeia da polimerase
Coletou-se 5 ml de sangue em tubos de vacutainer contendo EDTA. Logo após
foram armazenados e refrigerados a 4 ºC. Para então extrair leucócitos, seguindo o
protocolo descrito por Oliveira et al., (2007). Os leucócitos foram encaminhados à Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ / USP, onde foi realizada a extração do
DNA genômico, seguida da amplificação da região alvo e subsequentemente da
preparação da biblioteca. A extração de DNA foi realizada utilizando método de
precipitação de sal e soluções de proteinase K segundo Oliveira et al., (2007).
O desenho do primer para o gene da leptina foi feito com base na sequência
disponível no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) de
ovinos Genoma (Ovis aries), onde selecionou a região entre o segundo e terceiro exon do
gene.
39
Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas
Característica N Média DP
Peso de carcaça quente 185 16,08 3,72
Peso de carcaça fria 185 16,08 3,81
Rendimento de carcaça quente 185 46,50 14,45
Rendimento de carcaça fria 185 46,40 14,21
Rendimento verdadeiro 67 58,2 2,83
Rendimento biológico 67 76,56 3,17
Compacidade da carcaça 185 0,26 0,053
Escore de conformação de carcaça 185 2,22 0,35
Escore de terminação da carcaça 185 2,06 0,56
Comprimento interno da carcaça 185 60,47 5,78
Comprimento externo da carcaça 185 64,20 7,34
Comprimento do pernil 185 40,21 6,66
Perímetro da carcaça na região da garupa 185 60,69 11,27
Largura da carcaça na região da garupa 185 23,92 6,16
Largura da carcaça na região do tórax 185 22,59 10,21
Profundidade da carcaça na região do tórax 185 25,31 3,57
Peso da paleta 185 2,20 0,75
Rendimento da paleta 185 6,47 2,91
Peso do pescoço 185 1,12 0,39
Rendimento do pescoço 185 3,27 1,45
Peso da costela 184 3,25 1,19
Rendimento da costela 185 9,47 4,27
Peso do lombo 185 1,14 0,46
Rendimento do lombo 185 3,34 1,70
Peso da perna 176 3,71 1,80
Rendimento da perna 185 10,97 6,35
Peso do lombo desossado 144 0,59 0,38
Área de olho de lombo (cm2) 184 11,27 3,62
Espessura de gordura subcutânea 97 0,19 0,044
L* - luminosidade 181 44,69 4,31
a* - intensidade de vermelho 181 21,15 2,68
b* - intensidade de amarelo 185 8,49 1,82
Força de cisalhamento (kgf) 182 1,71 0,66
pH0 106 6,67 0,19
pH24 101 5,57 0,19
Perdas de peso por cocção (%) 180 15,23 5,53
O desenho dos oligonucleotídios foi realizado a partir do programa Primer 3
(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), que gerou possíveis sequências dos iniciadores. Para
testar a qualidade das sequências geradas e a escolha do primer, utilizou-se o net primer
(http://www.premierbiosoft.com). Após a escolha dos melhores primers forward e
reverse do gene, foi realizado o BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), que é
40
utilizado como uma ferramenta de busca para o alinhamento das sequências no NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para confirmar a similaridade com a espécie
Ovis aries e a região desejada.
Os primers utilizados para a amplificação da região alvo foram
5’GGACCCCTGTATCGATTCCT3’ forward e 3’CAAACTCAGGAGAGGGTGGA5’
reverse com 2045pb do tamanho de fragmento localizado entre o exon dois e três do gene.
Para a amplificação do fragmento utilizou-se um touch down com as seguintes condições:
desnaturação inicial de 98°C por 5 minutos, seguido de 20 ciclos com desnaturação a
98°C por 10 segundos, anelamento a 67°C descendo a 57°C variando em -0,5°C a cada
ciclo por 30 segundos e a extensão a 72°C por 3 minutos. Logo após os primeiros ciclos
seguiu-se com mais 20 ciclos para desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a
57°C por 30 segundos e a extensão a 72°C por 3 minutos, finalizando com uma extensão
final de 72°C por 5 minutos. Para a amplificação foram utilizados 15 ul de reação de
mistura contendo 0,3 mM de cada iniciador, Taq polimerase (Emeraldamp Max Hs
(Takara Bio, EUA) e 100 ng de DNA molde. A amplificação foi realizada pelo
termociclador Verity® (Applied Biosystems, EUA).
Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1% e as bandas
amplificadas foram coradas com GelRed (Biotium, EUA). O produto amplificado foi
avaliado quanto à presença de bandas desejadas, utilizando como controle positivo um
pool de DNA de ovelha da raça Santa Inês.
Purificação dos Amplificados
Após a amplificação das amostras, foi realizada a purificação dos amplicons, com
esferas magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA) e volume
recomendado para Agencourt AMPure XP (beads), homogenizando para as beads se
ligarem aos produtos de amplificados. Logo após esta etapa, realizou a purificação das
amostras com etanol 70% para remover os contaminates. Em seguida, o sedimento foi
diluído e as pérolas foram removidas.
As amostras foram diluídas a 2 nM, levando em consideração o tamanho em pares
de base do amplificado. As amostras foram quantificadas com fluorômetro Qubit® (Life
Technologies, USA), sendo diluído para 0,2 ng/μl e encaminhado para o preparo da
biblioteca e em seguida o sequenciamento.
41
Preparação e sequenciamento das bibliotecas
Para o preparo da biblioteca utilizou-se o kit Nextera® XT DNA Sample
Preparation e Nextera® XT Index (Illumina, San Diego, USA) e todas as etapas foram
realizadas com base no protocolo Nextera XT. O sequenciamento foi realizado na
plataforma MiSeq (Illumina, San Diego, USA) usando o kit MiSeq Reagent Kit v2
(500cycle).
Limpeza e alinhamento das reads
Após o sequenciamento, as qualidades das leituras foram verificadas pelo
software FastQC (www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/). Para a primeira filtragem
de dados, foi utilizado o software SeqyClean, versão 1.3.12 (ZHBANNIKOV et al.,
2013), adotando um parâmetro de qualidade de 24 (Phred score) para cada base e um
comprimento mínimo de 50 pb.
Após filtragem dos dados, foi realizado o alinhamento das reads contra o genoma
referência de ovinos depositado no NCBI Genoma Ovis aries (versão Oar_v4.0), com o
auxílio do programa Bowtie2 (LANGMEAD e SALZBERG, 2012).
Detecção de Polimorfismo
A detecção de polimorfismos (SNPs e INDELS) foi realizada com base na posição
no genoma de referência (Versão Oar_v4.0). Nesta etapa foi utilizado o software
SAMtools, versão 1.4 (LI e DURBIN, 2009). Em seguida, realizou-se a conversão dos
arquivos do formato SAM (do inglês, Sequence Alignment/Map) para o formato BAM.
Logo após fez-se a remoção das duplicatas de PCR, ordenamento das posições das
sequencias e index do arquivo ordenado. A chamada de variantes foi realizada usando a
opção mpileup do SAMtools cobrindo um valor definido para a qualidade do mapeamento
através da referência do genoma (-q20) e qualidade de filtragem ≥ 40 bases na escala de
Phred (-Q40). Finalmente utilizando o comando bcftools para converter o arquivo em
*.bcf para *.vcf, neste passo é executado o filtro que define a leitura de profundidade
máxima dos marcadores para a chamada. Neste caso, mais de 99.999 leituras para essa
variante. Este parâmetro (-D99999) é um valor superestimado para cobertura de variante.
A nomenclatura dos marcadores está de acordo com as regras definidas por
Human Genome Variation Society (HGVs).
42
Anotação estrutural
Por fim, realizou-se a anotação estrutural dos SNPs e INDELs usando a
ferramenta VEP (Variant Effect Predictor) para anotação funcional online, do Ensembl,
para identificar as localizações das mutações nas diferentes regiões do genoma (região
intergênica, exon, intron, sítio de splicing alternativo etc.) e prováveis efeitos funcionais
das variantes.
Determinação das frequências genotípicas e alélicas
As frequências de alelos e genótipos foram estimadas para cada loco por contagem
simples de alelos e genótipos, respectivamente, utilizando-se o software Statistical
Analysis System (SAS, 2004). O teste de Qui-quadrado foi utilizado para comparar as
frequências genotípicas e alélicas entre os dois grupos (Embrapa e UFBA) assumindo 5%
de probabilidade. Para tanto foi utilizado o PROC FREQ (SAS, 2004).
Testes de Associação
Os testes de associação foram realizados com o programa Qxpak 5 (PÉREZ-
ENCISO e MISZTAL, 2011), que realiza um teste razão de verossimilhanças entre um
modelo completo e um modelo reduzido. O modelo completo usado na análise de
variância para detectar o efeito de SNP foi: Y𝑖𝑗𝑘lm = 𝑢 + F𝑖 + Yj + Mk + ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 + β𝑖𝑗𝑘lm
Age + Al + Dm + 𝑒𝑖𝑗𝑘lm Onde: Y𝑖𝑗𝑘lm é o valor fenotípico da característica em análise; u é
a média geral dessa característica; F𝑖, Yj e Mk são efeitos fixos da fazenda, ano e mês de
nascimento, respectivamente; ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 e β𝑖𝑗𝑘lm Age são as covariáveis peso corporal e
idade no abate; Al e Dm são os efeitos aditivo e de dominância, respectivamente; e 𝑒𝑖𝑗𝑘lm
é o resíduo experimental. Já o modelo reduzido foi construído retirando-se do modelo
completo apenas o efeito que se deseja testar. A correção de Bonferroni foi usada para
estabelecer o nível de significância em 0,001391, mas efeitos sugestivos (P<0,05)
também são apresentados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O gene LEP em ovinos tem cerca de 16kb de comprimento e é dividido em 3
exons e dois introns, porém apenas os exons 2 e 3 participam da transcrição da proteína
funcional (HE et al., 1995). No presente estudo foi sequenciado um fragmento com
43
2045pb entre os exons dois e três do gene LEP, no qual foram identificados 21
polimorfismos (Tabela 2), sendo que 12 já estão depositados no NCBI e, portanto, nove
novos polimorfismos foram identificados no presente estudo.
O SNP g.92502367C>T é o único que está fixado nos animais do grupo UFBA
(Tabela 2), que são todos homozigotos CC. Os SNPs g.92502821C>T e g.92502987delA
estão praticamente fixados no grupo Embrapa. Sendo que este último também está
praticamente fixado no grupo UFBA. Também foram observadas diferenças (P<0,05)
entre os grupos estudados para as frequências alélicas e genotípicas dos marcadores
g.92501372G>A, g.92501407C>T, g.92501543A>G, g.92502245A>G,
g.92502283T>C, g.92502367C>T, g.92502623G>C, g.92502642A>G, g.92502663T>C,
g.92502821C>T, g.92502922G>T, g.92502947A>C, g.92503024G>A, g.92503025C>T
e g.92503086G>A (Tabela 2). Essas diferenças entre os grupos podem ser devidas a
diferenças no fluxo gênico de cada rebanho. A fazenda da Embrapa mantém um rebanho
fechado a cerca de 30 anos, enquanto os animais do grupo UFBA são oriundos de
rebanhos comerciais abertos. Assim, há variação nas frequências de alguns marcadores
aqui identificados e a resposta ao processo de seleção dependerá muito da frequência do
alelo favorável no rebanho sob seleção.
O SNP g.92501206C>T foi o único polimorfismo localizada em exon, mas é
considerada uma mutação sinônima, pois a troca do nucleotídeo não implica em mudança
de aminoácido, tirosina, na sequência da proteína. Este sNP não influencia, portanto, na
função da proteína sendo considerada uma mutação silenciosa. Polimorfismos no exon-2
do gene LEP vem sendo estudados em diferentes espécies, em especial uma troca C/T em
bovinos (BUCHANAN et al., 2002), a qual provoca a substituição de arginina por cisteína
e está associada a acabamento de gordura na carcaça. Outros autores também vêm
estudando mutações, no mesmo exon, associadas com diversas característica de interesse
zootécnico, como características de crescimento em peixe (WEI et al., 2013).
Polimorfismos em região de exon do gene LEP em ovinos são pouco comuns. Contudo,
Cauveri et al. (2014) estudando o exon 3 do gene LEP em ovinos da raça Nilagiri,
encontraram uma troca C/T com boa distribuição de frequências, sendo 0,77 CC e 0,23
CT, enquanto o genótipo TT não pareceu na população. Já nas raças Dorset e Suffolk,
Boucher et al. (2006) identificaram 3 SNPs, 2 em regiões de intron e 1 na região 3’ UTR
do gene, mas apenas a troca (A/G) no intron teve distribuição genotípica adequada para
realização de testes de associação.
44
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene LEP
Marcadores Número de Animais
Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.92501206C>T*
7 4 CC 6,7 4,7 C 6,7 4,7
- 0 0 CT 0,0 0,0 0,5626 T 93,3 95,3 0,4129
98 82 TT 93,3 95,3
g.92501356A>G**
21 12 AA 20,0 14,0 A 45,2 41,3
rs408463464 53 47 AG 50,5 54,7 0,5642 G 54,8 58,7 0,4313
31 27 GG 29,5 31,4
g.92501372G>A**
76 80 GG 72,4 93,0 G 82,4 96,5
rs419596134 21 6 GA 20,0 7,0 0,0007 A 17,6 3,5 <,0001
8 0 AA 7,6 0,0
g.92501407C>T**
79 29 CC 75,2 33,7 C 86,2 62,2
rs398357543 23 49 CT 21,9 57,0 <0,0001 T 13,8 37,8 <,0001
3 8 TT 2,9 9,3
g.92501438G>A
99 79 GG 94,3 91,9 G 97,1 95,9
rs409675427 6 7 GA 5,7 8,1 0,4966 A 2,9 4,1 0,5042
0 0 AA 0,0 0,0
g.92501543A>G**
19 2 AA 18,1 2,3 A 46,2 21,5
rs421064645 59 33 AG 56,2 38,4 <0,0001 G 53,8 78,5 <0,0001
27 51 GG 25,7 59,3
20 16 GG 19,0 18,6 G 44,3 43,6
g.92501808G>A** 53 43 GA 50,5 50,0 0,9838 A 55,7 56,4 0,8853 rs410864710
32 27 AA 30,5 31,4
85 29 AA 81,0 33,7 A 89,0 62,8
g.92502245A>G** 17 50 AG 16,2 58,1 <0,0001 G 11,0 37,2 <0,0001 rs422219521
3 7 GG 2,9 8,1
45
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene LEP
Continuação
Marcadores Número de Animais
Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.92502283T>C**
78 30 TT 74,3 34,9 T 85,7 63,4
rs400734857 24 49 TC 22,9 57,0 <0,0001 C 14,3 36,6 <0,0001
3 7 CC 2,9 8,1
g.92502367C>T
87 86 CC 82,9 100,0 C 90,5 100,0
rs423196216 16 0 CT 15,2 0,0 0,0003 T 9,5 0,0 <0,0001
2 0 TT 1,9 0,0
g.92502623G>C**
78 29 GG 74,3 33,7 G 85,7 62,8
- 24 50 GC 22,9 58,1 <0,0001 C 14,3 37,2 <0,0001
3 7 CC 2,9 8,1
g.92502642A>G**
78 51 AA 74,3 59,3 A 85,7 75,0
- 24 27 AG 22,9 31,4 0,0502 G 14,3 25,0 0,0104
3 8 GG 2,9 9,3
90 42 TT 85,7 48,8 T 91,4 69,8
g.92502663T>C** 12 36 TC 11,4 41,9 <0,0001 C 8,6 30,2 <0,0001 -
3 8 CC 2,9 9,3
104 73 CC 99,0 84,9 C 99,5 92,4
g.92502821C>T 1 13 CT 1,0 15,1 0,0002 T 0,5 7,6 0,0002 -
0 0 TT 0,0 0,0
47 66 GG 44,8 76,7 G 68,6 88,4
g.92502922G>T** 50 20 GT 47,6 23,3 <0,0001 T 31,4 11,6 <0,0001 -
8 0 TT 7,6 0,0
77 29 AA 73,3 33,7 A 85,2 62,8
g.92502947A>C** 25 50 AC 23,8 58,1 <0,0001 C 14,8 37,2 <0,0001 -
3 7 CC 2,9 8,1
46
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene LEP
Continuação
Marcadores Número de Animais
Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.92502987delA***
103 85 CACA 98,1 98,8 CA 98,6 99,4
1 1 CAC 1,0 1,2 0,6584 C 1,4 0,6 0,4236 -
1 0 CC 1,0 0,0
g.92503024G>A**
81 30 GG 77,1 34,9 G 87,1 63,4
21 49 GA 20,0 57,0 <0,0001 A 12,9 36,6 <0,0001 -
3 7 AA 2,9 8,1
g.92503025C>T**
80 30 CC 76,2 34,9 C 86,7 63,4 rs596008192
22 49 CT 21,0 57,0 <0,0001 T 13,3 36,6 <0,0001
3 7 TT 2,9 8,1
g.92503044A>G**
25 14 AA 23,8 16,3 A 46,7 43,0 rs429879457
48 46 AG 45,7 53,5 0,4161 G 53,3 57,0 0,4717
32 26 GG 30,5 30,2
g.92503086G>A**
80 30 GG 76,2 34,9 G 86,7 62,8 rs404287904
22 48 GA 21,0 55,8 <0,0001 A 13,3 37,2 <0,0001
3 8 AA 2,9 9,3
Prob. FG e Prog. FA – Probabilidades do teste qui-quadrado ao comparar os grupos Embrapa e UFBA quanto as frequências genotípicas e alélicas, respectivamente.
ID do cromossomo 4 que se localiza o gene da leptina no genoma de ovinos versão 4.0: NC_019461.2.
ID do gene da leptina no genoma de ovinos versão 4.0: 443534
*Mutação localizada no exon 2
**Marcadores usado no teste de associação
**INDEL
47
No presente estudo, 16 SNP, todos em região de intron, apresentaram frequência
em todos os três genótipos o que permitiu a utilização para estimar os efeitos aditivo e de
dominância nos testes de associação com características de interesse econômico. Apesar
destes SNPs estarem em região de intron, eles podem estar influenciando a expressão do
gene e dessa forma podem potencialmente influenciar características de interesse
econômico. No presente estudo quatro marcadores apresentaram ao menos efeito aditivo
sugestivo (P<0,05) com alguma característica de carcaça e qualidade de carne (Tabela 3),
mas efeitos de dominância não foram significativos (P>0,05).
Tabela 3. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-padrão (EP)
nos testes de associação com polimorfismos no gene LEP
Variável a(EP) LRT Prob.
g.92501372G>A
Peso do Pescoço 0,0964(0,0344) 7,69 0,556E-02
Rendimento de pescoço 0,7331(0,1898) 14,35 0,152E-03*
g.92501543A>G
Rendimento de carcaça quente 1,5847 (0,6990) 5,07 0,244E-01
Rendimento de carcaça fria 1,5133 (0,6837) 4,83 0,279E-01
Comprimento interno da carcaça 0,9147 (0,3731) 5,91 0,150E-01
Rendimento de perna -1,5589 (0,7238) 4,58 0,324E-01
Rendimento biológico 1,6453(0,5597) 8,13 0,436E-01
g.92502947A>C
Rendimento Verdadeiro -1,5064(0,5927) 6,17 0,130E-01
g.92503024G>A
Escore de Terminação de carcaça 0,1607 (0,0641) 6,18 0,129E-01
g. 92503044A>G
Intensidade de brilho (L*) -1.0885 (0.4349) 6,16 0,131E-01
Intensidade de amarelo (b*) -0.4449 (0.1903) 5.39 0.203E-01
LRT - Likelihood ratio test; Prob - Probabilidade do teste LRT
*Efeito significativo ao nível da correção de Bonferroni (P<0,001593)
O SNP g.92501372G>A apresentou efeito aditivo significativo ao nível da
correção de Bonferroni (P<0,001593) para rendimento de pescoço, e efeito aditivo
sugestivo (P<0,05) para peso do pescoço (Tabela 3). O alelo A foi o responsável por
aumentar o peso e o rendimento de pescoço e este alelo teve maior frequência no grupo
Embrapa quando comparado ao grupo UFBA (Tabela 2). O corte de pescoço não possui
grande valor comercial no mercado da carne ovina, logo em um processo de seleção o
alelo favorável seria o G. Este alelo está em grande frequência nos grupos estudados
(Tabela 2), pois 72,4% e 93% dos animais apresentam genótipo GG nos grupos Embrapa
e UFBA, respectivamente.
48
Já o SNP g.92501543A>G apresentou efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para os
rendimentos de carcaça quente e fria, comprimento interno da carcaça, rendimento de
pernil e rendimento biológico (Tabela 3). Neste caso o alelo A aumentou a média de todas
as variáveis, exceto o rendimento de pernil. Logo a seleção de animais AA pode ajudar a
ampliar os rendimentos de carcaça e biológico, mas a seleção para esse genótipo pode
diminuir o rendimento de pernil, o que não é desejável. A raça Santa Inês é formada por
animais que apresentam em média pernil com pouco desenvolvimento muscular (JUCÁ
et al., 2016), logo, ampliar o rendimento deste corte é um objetivo de seleção na raça.
Portanto, a informação desta associação deve ser considerada com cuidado nos processos
de seleção para evitar perdas de qualidade de carcaça, seja por diminuição do seu
rendimento ou por queda no rendimento de pernil. Ainda no contexto de rendimento, o
SNP g.92502947A>C teve efeito sobre o rendimento verdadeiro. Neste caso o alelo C
aumenta o valor médio dessas variáveis. As frequências genotípicas e alélicas desse
marcador diferem entre os grupos Embrapa e UFBA. Contudo, em ambos os grupos a
frequência do alelo C é consideravelmente menor que a do alelo A. Logo, trata-se de mais
um alelo favorável com baixa frequência e que, portanto, apresenta amplo espaço para a
seleção e obter ganhos com a ampliação de sua frequência.
Até o presente momento não é do conhecimento dos autores do presente estudo
que os rendimentos de carcaça ou de cortes nobres da carcaça e qualidade de carne
tenham sido avaliados em estudos de associação com ovinos. Contudo, Barzehkar et al.
(2009) reportaram associação de um polimorfismo no intron 2 de ovinos (A113G) com
peso de carcaça fria em ovinos das raças Iranianas Shal e Zel. Esse achado é um forte
indício de que os efeitos aditivos aqui encontrados para os SNP g.92501372G>A,
g.92501543A>G e g.92502947A>C, apesar de em muitos casos serem apenas sugestivos
(P<0,05), são de fato verdadeiros. Além disso, os efeitos de polimorfismos no gene LEP
sobre peso vivo e ganhos de peso em ovinos, reportados por Shojaei et al., (2010),
Tahmoorespur et al., (2010) e Hajihosseinlo et al., (2012), também são forte indício que
este gene pode ter efeito sobre características de carcaça em ovinos, pois estas variáveis
geralmente estão correlacionadas com peso vivo.
O SNP g.92503024G>A apresentou efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre
escore de acabamento da carcaça, tendo o alelo G aumentado o valor desse escore. Este
alelo tem grande frequência nos dois grupos estudados, sendo maior no grupo Embrapa.
O escore de acabamento de carcaça aqui avaliado é uma medida do nível de gordura
subcutânea na carcaça. A espessura de gordura subcutânea em ovinos Santa Inês é
49
pequena (JUCÁ et al., 2016) e geralmente inferior àquela observada em raças lanadas.
Isso é um problema para abate de animais jovens, pois a falta de gordura recobrindo a
carcaça pode causar perda de qualidade na carcaça durante o resfriamento. Assim, a
seleção de animais com o genótipo GG pode ajudar a ampliar a gordura de acabamento
na raça Santa Inês. As frequências desse genótipo são altas tanto no grupo Embrapa
quanto no grupo UFBA (Tabela 2), indicando que a raça tem um grande número de
animais com esse genótipo, mas essa frequência pode ser ampliada, pois também há
muitos animais AG nos dois grupos avaliados (Tabela 2).
Por fim, o SNP g. 92503044A>G teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre a
luminosidade da carne (L*) e intensidade da cor amarela (b*) (Tabela 3). O alelo G foi o
responsável pelo aumento dos valores dessas variáveis e as frequências alélicas e
genotípicas não diferem entre os dois grupos estudados (Tabela 2). A frequência do alelo
G é um pouco mais alta que a doa alelo A, mas ambos estão presentes em grande
frequência nos grupos estudados. Fatores como alimentação, pH, idade e raça
influenciam a cor da carne em ovinos (AMSA 2012) e por isso espera-se ampla variação
de valores dessas variáveis de cor, mesmo dentro de uma determinada raça.
Boucher et al. (2006) foi o primeiro estudo a reportar associação de polimorfismos
no gene LEP com características de interesse econômico em ovinos. Eles avaliaram
apenas três polimorfismos nas raças Suffolk e Dorset, sendo dois SNP no Intron 2
(A103G e C154T) e um na região 3’URT (C617G), tendo identificado associação do SNP
A103G com espessura de gordura subcutânea obtida por ultrassonografia do músculo
Longissimus dorsi. Apesar do polimorfismo reportado por Boucher et al. (2006) não ser
o mesmo avaliado no presente estudo, esse achado reforça a ideia de que o efeito aqui
encontrado seja real, apesar de não ter sido significativo a nível da correção de
Bonferroni. Barzehkar et al. (2009) também reportaram polimorfismo no intron 2 do gene
LEP (A113G) em ovinos da raça iraniana Shal associado a gordura corporal total e
deposição de gordura na calda. Esse achado é mais uma evidência de que polimorfismo
em região de intron do gene LEP de ovinos podem afetar deposição de gordura nesta
espécie. Além disso, em outras espécies como bovinos (OPRZADECK et al., 2005) e
suínos (FLORIS et al., 2004) também há relatos de efeito de polimorfismo em região de
intron do gene da Leptina afetando gordura subcutânea. Os estudos de expressão gênica
e de concentração plasmática de leptina em tecido adiposo também reforçam os achados
do presente estudo. Kumar et al. (1998) indicam que a expressão do RNAm da Leptina é
ligeiramente maior na gordura subcutânea de cordeiros, do que nas gorduras omental e
50
perirenal. Altman et al. (2006a) demonstraram que concentrações plasmáticas de Leptina
estão correlacionadas com tamanho das células de gordura em ovinos, mas (2006b)
reportam que o nível plasmático de Leptina está mais associado com gordura visceral do
que com gordura na carcaça de ovinos. Por outro lado, alta correlação entre a Leptina
plasmática e a gordura subcutânea (0,76) foi reportada por Bellman et al. (2004) em
bovinos da raça Charolês. Logo, há evidências de que a Leptina pode ter relação com a
gordura na carcaça de animais domésticos e por isso polimorfismos neste gene podem
ser uma útil informação no processo de seleção destes animais para terminação de
carcaça.
Os efeitos aditivos aqui reportados foram causados por mutações localizadas em
intron e não temos como afirmar neste momento qual o mecanismo de ação que essas
mutações utilizaram para afetar essas características. Uma possível hipótese é que essas
mutações estejam em desequilíbrio de ligação com mutações em região de exon, no
próprio gene LEP ou em outro gene próximo. Também não se pode descartar a hipótese
de que essas mutações em intron sejam de fato funcionais, pois mutações nos sítios de
junção de exon-intron (KRAWCZAK et al., 2006) ou mesmo afastadas deste sitio
(COOPER, 2010), mais ainda dentro de região de intron, podem afetar a transcrição do
gene ou a eficiência do splicing. Saravanaperumal et al., (2012) cita que um evento de
splicing no intron 5 do gene SCF (Stem cell factor) em ovinos levou a formação de dois
tipos de proteína SCF, uma solúvel e outra insolúvel, as quais possuem número diferente
de aminoácidos. Assim, maiores estudos devem ser desenvolvidos em busca de
identificar o mecanismo de ação que essas mutações em intron do gene LEP utilizam para
influenciar características de interesse econômico em ovinos.
CONCLUSÃO
O gene LEP em ovinos Santa Inês apresenta pelo menos 21 mutações em relação
a sequência do gene depositado no NCBI, sendo nove dessas mutações reportadas pela
primeira vez em ovinos.
O SNP g.92501206C>T foi o único polimorfismo localizado em exon, mas trata-
se de uma mutação sinônima, visto que a troca do nucleotídeo não altera o aminoácido na
sequência da proteína. Portanto, as regiões de Exon do gene LEP aparentemente estão
bem conservadas em ovinos Santa Inês.
Os SNP g.92501372G>A, g.92501543A>G, g.92502947A>C, g.92503024G>A e
g. 92503044A>G apresentaram efeito aditivo para pelo menos uma característica de
51
carcaça ou qualidade de carne aqui avaliada e, portanto, fornecem informações que
podem ser úteis para programas de seleção de ovinos da raça Santa Inês.
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55
Capítulo 2
Polimorfismos nos genes GH e IGF1 e associações com atributos da carne e da
carcaça de ovinos Santa Inês
56
Polimorfismos nos genes GH e IGF1 e associações com atributos da carne e da
carcaça de ovinos Santa Inês
RESUMO
Polimorfismos nos genes do hormônio do crecimento (GH) e do fator de
crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1) vem sendo testados para saber se estão
associados a caracteristicas de interesse econômico em animais de produção. Porém,
estudos dessa natureza com ovinos ainda são raros. Assim, este estudo teve como objetivo
identificar polimorfismos nos genes GH e IGF1 em ovinos da raça Santa Inês e testar se
estão associados ao pH pós-abate (pH0) e 24 horas post mortem (pH24), área de olho de
lombo do músculo Longissimus, caracterização cromática da carne (L*, a* e b*), força
de cisalhamento, perda de peso por cocção, pesos e aos rendimentos de carcaças quente
e fria, pesos e rendimentos de pescoço, perna, costelas, paleta e lombo, comprimentos
externo e interno da carcaça, comprimento da perna, larguras da carcaça nas regiões do
peito e da garupa, além de escores de conformação e acabamento de gordura da carcaça.
Dezoito polimorfismos foram identificados em região de intron do gene IGF1 e 21 no
gene GH, sendo 18 em intron e três em exon. Dentre os SNPs localizados no gene IGF1,
g.171108499T>G, g.171110428C>T, g.171111426G>A e g.171112496C>T tiveram
efeito sugestivo (P<0,05) para pelo menos uma das características em estudo. Além disso,
o SNP g.171108499T>G teve efeito significativo ao nível da correção de Bonferroni
(P<0,002023) para peso de carcaça fria e para os rendimentos de carcaça quente e fria. Já
para os SNPs localizados no gene GH, g.47486424T>C e g.47486819C>A apresentaram
efeito sugestivo (P<0,05) para diversas características. Além disso, observou-se efeito
significativo ao nível da correção de Bonferroni (P<0,002023) do SNP g.47486424T>C
sobre rendimento da perna e do SNP g.47486819C>A sobre peso e rendimento de costela,
peso e rendimento de lombo, peso de paleta e peso de perna. Logo, os genes IGF1 e GH
possuem mutações que podem fornecer importantes informações para o processo de
seleção da raça Santa Inês para melhoria de carcaça.
Palavras-chave: carcaça, ovinocultura, seleção, SNP, sequenciamento
57
Polymorphisms in the GH and IGF1 genes associated with meat and carcass traits
in Santa Ines sheep
ABSTRACT
Polymorphisms in the growth hormone (GH) and insulin-like growth factor-1 (IGF1)
genes have been tested to determine if they are associated with economic traits in farm
animals. However, studies of this nature with sheep are still rare. Thus, this study aimed
to identify polymorphisms in the GH and IGF1 genes in Santa Ines sheep and to test
whether they are associated with pH post-slaughter (pH0) and 24 hours post-mortem
(pH24), area of the Longissimus muscle, color parameters (L*, a* and b*), shear force,
weight loss by cooking, weights and yields of hot and cold carcasses, weights and yields
of neck, leg, ribs, shoulder and loin, external and internal carcass lengths, leg length,
carcass widths in the breast and croup regions, as well as conformation carcass score and
finishing carcass score. Eighteen polymorphisms were identified in the intron region of
the IGF1 gene, and 21 in the GH gene (18 in intron and 3 in exon). Among the SNPs
located in the IGF1 gene, g.171108499T>G, g.171110428C>T, g.171111426G>A and
g.171112496C>T had a suggestive effect (P<0.05) for at least one of the carcass and meat
traits under study. In addition, SNP g.171108499T>G had a significant effect (P
<0.002023) for cold carcass weight and for hot and cold carcass yields. For the SNPs in
the GH gene, g.47486424T>C and g.47486819C>A presented at least suggestive effect
(P<0.05) for several carcass traits. In addition, significant effect (P<0.002023) of the SNP
g.47486424T>C on leg yield and of the SNP g.47486819C>A on weights and yields of
rib and loin, and shoulder and leg weights were observed. Therefore, in the genes IGF1
and GH there are mutations that can provide important information for the selection of
the Santa Ines breed for improve meat and carcass traits.
Key words: carcass, ovine breeding, selection, SNP, sequencing
58
INTRODUÇÃO
Ovinos Santa Inês são deslanados e apresentam duas importantes características
para criação em sistema tropical, pois são mais resistentes ao calor (MCMANUS et al.,
2009) e a endoparasitos (MEXIA et al., 2011) que algumas raças lanadas. Seu
desempenho em sistema de criação a pasto (JUCÁ et al., 2014) e seus atributos de carne
(COSTA et al., 2015) e de carcaça (JUCÁ et al., 2016) foram objeto de estudo, onde é
possível observar que a raça necessita de seleção para aprimoramento das características
de carcaça. Contudo, essas variáveis são difíceis de melhorar pelos métodos clássicos de
seleção, pois apesar de terem coeficientes de herdabilidade de moderada a alta magnitude
(MORTIMER et al., 2010), são variáveis de difícil avaliação in vivo. Marcadores
moleculares podem auxiliar a seleção, ao identificar quais animais que apresentam
genótipo favorável para um determinado atributo de carcaça.
Polimorfismos nos genes do hormonio de crescimento (GH) e do fator de
crescimento semelhante a insulina 1 (IGF1) podem conter boas informações para o
processo de seleção, pois tratam-se de moleculas que estão envolvidas em diversas etapas
do metabolismo. Assim, alguns polimorfismos no gene GH em ovinos foram testados
para associação com peso vivo e medidas morfométricas (TAHMOORESPUR et al.,
2011; MORADIAN et al., 2013; JIA et al., 2014; MALEWA et al., 2014;
HAJIHOSSEINLO et al., 2015; CAUVERI et al., 2016; HAN et al., 2016; DEPISON et
al., 2017; e ABDELMONEIM et al. 2017), produção de leite (MARQUES et al., 2006;
VACCA et al., 2013; DETTORI et al., 2015), produção e qualidade de lã (FARAG et al.,
2016) e características de carcaça (GORLOV et al., 2017). Apesar de já haver prévios
estudos de associação entre polimorfismos no gene GH e características de carcaça em
ovinos, muitos fenótipos ainda não foram avaliados w polimorfismos em uma raça podem
não estar segregando em outra raça.
Polimorfismos no gene IGF1 foram testados para associação com persistência de
lactação (SCATÀ et al., 2010), prolificidade (HE et al., 2012) e variáveis de crescimento
(GHOLIBEIKIFARD et al., 2013; PROSKURA e SZEWCZUK, 2014; TRUKHACHEV
et al., 2016; NAZARI et al, 2016). Apesar de não haver relatos de polimorfismos
associados a características de carcaça em ovinos, níveis de expressão do IGF1 foram
associados com características de carcaça nesta espécie (SU et al., 2014; e SUN et al.,
2014). Além disso, Islam et al (2009) é um dos estudos que reportaram efeitos de
polimorfismos no gene IGF1 sobre características de carcaça em bovinos de corte.
Portanto, o gene IGF1 também é um potencial candidato para estudos de associação com
59
características de carcaça em ovinos e deve ser mais explorado em testes de associação.
Assim, o objetivo deste estudo foi identificar polimorfismos nos genes GH e IGF1 em
ovinos Santa Inês, descrever suas freqüências gênicas e genotípicas e testar se estão
associados com características de qualidade de carcaça.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e fenótipos avaliados
Foram avaliados 191 cordeiros Santa Inês com aproximadamente 240 dias de
idade; Destes, 105 nasceram entre 2010 e 2012 no campo experimental Pedro Arle, da
Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Frei Paulo / Sergipe. Enquanto que os
outros 86 cordeiros foram criados na fazenda experimental da Escola de Veterinária
Medicina e Zootecnia da UFBA, localizada em São Gonçalo dos Campos / Bahia, todos
nascidos em 2014. Todos os animais tiveram o peso vivo ao abate (PV) aferido após jejum
prévio de 16 horas. Após o abate foram mensurados os pesos do sangue, da cabeça, das
patas, do aparelho reprodutor e da carcaça quente (PCQ). As vísceras foram pesadas
individualmente cheias e vazias, para determinação do conteúdo do trato gastrointestinal
e do peso do corpo vazio (PCV). Além disso, foram calculados os rendimentos (%) de
carcaça quente (RCQ = PCQ/PV x 100), verdadeiro (RV = PCQ/PCV x 100) e biológico
(RB = PCV/PV x 100). As carcaças foram resfriadas em câmara fria por 24 horas a 2° C
e pesadas para obtenção do peso da carcaça fria (PCF) e cálculo do seu rendimento RCF
(%) = PCF/PV x 100.
Foi mensurado o pH da carcaça até 45 minutos pós-abate (pH0) e 24 horas post
mortem (pH24) com o auxílio de um peagâmetro digital. Foi feito um corte no músculo
Longissimus dorsi entre a 12ª e 13ª costelas para a introdução do eletrodo do peagâmetro,
e realizado 3 medidas sequenciadas. A média das triplicatas foram usadas como valor das
características.
A caracterização cromática da carne foi realizada após o descongelamento dos
músculos Longissimus dorsi (4° C por 12h e posteriormente exposto a temperatura
ambiente por 30 minutos). Utilizou-se o colorímetro MINOLTA CR-400 atuando no
sistema CIE/Lab com fonte D65, ângulo de 10° e calibrado no branco. Foram apurados
os valores das coordenadas cromáticas, sendo L* a luminosidade (com valores de 0 para
preto a 100 para branco); a* a intensidade da cor vermelha (com valores negativos para
60
a cor verde e positivos para a cor vermelha); e b* a intensidade da cor amarela (com
valores negativos para a cor azul e positivos para a cor amarela). Foram feitas medidas
para cada lombo, sendo a média das triplicatas o valor utilizado.
Depois do descongelamento dos músculos Longissimus dorsi, em temperatura
ambiente, foi realizada a avaliação da maciez pela força de cisalhamento via Warner
Bratzler Shear Force. Para tal, utilizou-se um vazador cilíndrico do próprio equipamento,
com a finalidade de retirar cinco fragmentos da parte central das porções com
aproximadamente 1,27 cm de diâmetro; o corte foi perpendicularmente as suas fibras e
livre de gorduras e nervos. O pico da força do cisalhamento (kgf) foi anotado, e a média
das cinco amostras de cada lombo foi considerada a força de cisalhamento.
A perda de peso por cocção foi aferida direto de cinco pedaços do lombo de
aproximadamente 2,0 cm cada. Os bifes foram pesados e expostos ao calor, usando um
grill até atingir uma temperatura interna do centro geométrico de aproximadamente 71°C,
controlado pelo termopar equipado com leitor digital. O valor da característica de perda
de peso por cocção foi medido pela diferença de peso inicial e final das amostras, após
serem submetidas ao tratamento térmico e expressa em porcentagem.
As medidas morfométricas foram aferidas na carcaça com auxílio de fita métrica
e compasso, sendo o comprimento interno (distância máxima entre a borda cranial do
púbis e a borda cranial da primeira costela em seu ponto médio); comprimento externo
(distância máxima entre a articulação cérvico-torácica e a primeira articulação
intercoccígea); comprimento da perna (distância máxima entre o trocânter maior do fêmur
e a borda lateral da articulação tarso-metatarsiana); largura do tórax (largura máxima
mensurada ao nível das costelas); profundidade do tórax (distância máxima entre o
esterno e a cernelha); largura da garupa (largura máxima entre os trocânteres dos
fêmures); perímetro da garupa (perímetro tomando como base os trocânteres dos
fêmures). O índice de compacidade da carcaça foi calculado como a razão entre o peso
da carcaça fria e o comprimento interno da carcaça, expresso em kg/cm.
Para classificação e tipificação das carcaças foram determinados escores de um a
cinco, por observação visual, para a conformação e o acabamento das mesmas. Para a
conformação os escores foram atribuídos de acordo com o perfil da musculatura da
carcaça, sendo: escore 1 (perfil côncavo – conformação ruim); escore 2 (perfil retilíneo –
conformação razoável); escore 3 (perfil subconvexo – conformação boa); escore 4 (perfil
convexo – conformação muito boa) e escore 5 (perfil hiperconvexo – conformação
excelente). Para o acabamento foram atribuídos escores de acordo com a quantidade de
61
gordura de cobertura, sendo escore 1 (muito baixa quantidade – carcaça muito magra);
escore 2 (baixa quantidade – carcaça magra); escore 3 (média quantidade – carcaça
média); escore 4 (quantidade elevada – carcaça gorda) e escore 5 (quantidade muito
elevada – carcaça muito gorda).
A carcaça foi seccionada ao meio e na meia carcaça esquerda foi efetuado um
corte transversal à altura da 12a e 13a costelas para mensuração da área de olho de lombo
do músculo Longissimus dorsi, com o contorno da porção cranial do referido músculo em
folhas de transparências com caneta apropriada, para cálculo da área após a digitalização
das imagens em software computacional. A espessura de gordura subcutânea foi
mensurada acima do referido músculo com paquímetro. A espessura de gordura máxima
foi aferida a 11 cm da linha mediana do corpo com auxílio de fita métrica e paquímetro.
A meia carcaça esquerda foi subdividida em cinco cortes cárneos: paleta (base
óssea: escápula, úmero, rádio e ulna); pescoço (entre a primeira e a sétima vértebra
cervical); costela (entre a primeira e a 13a vértebra torácica); pernil (secção entre a última
vértebra lombar e a primeira sacra); e lombo (vértebras lombares e músculos desta
região). Foram calculados os rendimentos dos cortes cárneos em função do peso vivo ao
abate. Os lombos direito e esquerdo de cada animal foram dissecados e pesados. Os
rendimentos destes cortes foram calculados em função do peso da meia-carcaça. Os
valores médios e respectivos desvios-padrão de todas as variáveis analisadas no presente
estudo podem ser observados na Tabela 1.
Extração de DNA genômico e reação em cadeia da polimerase
Uma amostra de 5 ml de sangue foi coletada em tubos vacutainer com EDTA,
sendo armazenadas e refrigerados a 4 ºC. Para extrair leucócitos foi seguido o protocolo
descrito por Oliveira et al., (2007). Os leucócitos foram encaminhados à Escola Superior
de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ / USP, onde foi realizada a extração do DNA
genômico, seguida da amplificação da região estudada e subsequentemente da preparação
da biblioteca. A extração de DNA foi realizada segundo Oliveira et al., (2007).
As regiões gênicas alvo foram escolhidas aleatoriamente e tendo em conta o
tamanho do gene e a distância entre os exons. O desenho dos primers para amplificação
dos fragmentos dos genes GH e IGF1 foi feito com base na sequência disponível no banco
de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) para o genoma de
ovinos (Ovis aries, versão Oar_v4.0).
62
Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas
Característica N Média DP
Peso de carcaça quente 185 16,08 3,72
Peso de carcaça fria 185 16,08 3,81
Rendimento de carcaça quente 185 46,50 14,45
Rendimento de carcaça fria 185 46,40 14,21
Rendimento verdadeiro 67 58,2 2,83
Rendimento biológico 67 76,56 3,17
Compacidade da carcaça 185 0,26 0,053
Escore de conformação de carcaça 185 2,22 0,35
Escore de terminação da carcaça 185 2,06 0,56
Comprimento interno da carcaça 185 60,47 5,78
Comprimento externo da carcaça 185 64,20 7,34
Comprimento do pernil 185 40,21 6,66
Perímetro da carcaça na região da garupa 185 60,69 11,27
Largura da carcaça na região da garupa 185 23,92 6,16
Largura da carcaça na região do tórax 185 22,59 10,21
Profundidade da carcaça na região do tórax 185 25,31 3,57
Peso da paleta 185 2,20 0,75
Rendimento da paleta 185 6,47 2,91
Peso do pescoço 185 1,12 0,39
Rendimento do pescoço 185 3,27 1,45
Peso da costela 184 3,25 1,19
Rendimento da costela 185 9,47 4,27
Peso do lombo 185 1,14 0,46
Rendimento do lombo 185 3,34 1,70
Peso da perna 176 3,71 1,80
Rendimento da perna 185 10,97 6,35
Peso do lombo desossado 144 0,59 0,38
Área de olho de lombo (cm2) 184 11,27 3,62
Espessura de gordura subcutânea 97 0,19 0,044
L* - luminosidade 181 44,69 4,31
a* - intensidade de vermelho 181 21,15 2,68
b* - intensidade de amarelo 185 8,49 1,82
Força de cisalhamento (kgf) 182 1,71 0,66
pH0 106 6,67 0,19
pH24 101 5,57 0,19
Perdas de peso por cocção (%) 180 15,23 5,53
O desenho do primer foi realizado a partir do programa Primer 3
(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), que gerou as possíveis sequências dos
oligonucleotídios. Para testar a qualidade das sequências geradas e a escolha do primer,
utilizou-se o net primer (http://www.premierbiosoft.com). Após a escolha dos melhores
primers forward e reverse de cada gene (Tabela 1), foi realizado o BLAST (Basic Local
63
Alignment Search Tool), que é utilizado como uma ferramenta de busca para o
alinhamento das sequências no NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para
confirmar a similaridade com a espécie Ovis aries e a região desejada.
Os ciclos de amplificação e os fragmentos de genes estão descritos na Tabela 1.
Para a amplificação foram utilizados 15 ul de reação de mistura contendo 0,3 mM de cada
iniciador, Taq polimerase (Emeraldamp Max Hs (Takara Bio, EUA)) e 100 ng de DNA
molde. A amplificação foi realizada pelo termociclador Verity® (Applied Biosystems,
EUA).
Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1% e as bandas
amplificadas foram coradas com GelRed (Biotium, EUA). O produto amplificado foi
avaliado quanto à presença de bandas desejadas contendo o número de pares de bases
indicados na Tabela 2, utilizando como controle positivo um pool de DNA de ovelha da
raça Santa Inês.
Purificação dos Amplificados
Após a amplificação das amostras, foi realizada a purificação dos amplicons. Para
a purificação utilizou-se esferas magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter,
USA), com o volume recomendado do Agencourt AMPure XP (beads) para o volume de
amostra, homogenizando bem para as beads se ligarem aos produtos de amplificados.
Logo após esta etapa, com o auxilio de uma placa magnetica, fez-se a lavagem das beads
mais os produtos de amplificados, utilizando etanol 70% para remover os contaminates.
Em seguida, o sedimento foi diluído e as pérolas foram removidas.
As amostras foram diluídas para 2 nM, levando em consideração o tamanho em
pares de base do amplificado. Logo após juntou-se as amostras em um pool com os genes
estudados. O pool foi quantificado com fluorômetro Qubit® (Life Technologies, USA),
sendo diluído para 0,2 ng/μl e encaminhado para o preparo da biblioteca e em seguida
para o sequenciamento.
64
Tabela 2. Primers Forward (F) e reverse (R) e ciclos de amplificação das regiões investigadas em cada gene
Primer Tamanho do amplificado
(bp)
Localização do primer no
genome ovino Ciclos de amplificação
IGF1-F GTG CTG CTT TTG TGA TTT CTT G 4550 Cromossomo 3 => Exon 1-2 1
IGF1-R GAT AGA AGA GAT GCG AGG AGG A
GH-F GCT GCT GAC ACC TTC AAA GA 1194 Cromossomo 11 => Exon 1-5 3
GH-R TGA CCC TCA GGT ACG TCT CC
Ciclo 1: PCR Touch-down – desnaturação inicial: 98 °C / 5 minutos, seguida de 10 ciclos de desnaturação a 98 °C / 10 segundos, anelamento de 61 °C a 56
°C, reduzindo -0.5°C a cada ciclo, por 30 segundos e extensão a 72 °C / 4 minutos. Seguindo de mais 30 ciclos com temperatura de desnaturação em 98 °C /10
segundos, anelamento a 56 °C / 30 segundos e extensão a 72 °C / 4 minutos, finalizando com extensão a 72 °C / 5 minutos;
Ciclo 2: PCR Touch-down – desnaturação inicial: 98 °C / 5 minutos, seguida de 20 ciclos de desnaturação a 98 °C / 10 segundos, anelamento de 63 °C a 53
°C, reduzindo -0.5°C a cada ciclo, por 30 segundos e extensão a 72 °C / 1 minuto. Seguindo de mais 20 ciclos com temperatura de desnaturação em 98 °C /10
segundos, anelamento a 53 °C / 30 segundos e extensão a 72 °C / 1 minuto, finalizando com extensão a 72 °C / 5 minutos;
65
Preparação e sequenciamento das bibliotecas
Para o preparo da biblioteca utilizou-se o kit Nextera® XT DNA Sample Preparation e
Nextera® XT Index (Illumina, San Diego, USA) e todas as etapas foram realizadas com base
no protocolo Nextera XT. O sequenciamento foi realizado na plataforma MiSeq (Illumina, San
Diego, USA) usando o MiSeq Reagent Kit v2 (500cycle).
Limpeza e alinhamento das reads
Após o sequenciamento, as qualidades das leituras foram verificadas pelo software
FastQC (www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/). Para a primeira filtragem de dados, foi
utilizado o software SeqyClean versão 1.3.12 (ZHBANNIKOV et al., 2013) assumindo um
parâmetro de qualidade de 24 (Phred score) para cada base e um comprimento mínimo de 50
pb.
Após filtragem dos dados, foi realizado o alinhamento das reads contra o genoma
referência de ovinos depositado no NCBI Genoma Ovis aries (Oar_v4.0), com o auxílio do
programa Bowtie2 (LANGMEAD e SALZBERG, 2012).
Anotação estrutural
Por fim realizou-se a anotação estrutural dos SNPs e INDELs usando a ferramenta
VEP (Variant Effect Predictor) para anotação funcional online, do Ensembl, para identificar as
localizações das mutações nas diferentes regiões do genoma (região intergênica, exon, intron,
sítio de scpling alternativo etc.) e prováveis efeitos funcionais das variantes.
Detecção de Polimorfismo
A detecção de polimorfismos (SNPs e INDELS) foi feita em cada um dos genes
selecionados com base na sua posição no genoma de referência (Oar_v4.0): IGF1 (171108381-
171112721 bp) e GH (47485801-47486981 pb). Nesta etapa foi utilizado o software SAMtools
- versão 1.4 (LI e DURBIN, 2009). Posteriormente, realizou-se a conversão dos arquivos em
formato SAM para o BAM. Logo após fez-se a remoção das duplicatas de PCR, ordenamento
das posições das sequencias e index do arquivo ordenado. A chamada de variantes foi realizada
usando a opção do comando mpileup do SAMtools cobrindo um valor definido para a qualidade
do mapeamento através da referência do genoma (-q20) e qualidade de filtragem ≥ 40 bases na
escala de Phred (-Q40). Finalmente, foi utilizada a opção de comando bcftools para converter
o arquivo em *.bcf para *.vcf, este passo é executado o filtro que define a leitura de
66
profundidade máxima dos marcadores para a chamada, neste caso, mais de 99.999 leituras para
essa variante.
Para nomear os polimorfismos foi utilizada as regras definidas pelo Human Genome
Variation Society (HGVs).
Determinação das frequências genotípicas e alélicas e testes estatísticos
As frequências de alelos e genótipos foram estimadas para cada loco por contagem
simples de alelos e genótipos, respectivamente, utilizando-se o software Statistical Analysis
System (SAS, 2004). O teste de Qui-quadrado foi utilizado para comparar as frequências
genotípicas e alélicas entre os dois grupos (Embrapa e UFBA) assumindo 5% de probabilidade.
Para tanto foi utilizado o PROC FREQ (SAS, 2004).
Testes de Associação
Os testes de associação foram realizados com o programa Qxpak 5 (PÉREZ-ENCISO e
MISZTAL, 2011), que realiza um teste razão de verossimilhanças entre um modelo completo
e um modelo reduzido. O modelo completo usado na análise de variância para detectar o efeito
de SNP foi: Y𝑖𝑗𝑘lm=𝑢+F𝑖+Yj+Mk+∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊+β𝑖𝑗𝑘lmAge+Al+Dm+𝑒𝑖𝑗𝑘lm Onde: Y𝑖𝑗𝑘lm é o valor
fenotípico da característica em análise; u é a média geral dessa característica; F𝑖, Yj e Mk são
efeitos fixos da fazenda, ano e mês de nascimento, respectivamente; ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 e β𝑖𝑗𝑘lm Age são
as covariáveis peso corporal e idade no abate; Al e Dm são os efeitos aditivo e de dominância,
respectivamente; e 𝑒𝑖𝑗𝑘lm é o resíduo experimental. Já o modelo reduzido foi construído
retirando-se do modelo completo apenas o efeito que se deseja testar. A correção de Bonferroni
foi usada para estabelecer o nível de significância em 0,002023 e associações com P<0,05 são
apresentadas e consideradas como sendo sugestivas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um total de 20 amostras do gene IGF1 não amplificaram, o que pode ser devido a
alguma mutação na região de alinhamento dos primers, nestes animais. Assim, 171 animais
foram sequenciados para o gene IGF1 e 191 animais para os genes GH. Após o controle de
qualidade, 18 polimorfismos foram identificados no gene IGF1 (Tabela 3) e 21 no gene GH
(Tabela 4), o que levou a uma densidade de 0,24 marcadores / Kb no gene IGF1 e de 11,13
marcadores / Kb no gene GH. Todos os 18 marcadores identificados no gene IGF1 estão
localizados no intron 1 e quatro deles (g.171108609C>A, g.171109001delA, g.171109002A>G
67
e g.171112488delCA) ainda não haviam sido depositados no NCBI. Já para o gene GH, 18
SNPs estão em intron e três em exon, sendo que os marcadores g.47485910G>C,
g.47486448T>G, g.47486453C>A, g.47486604G>A, g.47486832T>C, g.47486837A>T e
g.47486910G>T ainda não haviam sido depositados no NCBI.
Com relação ao gene IGF1, os polimorfismos g.171112440C>T e g.171112488delCA
estavam fixados no grupo UFBA (Tabela 3), da mesma forma que o SNP g.171109002A>G no
grupo Embrapa. Estas diferenças podem ocorrer devido a uma característica destes dois
rebanhos, enquanto a Embrapa é um rebanho fechado a mais de 30 anos, os animais do grupo
UFBA são provenientes de rebanhos comerciais abertos. Observa-se ainda que as frequências
genotípicas e alélicas dos marcadores g.171108499T>G, g.171108609C>A, g.171109151T>C,
g.171110428C>T, g.171110492C>T, g.171111015T>G, g.171111287C>T, g.171112440C>T
e g.171112488delCA, diferem (P<0,05) entre os rebanhos analisados (Tabela 3).
Os introns são sequências presentes no DNA que são transcritas em RNA total, mas em
uma das etapas do processo de maturação (splicing) são descartadas, não fazendo parte do RNA
mensageiro (mRNA). Sendo assim, os intron não codificam aminoácidos e não colaboram para
a formação de uma proteína. Porém Lewin (2004) cita que uma mutação no intron pode
influenciar a união dos exons inibindo o splicing e impedindo assim a formação do mRNA.
Portanto, apesar de muitos dos SNPs identificados estarem em região de intron, eles podem
estar envolvidos com mutações nas regiões regulatória do gene ou de genes próximos. Seis
marcadores do gene IGF1 (g.171108499T>G, g.171109262T>C, g.171110428C>T,
g.171111287C>T, g.171111426G>A e g.171112496C>T) apresentaram os três genótipos
possíveis e uma frequência (Tabela 3) que permitia estimar os efeitos aditivo e de dominância.
Por isso, estes foram os marcadores do IGF1 utilizados nos testes de associação.
Na Tabela 4 são apresentados os 21 marcadores identificados no gene GH. Os
polimorfismos g.47486149A>C, g.47486453C>A e g.47486781G>T estavam fixados nos
animais da UFBA, enquanto o SNP g.47486837A>T estavam fixados no grupo Embrapa,
indicando que para este gene também há variação genética entre os grupos estudados.
Observou-se ainda que os grupos UFBA e Embrapa diferem (P<0,05) quanto a frequências
genotípicas e alélicas dos marcadores g.47486059G>A, g.47486149A>C, g.47486322C>T,
g.47486453C>A, g.47486604G>A, g.47486781G>T, g.47486819C>A, g.47486832T>C,
g.47486837A>T, g.47486896A>G e g.47486914G>A (Tabela 4).
68
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene IGF1
Marcadores Número de Animais Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG)
Alelo
Frequência alélica
(%) Prob.
(FA)
Variação
existente no
NCBI Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.171108499T>G*
58 34 TT 67,4 40,0
0,0015
T 81,4 65,3
0,0008
24 43 TG 27,9 50,6 G 18,6 34,7 rs430457475
4 8 GG 4,7 9,4
g.171108609C>A
82 50 CC 95,3 58,8
<0,0001
C 97,7 79,4
<0,0001
4 35 CA 4,7 41,2 A 2,3 20,6 -
0 0 AA 0,0 0,0
g.171109001delA**
83 84 GAGA 96,5 98,8
0,3173
GA 98,3 99,4
3 1 GAA 3,5 1,2 A 1,7 0,6 0,3201 -
0 0 AA 0,0 0,0
g.171109002A>G
86 82 AA 100,0 96,5
0,2134
A 100,0 97,6
0 2 AG 0,0 2,4 G 0,0 2,4 0,0430 -
0 1 GG 0,0 1,2
g.171109151T>C
9 0 AA 10,5 0,0
0,0058
A 10,5 0,6
0 1 AC 0,0 1,2 C 89,5 99,4 <0,0001 rs410261231
77 84 CC 89,5 98,8
g.171109262T>C*
52 58 TT 60,5 68,2
0,5692
T 75,0 80,0
0,2683
25 20 TC 29,1 23,5 C 25,0 20,0 rs421621914
9 7 CC 10,5 8,2
79 82 CC 91,9 96,5 C 95,3 97,6
g.171110364C>G 6 2 CG 7,0 2,4 0,3588 G 4,7 2,4 0,2481 rs401398263
1 1 GG 1,2 1,2
28 12 CC 32,6 14,1 C 56,4 40,0
g.171110428C>T* 41 44 CT 47,7 51,8 0,0081 T 43,6 60,0 0,0024 rs412470350
17 29 TT 19,8 34,1
69
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene IGF1
Continuação
Marcadores Número de Animais Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG)
Alelo
Frequência alélica
(%) Prob.
(FA)
Variação
existente no
NCBI Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.171110492C>T
71 80 CC 82,6 94,1
0,0187
C 91,3 97,1
0,0228 rs402300271 15 5 CT 17,4 5,9 T 8,7 2,9
0 0 TT 0,0 0,0
g.171110600G>A
69 56 GG 80,2 65,9
0,0602
G 90,1 81,8
0,0262 rs418030625 17 27 GA 19,8 31,8 A 9,9 18,2
0 2 AA 0,0 2,4
g.171110688C>T
67 56 CC 77,9 65,9
0,0602
C 89,0 81,8
0,0599 rs425204511 19 27 CT 22,1 31,8 T 11,0 18,2
0 2 TT 0,0 2,4
g.171110860G>T
73 63 GG 84,9 74,1
0,1216
G 92,4 85,9
0,0509 rs403521045 13 20 GT 15,1 23,5 T 7,6 14,1
0 2 TT 0,0 2,4
g.171111015T>G
10 1 TT 11,6 1,2
0,0053
T 11,6 1,2
<0,0001 rs414846691 0 0 TG 0,0 0,0 G 88,4 98,8
76 84 GG 88,4 98,8
g.171111287C>T*
57 33 CC 66,3 38,8
0,0015
C 80,2 64,7
0,0013 rs430449367 24 44 CT 27,9 51,8 T 19,8 35,3
5 8 TT 5,8 9,4
18 7 GG 20,9 8,2
0,0633
G 37,2 27,1
0,0445 rs409110739 g.171111426G>A* 28 32 GA 32,6 37,6 A 62,8 72,9
40 46 AA 46,5 54,1
74 85 CC 86,0 100,0
0,0017
C 92,4 100,0
0,0003 rs421570650 g.171112440C>T 11 0 CT 12,8 0,0 T 7,6 0,0
1 0 TT 1,2 0,0
70
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene IGF1
Continuação
Marcadores Número de Animais Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG)
Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
existente no
NCBI Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.171112488delCA**
80 85 CCACCA 93,0 100,0
0,0132
CCA 96,5 100,0
6 0 CCAA 7,0 0,0 A 3,5 0,0 0,0140 -
0 0 AA 0,0 0,0
g.171112496C>T*
58 47 CC 67,4 55,3 C 78,5 73,5
19 31 CT 22,1 36,5 0,1179 T 21,5 26,5 0,2828 rs400113576
9 7 TT 10,5 8,2
Prob. FG e Prog. FA – Probabilidades do teste qui-quadrado ao comparar os grupos Embrapa e UFBA quanto as frequências genotípicas e alélicas, respectivamente.
ID do cromossomo 3 que se localiza o gene IGF1 no genoma de ovinos versão 4.0: NC_019460.2.
ID do gene IGF1 no genoma de ovinos versão 4.0: 443318
*Marcadores usado no teste de associação
**INDEL
71
Dentre os SNP detectados em região de exon do gene GH, o SNP g.47485910G>C é
uma mutação silenciosa localizada no Exon 5, pois a troca de base não altera o aminoácido
Treonina na sequência da proteína, enquanto as outras duas mutações em exon são não
sinônimas. As mutações não sinônimas são aquelas onde a troca do nucleotídeo muda a
sequência de aminoácidos na proteína, podendo ocorrer alteração da função da proteína. As
mutações não sinônimas podem ser classificadas em tolerável (quando a estrutura química do
novo aminoácido é similar ao anterior) ou não tolerável (quando os aminoácidos possuem
natureza química diferente) utilizando o escore SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) que é
gerado no programa VEP (Variant Effect Predictor) do Ensembl. O escore SIFT prediz se uma
troca de aminoácidos afeta a função da proteína. O SNP que apresenta o SIFT > 0,05 é
considerado tolerável, pois sua troca não vai alterar a função da proteína, mas mutações com
SIFT ≤ 0,05 são consideradas não toleráveis, uma vez que a troca de aminoácidos altera a
função da proteína podendo até inativar sua função (NG e HENIKOFF, 2003).
O SNP g.47486322C>T foi localizado no Exon 4 e pode ser considerado uma mutação
tolerável, pois seu escore SIFT foi 0,22, o que indica que a troca de Valina por Isoleucina na
sequência da proteína não prejudica a função da proteína. Já o SNP g.47486736C>T localizado
no Exon 3 pode ser considerado não tolerável, pois seu score SIFT foi 0,01, o que indica que a
troca do aminoácido arginina por histidina pode afetar a função da proteína.
No tocante aos testes de associação realizados com polimorfismos localizados no gene
IGF1, foram encontrados efeitos sugestivos (P<0,05) dos SNP g.171110428C>T,
g.171111426G>A e g.171112496C>T para perímetro da carcaça na região da garupa,
intensidade da cor vermelha (a*), intensidade da cor amarelo (b*), rendimento de costela e peso
do pescoço (Tabela 5). Já o SNP g.171108499T>G teve efeito significativo (P<0,002023) para
peso de carcaça fria e para os rendimentos de carcaça quente e fria (Tabela 5), além de efeitos
sugestivos (P<0,05) para comprimento interno da carcaça e peso de paleta.
72
Tabela 4. Frequências genotípica e alélica dos marcadores identificados no gene GH
Marcadores Número de Animais Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG)
Alelo
Frequência alélica
(%) Prob.
(FA)
Variação
existente no
NCBI Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.47485910G>C
103 85 GG 97,2 98,8
0,6114
G 98,1 99,4
0,2618
2 1 GC 1,9 1,2 C 1,9 0,6 -
1 0 CC 0,9 0,0
g.47485969G>A
103 82 GG 97,2 95,3
0,5032
G 98,6 97,7
0,5072
3 4 GA 2,8 4,7 A 1,4 2,3 rs397514078
0 0 AA 0,0 0,0
g.47486059G>A
104 78 GG 98,1 90,7
0,0215
G 99,1 95,3
0,0233
2 8 GA 1,9 9,3 A 0,9 4,7 rs397514077
0 0 AA 0,0 0,0
g.47486149A>C
63 86 AA 59,4 100,0
<0,0001
A 79,7 100,0
43 0 AC 40,6 0,0 C 20,3 0,0 <0,0001 rs397514076
0 0 CC 0,0 0,0
g.47486221T>C*
1 6 TT 0,9 7,0 T 47,2 51,7
98 77 TC 92,5 89,5 0,0587 C 52,8 48,3 0,3726 rs397514074
7 3 CC 6,6 3,5
g.47486322C>T
102 70 CC 96,2 81,4
0,0008
C 98,1 90,7
0,0011
4 16 CT 3,8 18,6 T 1,9 9,3 rs397514102
0 0 TT 0,0 0,0
22 17 CC 20,8 19,8 C 57,1 58,1
g.47486418C>G* 77 66 CG 72,6 76,7 0,6020 G 42,9 41,9 0,8338 rs397514073
7 3 GG 6,6 3,5
1 4 TT 0,9 4,7 T 47,2 50,6
g.47486424T>C* 98 79 TC 92,5 91,9 0,1833 C 52,8 49,4 0,5060 rs397514072
7 3 CC 6,6 3,5
73
Tabela 4. Frequências genotípica e alélica dos marcadores identificados no gene GH
Continuação
Marcadores Número de Animais Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG)
Alelo
Frequência alélica
(%) Prob.
(FA)
Variação
existente no
NCBI Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.47486448T>G
1 1 TT 0,9 1,2
0,4548
T 8,0 11,6
0,2333
15 18 TG 14,2 20,9 G 92,0 88,4 -
90 67 GG 84,9 77,9
g.47486453C>A
73 86 CC 68,9 100,0
<0,0001
C 84,4 100,0
<0,0001
33 0 CA 31,1 0,0 A 15,6 0,0 -
0 0 AA 0,0 0,0
g.47486604G>A
103 70 GG 97,2 81,4
0,0003
G 98,6 90,7
0,0004
3 16 GA 2,8 18,6 A 1,4 9,3 -
0 0 AA 0,0 0,0
g.47486736C>T
95 74 CC 89,6 86,0
0,4479
C 94,8 93,0
0,4628
11 12 CT 10,4 14,0 T 5,2 7,0 rs397514070
0 0 TT 0,0 0,0
.47486781G>T
88 86 GG 83,0 100,0
<0,0001
G 91,5 100,0
<0,0001
18 0 GT 17,0 0,0 T 8,5 0,0 rs397514069
0 0 TT 0,0 0,0
g.47486819C>A*
46 84 CC 43,4 97,7
<0,0001
C 69,3 98,8
<0,0001
55 2 CA 51,9 2,3 A 30,7 1,2 rs589527314
5 0 AA 4,7 0,0
103 68 TT 97,2 79,1 T 98,6 89,5
g.47486832T>C 3 18 TC 2,8 20,9 <0,0001 C 1,4 10,5 0,0001 -
0 0 CC 0,0 0,0
4 5 CC 3,8 5,8 C 6,1 9,3
g.47486836C>T* 5 6 CT 4,7 7,0 0,6241 T 93,9 90,7 0,2423 rs397514068
97 75 TT 91,5 87,2
74
Tabela 4. Frequências genotípica e alélica dos marcadores identificados no gene GH
Continuação
Marcadores Número de Animais Genótipos
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG)
Alelo
Frequência alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
existente no
NCBI Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.47486837A>T
106 82 AA 100,0 95,3
0,0248
A 100,0 97,7
0,0256
0 4 AT 0,0 4,7 T 0,0 2,3 -
0 0 TT 0,0 0,0
g.47486853C>T
98 84 CC 92,5 97,7
0,1054
C 96,2 98,8
0,1102
8 2 CT 7,5 2,3 T 3,8 1,2 rs397514066
0 0 TT 0,0 0,0
g.47486896A>G
78 84 AA 73,6 97,7
<0,0001
A 86,8 98,8
<0,0001
rs397514065
28 2 AG 26,4 2,3 G 13,2 1,2
0 0 GG 0,0 0,0
g.47486910G>T
69 66 GG 65,1 76,7
0,0789
G 82,5 88,4
0,1104
-
37 20 GT 34,9 23,3 T 17,5 11,6
0 0 TT 0,0 0,0
g.47486914G>A
78 84 GG 73,6 97,7
<0,0001
G 86,8 98,8
<0,0001
rs397514064
28 2 GA 26,4 2,3 A 13,2 1,2
0 0 AA 0,0 0,0
Prob. FG e Prog. FA – Probabilidades do teste qui-quadrado ao comparar os grupos Embrapa e UFBA quanto as frequências genotípicas e alélicas, respectivamente.
ID do cromossomo 11 que se localiza o gene GH genoma de ovinos versão 4.0: NC_019468.2.
ID do gene GH no genoma de ovinos versão 4.0: 443329
g.47485910G>C marcador localizado no exon 5; g.47486322C>T marcador localizado no exon 4; g.47486736C>T marcador localizado no exon 3
*Marcadores usado no teste de associação
75
Tabela 5. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-padrão (EP) nos
testes de associação
Variável a(EP) d(EP) LRT Prob.
IGF1
g.171108499T>G
Comprimento interno da carcaça -0,9265 (0,4223) - 4,74 0,294E-01
Rendimento verdadeiro 1,5942(0,6066) - 6,50 0,108E-01
Rendimento da carcaça fria -0,9799 (0,9164) 2,7613(1,1347) 14,26 0,801E-03*
Rendimento da carcaça quente -0,9982 (0,8972) 2,6585(1,1108) 14,22 0,818E-03*
Peso da carcaça fria -0,4081 (0,4005) 1,1876(0,4959) 13,61 0,111E-02*
Peso de paleta -0,0575 (0,0728) 0,1406 (0,0902) 6,47 0,390E-01
g.171110428C>T
Perímetro da carcaça na garupa -2,9285 (1,1473) - 6,39 0,115E-01
Intensidade de vermelho (a*) -0,7892 (0,2636) - 8,73 0,314E-02
Intensidade de amarelo (b*) -0,4345 (0,2142) - 4,06 0,439E-01
g.171111426G>A
Rendimento de costela 1,0003 (0,4588) - 4,69 0,304E-01
g.171112496C>T
Peso do pescoço 0,0567 (0,0278) - 4,10 0,429E-01
GH
g.47486424T>C
Largura da carcaça na garupa 3,4422 (1,2693) -3,4774 (1,3183) 11,11 0,386E-02
Peso da carcaça fria 1,5081 (0,6672) - 5,04 0,248E-01
Rendimento da carcaça fria 3,6665 (1,5287) - 5,66 0,144E-01
Peso da carcaça quente 1,2612 (0,6138) - 4,17 0,410E-01
Rendimento da carcaça quente 3,8536 (1,5625) - 5,98 0,173E-01
Rendimento de pernil -5,1736 (1,5775) - 10,44 0,123E-02*
g.47486819C>A
Peso de costela -0,4380 (0,1272) - 11,49 0,699E-03*
Rendimento de costela -2,2680 (0,6970) - 10,29 0,133E-02*
Peso do lombo -0,1893(0,0516) - 13,01 0,311E-03*
Rendimento do lombo -0,9423 (0,3259) - 8,17 0,425E-02
Peso de paleta -0,2265 (0,0779) - 8,27 0,402E-02
Rendimento de paleta -0,9424 (0,4184) - 5,01 0,253E-01
Peso de pernil -0,3960 (0,1375) - 8,10 0,443E-02
Peso de pescoço -0,0851 (0,0394) - 4,61 0,318E-01
Escore de terminação de carcaça -0,1700 (0,0839) - 4,06 0,439E-01
LRT - Likelihood ratio test; Prob. - Probabilidade do teste LRT. * - Associações significativas
ao nível da correção de Bonferroni (P<0,002023).
A garupa é uma região de grande importância para os animais, pois é no posterior
que estão localizados os cortes cárneos de maior valor comercial. Além disso, garupas de
maior amplitude facilitam o parto das ovelhas. Logo, para fins de melhoramento se deseja
76
ampliar o valor do perímetro da carcaça na região da garupa e, portanto, o alelo T do SNP
g.171110428C>T pode ser considerado favorável, pois é ele que aumenta a média dessa
variável. Observa-se na Tabela 3 que a frequência do alelo T difere (P<0,05) entre os
grupos UFBA e Embrapa, sendo maior no grupo UFBA. Percebe-se também um bom
equilíbrio nas frequências dos dois alelos desse SNP, o que indica amplo espaço para a
seleção a fim de aumentar a frequência do alelo T. Observa-se também que apesar da
frequência do alelo T ser próxima do alelo C, a frequência do genótipo TT não é tão alta,
o que deixa margem considerável para ampliação de sua frequência via seleção. Ressalta-
se que este mesmo marcador também apresentou efeito sugestivo (P<0,05) para as
intensidades das cores vermelho (a*) e amarelo (b*) e por isso também pode ter
implicações na qualidade da carne. Logo, para fins de melhoramento é necessário se ater
ao fato de que o alelo T também amplia as médias de a* e b* e o aumento de sua
frequência pode ter consequências não necessariamente desejáveis sobre esses
parâmetros de cor.
A costela é um corte comercial bastante valorizado em ovinos e por isso o objetivo
deve ser ampliar o valor médio do rendimento de costela. O alelo G do SNP
g.171111426G>A pode ajudar a atingir esse objetivo. As frequências genotípicas deste
marcador não diferem entre os grupos UFBA e Embrapa (Tabela 3), mas as frequências
alélicas diferem (P<0,05), sendo o alelo G menos frequente no grupo UFBA. Ressalta-se
que este alelo tem baixa frequência em ambos os grupos estudados e o genótipo GG
também é observado em menor número de animais que os outros genótipos. Logo, há
grande espaço para ampliar as frequências do alelo G e do genótipo GG na raça Santa
Inês, o que pode trazer bons ganhos em rendimento de costela.
O pescoço é um corte comercial pouco valorizado e por isso sua redução de
tamanho pode ajudar a ampliar o rendimento de outros cortes comerciais mais
valorizados. O alelo T do SNP g.171112496C>T diminuiu o peso do pescoço e por isso
sugere-se ampliar sua frequência. Percebe-se na Tabela 3 que as frequências genotípicas
e alélicas deste marcador não diferem (P>0,05) entre os grupos estudados. A frequência
do alelo T é consideravelmente menor que a do alelo C, enquanto o genótipo TT e menos
frequente que outros genótipos. Logo, trata-se de outro marcado em que há amplo espaço
para ampliar a frequência tanto do alelo quanto do genótipo desejáveis.
Por fim, o SNP g.171108499T>G teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre
comprimento interno da carcaça e rendimento verdadeiro, efeito de dominância
significativo (P<0,002023) para o peso da carcaça fria e os rendimentos das carcaças fria
77
e quente e efeito de dominância sugestivo para peso da paleta (Tabela 5). A princípio,
quanto maior for o valor médio dessas variáveis, melhor é para o sistema de produção.
Para os pesos de paleta e carcaça fria e os rendimentos de carcaça fria e quente, não há
um alelo favorável, pois não houve efeito aditivo, mas sim apenas um desvio devido a
dominância. Como os valores do efeito de dominância foram todos positivos nestas
associações, então a média dos animais heterozigotos é superior à média dos animais
homozigotos, logo a seleção deve ser no sentido de ampliar a frequência de animais TG.
Já para as variáveis comprimento interno de carcaça e rendimento verdadeiro, tem-se
efeito aditivo e neste caso há um alelo favorável. A média do rendimento verdadeiro foi
maior em animais TT e portanto o alelo favorável é o T, enquanto maior média de
comprimento interno de carcaça foi observada em animais GG. Logo, se o objetivo for
ampliar o valor médio dessa variável, então o alelo favorável seria o G. As frequências
genotípica e alélica deste marcador diferem (P<),05) entre os grupos UFBA e Embrapa
(Tabela 3). Em ambos os grupos o alelo G é menos frequente que o alelo T, sendo ainda
menos frequente no grupo Embrapa. O genótipo TG é pouco frequente no grupo Embrapa
e bem mais frequente no grupo UFBA. Ressalta-se que o grupo UFBA é formado de
animais que são de rebanhos comerciais abertos e submetidos a processos mais intensos
de seleção, enquanto o grupo Embrapa é formado por animais que estão em um rebanho
fechado há pelo menos 30 anos, onde se espera realmente menos heterozigose.
Até o presente momento poucos estudos reportaram associação entre
polimorfismos no gene IGF1 e características de interesse econômico em ovinos.
Proskura et al. (2014) testaram se o SNP g.271C>T no gene IGF1 estava associado a
pesos e ganhos de peso de ovinos da raça Pomeranian Coarsewool, mas não encontraram
efeito significativo (P>0,05). Gholibeikifard et al., (2013) testaram se polimorfismo no
exon-2 do gene IGF1 afetava pesos em diferentes idades nos ovinos da raça Iraniana
Baluchi e também não encontraram efeito significativo (P>0,05). Nazari et al. (2016)
testaram polimorfismo no Exon-1 do gene IGF1 em ovinos da raça Iraniana Zandi e
também não encontraram efeito sobre peso e ganho de peso. Contudo, efeitos
significativos foram reportados por Trukhachev et al., (2016), que avaliaram 18 SNP no
gene IGF1 em ovinos da raça Russian Soviet Merino, sendo apenas um localizado em
exon e os demais nos introns, e encontraram que os SNP c.-5363C>T, c.-5188G>C, c.-
5186G>A e c.-4088G>A da região 5’UTR do intron-1 estavam associados a peso vivo,
com maiores médias observadas em animais heterozigotos. Enquanto o SNP c.-91A>C
teve efeito sobre peso vivo, alturas na cernelha e na garupa, além de largura e
78
comprimento de garupa. Efeitos significativos para prolificidade (HE et al., 2012) e
persistência de lactação (SCATÀ et al., 2010) também foram reportados em ovinos.
Logo, até onde sabemos, o presente estudo é o primeiro a reportar efeito de SNP no gene
IGF1 afetando características de carcaça em ovinos. Su et al., (2014) reportaram que a
expressão gênica do IGF1 no músculo Longissimus dorsi estava positivamente e
significativamente correlacionada com o diâmetro das fibras musculares, o que indica que
polimorfismos neste gene podem afetar produção de carne em ovinos. Enquanto, Sun et
al. (2014) reportaram que o nível de expressão gênica do IGF1 estava positivamente
correlacionado (P<0,01) com peso vivo e peso de carcaça (P<0,05) em ovinos da raça Hu,
o que reforça os achados do presente estudo.
Os testes de associação com polimorfismos no gene GH indicaram que o SNP
g.47486424T>C apresentou efeito sugestivo (P<0,05) para pesos e rendimentos de
caraças quente e fria e largura de carcaça na região da garupa (Tabela 5), além de efeito
significativo (P<0,002023) para rendimento de pernil. Enquanto o SNP g.47486819C>A
teve efeito sugestivo (P<0,05) para escore de terminação de carcaça, rendimento de
lombo, peso e rendimento de paleta e pesos de pernil e pescoço (Tabela 5), além de efeito
significativo (P<0,002023) para peso e rendimento de costela e peso de lombo.
As variáveis afetadas pelo SNP g.47486424T>C são de grande importância
comercial para o sistema de produção ovina e maiores valores médios são desejáveis. Os
pesos e rendimentos de carcaça quente e fria e a largura da carcaça na região da garupa
foram maiores em animais TT, indicando que o alelo que aumenta o valor dessas variáveis
é o T. Já para rendimento de pernil, maiores médias foram observadas em animais CC,
indicando o alelo C como favorável. Portanto, a seleção com base na informação deste
marcador é complexa e não permitirá ampliar o valor médio de todas as seis variáveis
simultaneamente. Logo, a seleção para qualquer um destes alelos deve ser acompanhado
de um monitoramento da média de todas as variáveis a fim de evitar que perdas
aconteçam. As frequências alélicas e genotípicas deste marcador não diferiram entre os
dois grupos estudados, e as frequências dos alelos T e C são muito parecidas (Tabela 4).
Logo, o processo de seleção para os alelos deste marcador pode trazer bons ganhos nas
variáveis estudadas, visto haver amplo espaço para ampliação da frequência alélica tanto
de T quanto de C.
O objetivo de seleção é aumentar a média das variáveis que estão sob efeito aditivo
do SNP g.47486819C>A (Tabela 5), com exceção do peso de pescoço. O alelo que
aumenta a médias de todas as variáveis neste caso é o A e a seleção deve buscar aumentar
79
a frequência do genótipo AA. As frequências alélicas e genotípicas deste SNP diferem
entre os grupos UFBA e Embrapa, sendo o alelo C bem mais frequência do que o A em
ambos os grupos, mas consideravelmente maior no grupo UFBA. Assim, o objetivo de
ampliar a frequência do genótipo AA via seleção pode trazer importantes ganhos em
qualidade de carcaça dos ovinos Santa Inês.
Associações de polimorfismos no gene GH e características de interesse
econômico em ovinos foram objetivo de vários estudos. Há relatos de polimorfismos no
gene GH associados com produção e qualidade de leite (VACCA et al., 2013; DETTORI
et al., 2015; MARQUES et al., 2006) e qualidade de lã (FARAG et al., 2016), mas
principalmente com características de crescimento, como pesos e ganhos de peso e
medidas morfométricas. Moradian et al., (2013) reportaram efeito de polimorfismo
(SSCP) no Exon-4 do gene GH afetando peso em diferentes idades nos ovinos da raça
Makooei. Malewa et al. (2014) identificaram um polimorfismo (PCR-RFLP) com efeito
sobre peso a desmama e taxa de crescimento em ovinos das raças Donggala e East Java.
Jia et al., (2014) reportaram polimorfismos (SSCP) nas regiões reguladora 5’, Exon-4 e
3’UTR afetando peso vivo, comprimento e altura do corpo e largura do peito em ovinos
das raças Tibetan e Poll Dorset. Hajihosseinlo et al., (2015) identificaram polimorfismo
(PCR-SSCP) no gene GH em ovinos da raça Makooei associados a comprimento e largura
da calda, além de espessura de gordura na mesma. Cauveri et al., (2016) encontraram
associação entre o SNP 480G>A (intron-1) com peso a desmama e ganho de peso pré-
desmama em ovinos da raça Nilagiri. Han et al. (2016) reportaram efeitos dos SNP
g.616G>A (intron 2) e g.498G>C (exon 2) sobre peso e medidas morfométricas de ovinos
de raças chinesas. Depison et al., (2017) reportaram associações entre polimorfismos
(RFLP) no gene GH e peso vivo, ganho diário de peso e medidas morfométricas em
ovinos de raças da província de Jambi, na Indonésia. Enquanto Abdelmoneim et al.
(2017) reportaram polimorfismos no intron-2 (G871A), exon-4 (G1383A) e intron-4
(A1509G) do gene GH associados a peso vivo e ganho de peso em ovinos da raça Harri,
na Arábia Saudita.
Se há tantos resultados indicando polimorfismos no gene GH afetando
características de crescimento é de se esperar que também existam efeitos sobre atributos
de carcaça, já que eles estão em algum nível correlacionados com o peso vivo dos animais.
Contudo, características de carcaça foram pouco exploradas em testes de associação com
polimorfismos no gene GH em ovinos. Gorlov et al., (2017) foram os únicos a reportar
efeito de polimorfismo no gene GH associado a características de carcaça, além de
80
relatarem efeito para peso vivo e ganho de peso. Dentre os atributos de carcaça eles
identificaram efeito sobre peso de carne na meia carcaça, rendimento de carcaça e pesos
do coração e do rim em ovinos da raça Salsk, na Rússia. Logo, o presente estudo é mais
um a reforçar a hipótese de que polimorfismos no gene GH influenciam características de
carcaça em ovinos, com a diferença de termos identificado as trocas de base que causam
os efeitos.
Todos os polimorfismos aqui identificados nos genes IGF1 e GH e associados a
atributos de carcaça, estão localizados em região de intron. Mais estudos serão
necessários para definir qual o mecanismo de ação utilizado por estes polimorfismos para
afetar essas variáveis. Contudo, algumas hipóteses podem ser lançadas. É possível que
estes polimorfismos estejam em desequilíbrio de ligação com outros polimorfismos
posicionados em exons nestes genes ou em outros genes vizinhos. Também não se pode
descartar a hipótese de que essas mutações em intron sejam de fato funcionais, pois
mutações nos sítios de junção de exon-intron (KRAWCZAK et al., 2006) ou mesmo um
pouco afastadas deste sitio (COOPER, 2010), mais ainda dentro de região de intron,
podem afetar a transcrição do gene ou a eficiência do splicing. Saravanaperumal et al.,
(2012) cita que um evento de splicing no intron 5 do gene SCF (Stem cell factor) em
ovinos levou a formação de dois tipos de proteína SCF, uma solúvel e outra insolúvel, as
quais possuem número diferente de aminoácidos. Assim, maiores estudos devem ser
desenvolvidos em busca de elucidar o mecanismo de ação que essas mutações em intron
dos genes IGF1 e GH utilizam para influenciar atributos de carcaça em ovinos. De
qualquer forma, os achados do presente estudo indicam potencial de uso de
polimorfismos nestes genes em programas de seleção para melhoria de variáveis de
qualidade de carcaça em ovinos, especialmente na raça Santa Inês.
CONCLUSÕES
Existem pelo menos 18 mutações em região de intron do gene IGF1 e 21 no gene
GH (18 em intron e três em exon) em ovinos da raça Santa Inês, sendo que 11 mutações
(seis no IGF1 e cinco no GH) apresentam boa distribuição de frequências para uso em
testes de associação.
Para muitas mutações as frequências genotípicas e alélicas diferem entre os grupos
de animais UFBA e Embrapa, o que evidenciou diferenças de fluxo gênico entre os
grupos. Fato já esperado em função do grupo Embrapa ser um rebanho fechado há pelo
81
menos 30 anos, enquanto o grupo UFBA é um rebanho comercial aberto e, portanto, com
maior fluxo gênico que o rebanho Embrapa.
Os SNPs g.171108499T>G, g.171110428C>T, g.171111426G>A e
g.171112496C>T localizados no gene IGF1 e os SNPs g.47486424T>C e
g.47486819C>A localizados no gene GH apresentaram efeito sobre vários fenótipos aqui
estudados. Logo, fornecem importantes informações para programas de seleção em
ovinos da raça Santa Inês, além de serem fontes de informação para estudos de validação
em outras raças de ovinos.
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85
Capítulo 3
Polimorfismo nos genes CAPN1 e CAST associados a atributos da carne e da
carcaça em ovinos Santa Inês
86
Polimorfismo nos genes CAPN1 e CAST associados a atributos da carne e da
carcaça em ovinos Santa Inês
RESUMO
O objetivo deste estudo foi identificar e descrever as freqüências alélicas e
genotípicas de polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 em 191 ovinos da raça Santa
Inês e testar se estão associados ao pH pós-abate (pH0) e 24 horas post mortem (pH24),
área de olho de lombo do músculo Longissimus dorsi, caracterização cromática da carne
(L*, a* e b*), força de cisalhamento, perda de peso por cocção, pesos e rendimentos das
carcaças quente e fria, pesos e rendimentos de pescoço, perna, costelas, paleta e lombo,
comprimentos externo e interno da carcaça, comprimento da perna, larguras da carcaça
nas regiões do peito e da garupa, além de escores de conformação e acabamento de
gordura da carcaça. Foram identificados 58 SNPs no gene CAST e 45 no gene CAPN1. A
maioria dos marcadores foram identificados em região de intron e dois marcadores,
g.93396113G>A no gene CAST e g.42628678C>T no gene CAPN1, foram identificados
em exon, mas ambas são mutações sinônimas. Um total de 13 SNPs no gene CAST e 11
no CAPN1 ainda não haviam sido depositadas no NCBI. Os SNPs g.93395190A>T,
g.93395218A>G, g.93395243T>G, g.93395307T>C, g.93395469G>C,
g.93395478G>A, g.93395835G>A, g.93396080A>G, g.93396154T>C,
g.93396162T>C, g.93396257T>C, g.93396809G>A, g.93397179G>A, g.93397600C>G,
g.93397718C>T e g.93397780T>C no gene CAST apresentaram efeito aditivo sugestivo
(P<0,05) para pelo menos um atributo dentre aqueles avaliados. Já para o gene CAPN1
foram os SNPs g.42625446C>T, g.42625811G>A, g.42626685G>A, g.42626996T>C,
g.42627301T>C, g.42627413T>C, g.42627702G>C, g.42628173T>C e g.42628421A>G
que apresentaram efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para pelo menos uma das
características estudadas. Estes SNPs são potenciais marcadores para programas de
seleção em ovinos Santa Inês, mas ressalta-se que para muitos destes SNPs há variação
de frequências genotípicas e alélicas entre os rebanhos Santa Inês e a resposta a seleção
dependerá dessas frequências.
Palavras-chave: carcaça, ovinocultura, seleção, SNP, sequenciamento
87
Polymorphism in the CAPN1 and CAST genes associated with meat and carcass
quality traits in Santa Ines sheep
ABSTRACT
this study aimed identifying allelic and genotypic frequencies of polymorphisms in the
CAST and CAPN1 genes in 191 Santa Ines sheep and to test whether they are associated
with pH values post-slaughter (pH0) and 24 hours post-mortem (pH24), color parameters
(L*, a* and b*), shear force, weight loss by cooking, weights and yields of hot and cold
carcasses, weights and yields of neck, leg, ribs, shoulder and loin, external and internal
carcass lengths, leg length, carcass widths in the breast and croup regions, as well as
carcass conformation score and finishing carcass score. We identified 58 SNPs in the
CAST gene and 45 in the CAPN1 gene. Most markers were identified in the intron region
and two markers, g.93396113G>A in the CAST gene and g.42628678C>T in the CAPN1
gene, were identified in exon, but both are synonymous mutations. A total of 13 SNPs in
the CAST gene and 11 in CAPN1 had not yet been deposited in NCBI. The SNPs
G.93395228A>G, g.93395248A>G, g.93395307T>C, g.93395469G>C,
g.93395478G>A, g.93395835G>A, g.93395608A>G.93396169C>G, g.93397718C>T
and g.93397780T>C, g.93396809G>A, g.93397179G>A, g.93397600C>T and
g.93397780T>C in the CAST had additive suggestive effect (P<0.05) for at least one
phenotypic trait. For the CAPN1 gene, the SNPs g.42625446C>T, g.42625811G>A,
g.42626685G>A, g.42626996T>C, g.42627301T>C, g.42627413T>C, g.42627702G>C,
G.42628173T>C and g.42628421A>G showed additive suggestive effect (P <0.05) for at
least one of the trait studied here. These SNPs are the potential markers for selection
programs in Santa Ines sheep, but for many SNPs the genotypic and allelic frequencies
differ between Santa Ines herds and the response to selection will depend on these
frequencies.
Key words: carcass, ovine breeding, selection, SNP, sequencing
88
INTRODUÇÃO
A raça Santa Inês é composta de animais deslanados e foi formada na região
Nordeste do Brasil a partir de cruzamentos que envolveram várias raças. Alguns estudos
já demonstraram que a raça Santa Inês apresenta boas taxas de crescimento (JUCÁ et al.,
2014), além de maior resistência ao calor (MCMANUS et al., 2009) e a endoparasitos
(MEXIA et al., 2011) se comparada a algumas raças lanadas. Isso a caracteriza como uma
excelente opção para regiões de clima tropical e para criadores que possuem baixa
capacidade de investimento no sistema produtivo.
Alguns atributos de carcaça do Santa Inês foram descritos por Costa et al., (2015)
e Jucá et al., (2016) e é possível observar nestes trabalhos que a raça Santa Inês precisa
de seleção para melhoria de carcaça. Contudo, esses atributos são difíceis de melhorar
pela seleção clássica, pois requerem o abate dos animais. Assim, informações de
marcadores moleculares podem ser muito úteis para a obtenção de ganhos genéticos para
qualidade de carcaça, como descrito por Gao et al. (2007). Neste contexto tem-se os genes
CAPN1 e CAST. O gene CAPN1 codifica a enzima proteolítica μ-calpaína, que é
responsável por degradar proteínas miofibrilares do músculo no período post-mortem
(KOOHMARAIE, 1996; SMITH et al., 2000). As calpaínas são divididas em dois grupos,
as que são ativadas por níveis milimolar de Ca2+ (m-calpains) e as de nível micromolar
(µ-calpains). Ambas são inibidas por uma terceira proteína chamada de Calpastatina,
codificada pelo gene CAST, que impede a ligação das calpaínas às membranas celulares
(LAWRENCE, 2002). As calpaínas degradam específicamente as proteínas musculares
(HOSSNER, 2005), sendo a miosina degradada lentamente pelas calpaínas, já a actina
não sofre nenhum efeito desta enzima. Assim, a ação das calpainas é de enfraquecimento
do disco Z do músculo (LAWRENCE, 2002; HOSSNER, 2005).
Devido as funções supracitadas, polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 vem
sendo testados para associação com várias características de interesse econômico,
sobretudo para características relacionadas a qualidade de carne. Associação de
polimorfismos no gene CAST com maciez de carne ovina foram reportadas por Knight et
al. (2012), Knight et al. (2014) e Aali et al. (2017). Contudo, também há relatos de
associação com variáveis ligadas a crescimento. Nassiry et al (2006), Khan et al. (2012)
e Yilmaz et al., (2014) reportaram marcador no gene CAST associados com ganho de peso
diário em ovinos. Polimorfismos no gene CAPN1 também foram associados a peso vivo
de ovinos (DEHNAVI et al, 2012), enquanto Mahrous et al. (2016) reportaram um SNP
no gene CAPN1 associado com peso vivo e ganhos de peso em ovinos.
89
Se polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 estão associados a peso vivo, então
é possível que também estejam associados a atributos de carcaça dada a correlação entre
essas variáveis. Contudo, apenas Yilmaz et al., (2014) e Knight et al. (2014) relataram
ter testado associação entre polimorfismos nestes genes e características de carcaça.
Yilmaz et al., (2014) avaliaram o gene CAST e encontraram efeito de polimorfismo sobre
espessura de gordura subcutânea no músculo Longissimus. Enquanto Knight et al. (2014)
estudaram ambos os genes e não encontraram qualquer associação significativo com peso
de carcaça quente, espessura de gordura e profundidade do músculo Longissimus. Assim,
o objetivo desta pesquisa foi identificar e descrever as freqüências gênicas e genotípicas
de polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 em ovinos da raça Santa Inês e verificar se
estão associados a qualidade de carne e atributos de carcaça.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais e fenótipos avaliados
Foram avaliados 191 cordeiros Santa Inês com aproximadamente 240 dias de
idade; Destes, 105 nasceram entre 2010 e 2012 no campo experimental Pedro Arle, da
Embrapa Tabuleiros Costeiros, no município de Frei Paulo / Sergipe. Enquanto que os
outros 86 cordeiros foram criados na fazenda experimental da Escola de Veterinária
Medicina e Zootecnia da UFBA, localizada em São Gonçalo dos Campos / Bahia, todos
nascidos em 2014. Todos os animais tiveram o peso vivo ao abate (PV) aferido após jejum
prévio de 16 horas. Após o abate foram mensurados os pesos do sangue, da cabeça, das
patas, do aparelho reprodutor e da carcaça quente (PCQ). As vísceras foram pesadas
individualmente cheias e vazias, para determinação do conteúdo do trato gastrointestinal
e do peso do corpo vazio (PCV). Além disso, foram calculados os rendimentos (%) de
carcaça quente (RCQ = PCQ/PV x 100), verdadeiro (RV = PCQ/PCV x 100) e biológico
(RB = PCV/PV x 100). As carcaças foram resfriadas em câmara fria por 24 horas a 2° C
e pesadas para obtenção do peso da carcaça fria (PCF) e cálculo do seu rendimento RCF
(%) = PCF/PV x 100.
Foi mensurado o pH da carcaça até 45 minutos pós-abate (pH0) e 24 horas post
mortem (pH24) com o auxílio de um peagâmetro digital. Foi feito um corte no músculo
Longissimus dorsi entre a 12ª e 13ª costelas para a introdução do eletrodo do peagâmetro,
90
e realizado 3 medidas sequenciadas. A média das triplicatas foram usadas como valor das
características.
A caracterização cromática da carne foi realizada após o descongelamento dos
músculos Longissimus dorsi (4° C por 12h e posteriormente exposto a temperatura
ambiente por 30 minutos). Utilizou-se o colorímetro MINOLTA CR-400 atuando no
sistema CIE/Lab com fonte D65, ângulo de 10° e calibrado no branco. Foram apurados
os valores das coordenadas cromáticas, sendo L* a luminosidade (com valores de 0 para
preto a 100 para branco); a* a intensidade da cor vermelha (com valores negativos para
a cor verde e positivos para a cor vermelha); e b* a intensidade da cor amarela (com
valores negativos para a cor azul e positivos para a cor amarela). Foram feitas medidas
para cada lombo, sendo a média das triplicatas o valor utilizado.
Depois do descongelamento dos músculos Longissimus dorsi, em temperatura
ambiente, foi realizada a avaliação da maciez pela força de cisalhamento via Warner
Bratzler Shear Force. Para tal, utilizou-se um vazador cilíndrico do próprio equipamento,
com a finalidade de retirar cinco fragmentos da parte central das porções com
aproximadamente 1,27 cm de diâmetro; o corte foi perpendicularmente as suas fibras e
livre de gorduras e nervos. O pico da força do cisalhamento (kgf) foi anotado, e a média
das cinco amostras de cada lombo foi considerada a força de cisalhamento.
A perda de peso por cocção foi aferida direto de cinco pedaços do lombo de
aproximadamente 2,0 cm cada. Os bifes foram pesados e expostos ao calor, usando um
grill até atingir uma temperatura interna do centro geométrico de aproximadamente 71°C,
controlado pelo termopar equipado com leitor digital. O valor da característica de perda
de peso por cocção foi medido pela diferença de peso inicial e final das amostras, após
serem submetidas ao tratamento térmico e expressa em porcentagem.
As medidas morfométricas foram aferidas na carcaça com auxílio de fita métrica
e compasso, sendo o comprimento interno (distância máxima entre a borda cranial do
púbis e a borda cranial da primeira costela em seu ponto médio); comprimento externo
(distância máxima entre a articulação cérvico-torácica e a primeira articulação
intercoccígea); comprimento da perna (distância máxima entre o trocânter maior do fêmur
e a borda lateral da articulação tarso-metatarsiana); largura do tórax (largura máxima
mensurada ao nível das costelas); profundidade do tórax (distância máxima entre o
esterno e a cernelha); largura da garupa (largura máxima entre os trocânteres dos
fêmures); perímetro da garupa (perímetro tomando como base os trocânteres dos
91
fêmures). O índice de compacidade da carcaça foi calculado como a razão entre o peso
da carcaça fria e o comprimento interno da carcaça, expresso em kg/cm.
Para classificação e tipificação das carcaças foram determinados escores de um a
cinco, por observação visual, para a conformação e o acabamento das mesmas. Para a
conformação os escores foram atribuídos de acordo com o perfil da musculatura da
carcaça, sendo: escore 1 (perfil côncavo – conformação ruim); escore 2 (perfil retilíneo –
conformação razoável); escore 3 (perfil subconvexo – conformação boa); escore 4 (perfil
convexo – conformação muito boa) e escore 5 (perfil hiperconvexo – conformação
excelente). Para o acabamento foram atribuídos escores de acordo com a quantidade de
gordura de cobertura, sendo escore 1 (muito baixa quantidade – carcaça muito magra);
escore 2 (baixa quantidade – carcaça magra); escore 3 (média quantidade – carcaça
média); escore 4 (quantidade elevada – carcaça gorda) e escore 5 (quantidade muito
elevada – carcaça muito gorda).
A carcaça foi seccionada ao meio e na meia carcaça esquerda foi efetuado um
corte transversal à altura da 12a e 13a costelas para mensuração da área de olho de lombo
do músculo Longissimus dorsi, com o contorno da porção cranial do referido músculo em
folhas de transparências com caneta apropriada, para cálculo da área após a digitalização
das imagens em software computacional. A espessura de gordura subcutânea foi
mensurada acima do referido músculo com paquímetro. A espessura de gordura máxima
foi aferida a 11 cm da linha mediana do corpo com auxílio de fita métrica e paquímetro.
A meia carcaça esquerda foi subdividida em cinco cortes cárneos: paleta (base
óssea: escápula, úmero, rádio e ulna); pescoço (entre a primeira e a sétima vértebra
cervical); costela (entre a primeira e a 13a vértebra torácica); pernil (secção entre a última
vértebra lombar e a primeira sacra); e lombo (vértebras lombares e músculos desta
região). Foram calculados os rendimentos dos cortes cárneos em função do peso vivo ao
abate. Os lombos direito e esquerdo de cada animal foram dissecados e pesados. Os
rendimentos destes cortes foram calculados em função do peso da meia-carcaça. Os
valores médios e respectivos desvios-padrão de todas as variáveis analisadas no presente
estudo podem ser observados na Tabela 1.
92
Tabela 1. Tamanho amostral, média e desvio-padrão das variáveis analisadas
Característica N Média DP
Peso de carcaça quente 185 16,08 3,72
Peso de carcaça fria 185 16,08 3,81
Rendimento de carcaça quente 185 46,50 14,45
Rendimento de carcaça fria 185 46,40 14,21
Rendimento verdadeiro 67 58,2 2,83
Rendimento biológico 67 76,56 3,17
Compacidade da carcaça 185 0,26 0,053
Escore de conformação de carcaça 185 2,22 0,35
Escore de terminação da carcaça 185 2,06 0,56
Comprimento interno da carcaça 185 60,47 5,78
Comprimento externo da carcaça 185 64,20 7,34
Comprimento do pernil 185 40,21 6,66
Perímetro da carcaça na região da garupa 185 60,69 11,27
Largura da carcaça na região da garupa 185 23,92 6,16
Largura da carcaça na região do tórax 185 22,59 10,21
Profundidade da carcaça na região do tórax 185 25,31 3,57
Peso da paleta 185 2,20 0,75
Rendimento da paleta 185 6,47 2,91
Peso do pescoço 185 1,12 0,39
Rendimento do pescoço 185 3,27 1,45
Peso da costela 184 3,25 1,19
Rendimento da costela 185 9,47 4,27
Peso do lombo 185 1,14 0,46
Rendimento do lombo 185 3,34 1,70
Peso da perna 176 3,71 1,80
Rendimento da perna 185 10,97 6,35
Peso do lombo desossado 144 0,59 0,38
Área de olho de lombo (cm2) 184 11,27 3,62
Espessura de gordura subcutânea 97 0,19 0,044
L* - luminosidade 181 44,69 4,31
a* - intensidade de vermelho 181 21,15 2,68
b* - intensidade de amarelo 185 8,49 1,82
Força de cisalhamento (kgf) 182 1,71 0,66
pH0 106 6,67 0,19
pH24 101 5,57 0,19
Perdas de peso por cocção (%) 180 15,23 5,53
Extração de DNA genômico e reação em cadeia da polimerase
Foram coletados 5 ml de sangue em tubos de vacutainer contendo EDTA, os quais
foram refrigerados a 4 ºC. Posteriormente foram extraídos leucócitos, seguindo o
protocolo descrito por Oliveira et al., (2007). Os leucócitos foram encaminhados à Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, ESALQ / USP, onde foi realizada a extração do
93
DNA genômico, seguida da amplificação da região alvo e subsequentemente da
preparação da biblioteca. A extração de DNA foi realizada utilizando método de
precipitação de sal e soluções de proteinase K, seguindo o protocolo de Oliveira et al.,
(2007).
O desenho do primer para os genes CAST e CAPN1 foi feito com base na
sequência disponível no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology
Information) para o genoma ovino. O desenho dos oligonucleotídios foi realizado a partir
do programa Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/), que gerou possíveis
sequências dos iniciadores. Para testar a qualidade das sequências geradas e a escolha do
primer, utilizou-se o net primer (http://www.premierbiosoft.com). Após a escolha dos
melhores primers forward e reverse, foi realizado o BLAST (Basic Local Alignment
Search Tool), que é utilizado como uma ferramenta de busca para o alinhamento das
sequências no NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), para confirmar a
similaridade com a espécie Ovis aries e a região desejada.
Os primers utilizados para a amplificação da região alvo do gene CAST foram
5’AAAAGCCAAAGAAGAGGATCG3’ forward e 3’GGGAAACCACTTCAGAGAC
G 5’ reverse, com 4.108pb (tamanho do fragmento) localizados entre os exons 20 a 23.
Já para o gene CAPN1 foram utilizados os primers 5’TGTGCTGCGTTTCTTCTCAG3’
forward e 3’AAGGTCACCACTCCATCCAG5’ reverse, com 3.927pb (tamanho do
fragmento) localizado entre os exons 12 a 20 do gene CAPN1.
Na amplificação do fragmento do gene da CAST utilizou-se um PCR touch down
com as seguintes condições: desnaturação inicial de 98°C por 5 minutos, seguida de 10
ciclos com desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a 63°C descendo a 58°C
variando -0,5°C a cada ciclo por 30 segundos e a extensão a 72°C por 4 minutos. Logo
após os primeiros ciclos seguiu-se com mais 30 ciclos para desnaturação a 98°C por 10
segundos, anelamento a 58°C por 30 segundos e a extensão a 72°C por 4 minutos,
finalizando com uma extensão final de 72°C por 5 minutos para o gene CAST. Já na
amplificação do fragmento do gene da CAPN1 utilizou-se um PCR com as seguintes
condições: desnaturação inicial de 98°C por 5 minutos, seguida de 40 ciclos com
desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a 58°C por 30 segundos e a extensão
a 72°C por 4 minutos, finalizando com uma extensão final de 72°C por 5 minutos.
Para a amplificação foram utilizados 15 ul de solução contendo 0,3 mM de cada
iniciador, Taq polimerase (Emeraldamp Max Hs (Takara Bio, EUA) e 100 ng de DNA
molde. A amplificação foi realizada pelo termociclador Verity® (Applied Biosystems,
94
EUA). Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose a 1% e as bandas
amplificadas foram coradas com GelRed (Biotium, EUA). Os produtos amplificados
foram avaliados quanto à presença de bandas desejadas contendo o número de pares de
bases esperados, utilizando como controle positivo um pool de DNA de ovelha da raça
Santa Inês.
Purificação dos Amplificados
Após a amplificação das amostras, foi realizada a purificação dos amplicons, com
esferas magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA), seguindo a
recomedação do Agencourt AMPure XP (beads) para o volume de amostra,
homogenizando para as beads se ligarem aos produtos de amplificados. Logo após esta
etapa, realizou a purificação das amostras com etanol 70% para remover os contaminates.
Em seguida, o sedimento foi diluído e as pérolas foram removidas. As amostras foram
diluídas para 2 nM, levando em consideração o tamanho em pares de base do amplificado.
As amostras foram quantificadas com fluorômetro Qubit® (Life Technologies, USA),
sendo diluído para 0,2 ng/μl e encaminhado para o preparo da biblioteca e em seguida o
sequenciamento.
Preparação e sequenciamento das bibliotecas
Para o preparo da biblioteca utilizou-se o kit Nextera® XT DNA Sample
Preparation e Nextera® XT Index (Illumina, San Diego, USA) e todas as etapas foram
realizadas com base no protocolo Nextera XT. O sequenciamento foi realizado na
plataforma MiSeq (Illumina, San Diego, USA) usando o kit MiSeq Reagent Kit v2
(500cycle).
Limpeza e alinhamento das reads
Após o sequenciamento, as qualidades das leituras foram verificadas pelo
software FastQC (www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/). Para a primeira filtragem
de dados, foi utilizado o software SeqyClean versão 1.3.12 (ZHBANNIKOV et al., 2013)
adotando um parâmetro de qualidade de 24 (Phred score) para cada base e um
comprimento mínimo de 50 pb. Após filtragem dos dados, foi realizado o alinhamento
das reads contra o genoma Ovis aries (versão Oar_v4.0) depositado no NCBI, com o
auxílio do programa Bowtie2 (LANGMEAD e SALZBERG, 2012).
95
Detecção de Polimorfismo
A detecção de polimorfismos (SNPs e INDELS) foi realizada com base na posição
no genoma de referência (Versão Oar_v4.0). Nesta etapa foi utilizado o software
SAMtools versão 1.4 (LI e DURBIN, 2009). Em seguida, realizou-se a conversão dos
arquivos do formato SAM (do inglês, Sequence Alignment/Map) para o formato BAM.
Logo após fez-se a remoção das duplicatas de PCR, ordenamento das posições das
sequencias e index do arquivo ordenado. A chamada de variantes foi realizada usando a
opção mpileup do SAMtools cobrindo um valor definido para a qualidade do mapeamento
através da referência do genoma (-q20) e qualidade de filtragem ≥ 40 bases na escala de
Phred (-Q40). Finalmente utilizando o comando bcftools para converter o arquivo em
*.bcf para *.vcf, este passo é executado o filtro que define a leitura de profundidade
máxima dos marcadores para a chamada. Neste caso, mais de 99.999 leituras para essa
variante. Os marcadores foram nomeados de acordo com as regras definidas por HGVs
(Human Genome Variation Society).
Anotação estrutural
Por fim, realizou-se a anotação estrutural dos marcadores usando a ferramenta
VEP (Variant Effect Predictor) para anotação estrutural online, do Ensembl, visando
identificar as localizações das mutações nas diferentes regiões do genoma (região
intergênica, exon, intron, sítio de scpling alternativo etc.) e prováveis efeitos funcionais
das variantes.
Determinação das frequências genotípicas e alélicas
As frequências de alelos e genótipos foram estimadas para cada loco por contagem
simples de alelos e genótipos, respectivamente, utilizando-se o software Statistical
Analysis System (SAS, 2004). O teste de Qui-quadrado foi utilizado para comparar as
frequências genotípicas e alélicas entre os dois grupos (Embrapa e UFBA) assumindo 5%
de probabilidade. Para tanto foi utilizado o PROC FREQ (SAS, 2004).
Testes de Associação
Os testes de associação foram realizados com o programa Qxpak 5 (PÉREZ-
ENCISO e MISZTAL, 2011), que realiza um teste razão de verossimilhanças entre um
modelo completo e um modelo reduzido. O modelo completo usado na análise de
variância para detectar o efeito de SNP foi: Y𝑖𝑗𝑘lm = 𝑢 + F𝑖 + Yj + Mk + ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 + β𝑖𝑗𝑘lm
96
Age + Al + Dm + 𝑒𝑖𝑗𝑘lm Onde: Y𝑖𝑗𝑘lm é o valor fenotípico da característica em análise; u é
a média geral dessa característica; F𝑖, Yj e Mk são efeitos fixos da fazenda, ano e mês de
nascimento, respectivamente; ∝𝑖𝑗𝑘lm 𝐵𝑊 e β𝑖𝑗𝑘lm Age são as covariáveis peso corporal e
idade no abate; Al e Dm são os efeitos aditivo e de dominância, respectivamente; e 𝑒𝑖𝑗𝑘lm
é o resíduo experimental. Já o modelo reduzido foi construído retirando-se do modelo
completo apenas o efeito que se deseja testar. A correção de Bonferroni foi usada para
estabelecer o nível de significância dos testes de associação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nos ovinos o gene CAST está localizado no cromossomo cinco com
aproximadamente 90 Kb e é dividido em 27 exons e 26 introns. Após a amplificação da
região alvo das 191 amostras do gene CAST, apenas uma amostra não amplificou, o que
pode ser devido a alguma mutação na região de alinhamento dos primers. Portanto, foram
sequenciados 190 animais para este gene e após filtragens de qualidade foram
identificados 58 SNP (Tabela 2), o que levou a uma densidade média de
aproximadamente 0,65 SNP/Kb.
Todos os polimorfismos identificados no gene CAST apresentaram frequências
nos três genótipos, exceto o SNP g.93396113G>A que não apresentou animais
heterozigotos tanto no grupo Embrapa quanto no grupo UFBA (Tabela 2). O marcador
g.93395643G>A foi o único localizado em região de exon no gene CAST, mas trata-se de
uma mutação sinônima, pois a troca de base não altera o aminoácido Treonina. Os SNP
g.93395190A>T, g.93395218A>G, g.93395243T>G, g.93395307T>C, g.93395316A>G,
g.93395469G>C, g.93395478G>A, g.93395517C>T, g.93396080A>G, g.93396113G>A
g.93396809G>A, g.93397007T>C e g.93399475G>A são novos polimorfismos, pois
ainda não há registro deles no banco de dados (dbSNP) NCBI. Todos os outros 45
marcadores identificados no gene CAST já possuem prévio registro no NCBI (Tabela 2).
97
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência genotípica
(%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.93395190A>T**
97 15 AA 93,3 17,4
<0,0001
A 95,2 44,2
<0,0001 - 4 46 AT 3,8 53,5 T 4,8 55,8
3 25 TT 2,9 29,1
g.93395218A>G**
97 19 AA 93,3 22,1
<0,0001
A 95,7 47,1
<0,0001 - 5 43 AG 4,8 50,0 G 4,3 52,9
2 24 GG 1,9 27,9
g.93395243T>G**
99 34 TT 95,2 39,5
<0,0001
T 97,6 61,6
<0,0001 - 5 38 TG 4,8 44,2 G 2,4 38,4
0 14 GG 0,0 16,3
g.93395307T>C**
96 19 TT 92,3 22,1
<0,0001
T 94,7 45,9
<0,0001 - 5 41 TC 4,8 47,7 C 5,3 54,1
3 26 CC 2,9 30,2
g.93395316A>G**
97 30 AA 93,3 34,9
<0,0001
A 96,2 63,4
<0,0001 - 6 49 AG 5,8 57,0 G 3,8 36,6
1 7 GG 1,0 8,1
g.93395469G>C**
97 35 GG 93,3 40,7
<0,0001
G 96,2 66,3
<0,0001 - 6 44 GC 5,8 51,2 C 3,8 33,7
1 7 CC 1,0 8,1
96 18 GG 92,3 20,9 G 94,7 45,9
g.93395478G>A** 5 43 GA 4,8 50,0 <0,0001 A 5,3 54,1 <0,0001 -
3 25 AA 2,9 29,1
103 67 CC 99,0 77,9 C 99,5 88,4
g.93395517C>T 1 18 CT 1,0 20,9 <0,0001 T 0,5 11,6 <0,0001 -
0 1 TT 0,0 1,2
87 59 GG 83,7 68,6 G 91,3 83,1
g.93395643G>A*/** 16 25 GA 15,4 29,1 0,0491 A 8,7 16,9 0,0156 rs413442067
1 2 AA 1,0 2,3
98
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.93395788G>A**
87 74 GG 83,7 86,0
0,5851
G 91,3 91,9
0,8574 rs424912630 16 10 GA 15,4 11,6 A 8,7 8,1
1 2 AA 1,0 2,3
g.93395808G>A**
91 74 GG 87,5 86,0
0,7533
G 93,3 91,9
0,6008 rs403339381 12 10 GA 11,5 11,6 A 6,7 8,1
1 2 AA 1,0 2,3
g.93395835G>A**
39 27 GG 37,5 31,4 G 59,6 57,6
0,6852 rs414639908 46 45 GA 44,2 52,3 0,5336 A 40,4 42,4
19 14 AA 18,3 16,3
g.93395843A>G**
81 59 AA 77,9 68,6 A 88,5 83,1
0,1361
rs425997700 22 25 AG 21,2 29,1 0,3171 G 11,5 16,9
1 2 GG 1,0 2,3
g.93396010G>A**
75 80 GG 72,1 93,0 G 84,6 96,5
0,0001
rs415836747 26 6 GA 25,0 7,0 0,0009 A 15,4 3,5
3 0 AA 2,9 0,0
g.93396080A>G**
33 36 AA 31,7 41,9 A 33,7 44,2
0,0356
- 4 4 AG 3,8 4,7 0,3090 G 66,3 55,8
67 46 GG 64,4 53,5
95 83 GG 91,3 96,5 G 91,3 96,5
g.93396113G>A 0 0 GA 0,0 0,0 0,1451 A 8,7 3,5 0,0394 -
9 3 AA 8,7 3,5
31 27 AA 29,8 31,4 A 49,0 50,0
g.93396125A>G** 40 32 AG 38,5 37,2 0,9704 G 51,0 50,0 0,8520 rs426993921
33 27 GG 31,7 31,4
33 35 AA 31,7 40,7 A 57,7 62,2
g.93396140A>G** 54 37 AG 51,9 43,0 0,3993 G 42,3 37,8 0,3715 rs409851241
17 14 GG 16,3 16,3
99
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.93396154T>C**
36 34 TT 34,6 39,5
0,5813
T 61,1 62,2
0,8183 rs417020700 55 39 TC 52,9 45,3 C 38,9 37,8
13 13 CC 12,5 15,1
g.93396162T>C**
21 15 TT 20,2 17,4
0,7647
T 43,8 43,6
0,9773 rs428230968 49 45 TC 47,1 52,3 C 56,3 56,4
34 26 CC 32,7 30,2
g.93396180T>C**
31 33 TT 29,8 38,4 0,3779 T 56,7 60,5
0,4622 rs406915912 56 38 TC 53,8 44,2 C 43,3 39,5
17 15 CC 16,3 17,4
g.93396211C>T**
38 33 CC 36,5 38,4 0,8375 C 60,1 59,9
0,9664 rs422402447 49 37 CT 47,1 43,0 T 39,9 40,1
17 16 TT 16,3 18,6
g.93396257T>C**
25 30 TT 24,0 34,9 0,2358 T 45,2 51,7
0,2033 rs160120782 44 29 TC 42,3 33,7 C 54,8 48,3
35 27 CC 33,7 31,4
g.93396404A>G**
44 31 AA 42,3 36,0 0,6386 A 66,8 64,0
0,5575 rs408105678 51 48 AG 49,0 55,8 G 33,2 36,0
9 7 GG 8,7 8,1
43 48 AA 41,3 55,8 0,1300 A 66,8 74,4
g.93396422A>G** 53 32 AG 51,0 37,2 G 33,2 25,6 0,1071 rs419473804
8 6 GG 7,7 7,0
69 47 AA 66,3 54,7 0,2506 A 79,3 72,7
g.93396553A>C** 27 31 AC 26,0 36,0 C 20,7 27,3 0,1289 rs413404444
8 8 CC 7,7 9,3
29 16 AA 27,9 18,6 0,0981 A 55,3 44,8
g.93396619A>G** 57 45 AG 54,8 52,3 G 44,7 55,2 0,0412 rs399204438
18 25 GG 17,3 29,1
100
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.93396736T>C**
27 17 TT 26,0 19,8
0,1404
T 54,3 45,3
0,0815
rs425885251 59 44 TC 56,7 51,2 C 45,7 54,7
18 25 CC 17,3 29,1
g.93396809G>A**
51 29 GG 49,0 33,7
0,0812
G 70,2 62,8
0,1271
- 44 50 GA 42,3 58,1 A 29,8 37,2
9 7 AA 8,7 8,1
g.93396815G>A
93 54 GG 89,4 62,8 G 94,7 80,2
<0,0001
rs423099226 11 30 GA 10,6 34,9 <0,0001 A 5,3 19,8
0 2 AA 0,0 2,3
g.93397007T>C**
61 34 TT 58,7 39,5 T 75,5 66,3
0,0484
- 35 46 TC 33,7 53,5 0,0201 C 24,5 33,7
8 6 CC 7,7 7,0
g.93397044A>G**
55 56 AA 52,9 65,1 A 74,5 82,0
0,0812
rs406867092 45 29 AG 43,3 33,7 0,1657 G 25,5 18,0
4 1 GG 3,8 1,2
g.93397082T>C**
37 18 TT 35,6 20,9 T 59,1 45,9
0,0102
rs418210778 49 43 TC 47,1 50,0 0,0398 C 40,9 54,1
18 25 CC 17,3 29,1
43 30 TT 41,3 34,9 T 66,3 64,0
g.93397094T>C** 52 50 TC 50,0 58,1 0,5325 C 33,7 36,0 0,6258 rs429530795
9 6 CC 8,7 7,0
97 73 CC 93,3 84,9 C 96,6 91,3
g.93397157C>A 7 11 CA 6,7 12,8 0,0996 A 3,4 8,7 0,0261 rs408051866
0 2 AA 0,0 2,3
25 31 GG 24,0 36,0 G 46,2 53,5
g.93397179G>A** 46 30 GA 44,2 34,9 0,1790 A 53,8 46,5 0,1546 rs160120795
33 25 AA 31,7 29,1
101
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.93397195C>G**
33 22 CC 31,7 25,6
0,3795
C 49,5 48,3
0,8063
rs409258492 37 39 CG 35,6 45,3 G 50,5 51,7
34 25 GG 32,7 29,1
g.93397267G>T
93 61 GG 89,4 70,9
0,0036
G 94,7 84,3
0,0008
rs160120800 11 23 GT 10,6 26,7 T 5,3 15,7
0 2 TT 0,0 2,3
g.93397299A>G**
88 70 AA 84,6 81,4 A 91,8 89,5
0,4419
rs399091954 15 14 AG 14,4 16,3 0,6978 G 8,2 10,5
1 2 GG 1,0 2,3
g.93397418C>T**
86 69 CC 82,7 80,2 C 90,9 89,0
0,5363
rs160120803 17 15 CT 16,3 17,4 0,7323 T 9,1 11,0
1 2 TT 1,0 2,3
g.93397419G>A**
49 31 GG 47,1 36,0 G 69,7 64,0
0,2344
rs400315475 47 48 GA 45,2 55,8 0,2947 A 30,3 36,0
8 7 AA 7,7 8,1
g.93397428C>T**
25 17 CC 24,0 19,8 C 53,4 45,3
0,1198
rs411571641 61 44 CT 58,7 51,2 0,1538 T 46,6 54,7
18 25 TT 17,3 29,1
81 62 GG 77,9 72,1 G 88,0 84,9
g.93397448G>A** 21 22 GA 20,2 25,6 0,6537 A 12,0 15,1 0,3780 rs422744326
2 2 AA 1,9 2,3
91 59 CC 87,5 68,6 C 93,3 83,1
g.93397600C>G** 12 25 CG 11,5 29,1 0,0064 G 6,7 16,9 0,0019 rs418161864
1 2 GG 1,0 2,3
44 28 AA 42,3 32,6 A 66,8 61,6
g.93397631A>T** 51 50 AT 49,0 58,1 0,3798 T 33,2 38,4 0,2919 rs161885177
9 8 TT 8,7 9,3
102
Tabela 2. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.93397705C>T**
82 58 CC 78,8 67,4
0,1917
C 88,9 82,6
0,0738
rs403866848 21 26 CT 20,2 30,2 T 11,1 17,4
1 2 TT 1,0 2,3
g.93397718C>T**
57 59 CC 54,8 68,6
0,1025
C 73,6 80,2
0,1262
rs415186098 39 20 CT 37,5 23,3 T 26,4 19,8
8 7 TT 7,7 8,1
g.93397780T>C**
86 68 TT 82,7 79,1 T 89,4 89,0
0,8832
rs430517308 14 17 TC 13,5 19,8 0,2849 C 10,6 11,0
4 1 CC 3,8 1,2
g.93397817A>G**
89 75 AA 85,6 87,2 A 92,3 92,4
0,9609
rs409125240 14 9 AG 13,5 10,5 0,6318 G 7,7 7,6
1 2 GG 1,0 2,3
g.93397857G>T**
91 67 GG 87,5 77,9 G 93,3 87,8
0,0660
rs420247553 12 17 GT 11,5 19,8 0,2056 T 6,7 12,2
1 2 TT 1,0 2,3
g.93397920C>T**
83 58 CC 79,8 67,4 C 89,4 82,6
0,0526
rs427755483 20 26 CT 19,2 30,2 0,1438 T 10,6 17,4
1 2 TT 1,0 2,3
47 35 GG 45,2 40,7 G 68,8 65,7
g.93398021G>A** 49 43 GA 47,1 50,0 0,8001 A 31,3 34,3 0,5276 rs193637301
8 8 AA 7,7 9,3
88 73 CC 84,6 84,9 C 91,8 91,3
g.93398162C>T** 15 11 CT 14,4 12,8 0,7237 T 8,2 8,7 0,8482 rs421650487
1 2 TT 1,0 2,3
10 12 AA 9,6 14,0 A 33,7 26,2
g.93398392A>G** 50 21 AG 48,1 24,4 0,0036 G 66,3 73,8 0,1136 rs400201314
44 53 GG 42,3 61,6
103
Tabela 2, Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAST
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.93398442C>T**
80 62 CC 76,9 72,1 C 88,0 84,9
rs411539518 23 22 CT 22,1 25,6 0,6249 T 12,0 15,1 0,3780
1 2 TT 1,0 2,3
g.93398765C>T**
18 15 CC 17,3 17,4 C 43,3 43,6
rs418818682 54 45 CT 51,9 52,3 0,9968 T 56,7 56,4 0,9476
32 26 TT 30,8 30,2
g.93398827A>C**
101 82 AA 97,1 95,3 A 98,1 96,5
rs401407818 2 2 AC 1,9 2,3 0,7385 C 1,9 3,5 0,3427
1 2 CC 1,0 2,3
g.93399475G>A
91 54 GG 87,5 62,8 G 93,8 80,2
- 13 30 GA 12,5 34,9 0,0002 A 6,3 19,8 <0,0001
0 2 AA 0,0 2,3
Prob. FG e Prog. FA – Probabilidades do teste qui-quadrado ao comparar os grupos Embrapa e UFBA quanto as frequências genotípicas e alélicas, respectivamente.
ID do cromossomo 5 que se localiza o gene CAST no genoma de ovinos versão 4.0: NC_019462.2.
ID do gene CAST no genoma de ovinos versão 4.0: 443364
*Mutação localizada no exon 20
**Marcadores usado no teste de associação
104
Os grupos Embrapa e UFBA diferiram (P<0,05) em função das frequências
alélicas e genotípicas dos marcadores g.93395190A>T, g.93395218A>G,
g.93395243T>G, g.93395307T>C, g.93395316A>G, g.93395469G>C, g.93395478,
g.93395517C>T, g.93395643G, g.93396010G>A, g.93396815G>A, g.93397007T>C,
g.93397082T>C, g.93397267G>T, g.93397600C>G e g.93399475G>A (Tabela 2). Já
para os marcadores g.93396619A>G e g.93397157C>A as diferenças entre os grupos
foram apenas na frequência alélica, enquanto para o marcador g.93398392A>G houve
diferença nas frequências genotípicas. Uma possível explicação para essas diferenças está
no fluxo gênico dentro dos rebanhos. O grupo Embrapa é formado por um único rebanho
que está fechado há mais de 30 anos, enquanto o grupo UFBA é formado por animais de
um rebanho aberto. Apesar disso, não houve qualquer diferença entre os grupos Embrapa
e UFBA para 37 marcadores no gene CAST.
Das 191 amostras avaliadas para o genes CAPN1, oito não amplificaram, o que
pode ser decorrente de mutação na região de alinhamento do primer. Assim, foram
sequenciadas 183 amostras para esse gene e, após filtragens de qualidade, foram
identificados 45 marcadores (Tabela 3), o que levou a uma densidade média de
aproximadamente 1,82 SNP/Kb. Dos 45 marcadores, 44 foram localizados em regiões de
intron do gene CAPN1 e apenas o marcador g.42628678C>T (Tabela 3) foi localizado em
região codificadora (exon 20). Trata-se de uma mutação sinônima, pois o aminoácido
gerado pelo novo códon também é a Arparagina. Os SNP g.42626539G>A,
g.42626996T>C, g.42627113G>A, g.42627152G>A, g.42627199G>A,
g.42627301T>C, g.42627382G>C, g.42627386C>T, g.42627413T>C, g.42627482A>G
e g.42627701C>T ainda não haviam sido depositados no banco de dados (dbSNP) do
NCBI, sendo os demais 34 já referenciados no NCBI (Tabela 3).
Os grupos Embrapa e UFBA não diferiram (P>0,05) em função das frequências
alélicas e genotípicas para os marcadores g.42626874C>T, g.42627152G>A,
g.42627386C>T g.42627482A>G, g.42628237G>A, g.42628555G>A (Tabela 3). Para
todos os outros 39 marcadores há diferença entre os grupos Embrapa e UFBA para pelo
menos uma das frequências (genotípica ou alélica). Novamente uma possível explicação
pode estar no fluxo gênico diferenciado entre os grupos Embrapa e UFBA.
105
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAPN1
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.42625336G>A**
91 69 GG 93,8 80,2
0,0019
G 96,9 84,3
<0,0001 rs417411045 6 7 GA 6,2 8,1 A 3,1 15,7
0 10 AA 0,0 11,6
g.42625414G>T
92 71 GG 94,8 82,6
0,0256
G 97,4 90,7
0,0058 rs428375521 5 14 GT 5,2 16,3 T 2,6 9,3
0 1 TT 0,0 1,2
g.42625446C>T**
84 28 CC 86,6 32,6 C 93,3 60,5
<0,0001 rs407017992 13 48 CT 13,4 55,8 <0,0001 T 6,7 39,5
0 10 TT 0,0 11,6
g.42625525A>G**
39 8 AA 40,2 9,3 A 57,2 28,5
<0,0001 rs422192534 33 33 AG 34,0 38,4 <0,0001 G 42,8 71,5
25 45 GG 25,8 52,3
g.42625534T>C**
38 7 TT 39,2 8,1 T 55,2 27,3
<0,0001 rs400729075 31 33 TC 32,0 38,4 <0,0001 C 44,8 72,7
28 46 CC 28,9 53,5
g.42625600A>G**
35 7 AA 36,1 8,1 A 53,1 28,5
<0,0001 rs407944017 33 35 AG 34,0 40,7 <0,0001 G 46,9 71,5
29 44 GG 29,9 51,2
40 14 CC 41,2 16,3 C 56,7 31,4
g.42625785C>T** 30 26 CT 30,9 30,2 0,0002 T 43,3 68,6 <0,0001 rs419029128
27 46 TT 27,8 53,5
53 37 GG 54,6 43,0 G 68,0 70,3
g.42625811G>A** 26 47 GA 26,8 54,7 <0,0001 A 32,0 29,7 0,6334 rs401662939
18 2 AA 18,6 2,3
90 46 GG 92,8 53,5 G 96,4 72,1
g.42625831G>A** 7 32 GA 7,2 37,2 <0,0001 A 3,6 27,9 <0,0001 rs162278939
0 8 AA 0,0 9,3
106
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAPN1
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.42625974T>C**
25 45 TT 25,8 52,3
0,0002
T 39,7 65,7
<0,0001 rs424143722 27 23 TC 27,8 26,7 C 60,3 34,3
45 18 CC 46,4 20,9
g.42626055G>A**
54 39 GG 55,7 45,3
0,0001
G 68,6 70,9
0,6220 rs398261375 25 44 GA 25,8 51,2 A 31,4 29,1
18 3 AA 18,6 3,5
g.42626121C>T**
43 8 CC 44,3 9,3 C 59,3 27,9
<0,0001 rs413668712 29 32 CT 29,9 37,2 <0,0001 T 40,7 72,1
25 46 TT 25,8 53,5
g.42626178T>C**
40 7 TT 41,2 8,1 T 56,2 27,3
<0,0001 rs424964941 29 33 TC 29,9 38,4 <0,0001 C 43,8 72,7
28 46 CC 28,9 53,5
g.42626214T>C**
38 6 TT 39,2 7,0 T 55,2 25,0
<0,0001 rs403309597 31 31 TC 32,0 36,0 <0,0001 C 44,8 75,0
28 49 CC 28,9 57,0
g.42626217G>A**
40 7 GG 41,2 8,1 G 57,2 27,9
<0,0001 rs410518425 31 34 GA 32,0 39,5 <0,0001 A 42,8 72,1
26 45 AA 26,8 52,3
91 72 AA 93,8 83,7 A 96,9 91,3
g.42626230A>G 6 13 AG 6,2 15,1 0,0761 G 3,1 8,7 0,0208 rs423441243
0 1 GG 0,0 1,2
42 31 GG 43,3 36,0 G 60,8 66,3
g.42626364G>A** 34 52 GA 35,1 60,5 0,0001 A 39,2 33,7 0,2797 rs417258958
21 3 AA 21,6 3,5
59 37 GG 60,8 43,0 G 71,1 70,3
g.42626539G>A** 20 47 GA 20,6 54,7 <0,0001 A 28,9 29,7 0,8691 -
18 2 AA 18,6 2,3
107
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAPN1
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.42626685G>A**
54 76 GG 55,7 88,4
<0,0001
G 66,0 92,4
<0,0001 rs428514817 20 7 GA 20,6 8,1 A 34,0 7,6
23 3 AA 23,7 3,5
g.42626803C>T**
28 30 CC 28,9 34,9
0,0012
C 54,6 66,3
0,0232 rs403089766 50 54 CT 51,5 62,8 T 45,4 33,7
19 2 TT 19,6 2,3
g.42626874C>T
77 60 CC 79,4 69,8 C 89,7 84,3
0,1241 rs418303621 20 25 CT 20,6 29,1 0,2215 T 10,3 15,7
0 1 TT 0,0 1,2
g.42626996T>C**
12 9 TT 12,4 10,5 T 47,9 29,1
0,0002 - 69 32 TC 71,1 37,2 <0,0001 C 52,1 70,9
16 45 CC 16,5 52,3
g.42627113G>A
70 50 GG 72,2 58,1 G 86,1 77,9
0,0411 - 27 34 GA 27,8 39,5 0,0641 A 13,9 22,1
0 2 AA 0,0 2,3
g.42627152G>A
70 54 GG 72,2 62,8 G 86,1 80,8
0,1742 - 27 31 GA 27,8 36,0 0,2607 A 13,9 19,2
0 1 AA 0,0 1,2
71 37 GG 73,2 43,0 G 86,6 65,7
g.42627199G>A** 26 39 GA 26,8 45,3 <0,0001 A 13,4 34,3 <0,0001 -
0 10 AA 0,0 11,6
67 41 TT 69,1 47,7 T 84,5 71,5
g.42627301T>C** 30 41 TC 30,9 47,7 0,0034 C 15,5 28,5 0,0025 -
0 4 CC 0,0 4,7
40 55 GG 41,2 64,0 G 69,6 80,2
g.42627382G>C** 55 28 GC 56,7 32,6 0,0047 C 30,4 19,8 0,0196 -
2 3 CC 2,1 3,5
108
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAPN1
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.42627386C>T
80 77 CC 82,5 89,5
0,1721
C 91,2 94,8
0,1895 - 17 9 CT 17,5 10,5 T 8,8 5,2
0 0 TT 0,0 0,0
g.42627413T>C*
54 65 TT 55,7 75,6
0,0075
T 75,8 87,8
0,0032 - 39 21 TC 40,2 24,4 C 24,2 12,2
4 0 CC 4,1 0,0
g.42627482A>G
87 71 AA 89,7 82,6 A 94,8 91,3
0,1771 - 10 15 AG 10,3 17,4 0,1609 G 5,2 8,7
0 0 GG 0,0 0,0
g.42627701C>T**
60 71 CC 61,9 82,6 C 74,2 90,7
<0,0001 - 24 14 CT 24,7 16,3 0,0013 T 25,8 9,3
13 1 TT 13,4 1,2
g.42627702G>C**
60 63 GG 61,9 73,3 G 74,2 85,5
0,0078 rs406194123 24 21 GC 24,7 24,4 0,0212 C 25,8 14,5
13 2 CC 13,4 2,3
g.42628023G>A**
94 48 GG 96,9 55,8 G 98,5 74,4
<0,0001 rs403005481 3 32 GA 3,1 37,2 <0,0001 A 1,5 25,6
0 6 AA 0,0 7,0
43 24 TT 44,3 27,9 T 59,3 55,2
g.42628173T>C** 29 47 TC 29,9 54,7 0,0031 C 40,7 44,8 0,4347 rs418468486
25 15 CC 25,8 17,4
60 47 GG 61,9 54,7 G 78,9 76,2
g.42628237G>A** 33 37 GA 34,0 43,0 0,4025 A 21,1 23,8 0,5359 rs429532201
4 2 AA 4,1 2,3
35 21 AA 36,1 24,4 A 56,7 58,7
g.42628259A>G** 40 59 AG 41,2 68,6 0,0004 G 43,3 41,3 0,6963 rs403953588
22 6 GG 22,7 7,0
109
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAPN1
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
g.42628421A>G**
74 74 AA 76,3 86,0
0,0148
A 80,9 91,9
0,0026 rs414993519 9 10 AG 9,3 11,6 G 19,1 8,1
14 2 GG 14,4 2,3
g.42628438T>C**
32 31 TT 33,0 36,0
<0,0001
T 52,1 65,7
0,0082 rs430307080 37 51 TC 38,1 59,3 C 47,9 34,3
28 4 CC 28,9 4,7
g.42628555G>A
89 84 GG 91,8 97,7 G 95,4 98,8
0,0519 rs161627795 7 2 GA 7,2 2,3 0,1947 A 4,6 1,2
1 0 AA 1,0 0,0
g.42628581G>A**
48 72 GG 49,5 83,7 G 68,0 91,9
<0,0001 rs427085960 36 14 GA 37,1 16,3 <0,0001 A 32,0 8,1
13 0 AA 13,4 0,0
g.42628609A>C**
91 70 AA 93,8 81,4 A 96,4 89,0
0,0057 rs409655600 5 13 AC 5,2 15,1 0,0358 C 3,6 11,0
1 3 CC 1,0 3,5
g.42628678C>T*/**
48 42 CC 49,5 48,8 C 65,5 73,8
0,0828 rs421035003 31 43 CT 32,0 50,0 0,0002 T 34,5 26,2
18 1 TT 18,6 1,2
54 82 CC 55,7 95,3 C 55,7 97,7
g.42628813C>T** 0 4 CT 0,0 4,7 <0,0001 T 44,3 2,3 <0,0001 rs590844301
43 0 TT 44,3 0,0
44 39 TT 45,4 45,3 T 61,9 71,5
g.42628830T>G** 32 45 TG 33,0 52,3 0,0002 G 38,1 28,5 0,0510 rs410614126
21 2 GG 21,6 2,3
110
Tabela 3. Frequências genotípicas e alélicas dos polimorfismos identificados no gene CAPN1
continuação
Marcadores Número de animais
Genótipo
Frequência
genotípica (%) Prob.
(FG) Alelo
Frequência
alélica (%) Prob.
(FA)
Variação
Existente
(NCBI) Embrapa UFBA Embrapa UFBA Embrapa UFBA
44 36 GG 45,4 41,9 G 62,9 70,3
g.42628928G>A** 34 49 GA 35,1 57,0 <0,0001 A 37,1 29,7 0,1314 rs400201468
19 1 AA 19,6 1,2 Prob. FG e Prog. FA – Probabilidades do teste qui-quadrado ao comparar os grupos Embrapa e UFBA quanto as frequências genotípicas e alélicas,
respectivamente.
ID do cromossomo 21que se localiza o gene CAPN1 no genoma de ovinos versão 4.0: NC_019478.2.
ID do gene CAPN1 no genoma de ovinos versão 4.0: 443130
*Mutação localizada no exon 20
**Marcadores usado no teste de associação
111
Alguns marcadores identificados nos genes CAST e CAPN1 não foram utilizados
nos testes de associação com as características de carcaça e qualidade de carne devido à
ausência ou baixa frequência em alguma classe genotípica, o que impedia a estimação
dos efeitos de interesse (aditivo ou dominância). Um total de 52 marcadores no CAST e
36 no CAPN1 foram utilizados nos testes de associação, o que levou a um nível de
significância de 0,000253 pela correção de Bonferroni. Contudo, aquelas associações
significativas ao nível de 5% também foram apresentadas nas Tabelas 4 e 5, as quais são
aqui consideradas como ligações sugestivas.
A calpastatina é um inibidor específico das calpaínas e polimorfismos no gene
CAST estão essencialmente associados com a maciez da carne post mortem em algumas
espécies de animais domésticos, incluindo os ovinos (KNIGHT et al., 2012; KNIGHT et
al., 2014; e AALI et al., 2017). Também há relatos de efeito sobre características de
crescimento (NASSIRY et al., 2006; e KHAN et al., 2012). Contudo, apenas Yilmaz et
al., (2014) reportaram efeito de polimorfismo no gene CAST sobre característica de
carcaça, no caso espessura de gordura subcutânea. Assim, trata-se de um gene que pode
ser candidato a estudos de associção com várias características de interesse econômico,
incluindo atributos de carcaça. No presente estudo foram identificadas 26 ligações
sugestivas entre polimorfismos no gene CAST (Tabela 4) e atributos de carcaça e
qualidade de carne, mas apenas uma associação significativa ao nível da correção de
Bonferroni para a característica de perda de peso por cocção.
O SNP g.93395190A>T teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para o peso e o
rendimento de paleta e para o rendimento de costela (Tabela 4). No caso dos rendimentos,
foram observados efeitos aditivo e de dominância, mas para o peso de paleta foi
encontrado apenas efeito aditivo. Os cortes de paleta e costela são bastante valorizados
no comércio de carne ovina e por isso o objetivo de seleção deve ser ampliar o valor
médio destas três variáveis. O alelo A atende esse objetivo e ele tem boa frequência em
ambos os grupos aqui avaliados, mas é consideravelmente maior no grupo Embrapa
(Tabela 2). Ressalta-se que as frequências alélicas e genotípicas deste marcador diferem
entre os grupos estudados, logo a resposta a seleção pode variar dentro da raça Santa Inês.
O efeito de dominância observado para os rendimentos de paleta e de costela indicam que
os heterozigotos apresentam um desvio em relação à média dos homozigotos e como o
valor é negativo a média dos homozigotos é superior à média dos heterozigotos.
112
Tabela 4. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-padrão (EP) nos
testes de associação com polimorfismos no gene CAST
Variável a(EP) d(EP) LRT P
g.93395190A>T
Peso de paleta 0,1260 (0,0615) - 4,14 0,418E-01
Rendimento de paleta 0,9377 (0,3224) -0,8779 (0,4725) 10,96 0,416E-02
Rendimento de costela 1,8187 (0,5451) -2,0732 (0,7913) 16,04 0,328E-03
g.93395243T>G
Peso de carcaça fria -0,8830 (0,3531) - 6,15 0,131E-01
Comprimento interno da carcaça -0,9105 (0,4460) - 4,12 0,423E-01
Comprimento externo da carcaça -1,8191 (0,5694) - 9,93 0,162E-02
Rendimento de lombo 0,5714 (0,2925) -0,6587 (0,3985) 10,20 0,610E-02
g.93395469G>C
Peso de pernil 0,2647 (0,1318) - 3,99 0,458E-01
Rendimento de pernil 1,9915 (0,9640) - 4,22 0,400E-01
g.93395478G>A
Peso de costela 0,2639 (0,0981) - 7,11 0,765E-02
Peso de carcaça quente 0,7166 (0,2933) - 5,87 0,154E-01
Peso de pescoço 0,0628 (0,0298) - 4,40 0,360E-01
g.93395835G>A
pH0 -0,0700 (0,0239) - 10,51 0,119E-02
g.93396080A>G
Área do músculo L. dorsi -0,3876(0,1628) - 5,58 0,182E-01
g.93396154T>C
Rendimento biológico 1,4738 (0,5412) - 7,03 0,801E-02
g.93396162T>C
Rendimento de pescoço -0,3021 (0,1318) - 5,18 0,229E-01
g.93396257T>C
Peso de lombo desossado 0,0283(0,0125) -0,0416(0,0213) 8,06 0,177E-01
g.93397179G>A
pH24 -0,0862 (0,0324) - 8,24 0,409E-02
g.93397600C>G
Perdas de peso por cocção 0,0203 (0,0051) - 14,17 0,167E-03
g.93397718C>T
Largura da carcaça na garupa 1,5625(0,5245) - 8,67 0,324E-02
Largura da carcaça no tórax 2,9299(1,1052) - 6,90 0,863E-02
Intensidade de brilho (L*) -0,9409 (0,4757) - 3,87 0,491E-01
Intensidade de vermelho (a*) -0,8445 (0,2554) - 10,62 0,112E-02
Intensidade de amarelo (b*) -0,4414 (0,2074) - 4,48 0,344E-01
g.93397780T>C
Escore de terminação de carcaça 0,1738(0,0752) - 5,26 0,218E-01
LRT - Likelihood ratio test; Prob - Probabilidade do teste LRT
O marcador g.93395218A>G teve efeito aditivo sugestivo (p<0,05) para a
variável comprimento interno da carcaça, onde o alelo G é o responsável pelo aumento
113
do comprimento. Porém a frequência deste alelo nos grupos estudados foi baixa,
indicando que há espaço para a amplificação da mesma nos dois rebanhos.
O SNP g.93395243T>G teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para as variáveis
peso de carcaça fria, comprimento externo da carcaça e rendimento do lombo (Tabela 4),
sendo o alelo T responsável por aumentar a média do rendimento de lombo, enquanto o
alelo G aumentou os valores médios das demais variáveis. Este mesmo SNP também
apresentou efeito de dominância para rendimento do lombo, sendo a média dos
heterozigotos inferior à média dos homozigotos. As frequências genotípicas e alélicas
deste marcador também diferem (P<0,05) entre os grupos estudados e a frequência do
alelo T é maior que a do G, sobretudo no grupo Embrapa. A princípio o objetivo de
seleção destas variáveis é ampliar o valor médio. Contudo, as informações deste marcador
não possibilitam que esse aumento ocorra simultaneamente para essas quatro variáveis.
Logo, a seleção para um destes alelos deve ser acompanhada de um monitoramento das
outras variáveis a fim de evitar que perdas ocorram.
O SNP g.93395307T>C apresentou efeito aditivo sugestível para o peso de
costela. A costela é um corte comercial bastante apreciado em ovinos e por isso o objetivo
deve ser ampliar o valor médio do peso de costela. O alelo T pode ajudar a atingir esse
objetivo. As frequências genotípicas e alélica para o genótipo TT e o alelo T foi maior no
grupo Embrapa (Tabela 2), indicando grande espaço para ampliar as frequências do alelo
T e do genótipo TT na raça Santa Inês no grupo UFBA e pode trazer bons ganhos em
peso de costela. Os resultados das frequências para este marcador mostram que há
diferença entre os rebanhos Santa Inês e pode ser um marcador usado em seleção para a
melhoria da variável peso de costela.
O SNP g.93395469G>C teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre peso e
rendimento de pernil (Tabela 4). A raça Santa Inês apresenta pernil com pouco
desenvolvimento muscular e é um objetivo de seleção ampliá-lo. O alelo G é aquele que
aumenta o valor destas variáveis e sua frequência difere entre os grupos estudados. Sua
frequência é maior que a do alelo T, sendo bastante alta no grupo Embrapa (Tabela 2).
As frequências genotípicas também diferem entre os grupos, pois enquanto praticamente
todos os animais da Embrapa são GG, grande parte dos animais UFBA são GC. Logo, a
resposta a seleção com base neste marcado dependerá do rebanho sob seleção.
O SNP g.93395478G>A teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre os pesos de
carcaça quente e pescoço (Tabela 4). O peso de carcaça quente tem grande valor
comercial e o objetivo de seleção é ampliar suas médias, enquanto o peso do pescoço tem
114
pouco valor de mercado e por isso seu peso é pouco importante para o sistema de
produção. O alelo G proporciona maiores valores médios dessas variáveis que o alelo A
e por isso deve ser considerado o alelo favorável. No entanto, a resposta a seleção com
base nas informações deste marcador irá depender do rebanho sob seleção, pois as
frequências alélica e genotípica desse SNP diferiram entre os grupos estudados (Tabela
2). No grupo Embrapa a frequência de G é consideravelmente maior que a do alelo A,
mas no grupo UFBA os dois alelos apresentaram frequências muito próximas. Além
disso, o genótipo desejável (GG) é bem menos frequente no grupo UFBA do que no grupo
Embrapa, onde praticamente todos os animais são GG. A combinação das informações
deste SNP com as informações do SNP g.93396162T>C pode ser útil, pois este último
também está associado (P<0,05) a uma medida de pescoço, mas não com peso e sim com
seu rendimento (Tabela 4). O alelo não-mutante T diminui esse rendimento e deve ser
considerado favorável. Logo, para ambos os SNP a seleção deve priorizar o aumento da
frequência dos alelos não-mutantes. As frequências alélicas e genotípicas do SNP
g.93396162T>C não diferem (P>0,05) entre os grupos estudados, mas o genótipo TT tem
menor frequência que os demais e o a alelo T é menos frequente que o C (Tabela 2), o
que evidencia grande espaço para ampliar as frequências do genótipo e do alelo de
interesse.
Os SNP g.93395835G>A e g.93397179G>A tiveram efeito aditivo sugestível
(P<0,05) para as variáveis pH0 e pH24, respectivamente. O pH é uma característica
importante para a qualidade da carne, pois pode influenciar vários fatores como
capacidade de retenção de água, perda de peso por cozimento, força de cisalhamento e a
cor, alterando assim a aparência e suculência da carne. Por isso, valores muito elevados
ou muito baixos, podem estar associados a carnes DFD (Dark, Firm, Dry) ou PSE (Pale,
Soft, Exudative), respectivamente. Segundo Adzitey e Nurul (2011), a carne bovina se
caracteriza como PSE quando o pH mensurado 45 minutos pós-abate apresenta um valor
inferior a seis, enquanto carne bovina com pH≥6,0 entre 12 e 48 pós-abate são DFD. O
pH inicial geralmente é maior que 6 em ovinos, como pode ser observado em Sañudo et
al. (2000) e Costa et al. (2015) e o pH24 dificilmente é superior a seis em ovinos Santa
Inês (Jucá et al., 2016). Assim, é difícil caracterizar um alelo favorável nesses casos em
que a variável não pode ter valores muito baixos ou muito altos. Nos dois SNPs, o alelo
A aumenta os valores médios de pH. As frequências alélicas e genotípicas destes
marcadores não diferem entre os grupos estudados. No caso do SNP g.93395835G>A o
alelo A é um pouco menos frequente que o G em ambos os grupos, mas para o SNP
115
g.93397179G>A o alelo A é mais frequente que o G no grupo Embrapa (Tabela 2).
Também pode se observar na Tabela 2 que a frequência dos heterozigotos é superior à
dos homozigotos, exceto para o SNP g.93397179G>A no grupo UFBA.
O marcador g.93397600C>G foi o único que teve efeito aditivo (P<0,000253)
significativo ao nível da correção de Bonferroni e influenciou a variável perda de peso do
músculo durante o processo de cozimento (Tabela 4). O alelo C aumenta as perdas por
cocção e por isso o alelo G é o desejável. As frequências alélicas e genotípicas deste
marcador diferem entre os grupos estudados, mas a frequência do alelo G é baixa nos dois
rebanhos (Tabela 2), sendo o genótipo GG observado em poucos animais. Logo, a seleção
para ampliar a frequência deste grupo pode trazer boms ganhos para essa variável.
O SNP g.93396080A>G teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre a área do
músculo Longissimus dorsi (Tabela 4). Esse músculo tem alto valor comercial e por isso
a seleção tem como objetivo ampliá-lo. O alelo A pode ajudar a atingir esse objetivo pois
foi observado maior valor médio em animais AA que animais GG. As frequências
genotípicas desse marcador são semelhantes (P>0,05) nos dois grupos estudados, mas as
frequências alélicas diferiram (P<0,05) (Tabela 2). O alelo desejável A é um pouco mais
frequente no UFBA que no grupo Embrapa. Contudo, em ambos os grupos o alelo A é
menos frequente que o alelo G. Chama atenção o fato de que o peso do lombo desossado
também sofre efeito aditivo sugestivo (P<0,05) de polimorfismo neste gene, mas por
outro SNP g.93396257T>C (Tabela 4). O alelo favorável também é o não mutante (T),
cujas frequências não diferem entre os grupos estudados (Tabela 2), mas o alelo T é
menos frequente que o alelo C em ambos os grupos. Esse marcador também tem um efeito
de dominância sobre o peso do lombo desossado, mas com sinal negativo. Logo, a média
dos heterozigotos é inferior à média dos homozigotos e a seleção deve buscar não apenas
ampliar a frequência do alelo T, mas sim a frequência do genótipo TT. O fato dos alelos
e genótipos desse dois SNP estarem em baixa frequência nos grupos estudados indica que
a seleção a partir de suas informações tem grande potencial de melhorar o tamanho do
Longissimus dorsi em ovinos Santa Inês.
Apesar de polimorfismos no gene CAST terem influenciado o rendimento de todos
os cortes da carcaça (lombo, paleta, pernil, costela e pescoço), não foram observados
efeitos sobre os rendimentos das carcaças quente e fria. Contudo, o SNP g.93396154T>C
teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre o rendimento biológico (Tabela 4), com o
alelo T aumentando o valor médio. As frequências alélicas e genotípicas desse SNP não
diferiram entre os grupos estudados (Tabela 2), mas pode se observar que apesar do alelo
116
desejável ser mais frequente nos dois grupos estudados, o genótipo desejável (TT) é
menos frequente que o heterozigoto TC, indicando que há espaço para ampliar as
frequências do alelo e do genótipo desejáveis.
O SNP g.93397718C>T teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre as larguras
da carcaça nas regiões da garupa e do tórax e para as características cromáticas da carne
(L*, a* e b*) (Tabela 4). Ampliar essas larguras pode levar as carcaças a ficarem mais
pesadas e por isso o objetivo de seleção é aumentar a médias dessas duas variáveis. O
alelo C pode ajudar a atingir esse objetivo, pois a médias dos animais homozigoto CC foi
maior que a média dos homozigotos TT. As frequências alélicas e genotípicas desse SNP
não diferem entre os grupos estudados (Tabela 2) e o alelo desejável aparece com mais
de 2/3 da frequência. Contudo, o genótipo desejável pode ter sua frequência ampliada,
pois ainda há um número elevado de animais heterozigotos nos dois grupos. Porém o
aumento da frequência deste genótipo deve ser monitorado pois pode interferir na
aparecia da carne já que o C diminui os valores de L*, a* e b*. Por isso a seleção para
qualquer um destes alelos deve ser acompanhado para evitar perdas em alguma
característica de interesse.
Por fim, o SNP g.93397780T>C teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre
escore de terminação de carcaça (Tabela 4). O escore de terminação indica qual o nível
de gordura de cobertura na carcaça dos animais e ovinos Santa Inês quando abatidos em
idades mais jovens tendem a ter pouca gordura de cobertura na carcaça (Jucá et al, 2016).
Essa gordura é importante, pois sem ela em um nível adequado a carcaça tende a perder
qualidade durante o processo de resfriamento. O alelo T responsável por aumentar o valor
médio dessa variável e por isso deve ser considerado como favorável. As frequências
alélicas e genotípicas deste SNP não diferem entre os grupos estudados (Tabela 2) e a
frequência do alelo desejável já se encontra bastante alta (>89%) em ambos os grupos.
Logo, a seleção com base neste marcador não tende a trazer grande impacto na média
dessa variável.
O gene CAPN1 em ovinos está localizado no cromossomo 21 com
aproximadamente 25 kb e se dividi em 22 exons e 21 introns. Ele é responsável pela
codificação da enzima proteolítica µ-calpaína (SMITH et al., 2000), a qual atua na
degradação de fibras musculares no post-mortem. Assim, associações significativas entre
polimorfismos no gene CAPN1 e maciez de carne foram reportadas em vários estudos
com bovinos (PINTO et al., 2010; TAIT-JR et al., 2014). Já nos ovinos há relatos de
associações entre polimorfismos no gene CAPN1 com peso vivo (DEHNAVI et al, 2012)
117
e taxa de crescimento (MAHROUS et al., 2016), mas não com variáveis de carcaça e
carne. No presente estudo foram identificadas 21 ligações sugestivas (P<0,05)
envolvendo oito polimorfismos no gene CAPN1 (Tabela 5), mas nenhuma associação
significativa ao nível da correção de Bonferroni.
Tabela 5. Efeitos aditivo (a) e de dominância (d), com seus respectivos erros-padrão (EP) nos
testes de associação com polimorfismos no gene CAPN1
Variável a(EP) d(EP) LRT P
g.42625446C>T
Rendimento de costela - -1,7757 (0,8455) 10,34 0,130E-02
Perdas por cocção 0,2926 (0,1282) 0,3050 (0,1283) 4,15 0,415E-01
g.42625811G>A
Área do músculo L. dorsi -0,5317 (0,2316) - 5,19 0,227E-01
g.42626685G>A
Escore de terminação de carcaça 0,1399 (0,0544) - 6,49 0,108E-01
Rendimento de paleta -0,5888 (0,2696) - 4,70 0,300E-01
Intensidade de vermelho (a*) -0,5153 (0,2543) - 4,06 0,440E-01
g.42626996T>C
pH0 -0,0910 (0,0349) - 6,57 0,104E-01
g.42627413T>C
Escore de conformação de carcaça 0,1053 (0,0469) - 4,96 0,259E-01
Comprimento de pernil 1,0045 (0,4605) - 4,69 0,302E-01
Peso de pernil -0,2971 (0,1198) - 6,04 0,140E-01
Rendimento de pernil -2,4015 (0,8787) - 7,31 0,686E-02
Intensidade de brilho (L*) -1,4828 (0,6202) - 5,62 0,177E-01
Intensidade de amarelo (b*) -0,5907 (0,2650) - 4,89 0,269E-01
g.42627702G>C
Peso da carcaça fria 0,6152 (0,2945) - 4,31 0,378E-01
Profundidade do tórax 0,4657 (0,2104) - 4,83 0,279E-01
Peso de pescoço 0,0553 (0,0267) - 4,25 0,393E-01
g.42628173T>C
Comprimento interno da carcaça 0,6507 (0,3080) - 4,41 0,358E-01
g.42628421A>G
Peso de costela 0,3137 (0,1016) -0,4464 (0,2064) 10,22 0,603E-02
Peso do lombo desossado -0,0372 (0,0179) - 4,26 0,390E-01
Força de cisalhamento 0,1993 (0,0714) - 7,62 0,575E-02
LRT - Likelihood ratio test; Prob - Probabilidade do teste LRT
O SNP g.42625446C>T teve efeito de dominância (P<0,05) sobre rendimento de
costela. O rendimento de costela é uma variável que os criadores desejam aumentar o
valor médio, enquanto para as perdas por cocção o objetivo é reduzir o valor médio. Para
a variável rendimento de costela o efeito de dominância foi negativo e indica que a média
dos heterozigotos é inferior à média dos dois homozigotos. Outro SNP que também afeta
uma medida de costela é o g.42628421A>G, mas neste caso além de efeito de dominância
também há efeito aditivo. Para este SNP o efeito de dominância também é negativo e
novamente a média dos heterozigotos é inferior à média dos dois homozigotos. O alelo
118
que aumenta peso de costela no SNP g.42628421A>G é o A. Para ambos os SNP as
frequências alélicas e genotípicas diferem entre os grupos estudados (Tabela 3), indicando
que a resposta a seleção pode variar em função do rebanho. Contudo, o alelo A do SNP
g.42628421A>G apesar de ser desejável, já se encontra em alta frequência nos dois
grupos aqui estudados. O SNP g.42625446C>T também teve efeito sobre perdas por
cocção, mas neste caso tem-se efeito aditivo e de dominância. Perda por cocção é um uma
variável que o objetivo de seleção visa reduzir seu valor e o alelo T pode contribuir para
atingir esse objetivo. As frequências alélicas e genotípicas desse marcador diferem
(P<0,05) entre os grupos estudados (Tabela 2), sendo a frequência do alelo T menor que
a do alelo C em ambos os grupos, mas bem menor no grupo Embrapa, no qual não foi
observado nenhum animal TT. O fato do efeito de dominância deste marcador ser
positivo indica que os heterozigotos apresentam perda por cocção maior que a média dos
heterozigotos, o que leva a necessidade de buscar animais homozigotos para TT e não
apenas ampliar a frequência do alelo T.
O SNP g.42625811G>A teve efeito aditivo sobre a área do músculo Longissimus
dorsi, sendo o alelo G responsável por aumentar o valor médio dessa variável. As
frequências genotípicas diferem entre os grupos Embrapa e UFBA (Tabela 3), mas as
frequências alélicas são semelhantes nestes. A frequência do alelo G já se encontra acima
de 65% em ambos os grupos, mas o genótipo desejável GG ainda pode ter sua frequência
ampliada de forma significativa, visto que ainda há muito animais heterozigotos,
principalmente, no grupo UFBA. Outro SNP que influencia esse músculo é o
g.42628421A>G, mas neste caso através do peso de lombo desossado e força de
cisalhamento (Tabela 5). Este SNP teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) e o alelo que
aumenta o peso do lombo é o A. Este mesmo alelo diminuo a força de cisalhamento, o
que é desejável. Contudo, como já mencionado, este alelo está em alta frequência nos
dois grupos estudados e pouco ganho é esperado com a utilização de sua informação no
processo de seleção.
O SNP g.42626685G>A teve efeitos aditivos sugestivos (P<0,05) sobre escore de
terminação de carcaça, rendimento de paleta e intensidades da cor vermelha (a*), com o
alelo G proporcionando maiores valores de escore de terminação, enquanto o alelo A
aumenta o rendimento de paleta e a intensidade da cor vermelha. Como já mencionado, a
seleção para escore de terminação visa aumentar o grau de acabamento das carcaças dos
ovinos Santa Inês, visto serem muito desprovidas de gordura quando os animais são
abatidos jovens. Por outro lado, a paleta é um corte comercial valorizado e ampliar seu
119
tamanho pode trazer benefícios, bem como a intensidade da cor vermelha que influencia
na aparência da carne. Assim, as informações deste marcador devem ser utilizadas com
cautela e seja qual for o alelo escolhido é importante manter um monitoramento das
demais variáveis para evitar perdas. As frequências alélicas e genotípicas deste SNP
diferem entre os grupos Embrapa e UFBA (Tabela 3). Contudo, em ambos os grupos o
alelo G é mais frequente que o A e o genótipo GG mais frequente que os demais. Logo,
a seleção visando ampliar o rendimento de paleta e a intensidade da cor vermelha pode
trazer maiores ganhos que a seleção para ampliar escore de terminação de carcaça.
O SNP g.42626996T>C teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre pH da carne
logo após abate (Tabela 5), sendo o alelo C responsável por aumentar o valor dessa
variável. Para este marcador as frequências alélicas e genotípicas diferem entre os grupos
estudados (Tabela 3), seno o alelo C mais frequente que o T em ambos os grupos, mas as
frequências destes alelos diferem principalmente no grupo UFBA. Por se desejar valores
de pH não muito altos, o alelo T pode ser o alelo favorável, mas em todos os genótipos o
pH foi inferior a sete que é o recomendado logo após abate.
O SNP g.42627413T>C teve efeitos aditivos sugestivos (P<0,05) sobre escore de
conformação de carcaça, comprimento de pernil, peso de pernil, rendimento de pernil,
intensidades de brilho (L*) e da cor vermelha (a*) (Tabela 5). O objetivo de seleção para
essas variáveis é aumentar o valor médio e o alelo T foi o responsável pelo aumento nos
valores médios do escore de conformação de carcaça e do comprimento de pernil,
enquanto o alelo C aumentou o valor médio do peso, rendimento de pernil, L* e a*.
Novamente tem-se as frequências genotípicas e alélicas diferindo entre os grupos
Embrapa e UFBA (Tabela 3). Tanto o alelo C quanto o genótipo CC aparecem em baixa
frequência nos grupos estudados, o que indica maior potencial de ganho com a seleção
direcionada para este alelo e genótipo do que o ganho com a seleção para o alelo T ou
genótipo TT. Ressalta-se que a raça Santa Inês carece de um trabalho de seleção que
melhore o desenvolvimento do pernil e as informações deste marcador podem ser uteis
neste processo.
O SNP g.42627702G>C teve efeitos aditivos sugestivos (P<0,05) sobre os pesos
de carcaça fria e pescoço e sobre profundidade do tórax (Tabela 5), sendo o alelo G
responsável por aumentar o valor médio das três variáveis. As frequências alélicas e
genotípicas deste marcador diferem (P<0,05) em função dos grupos Embrapa e UFBA
(Tabela 3), mas o alelo G é mais frequente que o C em ambos os grupos. A frequência do
120
genótipo GG é superior a 60% em ambos os grupos, indicando que os ganhos com a
seleção para este genótipo podem não ser tão altos.
Por fim, o SNP g.42628173T>C teve efeito aditivo sugestivo (P<0,05) sobre
comprimento interno da carcaça (Tabela 5). O Alelo T aumentou o valor médio dessa
variável e sua frequência não difere entre os grupos estudados (Tabela 3), sendo maior
que a do alelo C em ambos os grupos. Já as frequências genotípicas deste SNP não são
similares entre os grupos UFBA e Embrapa, sendo o genótipo TT mais frequente que os
demais no grupo Embrapa, enquanto no grupo UFBA o genótipo TC é o mais comum.
Logo, a resposta a seleção com base na informação deste marcador dependerá das
frequências genotípicas do rebanho sob seleção.
Variáveis relacionadas com qualidade de carne e de crescimento foram mais
exploradas que aquelas relacionadas com atributos de carcaça em estudos de associação
com polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 em ovinos. Aali et al., (2017) reportaram
haplótipos no gene CAST, formados a partir dos SNPs C24T, G62A, G65T e T69- (intron
5) e c.197A>T e c.282G >T (exon 6), associados a maciez de carne, perfil de ácidos
graxos e colesterol na carne de ovinos. Knight et al., (2012) também citam efeitos dos
SNPs 101781475G>A e 101841509C>T no gene CAST sobre maciez da carne ovina, mas
nenhum efeito de polimorfismos no gene CAPN1 sobre essa variável. Enquanto Knight
et al., (2014) identificaram o SNP localizado na posição 101783060 entre os exons 1 e 2
do gene CAST, associado a maciez da carne cinco dias pós-abate, mas não identificaram
nenhum efeito do gene CAPN1 sobre essa variável. Outros estudos reportam efeito de
polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 sobre crescimento. Nassiry et al., (2006)
reportaram polimorfismo do tipo PCR-SSCP associado a ganho de peso do nascimento a
desmama em ovinos da raça Kurdi, enquanto Khan et al., (2012) reportaram associação
entre polimorfismos do tipo PCR-RFLP no exon 1 do gene CAST e ganho de peso em
ovinos das raças Balkhi e Kajli. Porém, Sutikno et al., (2011) e Denhavi et al., (2012)
também testaram associação com peso vivo, mas não encontraram efeito significativo
(P>0,05) de polimorfismo no gene CAST. Denhavi et al., (2012) reportaram associação
de polimorfismo PCR-RFLP no gene CAPN1 associado com peso aos 12 meses, enquanto
Mahrous et al., (2016) identificaram SNP no intron-5 do gene CAPN1 afetando peso vivo
e ganho de peso diário.
Polimorfismos nos genes CAST e CAPN1 que influenciam peso vivo em ovinos,
então pode haver efeito para atributos de carcaça. Contudo, apenas um estudo reportou
ter realizado testes de associação de polimorfismos no gene CAST e CAPN1 com variáveis
121
de qualidade de carcaça em ovinos, até o presente momento. Knight et al., (2014)
realizaram teste de associação de polimorfismos nestes genes para três variáveis de
carcaça: profundidade do músculo Longissimus entre a 12ª e 13ª costelas, espessura de
gordura neste músculo na mesma região e o peso de carcaça quente, mas não encontraram
nenhum efeito de SNPs nos genes CAST ou CAPN1 sobres estas três variáveis. Logo, o
presente estudo é o primeiro a reportar efeitos de polimorfismos no gene CAST sobre
variáveis de carcaça em ovinos.
Os polimorfismos aqui identificados como associados a atributos de carcaça estão
localizados em região de intron. É possível que estes polimorfismos estejam em
desequilíbrio de ligação com outros polimorfismos posicionados em exons nestes genes
ou em outros genes vizinhos. Também não se pode descartar a hipótese de que essas
mutações em intron sejam de fato funcionais, pois mutações nos sítios de junção de exon-
intron (KRAWCZAK et al., 2006) ou mesmo um pouco afastadas deste sitio (COOPER,
2010), mais ainda dentro de região de intron, podem afetar a transcrição do gene ou a
eficiência do splicing. Saravanaperumal et al., (2012) cita que um evento de splicing no
intron 5 do gene SCF (Stem cell factor) em ovinos levou a formação de dois tipos de
proteína SCF, uma solúvel e outra insolúvel, as quais possuem número diferente de
aminoácidos. Assim, maiores estudos devem ser desenvolvidos em busca de elucidar o
mecanismo de ação que essas mutações em intron dos genes CAST e CAPN1 utilizam
para influenciar atributos de carcaça nos ovinos Santa Inês. De qualquer forma, os
achados do presente estudo indicam potencial de uso de polimorfismos nestes genes em
programas de seleção para melhoria de variáveis de qualidade de carcaça em ovinos,
especialmente na raça Santa Inês.
CONCLUSÕES
Existem pelo menos 58 mutações no gene CAST em ovinos Santa Inês quando
comparado ao gene referência depositado no NCBI, sendo que 13 SNPs aqui encontrados
ainda não haviam sido depositados no NCBI. Enquanto no gene CAPN1 existem pelo
menos 45 mutações, das quais 11 ainda não haviam sido depositadas no NCBI.
Apenas uma mutação (g.93395643G>A) no gene CAST foi localizada em região
de exon, indicando que o gene em questão tem regiões de exon com baixa variabilidade.
Este SNP é uma mutação sinônima, pois a troca de base não altera o aminoácido Treonina.
O Mesmo foi observado para o gene CAPN1, no qual apenas o marcador g.42628678C>T
122
foi localizado em região codificadora. Também se trata de uma mutação sinônima, pois
o novo códon não altera o aminoácido Arparagina.
Os SNPs g.93395190A>T, g.93395218A>G, g.93395243T>G, g.93395307T>C,
g.93395469G>C, g.93395478G>A, g.93395835G>A, g.93396080A>G,
g.93396154T>C, g.93396162T>C, g.93396257T>C, g.93396809G>A, g.93397179G>A,
g.93397600C>G, g.93397718C>T e g.93397780T>C no gene CAST apresentam efeito
aditivo sugestivo (P<0,05) para pelo menos uma característica aqui estudada. Já para o
gene CAPN1 os SNPs g.42625446C>T, g.42625811G>A, g.42626685G>A,
g.42626996T>C, g.42627413T>C, g.42627702G>C, g.42628173T>C e g.42628421A>G
apresentam efeito aditivo sugestivo (P<0,05) para pelo menos um atributo de carcaça ou
qualidade de carne. Assim, estes SNPs são os potenciais marcadores para programas de
seleção em ovinos Santa Inês. Ressalta-se que para muitos destes SNPs há variação de
frequências genotípicas e alélicas entre os rebanhos Santa Inês e a resposta a seleção
dependerá dessas frequências.
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125
CONSIDERAÇÕES GERAIS
O presente estudo identificou um elevado número de marcadores nos genes
estudados, dos quais 115 SPN apresentaram distribuição de frequência que permitiu
utilizá-los em testes de associação, sendo 6 (IGF1), 16 (LEP), 52 (CAST), 5 (GH) e 36
(CAPN1). Contudo, grande parte dos marcadores encontram-se em introns e apenas seis
estão em exon. Isso evidencia que as regiões de exon dos genes estudados apresentam
pouca variação, o que já era de se esperar por se tratar de genes que atuam em várias
etapas importantes do metabolismo. Porém, algumas regiões de exon não foram
sequenciadas no presente estudo e é possí vel que polimorfismos nelas estejam
influenciando a variação das características aqui estudados. Assim, recomenda-se que
sejam identificados marcadores tanto nos exons quanto nos introns que não foram
estudados no presente trabalho, a fim de que uma varredura mais completa do efeito
destes genes seja efetuada.
Para alguns marcadores as frequências genotípicas e alélicas diferiram de forma
expressiva entres os dois grupos de animais estudados (Embrapa e UFBA). Isso indica
que há variação nas frequências de alguns marcadores dentro dos rebanhos da raça Santa
Inês e a resposta ao processo de seleção dependerá muito da frequência do alelo favorável
no rebanho sob seleção.
Marcadores nos genes GH, LEP, IGF1, CAPN1 e CAST apresentaram associação
com as características aqui estudadas. Alguns destes efeitos foram aditivos e podem ser
boa fonte de informação para a seleção de ovinos da raça Santa Inês.