Post on 05-Oct-2020
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA
INSTITUTO DE QUÍMICA
Anne Natalia Almeida de Oliveira
Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera Floribunda
NATAL,RN
2015
Anne Natalia Almeida de Oliveira
Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera floribunda
NATAL,RN
2015
Monografia apresentada ao Instituto de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Química.
Orientadora: Profª. Drª. Renata Mendonça Araújo
Divisão de Serviços Técnicos
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN Biblioteca Setorial do Instituto de Química
Oliveira, Anne Natália Almeida de.
Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera floribunda/ Anne Natália Almeida de
Oliveira. – Natal, RN, 2015.
62 f. : il.
Orientadora: Renata Mendonça Araújo.
Monografia (Graduação em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra.
1. Bredemeyera floribunda – Monografia. 2. Polygalaceae – Monografia. 3. Raiz-
de-cobra – Monografia. I. Araújo, Renata Mendonça. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UFRN/BSE- Instituto de Química CDU 54:615 (02)
Anne Natalia Almeida de Oliveira
Estudo químico/farmacológico de Bredemeyera floribunda
Monografia apresentada ao Instituto de Química, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Bacharel em Química, na área de concentração em Química Orgânica.
Aprovada em : ___/___/___
_________________________________________________________
Profa. Dra. Renata Mendonça de Araujo (Orientadora)
_________________________________________________________
Prof. Dr. Fabricio Gava Menezes
_________________________________________________________
Ms. Daniele Silva dos Santos
Tu, Senhor, guardarás em perfeita paz
aquele cujo propósito está firme, porque em ti confia.
Isaías 26:3
AGRADECIMENTOS
Quero primeiramente agradecer a Deus por toda a força e capacitação para
realização deste trabalho, sem Ele, nada disso estaria acontecendo.
Quero também agradecer ao meu pai Paulo Roberto, que mesmo não
estando presente fisicamente, me deu as forças necessárias para que eu pudesse
seguir em frente.
Agradeço a minha mãe Kilza, que sempre enfrentou as dificuldades que a
vida lhe impôs, em busca do melhor para todos os seus filhos. Obrigada por não me
deixar desistir, obrigada por cada injeção de ânimo. Eu amo a senhora.
Á meu padrasto Maciel que me deu todo o suporte necessário para realização
deste sonho. Obrigada por me escolher e me acolher como sua filha, a você o meu
eterno agradecimento. Te amo.
À os meus irmãos, que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
deste sonho. Eu amo vocês.
À os meus padrinhos Manoel Fontes e Nudia Fontes, por toda a ajuda, os
senhores contribuíram muito para a realização deste sonho. Amo vocês.
À Deusiely Avelar, por sempre estar pronta para me ajudar, por ouvir as
minhas reclamações, não me deixar desistir e acreditar no meu potencial. Muito
obrigada
À Sheeza Duarte, que está comigo desde o primeiro semestre, me ajudando
em tudo, me aconselhando e o mais importante, acreditando no meu potencial
quando eu não acreditava mais. Muito obrigada.
Aos grandes e inesquecíveis amigos: Jéssica Santana, Ângela Luciana e
Taiannie Soriano que nas horas de sufoco, estiveram ali dizendo que no final tudo
daria certo.
À minha orientadora Renata Mendonça, pela a força, pela a amizade e pela
orientação nesses 4 anos, que certamente contribuíram para o meu crescimento
como profissional. Obrigada por sempre acreditar no meu potencial.
Aos companheiros de laboratório desde os antigos até os mais recentes, em
especial aos meus colegas de área: Gizely, Marcela, Rusceli, Vanessa, Kleiton,
Nara, Daniele e Fatima. Também aos meus vizinhos de pesquisa, os alunos da
síntese: Erivaldo Paulino, Edson Lima, Jannielly, Lilian e Djalan.
À CNPq e UFRN.
RESUMO
Certas espécies de plantas são utilizadas popularmente para tratar
acidentes com animais peçonhentos, e seus estudos se mostram interessantes do
ponto de vista fitoquímico, muitas vezes contribuindo para o isolamento e
identificação de compostos biologicamente ativos. A espécie Bredemeyera
floribunda Willd, pertencente à família Polygalaceae, é uma destas espécies
conhecida popularmente como “raiz de cobra” devido ao seu uso como antiofídico.
Além de suas propriedades antiofídicas, também é conhecida por suas propriedades
expectorante, diurética e hipotensiva. O estudo cromatográfico desta planta resultou
no isolamento de dois metabolitos secundário, a primeira um flavonoide rutina e a
segunda uma xantona, denominada 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona. Indicou
também a presença de açúcares, além de uma fração contendo uma mistura de
duas saponinas. Essas com um estimado valor biológico, devido às várias atividades
desenvolvidas por elas e por isso incentivam a continuação desse trabalho. A
determinação estrutural dos metabólitos secundários isolados foi realizada através
das técnicas: Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C, uni e bidimensionais e
comparação com dados de RMN da literatura. O estudo anti-hemorrágico mostrou
atividade para o extrato da planta, mas não para o constituinte majoritário, o
flavonóide rutina.
Palavras-chave: Bredemeyera floribunda. Polygalaceae. “raiz-de-cobra”.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Bredemeyera floribunda Willd........................................................... 17
Figura 2 - Fotografia de Bothrops jararacussu.................................................. 18
Figura 3 - Esqueleto base da xantona............................................................... 19
Figura 4 - Estrutura básica da saponina característica da família
Polygalaceae.....................................................................................
25
Figura 5 - Bredemeyerosídeo C da espécie B.
Floribunda..........................................................................................
26
Figura 6 - Bredemeyerosídeo D da espécie B. Floribunda................................ 26
Figura 7 - Esqueleto básico do núcleo xantona................................................. 27
Figura 8 - Espectro de RMN 1H (MeOD, 400 MHz) de B1.................................. 42
Figura 9 - Expansão do espectro RMN 1H (MeOD, 400 MHz) entre δ 6,19 e
7,67 da B1.........................................................................................
43
Figura 10- Espectro de RMN 13C (MeOD, 100 MHz) de B1................................ 44
Figura 11- Espectro de HSQC (C5D5N, 500 MHz) de B1.................................... 45
Figura 12- Estrutura do flavonóide Rutina (B1) .................................................. 46
Figura 13- Espectro de RMN 13C (D2O, 125 MHz) de B2................................... 48
Figura 14- Espectro RMN 1H (D2O, 500 MHz) de B2.......................................... 49
Figura 15- Espectro de RMN 1H (DMSO, 300 MHz) de B3................................. 51
Figura 16- Espectro de RMN 13C (DMSO, 75 MHz) de B3............................................ 52
Figura 17- Espectro de HSQC (DMSO, 500 MHz) de B3.................................... 53
Figura 18- Estrutura da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona.............................. 54
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Dados da obtenção dos extratos de B. floribunda............................. 32
Tabela 2 - Dados da obtenção dos extratos após a partição de B. floribunda... 33
Tabela 3 - Dados finais da B1............................................................................. 34
Tabela 4 - Dados finais de B2............................................................................. 36
Tabela 5 - Dados finais de B3............................................................................. 38
Tabela 6 - Dados de RMN 1H (MeOD, 400 MHz) e 13C (MeOD, 100 MHz) de
B1 e dados da literatura de MOURA et al., 2011..............................
48
Tabela 7 - Dados de RMN 1H e 13C da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona (SILVEIRA et al., 1995)......................................................................
54
LISTA DE ABREVIATURAS
BFRE - Extrato etanólico da raiz de Bredemeyera floribunda
BFRMA - Extrato da raíz de Bredemeyera floribunda em metanol/água
(70:30)
BFTE - Extrato etanolico do talo de Bredemeyera floribunda
CCD - Cromatografia de Camada Delgada
CENAUREMN-
UFC -
Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância
Magnética Nuclear da Universidade Federal do Ceará
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
DMSO - Dimetilssulfóxido
HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HSQC - Heteronuclear Single Quantum Correlation
MS Ministério da Saúde
PBS - Veneno de B. jararacussu em solução salina
RMN - Ressonância Magnética Nuclear
SAB - Soro antibotrópico
SINAN- Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SUS- Sistema Único de Saúde
VBju - Veneno de Bothrops jararacussu
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................... 13
1.1 PLANTAS MEDICINAIS ....................................................................... 13
1.2 ACIDENTES OFÍDICOS ...................................................................... 14
2 OBJETIVOS......................................................................................... 16
2.1 Objetivo geral........................................................................................ 16
2.2 Objetivos específicos............................................................................ 16
3 CONSIDERAÇÕES.............................................................................. 17
3.1 SOBRE FAMÍLIA POLYGALACEAE.................................................... 17
3.2 SOBRE BREDEMEYERA FLORIBUNDA WILLD................................. 17
4 BOTHROPS JARARACUSSU............................................................. 18
5 PRINCIPAIS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ISOLADOS DO
GÊNERO BREDEMEYERA.................................................................
20
5.1 XANTONAS........................................................................................... 20
5.2 SAPONINAS.......................................................................................... 25
5.3 FLAVONOIDE........................................................................................ 28
6 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.................................................... 30
6.1 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS...................................................... 30
6.2 METODOS ESPECTROSCOPICOS..................................................... 31
6.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de
Hidrogênio (RMN 1H) e de carbono-13 (RMN 13C)............................
31
6.3 MATERIAL VEGETAL...........................................................................
32
6.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS............................................................. 32
6.5 PARTIÇÃO LIQUIDO/LIQUIDO............................................................. 33
7 ESTUDO FITOQUIMICO DE BREDEMEYERA FLORIBUNDA........... 34
7.1 FRACIONAMENTO CROMOTOGRÁFICO DO EXTRATO BFRE........ 34
7.2 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO BFRMA/C.. 36
7.3 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO BFTE......... 38
8 TESTES BIOLÓGICOS......................................................................... 40
8.1 ENSAIOS IN VIVO PARA ATIVIDADE HEMORRÁGICA...................... 40
9 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 41
9.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B1.................................................. 45
9.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B2.................................................. 48
9.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B3.................................................. 51
10 ATIVIDADES BIOLOGICAS................................................................. 55
10.1 ATIVIDADE HEMORRÁGICA................................................................ 55
11 CONCLUSÃO........................................................................................ 56
REFERÊNCIAS..................................................................................... 57
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 PLANTAS MEDICINAIS
A utilização de plantas como medicamento é tão antiga quanto a própria
existência do homem. Há relatos da utilização de plantas medicinais na terapêutica
por várias civilizações antigas, como chinesas, assírias e egípcias. Os egípcios, em
seus papiros de 2.300 a.C. já mencionavam vários nomes de substâncias, ou nomes
de preparações como: mirra, ópio, aloe, cássia, dentre outras, que eram utilizadas
em atividades, como o embalsamamento de múmias (VOEKS, 2004).
No Brasil, o uso de plantas medicinais e a automedicação, práticas
comuns que se inserem nas circunstâncias analisadas anteriormente, podem
incluir fatores como crenças, carência econômica, dificuldade de acesso à
assistência médica ou ainda por influência da mídia, que promove os produtos
que contém em suas formulações diversos componentes naturais (ARRAIS et
al.,1997; LOYOLA-FILHO et al., 2002; SCHENKEL et al., 2004).
O governo brasileiro aprovou em 2006 duas políticas públicas que
inserem no Sistema Único de Saúde (SUS) a utilização das plantas medicinais
e dos fitoterápicos. A Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
têm como objetivo geral a garantia de acesso seguro e racional de plantas
medicinais e fitoterápicos, promoção do uso sustentável da biodiversidade e
desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional (BRASIL, 2006a)
Até metade do século XX, antes do crescimento da síntese química, as
plantas medicinais representavam a base da terapia medicamentosa. Ainda hoje,
medicamentos obtidos a base de plantas são amplamente utilizados na terapêutica.
Podemos citar como um exemplo clássico a Papaver somniferum L.
(Papaveraceae), popularmente conhecida como papoula, usada para produção do
ópio, que tem como principal componente a morfina, substância há muito tempo
empregada para combater a dor (FOGLIO et al., 2006).
Algumas plantas medicinais representam uma importante fonte de
compostos bioativos com capacidade de auxiliar diretamente no tratamento de
envenenamentos ofídicos, ou complementar a utilização da soroterapia tradicional.
Sendo assim, pessoas do mundo todo se utilizam de plantas para tratar
acidentes ofídicos, principalmente indígenas e residentes de zonas rurais. (MORS et
al., 2000; SOARES et al., 2009).
14
O emprego de plantas no tratamento de acidentes peçonhentos é uma prática
comum em vários povos do mundo, principalmente em regiões de difícil acesso ao
soro anti-ofídico. Extratos de plantas têm recebido considerável atenção como
antídotos alternativos, tendo algumas plantas sua atividade antiofídica relatada,
como Curcuma longa (FERREIRA et al, 1992), Casearia sylvestris (BORGES et al,
2001) e Bauhinia forficata (OLIVEIRA et al, 2005).
1.2 ACIDENTES OFÍDICOS
O emprego de plantas medicinais para o tratamento em casos de acidentes
ofídicos se dá há vários séculos. Curandeiros em todo o mundo relatam que extratos
aquosos ou etanólicos de plantas medicinais, tem capacidade de aliviar o edema e a
hemorragia (OTERO et al., 2000). A aplicação tópica da planta na área da picada,
mastigar as folhas ou cascas, ou ainda ingerir os extratos ou decocções são alguns
procedimentos realizados com o intuito de neutralizar a atividade do veneno (MEBS,
2000).
Acidentes com serpentes peçonhentas podem ser considerados preocupantes
para a saúde pública, principalmente em regiões tropicais e subtropicais tais como,
África, Ásia, Oceania e América Latina, por ocorrerem com maior frequência,
causando considerável morbi-mortalidade (PINHO et al., 2004; CRUZ et al., 2009).
Segundo dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação
(SINAN) do Ministério da Saúde (MS), foram registrados entre os anos de 2000 a
2013, um total de 360.506 casos de acidentes envolvendo serpentes peçonhentas,
com uma média de 14,0 casos a cada 100.000 habitantes, resultando em 1.487
óbitos (BRASIL, 2015). Em torno de 90% desses acidentes são causados por
serpentes do gênero Bothrops, com nomes populares tais como: jararaca,
jararacussu, urutu, caiçaca e comboia (SANTORO et al., 2008).
Oficialmente, os acidentes ofídicos são tratados exclusivamente por
soroterapia, que consiste na administração de anticorpos que auxiliam a neutralizar
as toxinas da peçonha. Um dos fatores limitantes desse tratamento é que em alguns
casos, as pessoas que são mordidas residem em local afastado do lugar onde
ocorre a administração do soro antiofídico. E consequentemente, a ação do soro se
torna limitada, pois devido ao extenso tempo transcorrido até o atendimento, a
peçonha já destruiu grande parte dos tecidos (CARDOSO et al., 2003).
15
A soroterapia, mesmo administrada em tempo hábil, é eficaz na neutralização
de efeitos sistêmicos, mas tem limitações quanto a neutralização de danos teciduais
locais (MELO et al., 2007). Pesquisas têm sido realizadas com o intuito de encontrar
tratamentos alternativos para casos de pacientes que sofreram acidentes ofídicos,
tais como: o uso de plantas medicinais, terapia com irradiação a laser e, ainda, de
terapias baseadas no emprego de anticorpos recombinantes humanos, visando o
tratamento de danos locais e promovendo efeitos anti-inflamatórios, alívio da dor e
aumento da regeneração do tecido danificado (BARBOSA et al., 2008).
São produzidos os seguintes soros antibotrópicos: antibotrópico
pentavalente, produzido a partir dos venenos de Bothrops jararaca (50%), Bothrops
jararacussu, Bothrops alternatus, Bothrops moojeni e Bothrops neuwedii (12,5%
cada); antibotrópico-crotálico, acrescentando-se soro anticrotálico (Crotalus durissus
terrificus) ao soro antibotrópico pentavalente; antibotrópico-laquético (Lachesis muta)
e antibotrópico-laquético-crotálico (ARAÚJO et al., 2008).
As raízes de B. floribunda são utilizadas amplamente no Brasil,
especialmente no Nordeste, sob a forma de infusões, chás e outras preparações
para o tratamento de diversas enfermidades, principalmente em acidentes ofídicos,
cálculo renal e hipertensão, infecções da pele, disenteria amebiana, reumatismo e
manifestações sifílicas (BEVEVINO et al., 1994).
Os estudos fitoquímicos realizados com esta espécie constataram que seus
principais constituintes são saponinas, xantonas e flavonóides. Desses, as
saponinas constituem a classe de substâncias mais interessantes, (exemplificadas
pelos Bredemeyerosídeos B, C e D, substâncias que apresentaram forte atividade
antiofídica (SILVEIRA et al., 1995; PEREIRA et al., 1996; DAROS et al., 1996).
16
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Contribuir para o conhecimento químico e farmacológico da espécie
Bredemeyera floribunda Willd e testar a atividade hemorrágica do extrato e
substâncias isoladas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Preparar extratos orgânicos e aquosos das raízes de Bredemeyera floribunda;
Particionar os extratos orgânicos obtidos por meio de partição líquido/líquido
e/ou cromatografia em gel de sílica;
Isolar os metabólitos secundários através de métodos apropriados, como
técnicas de cromatografia em coluna (adsorção e/ou exclusão molecular)
Identificar os metabólitos secundários presentes nas frações;
Elucidar estruturalmente os compostos isolados por meio de técnicas
espectroscópicas como RMN 1H e 13C uni e bidimensionais e comparação
com a literatura.
Testar a atividade hemorrágica do extrato, frações e substâncias isoladas
17
3 CONSIDERAÇÕES
3.1. SOBRE A FAMÍLIA POLYGALACEAE.
A família Polygalaceae engloba alguns gêneros, dentre eles o Bredemeyera,
com espécies encontradas nas Américas Central e do Sul e nas Índias Ocidentais.
No Brasil, este gênero é representado por 14 espécies que estão espalhadas desde
a região Nordeste até o estado do Paraná, com a maioria ocorrendo entre os
estados do Amazonas e Minas Gerais. Entretanto, consta na literatura estudos
incluindo a planta em listagens também da região Sul (LUDTKE et al., 2008).
Espécies desta família são conhecidas por conter compostos químicos que
exibem atividades analgésica, expectorante, sedativa, antifúngica, entre outras. A
família também tem sido alvo de estudos fitoquímicos, nos quais já foram descritos
saponinas, xantonas, derivados de pironas, cumarinas, ácidos graxos, fenóis e
alcaloides.
Duas espécies deste gênero são encontradas no Ceará, sendo as duas
denominadas pelo mesmo nome popular, Bredemeyera floribunda Willd., encontrada
na serra de Ibiapaba, e Bredemeyera brevifolia Klotzsch., encontrada na chapada do
Araripe (MATOS, 2007).
3.2 SOBRE A ESPÉCIE BREDEMEYERA FLORIBUNDA WILLD.
Conhecida popularmente por pacari, botica-inteira, marfim-de-rama, pau-
rendoso, pau-caixão, pau-gemada, laça-vaqueiro, raiz-de-cobra e raiz-de-joão-da-
costa. Duas espécies deste gênero são encontradas no Ceará, sendo as duas
denominadas pelo mesmo nome popular, Bredemeyera floribunda Willd., encontrada
na serra de Ibiapaba, e Bredemeyera brevifolia Klotzsch., encontrada na chapada do
Araripe (MATOS, 2007).
Bredemeyera floribunda Willd Figura 1 é uma trepadeira lenhosa e pertence à
família Polygalaceae. Possui folhas simples e glabras de 7-10 centímetros de
comprimento. Suas flores, reunidas em vistosas inflorescências, são alvacentas com
as asas amarelas ou vermelhas e perfumadas. As raízes têm casca espessa quase
esponjosa, amarga e espumígea quando agitadas com água (MATOS, 2007).
18
O estudo da espécie é bastante extenso, portanto várias classes de
substâncias já foram identificadas e isoladas das suas raízes, como xantonas,
saponinas e flavonoides.
Figura 1 - Bredemeyera Floribunda Willd.
Fonte: Profº Francisco José de Abreu Matos, Horto de Plantas Medicinais, Campus do Pici, UFC.
4 BOTHROPS JARARACUSSU
A Bothrops Jararacussu é responsável por mais de 80% dos acidentes
peçonhentos no Brasil (BRASIL, 2015).
No território brasileiro, o gênero Bothrops (família Viperidae, subfamília
Crotalinae) possui 20 espécies já classificadas. São consideradas solenóglifas, pois
os dentes inoculadores de veneno situam-se na parte anterior do maxilar. Dentro
desse gênero, as serpentes da espécie B. jararacussu podem alcançar maior
comprimento (até 1,8 m) e produzem maior quantidade de veneno, predominando
nas regiões Sul e Sudeste do país (ZENI et al., 2007; BRASIL, 2015). Esta espécie
representada na Figura 2 é conhecida popularmente como urutu dourado ou
surucucu tapete e pode atingir até 22 centímetros de diâmetro.
É encontrada em florestas tropicais, pântanos e margens de rios do Brasil,
em várias ilhas na região sul do Rio Grande do Sul, nordeste da Argentina e sul da
Bolívia e do Paraguai (MILANI et al., 1997).
19
Figura 2 - Fotografia de Bothrops jararacussu.
Fonte: http://www.panoramio.com/photo/9179345.
A produção de veneno dessa espécie é a maior do gênero, podendo atingir 1
g de peso seco (MILANI et al., 1997).
20
5 PRINCIPAIS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS ISOLADOS DO GÊNERO
BREDEMEYERA
5.1 XANTONAS
A palavra xantona é derivada do grego e significa amarelo, cor apresentada
pela grande maioria desses constituintes químicos (ROBERTS, 1961). A xantona,
ou quimicamente 9H-xanten-9-ona, é estruturalmente formada por dois anéis
benzênicos (A e B) e uma γ-pirona central (C), conferindo um arranjo simétrico a
esse tipo de esqueleto. A classe das xantonas abrange uma importante série de
heterociclos oxigenados bastante estudados quimicamente (SULTANBAWA, 1980).
Neste desenho esquemático Figura 3, as posições numeradas de 1-4 e de
5-8 correspondem aos carbonos com h idrogên ios substituíveis, resultando em
uma variedade de derivados xantônicos, que podem ser obtidos por meios naturais
(ROBERTS 1961; VIEIRA et al., 2005) ou por rotas sintéticas (SOUSA et al.,
2005). As demais posições não estão susceptíveis a introdução de nenhum
grupamento químico, pois já são completamente substituídas.
Figura 3 - Esqueleto básico do núcleo xantona
O
O
B A
8
7
6
5
8a 8b
4b 4a
1
2
3
4
Fonte: Autor, 2015
21
As xantonas possuem várias atividades biológicas e medicinais, como por
exemplo bactericida, antiviral, antioxidativa, anti-inflamatória, anti-hipertensiva,
antitrombótica, anticâncer, citotóxica, coagulante, antifúngica, entre outras (PERES
et al., 1997).
As plantas produzem esses metabólitos aparentemente para o controle do
estresse oxidativo, causado pela incidência da luz solar e oxigênio. Assim, esses
metabólitos representam uma interessante fonte de novos compostos com
atividade antioxidante, e muitos estudos estão sendo realizados com o objetivo
de identificar novas substâncias antioxidantes com baixa toxicidade
(SCARTEZZINI et al., 2000).
Geralmente, a alta atividade antioxidante de derivados fenólicos, como
hidroxixantonas, é atribuída aos substituintes OH que atuam como poderosos
doadores de próton. Isso ocorre devido à deslocalização de elétrons ao longo da
molécula estabilizando os radicais fenoxi R–O.
A presença de hidroxilas no núcleo xantona, além de contribuir para o
aumento da atividade antioxidante, promove também a captura de radicais
livres, e atuação como quelante de metais, bem como no impedimento da
oxidação lipídica. (SATO et al., 1992). Essa propriedade tem implicado na
melhora de sua ação hepatoprogressiva (FERNANDES et al., 1995; MARTINEZ et
al., 2001) e quimiopreventiva ao câncer (MACKEEN et al., 2000; PAULETTI et
al., 2003), além de antiinflamatória (MADAN et al., 2002; JIANG et al., 2004).
Para ilustrar alguns integrantes deste grupo, no Quadro 1 estão
representados seis substâncias conhecidas e bastante estudadas
biologicamente. As xantonas e seus respectivos grupos são: fusarindina
(simples), mangiferina (glicosilada), mangostina (prenilada), kielcorina
(xantonolignóide), Globulixantona E (bis-xantona) e xantofulvina (miscelânea).
22
Quadro 1: Alguns representantes de cada classe das xantonas.
O
OCH3 OH
OHOH
87
6
5
1
2
3
4
O
O
OH
OH
OH
OHOH
OH
OH
OH
O
O
H3CO
OH
OH
CH3
CH3
OH
CH3 CH3
O
O
O
OCH3
O
O
OH OH
OCH3
Fusarindina (simples)
Mangiferina (glicosilada)
Mangostina (prenilada)
Kielcorina (xantonolignóide)
23
O
OH OH
OH
OCH3
O
O
O
O
CH3
CH3
CH3
CH3
O
O COOH
OH
OH
CH3 OO
OH
OH
COOHMeOCO
Fonte: Autor, 2015
Do gênero Bredemeyera, foram isoladas 5 xantonas, duas das quais foram
isoladas de Bredemeyera brevifolia e três isoladas de Bredemeyera floribunda. No
Quadro 2 abaixo estão apresentadas as xantonas isoladas para este gênero.
(OLIVEIRA, 2000; SILVEIRA et al, 1995).
Globulixantona E (bis-xantona)
Xantofulvina (miscelânea)
24
Quadro 2 : Xantonas isoladas do gênero Bredemeyera
O
OO
O O
O
OCH3
O
OCH3
OH
OH
OCH3
OCH3
O
O
H3CO
OH
OH
O
OH
OCH3
O
OCH3
OH
OH
OH
OCH3
O
O
O
O
CH3 OCH3OCH3
H3CO
B. brevifolia B. brevifolia
B. floribunda B. floribunda
B. floribunda
Fonte: Autor, 2015
1-metoxi-2,3,7,8-dimetilenodioxixantona
1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona
1,3,6-trihidroxi-2,7-dimetoxixantona 1,3,7-trihidroxi-4,8-dimetoxixantona
1,7,8-trimetoxi-2,3-metilenodioxixantona
25
5.2 SAPONINAS
As saponinas constituem uma classe química bastante heterogênea, cujo
nome deriva de sua propriedade de formação de espuma em solução aquosa
(MILGATE et al., 1995). Estão amplamente distribuídas em diversas espécies
vegetais abrangendo aproximadamente 100 famílias (OLESZEK, 2002) e alguns
gêneros de esponjas marinhas. Quimicamente são constituídas por uma porção
hidrofóbica triterpênica ou esteróide ligada a uma ou mais cadeias de açúcares, em
geral, glicose, galactose, ácido glicurônico, xilose ou metilpentose (FRANCIS et al.,
2002) cuja massa molecular pode variar entre 600 e 2000 Da, aproximadamente
(OLESZEK, 2002; SCHENKEL et al, 2003).
Saponinas são subdivididas em duas classes, triterpênicas e esteroidais,
ambas derivadas do óxido de esqualeno, com 30 átomos de carbono (C30). A
diferença entre estas duas classes é que as saponinas esteroidais têm 3 grupos
metila a menos (C27), enquanto as saponinas triterpênicas se mantêm com 30
átomos de carbono. (RIBEIRO, 2012)
As saponinas mais comumente encontradas na natureza são as triterpênicas
com agliconas de 30 átomos de carbono. Nesta classe, 50% apresentam o
núcleo hidrofóbico do tipo oleano (HILLER, 1987).
As saponinas podem ser subdivididas também em função do número de
cadeias de açúcares ligados. As que apresentam uma única cadeia de açúcar
ligado à aglicona, via ligação éter na posição C3, são as monodesmosídicas.
Quando apresentam duas ou três cadeias de açúcares são classificadas como
bidesmosídicas ou tridesmosídicas, respectivamente (HILLER, 1987; SCHENKEL
et al., 2003).
Embora as saponinas tenham sido utilizadas por séculos como detergente
doméstico (SPARG et al., 2004), devido a sua característica lipofílica com a
presença de uma aglicona sóluvel em lipídeo e das unidades solúveis em água nas
cadeias laterais (GÜÇLÜ-ÜNTÜNDAĞ et al., 2007), as novas descobertas acerca
das propriedades anticâncer das saponinas de origem vegetal tem itensificado as
produções científicas na área. Além disso, as saponinas também são bastante
conhecidas por possuírem complexos metálicos de ferro, zinco e cálcio (MILGATE et
al., 1995).
26
Do mesmo modo que as indústrias farmacêutica, alimentícia e cosmética
vêm utilizando as saponinas, outros tipos de indústrias também exploram o potencial
desse metabólito. Elas o fazem através de subprodutos ricos em saponinas
(derivados da produção do petróleo), utilizando-os como vermífogo botânico e
gerindo seletivamente minhocas lançadas em campos de golfe e outros esportes
(AUGUSTIN et al., 2011).
A maior parte das saponinas da família Polygalaceae foi isolada do extrato
bruto das raízes das plantas obtido a partir de etanol/água 70%. As saponinas desta
família possuem uma estrutura bem característica e intimamente relacionada,
constituindo triterpenóides pentacíclicos oxigenados, como mostra a Figura 4. Além
disso, a maior parte é composta por glicosídeos bidesmosídicos baseadas em
agliconas com uma ou duas glicoses em C3 e de um a seis açúcares em C28, sendo
acilados pelos ácidos para, di ou trimetoxicinâmico e/ou ácido acético (LACAILLE-
DUBOIS et al., 2005).
Figura 4 - Estrutura básica da saponina característica da família Polygalaceae
OH
O
H
CH3CH3
R1
OHR2 CH3
CH3 CH3
R3
1
2
3 4
5
10
6
7
8
9
11
12
13
14
15
1817
16
19 20 21
22
2825
2324
27
26
29 30
Fonte: Autor, 2015
Três saponinas já foram isoladas da espécie Bredemeyera floribunda, sendo
conhecidos como Bredemeyerosídeos B, C Figura 5 e D Figura 6. Destes, não foi
encontrada a estrutura do Bredemeyerosídeo B. (PEREIRA et al., 1996).
27
Figura 5 - Bredemeyerosídeo C da espécie B. Floribunda
Fonte: Autor, 2015
Figura 6 - Bredemeyerosídeo D da espécie B. Floribunda
Fonte: CAVALCANTE, 2015.
28
5.3 FLAVONOIDES
Os flavonoides fazem parte de uma subclasse de polifenóis, caracterizados
por possuir quinze átomos carbonos no seu esqueleto básico. A sua estrutura geral
é formada por dois anéis aromáticos (anel A e anel B), com mais três átomos de
carbono que unem os dois anéis e formam um terceiro oxigenado entre eles (anel
C). Compostos que possuem como esqueleto básico a estrutura apresentada na
Figura 7 são denominados flavonoides. Quando apresentam uma unidade
glicosídica ou O-glicosídica ligadas a algum átomo de carbono da cadeia, são
classificados como flavonoides glicosilados. Esses compostos agem como
antioxidantes, não apenas pelo seu poder doador de hidrogênio ou elétrons, mas
também devido a seus radicais intermediários estáveis, que impedem a oxidação de
vários ingredientes de alimentos, por exemplo. (BRAND-WILLIAMS, 1995)
Figura 7 - Esqueleto base de um flavonoide
O
2
3
45
6
7
8
1' 5'
4'2'
A
B
C
Fonte: Autor, 2015
Os flavonoides podem ainda ser divididos entre diferentes classes, o quadro
3 exemplifica as principais subclasses reportadas na literatura e suas respectivas
estruturas moleculares.
29
Quadro 3 : Subclasses dos flavonoides
O
O
O
O
OH
O
OH
O
O
O+
OH
O
O
Fonte: Autor, 2015
Flavanona
Flavonol
Flavanol
Antocianina
Isoflavona
Flavona
30
6 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
6.1 MÉTODOS CROMATOGRAFICOS
Nas cromatografias de adsorção foram utilizadas gel de sílica 60 Ø 63-200 μm
e de sílica 60 para coluna cromatográfica flash (Ø 400 - 200 μm) da marca Ultra
Chem. O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as
alíquotas das amostras e as quantidades de gel de sílica utilizadas. As colunas
utilizadas na cromatografia de adsorção sob pressão média (cromatografia flash)
foram de vidro resistente à pressão e continham bulbos no ápice, para
armazenamento do solvente.
Na Cromatografia de Exclusão Molecular, os fracionamentos foram
efetuados em gel de dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals,
utilizando-se como eluente metanol.
Para cromatografia de camada delgada (CCD) utilizou-se cromatoplacas de
gel de sílica 60 (Ø 2-25 μm) sobre poliéster e/ou alumínio T-6145 da marca Sigma
Chemical CO.
Os eluentes utilizados foram: hexano, clorofórmio, diclorometano, acetato de
etila, e metanol, puros ou combinados em proporções crescentes de polaridade.
A revelação das substâncias nas cromatoplacas analíticas foi realizada por
imersão em solução de vanilina (C8H8O3) e ácido perclórico (HClO4) em etanol
(C2H6O), seguido de aquecimento em chapa a 100 0C por aproximadamente 5
minutos, ou ainda por exposição a vapores de iodo e observação sob luz UV.
31
6.2 MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS
6.2.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e de carbono-13 (RMN 13C)
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e
Carbono-13 (RMN 13C), uni e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetros
Bruker, modelo Avance DRX-500 e processados no programa Bruker TopSpin
versão 3.0, em computador com windows 7.0, pertencentes ao Centro Nordestino de
Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal do
Ceará (CENAUREMN-UFC).
Os experimentos foram realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500 e
DPX-300. O tipo de sonda variou conforme o tipo de técnica: sonda dual de 5 mm
com detecção direta (experimentos unidimensionais) e sonda multinuclear de 5 mm
com detecção inversa (experimentos bidimensionais). As amostras foram dissolvidas
em alíquotas de 0,6 mL de solvente deuterado: clorofórmio (CDCl3), água (D2O) e
metanol (CD3OD), Tedia Brazil. Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em
partes por milhão (ppm) e referenciados, no caso dos espectros de Hidrogênio,
pelos picos dos hidrogênios pertencentes às moléculas residuais não-deuteradas
dos solventes deuterados utilizados: clorofórmio (δ 7,27), metanol (δ 3,31), água (δ
4,80), piridina (δ 8,73, 7,59 e 7,22) e DMSO (δ 2,71). Nos espectros de 13C, os
deslocamentos químicos foram referenciados pelos picos centrais dos carbonos-13
dos solventes: clorofórmio (δ 77,23), metanol (δ 49,15), piridina (δ 150,2 ) e DMSO (δ
40,1).
As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H foram
indicadas segundo a convenção: s (singleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t
(tripleto), q (quarteto), m (multipleto).
Os microprogramas utilizados para a aquisição dos dados foram: 1H (zg),
13C-CPD (zgpg), 13C-DEPT 135 o (dept135), gs-COSY (cosygp), gs-HSQC
(hsqcgpph), gs-HMBC (hmbclpndqf).
A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com
ângulos de nutação de 135 o, CH e CH2 com amplitudes em oposição aos CH2, e 90
o, somente CH, foi utilizada na determinação do padrão de hidrogenação dos
carbonos em RMN 13C, descrito segundo a convenção: C (carbono não-
32
hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2 (carbono metilênico ou metilidênico) e
CH3 (carbono metílico). Os carbonos não-hidrogenados foram caracterizados pela
subtração do espectro DEPT 135 do espectro BB.
Os experimentos bidimensionais de correlação heteronuclear (HSQC e
HMBC), realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500, foram efetuados em sonda
multinuclear de 5 mm, com detecção inversa, empregando-se gradiente de campo,
posicionado no eixo z e magnitude de 10 A. Os valores de J utilizados para os
experimentos pertinentes foram 1JH,C = 145, nJH,C = 7, onde n ≥ 2.
6.3 MATERIAL VEGETAL
As raízes e talos de Bredemeyera floribunda Willd utilizadas no estudo foram
coletadas na chapada Araripe, Ceará, em março de 2013. A planta foi identificada
por comparação com um espécime de B. floribunda, coletado em Julho de 2001 em
Macaíbas, região do Crato, no Ceará, e depositado no Herbário Prisco Bezerra, da
Universidade Federal do Ceará, com Nº de exsicata 30844.
6.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS
Após a coleta das raízes de Bredemeyera floribunda e do talo, estas foram
trituradas e colocadas em mariote contendo etanol e um outro contendo
metanol/água. Posteriormente o resíduo da planta foi filtrado com algodão, para
remoção de partículas maiores, e o solvente evaporado à pressão reduzida, dando
origem ao extrato etanólico das raízes de B. Floribunda, denominado BFRE, ao
extrato etanólico do talo chamado de BFTE e ao extrato hidroalcoólico denominado
BFRMA. Os extratos estão descriminados na Tabela 01.
Tabela 01 - Dados da obtenção dos extratos de B. floribunda
Fonte: Autor, 2015
Extratos Massa(g)
BFRE 20
BFTE 26,4
BFRMA 3,58
33
6.5 PARTIÇÃO LÍQUIDO/LÍQUIDO
O extrato bruto BFRMA (3,5817g) foi submetido à extração líquido-líquido,
utilizando como solventes hexano (C6H14), clorofórmio (CHCl3) e acetato de etila
(C4H8O2). Foram adicionados 80,0 mL de água e 30,0 mL de MeOH, e então esta foi
colocada em funil de separação, juntamente com 100,0 mL de hexano (4 x 25,0 mL)
então separou-se a solução hexânica (BFRMA/H). Em seguida, adicionou-se à fase
hidro-alcoólica 100,0 mL de clorofórmio (4 x 25,0 mL), e separou-se a solução
clorofórmica (BFRMA/C) para cada extrato bruto. Removida esta fração, adicionou-
se ao funil 40,0 mL de acetato de etila, separando então a solução (BFRMA/AC).
Logo após estes procedimentos, os resíduos hidro-alcoólicos foram reunidos. As
extrações com solventes foram concentradas em evaporador rotativo de baixa
pressão, originando seus respectivos extratos, como descriminados na Tabela 02.
Tabela 02 - Dados da obtenção dos extratos após a partição de B. floribunda
Fonte: Autor, 2015
Extratos Massa (g)
BFRMA/H 0,28
BFRMA/C 1,53
BFRMA/AC 0,58
34
7 ESTUDO FITOQUIMICO DE BREDEMEYERA FLORIBUNDA
7.1 FRACIONAMENTO DO EXTRATO BFRE
O extrato BFRE foi submetido a um processo de liofilização, resultando em
14g de pó amarelo, o qual foi submetido à cromatografia do tipo em gel de dextrana
Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals, utilizando-se metanol puro. Este
procedimento foi realizado quatro vezes, todas utilizando apenas metanol como fase
móvel. Para a primeira coluna utilizou-se uma massa de amostra de 3,3031g,
obtendo 17 frações; a segunda com massa 3,7477g, resultando em 14 frações; a
terceira com massa 3,4170g, obtendo 16 frações; por fim, a quarta com 3,5333g,
rendendo 13 frações. As frações obtidas foram analisadas por CCD e reunidas de
acordo com a sua semelhança, resultando em 5 frações denominadas A, B, C, D e
E, como apresentadas na Tabela 03 e no Fluxograma 1, abaixo. Estas frações
foram analisadas por RMN 1H para caracterização química inicial do extrato, depois
também por RMN 13C, quando constatou-se que a fração BFRE-D se tratava de um
flavonoide rutina, denominada B1.
Tabela 03 - Dados finais da B1
Fonte: Autor, 2015
Frações Finais Massa(g)
A 6,1 g
B 0,5g
C 0,9g
D 2,6g
E 3,2g
35
FLUXOGRAMA 1 : Procedimento experimental da B1
Fonte: Autor, 2015
RAIZ
1) Maceração
2) Liofilização
Extrato
Liofilizado
3) Sephadex LH-20
5) RMN
A B C D E
4) CCD
5) RMN 5) RMN 5) RMN 5) RMN
Saponina e
Sacarose
E
Sacarose
E
Sacarose e
Rutina
E
B1
E
Flavonoide e
Rutina
E
36
7.2 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO BFRMA/C
O extrato BFRMA/C (1,5361g) foi submetido à cromatografia de exclusão
molecular em gel de dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals,
utilizando-se metanol puro. Este procedimento foi realizado cinco vezes, todas
utilizando apenas metanol como fase móvel. Para a primeira coluna utilizou-se uma
massa de 0,3031g, obtendo 11 frações; a segunda com massa 0,2477g, resultando
em 09 frações; a terceira com massa 0,3170g, obtendo 10 frações, a quarta com
0,331g, rendendo 10 frações, por fim a quinta com 0,313g. As frações obtidas foram
analisadas por CCD e reunidas de acordo com a sua semelhança, resultando em 3
frações denominadas A, B, C e D, como apresentadas na Tabela 04 e no
Fluxograma 3, abaixo. Após análise dos espectros de RMN 1H e 13C, constatou-se
que a fração B é uma saponina, ainda não totalmente identificada, denominada B2.
Tabela 04 - Dados finais da B2
Fonte: Autor, 2015
Frações Finais Massa(g)
A 0,2453g
B 0,3057g
C
D
0,2958g
0,3145g
37
FLUXOGRAMA 02: Procedimento experimental da B2
Fonte: Autor, 2015
TALO
Extrato
hidroalcolico
1) Maceração
2) Partição liquido/liquido
BFRMA/H BFRMA/C BFRMA/Ac
3) Sephadex LH-20
4) CCD
A B C
5) RMN
B2
38
7.3 FRACIONAMENTO CROMATOGRÁFICO DO EXTRATO BFTE
O extrato BFTE (26,4g) foi submetido a cromatografia de adsorção (coluna do
tipo filtrante), utilizando eluição gradiente com misturas binárias dos solventes
hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol. Foram obtidas 20 frações, que foram
analisadas por CCD e reunidas de acordo com a sua semelhança. A fração 7
(0,8857g) apresentou-se promissora, sendo então submetida à cromatografia de
adsorção sob pressão média (coluna “flash”). Após este procedimento, a fração 08
foi analisada por CCD, como apresentadas no Fluxograma 3 e na Tabela 05
abaixo, posteriormente encaminhada para o RMN. Após análise dos espectros de
RMN 1H e 13C, constatou-se que a fração 08 tratava-se da 1,7-dihidroxi-3,4,8-
trimetoxixantona, denominada B3.
TABELA 05 - Dados finais da B3
Fonte: Autor, 2015
Frações Finais Massa(g)
01-02 0,2811g
03-04 0,0457g
05-07 0,0797g
08 0,0992g
09-10 0,0867g
11-14 0,0371g
15-16
17-18
19-20
0,129g
0,0237g
0,0025g
39
FLUXOGRAMA 03: Procedimento experimental da B3
Fonte: Autor, 2015
TALO Extrato
etanólico 1) Maceração
2) Coluna filtrante
20 frações
3) CCD
01-02 03-04 05-07 08 09-10 11-14 15-16 17-18 19-20
5) RMN
07
4) Coluna “flash”
B3
40
8 TESTES BIOLÓGICOS
Os testes biológicos do extrato das raízes de Bredemeyera floribunda,
frações e substâncias isoladas foram realizados no Laboratório de Farmacologia de
Venenos e Toxinas (LAFAVET) da UFC, pela mestranda Natacha Queiroz e por
Rafael Ximenez, sob a orientação da professora Helena Serra Azul Monteiro.
8.1 ENSAIOS IN VIVO PARA ATIVIDADE HEMORRAGICA
a) Grupos experimentais
I. Grupo veneno: animais tratados com 50 μg/animal de veneno de Bothrops
jararacussu (vBju) dissolvidos em 50μL de solução de NaCl 0,9%.
II - Grupo pré-tratado i.p.: animais tratados com o extrato de B. floribunda (BFRE;
150mg/kg, i.p.) 30 minutos antes da administração do veneno (50 μg/animal).
III – Grupo pré-tratado v.o.: animais tratados com o extrato de B. floribunda (BFRE;
150mg/kg, v.o.) 30 minutos antes da administração do veneno (50 μg/animal).
IV- Grupo pós-tratado i.p.: animais tratados com BFRE (150mg/kg, i.p.) 30 minutos
após a administração do vBju (50 μg/animal).
V - Grupo pós-tratado v.o.: animais tratados com BFRE (150mg/kg, v.o.) 30 minutos
após a administração do vBju (50 μg/animal).
VI - Grupo pré-incubado: animais tratados com BFRE (150mg/kg) e vBju (50
μg/animal), (1:3, p/p) pré-incubados por 15 minutos a temperatura de 37º C.
VII - Grupo controle com soro antibotrópico (SAB): animais tratados com SAB i.p.
(quantidade suficiente para neutralizar 500 μg de veneno) 30 minutos antes da
administração do vBju (50 μg/animal).
41
b) Procedimento Experimental
Camundongos machos Swiss, foram anestesiados com pentobarbital sódico
(50mg/kg i.p.) para posteriormente ter o dorso tricotomizado onde foi injetado por via
intradérmica 50 μL de uma solução contendo 50 μg de vBju. Os tratamentos foram
realizados conforme os grupos experimentais discriminados anteriormente.
Decorridas 2 horas para cada grupo, os animais foram sacrificados e a pele do dorso
foi removida. A superfície interna da pele foi examinada e fotografada. O tamanho da
área hemorrágica foi medido com o programa Image®, um software desenvolvido
por Wayne Rasband do Research Services Branch, National Institute of Mental
Health, Bethesda, Maryland. A área dos halos é contornada por meio de ferramentas
do programa e o resultado é transformado de pixels para mm². O tecido do dorso foi
coletado para análise histológica (ESMERALDINO et al., 2005).
42
9 RESULTADOS E DISCUSSÃO
9.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B1
Após os procedimentos cromatográficos realizados com o extrato etanólico
das raízes de B. floribunda, obteve-se 5,3 g de uma substância denominada B1, que
apresentou-se como um sólido alaranjado e solúvel em metanol.
O espectro de RMN 1H (MeOD, 500 MHz, Figura 8) apresentou absorções
características de hidrogênios de ligações glicosídicas entre δ 3,26 e 3,81 ppm. E
ainda, absorções características de hidrogênios aromáticos com deslocamento entre
δ 6,19 e 7,67 ppm.
Figura 8 - Espectro de RMN 1H (MeOD, 400 MHz) de B1
Fonte: Autoria própria, 2015
2
3456
7
89
10
1'
2'3'
4'
5'
6'
OO
O
HOH
HO
O
OH
OH
OH
O
O
HO
OH
OH
OH
O
1"
2"
3"4"
5"6"
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''6'''
43
Figura 9 - Expansão do espectro RMN 1H (MeOD, 400 MHz) entre δ 6,19 e 7,67 da B1
Analisando a região compreendida entre δ 6,19 e 7,67 (Figura 9), foi
possível identificar δ 6,19 (H6, d, J = 1,8 Hz) e δ 6,38 (H8) o qual não foi possível
calcular a constante de acoplamento, devido o sinal não apresentar multiplicidade.
Contudo a constante de acoplamento para o H6, além de outros sinais espectrais
como 13C, apontam para um acoplamento meta entre si. Foi possível também
visualizar os acoplamentos dos hidrogênios 5´ e 6´ localizados no anel B, com
deslocamentos δ 6,87 (H5’, d, J =6,7 Hz) e δ 7,62 (H6’, dd, J = 1,4 Hz e 6,7 Hz) ppm,
com acoplamento orto e meta. E neste mesmo anel temos o hidrogênio em δ 7,67
(H2’, d, J = 1,36 Hz), em um acoplamento meta com o hidrogênio 6’.
44
O espectro de RMN 13C (100MHz, MEOD, Figura 10) apresentou um sinal
em δ 18,0 ppm, característico de carbono metílico. Na região compreendida entre δ
68,6 e 104,8 ppm, há presença de carbonos com hibridização sp3 oxigenados,
característicos de carbonos de unidades glicosídicas, além de duas absorções
características de carbonos anoméricos em δ 102,5 (C-1’’’) e 104,8 (C-1’’). No
intervalo entre δ 105,7 até 166,0 ppm, foi observado absorções características de
carbonos sp2 pertencentes à anéis aromáticos. Além destes o espectro também
mostrou uma absorção característica de carbonila de cetona alfa-beta-insaturada em
δ 179,4 ppm.
Figura 10 - Espectro de RMN 13C (MeOD, 100 MHz) de B1
Fonte: Autoria própria, 2015
2
3456
7
89
10
1'
2'3'
4'
5'
6'
OO
O
HOH
HO
O
OH
OH
OH
O
O
HO
OH
OH
OH
O
1"
2"
3"4"
5"6"
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''6'''
45
A análise do espectro de RMN bidimensional de correlação heteronuclear a
uma ligação (1H, 13C – HSQC) (Figura 11) corroborou com o padrão de
hidrogenação proposto para cada carbono (Tabela 5).
Figura 11 - Espectro de HSQC (C5D5N, 500 MHz) de B1
46
Todos esses dados indicados nos espectros de Ressonância Magnética
Nuclear, além da comparação com dados disponíveis na literatura (Tabela 5),
comprovam que o metabólito secundário denominado B1 se trata do flavonoide
rutina, (Figura 13) já descrito anteriormente (MOURA et al., 2011).
Figura 12 - Estrutura do flavonóide Rutina (B1)
Fonte: Autor, 2015
2
3456
7
89
10
1'
2'3'
4'
5'
6'
OO
O
HOH
HO
O
OH
OH
OH
O
O
HO
OH
OH
OH
O
1"
2"
3"4"
5"6"
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''6'''
47
Tabela 06 - Dados de RMN 1H (MeOD, 400 MHz) e 13C (MeOD, 100 MHz) de B1 e dados da literatura
de MOURA et al., 2011.
Fonte: Autor, 2015
C RMN 13C RMN 13C
MOURA et al.,
2011
RMN 1H
(int.,mult., JH,H)
RMN 1H
(int.,mult., JH,H)
MOURA et al., 2011
2 159,4 156,5
3 145,9 133,2
4 179,4 177,3
5 163,0 161,2
6 100,0 98,7 6,19 (1 H, d, J=1,4 Hz)
6,20 (1 H, d, J=2,1 Hz)
7 166,0 164,5
8 95,0 93,6 6,38 (1 H, d, J=1,4 Hz)
6,40 (1 H, d, J=2,1 Hz)
9 158,5 156,4
10 105,7 103,7
1’ 135,7 121,5
2’ 123,4 116,2 7,67 (1 H, d, 1,4 Hz) 7,53 (1 H, d, J=2,0 Hz)
3’ 117,8 115,2
4’ 149,8 148,5
5’ 116,1 115,2 6,87 (1 H, d, J=6,7 Hz)
6,83 (1 H, d, J=9,0 Hz)
6’ 123,2 121,0 7,62 (1 H, dd, J=1,4 Hz e J=6,7 Hz)
7,75 (1 H, dd, J=2,4 Hz e J=7,8 Hz)
1’’ 104,8 101,2
2’’ 77,2 75,8
3’’ 75,8 74,0
4’’ 71,4 69,9
5’’ 78,2 76,4
6’’ 68,6 66,9
1’’’ 102,5 100,7
2’’’ 72,3 70,5
3’’’ 72,1 70,3
4’’’ 74,0 71,8
5’’’ 68,9 68,2
6’’’ 18,0 17,6
48
9.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B2
Após os procedimentos cromatográficos realizados com o extrato aquoso
das raízes de B. floribunda, obteve-se também 0,300g de uma amostra denominada
B2, que apresentou-se como um cristal esbranquiçado e solúvel em metanol.
Esta fração foi submetida à análise por RMN 13C e o espectro (D2O, 500
MHz, Figura 13) obtido revelou tratar-se de uma mistura de saponinas.
Figura 13 - Espectro de RMN 13C (D2O, 100 MHz) de B2.
Fonte: Autoria própria, 2015
49
Embora o espectro seja claro em relação à presença de saponina
triterpênica glicosilada através de absorções características de carbonos sp3 entre δ
13,1 e 51,1. Além disso, os sinais dos carbonos sp2 em δ 125,5 (C-12) e 138,7 (C-
13) são característicos de aglicona do tipo presenegenina, já descritas na literatura
para esta espécie (VASCONCELOS, 2015). Os carboidratos foram observados na
região do espectro entre δ 60,7 e 83,7 e os carbonos anoméricos foram observados
entre δ 92,9 e 109,6. Do mesmo modo, o espectro ainda revelou a presença de 4
carbonilas em δ 175,6, 170,4, 170,3 e 169,57 que demonstraram mais uma vez que
esta fração se tratava de uma mistura de duas saponinas, já que as saponinas
relatadas na literatura possuem apenas duas carbonilas em seu esqueleto.
Figura 14 - Espectro RMN 1H (D2O, 500 MHz) de B2.
Fonte: Autoria própria, 2015
50
A análise desta fração permitiu a identificação de uma classe de substâncias
anteriormente isolada dessa espécie, as saponinas. Elas têm estimado valor
biológico, devido às várias atividades desenvolvidas por elas e por isso incentivam a
continuação desse trabalho.
9.3 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA B3
A amostra B3 apresentou-se como um sólido amarelo, solúvel em clorofórmio,
que foi analisado por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono
(RMN1H e RMN13C).
Figura 15 - Espectro de RMN 1H (DMSO, 300 MHz) de B3
Fonte: Autoria própria, 2015
O
O OH
OCH3
OCH3
OH
OCH3
8
7
6
5
8a 8b
4b 4a
1
2
3
4
51
O espectro de RMN1H (300 MHz, DMSO, Figura 15) revelou um sinal de
hidrogênio em região de campo baixo (δ 13,14 ppm), indicando presença de uma
hidroxila quelada, devido ao alto deslocamento observado no valor do sinal do
próton. Além destes sinais, havia também dois pares de dubletos centrados em δ
7,38 (1 H, J = 9,0 Hz) e δ 7,28 ppm (1 H, J = 9,0 Hz), indicando a presença de
hidrogênios aromáticos vizinhos, com acoplamento orto.
Também foi identificado um sinal singleto em δ 6,51, referente a hidrogênio
ligado a anel aromático protegido por efeitos ressonantes provenientes da hidroxila
ligada ao C-1 e C-2, o espectro evidenciou picos para absorções grupos metoxi, com
deslocamentos em δ 3,91, 3,80, 3,76 ppm. Após a verificação de todos os sinais dos
espectros, foi possível concluir que a substância em questão era uma xantona
trimetoxilada.
Figura 16 - Espectro de RMN 13C (DMSO 75 MHz) de B3
O
O OH
OCH3
OCH3
OH
OCH3
8
7
6
5
8a 8b
4b 4a
1
2
3
4
52
O espectro de 13C (75 MHz, DMSO, Figura 16) nos possibilitou identificar
treze carbonos com hidribização sp2, sendo três deles hidrogenados em δ 94,6,
113,3 e 124,4 e nove não hidrogenados em δ159,2, 114,6, 146,9, 114,7, 102,6,
145,5, 127,5, 146,9 e 149,3 como também uma absorção característica de carbonila
em δ 180,9. Indicou também a presença de três grupos metoxi, mostrando duas
absorções em δ 60,8 e δ 60,9, referente ao impedimento estérico que ambos os
grupos estão sofrendo. Por último, temos um sinal para um grupo metoxila
desimpedido em δ 56,4.
Através da análise do Espectro de RMN bidimensional de correlação
heteronuclear (HSQC) Figura 17, foi possível correlacionar os hidrogênios
pertencentes a cada anel aromático aos seus respectivos carbonos.
Figura 17 - Espectro de HSQC (DMSO 125 MHz) de B3
53
Todas essas absorções mostradas nos espectros de Ressonância
Magnética Nuclear, comprovam que o metabólito secundário denominado B3 se
trata da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona (Figura 18), já descrito na literatura
(SILVEIRA et al., 1995). Os dados de RMN 1H e 13C foram comparados aos dados
da literatura e organizados na Tabela 07.
Figura 18 - Estrutura da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona
O
O OH
OCH3
OCH3
OH
OCH3
8
7
6
5
8a 8b
4b 4a
1
2
3
4
Fonte: Autor, 2015
Tabela 07 - Dados de RMN 1H e 13C da 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona (SILVEIRA et al., 1995)
C δ C δ C* (SILVEIRA
et al., 1995)
δ H (mult., int., J/Hz) δ H (mult., int., J/Hz)*
(SILVEIRA et al., 1995)
1 159,2 159,3
2 94,6 94,6 6,51 (s, 1 H) 6,39 (s, 1 H)
3 158,3 158,4
4 127,5 127,5
4a 146,9 148,3
4b 149,3 149,4
5 113,3 113,4 7,28 (d, 1 H, J = 9,0) 7,25 (d, 1 H, J = 9,0)
6 124,4 124,6 7,38 (1 H, J = 9,0 Hz) 7,36 (d, 1 H, J = 9,0)
7 146,9 147,0
8 145,5 145,4
8a 114,7 114,6
8b 102,6 102,2
C=O 180,9 180,8
OMe 60,9 61,0 3,91 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H)
OMe 60,8 60,9 3,80 (s, 3 H) 3,88 (s, 3 H)
OMe 56,4 56,4 3,76 (s, 3 H) 3,94 (s, 3 H)
Fonte: Autor, 2015
54
10 ATIVIDADES BIOLÓGICAS
10.1. ATIVIDADE HEMORRÁGICA
O extrato etanólico de B. floribunda (BFRE) e o flavonóide Rutina foram
submetidos ao teste hemorrágico in vivo utilizando camundongos machos Swiss. O
teste gerou resultado promissor para o extrato e está indicado no Quadro 04.
Quadro 04 - Inibição da peçonha de B. jararacussu por BFRE
Fonte: Autor, 2015
* Os grupos representados são: Veneno de Bothrops jararacussu em solução salina (PBS), Soro
antibotrópico (SAB), Extrato de etanólico B. floribunda (BFRE): Pré-incubado (PI), Administração do
extrato 30 min antes (30’A) e Administração do extrato 30 min depois (30’D). A área hemorrágica foi
calculada em mm². Para análise estatística, foi utilizado ANOVA, seguido de Bonferroni com *P <
0,05 vs vBJu, **P < 0,01 vs vBJu ***P < 0,001 vs vBJu; # P < 0,05 vs SAB.
A hemorragia causada pela peçonha de B. jararacussu foi inibida pelo
extrato etanólico de B. floribunda nas diferentes proporções testadas. Observou-se
que a hemorragia causada pela peçonha utilizada foi mais fortemente inibida quando
administrado o extrato (BFRE) 30 min após administrar o veneno. O flavonóide
Rutina não apresentou atividade antihemorrágica.
Muitas substâncias antihemorrágicas têm sido isoladas de plantas. E
estudos sugerem que a atividade enzimática das peçonhas é alterada pelos extratos
naturais através da captação do zinco ou cálcio dos sítios catalíticos, tornando-os
inativos, ou pela interação de grupamentos dessas substâncias naturais que podem
estar interferindo na conformação estrutural das proteínas (COSTA, 2010).
55
11 CONCLUSÕES
O estudo fitoquímico do extrato etanólico das raizes e dos talos de B.
floribunda permitiu o isolamento de grande quantidade do flavonóide rutina, de uma
xantona denominada 1,7-dihidroxi-3,4,8-trimetoxixantona. Além do isolamento de
uma mistura de saponinas, presente no extrato aquoso daB. floribunda.
O extrato etanólico das raízes de B. floribunda, assim como as frações
obtidas deste e substâncias isoladas foram submetidas a ensaio hemorrágico in
vivo, utilizando o veneno de Bothrops jararacussu, demonstrando resultados
promissores, que contribuem para o conhecimento químico e biológico desta
espécie e estimulam a continuidade deste estudo
Vale considerar que a soroterapia tradicional tem eficácia limitada contra os
efeitos locais dos acidentes peçonhentos e compostos isolados de plantas mostram-
se uma boa alternativa para complementar este tratamento, o que torna a
continuidade deste estudo bastante promissor, a fim de identificar o princípio ativo
desta planta.
56
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