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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CANDIDA NÃO ALBICANS DE ORIGEM
CLÍNICA
MAIZA ROCHA DE ABRANTES
NATAL/RN 2013
ii
MAIZA ROCHA DE ABRANTES
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CANDIDA NÃO ALBICANS DE ORIGEM
CLÍNICA
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da
Saúde da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
para a obtenção do título de Doutor
em Ciências da Saúde.
Orientador: Profa. Dra. Eveline Pipolo Milan
Colaborador: Profa. Dra. Edeltrudes de Oliveira Lima - UFPB
NATAL/RN
2013
iii
v
MAIZA ROCHA DE ABRANTES
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE CANDIDA SPP DE ORIGEM CLÍNICA
Aprovada em: 06 de dezembro de 2013
BANCA EXAMINADORA:
Prfa. Dra. Eveline Pipolo Millan - UFRN (Presidente)
Prfa. Dra. Maria de Fátima Vitória Moura - UFRN (Membro Interno)
Prof. Dr. Cícero Flavio Soares Aragão - UFRN (Membro Interno)
Profa. Dra Raimunda Samia N. Brilhante - UFC - Fortaleza (Membro Externo)
Profa. Dra Hilzeth de Luna Freire Pessôa - UFPB (Membro Externo)
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Profa. Dra. Ivonete Batista de Araújo.
vi
A Deus, à minha família e a todos os que acreditam
que a evolução do ser humano ocorre através da
busca do saber.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela oportunidade da vida, pelo seu amor, seu sacrifício e
sua paixão por todos nós. Sem ele eu não seria nada, mas com ele me
sinto forte;
Aos meus pais, Manoel e Marluce por priorizar a educação na vida de seus
filhos. Agradeço em particular pelo amor incondicional e pelo incentivo;
Aos meus irmãos Sales, Jackeline, Maria do Socorro e Magna que sempre
foram parceiros;
A meu esposo, João José, por estar sempre ao meu lado, incentivando,
confiando e torcendo pelo sucesso desse trabalho;
Aos meus filhos, Ramon e Luiza, cuja existência é fonte constante de
aprendizagem, de inspiração e grande bênção;
Aos meus sobrinhos Samuel e Manuela que são alegrias em minha vida;
Às minhas orientadoras Profª. Dra. Eveline Pipolo Milan e Profª. Dra
Edeutrudes de Oliveira Lima pelas orientações, aprendizagem, confiança,
paciência e companheirismo. Vocês foram fundamentais para o meu
crescimento como profissional e como humano nesse processo, pois me
fizeram entender que nenhum obstáculo é intransponível quando a
necessidade de vencer supera as impossibilidades;
Aos companheiros de laboratório: Felipe Queiroga Sarmento Guerra,
Camilla Pinheiro de Menezes, Janiere Pereira, Elizabeth Cristina Gomes
dos Santos e Mariana Araújo Paulo de Medeiros por terem me ajudado na
execução dos experimentos e terem sido luz nos momentos de dúvidas;
À Profa. Dra. Zélia B. V. S. Pontes e à farmacêutica Maria de Fátima F. P.
Carvalho pela ajuda e contribuição;
Aos Professores Ivanaldo Amâncio da Silveira, Guilherme G. Chaves,
Geraldo B. Cavalcanti Jr. e Francisco Ricardo Lins Vieira de Melo, pelo
apoio e incentivo em prol da conquista dessa meta;
Agradeço em particular às Professoras Doutoras Telma Maria Araújo Moura
Lemos e Tereza Neuma de Souza Brito pelo apoio logístico na construção
desse doutorado;
viii
Aos professores, técnicos e funcionários do Programa de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde, minha gratidão pelas grandiosas informações e
experiências adquiridas no decorrer dessa jornada;
Ao Hospital Giselda Trigueiro (HGT) e ao Hospital Pediátrico Maria Alice
Fernandes, Natal-RN, pela doação e identificação bioquímica do Banco de
Leveduras, em especial às farmacêuticas Ana Cristina Santos Fernandes e
Maria Narriman Guimarães Goveia;
A todos vocês, o meu apreço, e que Deus os abençoe sempre.
ix
“Ao longo da torrente, em cada uma de suas margens, crescerão
árvores frutíferas de toda espécie, e sua folhagem não
murchará, e não cessarão jamais de dar frutos: todos os meses
frutos novos, porque essas águas vêm do santuário. Seus
frutos serão comestíveis e suas folhas servirão de remédio.”
(Eze. 47:12)
x
RESUMO
Candidíase é um problema de importância crescente, devido o aumento do
número de indivíduos imunocomprometidos e o surgimento de cepas
resistentes aos antifúngicos convencionais. É de fundamental importância a
busca por novos agentes antifúngicos mais eficazes, menos tóxicos, sendo os
óleos essenciais (OEs) excelentes alternativas para esse propósito. Esse
estudo investigou a atividade biológica do OE de Mentha spicata L. sobre
Candida guilliermondii de origem anal e vaginal. Para tanto foram determinadas
a Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Fungicida Mínima
(CFM), cinética do crescimento das leveduras (Time-Kill), alterações
micromorfológicas (técnica do microcultivo em câmara úmida) e investigação
do mecanismo de ação antifúngico, utilizando o bioensaio do sorbitol. O OE de
M. spicata foi obtido pelo processo de extração por destilação a vapor. Na
análise fitoquímica desse óleo foi observada a presença de carvona com
84,32%, seguida pelo limoneno (13,70%) e traços de iso-dihidrocarvona
(0,82%). Os resultados da análise da CIM variou entre 32 e 128 μg/mL. A CFM
variou entre 64 e 1024 μg/mL. Na avaliação da ação de OE e da nistatina
100UI/mL, o antifúngico padrão apresentou o efeito fungicida a partir de 4
horas e para OE de M. spicata foi observado efeito fungistático na CIM, CIMX2
e CIMX4 frente às cepas avaliadas. O OE de M. spicata apresentou forte
atividade antifúngica contra as cepas de C. guilliermondii, promovendo
alterações micromorfológicas visíveis por microscopia óptica, nas
concentrações testadas (CIM, CIMx2), resultado semelhante ao que se
observou com a nistatina (100UI/mL). Na investigação do mecanismo de ação
antifúngico foi constatado que houve alteração da CIM na presença de sorbitol,
com elevação dos valores quatro vezes maior que a concentração inicial, o que
indica que os componentes desse OE apresentam ação direta sobre a parede
celular das leveduras. Conclui-se que o OE de Mentha spicata é um potencial
agente terapêutico no tratamento de candidíase.
PALAVRAS CHAVES: Antifúngicos, Candidíase, Óleos voláteis, Produtos
naturais, Sorbitol.
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares 14
SUS Sistema Único de Saúde 14
PNPMF Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos 14
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária 14
OMS Organização Mundial de Saúde 15
ISO International Standard Organization 15
OEs Óleos Essenciais 15
CG Cromatógrafo Gasoso 19
EM Espectrômetro de Massa 19
CIM Concentração Inibitória Mínima 19
CFM Concentração Fungicida Mínima 19
DCF Departamento de Ciências Farmacêuticas 20
CCS Centro de Ciências da Saúde 20
UFPB Universidade Federal da Paraíba 20
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte 20
LUDEM Laboratório Unificado de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos
20
CECON Centro de Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda 21
ASD Ágar Sabouraud Dextrose 21
DMSO Dimetilsulfóxido 22
CSD Caldo Sabouraud Dextrose 22
HGT Hospital Giselda Trigueiro 23
YPD Extrato de levedura, Peptona, Dextrose 23
CHROMagar Ágar Cromogênico 24
UFC Unidades Formadoras de Colônias 24
A Origem Anal 29
V Origem Vaginal 29
M Molar 30
PM Peso Molecular 31
xii
LISTA DE FIGURAS, QUADROS E TABELAS
Quadro 1. Óleos essenciais utilizados no “screening” para determinação
da atividade antifúngica sobre cepas de Candida spp.
21
Tabela 1. Laudo técnico do óleo essencial de M. spicata (hortelã-
peluda)
22
Figura 1. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) - Ellof (1998)
26
Figura 1. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) - Ellof (1998)
27
Figura 2. Efeito do óleo essencial sobre o tempo de morte das leveduras - Klepser et al. (1998)
28
Figura 3. Efeito do óleo essencial de M. spicata L. sobre a morfogênese de cepas de C. guilliermondii - Técnica do microcultivo
30
Figura 4: Investigação do mecanismo de ação antifúngico - método do sorbitol
31
xiii
Sumário
Páginas
1 Introdução 13
2 Justificativa 18
3 Objetivos 19
3.1 Objetivo Geral 19
3.2 Objetivos Específicos 19
4 Métodos 20
4.1 Desenho do estudo 20
4.2 Local do trabalho 20
4.3 Obtenção do material botânico 20
4.4 Análise dos componentes do óleo essencial de M. spicata L. 22
4.5 Controle de qualidade 23
4.6 Microrganismos 23
4.7 Verificação da viabilidade e pureza das leveduras 24
4.8 Inóculo 24
4.9 Ensaios microbiológicos 24
4.9.1 Determinação da concentração inibitória mínima e concentração
fungicida mínima
24
4.9.2 Efeito do óleo essencial de M. spicata sobre o tempo de morte
das leveduras
27
4.9.3 Efeito do óleo essencial de M. spicata sobre a morfogênese de
cepas de C. guilliermondii
29
4.9.4 Investigação do mecanismo de ação antifúngico - método do
sorbitol
30
5 Artigos Produzidos 32
5.1 Artigo 1: Plant essential oils and their antimicrobial activity - review
2010-2013
32
5.2 Artigo 2: Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre leveduras
Candida não albicans
52
5.3 Artigo 3: Antifungal activity of the essential oil of M. spicata L. on
clinical strains of Candida guilliermondii
69
xiv
5.4 Artigo 4: Antifungal mechanism of essential oil from Mentha spicata
L. on clinical strains of Candida guilliermondii
87
6 Comentários, Críticas e Sugestões 107
7 Referências 109
Anexos 115
Anexo 1 Laudo técnico do óleo essencial de Mentha spicata 115
Anexo 2 Parecer da aprovação do projeto 116
13
1 INTRODUÇÃO
Candidíase é um problema relevante devido à sua frequência e
gravidade das suas complicações. Trata-se de infecção fúngica,
predominantemente endógena, de caráter oportunista e que causa significante
mortalidade e morbidade em pacientes imunocomprometidos (Rukayadi et al.,
2011, Jin et al., 2010; Kothavade et al., 2010).
A maioria dos casos de candidíase é causada por C. albicans.
Entretanto, espécies de C. não albicans têm recentemente contribuído como
agentes de infecções, indicando uma tendência de mudança na etiologia desse
agravo. As espécies de C. não albicans comumente isoladas de material clínico
são C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii, C.
kefyr, C. lusitaniae, C. viswanathii , C. famata, C. haemulonii e C. norvegensis
(Oberoi et al., 2012; Rukayadi et al., 2011; Couto et al., 2011; Santos, 2009).
Os principais agentes antifúngicos utilizados para o tratamento da
candidíase são os azóis e polienos. Os azóis, como cetoconazol, miconazol,
clotrimazol, fluconazol, itraconazol, voriconazol e, mais recentemente, o
posaconazol; atuam através da interação com a citocromo P-450-dependente
14--desmetilase, e, como resultado, inibem a síntese de ergosterol, que é o
principal componente da membrana celular fúngica. Já os polienos, nistatina,
anfotericina B e as suas formulações lipídicas atuam ligando-se aos esteróis na
membrana celular e formam canais, permitindo que os íons de K+ e Mg++ saiam
da célula. Alguns farmácos, como a anfotericina B, são muito tóxicos, e outros,
como fluconazol, são limitados por causa da alta taxa de resistência (Oliveira et
al., 2011; Lima, 2011; Mendes, 2011).
É importante ressaltar a real existência de resistência in vitro e in vivo
em isolados de Candida, pricipalmente em espécies de Candida não-albicans.
Espécie como C. krusei apresenta resistência intrínseca ao fluconazol, ao
passo que outras, como C. tropicalis e C. glabrata, têm apresentado crescente
resistência adquirida (Khan & Malik, 2012; Mendes, 2011).
A disseminação de leveduras resistentes aos antifúngicos é uma das
mais graves ameaças para o sucesso do tratamento das doenças micóticas.
Apesar da existência de antifúngicos potentes, cepas resistentes ou multi-
resistentes estão aparecendo continuamente. A necessidade de terapia
14
supressiva com antifúngicos por longo período pode ser responsável pela
seleção de cepas resistentes (Khan & Malik, 2012).
A crescente resistência aos antifúngicos, o reduzido número de
medicamentos disponíveis, limitações terapêuticas, ineficácia, toxicidade,
neutropenia grave, interações medicamentosas e a biodisponibilidade
insuficiente dos antifúngicos atualmente disponíveis tornam o tratamento das
micoses humanas muito difícil e estimulam a busca por novas alternativas
terapêuticas entre as plantas aromáticas e seus óleos essenciais,
empiricamente usados por apresentar propriedades antifúngicas (Khan & Malik,
2012; Silva, et al., 2009). Dessa forma, destaca-se a importância da busca de
novas fontes terapêuticas para o tratamento das infecções fúngicas, que se
apresentem mais eficazes e com menos efeitos adversos para o hospedeiro.
Plantas medicinais e aromáticas são amplamente empregadas na
medicina popular e têm sido extensivamente estudadas a fim de encontrar
compostos mais eficazes e menos tóxicos. Seus produtos e derivados são
reconhecidamente importantes na pesquisa farmacológica e no
desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas. Assim, constituem uma
importante fonte de novos compostos biologicamente ativos e podem ser
utilizadas como uma nova possibilidade de intervenção terapêutica. Nesse
sentido, o estudo apropriado da química e farmacologia de plantas medicinais
se apresenta como um instrumento relevante de investigação de suas
propriedades (Saad, 2010).
No Brasil, país com vasta biodiversidade, experiências atreladas ao
conhecimento popular aproximam a utilização de produtos naturais aos
recursos terapêuticos disponíveis, sendo, inclusive, esta prática recomendada
pelo poder público. Em 3 de maio de 2006, o Ministério da Saúde, através da
Portaria 971, aprovou a Política Nacional de Práticas Integrativas e
Complementares (PNPIC) no âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS)
(Ministério da Saúde (Brasil), 2006).
Em 2007, o Ministério da Saúde do governo brasileiro lançou a Política
Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), que visa garantir à
população brasileira o acesso seguro, o uso racional de plantas medicinais e
fitoterápicos através do SUS. Atualmente, doze medicamentos fitoterápicos
com registro da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) são
15
distribuídos pela rede pública em quatorze estados (Acre, Amazonas, Bahia,
Espírito Santos, Goiás, Pará, Paraíba, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul,
Santa Catarina, Sergipe, São Paulo, Tocantins e Distrito Federal). Entre os
fitoterápicos distribuídos, estão a Aloe vera (Babosa) para o tratamento de
psoríase e queimaduras, o Salix alba (Salgueiro) usado contra dores na região
lombar e a Rhamnus purshiana (Cáscara sagrada) para prisão de ventre.
Os benefícios da fitoterapia são reconhecidos pela Organização
Mundial de Saúde (OMS). Assim, medicamentos fitoterápicos assumem papel
relevante na área farmacêutica, desde que usados de forma adequada e com
qualidade assegurada (portalsaude.saude.gov.br, 2012; Ministério da Saúde
(Brasil), 2007).
A ISO (International Standard Organization) define óleos essenciais
(OEs) como produto obtido de partes de plantas através de destilação por
arraste com vapor d’água, bem como os produtos obtidos por compressão dos
pericarpos de frutos cítricos (Silva, 2011; Mendes, 2011).
Os óleos essenciais são misturas de compostos voláteis originados do
metabolismo secundário das plantas, de composição química complexa,
destacando-se a presença de terpenos e fenilpropanóides. São uma rica fonte
de compostos biologicamente ativos, conhecidos desde a antiguidade (Silva et
al., 2013; Lima et al., 2012; Saad et al., 2010) e que apresentam diversas
propriedades farmacológicas, tais como: antioxidante (Maskovic et al., 2013; Xu
et al., 2013), antiflamatória (Ramos et al., 2013; Salud et al., 2013; Arumugam
et al., 2008), larvicida (Govindarajan et al., 2012; Souza et al., 2012), inseticida
(Arango et al., 2013; Salama et al., 2012 ), antibacteriana (Guerra et al., 2013;
Castro, et al., 2011) e antifúngica (Tyagi et al., 2013; Khan & Malik, 2012;
Oliveira et al., 2011).
A atividade anticandida dos OEs vem sendo extensivamente
investigada na tentativa de disponibilizar alternativas terapêuticas para o
tratamento da candidíase. Entretanto, os mecanismos de ação desses
compostos e seus constituintes não estão totalmente elucidados. Especula-se
que a maioria dos OEs exerçam sua atividade antifúngica através de
modificações na estrutura da parede celular (Palmeira - de - Oliveira et al.,
2009).
16
O gênero Mentha (família Lamiaceae), de origem europeia, é
atualmente cultivado em todo o mundo, devido a sua utilização como
flavorizante, aromatizante e pelas aplicações farmacêuticas. A Índia produz
cerca de 80% do total mundial de óleo de menta. Embora oito espécies desse
gênero sejam cultivadas na Índia, apenas três (Mentha arvensis L., Mentha
piperita L e Mentha spicata L.) foram aprovadas pela International Standard
Organization (ISO). Esse gênero apresenta dificuldades para sua classificação
devido à grande variabilidade em suas características morfológicas e a
facilidade de hibridização (Peixoto, 2010; Ferreira, 2008).
Mentha spp. possui um dos óleos essenciais mais consumidos do
mundo, com atividade antimicrobiana comprovada e seus derivados são
largamente utilizados na produção de alimentos, de produtos de higiene,
cosméticos, farmacêuticos, tabaco e bebidas. Os fitoconstituintes do óleo de
Mentha spp. variam de acordo com a idade da planta, variedade da espécie,
região geográfica, clima e condições do processamento. Os principais
constituintes identificados são os monoterpenóides como mentol, mentona, iso
mentona, carvona, limoneno, pulegona, iso-dihidrocarvona e s-carvona
(Peixoto, 2010; Mkaddem, 2009). Alguns deles possuem alta atividade
antioxidante (Abdullah et al., 2010). A planta também é conhecida por sua ação
inseticida, propriedades antimicrobianas, antiespasmódica, antiplaquetária,
estimulante, antihelmintica e carminativa (Mkaddem, 2009).
Mentha spicata L. é uma planta comestível e medicinal, distribuída
principalmente no sudeste e sul da Ásia. É uma rizomatosa rastejante, erva
perene glabra e com um forte odor aromático. É popularmente conhecido como
hortelã peluda, hortelã rateiro, hortelã vilhoça ou hortelã verde. É um híbrido
entre M. sylvestris e M. suaveolens. A carvona e o limoneno são os principais
constituintes químicos do óleo essencial (Govindarajan et al., 2012; Mkaddem,
2009; Ferreira, 2008). Popularmente foi indicada para o tratamento de afecções
respiratórias, calmante, estomáquica como estimulante gástrico, antiflatulento,
antigripal e vermífurgo. Outras propriedades são as de antiséptico,
antiespasmódica, adstringente, carminativa, descongestionante, digestivo,
diurético e pode ser utilizada como aromatizante. Utilizada em temperos, em
gomas de mascar, bombons, pastas dentais, creme de barbear, não só pelas
suas características aromatizantes, como também pelas suas propriedades
17
bactericida e antiséptica (Ferreira, 2008). O óleo essencial de M. spicata
mostrou atividade inseticida e mutagênica forte (Chauhana et al., 2009).
Com base nessas considerações e na alta incidência da candidíase,
aumento do número de indivíduos imunocomprometidos, surgimento de cepas
resistentes aos antifúngicos comercialmente utilizados, do elevado custo do
tratamento, toxicidade dos antifúngicos existentes, é de fundamental
importância a busca por novos agentes antifúngicos mais eficazes, menos
tóxicos, economicamente viáveis, sendo os produtos derivados de plantas
medicinais, excelentes alternativas para esse propósito (Machado et al., 2013;
Peixoto, 2010).
O desenvolvimento de estratégias eficazes para o tratamento da
candidíase e outras doenças causadas por fungos é um desafio, considerando
o aumento em infecções fúngicas oportunistas em pacientes HIV positivos e
imunocomprometidos (Khan & Malik, 2012; Zirkel,et al., 2012). O objetivo
principal da busca por novos fitoterápicos não é substituir os medicamentos já
existentes, mas sim aumentar o arsenal terapêutico disponível, ofertando
medicamentos equivalentes, talvez mais baratos, com espectro de ação mais
adequado e baixo risco de desenvolvimento de resistência microbiana in vitro
(Carmo, 2011).
A pesquisa de um novo antifúngico com ação sobre fungos
potencialmente patogênicos ou oportunistas se faz necessária. Este trabalho se
propõe a avaliar a composição química, atividade biológica e mecanismo de
ação do óleo essencial de Mentha spicata L. sobre Candida guilliermondii de
origem clínica.
18
2 JUSTIFICATIVA
O gênero Candida compreende leveduras oportunistas colonizantes da
microbiota humana. Em pacientes imunocomprometidos são a causa mais
comum de infecções fúngicas, cujo espectro varia desde patologias
mucocutâneas não-fatais, a processos invasivos que podem envolver qualquer
órgão (Oliveira et al., 2011, Mendes, 2011).
A elevada incidência de candidíase nos últimos anos se deve à baixa
sensibilidade de algumas cepas aos antifúngicos utilizados na prática clínica,
necessitando diversificadas estratégias terapêuticas, tais como aumento da
dose ou do tempo de uso do antifúngico. (Oliveira et al, 2011).
Outro determinante do agravamento dessa patologia é a grande
dificuldade no tratamento, relacionado aos seus efeitos adversos, sendo
observada alta taxa de mortalidade em pacientes imunocomprometidos
(Peixoto, 2010).
Pesquisas desenvolvidas na expectativa de se obter novos produtos
antifúngicos de origem natural tornam-se relevantes, levando-se em
consideração a crescente importância clínica e epidemiológica dispensada às
infecções micóticas e a necessidade de tratamentos mais eficazes e menos
tóxicos para os indivíduos acometidos (Khan & Malik, 2012; Peixoto, 2010).
É dentro desse contexto que pesquisadores de todo o mundo têm se
dedicado ao estudo de alternativas viáveis aos tratamentos destas
enfermidades. Uma destas alternativas são os estudos com plantas medicinais
e seus derivados, considerando os aspectos fitoquímicos e atividades
biológicas (Khan & Malik, 2012; Oliveira et al., 2011; Mendes, 2011).
Nossa proposta de trabalho foi avaliar a atividade biológica,
composição química e mecanismo de ação do óleo essencial de Mentha
spicata L. sobre Candida guilliermondii provenientes de vulvovaginites e
material anal.
19
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade biológica, composição química e mecanismo de
ação do óleo essencial de Mentha spicata L. sobre Candida guilliermondii de
origem clínica.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar um “screening” da atividade antifúngica de óleos essenciais
sobre espécies de Candida não albicans de origem clínica;
Identificar a composição química do óleo essencial de Mentha spicata,
utilizando um Cromatógrafo Gasoso (CG) acoplado com Espectrômetro
de Massa (EM);
Determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração
Fungicida Mínima (CFM) desse produto sobre as cepas de Candida
guilliermondii provenientes de vulvovaginites e material anal;
Avaliar a interferência dos efeitos desse óleo essencial sobre a cinética
de crescimento das leveduras;
Analisar o efeito do óleo essencial de Mentha spicata sobre a
micromorfologia das cepas de Candida guilliermondii em estudo;
Pesquisar ação desse óleo essencial sobre a parede celular fúngica.
20
4 MÉTODOS
4.1 Desenho do estudo
Trata-se de um estudo “in vitro”, onde foram coletados dados
micológicos e químicos, com o intuito de observar e estimar a composição
química e a ação antifúngica do óleo essencial de M. spicata frente à Candida
guilliermondii de origem clínica.
4.2 Local do trabalho
O trabalho foi realizado no Laboratório de Micologia do Departamento
de Ciências Farmacêuticas (DCF), do Centro de Ciências da Saúde (CCS), da
Universidade Federal da Paraíba (UFPB) e no Laboratório de Microbiologia
Clínica do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas do Centro de
Ciências da Saúde (CCS), da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN). Parcerias, para o apoio no desenvolvimento do trabalho, foram
também realizadas para análise da composição do óleo essencial de M. spicata
(hortelã peluda) ocorrida no Laboratório Unificado de Desenvolvimento e
Ensaios de Medicamentos (LUDEM), do Centro de Ciências da Saúde (CCS),
da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). A concordância dos resultados da
identificação bioquímica do Banco de Levedura foi realizada no Laboratório de
Microbiologia do Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes, Natal (RN), através
do Sistema MicroScan®.
4.3 Obtenção do material botânico:
O óleo essencial (OE) de M. spicata L. (FERQUIMA – Indústria e
Comércio Limitada, Vargem Grande/ São Paulo) veio acompanhado de uma
ficha técnica com informações sobre o produto, onde destacamos o lote (184) e
a composição química: L- carvona 70%, Limoneno 19%, outros 11% (Anexo 1).
O óleo essencial de M. spicata foi selecionado para a realização desse
estudo após realização do “Screening” microbiológico. Nesta etapa foram
21
avaliados onze óleos essenciais extraídos dos espécimes botânicos
especificados no quadro 1. Nessa avaliação os óleos foram utilizados “in
natura“, ou seja, 100% puros. O método microbiológico utilizado foi o de
difusão em meio sólido com discos de papel (Sensiobiodisc do Centro de
Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda – CECON/SP) impregnados com
10 µL dos óleos essenciais, desenvolvidos em ágar sabouraud dextrose (ASD -
Difco® - France). O sistema foi incubado a 35°C por 48 horas (Koneman et al.,
2008; Yaya, 2008; Ostrosky et al., 2008; Craveiro, 1981). Os ensaios foram
realizados em duplicatas e os resultados considerados positivos, quando a
média aritmética dos halos de inibição apresentaram valores iguais ou
superiores a 15mm de diâmetro, em pelo menos, 50% do total das cepas
testadas (Mendes, 2011).
Quadro 1. Óleos essenciais utilizados no “screening” para determinação
da atividade antifúngica sobre cepas de Candida spp.
Fonte: www.plantamed.com.br
O óleo essencial de M. spicata foi escolhido para estudos posteriores,
por ter apresentado um dos melhores resultados na triagem microbiológica.
Esse produto teve seu parâmetro de qualidade (coloração, pureza, odor,
Espécie
Família Nome popular
Cinnamomum zeylanicum Blume Lauraceae canela-da-índia
Citrus limonum Burm. F. Rutaceae limão-siciliano
Coriandrum sativum L. Krause Apiaceae coentro
Eucalyptus globulus Labill Myrtaceae eucalipto
Eugenia coryophyllata Thumb. Lamiaceae cravo-da-índia
Mentha arvensis L. Stewart Lamiaceae hortelã comum
Mentha piperita L. Briq. Lamiaceae hortelã-pimenta
Mentha spicata Schrad. ex Willd Lamiaceae hortelã-peluda
Ocimum basilicum Schumach. & Thonn Lamiaceae manjericão
Origanum vulgare L. (G. Beck) Klok Lamiaceae orégano
Pimpinella anisum Gaertn.
Apiaceae erva-doce
22
densidade a 20°C e índice de refração a 20°C) descrito em um laudo técnico
enviado pela empresa (Tabela 1).
Tabela 1 - Laudo técnico do óleo essencial de M. spicata (hortelã-peluda)
Itens Controlados Resultados
Aparência Líquido límpido
Cor Amarelo palha
Impurezas Isento
Odor Característico
Densidade (20°C) 0,934
Índice de Refração (20°C) 1,490
CAS 84696-51-5
Origem China
Principais componentes L-carvone = 70%, Limonene = 19%
Fonte: Ferquima Ind. E Com. Ltda. Engenheira Química Responsável: Alice Elizabet Lasthaus, CRQ: IV 04330754.
Este óleo foi conservado em um frasco de alumínio e mantido sob
refrigeração. No momento da utilização foi preparada uma emulsão do óleo
essencial de M. spicata, conforme o protocolo de Allegrini et al (1993). Em um
tubo de ensaio esterilizado, foi colocado 16.389μg do óleo essencial, 0,4mL de
dimetilsulfóxido (DMSO - Merck), 0,08mL de Tween 80 (INLAB/Indústria
Brasileira) e quantidade suficiente para 8mL de água destilada estéril. Através
de diluições em Caldo Sabouraud Dextrose (CSD - Difco® - France)
duplamente concentrado foram obtidas as concentrações desejadas do óleo
essencial.
4.4 Análise dos componentes do óleo essencial de M. spicata
Para a análise dos fitoconstituintes foi utilizado um Cromatógrafo
Gasoso (CG) da Shimadzu (GC17-A), equipado com um Espectrômetro de
Massa (EM). A coleta de dados e integração foi realizada com o software
Class5000. A fase móvel foi composta por hélio e bombeada na vazão de 1,6
mL/min com split 1:5.
A separação cromatográfica foi realizada utilizando uma coluna capilar
DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). A temperatura do forno da coluna foi
23
programada para passar de uma temperatura inicial de 60°C a 120°C a
5°C/min e de 120°C a 280°C a 20°C/min. A temperatura do injetor e do detector
foram 260 e 280°C respectivamente. O tempo total foi de 20 minutos e o
volume de injeção foi 1,0 μL.
A identificação dos constituintes do OE foi efetuada junto ao sistema de
computação e processamento de dados (workstation) interligado ao CG-EM. O
sistema é equipado com uma biblioteca Wiley, 6ª Edição da classe-5000 1999,
com 229.119 espectros.
4.5 Controle de qualidade
A nistatina (Sigma-Aldrich®) foi selecionada como antifúngico padrão,
após realização do antifungigrama pelo método microbiológico de difusão em
ASD, o qual apresentou melhor perfil de sensibilidade para esse banco de
leveduras. As soluções também foram preparadas no momento de execução
dos testes.
4.6 Microrganismos
Para o estudo de atividade antifúngica com óleos essenciais, foram
utilizadas quatorze cepas de Candida guilliermondii obtidas de um banco
preexistente, provenientes de vagina e ânus. Este banco foi coletado e
identificado pelo Laboratório de Micologia do Hospital Giselda Trigueiro (HGT)
Natal-RN, mediante aprovação do Comitê de Ética do Centro de Ciências da
Saúde da UFRN, sob o protocolo 154/06. As cepas foram identificadas através
de sua macro e micromorfologia, comportamento fisiológico e bioquímico,
conforme o protocolo recomendado por Kurtzman & Feel, 1998. A
concordância dos resultados da identificação bioquímica do Banco de
Leveduras foi realizada no Laboratório de Microbiologia do Hospital Pediátrico
Maria Alice Fernandes, Natal (RN), através do Sistema MicroScan®. As cepas
estoques das leveduras foram mantidas em criotubos devidamente
identificados e contendo YPD (Extrato de levedura, Peptona, Dextrose), glicerol
e miçangas estéreis. Os criotubos contendo as leveduras, o meio de cultura
24
com glicerol e as miçangas foram colocados na estufa a 35°C. Posteriormente,
foram armazenadas sob-refrigeração a 8°C e no freezer a -70°C.
4.7 Verificação da viabilidade e pureza das leveduras
Previamente aos experimentos, as cepas foram submetidas à
verificação de sua viabilidade e pureza. Para isso, foram semeadas em meio
Ágar Sabouraud Dextrose (Difco® - France), a fim de obter culturas recentes.
Para avaliação da pureza, as leveduras foram semeadas com alça
descartável pela técnica de esgotamento em meio CHROMagar Candida®
(meio cromogênico, que permite a identificação de culturas mistas de leveduras
- Difco® - France) e depois incubação a 35C, durante 24-48 horas.
4.8 Inóculo
A partir das culturas recentes e mantidas em Ágar Sabouraud
Dextrose - ASD (Difco® - France), durante 24-48 horas a 35C, o inóculo foi
preparado e padronizado em solução fisiológica a 0,9% estéril (Fresenius Kabi
Brasil Ltda). Inicialmente, preparou-se uma suspensão comparativa com o
tubo 0,5 da escala de McFarland. A mesma foi ajustada no espectrofotômetro
(Leitz-Fhotometer 340-800) para conter aproximadamente 106 UFC/mL. Em
seguida, essa suspensão foi diluída com água destilada numa proporção de
1:9, resultando em um inóculo contendo aproximadamente 105 UFC/mL, que foi
utilizado nos ensaios (Koneman et al., 2008; Ostrosky et al., 2008).
4.9.Ensaios microbiológicos
4.9.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima – (CIM) e
Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Os ensaios de atividade antifúngica do óleo essencial de M. spicata
sobre cepas de C. guilliermondii foram realizados pela técnica de microdiluição
25
(Koneman et al., 2008; Ostrosky et al., 2008; Hadacek & Greger, 2000; Ellof,
1998).
A partir das culturas recentes e mantidas em Ágar Sabouraud Dextrose
- ASD (Difco® - France), durante 24-48 horas a 35C, o inóculo foi preparado e
padronizado em solução fisiológica a 0,9% estéril (Fresenius Kabi Brasil Ltda).
Inicialmente, preparou-se uma suspensão comparativa com o tubo 0,5 da
escala de McFarland. Em seguida, essa suspensão foi diluída com água
destilada numa proporção de 1:9, resultando em um inóculo contendo
aproximadamente 105 UFC/mL, que foi utilizado nos ensaios.
Foram utilizadas placas de microtitulação com 96 orifícios estéreis
(INLAB). Em cada orifício da placa, foram adicionados 100 µl do meio Caldo
Sabouraud Dextrose (CSD - Difco® - USA/France). Em seguida, foi adicionado
100 µl da emulsão do OE na concentração inicial de 1024 µg/mL nas cavidades
da primeira linha da placa. Por meio de uma diluição seriada a uma razão de
dois, foram obtidas concentrações de 1024 µg/mL até 4 µg/mL. Por fim, foram
adicionados 10 µl da suspensão das espécies das leveduras nas cavidades,
onde cada coluna da placa refere-se a uma cepa de C. guilliermondii.
Em conjunto com os ensaios microbiológicos, foram realizados os
controles de esterilidade (meio líquido CSD sem a suspensão da levedura), de
viabilidade/crescimento do microrganismo (no meio líquido isento de produto
antifúngico) e com antifúgico padrão (nistatina 100 UI/mL).
Os ensaios microbiológicos foram incubados à temperatura de
35ºC/24-48 horas. Decorrido o tempo de incubação adequado, foi feita a leitura
e interpretação dos resultados. A CIM foi definida como a menor concentração
capaz de inibir visualmente o crescimento fúngico verificado nas cavidades,
quando comparado com o crescimento controle. Os ensaios foram realizados
em duplicata e o resultado expresso pela média aritmética dos valores da CIM
obtidas nos dois ensaios (Eloff, 1998; Cleeland & Squires, 1991).
A atividade antifúngica dos produtos foi interpretada e considerada
ativa ou não, conforme os seguintes parâmetros: CIM até 500 μg/mL= forte
atividade antimicrobiana, CIM entre 600 e 1600 μg/mL= possuem atividade
moderada e CIM acima de 1600 μg/mL= considerado com fraca atividade
(Sartoratto et al., 2004).
26
Koneman, et al., 2008; Ostrosky et al., 2008; Hadacek & Greger, 2000; Cleeland & Squires, 1991
Crescimento de
C. guilliermondii
de 24-48h, em Ágar
Sabouraud
Inóculo em salina
estéril a 0,9%
Escala 0,5 de
McFarland
Inóculo em salina
estéril a 0,9% com 105
UFC/mL (diluição 1:9)
Preparo do inóculo Microdiluição em caldo
µg/mL
10
24
51
2
25
6
12
8
64
32
16 8 4
Co
ntr
ole
-
Co
ntr
ole
+
Nis
tati
na
10
0 U
I/m
L
Incubar a
35-37 C/ 24-48h
100 µL da emulsão
de OE a 2048
µg/mL
Leitura e
Interpretação
100 µL de
Caldo Sabouraud
10 µL das cepas
C. guilliermondii (105 UFC/mL)
Figura 1: Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) - Ellof (1998)
A CFM foi definida após a determinação da CIM, alíquotas de 20 μL
foram retiradas de cada poço da placa de microtitulação correspondente à
concentração inibitória e às duas imediatamente superiores, bem como os
controles positivos e subcultivados em placas de ágar Sabouraud dextrose.
Após 24 horas de incubação a 35C, as leituras das CFMs foram realizadas
com base no crescimento dos controles, sendo considerada CFM a menor
concentração semeada em placa de ASD em que houve crescimento menor
que três (03) UFCs (Amato Neto et al., 1994; Zaror & Espinel-Ingroff, 1989).
27
Amato Neto et al., 1994; Zaror & Espenel-Ingroff, 1989
µg/mL1024
512
256
128
64
32
16
8 4
Co
ntr
ole
-
Co
ntr
ole
+
Nis
tati
na 1
00
UI/
mL
Incubar a
35 C/ 24hLeitura e
Interpretação
Após
incubação e
Determinação
da CIMs 20 µL de cada poço
CIM, CIMx2, CIMx4 e
Controle positivoÁgar Sabouraud
Dextrose
Subcultivo
Considerado crescimento menor que três (03) UFCs
Concentração Fungicida Mínima (CFM)
Figura 2: Determinação da concentração fungicida mínima (CFM) - Ellof (1998)
4.9.2 Efeito do óleo essencial de M. spicata sobre o tempo de morte das
leveduras
Procedimentos para curva de tempo de morte foram realizados
utilizando a metodologia de Klepser et al. (1998). Foram selecionadas duas
cepas representativas de C. guilliermondii. Antes do ensaio, as leveduras foram
cultivadas em ASD. As suspensões fúngicas foram preparadas de acordo com
o padrão 0,5 de McFarland (1-5x106 UFC/mL) (Cleeland & Squires, 1991;
Hadacek & Greger, 2000). Um mililitro da suspensão fúngica ajustada foi
adicionado a cada tubo que continha 9 mL de CSD, com ou sem drogas. Isto
resultou em uma diluição de 1:10 da suspensão fúngica e forneceu um inóculo
inicial de cerca de 1-5 x 105 UFC/mL. As concentrações do OE testadas foram
de 1, 2 e 4 vezes o valor da CIM. A nistatina foi testada na concentração de
100UI/mL. Em pontos de tempo predeterminados (0, 2, 4, 8 e 24 h após a
adição do OE ou nistatina), 0,1 mL da amostra foi removida de cada tubo de
cultura e serialmente diluída com água destilada estéril. Uma alíquota de 10 μL
de cada diluição foi semeada uniformemente em placas de ASD. Quando
suspeitou-se que o número de colônias fosse menor que 1000 UFC/mL, 10 μL
da amostra foi retirada e semeada sem diluição (Giannuzzi, 1996).
28
As placas foram incubadas a 35°C por 24 a 48 h. Após esse período de
incubação, o número de unidades formadoras de colônia (UFC) em cada placa
foi contado e multiplicado pelo fator da diluição utilizada, para obter, assim, o
número de UFC/mL. O limite de detecção mínimo foi de 100 UFC/mL.
As curvas foram construídas plotando-se a contagem média de
colônias (log10UFC/mL) em função do tempo (horas) com o GraphPad Prism
version 5.0 for Windows. Foi considerada atividade fungicida da droga quando
houve redução no crescimento maior ou igual a 3 log10 (≥ 99,9%) a partir do
inóculo inicial, e atividade fungistática quando houve redução no crescimento
menor que 3 log10 (< 99,9%) UFC/mL (Correa-Royero et al., 2010; Ernst et al.,
2002; Keele et al., 2001; Cleeland & Squires, 1991).
Inóculo de C.
guilliermondii
106 UFC/mL
1 mL
Caldo Sabouraud
Dextrose – 9mL
Inóculo fúngico de 1 a 5 x 105
UFC/mL
Nistatina
100UI/mL
Controle 1 X CIM 2 X CIM 4 X CIM
Óleo essencial de M. spicata
Incubar a 35 C
Sob agitação a 200 rpm
Alíquota de 10 µL
Semeio em ágar
Sabouraud
Diluições seriadas em
água destilada
Tempo 0, 2, 4, 8 e 24hs
Incubar a 35 C/
24-48h
Atividade fungicida
crescimento ≥ a 3 log10 (≥ 99,9%)
Atividade fungistática
crescimento <3 log10 (< 99,9%)
Hadacek & Greger, 2000; Cleeland & Squires, 1991
Alíquota de 0,1mL
As curvas foram construídas
plotando-se a contagem média
de colônias em função do tempo
– GraphPad Prism version 5.0
for Windows
Figura 3: Efeito do óleo essencial sobre o tempo de morte das leveduras - Klepser et al. (1998)
29
4.9.3 Efeito do óleo essencial de M. spicata sobre a morfogênese de cepas
de C. guilliermondii
Para o estudo de possíveis alterações na micromorfologia de C.
guilliermondii, provocadas pela ação dos óleos essenciais, foi empregada à
técnica do microcultivo. Com base nos resultados dos valores de CIM
encontrados, foram selecionadas duas cepas representativas, uma de origem
anal (C. guilliermondii 9A) e outra de origem vaginal (C. guilliermondii 9V)
(Sidrim & Rocha, 2004; Lacaz, 2002; Dalmau, 1929). Utilizando o meio sólido
ágar-fubá com Tween 80 (Difco® - France) em câmara úmida, o ensaio foi
realizado em placas de Petri 90 x 15 mm, contendo uma lâmina sobre um
suporte para o microcultivo e papel de filtro (30 x 30 mm), devidamente
esterilizados.
O óleo essencial e o antifúngico padrão em quantidade suficiente para
obtenção da concentração final desejada foram solubilizados em tubos
estéreis. Em seguida, foi adicionado 4 mL de Agar-fubá-Tween 80 fundido em
cada um desses tubos: sem óleo nem antifúngico (Controle), com o óleo
essencial em concentração correspondente a CIM, CIMx2, e nistatina em
concentração correspondente a 100UI/mL.
Os tubos foram homogeneizados e para evitar que o meio solidificasse,
rapidamente, 1mL foi transferido e espalhado sobre a lâmina, formando uma
camada delgada. Após a solidificação do meio, a levedura foi semeada com o
auxílio de alça bacteriológica, fazendo uma estria central. A estria foi coberta
com lamínula esterilizada. Foi adicionado 1mL de água destilada estéril sobre o
papel de filtro para manter a umidade do meio (câmara úmida). A placa foi
fechada e incubada à temperatura de 35ºC durante 24-48 horas. Decorrido o
tempo de incubação, as lâminas foram analisadas em um microscópio óptico
comum (Zeiss® model Primo Star), em um aumento de 400x, para a
observação da formação ou não de estruturas características como
blastoconídios nas constrições de pseudomicelio e pseudomicelio delicado.
30
Ágar-fubá com Tween 80
fundido – 4mL
Inóculo fúngico de 1 a 5 x 105
UFC/mL
Nistatina
100UI/mL
Controle CIM 2 X CIM
Óleo essencial
de M. spicata
agitar
Placas de Petri 90x15 mm com lâmina
sobre um suporte e papel de filtro
Incubar a 35 C/
24-48h Sidrim & Rocha, 2004; Lacaz, 2002; Dalmau, 1929
Alíquota de 1mL
Crescimento de
C. guilliermondii
9A e 9V
de 24-48h, em
Ágar Sabouraud
Aumento de 400x
Figura 4: Efeito do óleo essencial de M. spicata L. sobre a morfogênese de cepas de C.
guilliermondii - Técnica do microcultivo
4.9.4 Investigação do mecanismo de ação antifúngico – método do
sorbitol
Este método se baseia na medida dos danos que os produtos com
atividade antifúngica produzem aos componentes da parede celular fúngica.
Caso o composto atue de alguma forma sob a parede celular do fungo, ele
provocará lise de suas células quando na ausência de um estabilizador
osmótico, mas permitirá seu crescimento na presença desse suporte osmótico.
Dessa maneira, este ensaio compara as CIM’s dos produtos antifúngicos na
ausência e presença de sorbitol a 0,8 M, um protetor osmótico usado para
estabilizar os protoplastos de fungos.
A determinação da CIM dos produtos, na presença do sorbitol, foi
realizada pela microdiluição, utilizando placas de microtitulação contendo 96
31
cavidades, com fundo em forma de “U” e em duplicata, semelhante ao item
4.9.1. Em cada orifício da placa, foram adicionados 100 µL do meio líquido
CSD previamente adicionado de sorbitol (PM = 182,17) (VETEC Química Fina
Ltda – Rio de Janeiro/RJ), ambos duplamente concentrados. Posteriormente,
100 µL da solução dos produtos, também duplamente concentrados, foram
dispensados nas cavidades da primeira linha da placa. E por meio de uma
diluição seriada a uma razão de dois, foram obtidas concentrações de 1024
µg/mL até 4 µg/mL dos produtos e, no caso do sorbitol, uma concentração final
de 0,8 M em cada cavidade. Por fim, foram adicionados 10 µL do inóculo das
espécies nas cavidades, onde cada coluna da placa refere-se a uma cepa
fúngica, especificamente.
Um controle de microrganismo foi realizado colocando-se nas
cavidades 100 µL do mesmo CSD e sorbitol (0,8 M), 100 µL de água destilada
estéril e 10 µL do inóculo de cada espécie. Um controle de esterilidade também
foi realizado, onde foi colocado 200 µL do CSD em um orifício sem a
suspensão dos fungos. Por último, foi realizado o mesmo procedimento com o
antifúngico padrão (Nistatina 100 UI/mL). As placas foram seladas e incubadas
a 35°C por 48 horas, posteriormente foi realizada a leitura (Zacchino, 2001;
Frost et al., 1995).
Zacchino, 2001; Frost et al., 1995;
Crescimento de
C. guilliermondii
de 24-48h, em Ágar
Sabouraud
Inóculo em salina
estéril a 0,9%
Escala 0,5 de
McFarland
Inóculo em salina
estéril a 0,9% com 105
UFC/mL (diluição 1:9)
Preparo do inóculo Microdiluição em caldo
µg/mL
10
24
51
2
25
6
12
8
64
32
16 8 4
Co
ntr
ole
-
Co
ntr
ole
+
Nis
tati
na
10
0 U
I/m
L
Incubar a
35-37 C/ 24-48h
100 µL da emulsão
de OE a 2048
µg/mL
Leitura e
Interpretação
100 µL de CSD + Sorbitol
(PM = 182,17)
10 µL das cepas
C. guilliermondii (105 UFC/mL)
Figura 5: Investigação do mecanismo de ação antifúngico – método do sorbitol
32
5 ARTIGOS PRODUZIDOS
5.1 Artigo 1:
Periódico: Pharmaceutical Biology - ISSN: 1388-0209. Status: a ser submetido.
Plant essential oils and their antimicrobial activity – review 2010-2013
Maiza Rocha de Abrantes1*, Edeltrudes de Oliveira Lima2, Mariana Araújo Paulo
de Medeiros1, Felipe Queiroga Sarmento Guerra2, Eveline Pipolo Milan3
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da
Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
2Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal da Paraíba
3Departamento de Infectologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte
*Corresponding author. Mailing address: Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, R. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, 1o andar,
Petrópolis, Natal, RN, Brazil. CEP: 59012-570. Phone: +55 (84) 3342-99797,
3342-9801. Mobile: + 55 (84) 9955-1703. E-mail: maizajrl@ufrnet.br.
Keywords: Natural products, Volatile oils, Lamiaceae.
33
ABSTRACT
The use of essential oils of vegetable origin is rooted in popular
knowledge and has now been evoked by scientific studies. This study included
an inventory of oils extracted from plants with antimicrobial activity, highlighting
their applications and use. The literature review included any scholarly, peer-
reviewed journal articles published in databases such as Google Scholar,
PubMed (Medical Publications), MEDLINE (International Literature on Health
Sciences), LILACS (Latin American and Caribbean Health Sciences Literature),
SciELO (Scientific Electronic Library Online) as well as a wide range of
academic dissertations and theses from 2010 to 2013. We found 29 essential
oils of vegetable origin with antimicrobial activity, several of which from the
Lamiaceae family. This review suggests that progress has been made in the
study of essential oils.
Introduction
Essential oils (EOs) are complex mixtures of volatile, lipophilic, liquid
and colorless or slightly yellowish compounds with a strong and pleasant
aroma. They originate from the secondary metabolism of plants, and are very
unstable, especially in the presence of air, light, heat, moisture and metals
(Peixoto, 2010; Oliveira, 2011; Ehlert et al., 2013).
These oils can be found in the leaves, flowers, branches, buds, stems,
fruits, seeds, bark and roots of the plants (Lavinik, 2013) and perform various
necessary functions for their survival, playing a key role in the defense against
34
microorganisms, in attracting pollinators, in protecting the plant from heat,
amongst other functions (Bassolé & Juliani, 2012; Trajano, 2012; Gomes, 2013;
Silva et al., 2013).
Medicinal plants require different techniques for growing, harvesting,
and postharvest processing in order to determine which methods provide higher
biomass accumulation and chemical constituents of interest (Ehlert et al., 2013).
The chemical and biological properties of EOs may vary according to the
environment in which the plant develops, the type of cultivation technique, the
collection of plant material, the season, the climate, the vegetative stage, the
plant organ, age, the time of vegetative phase and the extraction method used
(Zheljazkov et al., 2010; Ehlert et al., 2013; Machado, Ribeiro, Druzian, 2013;
Zhaoa et al., 2013). Plants rich in essential oils should be collected in the
morning or evening since sun exposure may cause loss of a significant amount
of oil. Nevertheless, one can not predict or establish the use of a single
standard technique, since each species reacts differently to environmental
changes (Peixoto, 2010).
There are various methods for extracting essential oils, some of which
include: steam distillation, hydrodistillation (Clevenger method), organic solvent
extraction, microwave-assisted distillation, microwave hydrodiffusion and
gravity, high-pressure solvent extraction, supercritical fluid CO2 extraction,
ultrasonic extraction and solvent-free microwave extraction. However, steam
distillation is the most commonly used method for commercial production scale
(Okoh, Sadimenko, Afolayan, 2010).
Phytochemicals derived from EOs include terpene hydrocarbons,
alcohols, terpene alcohols, aldehydes, ketones, phenols, esters, ethers, oxides,
35
peroxides, organic acids, lactones, coumarins and sulfur compounds.
Chemically, the vast majority of EOs are derived from phenylpropanoid and
predominantly from terpenoids (Lima, 2011), whereas the majority of their
antimicrobial activity derive from oxygenated terpenes, particularly terpene
phenolics, phenylpropanoids and alcohols (Bassolé & Juliani, 2012).
Essential oils have been widely used by pharmaceutical, sanitary,
cosmetic, agricultural and food industries because of their biologically active
compounds, which present several pharmacological activities: antioxidant
(Maskovic et al., 2013, Xu et al., 2013), anti-inflammatory (Salud et al., 2011;
Ramos et al., 2013), larvicide (Govindarajan et al., 2012; Souza et al., 2012),
insecticide (Salama et al., 2012; Arango et al., 2013), antibacterial (Castro, et
al., 2011; Guerra et al., 2013) and antifungal activities (Oliveira et al., 2011;
Tyagi et al., 2013). Moreover, EOs may be used alone or in combination with
existing methods, which is considered an interesting alternative to reduce or
eliminate resistant pathogens (Khan et al., 2012).
The antifungal properties of EOs of vegetable origin have been
demonstrated through intensive research, driven by the growing trend towards
replacing synthetic agents (Zuzarte et al., 2012). The use of natural antifungal
compounds is important not only for food preservation, but also in the control of
diseases that affect both plants and humans. The search for new antifungal
agents is needed due to the emergence of resistant microorganisms and fatal
opportunistic infections (Carmo, 2011).
The antimicrobial properties of EOs of vegetable origin have been
empirically known for centuries, but only recently has science recognized their
importance. Such properties have been systematically investigated by different
36
research groups, which study the biological activity of medicinal plants
throughout the world, according to their popular use. In contrast,
microorganisms that cause disease have developed resistance to most of the
available antibiotics, which further fosters the search for natural antibiotics
(Machado, Ribeiro, Druzian, 2013).
The mechanism of action of EOs on microorganisms is complex and not
yet fully elucidated. As is well known, the hydrophobic properties of EOs and
their components cause their binding to lipids in the cell membrane, altering its
structure and increasing its permeability, thus leading to cell leakage and cell
death (Guerra et al., 2012; Gomes, 2013; Lavinik, 2013). This mechanism of
action can not be assigned to a specific target, although there may be many of
them within the cell (Kacániová et al., 2012).
Essential oils of vegetable origin with antifungal action present two
important characteristics: their natural origin (safe for consumers and for the
environment) and lower risk of development of microbial resistance. The latter is
based on the fact that EOs have a complex chemical composition and,
consequently, different mechanisms of activity, making it difficult for
microorganisms to adapt and mutate (Carmo, 2011).
In this retrospective study, we developed an inventory of oils extracted
from plants with antifungal activity, highlighting their applications for humans.
Methods
This is a descriptive study with quantitative and qualitative approaches.
The literature review included any scholarly, peer-reviewed journal articles and
37
academic dissertations and theses from 2010 to 2013. The following databases
were used: Google Scholar, PubMed (Medical Publications), MEDLINE
(International Literature on Health Sciences), LILACS (Latin American and
Caribbean Health Sciences Literature) and SciELO (Scientific Electronic Library
Online). The keywords used for the search were: essential oils, natural products
and antimicrobials.
Results and Discussion
The sample consisted of 29 EOs with antifungal, antibacterial and
antimicrobial (antifungal + antibacterial) properties. As shown in Table 1,
Lamiaceae has been the most studied family.
Studies have reported the antifungal and antibacterial properties of
some Cymbopogon species. According to Carmo (2011), the EO of
Cymbopogon citratus (Gramineae - Poaceae) is indicated for the treatment of
dermatoses (urticaria, ulcers, spots and rashes), acting against clinical strains
of Malassezia isolated from patients at the Hospital Universitário Lauro
Wanderley (Universidade Federal da Paraíba, Brazil). Moreover, Oliveira (2011)
investigated the activity of the EO of Cymbopogon winterianus (lemongrass) on
Candida albicans, Aspergillus flavus and Aspergillus fumigatus using time-kill
methodology. In this study, is was suggested that this EO had a concentration-
dependent antifungal effect for all strains tested.
In order to develop an alternative therapy for candidiasis - since the one
currently available has become problematic as a result of the toxicity of
antifungal agents and the increasing prevalence of antibiotic-resistance -, Khan,
38
Malik and Ahmad (2012) studied the effect of 21 plant EOs against multidrug-
resistant (MDR) strains of C. albicans. According to the study, the oil of
Cymbopogon martini showed a strong inhibitory activity against C. albicans with
Minimal Inhibitory Concentrations ranging from 90 to 100 µg/ml.
While studying the antifungal effect of microcapsules containing EO of
Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) on Aspergillus flavus, Trajano
(2012) noted that in in vitro assays this EO showed fungistatic (650μg/mL) and
fungicide (2600μg/mL) activities. According to the searched literature, C.
zeylanicum have some medicinal properties such as astringent, aphrodisiac,
antiseptic, aromatic, carminative, digestive, stimulant, hypertensive, sedative,
tonic and vasodilator (www.plantamed.com.br).
Antifungal properties have also been found in plant species from genera
Cicuta and Eugenia. An EO extracted from the fruits of Cicuta virosa L. var.
latisecta Celak was used against four food-borne fungi: Aspergillus flavus, A.
oryzae, A. niger and Alternaria alternata. Results showed that this EO had a
strong inhibitory effect on spore production and germination in all tested fungi
(Jun et al., 2011). Furthermore, Mendes (2011) evaluated the activity of the EO
of Eugenia caryophyllata Thunb on strains of C. tropicalis using Minimal
Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal Concentration (MFC)
values, and micromorphology, fungal viability (time-kill) and checkerboard
methodologies. Therefore, they observed a concentration-dependent antifungal
activity in the EO, which is potentialized in association with amphotericin B.
An study with Hyptis spp. (Lamiaceae) has shown the antimicrobial
activity of H. suaveolens, H. rhomboidea and H. Brevipes (Xu et al., 2013),
whereas Guerra-Boone et al. (2013) have shown that the EO of Magnolia
39
grandiflora presents an antifungal activity against dermatophyte strains.
While investigating the antifungal activity of EOs of Lavandula viridis,
Zuzarte et al. (2011) showed that dermatophyte fungi and Cryptococcus
neoformans were the most sensitive to the EOs (0.32 to 0.64 mL μL⁻¹), followed
by Candida spp. (0.64 to 2.5 ml μL⁻¹). For most of these strains, MIC values
were equal to MLC values, showing the fungicidal effect of the essential oils.
Additionally, it has been observed that the EOs had completely inhibited the
filamentation of C. albicans at concentrations sixteen times below the MIC
value.
Additionally, Zuzarte et al. (2012) studied the activity of the EO of
Lavandula luisieri against dermatophyte fungi and Aspergillus strains as well as
its influence on the dimorphic transition in C. albicans, evaluated through the
inhibition of germ tube formation assay. As previously reported (Zuzarte et al.,
2011), the filamentation in all strains was completely inhibited at concentrations
below sixteen times the MIC. The results support the use of EOs of L. luisieri for
the development of new phytochemicals and food preservatives, emphasizing
their antifungal properties at non-cytotoxic concentrations or at concentrations
with very low negative effects on mammalian cells.
Studies with species of Mentha have made progress in reporting their
antifungal properties on different pathogenic fungi. Peixoto (2010), for instance,
evaluated the anti-Candida action of EOs and fractions of different accessions
of Mentha spp. against C. albicans and C. dubliniensis. Four of the EOs
analyzed showed strong activity with broad spectrum: M. canadensis (MC 05) -
(<0,007 to 0,500 mg/mL); M. spicata (MC 30) (0,062 mg/mL to 0,500 mg/mL);
M. arvensis (MC 36) (<0,007 mg/mL to 1 mg/mL) and M. suaveolens x spicata
40
(MC 52) - (0,062 mg/mL to 0,500 mg/mL). In addition, Abdullah et al. (2010)
have also investigated the antifungal activity of the EO extracted from aerial
parts of Mentha spicata L. (mint) against five pathogenic fungi: Aspergillus
niger, Mucor mucedo, Fusarium solani, Botryodiplodia theobromae, and
Rhizopus solani. In this study, all tested microorganisms were strongly affected
by the EO, indicating an appreciable antimicrobial potential of spearmint oil.
In a study by Castro et al. (2011), it was suggested the use of the EO of
Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae) as an antibacterial agent in food. For this
purpose, they studied the antimicrobial activity of the EO against
Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolated from artisanal Minas
cheese produced in Brazil and found that both strains were sensitive to its
bactericidal activity.
A multiple-species approach has been used in many researches. In the
in vitro evaluation of the antimicrobial activity of EOs of Cinnamomum cassia
(Chinese cinnamon), Origanum vulgare (oregano), Piper nigrum (black pepper)
and Thymus vulgaris (white thyme), Lavinik (2013) has found that only P.
nigrum showed no inhibitory effect on the growth of enteric Salmonella samples
isolated from poultry. In contrast, T. vulgaris and C. cassia were effective
against 91.3% of the strains, while O. vulgare had an effectiveness of 100%.
The high antimicrobial activity of Thymus and Origanum species has been
associated to their phenolic components such as thymol and carvacrol (Bassolé
& Juliani, 2012). Additionally, similar results were observed by Cleff et al.
(2010). They studied the EO of O. vulgare against strains of Candida spp.
isolated from animals and found that this oil may represent an alternative for the
treatment of candidiasis.
41
By investigating the antibacterial activity of EOs from Coriandrum
sativum L. (coriander), Ocimum basilicum L. (sweet basil), Origanum majorana
L. (marjoram) and Rosmarinus officinalis L. (rosemary), Guerra et al. (2012)
found that they presented an effective antibacterial activity against MDR strains
of Acinetobacter spp., except for coriander, which presented lower activity. A
latter study by Guerra et al. (2013) suggested that the EO of Citrus limonun is
also effective against MDR strains of Acinetobacter spp.
Following the multiple-species approach, Silveira et al. (2012) studied
the antimicrobial activity of EOs of herbs grown in the southern Brazil against 12
important bacterial species in food. They noted that the EOs with greater activity
against the bacteria tested were, in descending order, Cymbopogon flexuosus
(lemongrass), Ocimum basilicum L. (sweet basil), Origanum vulgare (oregano),
Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) and Laurus nobilis (bay laurel). The
bacterium Yersinia enterocolitica was the most sensitive pathogen to all EOs
tested (MIC 0.62 mg mL-1).
Furthermore, Rana et al. (2011) investigated the antibacterial activity of
19 EOs against four species of bacteria: Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium and Bacillus subtilis. Various
degrees of antibacterial activity were found: Cinnamomum zeylanicum, with the
most prominent antibacterial activity, was followed, respectively, by
Cymbopogon ciatrus and Carum copticum.
Recent researches have aimed to detect in vitro antifungal action of
EOs extracted from plant species native to other biomes. Cyclotrichium
leucotrichum (Lamiaceae), a plant species native to Iran, and Thymus
broussonetii Boiss, native to Morocco, were suggested to be effective against
42
Candida albicans (Mirjalili et al., 2013; Bellete et al., 2012). The latter was
further suggested to have an antifungal action against Aspergillus fumigatus
and dermatophytes (Bellete et al., 2012).
Calamintha nepeta L (Lamiaceae) Savi subsp. nepeta and Smyrnium
olusatrum L. (Apiaceae), two species native to the Mediterranean coast (Island
of Sardinia, Italy) and to Portugal’s Atlantic coast, were used by Marongiu et al.
(2010, 2012) in order to evaluate the antifungal activity of their EOs against five
species of Candida (C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. guillermondii, C.
parapsilosis), three species of Aspergillus (A. niger, A. fumigatus, A. flavus), two
species of Microsporum (M. canis, M. gypseum), two species of Trichophyton
(T. rubrum, T. mentagrophytes), Cryptococcus neoformans and
Epidermophyton floccosum. Using MIC and MLC values, it was observed that
C. nepeta L populations rich in pulegone exhibited significant antifungal activity
against Aspergillus and dermatophyte strains (MIC = 0.32 to 1.25 mL mL⁻¹). In
the other hand, S. olusatrum L. oils were particularly active against
dermatophytes strains and C. neoformans (MIC = 0.32 to 0.64 mL mL⁻¹).
Concerning the cell wall structure of bacteria, some studies have
reported that EOs show better activity against Gram-positive bacteria rather
than Gram-negative bacteria. Marzoug et al. (2010), for example, observed this
phenomenon by studying the antimicrobial activity of the EO of Eucalyptus (E.
gracilis, E. oleosa, E. salubris, and E. salmonophloia). Furthermore, Zarai et al.
(2011) reported the same antimicrobial activity while studying the EO of
Marrubium vulgare.
Finally, after analyzing all data collected in this literature review and as
pointed out in a previous study by Lavinik (2013), we noted that it is difficult to
43
compare results from different studies because of the considerable variation
among the methods used to evaluate the inhibitory effect of EOs on different
microorganisms, such as: exposure of the microorganism to the oil, amount of
emulsifier used, oil solubility and the type of microorganisms used in different
tests.
Conclusion
This review suggests that there has been an improvement in the study
of essential oils of vegetable origin and in the elucidation of their antimicrobial
activity. Undoubtedly, essential oils have proven to be a promising source of
biologically active compounds. Hence, further studies are needed in order to
understand their therapeutic potential and to establish new treatments for
pathogenic diseases.
Declaration of interest
The authors report no declarations of interest
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50
Table 1 - Distribution of essential oils and their respective therapeutic actions (2010-2013)
Essential Oil Therapeutic Actions
Family Authors Species
Common name Popular use Scientific use
Calamintha nepeta Lesser Calamint
Digestive, stimulant, expectorant, sudorific,
tonic
Antifungal (Aspergillus,
dermatophytes) Lamiaceae Marongiu
et al., 2010
Carum copticum Ajowan
Aphrodisiac, antiasthmatic, antidiarrhoeal,
antimicrobial, fungicidal, anthelmintic, tonic, digestive, aromatic
Antibacterial
Apiaceae Rana et al.,
2011
Cicuta virosa L Cowbane or
Northern Water Hemlock
Analgesic, anticonvulsant
Antifungal (filamentous) Apiaceae Jun et al.,
2011
Cinnamomum cassia
Chinese cinnamon Cough, cold Antibacterial
(Salmonella) Lauraceae Lavinik, 2013
Cinnamomum zeylanicum
Blume
Indian cinnamo
n
Aphrodisiac, antiseptic,
aromatic, digestive,
stimulant, hypertensive,
sedative, vasodilator
Antifungal (A. flavus)
Antibacterial
Antibacterial
(Food pathogens)
Lauraceae
Trajano, 2011
Rana et al.,
2011
Silveira et al., 2012
Citrus limonun Lime
Stress, arteriosclerosis, fatigue, capillary
fragility, astringent,
diuretic, antiseptic,
anti-inflammatory
Bactericide Acinetobacter
(MDR) Rutaceae Guerra et
al., 2013
Coriandrum sativum L Coriander Diuretic, stomachic,
tonic Bactericide
Acinetobacter (MDR)
Apiaceae Guerra et al., 2012
Cyclotrichium leucotrichum -------------
Sedative, carminative, respiratory disorders
Antimicrobial Lamiaceae Mirjalili et
al., 2013
Cymbopogon citratus Stapf.
Lemongrass
Dermatoses (urticaria, ulcers, spots and rashes), venereal
diseases, urinary tract infections,
gastrointestinal, fevers, pain
Antifungal (Malassezia spp)
Antibacterial
Gramineae - Poaceae
Carmo, 2011
Rana et al., 2011
Cymbopogon flexuosus
East Indian Lemongrass
Anxiolytic, antibacterial, antidiarrheal,
antipyretic, digestive, carminative, sedative,
insect repellent.
Antibacterial (Food pathogens) Poaceae Silveira et
al., 2012
Cymbopogon martini Ginger
Antiseptic, analgesic, anesthetic, mosquito
repellent
Antifungal (fluconazole-
resistant C. albicans) Poaceae
Khan; Malik;
Ahmad. 2012
Cymbopogon winterianus Citronella
Sedative, bactericidal, carminative, insect
repellent
Antifungal (C. albicans, A.
flavus, A. fumigatus) Poaceae Oliveira et
al., 2011
Eucalyptus Eucalyptus expectorant, antipyretic,
vaginal irritation, enema, burn
Antimicrobial Myrtaceae Marzoug et al, 2010
Eugenia caryophyllata
Thunb Clove
Antiseptic, analgesic, anesthetic, mosquito
repellent
Antifungal (C. tropicalis)
Antibacterial
Anticariogenic
Lamiaceae
Mendes, 2011
Nuñez & Aquino,
2012
Kouidhi et al., 2010
Hyptis spp Lavender Basil bush Mint bush
fever, headache, gastrointestinal
bloating, rheumatism, Antimicrobial Lamiaceae Xu et al.,
2013
51
hepatitis, ulcer, malaria.
Laurus nobilis L Bay laurel Digestive, stimulant, expectorant, hepatic
Antibacterial (Food pathogens) Lauraceae Silveira et
al., 2012
Lavandula luisieri
Lavandula viridis
Tunisian Lavender ____________
Antifungal (Dermatophytes,
Aspergillus, Candida)
Antifungal
(Dermatophytes, Aspergillus, Candida)
Lamiaceae
Zuzarte et al 2012
Zuzarte et al 2011
Lippia sidoides Cham. Pepper-rosmarin Antioxidant,
antimicrobial Bactericidal Verbenaceae Castro et al., 2011
Magnolia grandiflora Magnolia
Astringent, antiseptic, antibacterial,
antiparasitic, antiviral, flavoring, carminative,
digestive, diuretic, hypertensive, muscle
relaxant, sedative, tonic
Antimicrobial
Magnoliaceae
Guerra-Boone et al., 2013
Mentha spp Mint
Insecticidal, antimicrobial,
antispasmodic, stimulant, anthelmintic,
carminative
Antifungal Lamiaceae Peixoto, 2010
Mentha spicata Spearmint
Antioxidant insecticidal, antimicrobial,
antispasmodic, anti-platelet, stimulant,
carminative, anthelmintic
Antimicrobial Lamiaceae Abdullah et al., 2010
Marrubium vulgare
White Horehound,
Common Horehound
Diuretic, cardiac stimulant, digestive,
expectorant. Antimicrobial Lamiaceae Zarai et al
2011
Ocimum basilicum L. Sweet Basil Flavoring, seasoning
Antibacterial Acinetobacter
(MDR) Antibacterial
(Food pathogens)
Lamiaceae
Guerra et al., 2012
Silveira et al., 2012
Origanum majorana L.
Marjoram
Antioxidant,
antimicrobial, flavoring Bactericide
Acinetobacter (MDR)
Lamiaceae Guerra et al., 2012
Origanum vulgare Oregano Flavoring, antioxidant
Antibacterial (Salmonella)
Antifungal
(Candida pp.)
Antibacterial (Food pathogens)
Lamiaceae
Lavinik, 2013
Cleff, et al., 2010
Silveira et al., 2012
Schinus molle L.
Peruvian pepper, American pepper,
escobilia, pepper tree
Astringent, aphrodisiac, balsamic, healing,
depurative, diuretic, laxative
Antibacterial
Anacardiaceae
Guerra-Boone et al., 2013
Thymus broussonetii
Boiss ----------- ---------------
Antifungal
Lamiaceae Bellete et
al., 2012
Thymus vulgaris Common thyme Flavoring, antioxidant Antibacterial (Salmonella) Lamiaceae Lavinik,
2013
Rosmarinus offinalis Rosemary Antioxidant,
antimicrobial Bactericide
Acinetobacter (MDR)
Lamiaceae Guerra et al., 2012
Supplemented with information from www.plantamed.com.br
52
5.2 Artigo 2:
Enviado para publicação em 18/09/2012 no periódico _Revista Brasileira de
Farmácia_ recebeu o número 539/847 - ISSN 2176-0667 - Status: publicado
(94 (3): 227 – 233, 2013).
Atividade antifúngica de óleos essenciais sobre leveduras Candida não
albicans
Antifungal activity of essential oils on non Candida albicans yeasts
Maiza Rocha de Abrantes1, Edeltrudes de Oliveira Lima
2, Mariana Araújo Paulo de
Medeiros1, Camilla Pinheiro de Menezes
2, Felipe Queiroga Sarmento Guerra
2 & Eveline
Pipolo Milan3.
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas – UFRN
2Departamento de Ciências Farmacêuticas / Centro de Ciências da Saúde – UFPB
3Departamento de Infectologia – UFRN
Endereço para contato: Maiza Rocha de Abrantes. Rua Maria Nazaré de
Araújo, 365, Capim Macio, Natal, Rio Grande do Norte, RN. CEP:59082-380.
Telefones do Trabalho: (84)33429796, (84)334299797, (84)33429801. Celular:
(84) 99551703. E-mail: maizajrl@ufrnet.br
53
RESUMO: Os produtos oriundos de plantas medicinais com atividade
antimicrobiana vêm ganhando grande perspectiva e tem como meta a obtenção
de princípios ativos para uma possível aplicação prática no tratamento das
infecções. Neste trabalho foi realizada uma avaliação da atividade antifúngica
desses óleos essências (OE) obtidos de plantas medicinais sobre Candida não
albicans, isoladas das mucosas vaginal e anal. A metodologia empregada foi a
técnica de difusão com disco, em ágar Sabouraud dextrose. Os ensaios foram
realizados em duplicata e os resultados considerados positivos quando as
médias aritméticas dos halos de inibição apresentaram valores iguais ou
superiores a 15 mm de diâmetro, em pelo menos, 50% do total das cepas
testadas. Dentre os produtos testados, as leveduras foram resistentes ao OE
de Coriandrum sativum. No entanto, apresentaram boa sensibilidade aos OEs
de Citrus limonum, Cinnamomum zeylanicum, Eucalyptus globulus, Eugenia
coryophyllata, Mentha arvensis, Mentha piperita, Mentha spicata, Origanum
vulgare, Pimpinella anisum com média de halos de inibição entre 18 a 49 mm
de diâmetro. Considerando os resultados obtidos no estudo, conclui-se que os
OEs acima citados, exceto o C. sativum, mostraram forte atividade anticandida.
Planeja-se realizar investigações mais amplas de tais produtos para a inibição
do crescimento de leveduras Candidas não albicans.
PALAVRAS CHAVES: Plantas medicinais, Produtos naturais, Resistência a
medicamentos.
54
ABSTRACT: The products from medicinal plants with antimicrobial activity have
been gaining great perspective and aims to achieve active principles for a
possible practical application in the treatment of infections. This work was
carried out an evaluation of the antifungal activity of these essential oils (EO)
obtained from medicinal plants on non-Candida albicans isolated from vaginal
and anal mucosa. The methodology used was the disk diffusion technique in
Sabouraud dextrose agar. Assays were performed in duplicate and the results
considered positive when the averages of inhibition halos show values equal or
superior to 15 mm in diameter, at least 50% of strains tested. Among the
products tested, the yeasts were resistant OE Coriandrum sativum. However
showed good sensitivity to the EOs of Citrus Limonum, Cinnamomum
zeylanicum, Eucalyptus globulus, Eugenia coryophyllata, Mentha arvensis,
Mentha piperita, Mentha spicata, Origanum vulgare, Pimpinella anisum mean
inhibition zones between 18 and 49 mm in diameter. Considering the results
obtained in the study, it is concluded that the EOs listed above, except C.
sativum, showed strong anti-Candida activity. It is planned to carry out more
extensive investigation of such a product for inhibiting yeast growth Candidas
not albicans.
KEYWORDS: Medicinal plants, Natural products, Drug resistance.
55
INTRODUÇÃO
Candidíase é a mais frequente infecção fúngica oportunista endógena,
por isso somente ocorre em tecidos de hospedeiros que apresentam
comprometimento de seus sistemas específicos ou inespecíficos de defesa,
causando significante mortalidade e morbidade (Rukayadi et al., 2011; Yang et
al., 2011; Kothavade et al., 2010).
Atualmente leveduras não Candida albicans como C. glabrata, C.
guilliermondii, C. parapsilosis e outras espécies têm apresentado maior
importância na etiologia das infecções fúngicas, quanto ao problema da
resistência antifúngica (Rukayadi et al., 2011; Asadzadeh et al., 2008; Yaya et
al., 2008).
Preocupações com o surgimento de cepas resistentes aos antifúngicos
convencionais têm aumentado e a realização de estudos de vigilância da
resistência antimicrobiana de leveduras têm ocorrido frequentemente. Um
exemplo é um estudo, publicado em 2008 por Yang e colaboradores, realizado
com um total de 964 isolados de Cândida coletados em Taiwan, onde os
autores observaram que 16 dos 17 isolados anfotericina B - resistentes
pertenciam a espécies de Candida não-albicans.
É bom ressaltar a questão da resistência in vitro versus in vivo em
isolados de Candida não-albicans, bem como da resistência inata e adquirida.
Espécies como C. krusei apresentam resistência intrínseca ao fluconazol, ao
passo que outras espécies, como C. tropicalis e C. glabrata têm apresentado
crescente resistência adquirida (Tan et al., 2008).
56
De forma convencional, o tratamento da candidíase não tem se mostrado
abrangente em sua totalidade, pelo surgimento de constantes barreiras
ocasionadas, principalmente, pela reduzida quantidade de agentes
antimicóticos disponíveis para tratamento sistêmico, como também a elevada
toxicidade dos mesmos e o crescente aumento de espécimes resistentes aos
antifúngicos (Khan et al., 2012; Kiraz & Yasemin, 2011).
A crescente preocupação com a resistência e com a toxicidade dos
antifúngicos fez surgir importantes estudos relacionados com atividade
antifúngica de produtos vegetais, destacando-se entre eles os realizados por
Yaya el al., 2011, Oliveira el al., 2011, Zapata et al., 2010; Coutinho et al.,
2009, os quais testaram compostos derivados de produtos naturais contra
várias espécies fúngicas. A tendência atual nas pesquisas com produtos
naturais é a obtenção de princípios ativos contidos nas espécies vegetais para
uma possível aplicação no tratamento de infecções causadas por
microrganismos, entre eles, os fungos.
Os óleos essenciais são compostos químicos oriundos do metabolismo
secundário das espécies vegetais, constituindo uma rica fonte de compostos
biologicamente ativos. São conhecidos desde a antiguidade por possuir
propriedades antifúngicas cuja utilização pode representar um avanço contra os
mecanismos de resistência que inativam antifúngicos padrões (Castro, 2010;
Saad et al., 2010; Tempone et al., 2008). Assim, a descoberta de produtos
naturais com princípios ativos de atividade antifúngica pode representar uma
nova ferramenta à produção e ao uso de fitoterápicos no combate aos agentes
infecciosos (Khan, et al., 2012; Mendes, 2011; Silva, et al., 2009).
57
Dentro desse contexto, o objetivo desse estudo foi realizar um “screening”
da atividade antifúngica de óleos essenciais sobre leveduras Candida não
albicans o qual será utilizado em futuras investigações.
MATERIAIS E MÉTODOS
Desenho do estudo
Trata-se de um estudo “in vitro”, onde foram estimadas as ações
biológicas de óleos essenciais de plantas medicinais brasileiras frente às
leveduras Candida não albicans isoladas das mucosas vaginal e anal.
Óleos Essenciais
Os óleos essenciais selecionados para a realização do estudo foram
extraídos dos espécimes botânicos especificados no quadro 1.
Quadro 1. Óleos essenciais utilizados no “screening” para determinação
da atividade antifúngica sobre cepas de Candida não albicans.
Fonte: www.plantamed.com.br
Espécie Família Nome popular
Cinnamomum zeylanicum Blume Lauraceae canela-da-índia
Citrus limonum Burm. F. Rutaceae limão-siciliano
Coriandrum sativum L. Krause Apiaceae coentro
Eucalyptus globulus Labill Myrtaceae eucalipto
Eugenia coryophyllata Thumb. Lamiaceae cravo-da-índia
Mentha arvensis L. Stewart Lamiaceae hortelã comum
Mentha piperita L. Briq. Lamiaceae hortelã-pimenta
Mentha spicata Schrad. ex Willd Lamiaceae hortelã-peluda
Ocimum basilicum Schumach. & Thonn Lamiaceae manjericão
Origanum vulgare L. (G. Beck) Klok Lamiaceae orégano
Pimpinella anisum Gaertn. Apiaceae erva-doce
58
Os óleos essenciais foram obtidos pelo processo de extração por
destilação a vapor, segundo as técnicas adotadas pela FERQUIMA – Indústria
e Comércio Limitada, Vargem Grande / São Paulo.
Microrganismos
Para o estudo de atividade antifúngica com óleos essenciais, foram
utilizados isolados de Candida não-albicans obtidos de um banco preexistente,
provenientes de vagina e ânus. Este banco foi coletado e identificado pelo
Laboratório de Micologia do Hospital Giselda Trigueiro (HGT), Natal-RN,
mediante a aprovação do Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde da
UFRN, sob protocolo 154/06. As cepas foram identificadas através de sua
macro e micromorfologia, comportamento fisiológico e bioquímico, conforme o
protocolo recomendado por Kurtzman & Feel, 1998. A concordância dos
resultados da identificação bioquímica do Banco de Leveduras foi realizada no
Laboratório de Microbiologia do Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes,
Natal (RN), através do Sistema MicroScan®.
Inóculo
A partir das culturas recentes e mantidas em Ágar Sabouraud Dextrose -
ASD (Difco® - France), durante 24-48 horas a 35C, o inóculo foi preparado e
padronizado em solução fisiológica a 0,9% estéril. Inicialmente, preparou-se
uma suspensão comparativa com o tubo 0,5 da escala de Mc Farland. A
mesma foi ajustada no espectrofotômetro (Leitz-Fhotometer 340-800), para
conter aproximadamente 106 UFC/mL. Em seguida, essa suspensão foi diluída
com água destilada numa proporção de 1:9, resultando em um inóculo
59
contendo aproximadamente 105 UFC/mL, que foi utilizado nos ensaios
(Koneman et al., 2008; Ostrosky et al., 2008).
“Screening” microbiológico Para a realização do estudo, os óleos essenciais foram utilizados “in
natura”. O método microbiológico utilizado foi o de difusão em meio sólido com
discos de papel (Sensiobiodisc do Centro de Controle e Produtos para
Diagnósticos Ltda – CECON/SP) impregnados com 10 µL dos óleos essenciais,
desenvolvidos em ASD. O sistema foi incubado a 350C, por 48 horas (Koneman
et al., 2008; Yaya, 2008; Ostrosky et al.,2008). Os ensaios foram realizados em
duplicatas e os resultados considerados positivos quando a média aritmética
dos halos de inibição apresentaram valores iguais ou superiores a 15 mm de
diâmetro, em pelo menos, 50% do total das cepas testadas (Mendes, 2011).
A nistatina (Centro de Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda –
CECON/SP) foi selecionada como antifúngico padrão, após realização do
antifungigrama pelo método microbiológico de difusão em ASD, o qual
apresentou melhor perfil de sensibilidade para esse banco de leveduras.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente estudo permitiu identificar através da avaliação pré-clínica a
atividade antifúngica de óleos essenciais sobre Candida não albicans,
utilizando o método de investigação preliminar, difusão em meio sólido. Tal
método fornece informação qualitativa, mas bastante útil para estabelecer a
sensibilidade de microrganismos aos óleos essenciais.
60
Na tabela 1 estão apresentados os resultados dos óleos essenciais
testados sobre leveduras Candida não albicans, isoladas da mucosa vaginal.
Dentre, os onze produtos testados, as leveduras apresentaram-se resistentes
apenas ao óleo essencial de C. sativum, os demais óleos (C. limonum, C.
zeylanicum, E. coryophyllata, E. globulus, M. arvensis, M. piperita, M. spicata,
O. basilicum, O. vulgare e P. anisum) produziram intensa atividade, pois a
média dos seus halos de inibição oscilou entre 17 a 49 mm de diâmetro,
mostrando-se superiores à média daqueles obtidos com a droga padrão
nistatina (16 mm).
61
Tabela 1 – Halos de inibição de onze óleos essenciais e nistatina sobre Candida não albicans de origem vaginal
Os resultados apresentados na tabela 2 são referentes aos ensaios para
avaliação da atividade antifúngica dos óleos essenciais testados sobre o
crescimento de leveduras Candida não albicans, isoladas da mucosa anal.
Essas leveduras apresentaram resistência ao óleo essencial de C. sativums,
perfil semelhante ao observado nas de origem vaginal. O óleo de O. basilicum
também apresentou perfil de resistência para essas leveduras desse sítio, pois
a média aritmética dos halos de inibição apresentaram valores inferiores a
15mm de diâmetro, em mais de 50% das cepas testadas. Os demais óleos
produziram intensa atividade, onde a média dos seus halos de inibição foi entre
24 a 49 mm de diâmetro, mostrando-se bem superiores à média da droga
padrão nistatina com 17 mm de diâmetro.
Óleos essenciais (mm)
CCepas
C.
limo
num
C.
sativum
C.
zeyla
nic
um
E. c
ory
ophylla
ta
E.
glo
bulu
s
M.
arv
ensis
M.
pip
erita
M. spic
ata
O.
basili
cum
O. vulg
are
P.
anis
um
Contr
ole
nis
tatin
a (
NY
)
C. parapsiloses 02V 50 0 23 0 50 50 50 50 20 14 50 15
C. parapsiloses 15V 50 0 22 17 50 50 50 50 19 23 50 15
C. guillermondii 30V 50 0 20 22 50 50 50 50 18 50 50 18
C. guillermondii 33V 50 0 34 34 50 50 50 50 16 30 50 19
C. parapsiloses 50V 50 0 22 12 50 50 50 50 16 50 25 19
C. guillermondii 62V 50 0 34 30 50 50 50 50 22 30 50 12
C. guillermondii 66V 40 0 18 19 35 50 50 50 10 22 24 20
C. parapsiloses 71V 50 0 35 50 50 50 50 50 20 50 50 15
C. guillermondii 75V 50 0 23 22 50 50 50 50 14 20 50 20
C. guillermondii 81V 50 0 28 50 50 50 50 50 18 50 50 12
C. glabrata 82V 50 0 23 50 50 50 50 50 20 50 50 16
C. glabrata 85V 50 0 20 18 30 50 50 50 16 15 24 13
C. guillermondii 91V 48 0 20 20 40 42 42 42 15 24 30 16
C. guillermondii 94V 50 0 22 20 50 50 50 50 20 50 50 13
62
Tabela 2 – Halos de inibição de onze óleos essenciais e nistatina sobre Candida não albicans de origem anal
Os melhores resultados foram observados para os óleos essenciais de C.
limonum, E. globulus, M. arvensis, M. piperita, M. spicata, O. vulgare e P.
anisum. A maioria destes óleos é originada de plantas pertencentes à família
Lamiaceae. Isto pode significar que os mesmos compostos sejam responsáveis
pela atividade anticandida nestas plantas.
Mendes, 2011, observou halos médios de inibição de 42mm, 21mm,
39mm e 43mm, respectivamente para os óleos essenciais de C. zeylanicum
(canela-da-índia), C. sativum L (coentro), E. coryophyllata (cravo-da-índia) e O.
vulgare L. (orégano), sobre Candida tropicalis. Em nosso estudo também
foram observados bons resultados para C. zeylanicum (canela-da-índia), E.
coryophyllata (cravo-da-índia) e O. vulgare L. (orégano). Apenas C. sativum L
(coentro) não apresentou perfil de sensibilidade.
Óleos essenciais (mm)
CCepas
C.
limo
num
C.
sativum
C.
zeyla
nic
um
E. corp
ophylla
ta
E. g
lobulu
s
M.
arv
ensis
M.
pip
erita
M. spic
ata
O.
basili
cum
O. vulg
are
P.
anis
um
Contr
ole
nis
tatin
a
(NY
)
C. parapsiloses 02A 50 0 18 0 50 50 50 50 14 50 50 13
C. glabrata 15A 50 0 20 15 40 50 50 50 12 50 30 22
C. parapsiloses 30A 50 0 34 34 50 50 50 50 16 30 50 19
C. guillermondii 31A 50 0 30 30 50 50 50 50 16 50 50 17
C. guillermondii 33A 50 0 20 20 50 50 50 50 0 50 50 21
C. glabrata 50A 50 0 22 12 50 50 50 50 14 50 25 15
C. guillermondii 62A 50 0 22 20 50 50 50 50 16 50 50 14
C. parapsiloses 71A 50 0 30 22 50 50 50 50 15 50 50 15
C. guillermondii 75A 50 0 23 22 50 50 50 50 14 20 50 23
C. glabrata 81A 50 0 25 25 50 50 50 50 22 50 50 15
C. glabrata 82A 50 0 18 20 40 50 50 50 14 50 50 17
C. glabrata 85A 38 0 18 15 34 30 30 30 10 40 20 14
C. guillermondii 91A 50 0 36 22 42 50 50 50 10 50 50 17
C. guillermondii 94A 50 0 24 20 50 50 50 50 20 50 50 16
C . guillermondii 96A 50 0 22 20 44 50 50 50 15 50 50 17
C. guillermondii 98A 50 0 20 20 50 50 50 50 20 50 50 18
63
Kouidhi et al., 2010, utilizando o método de difusão em disco relataram a
potente atividade antibacteriana e antifúngica do óleo de Eugenia caryophyllata
(cravo) contra 114 cepas de bactérias cariogênicas e 46 cepas de leveduras,
entre elas Candida albicans, Candida guilliermondii, Candida glabrata e
Candida tropicalis.
Os resultados desta investigação também se assemelham aos de Lima et
al., (2007) que avaliando atividade anticandida, pelo método de difusão em
meio sólido, acompanhada de microdiluição, observaram que o óleo essencial
de C. zeylanicum apresentava destacável resultado, visto que inibiu o
crescimento de 58% das cepas ensaiadas e CIM de 4%.
Fu et al.,2007, também poderam constatar que o óleo essencial de
Syzygium aromaticum (cravo) apresentava atividade antifúngica contra cepas
de C. albicans, com halos de inibição de 32mm, resultados semelhantes ao que
foi descrito nesta investigação para C. não albicans.
Utilizando a técnica de microdiluição, Yaya et al., (2008 e 2011)
observaram que o extrato de Albizia myriophylla Benth (Fabaceae) e Curcuma
xanthorrhiza Roxb (Zingiberaceae) também apresentam atividades anticandida.
As pesquisas envolvendo plantas medicinais têm crescido
significativamente em número e importância, principalmente quanto aos
aspectos químicos, etnobotânicos e atividade biológica, no entanto, muitas são
as espécies vegetais que ainda carecem de investigação. A possibilidade de
se obter produtos menos agressivos, de menor custo e, portanto, mais
acessíveis tem incentivado a avaliação de compostos quimicamente puros,
óleos essenciais e extratos brutos no que diz respeito às suas ações
terapêuticas, efeitos tóxicos, entre outros, fundamentando a validade dos
64
princípios medicamentosos com o intuito de atender às necessidades básicas
de saúde (Kurtzman & Feel, 1998). Neste contexto, os produtos naturais
representam uma importante e interessante área de desenvolvimento e sua
completa apreciação permite comprovar a legitimidade dos seus inúmeros
benefícios.
CONCLUSÕES
Os óleos essenciais C. limonum, C. zeylanicum, E. globulus, M. arvensis,
M. piperita, M. spicata, O. vulgare e P. anisum mostraram forte atividade
anticandida independentemente do sítio de origem das espécies, superando os
valores de inibição da nistatina.
O óleo essencial de C. sativum (Coentro) não apresentou atividade
antifúngica contra as espécies de Candida não-albicans.
O óleo de O. basilicum apresentou perfil de resistência para as leveduras
do sítio anal.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Hospital Giselda Trigueiro (HGT) e ao Hospital
Pediátrico Maria Alice Fernandes, Natal-RN, pela doação e identificação
bioquímica do Banco de Leveduras.
65
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69
5.3 Artigo 3:
Periódico Journal of Medical Microbiology (JMM) - Print ISSN: 0022-2615;
Online ISSN: 1473-5644. Status: a ser submetido
Antifungal activity of the essential oil of Mentha spicata L. on clinical
strains of Candida guilliermondii
Maiza Rocha de Abrantes1, Edeltrudes de Oliveira Lima2, Camilla Pinheiro de
Menezes2, Felipe Queiroga Sarmento Guerra2, Fábio Santos de Souza3,
Vinicius Nogueira Trajano3, Valmir Gomes de Souza3 & Eveline Pipolo Milan4.
Author affiliation
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil;
2Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade
Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil;
3Laboratório Unificado de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos, Universidade Federal
da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil;
4Departamento de Infectologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,
Brazil.
Corresponding author. Mailing address:
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, R. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, 1o
andar, Petrópolis, Natal, RN, Brazil. CEP: 59012-570. Phone: +55 (84) 3342-99797, 3342-9801.
Mobile: + 55 (84) 9955-1703. E-mail: maizajrl@ufrnet.br.
Abbreviations:
Eos - essential oils
MIC - Minimal Inhibitory Concentration
MFC - Minimal Fungicidal Concentration
Keywords: Candidiasis, Volatile oils, Natural products.
70
ABSTRACT
Candidiasis is a relevant issue because of the increasing number of
immunocompromised individuals and the emergence of strains resistant to
conventional antifungal agents. The search for new, more effective and less
toxic antifungal agents is of fundamental importance to the treatment of this
disease, and essential oils (EOs) are an excellent alternative for this purpose.
The present study investigated the antifungal activity of the EO of Mentha
spicata on anal and vaginal Candida guilliermondii. Thus, we determined the
Minimal Inhibitory Concentration (MIC), Minimal Fungicidal Concentration
(MFC) and antifungal activity of the EO. The EO of M. spicata was extracted by
steam distillation. Phytochemical analysis of M. spicata showed the presence of
carvone (84.32%), followed by limonene (13.70%) and isodihydrocarvone
(0.82%). Results for MIC varied from 32 to 128 μg/mL, whereas MFC values
ranged between 64 and 1024 μg/mL. Evaluating the effect of the EO and
nystatin 100 Ul/mL, we observed that the standard antifungal agent had a
fungicidal effect after a 4-hour exposure, whereas the EO of M. spicata showed
a fungistatic effect in MIC, MICX2 and MICX4 on all evaluated strains.
Therefore, we concluded that the EO of M. spicata showed strong antifungal
activity against all evaluated strains.
INTRODUCTION
Candidiasis is a relevant issue because of its incidence and severe
complications. It consists of opportunistic and predominantly endogenous fungal
infections, causing significant morbidity and mortality in immunocompromised
patients (Rukayadi et al., 2011, Jin et al., 2010; Kothavade et al., 2010).
Most cases of candidiasis are caused by C. albicans. However, non-albicans
Candida species have recently shown to be infectious agents for candidiasis,
indicating a changing trend in the etiology of this disease. The non-albicans
Candida species commonly isolated from clinical material are C. glabrata, C.
tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae, C.
viswanathii, C. famata, C. norvegensis and C. haemulonii (Oberoi, et al., 2012;
71
Rukayadi et al., 2011; Couto et al., 2011; Santos, 2009).
Increasing resistance to antifungal agents, the limited number of available
drugs, therapeutic limitations, ineffectiveness, toxicity, severe neutropenia, drug
interactions and insufficient bioavailability of the currently available antifungal
drugs make the treatment of human mycoses very difficult, increasing the
search for new therapeutic alternatives among aromatic plants and their
essential oils, empirically used for their antifungal properties (Khan, et al., 2012;
Silva, et al., 2009).
M. spicata L., a creeping rhizomatous, perennial herb with a strong aromatic
odor, belongs to the Lamiaceae family. It is commonly known as spearmint, and
it is a hybrid between M. sylvestris and M. suaveolens. Carvone and limonene
are the major chemical constituents of the essential oil of M. spicata L.
(Govindarajan et al., 2012; Mkaddem, 2009; Ferreira, 2008). In alternative
medicine, it has been used to treat respiratory diseases and the common flu, as
well as tranquilizer, gastric stimulant, and antiflatulent, anthelmintic,
antibacterial and antiseptic agents (Peixoto, 2010; Ferreira, 2008).
The development of effective strategies for the treatment of candidiasis and
other fungal diseases is a challenge, considering the increase in opportunistic
fungal infections in human immunodeficiency virus-positive patients and in other
immunocompromised patients (Khan, 2012; Zirkel et al., 2012). The main goal
of the search for new herbal drugs is not to replace existing drugs, but to
broaden the available therapeutic arsenal and to offer equivalent drugs at lower
prices or with more appropriate action spectra (Carmo, 2011). Thus, the search
for a new product that acts on potentially pathogenic or opportunistic fungi is
pivotal for the treatment of candidiasis: a product with a broad spectrum action,
short-term use, minimal adverse effects on the host and high levels of efficacy.
Hence, our purpose was to investigate the antifungal activity of the essential oil
of M. spicata on clinical strains of Candida gulliermondii.
72
METHODS
Essential Oil of M. spicata and chemical analysis
Chemical composition of the essential oil (EO) of M. spicata L. (FERQUIMA –
Indústria e Comércio Limitada, Vargem Grande/São Paulo, batch 184) was L-
carvone 70%, Limonene 19%, others 11%.
Phytochemical analysis was performed by a Shimadzu Gas Chromatograph
(GC-17A) equipped with a Mass Spectrometer (MS). Data collection and
integration were carried with the software Class5000. The carrier gas was
helium at 1.6 mL/min with split ratio of 1:5.
Chromatographic separation was performed on a DB-5 capillary column (30 m x
0.25 mm x 0.25 μm). The temperature of the column oven was initially set to
60°C and subsequently increased to 120°C (5°C/min) and then to 280°C
(20°C/min). Injector and detector temperatures were 260°C and 280°C,
respectively. The total run time for each injection was 20 min and the injection
volume was 1.0 μl. The identification of the EO was performed using a
computer system and data processing (workstation) connected to the GC-MS
and equipped with a Wiley library, 6th Edition 5000-class 1999 with 229.119
spectra.
Microorganisms
We used fourteen strains of Candida guilliermondii from an existing database,
originally obtained from vaginal and anal orifices. This database was collected
and identified by the Mycology Laboratory of the Hospital Giselda Trigueiro
(HGT) Natal, RN, Northeastern Brazil, with the approval from the Ethics
Committee of the Centro de CIências da Saúde of the Universidade Federal do
Rio Grande do Norte (protocol 154/06). The concordance in the results from
biochemical identification tests of the Banco de Leveduras was performed by
the Laboratory of Microbiology of the Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes
by MicroScan® System.
73
Standard antifungal drug
In order to test the biological activity of the EO of M. spicata on strains of C.
guilliermondii, we used the standard antifungal drug Nystatin (Sigma-Aldrich®)
as a control treatment.
Microbiological assays
Determination of the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal
Fungicidal Concentration (MFC)
Antifungal activity assays were performed by microdilution (Koneman et al.,
2008; Ostrosky et al., 2008; Hadacek & Greger, 2000; Ellof, 1998). Prior to
testing, cultures on Sabouraud Dextrose Agar (SDA; Difco®-France) were
incubated at 35°C for 24 to 48 h. The inoculum was prepared and standardized
in sterile saline solution (0.9%). Initially, a McFarland 0.5 standard suspension
was prepared. The suspension was then diluted in distilled water at 1:9 ratios
resulting in an inoculum of approximately 105 CFU/mL.
Sterile 96-well microtiter plates (INLAB) were used. To each well, we added 100
µl of Sabouraud Dextrose Broth (SDB; Difco®-USA/France) followed by the
addition of 100 µl of an emulsion of the EO at an initial concentration of 1024
µg/mL to the first row of wells. This solution was then serially diluted twofold to
obtain final concentrations ranging from 1024 µg/mL to 4 µg/mL. Finally, 10 µL
of yeast cell suspension were added to each column of wells, with each column
corresponding to a different strain of C. guilliermondii. In conjunction with
microbiological assays, we performed sterility control (SDB medium with no
yeast suspension), microorganism growth and viability control (antifungal-free
medium) and standard antifungal control (nystatin 100 UI/mL).
The assays were incubated at 35ºC for 24-48 h, followed by the reading and
interpretation of the results. MIC was defined as the lowest concentration
capable of inhibiting any visible fungal growth in the wells when compared to
the control treatment. Assays were performed in duplicate and the results were
74
expressed as the geometric mean of MIC values obtained in both assays (Eloff,
1998; Cleeland & Squires, 1991). The antifungal activity was evaluated
according to the following parameters: MIC ≤ 500μg/mL = strong antimicrobial
activity; MIC = 600-1600μg/mL = moderate activity; MIC ≥ 1600μg/mL = low
activity (Sartoratto et al., 2004).
Following MIC determination, MFCs were determined for: drug concentrations
that inhibited growth after incubation, the two immediately above concentrations
and the positive controls. For this purpose, 20 μL of each of these wells were
transferred onto Sabouraud dextrose agar plates. The plates were then
incubated at 35°C for 24 h and MFC readings were defined based on the
controls’ growth. MFC was defined as the lowest concentration yielding a
growth rate lower than three (03) CFUs on a streaked SDA plate (Amato Neto
et al., 1994; Zaror & Espenel-Ingroff, 1989).
Effect of the essential oil on C. guilliermondii (time-kill)
Time-kill curves were obtained according to the methodology used previously
by Klepser et al. (1998) and by selecting two representative strains of C.
guilliermondii. Prior to the assay, yeasts were grown on SDA. Fungal
suspensions were prepared in accordance with 0.5 McFarland standard (1-
5x106 CFU/mL) (Hadacek & Greger, 2000; Cleeland & Squires, 1991). One
milliliter of the adjusted fungal suspension was added to 9 mL of either SDB
with drugs or SDB without drugs. This resulted in a 1:10 dilution of the fungal
suspension and yielded a starting inoculum of approximately 1-5 x 105 CFU/mL.
Nystatin and EO concentrations in test solution were, respectively, 100UI/mL
and equal to 1, 2 and 4 times the MIC value. At predetermined time points (0, 2,
4, 8 and 24 h) following the addition of either EO or Nystatin, a 100-μL aliquot
was removed from each culture tube and then serially diluted with sterile
distilled water. A 10-μL aliquot from each dilution was uniformly streaked onto
SDA plates for colony count determination. When the number of colonies was
less than 1000 CFU/mL, 10 μL of sample were removed and plated undiluted
(Giannuzzi, 1996).
75
Following incubation at 35°C for 24 to 48 h, the number of CFU on each plate
was determined and multiplied by the dilution factor in order to get the number
of CFU per mL. The minimum detection limit was 100 CFU/mL.
Concentration time-kill curves were constructed by plotting the log10 CFU per
milliliter values versus time with GraphPad Prism 5.0 for Windows (GraphPad
Software, San Diego, CA). Fungicidal activity was defined as a drop in the
starting inoculum by at least 3 log10 CFU/ml (≥ 99,9%) whereas fungistatic
activity as a drop in the starting inoculum by less than 3 log10 CFU/ml (< 99,9%)
(Hadacek & Greger, 2000; Cleeland & Squires, 1991).
RESULTS
The chemical composition of EO from tested M. spicata leaves was determined
by GC-MS analysis. Table 1 shows their quantitative and qualitative
composition and their respective retention times and percentages. The major
component was carvone (84.32%) followed by limonene (13.70%). In addition,
there were traces of isodihydrocarvone (0.82%).
MIC analysis showed a variation from 32 to 128 μg /mL (Table 2). MIC50 and
MIC90 values were, respectively, 64 μg/mL and 128 μg/mL. Fungal strains were
all able to grow in SDB alone (without EO), showing its viability.
The MFC values for the EO of M. spicata ranged between 64 and 1024 μg/mL.
The results showed that 12/14 (86%) of the strains subjected to biological
assays had MFC values ≤ 512 μg/mL. Only 1/14 (7.1%) was 1024 μg/mL.
MFC50 was 256 μg/mL.
The effect of different concentrations of the EO on microbial death was based
on the MIC values of two representative strains of C. guilliermondii. Time-kill
curves were plotted graphically as log10CFU/mL versus time, for C.
guilliermondii strain 9A (Figure 1) and C. guilliermondii strain 9V (Figure 2), in
the absence of EO (control), in the presence of MIC, MICX2 and MICX4, and in
76
the presence of nystatin 100 UI/mL.
According to Figure 1, only nystatin 100 UI/mL showed fungicidal effect after a
4-hour exposure (drop in the starting inoculum by at least 3 log10 CFU/ml).
However, the fungistatic effect was observed in the presence of MIC, MICX2
and MICX4 of the EO of M. spicata against C. guilliermondii strain 9 A.
Figure 2 shows that the time-kill curve of C. guilliermondii strain 9V with EO of
M. spicata is similar to the results of C. guilliermondii strain 9 A (Figure 1).
However, the rate and extent of antifungal activity varied slightly between the
two strains.
DISCUSSION
Plant-originated substances have been used for the treatment of
various diseases. However, the potential use of plants as a source of new drugs
has not been fully explored. In fact, the available data show that only 15 to 17%
of plants have had their pharmacological properties sufficiently studied (Laviniki,
2013; Oliveira et al., 2011). Thus, the search for new drugs in plants with
therapeutic potential is pivotal for the development of new treatments.
Moreover, EOs are important because of their several pharmacological
activities: antioxidant (Maskovic et al., 2013; Xu et al., 2013), anti-inflammatory
(Ramos et al., 2013; Salud et al., 2013), larvicide (Govindarajan et al., 2012;
Souza et al., 2012), insecticide (Arango et al., 2013; Salama et al., 2012),
antibacterial (Guerra et al., 2013; Castro, et al., 2011) and antifungal (Tyagi et
al., 2013; Khan et al., 2012; Oliveira et al., 2011).
The EOs, complex mixtures of volatile compounds originating from the
secondary metabolism of plants, are a rich source of biologically active
compounds, especially terpenes and phenylpropanoids, found in broad-
spectrum antimicrobials (Silva et al., 2013; Lima, 2011; Saad et al., 2010).
GC-MS analysis of the EO of M. spicata L. resulted in the identification of two
77
major components: carvone and limonene. In other studies, these
phytochemicals have been among the most commonly isolated compounds
(Govindarajan et al., 2012; Abdullah et al., 2010; Hussain et al., 2010;
Chauhana et al., 2009; Mkaddem et al., 2009; Soković, et al., 2009).
In medicine, carvone has been used to treat respiratory diseases, the common
flu, as well as tranquilizer, gastric stimulant, and as antiflatulent, anthelmintic,
antibacterial, antifungal and antiseptic agents. It has also been used in
condiments, chewing gum, candy, toothpaste and shaving cream, not only for
its flavor, but for its antibacterial and antiseptic properties (Ehlert et al., 2013).
Limonene is the key precursor of the main Mentha monoterpenes, including
carvone. It has been directly used in the production of natural flavors and
fragrances (Silva, 2011) and artificial essential oils, and as solvents and
dispersants (Ehlert et al., 2013).
According to Sartoratto and colleagues (2004), EOs with MIC values of 500
μg/mL or lower have strong antimicrobial activity. Based on this principle, the
EO of M. spicata showed an excellent antimicrobial potential against the studied
strains of C. guilliermondii (MIC values ranged from 128 to 32 μg/mL). Using
microdilution assays, Soković, at al. (2009) have observed a strong antifungal
activity in the EO of Mentha spp, which may be used as a natural preservative.
A clear understanding of the pharmacodynamic properties of antifungal agents
is important for the adequate treatment of fungal infections such as candidiasis.
For certain antifungal agents, determining the MFC and time-kill curve could be
clinically more relevant than the determination of MIC (Lemos et al., 2009).
Drug-concentration time-kill curves have shown that the higher the EO
concentration, the greater the antifungal activity (Guerra, et al., 2013). Hence,
the EO of M. spicata used on C. guilliermondii strains selected for our study
showed a concentration-independent fungistatic effect. In contrast, Oliveira
(2011) investigated the activity of the EO of Cymbopogon winterianus
(lemongrass) on C. albicans, A. flavus and A. fumigatus using time-kill
78
methodology and observed that this EO had a concentration-dependent
antifungal effect for all strains tested.
Clinically, differences in fungal dynamics may influence the selection of optimal
dose regimens for antifungal therapies. Agents in which the rate and extent of
antifungal activity improve with increasing concentration (e.g. amphotericin B
and nystatin) may be optimized by the administration of prolonged therapeutic
regimens. In contrast, the efficacy of antifungal agents such as fluconazole
does not improve with increasing concentration because of its concentration-
independent fungistatic effect (Oliveira, et al., 2011).
Several studies using fungal cell viability test (time-kill) have investigated the
activity of the EOs in plants from the Lamiaceae family. Among them, Mendes
(2011) has observed a concentration-dependent antifungal activity in the EO of
Eugenia caryophyllata Thunb on C. tropicalis strains.
The increased resistance of Candida species have valued the search for new
antifungal agents. The antifungal activity demonstrated by the essential oil of M.
spicata L makes it a potential candidate as a major agent in controlling fungi
growth that cause Candidiasis.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank to the Hospital Giselda Trigueiro (HGT) and Hospital Pediátrico Maria
Alice Fernandes for the donation and biochemical identification (Banco de
Leveduras), especially to pharmacists Ana Cristina Santos Fernandes and
Maria Guimaraes Narriman Goveia; to Professors Telma Maria Araújo Moura
Lemos and Tereza Neuma de Souza Brito for logistical support in the
elaboration of this study; and to everyone who work in the Laboratory of Clinical
Microbiology at the Universidade Federal do Rio Grande do Norte and in the
Laboratory of Mycology at the Universidade Federal da Paraíba.
79
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84
Table 1 – Chemical composition of the essential oil from M. spicata leaves.
Picos Retention time (min) Phytochemicals Area % formulation
1 7.45
limonene
1031 13,70
2 11.71
iso-dihidrocarvona
1193 0,82
3 12.74
carvone
1242 84,32
4
other compounds
1,15
85
Table 2 – Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal
Concentration (MFC) of the EO of M. spicata on clinical strains of C.
guilliermondii.
+ ꞉ Microorganism growth - ꞉ Microorganism growth inhibition A = anal e V= Vaginal MIC and MFC were determined by geometric mean
Strains
Essential oil (µg/mL)
Nystatin 100 UI
Strain
Control
MIC MFC
3A - C. guilliermondii 128 512 - +
4A - C. guilliermondii 64 512 - +
5A- C. guilliermondii 64 512 - +
7A - C. guilliermondii ≥2048 ≥2048 - +
8A- C. guilliermondii 32 128 - +
9A - C. guilliermondii 64 128 - +
10A - C. guilliermondii 128 1024 - +
11A- C. guillermondiii ≥2048 ≥2048 - +
4V - C. guilliermondii 64 128 - +
5V- C. guilliermondii 64 128 - +
6V - C. guilliermondii 64 256 - +
7V - C. guilliermondii 64 64 - +
8V- C. guilliermondii 64 256 - +
9V - C. guilliermondii 64 128 - +
86
0 4 8 12 16 20 240
1
2
3
4
5
6
7Control
MIC
MIC X 2
MIC X 4
Nistatine
limit
Hours
Lo
g C
FU
/mL
Figure 1 - Time-kill curve (Log CFU/mL) of C. guilliermondii strain 9A with EO
of M. spicata and nystatin.
0 4 8 12 16 20 240
1
2
3
4
5
6
7Control
MIC
MIC X 2
MIC X 4
Nistatine
Limit
Hours
Lo
g C
FU
/mL
Figure 2 - Time-kill curve (Log CFU/mL) of C. guilliermondii strain 9V with EO of M.
spicata and nystatin.
87
5.4 Artigo 4:
Periódico: Brazilian Journal of Microbiology (JMM) - ISSN: 1517-8382 versão
impressa. ISSN: 1678-4405 versão on-line. Status: a ser submetido
Antifungal mechanism of essential oil from Mentha spicata L.
on clinical strains of Candida guilliermondii
Maiza Rocha de Abrantes1, Edeltrudes de Oliveira Lima2, Camilla Pinheiro
de Menezes2, Felipe Queiroga Sarmento Guerra2, Fábio Santos de Souza3,
Vinicius Nogueira Trajano3, Valmir Gomes de Souza3 & Eveline Pipolo
Milan4.
1Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Centro de Ciências da
Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil;
2Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil; 3Laboratório
Unificado de Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos, Universidade
Federal da Paraíba, João Pessoa, PB, Brazil; 4Departamento de Infectologia,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
Corresponding author. Mailing address: Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, R. Gal. Gustavo Cordeiro de Farias, S/N, 1o andar,
Petrópolis, Natal, RN, Brazil. CEP: 59012-570. Phone: +55 (84) 3342-99797,
3342-9801. Mobile: + 55 (84) 9955-1703. E-mail: maizajrl@ufrnet.br.
88
ABSTRACT
The study of the antifungal activity of medicinal plants has achieved a great
importance in recent years, and aims to find active principles to develop new
practical applications such as the development of new treatment for pathogenic
diseases. The present study verified the biological activity of the essential oil
(EO) of Mentha spicata L., extracted by steam distillation, on anal and vaginal
Candida guilliermondii. For this purpose, we determined the Minimal Inhibitory
Concentration (MIC), observed micromorphological changes in C. guilliermondii
using a microculture chamber and investigated the antifungal action mechanism
using the sorbitol bioassay. Phytochemical analysis of M. spicata showed the
presence of carvone (84.32%), followed by limonene (13.70%) and
isodihydrocarvone (0.82%). Results for MIC varied from 32 to 128 μg/mL. The
EO of M. spicata showed strong antifungal activity against all strains tested.
Micromorphological changes in C. guilliermondii were observed by optical
microscopy at all concentrations tested (MIC, MICx2), which were similar to
results found using 100 Ul/mL nystatin. During the experiment, we observed a
change in MIC values when sorbitol concentration was increased by 4 times the
initial concentration, which suggests that the components of the EO have a
direct effect on the cell wall. Therefore, we concluded that M. spicata may be a
potential candidate as a major agent in controlling fungi growth that cause
Candidiasis.
Keywords: Candidiasis, Sorbitol, Natural products.
89
INTRODUCTION
Mentha spicata L., a creeping rhizomatous, perennial herb with a strong
aromatic odor, belongs to the Lamiaceae family. It is commonly known as
spearmint, and it is a hybrid between M. sylvestris and M. suaveolens. Carvone
and limonene are the major chemical constituents of the essential oil of M.
spicata L. (Govindarajan et al., 2012; Abdullah et al., 2010, Hussain et al., 2010,
Chauhan et al., 2009, Mkaddem, 2009; Soković et al., 2009). It has been used
in folk medicine to treat respiratory diseases and the common flu, as well as
tranquilizer, gastric stimulant, and antiflatulent, anthelmintic, antibacterial and
antiseptic agents (Peixoto, 2010; Ferreira, 2008). The EO of M. spicata has also
shown a strong antioxidant (Abdullah et al., 2010), insecticide and mutagenic
activity (Chauhan et al., 2009).
Medicinal and aromatic plants are widely used in folk medicine and
have been extensively studied in order to find more effective and less toxic
compounds. Plant-originated products and their derivatives are known to be
important in pharmacological research and in the development of new
therapeutic tools. Therefore, they constitute an important source of biologically
active compounds that can be used as an alternative for therapeutic
intervention. Accordingly, the proper study of the pharmacology of medicinal
plants has shown to be an important tool to study their biological properties
(Saad, 2010).
The dissemination of antifungal drug-resistant yeasts is one of the most
serious threats to the successful treatment of mycotic diseases. Despite the
outcome of potent antifungal therapies, drug-resistant or multidrug-resistant
90
strains have continuously emerged. The need for long-term suppressive therapy
with antifungal agents may be responsible for the selection of resistant strains
(Khan & Malik, 2012).
Increasing resistance to antifungal agents, the limited number of
available drugs, therapeutic limitations, ineffectiveness, toxicity, severe
neutropenia, drug interactions and insufficient bioavailability of the currently
available antifungal drugs make the treatment of human mycoses very difficult,
increasing the search for new therapeutic alternatives among aromatic plants
and their essential oils, empirically used for their antifungal properties (Khan, et
al., 2012; Oliveira, et al., 2011; Silva, et al., 2009).
Based on these considerations, and on other factors such as the high
incidence of candidiasis, the increasing number of immunocompromised
individuals, the emergence of resistant strains and the toxicity of existing
antifungal compounds, we highlight the importance of finding new therapies for
the treatment of fungal infections. Such therapies should include biological
agents with a broad spectrum action, short-term use, minimal adverse effects
on the host and high levels of efficacy. For this purpose, medicinal plant-derived
products are an excellent alternative. Hence, our purpose was to investigate the
biological activity of the EO of M. spicata by determining the MIC,
micromorphological changes in C. guilliermondii and the antifungal action
mechanism of this EO on clinical strains of C. guilliermondii.
91
MATERIAL AND METHODS
Essential Oil of M. spicata and chemical analysis
Chemical composition of the essential oil (EO) of M. spicata L.
(FERQUIMA – Indústria e Comércio Limitada, Vargem Grande/São Paulo,
batch 184) was L-carvone 70%, Limonene 19%, others 11%.
Phytochemical analysis was performed by a Shimadzu Gas
Chromatograph (GC-17A) equipped with a Mass Spectrometer (MS). Data
collection and integration were carried with the software Class5000. The carrier
gas was helium at 1.6 mL/min with split ratio of 1:5.
Chromatographic separation was performed on a DB-5 capillary column
(30 m x 0.25 mm x 0.25 μm). The temperature of the column oven was initially
set to 60°C and subsequently increased to 120°C (5°C/min) and then to 280°C
(20°C/min). Injector and detector temperatures were 260°C and 280°C,
respectively. The total run time for each injection was 20 min and the injection
volume was 1.0 μl. The identification of the EO was performed using a
computer system and data processing (workstation) connected to the GC-MS
and equipped with a Wiley library, 6th Edition 5000-class 1999 with 229.119
spectra.
Microorganisms
We used 14 strains of Candida guilliermondii from an existing database,
originally obtained from vaginal and anal orifices. This database was collected
92
and identified by the Mycology Laboratory of the Hospital Giselda Trigueiro
(HGT) Natal, RN, Northeastern Brazil, with the approval from the Ethics
Committee of the Centro de CIências da Saúde of the Universidade Federal do
Rio Grande do Norte (protocol 154/06). The concordance in the results from
biochemical identification tests of the Banco de Leveduras was performed by
the Laboratory of Microbiology of the Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes
by MicroScan® System.
Standard antifungal drug
In order to test the biological activity of the EO of M. spicata on strains
of C. guilliermondii, we used the standard antifungal drug Nystatin (Sigma-
Aldrich®) as a control treatment.
Microbiological assays
Determination of the Minimal Inhibitory Concentration (MIC)
Antifungal activity assays were performed by microdilution (Ellof, 1998).
Prior to testing, cultures on Sabouraud Dextrose Agar (SDA; Difco®-France)
were incubated at 35°C for 24 to 48 h. The inoculum was prepared and
standardized in sterile saline solution 0.9% (Fresenius Kabi Brasil Ltda). Initially,
a McFarland 0.5 standard suspension was prepared. The suspension was then
diluted in distilled water at 1:9 ratios resulting in an inoculum of approximately
105 CFU/mL (Koneman, et al., 2008; Ostrosky et al., 2008; Hadacek & Greger,
93
2000; Cleeland & Squires, 1991).
Sterile 96-well microtiter plates (INLAB) were used. To each well, we
added 100 µl of double-concentrated Sabouraud Dextrose Broth (SDB; Difco®-
USA/France) followed by the addition of 100 µl of an emulsion of the EO at an
initial concentration of 2048 µg/mL (double-concentrated) to the first row of
wells. This solution was then serially diluted twofold to obtain final
concentrations ranging from 1024 µg/mL to 4 µg/mL. Finally, 10 µL of yeast cell
suspension were added to each column of wells, with each column
corresponding to a different strain of C. guilliermondii. In conjunction with
microbiological assays, we performed sterility control (SDB medium with no
yeast suspension), microorganism growth and viability control (antifungal-free
medium) and standard antifungal control (nystatin 100 UI/mL).
The assays were incubated at 35ºC for 24-48 h, followed by the reading
and interpretation of the results. MIC was defined as the lowest concentration
capable of inhibiting any visible fungal growth in the wells when compared to
the control treatment. Assays were performed in duplicate and the results were
expressed as the geometric mean of MIC values obtained in both assays (Eloff,
1998; Cleeland & Squires, 1991). The antifungal activity was evaluated
according to the following parameters: MIC ≤ 500μg/mL = strong antimicrobial
activity; MIC = 600-1600μg/mL = moderate activity; MIC ≥ 1600μg/mL = low
activity (Sartoratto et al., 2004).
94
Effect of the essential oil of M. spicata on the morphogenesis of C.
guilliermondii
We used the microculture technique to observe any micromorphological
changes in C. guilliermondii as a result of the use of the essential oil. Based on
the MIC values previously obtained by microdilution, we selected two
representative strains of C. guilliermondii: C. guilliermondii 9A (anal strain) and
C. guilliermondii 9V (vaginal strain) (Sidrim & Rocha, 2004; Lacaz, 2002;
Dalmau, 1929). In a moist chamber, the microculture assay was carried out in
90 x 15 mm sterile Petri dishes containing Cornmeal Dextrose Agar (CMDA)
with Tween 80 (Difco® - France), a sterile slide and filter paper (30 x 30 mm).
The essential oil and nystatin, both used in sufficient quantity to obtain
the desired final concentration, were solubilized (Tween 80 - INLAB and DMSO
- Merck) in sterile tubes. Then, 4 mL of CMDA-Tween 80 were added to each of
the following tubes: control (no oil or antifungal drug), essential oil at a
concentration corresponding to the MIC, essential oil at a concentration
corresponding to the MICx2, and 100 Ul/mL nystatin.
The tubes were homogenized and 1 mL of the medium was quickly
transferred and spread onto the sterile slides, forming a thin layer. After
solidification of the medium, the C. guilliermondii strains were seeded in the
center of the plate using an inoculation loop and then covered with a sterile
coverslip. One milliliter of sterile distilled water was added on the filter paper to
keep a moist environment. The Petri dishes were then incubated at 35ºC for 24
to 48 h. Finally, the slides were analyzed in an optical microscope (Zeiss Primo
Star ® model) with 400x magnification in order to look for reproductive
95
structures such as blastoconidia in the constrictions of pseudomycelium and
ultrathin pseudomycelium.
Investigation of the antifungal mechanism - sorbitol method
Antifungal activity assays were performed by microdilution and MIC
values were determined in the presence of 0.8 M sorbitol (MW = 182.17)
(VETEC Química Fina Ltda – Rio de Janeiro/RJ) against the two representative
strains of C. guilliermondii: C. guilliermondii 9A (anal strain) and C.
guilliermondii 9V (vaginal strain). This method is based on the degree of
damage caused by the antifungal compounds on components of the fungal cell
wall. Antifungal compounds may cause lysis of cells in the absence of an
osmotic stabilizer, but allow cells to grow in the presence of this osmotic
support. Thus, this assay compares MIC values of the antifungal compounds in
the absence and in the presence of 0.8 M sorbitol, an osmotic protector used to
stabilize fungal protoplasts (Zacchino, 2001; Frost et al., 1995).
RESULTS
The chemical composition of EO from tested M. spicata leaves was
determined by GC-MS analysis. Table 1 shows their quantitative and qualitative
composition and their respective retention times and percentages. The major
component was carvone (84.32%) followed by limonene (13.70%). In addition,
there were traces of isodihydrocarvone (0.82%).
96
Table 1 – Chemical composition of the essential oil from M. spicata
Peaks Retention time (min)
Phytochemicals Area %
1 7.45 limonene 1031 13.70
2 11.71 isodihydrocarvone 1193 0.82
3 12.74 carvone 1242 84.32
4 other compounds 1.15
MIC analysis showed a variation from 32 to 128 μg /mL (Table 2). MIC50
and MIC90 values were, respectively, 64 μg/mL and 128 μg/mL. Fungal strains
were all able to grow in SDB alone (without EO), showing its viability.
Table 2- Minimal Inhibitory Concentration (MIC) mean values (n=2) of the EO of
M. spicata L. on clinical strains of C. guilliermondii, by microdilution.
C. guilliermondii strain EO of M. Spicata L
MIC (µg/mL)
Nystatin 100 Ul
Growth control
3A 128 - +
4A 64 - +
5A 64 - +
7A ≥2048 - +
8A 32 - +
9A 64 - +
10A 128 - +
11A ≥2048 - +
4V 64 - +
5V 64 - +
6V 64 - +
7V 64 - +
8V 64 - +
9V 64 - +
+ ꞉ Microorganism growth - ꞉ Microorganism growth inhibition A = anal e V= Vaginal MIC was determined by geometric mean
The use of micromorphological techniques allowed to observe changes
in C. guilliermondii caused by the EO of M. spicata L. on C. guilliermondii 9A
(Figure 1) and C. guilliermondii 9V (Figure 2). The treatments used were as
97
follows: A) negative control (yeast alone); B) positive control (yeast + 100 Ul/mL
nystatin); C) yeast + EO of M. spicata L. at the MIC; D) yeast + EO of M. spicata
L. at the MICx2. Micromorphological analysis using optical microscopy showed
that C. guilliermondii underwent notable micromorphological changes when
treated with the EO of M. spicata L. and nystatin.
A B
C D
Figure 1 - Effect of the essential oil of M. spicata on the morphogenesis of C.
guilliermondii 9A ((anal strain): A) negative control (yeast alone); B) positive
control (yeast + 100 Ul/mL nystatin); C) yeast + EO of M. spicata L. at the MIC; D)
yeast + EO of M. spicata L. at the MICx2, (400x).
AB
ADC
Figure 2 - Effect of the essential oil of M. spicata on the morphogenesis of C.
guilliermondii 9V (vaginal strain): A) negative control (yeast alone); B) positive
control (yeast + 100 Ul/mL nystatin); C) yeast + EO of M. spicata L. at the MIC; D)
yeast + EO of M. spicata L. at the MICx2,(400x).
A B
C DC D
98
As depicted in Figures 1A and 2A (negative control), evidence of fungal
growth was observed to occur with modification of the morphological structures:
blastoconidia in the constrictions of pseudomycelium and ultrathin
pseudomycelium (Sidrim & Rock, 2004). These data support the viability of cell
samples and their capacity to undergo normal morphogenesis (Mendes, 2011).
The assays with the standard antifungal (100 UI/mL nystatin) resulted in
different types of hyaline blastoconidia but revealed the absence of
pseudomycelium and blastoconidia with fragmented pseudomycelia (Figures 1B
and 2B, respectively).
Yeasts grown in EO of M. spicata L. at the MIC (Figures 1C and 2C)
and at the MICx2 (Figures 1D and 2D) showed morphological changes similar
to the ones observed in the positive control but with a significant reduction in
pseudomycelia, an important pathogenic factor (Zhu & Filler, 2010).
In all assays, we observed the presence of hyaline blastoconidia
(Figures 1 and 2), which should be observed since it is the commensal form of
the yeast (Zhu & Filler, 2010).
The results of the investigation of the antifungal mechanism are shown
in Table 3. When comparing the antifungal potential of the EO of M. spicata L.
in the presence and in the absence of sorbitol, we found that there was a
change in MIC values when sorbitol concentration was increased by 4 times the
initial concentration. The negative control (sorbitol alone without the EO)
ensured that there were no contamination, since the strains were able to grow
in the presence of sorbitol and in the absence of the EO of M. spicata L.
99
Table 3 – Activity of the essential oil of Mentha spicata L. on the yeast cell wall
of two strains of C. guilliermondii (anal and vaginal)
Strains MIC (µg/mL)
EO of M. Spicata L
Controls
C. guilliermondii
Without sorbitol With sorbitol Sorbitol
Nystatin
100UI
Sterility
9A 64 1024 + - -
9V 64 1024 + - -
+ ꞉ Microorganism growth - ꞉ Microorganism growth inhibition
A = anal e V= Vaginal
DISCUSSION
Azoles (fluconazole, itraconazole) and polyenes (nystatin, amphotericin
B and its lipidic formulations) are the main antifungal drugs used in the
treatment of candidiasis. Some drugs, such as amphotericin B, are extremely
toxic, while others, such as fluconazole, are limited because of their high
resistance rate. These factors combined with long-term antifungal therapy may
limit the use of these substances in the future (Oberoi et al, 2012; Oliveira, et
al., 2011).
Due to limitations of current antifungal therapy and to the emergence of
resistant strains, the search for new, more effective and less toxic antifungal
agents has become pivotal. Moreover, essential oils are a excellent alternative
because they are known for their several biological activities such as
antibacterial (Guerra et al., 2013) and antifungal (Oliveira et al., 2011).
The GC-MS analysis of the EO of M. spicata L. resulted in the
identification of two major components: carvone and limonene. In other studies,
these phytochemicals have been among the most commonly isolated
100
compounds (Govindarajan et al., 2012; Abdullah et al., 2010; Hussain et al.,
2010; Chauhan et al., 2009; Mkaddem et al., 2009; Soković, et al., 2009).
According to Sartoratto and colleagues (2004), EOs with MIC values of
500 μg/mL or lower have strong antimicrobial activity. Based on this principle,
the EO of M. spicata showed an excellent antimicrobial potential against the
studied strains of C. guilliermondii (MIC values ranged from 128 to 32 μg/mL).
Using microdilution assays, Soković, at al. (2009) have observed a strong
antifungal activity in the EO of Mentha spp, which may be used as a natural
preservative.
Fungal morphology is an important factor to fungal invasiveness and
virulence. The filamentous form (hyphae and pseudohyphae) is associated with
the parasitical state, serving as a barrier to phagocytosis, while the yeast form is
associated with the commensal state. The ability to switch between the yeast
form and the multi-cellular filamentous form is tightly associated with virulence.
Environmental factors are believed to influence the physiological state of the
commensal yeast, causing infections (Zhu & Filler, 2010).
Hyphae are not only essential for invasion, they also adhere more
readily to host epithelial surfaces than do yeast cells (Martin et al. 2011). The
adhesion to epithelial surfaces is a critical step in the colonization of mucosal
surfaces, and adhesins often exhibit differential expression between yeast and
hyphal forms (Zhu & Filler, 2010).
Several studies have reported antifungal activity of EOs on the
micromorphological level, which significantly reduces the development of key
structures such as pseudo-hyphae, blastoconidia and chlamydospore. These
findings make possible the use of EOs as promising therapeutic agents in the
101
treatment of candidiasis (Oliveira, et al., 2011; Mendes, 2011; Castro, 2010).
Sorbitol is an osmotic protector used to stabilize fungal protoplasts. The
test with 0.8 M sorbitol is based on the degree of damage caused by the
antifungal compounds on components of the fungal cell wall. Antifungal
compounds may cause lysis of cells in the absence of an osmotic stabilizer.
Thus, this assay compares MIC values of the antifungal compounds in the
absence and in the presence of 0.8 M sorbitol (Lima et al, 2012).
We observed that the antifungal potential of the EO of M. spicata L. was
reduced in the presence of sorbitol (MIC values were higher when sorbitol
concentration was increased by 4 times the initial concentration). Since sorbitol
is an osmotic protector, the EO cannot efficiently reach the cell wall. Therefore,
these results suggest that the two major components of this EO (carvone and
limonene) act directly on the fungal cell wall.
Our results are similar to those observed by Oliveira et al. (2011) and
Castro (2010). They reported anti-Candida activity of the EOs of Cymbopogon
winterianus e Cinnamomum zeylanicum, respectively, suggesting their action
on the fungal cell wall.
Finally, as antibiotic resistance becomes a global problem, the search
for new antifungal agents becomes emergent.
CONCLUSION
Our study demonstrated the antifungal activity of the essential oil of
Mentha spicata L. against anal and vaginal Candida guilliermondii. This
antifungal action occurs on the fungal cell wall, leading to micromorphological
102
changes and causing the inhibition of pseudomycelium formation, an important
pathogenic factor for Candida. A similar result was observed in the presence of
nystatin (positive control).
Hence, the antifungal activity demonstrated by the essential oil of M.
spicata L. makes it a potential candidate as a major agent in controlling fungi
growth that cause Candidiasis
ACKNOWLEDGMENTS
We thank to the Hospital Giselda Trigueiro (HGT) and Hospital Pediátrico
Maria Alice Fernandes for the donation and biochemical identification (Banco de
Leveduras), especially to pharmacists Ana Cristina Santos Fernandes and
Maria Guimaraes Narriman Goveia; to Professors Telma Maria Araújo Moura
Lemos and Tereza Neuma de Souza Brito for logistical support in the
elaboration of this study; and to everyone who work in the Laboratory of Clinical
Microbiology at the Universidade Federal do Rio Grande do Norte and in the
Laboratory of Mycology at the Universidade Federal da Paraíba.
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6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES
O anteprojeto que deu origem a essa tese foi intitulado “Estudo da
atividade antifúngica de óleos essenciais e fitoconstituintes sobre o gênero
Candida”, aprovado no Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde da
UFRN, sob o protocolo 154/06.
Os produtos naturais representam uma importante e interessante área
de desenvolvimento e a sua completa apreciação permite comprovar a
legitimidade dos seus inúmeros benefícios. Tendo em vista a elevada
relevância clínica atribuída às candidiases e considerando a importância de se
verificar a eficácia de meios terapêuticos alternativos através das plantas
medicinais encontradas na nossa região, partindo do conhecimento popular.
Assim, resolvemos estudar as atividades antifúngicas de óleos essenciais e
fitoconstituintes de algumas espécies vegetais contra leveduras do gênero
Candida provenientes de vulvovagites e material anal, fornecidos pelo Hospital
Giselda Trigueiro (HGT), Natal-RN.
Esse estudo mostrou nos ensaios preliminares que dentre os onze
óleos essenciais analisados os de Citrus limonum, Cinnamomum zeylanicum,
Eucalyptus globulus, Eugenia coryophyllata, Mentha arvensis, Mentha piperita,
Mentha spicata, Origanum vulgare e Pimpinella anisum apresentaram forte
atividade anticandida. Então, foi decidido realizar investigações mais amplas de
tais produtos, iniciando pelas Menthas que apresentaram melhor padrão de
sensibilidade.
O óleo essencial de M. spicata apresentou forte atividade antifúngica
contra cepas de C. guilliermondii isoladas de vagina e ânus. O mecanismo de
ação ocorre na parede celular, promovendo alterações micromorfológicas,
108
inibindo o desenvolvimento do pseudomicelio, importante fator de
patogenicidade para estas leveduras, resultado semelhante ao que se
observou com a nistatina, antifúngico padrão usado como controle positivo.
Assim, este óleo essencial de M. spicata representa uma nova
possibilidade entre os produtos com atividade antifúngica contra C.
guilliermondii, entretanto, são necessários testes in vivo para uma possível
avaliação clínica.
O presente estudo ressalta a importância da equipe multiprofissional,
formada por farmacêuticos, médicos, auxiliares de laboratório e de serviços
gerais do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, do Laboratório
de Micologia do Hospital Giselda Trigueiro (HGT - UFRN), do Laboratório de
Microbiologia do Hospital Pediátrico Maria Alice Fernandes, no Laboratório de
Micologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas (DCF-UFPB),
estudantes e professores do Programa de Pós-Graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos da Universidade Federal da Paraíba,
farmacêuticos e químicos do Laboratório Unificado de Desenvolvimento e
Ensaios de Medicamentos (LUDEM), do Centro de Ciências da Saúde (CCS),
da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), em consonância com o objetivo
principal do programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, que consiste
na relação recíproca entre as múltiplas intervenções técnicas e na interação
dos agentes de diferentes áreas profissionais.
Cumprimos com o cronograma, de acordo as metas estabelecidas para
a coleta de dados, disciplinas e a escrita de quatro artigos e um trabalho
apresentado no Congresso Brasileiro de Micologia.
As dificuldades com as quais nos deparamos foram relacionadas à
parte metodológica, pois muitos dos ensaios realizados não estão disponíveis
em nosso departamento, de modo que tivemos que recorrer à UFPB. Além
disso, o projeto não teve financiamento, dessa forma, foram utilizados recursos
próprios.
A doutoranda é professora adjunta III do Departamento de Análises
Clínicas e Toxicológicas da UFRN e pretende continuar na pesquisa de
produtos naturais, implantando as metodologias utilizadas nesse estudo e
formando parceria com o Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos da Universidade Federal da Paraíba.
109
7 REFERÊNCIAS
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ANEXO 1: Laudo técnico do óleo essencial de Mentha spicata
116
ANEXO 2: Parecer da aprovação do projeto