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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal
Kátia Regina Freire Lopes
Uso da Dimetilformamida como crioprotetor alternativo para o sêmen canino
Mossoró – Rio Grande do Norte Dezembro de 2008
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal
Kátia Regina Freire Lopes
Uso da Dimetilformamida como crioprotetor alternativo para o sêmen canino
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal Rural do Semi-Árido, como requisito parcial para a obtenção de grau de Mestre em Ciência Animal. Área de concentração: Reprodução Animal. Orientador: Alexandre Rodrigues Silva
Mossoró – Rio Grande do Norte Dezembro de 2008
Ficha catalográfica preparada pelo setor de classificação e catalogação da Biblioteca “Orlando Teixeira” da UFERSA
L864m Lopes, Kátia Regina Freire. Uso da dimetilformamida como crioprotetor alternativo
para o sêmen canino. / Kátia Regina Freire Lopes. -- Mossoró: 2008.
76f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal: Área de concentração: Reprodução Animal) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido. Pró-Reitoria de Pós-Graduação. Orientador: Prof.º Dr.Sc. Alexandre Rodrigues Silva 1.Cão. 2.Criopreservação. 3.Dimetilformamida. Título.
CDD:636.7 Bibliotecária: Marilene Santos de Araújo
CRB-5/1033
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal
Uso da Dimetilformamida como crioprotetor alternativo para o sêmen canino
Kátia Regina Freire Lopes
Dissertação aprovada em ___05___ / __12__ / __2008__
Banca Examinadora
__________________________________________
Prof Dr.Alexandre Rodrigues Silva
Orientador
Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva Examinadora
Dra. Ticiana Franco Pereira da Silva Examinadora
És aquele, que vives em matas, ou como adorno de minha casa,
o mesmo que carrega o peso do meu corpo ou quinquilharias
para que eu possa vender em troca do meu pão de cada dia.
És aquele que serve de atração turística em feiras fazendo-me obter glórias.
Açoito, imponho-te pesos maiores do que podes carregar
e te suplicio em rodeios para ter prazer,
rio de tua humilhação, por ficar exposto através de grades,
fazendo-me crer que sou poderoso e que meu chicote domina tua ferocidade.
Vangloriando-me, atirando em suas jaulas gargalhadas e gritos,
não só para demonstrar minha falsa liberdade,
mas também provocando-te morte pelo tédio e lembrança de onde nasceste.
Em retribuição me roubas um sorriso dos lábios ao vê-lo fazer piruetas
ou quando se esfrega em minhas pernas saudando minha existência.
Espantando ratos, insetos, maus-olhados
somente para que eu tenha melhores condições de saúde.
Oferecendo-me proteção e carinho.
Caço, mato-o dizendo ter medo de sua rusticidade.
Abato-o com degola, com marretadas, empurro-o para a morte com choques,
perdendo a chance de viver sadio, pois o veneno de sua carne pútrida
em meu corpo, leva ao desequilíbrio de minhas funções.
Sirvo-me de ti em travessas, panelas e espetos,
que ainda pouco escolhi no balcão do mercado
ou no cardápio do restaurante, para simplesmente, saciar minha fome.
Não me apiedo de teu sofrimento, mesmo sabendo ser inútil,
amarro-o, trancafio-o em gaiolas ou mesmo ao mantê-lo contido em aparelhos de tortura,
submeto-o aos meus experimentos para alcançar fama e poder.
Vítimas solicitadas pela ciência para benefícios da humanidade.
A ti, que nos ensina muito mais através do olhar humilde,
transmitindo a vontade de viver.
Meu reconhecimento, respeito e eterna gratidão.
Kátia Regina
A Kleber Jacinto, meu ponto de apoio
Dê-me uma alavanca e um ponto de apoio,
e eu serei capaz de mover o mundo!
(Arquimedes)
Ao Meu PAI
Antonio Freire Lopes
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Aos Principais Colaboradores e seus Tutores: Nagan e Kleber Jacinto, Sadan e Dona
Conceição, Shiro e Rafael Tamashiro, Zeus e Adaucides Câmara, Tayson e Eduardo
Cavalcante.
Aos Coadjuvantes: Sadan, Zeus e Fabio Igo; Sadan, Brutos e Silvestre Stalone; Aquiles e
Luiz Eduardo, Bacco e Ederson Freitas, Skol e Felipe Farias, Logan e Tammy Rodrigues,
Thor e Paulo Fernandes, Bob, Bile e Madom Ferazi, Kiko e Nicholas Bezerra, Rone e
Sabrina Mendonça, que não participaram diretamente dos resultados deste experimento, mas
se voluntariaram para o mesmo.
Ao Dr Alexandre Rodrigues Silva, pela coragem, credibilidade, confiança, compreensão e
principalmente pelo privilegio de me tornar sua primeira orientada em pós-graduação. Ao
orientador fica o reconhecimento e exemplo de amor à profissão e determinação sempre em
busca da excelência. Ao Amigo, impossível simplesmente agradecer. Apesar de tudo o que
aprendi, meu maior legado desta experiência, será sempre, o modelo de caráter e a honra da
amizade.
Aos membros da banca, Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva e Dra. Ticiana Franco
Pereira da Silva, que tão atenciosamente doaram um pouco de seu tempo e seu conhecimento
para o engrandecimento deste trabalho e, conseqüentemente, para o meu engrandecimento
profissional.
A Leonardo Lelis e Gabriela Liberalino que em muitos momentos deixaram de ser meramente
colegas e foram mestres.
A Ana Liza Paz de Souza e Antonio Cavalcante Mota Filho pela relevante colaboração.
A Rafael Godói, Rodrigo Lira, Felipe Farias pela pequena, mas significante contribuição.
A Saul Cortez, Adriene Rosceli, Marcio Rodrigues, Jonatha Werrisimo, Gyslaine Peixoto,
Paulo Fernandes, pelo auxílio na busca por possíveis colaboradores, e a todos os
“verdinhos” pelo apoio e ajuda mesmo que indiretamente, contribuindo para elaboração
deste trabalho.
Aos Mestres: Benito Soto Blanco, José Domingues Fontenele, Sidnei Miyoshi Sakamoto,
Alex Sandro Maia, Jean Berg Alves da Silva, Mestres co-responsáveis pela formação de
mais esta etapa da minha profissionalização.
Aos colegas de Turma: Allyssandra Maria Lima Rodrigues, Ana Liza Paz de Souza, Carolina
de Gouveia Mendes, Daniel Santiago, Erika de Souza Paiva, Idalécio Pacífico da Silva,
Mario Cardoso, Michele Daiana, Nicholas Morais Bezerra, Paulo Henrique Cavalcante,
Roberta Cristina da Rocha e Silva, Tâmara Lúcia dos Santos Silva, Wesley Adson Costa
Coelho, que pela heterogeneidade de formação, deram origem a divergências construtivas
durante a nossa convivência, consolidando nossa formação profissional.
Ao Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino e as professoras Dra. Cristiane
Salgueiro e Dra Carminda Sandra Brito Salmito Wanderley
Aos Laboratórios de Biofísica, Fisiologia e Farmacologia Veterinária, Histologia
Veterinária, Clinica Veterinária e Imunologia Veterinária da Universidade Federal Rural
do Semi-Árido pela disponibilização de material e estrutura física para a elaboração das
analises.
A Regina Valeria da C Dias, pelo apoio, muitas vezes servindo de muro das lamentações,
conseguido estar sempre presente dividido com Kleber a função de “Divã”, mesmo virtual.
À todos aqueles que fizeram parte desta história de quinze anos, principalmente aos meus
“irmãos” amigos incondicionais, Flavia Moura, Oscar Bezerra e Ylanna Burgos.
À todos os meus “amigos de infância e que estarão comigo por toda vida” pois me
ensinaram a amar cada animal e me deram as primeiras lições veterinárias: Totó, Lessie,
Jabuti, Jack, Jobel, Jaqueline, Pelé, Tauros, Bob, Niki, Nikita, as “Nigra”, os “Popó”,
Hulk, Bob Coco, Yanka, Kate, Tof, Nix, Rock, Adna, Mist,... Aos que convivem comigo hoje:
Mel, Nagan, Judy, Brigith, Yang, Lilo e Stitch.
À minha melhor amiga e companheira de todas as conclusões, que agora não se encontra
deitada nos meus pés, balançando o rabo e esperando calmamente por atenção, mas sem
dúvida nenhuma vai estar em todos os animais que eu encontrar e conviver... Enya Maria.
...e à todas as pessoas que foram capazes de me desejar ao menos um “Bom dia” com
sinceridade.
RESUMO
A origem ancestral dos cães ainda é nebulosa, mas sua importância na vida do homem, seja
pelo contexto afetivo seja pela sua capacidade de trabalho, é inegável. Como ocorre com
outros animais de produção, cada vez é mais premente a necessidade de dominar as técnicas
de reprodução dos canídeos para fins de melhoramento e intercâmbio genético, bem como na
conservação de espécies em rumos de extinção. Existem técnicas já consolidadas de
congelação do sêmen canino, a maioria delas vinculadas ao uso do glicerol, porém o estudo
com outras substâncias agindo como crioprotetores amplia o campo de pesquisa e pode trazer
métodos mais eficientes, de menor custo e mais práticos de executar que os tradicionais. O
objetivo deste estudo foi comparar o efeito do glicerol e da dimetilformamida na
criopreservação de sêmen do cão. O sêmen foi diluído em duas etapas com diluidor à base de
Tris-hidroximetil-aminometano e gema de ovo contendo uma concentração final de 6%
glicerol ou 6% dimetilformamida (DMF), e congelados em palhetas 0,25 mL, expostos à ação
de vapores de nitrogênio líquido. Imediatamente após a descongelação, a motilidade
espermática foi avaliada, tanto sob um microscópio óptico, como através de análise de sêmen
auxiliada por computador (CASA). A integridade funcional da membrana espermática foi
avaliada com o uso de uma solução hiposmótica. Morfologia e porcentagem de
espermatozóides vivos também foram avaliados por microscopia de luz. Depois de
descongelado, uma maior concentração de células vivas foi detectada quando da utilização do
glicerol (P <0,05), mas parâmetros funcionais, tais como, motilidade progressiva e total, bem
como a integridade funcional da membrana não diferiram entre o glicerol e a DMF (P> 0,05),
sugerindo que ambos podem atuar de forma semelhante na criopreservação de sêmen canino.
Foram ainda encontradas interações entre o efeito individual dos cães e os crioprotetores no
decorrer dos procedimentos. Conclui-se que a DMF pode ser utilizada como um crioprotetor
alternativo ao sêmen canino, e sugere-se que seu efeito possa ser especialmente apropriado
para aqueles indivíduos que apresentem alta sensibilidade ao glicerol. É Sugere-se a
realização de novas pesquisas a fim de aprimorar o uso da DMF para o sêmen canino.
ABSTRACT
The ancestral past of the dogs is still nebulous, but its importance in the man’s life, in
emotional context and their ability to work is undeniable. As with other working animals, it is
becoming more urgent the need to domain the reproductive techniques of dogs, for select and
exchange genetic material, as well as the conservation of species from extinction. There are
consolidated techniques of canine semen’s cryopresenvation, most of them linked to the use
of glycerol, but the study with other substances acting as cryoprotectants expands the research
field and can provide more efficient methods with lower cost and more practical to
implement. The purpose of this study was to compare the effect of glycerol and
dimethylformamide (DMF) in the cryopreservation of dog sperm. The semen was diluted in
two stages with Tris-hydroxymethyl-aminomethane plus egg yolk containing a final
concentration of 6% glycerol or 6% DMF, and frozen in 0.25 mL straws, exposed to nitrogen
vapors and maintained in liquid N2. Immediately after thawing, sperm motility was evaluated
both under a light microscope and with a computer-assisted sperm analyzer (CASA). The
functional integrity of sperm membrane was assessed with the use of a hypo-osmotic solution.
Morphology and percentage of live sperm were also evaluated by light microscopy. After
thawing, a higher concentration of living cells was detected in the use of glycerol (P <0.05),
but functional parameters such as total and progressive motility as well as the functional
integrity of the membrane does not differ between the glycerol and DMF (P> 0.05) suggesting
that both can act with similar performance in cryopreservation of canine semen. The effect of
the individual animal and interactions between animals and cryoprotectants were verified for
various semen characteristics (P < 0.05) evidencing a marked difference among the semen of
individual dogs in their tolerance to cryopreservation. In conclusion, DMF could be used as
an alternative cryoprotectant for canine semen. It is also suggested that DMF could have a
beneficial effect especially for those individual animals that present high sensitivity to
glycerol. Further studies regarding DMF action on canine semen should be conducted.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 17
JUSTIFICATIVA ................................................................................................................. 19
HIPÓTESE .......................................................................................................................... 20
OBJETIVOS ........................................................................................................................ 21
Objetivo Geral: ......................................................................................................... 21 Objetivos Específicos: .............................................................................................. 21
1. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 22
Artigo 01: Considerações sobre a importância do cão doméstico dentro da
sociedade humana ......................................................................................................... 22
1.1.1 Apresentação ....................................................................................................... 23 1.1.2 Um pouco de História .......................................................................................... 23 1.1.3 Biologia ............................................................................................................... 29 1.1.4 Trabalhando com os humanos .............................................................................. 33 1.1.4 Considerações Finais ........................................................................................... 35 Referências ................................................................................................................... 36
1.2. Criopreservação do sêmen canino .............................................................................. 42
1.2.1 Diluentes ............................................................................................................. 43 1.2.2 Crioprotetores ...................................................................................................... 45
1.2.2.1. Glicerol ........................................................................................................ 45 1.2.2.2. Dimetilformamida ........................................................................................ 46
2. COMPARAÇÃO ENTRE O GLICEROL E A DIMETILFORMAMIDA PARA A
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES .................................................................. 49
Artigo 02: Comparison between glycerol and dimethylformamide for dog semen
cryopreservation ............................................................................................................... 49
2.1 Introdução .................................................................................................................. 51
2.2. Materiais e Métodos .................................................................................................. 52
2.2.1. Animais .............................................................................................................. 52 2.2.2 Colheita e avaliação inicial do sêmen ................................................................... 52 2.2.3 Processamento do Sêmen ..................................................................................... 52 2.2.4. Análise computadorizada do sêmen (CASA) ....................................................... 53 2.2.5 Análise estatística ................................................................................................ 54
2.3. Resultados ................................................................................................................. 54
2.4 Discussão ................................................................................................................... 56
Referências ....................................................................................................................... 59
CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 62
PERSPECTIVAS ................................................................................................................. 63
ANEXOS ............................................................................................................................. 64
Anexo 01: Comparison between glycerol and dimethylformamide for dog semen
cryopreservation ............................................................................................................... 65
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ºC Graus Celsius. Unidade de temperatura do sistema métrico internacional
µL microlitro. submúltiplo do litro (1x10-6L), unidade de volume do sistema
métrico internacional
ALH amplitude of lateral head. amplitude lateral de cabeça
BCF beat cross frequency. freqüência de batimento de cauda
CASA computer-assisted sperm analysis. Análise de Sêmen assistida por computador
cm centímetros. Submúltiplo do metro (1x10-2m). Unidade de comprimento do
sistema métrico internacional
DMF dimethylformamide. dimetilformamida
DNA Deoxyribonucleic acid. Ácido Desoxirribonucléico
EUA Estados Unidos da América
EYT Egg Yolk Tris. Tris-gema de ovo
FCI Fédération Cynologique Internationale. Federação Internacional de Cinologia
Hz Hertz. Unidade de freqüência do sistema métrico internacional
ITIS Integrated Taxonomic Information System. Sistema de Informação Integrada
de Taxonomia
L litro. Unidade de volume do sistema métrico internacional
m metros. Unidade de comprimento do sistema métrico internacional
min minuto. Múltiplo do segundo, unidade de tempo do sistema métrico
internacional.
mL mililitro. Sub-multiplo do litro (1x10-3L), unidade de volume do sistema
métrico internacional
mOsm/L miliosmol por litro. Medida do peso atômico dividido pelo número de
partículas que exercem determinada pressão osmótica
nm nanômetro. Submúltiplo do metro (1x10-9m). Unidade de comprimento do
sistema métrico internacional
pH potencial Hidrogeniônico. Escala utilizada para medir acidez ou alcalinidade
SD Standard derivation. Desvio padrão
STR straightness. índice de progressão
TGG Tris acrescido de gema de ovo e glicerol
TRIS Tris-hidroximetil-aminometano
VAP velocity average pathway. velocidade média na trajetória
VCL curvilinear velocity. velocidade curvilínea
VSL velocity straight line. velocidade progressiva
LISTA DE FIGURAS
Artigo 01 .............................................................................................................................. 22
Figura 01 – Árvore evolutiva da famíla Canidae. Fonte: WANG & TEDFORD, 2008...... 24
Figura 02 – Distribuição da sub-família Caninae. Fonte: Vilà et al. 1997 .......................... 25
Figura 03 – Tumba H. 104 em Mallaha, Nordeste de Israel, mostrando esqueleto de um
homem com um filhote de cão entre suas mãos. Fonte: DAVIS & VALLA, 1978 ............ 26
Figura 04 – Imagem geral do esqueleto do cão. Fonte: MERRIAM-WEBSTER, 2008. ... 30
Figura 05 – Comparação entre o espectro luminoso visível por cães e humanos. Fonte:
Davis, 1998 ...................................................................................................................... 31
Artigo 02 .............................................................................................................................. 49
Figura 01: Motilidade Progressiva dos espermatozóides frescos (Fr), diluídos (Ext),
resfriado (Cool) e descongelado (Thaw) acrescido de glicerol ou dimetilformamida (DMF).
............................................................................................ Erro! Indicador não definido.
LISTA DE TABELAS
2. COMPARAÇÃO ENTRE O GLICEROL E A DIMETILFORMAMIDA PARA A
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES .................................................................. 49
Artigo 02: Comparison between glycerol and dimethylformamide for dog semen
cryopreservation ............................................................................................................... 49
Tabela 1: Motilidade espermática progressiva (%) no semen canino fresco, diluído,
adicionado de glycerol ou dimetilformamida (DMF) e congelado/descongelado (n=10
ejaculados de 05 cães). ..................................................................................................... 55
Tabela 2: Percentagem (%) da integridade funcional da membrana, espermatozóides vivos,
morfologia espermática normal e alterado em sêmen canino (n=10 ejaculados de 05 cães)
fresco e congelado/descongelado, acrescentado de glicerol ou dimetilformamida (DMF). 55
Tabela 3: Parâmetros de motilidade espermática mensurados por análise espermática
assistida por computador no sêmen canino congelado/descongelado (n=10 ejaculados de 05
cães) usando glicerol ou dimetilformamida (DMF) como crioprotetores. .......................... 56
17
INTRODUÇÃO
A cada novo dia, o homem afasta-se do meio natural. Apesar da crescente
preocupação com o meio ambiente, a evolução tecnológica, o crescimento das cidades e a
dependência da eletrônica têm cobrado um alto preço: a diminuição dos espaços naturais e sua
biodiversidade.
O homem tem tentado minimizar este lado negativo do progresso tomando para si
a responsabilidade de corrigir erros históricos contra a natureza. Assim, crescem o número de
projetos de conservação de espécies silvestres como peixe-boi marinho1, tartaruga marinha2,
baleia-franca3, dentre outros, e também a abertura de espaço na mídia (vide canais de TV4
como Animal Planet, Discovery Channel, National Geographic Channel) para uma
apresentação mais ampla dos animais como companheiros, como auxiliares e como elementos
cruciais nos complexos ecossistemas espalhados pela terra.
Essa popularização ocorre não apenas por uma conscientização na raça humana,
mas porque a vida com animais traz benefícios que remontam à pré-história. Há provas
fósseis do convício com o cão desde cerca de 15000 anos e muitas sociedades até hoje
possuem uma base cultural e mesmo religiosa fortemente pautada no convívio com os cães.
Considerada por especialistas como atividade até mesmo terapêutica, o convívio
com animais fortalece o senso de responsabilidade e prioriza o crescimento de sentimentos
altruísticos (VACCARI & ALMEIDA, 2007). Neste contexto, criar cães tornou-se prática
corriqueira em qualquer aglomerado humano, e nos grandes centros movimenta muitos
recursos financeiros, corresponde a um grande volume de negócios, considerados os mercados
de medicamentos, acessórios, rações e profissionais diretamente ligados ao trato com os
animais, em especial os médicos veterinários.
Assim, para melhorar este convívio com os animais ou ampliar os seus benefícios,
muitos pesquisadores estão utilizando a seleção para aperfeiçoar as raças caninas, exigindo,
por conseguinte, a aplicação das biotécnicas reprodutivas para um aproveitamento do
1 Projeto peixe-boi marinho. http://www.projetopeixe-boi.com.br/ 2 Projeto TAMAR. http://www.projetotamar.org.br/ 3 Projeto Baleia Franca. http://www.baleiafranca.org.br/ 4 Canais distribuídos no Brasil através do modelo de assinatura, que cedem freqüentemente conteúdo para a Televisão aberta.
18
potencial genético dos reprodutores de elevado valor (FORSBERG & FORSBERG, 1993;
CUNHA, 2002).
Estudos estão sendo desenvolvidos para determinação das melhores condições
para a criopreservação do espermatozóide de cães (STROM et al., 1998; PEÑA, 2000;
VERSTEGEN et al. 2002; RIJSSELAERE et al. 2005; SILVA et al., 2006; CARDOSO et al.,
2007). Porém, muitos fatores são envolvidos no processo de criopreservação do sêmen. Até os
dias atuais, nenhuma metodologia parece ser a ideal para todos os cães e para todos os
ejaculados, pois variações intrínsecas às propriedades, como sensibilidade osmótica entre
espermatozóides de diferentes cães e ejaculados fazem com que a resposta à criopreservação
não seja totalmente previsível (EILTS, 2005; MINTER & DeLIBERTO, 2005).
Diversas metodologias têm sido descritas para a criopreservação do sêmen de cães
e variam de acordo com o diluente, protetores de resfriamento e congelamento empregados,
preconizando o uso de diferentes velocidades de criopreservação. Em todas elas, busca-se
minimizar o dano causado ao espermatozóide pelo processamento, visando recuperar um
máximo possível de espermatozóides viáveis (STROM et al., 1997). O método até então mais
utilizado para a criopreservação do sêmen canino é o descrito por Andersen (1975), que
consiste na utilização de um diluidor à base de Tris acrescido de gema de ovo e glicerol
(TGG).
A colaboração que se deseja com este trabalho é a de investigar o efeito da
dimetilformamida como uma alternativa ao glicerol na crioproteção do sêmen canino diluído
em Tris, podendo esta investigação prover subsídios para novas técnicas de reprodução.
A dimetilformamida foi testada e é usada com sucesso em diversas espécies de
animais domésticos e selvagens mas as técnicas que envolvem seu uso foram pouco estudadas
se comparadas a outros crioprotetores, como ao glicerol. Apesar de ser substância
reconhecidamente dotada das características necessárias á criopreservação seu uso na prática é
muito reduzido, em especial pela falta de estudos e métodos que comprovem o sucesso de sua
utilização.
19
JUSTIFICATIVA
Constantemente, observa-se um crescente interesse acerca dos animais de estimação,
principalmente os cães. Estes animais, sem dúvida, têm uma intrínseca relação com o homem,
que os utiliza como simples companhia ou no auxílio em transportes, manejo de rebanho,
tratamento médico, participação em atividades policias, tanto de identificação de contrabando
e drogas, como resgate de vidas. Desse modo, a cada dia, vem-se procurando o melhoramento
genético, mas principalmente a manutenção e dissipação de características destes animais.
Para isso, a utilização de biotécnicas reprodutivas é de suma importância, diminuindo
distâncias, resguardando a sanidade dos animais. Sendo assim, técnicas e alternativas para
aprimorar, e facilitar estes processos a cada dia vem sendo estudadas, e métodos alternativos
são cada vez mais procurados, como forma de ter mais possibilidades e nenhum animal ficar
excluído destes processos.
A busca por aprimorar e apresentar alternativas às técnicas de reprodução assistida é
caminho não somente para atender ao desejo de realizar a seleção e disseminação de raças de
canídeos, mas principalmente podem representar, em curto prazo, métodos concretos para
retirar animais da categoria de espécies em extinção. Possuir técnicas que ampliem a
conservação e o transporte de sêmen canino permitem que raças sejam melhor difundidas,
minimiza-se a consangüinidade, pelo intercâmbio de sêmen, aumenta as fronteiras comerciais
de linhagens com características apropriadas para o trabalho, dentre outras possibilidades.
Possuir alternativas às substâncias crioprotetoras tidas como preferenciais, não só abre
novas fronteiras para pesquisa, como reforçam a não-dependência das oscilações do mercado,
alterações de cotações de moeda ou distribuição/venda sem regularidade.
Algumas substâncias alternativas vêm sendo testadas como crioprotetores. Dentre
estas, a dimetilformamida vem sendo utilizada como tal com sucesso em algumas espécies
como eqüinos, faisões, dentre outros. Principalmente se destacando como substituta ao
glicerol, em animais que possuem sensibilidade ao mesmo.
Em cães, algumas pesquisas já obtiveram resultados relevantes, entretanto a maioria
delas não realizou análises com tecnologias mais recentes como a análise computadorizada do
sêmen (CASA), que certamente validará os resultados com uma maior eficácia e precisão.
20
HIPÓTESE
• A dimetilformamida pode ser utilizada como uma alternativa ao glicerol para a
criopreservação do sêmen canino se observadas as características do sêmen sob a
análise qualitativa realizada através de análise computadorizada (CASA).
21
OBJETIVOS
Objetivo Geral:
• Estudar o uso da dimetilformamida como um crioprotetor alternativo para a
criopreservação do sêmen de cães, utilizando-se o tris-gema de ovo como diluente.
Objetivos Específicos:
• Verificar o efeito da dimetilformamida na conservação das características seminais de
cães após os processos de criopreservação e descongelação;
• Realizar a avaliação computadorizada dos parâmetros de motilidade espermática no
sêmen congelado e descongelado em diferentes crioprotetores.
22
1. REVISÃO DE LITERATURA
Artigo 01:
Considerações sobre a importância do cão doméstico dentro da
sociedade humana
Kátia Regina F. Lopes & Alexandre R. Silva
Laboratório de Manipulação e Conservação de Germoplasma Animal, Universidade
Federal Rural do Semi-Árido / BR 110 - Km 47 Bairro Pres. Costa e Silva; 59.625-900 -
Mossoró – Rio Grande do Norte
Resumo
A origem ancestral do cão doméstico é questionável. A teoria tradicional
defende a intervenção direta do homem há 15.000 anos sobre lobos selvagens que
através de doma e treino, criou uma nova linhagem, esta domesticável e que tornou-
se o cão que conhecemos. Porém, pesquisas recentes apontam para uma nova teoria:
não uma ação do homem, mas um processo de seleção natural aproximou o cão
ancestral das habitações humanas e seus descendentes vivem entre os homens até
hoje. Qualquer que seja a origem, os cães possuem um papel importante na vida do
homem moderno, seja por seu apelo afetivo seja pelo uso de seus sentidos apurados
em atividades e trabalhos. Desse modo, o presente trabalho tece considerações acerca das
interações entre o cão e o homem e sua importância dentro da sociedade humana.
Palavras-Chave: cão, origem, sociedade humana.
Abstract
The origin of the domestic dog is questionable. The traditional theory says that the
direct intervention of humans (15,000 years ago) on the wild wolves created a new domestic
blood line, that became the dogs we know. However, surveys point to a new theory: not a
man´s action, but a process of natural selection has brought the ancestor dog of human
dwellings and their descendants live among men today. Whatever the source, the dogs have
an important role in the life of modern man, either on its emotional appeal or when the man
use your senses in activities and work. Therefore, this review presents considerations on the
interactions between dogs and men and their importance into the human society.
Keywords: dog, origin, human society.
23
1.1.1 Apresentação
Apesar da estreita relação entre humanos e cães, ainda hoje não é clara a origem dos
animais que conhecemos como “os melhores amigos do homem”. Porém alguns fatos
históricos arqueológicos são relevantes. Não há registro fóssil de cães (Canis lupus familiaris)
além de 15 ou 20 mil anos atrás, fato inesperado para um animal tão comum nos dias atuais, o
que aponta para que a espécie que hoje conhecemos não existia antes desta data. Quando
começam a surgir registros fósseis, estes estão quase sempre associados a nichos de
permanência humana. É possível que a conjunção destes fatos se concretize numa das mais
significativas intervenções do homem sobre a natureza e a consolidação, por seleção natural
ou artificial, de uma das espécies mais bem sucedidas viventes hoje: o cão.
Os cães são parte importante das atividades humanas e por vezes constituem-se
indivíduos das famílias humanas e a evolução cultural e psicológica da humanidade mostra-se
intimamente ligada à presença destes animais. Desse modo, o presente trabalho tece
considerações acerca das interações entre o cão e o homem e sua importância dentro da
sociedade humana.
1.1.2 Um pouco de História
A paleontologia se ocupa, dentre outras atividades, da descrição da vida das espécies
no passado e suas reflexões nas espécies existentes hoje. Este estudo é realizado
principalmente através da existência de fósseis (do latim, fossilis: restos materiais de antigos
organismos ou as manifestações da sua atividade, que ficaram conservados, com maior ou
menor qualidade nas rochas ou em outros fósseis - MENDES, 1988). Sob esta perspectiva é
possível constituir as origens ancestrais dos seres vivos que dominam o mundo atualmente e
determinar a época e o contexto em que surgiram. No caso dos cães, é possível chegar-se aos
seus ancestrais e vincular grau de parentesco com outras espécies de canídeos, porém o “elo
perdido” dos canídeos ainda é alvo de teorias diversas (FUCHSLUGER & WHITE, 2007).
A família Canidae [Reino: Animalia; Filo: Chordata; Classe: Mammalia; Ordem:
Carnivora; Sub-ordem: Caniformia] tem origens no Eoceno (cerca de 40 milhões de anos
atrás), a partir da evolução dos Miacídeos, pequenos carnívoros que seriam ancestrais de
canídeos, felídeos e outros carnívoros, remanescentes do Paleoceno (65 milhões de anos). A
família desenvolveu-se em três grandes ramos evolutivos: a sub-família Hesperocyoninae
24
(hoje extinta, endêmica em toda a América do Norte entre 40 e 15 milhões de anos), a sub-
família Borophaginae (extinta, endêmica em todo o hemisfério norte entre 35 e 2,5 milhões de
anos) e a sub-família Caninae (surgida a 25 milhões de anos e vivente até hoje) a qual engloba
todos os canídeos vivos (WILSON & REEDER, 2005).
A primeira era constituída de pequenos onívoros, espécies adequadas à época posterior
à extinção dos grandes répteis. A segunda família, provavelmente descendeu da sub-família
Hesperocyoninae, e era constituída de carnívoros de maior porte, podendo chegar aos 250kg.
Com mandíbulas curtas e fortes, as suas espécies chegam a ser chamadas de “bone-crushing
dogs” (ou “cães esmaga-ossos”), pois alimentavam-se de toda sua presa, inclusive os ossos.
Por fim, o terceiro ramo evolutivo e que conhecemos até hoje em suas diversas formas, a sub-
família Canineae, que possui membros de porte, modo de vida e nichos ecológicos tão
distintos quanto os lobos da tundra (Canis lupus albus), o cão selvagem africano (Lycaon
pictus), o lobo guará do cerrado brasileiro (Chrysocyon brachyurus) ou o próprio cão
doméstico (Canis lupus familiaris) (WANG & TEDFORD, 2008).
Figura 01 – Árvore evolutiva da famíla Canidae. Fonte: WANG & TEDFORD, 2008
Os registros fósseis demonstram que a família Canidae desenvolveu-se na América do
Norte de onde se espalhou para a América do Sul, Ásia e Europa. Os Hesperocyoninae
predominaram na América do Norte, os Borophaginae difundiram-se no hemisfério norte e os
Caninae espalharam-se em todos os continentes (VILÀ et al., 1997).
25
Figura 02 – Distribuição da sub-família Caninae. Fonte: Vilà et al. 1997
Graças às semelhanças morfológicas e fisiológicas, cães domésticos e lobos sempre
foram considerados parentes, porém desde que foi possível mapear o DNA destas espécies
percebeu-se que a semelhança genética é inconfundível: apresenta cerca de 0,2% de
diferenciação (LEONARD et al., 2002), sendo motivo para a reclassificação taxonômica em
1997, proposta pelo Instituto Smithsonian5 e pela American Society of Mammalogists6, de
Canis familiaris para Canis lupus familiaris, ou seja, o cão doméstico é classificado como
sub-espécie da espécie dos lobos cinzentos (WILSON & REEDER, 2005).
Esta proximidade biológica e histórica gerou uma teoria fortemente aceita sobre a
origem dos cães domésticos: que eles teriam descendido diretamente dos lobos cinzentos
através da ação do homem que selecionara, treinara e domesticara exemplares de lobos e, que
com seqüências de acasalamentos, geraram os cães. Existem evidências concretas destes fatos
pois há registros fósseis da convivência de homens e cães a partir de 12 a 15.000 anos como
as encontradas no nordeste de Israel em 1978 (Figura 03 - DAVIS & VALLA, 1978). Muitos
registros fósseis apontam esta época como aquela em que homens e cães passaram de fato a
conviver em conjunto, não mais como competidores por um nicho, mas como parceiros.
5 Website: http://www.si.edu/ 6 Website: http://www.mammalsociety.org/
26
Figura 03 – Tumba H. 104 em Mallaha, Nordeste de Israel, mostrando esqueleto de um homem com
um filhote de cão entre suas mãos. Fonte: DAVIS & VALLA, 1978
Por esta teoria, o homem havia, pouco a pouco, por compartilhar espaços de caça e de
vivência, aproximando-se dos lobos selvagens. Com o tempo, as duas espécies teriam passado
a cooperar entre si: os lobos alimentando-se dos restos dos alimentos dos homens e os homens
observando o comportamento dos lobos para melhor encontrar recursos, como água e caça.
Essa proximidade teria sido possível pelo comportamento e desejo de vivência em grupo
compartilhada pelas duas espécies. O cão, como espécie consolidada, apenas teria surgido em
virtude da ação direta do homem, que ao treinar e domesticar os lobos, teria realizado uma
seleção artificial e criou a nova espécie (neste caso sub-espécie de lobo) (SERPEL, 1995).
Apesar de aceita e perpetuada, esta teoria não considera que, num tempo histórico e
evolutivo tão curto, os cães teriam perdido características que são importantes para uma
espécie carnívora e caçadora, principalmente se comparada com outros animais domésticos
também carnívoros, como os gatos que possuem garras retráteis como seus ancestrais
selvagens (COPPINGER & COPPINGER, 2002). Os gatos domésticos até hoje exercitam
27
práticas de caça e alimentam-se de insetos e aves, mesmo quando há disponibilidade de
alimento (AMERICAN BIRD CONSERVANCY, 1997).
A referida teoria não considera também o fato de que os lobos são seres que vivem em
sociedade (alcatéias), mas que possuem personalidades individuais muito fortes, e com
funções específicas dentro do grupo (HARRINGTON & PAQUET, 1982). Considerando-se
este fato, seria necessário que não um ou outro lobo fosse domesticado, mas toda uma
alcatéia, para que de um grupo, alguns indivíduos de fato fossem “acostumados” com a
convivência humana (COPPINGER & COPPINGER, 2002). E esta tarefa seria de grande
dificuldade para o homem ancestral que ainda não dominava técnicas avançadas de manejo,
estava deixando uma vida nômade e preocupando-se em aprender a lidar com o cultivo de
vegetais e a domesticação de outras espécies bem mais pacatas como os herbívoros e aves
(ISAAC, 1962; REED, 1959).
Por fim um dos maiores impasses para esta teoria é que por mais que se tente
domesticar lobos atualmente, mesmo pesquisadores ou pessoas com extrema expediência não
conseguem reproduzir plenamente a domesticação. Mesmo criando domesticamente filhotes
de lobos, ao crescerem, não possuem as características sociais dos cães. Seus instintos, por
mais que as técnicas sejam aprimoradas e que seja dedicado todo o cuidado com a modelagem
da personalidade dos animais, afloram e percebe-se que de fato apenas criaram-se lobos um
pouco menos selvagens e não novos cães (ZIMEN, 1981).
Todos estes fatos são observados pelos biólogos Raymond e Lorna Coppinger, em sua
obra Dogs: A New Understanding of Canine Origin, Behavior and Evolution, de 2002. Eles
chamam a teoria vigente de “Hipótese do Pinóquio”. Na estória, o boneco Pinóquio é feito
pelo marceneiro Gepeto, com amor e carinho e, através de duas intervenções mágicas,
primeiro o boneco ganha vida e depois se torna menino de carne e osso. Na opinião dos
autores, tão mágica quanto a estória do Pinóquio é a possibilidade do homem pré-histórico ter
domado plenamente o lobo e “transformado-o” em cão.
Estudos recentes da análise de DNA mitocondrial revelaram que lobos e cães
descendem de um ancestral comum, localizado há cerca de 100.000 anos, bem antes do
contato humano (VILÁ et al., 1997). Neste contexto, apesar da relevância do contato humano,
os cães de fato teriam surgido de um ancestral comum com os lobos, numa época mais remota
que aquela tradicionalmente aceita. Este ancestral comum, chamado de proto-cão por
Coppinger & Coppinger (2002), já bem próximo das características dos cães atuais, não seria
um animal caçador, como os lobos, mas um animal que alimentava-se de restos. Este animal
28
estaria muito mais propenso a não temer e aproximar-se de outros animais, inclusive do
homem (KOLER-MATZNICK, 2002).
O homem começava a fixar-se, constituir pequenas aldeias e a tendência natural é que,
tal qual nas cidades humanas de hoje, os resíduos das ações humanas, em especial de restos de
alimentos, fossem acumulados em locais próximos. Os ancestrais dos cães, que até então,
como o homem, eram nômades, podiam agora fixar-se, pois possuíam reservas de alimentos
disponíveis (COPPINGER & COPPINGER, 2002).
Assim os espécimes ou as espécies que estavam mais aptas a buscar alimentos junto
aos vilarejos foram naturalmente selecionados, e não selecionados pelo homem como no
paradigma anterior, e passaram a viver próximos destes vilarejos. Koler-Matznick (2002)
aponta que mesmo hoje, ainda existem espécies de cães selvagens como o dingo (Canis lupus
dingos) na Austrália e Nova Guiné e o dhole indiano (Cuon alpinus) como provas de que há
espécies selvagens de cães que não coabitam com o homem, mas que vivem em sua presença
sem transtornos. Somente subespécies do Canis lupus reconhecidos, em 2008, pelo Integrated
Taxonomic Information System (ITIS – Sistema de Informação Integrada de Taxonomia)7, há
38 subespécies, muitas delas com as características citadas por Koler-Matznick (2002), sem
considerar-se o fato de que o cruzamento entre estas subespécies podem gerar descendentes
férteis e portando podendo gerar, no futuro como no passado, outras variedades.
É óbvio que o homem deve ter reagido à presença deste cão ancestral, muitas vezes
negativamente, mas possuir um “lixeiro” próximo à vila tinha suas vantagens, e outros
benefícios foram sendo percebidos até que o homem passou a levar o visitante para o interior
das suas moradias (COPPINGER & COPPINGER, 2002).
Não houve assim alteração biológica do DNA, daí a semelhança com os lobos, mas é
certo que o homem passou então a agir sobre os cães. Não à toa evidenciam-se as centenas de
raças hoje existentes com variações de tamanho, pelagem, comportamento e habilidades. A
Fédération Cynologique Internationale (FCI – Federação Cinológica Internacional)8
reconhece hoje mais de oito centenas de raças de cães, reunidos em 10 grupos, a saber Grupo
1 - Cães de Pastor e Boieiros; Grupo 2 - Cães de tipo Pinscher e Schnauzer, Molossóides e
Cães de Montanha, e Boieiros Suíços; Grupo 3 – Terriers; Grupo 4 – Dachshunds; Grupo 5 -
Cães de tipo Spitz e de tipo Primitivo; Grupo 6 - Sabujos Farejadores e Raças Assemelhadas;
Grupo 7 - Cães de Parar ou Cães Apontadores; Grupo 8 - Cães Levantadores e Cobradores de
Caça e Cães de Água; Grupo 9 - Cães de Companhia e Grupo 10 - Galgos (Lébreis).
7 Website: http://www.itis.gov/index.html 8 Website: http://www.fci.be/home.asp?lang=en
29
A discussão ganha volume à medida que o homem cada vez mais integra os cães à
suas atividades de trabalho e lazer. As pesquisas mais recentes apóiam o novo paradigma em
detrimento da antiga idéia da doma dos lobos, esta última ainda muito incorporada no
imaginário popular e mesmo na comunidade científica. Há cientistas que julgam improdutivas
as buscas por uma “verdade” (VERGANO, 2002), mas definir esta origem pode apontar
melhores técnicas de treinamento e formas melhor de lidar com as espécies de canídeos
selvagens.
1.1.3 Biologia
Os cães são mamíferos, quadrúpedes, dotados de pêlos na maior parte do corpo
(exceto algumas raças) sem a presença de dimorfismo sexual, apresentando apenas poucas
diferenças entre os sexos além da presença dos órgãos genitais, como tamanho e peso.
Possuem mandíbulas dotadas de dentes especializados para apreensão, corte e trituração.
Possuem, como a maioria dos mamíferos predadores, músculos poderosos e sistema
cardiovascular disponível para ações explosivas, corridas e ataques. O esqueleto possui
características que acompanham esta demanda. Na maior parte das raças, os membros
anteriores são flexíveis e os posteriores possuem grande massa muscular, proporcionando
poder de executar saltos longos e corridas a altas velocidades. As patas apóiam-se sobre as
falanges (terceiras), possuem almofadas plantares macias e garras usadas para fixação ao solo,
escalada ou para ataques (DEWEY & BHAGAT, 2002).
30
Figura 04 – Imagem geral do esqueleto do cão.
Fonte: MERRIAM-WEBSTER, 2008.
Muitas características físicas são específicas de cada raça. As diversas raças de cães
possuem diferenças significativas entre si, em especial quanto ao tamanho, pelagem e
conformação. Por questões relacionadas à genética (OSTRANDER & WAYNE, 2007) e aos
cruzamentos forçados pela ação humana, existem raças com menos de 20 cm como os
Chihuahua, e outras com mais de 1m de altura como o Dinamarquês ou Dogue Alemão. A
diferença corporal não os faz de espécies diferentes, mantendo-se inclusive a possibilidade de
cruzamento (MICHELL, 1999).
A pelagem varia quanto à textura (duro, sedoso, lanoso), densidade, comprimento
(curto, longo ou misto), coloração, brilho, padrão (tigrado, pintalgada, arlequim, etc.), dentre
outras características. Esta diferenciação comumente está ligada à função de trabalho da raça,
bem como com a condição ambiental a que está costumeiramente associado (DE CICCO,
2006). Os padrões são oriundos ainda da vida selvagem quando os animais, como caça ou
caçadores, precisavam ocultar-se em seus ambientes naturais (CUNLIFFE, 2004).
A visão é bastante diferente em cada raça, mas de forma geral os cães possuem campo
de visão (270º em média) muito superior ao dos humanos (180º), porém possuem visão
dicromática, similar aos humanos acometidos de daltonismo (não distinção entre tons de
verde e vermelho) (DAVIS, 1998).
31
Figura 05 – Comparação entre o espectro luminoso visível por cães (“the Dog’s view”) e
humanos(“the Human’s view”). Fonte: DAVIS, 1998
A audição dos cães é muito superior às características da audição humana. No cão
médio, a faixa de freqüência audível vai de 40 a 60.000 Hz, além de uma capacidade de
detectar rapidamente a localização dos sons, em especial pela capacidade de mudar as orelhas
de posição e com isso direcionar a captação do som. Em algumas raças, até dezoito músculos
para realizar rotação e movimentos ascendentes e descendentes das orelhas estão presentes
(ELERT & CONDON, 2003).
O olfato é extremamente desenvolvido, em especial nas raças de focinho longo, por
possuírem cavidades nasais maiores e, conseqüentemente, mais células sensoriais. Em média,
possuem 220 milhões de células sensíveis, enquanto o homem possui apenas 5 milhões. Os
cães conseguem detectar odores em concentrações 100 milhões de vezes menores que os
humanos (ALABAMA & AUBURN UNIVERSITIES, 2008). Esta característica tem
incentivado cientistas a realizar pesquisas na detecção de moléculas associadas a doenças
como o câncer. Em alguns casos esta detecção ocorre com uma precisão de 87 a 95% de
acerto (LOVGREN, 2006; SAGE, 2006).
Possuem caudas, que apesar de muitas vezes serem extraídas por razões estéticas, são
parte importante na comunicação dos cães e possui papel funcional em cães nadadores e na
manutenção do equilíbrio em corridas e situações de caça. Os cães são animais sociáveis, com
os de sua espécie e com outras espécies. Organizam-se de forma hierárquica, normalmente
reconhecendo um líder, que pode ser humano, que possui prioridade em decisões como
32
alimentação. Muitos apontam este fato como o que determina o sucesso do convívio do
homem como líder de seus cães (ZIMEN, 1981).
Zimen (1981) ressalta que a inteligência dos cães varia conforme as raças e por vezes
se confunde com a determinação e personalidade forte, pois definir inteligência significa
medir características subjetivas. Algumas raças são mais sensíveis a treino e aprendizado de
comandos (Border Collies) outras, com forte senso de territorialidade e capacidade de
entender situações de perigo, são protetores, como os Pastores Alemães (JONES &
GOSLING, 2005).
Com corpos distintos entre raças, doenças diferentes atingem cada uma delas. Raças
de focinho curto têm problemas respiratórios; displasia é comum em raças de médio
(TORRES et al., 1999) e grande porte como estes comumente sofrem de doenças de coluna.
A própria longevidade é afetada pela raça: em geral, cães de pequeno porte são mais longevos
que os de grande porte (SHEPHERD, 1986). Muitas doenças não distinguem raça, como a
parvovirose (HAGIWARA et al., 1996), a cinomose (GEBARA et al., 2004), a raiva
(hidrofobia) (SCHNEIDER et al., 1996) e a Leishmaniose visceral (GONTIJO, 2004), estas
duas últimas afetam também a humanos em muitas regiões do Brasil, tendo o cão como vetor
ou reservatório.
Com o convívio humano, a nutrição dos cães alterou-se e muitas substâncias usadas
naturalmente em nossa alimentação podem causar danos aos cães. Os teores de gordura,
açúcar e sal contidos na comida humana são tão danosos aos cães quanto aos humanos.
Chocolates e outros alimentos que contém metilxantinas são potenciais causadores de
vômitos, diarréias, sudorese, arritmia cardíaca, tremores entre outros sintomas (CRUZ et al.,
2001). Uvas e passas podem causar falência renal agudas (McKNIGHT, 2005). Bebidas
alcoólicas em pequenas porções podem facilmente intoxicar cães. Substitutos para os açúcares
encontrados em produtos dietéticos são potencialmente tóxicos (DUNAYER, 2006). Por fim,
os mesmos males da auto-medicação humana afetam também os cães, pois medicações como
o paracetamol, de uso tão comum humano, podem trazer problemas hepáticos para os cães
(ASPCA, 2004).
Entre os cães a maturidade sexual ocorre entre 6 e 12 meses de vida, tanto para
machos quanto para fêmeas e, exceto em caso de problemas, têm vida sexualmente ativa até a
velhice e morte (KUSTRITZ, 2005). O ciclo estral das cadelas é, normalmente, bianual,
período em que se prepara fisicamente para o coito e possível prenhez. A gestação dura cerca
de 60 dias, após os quais nascem, em média, 06 filhotes (ALLEN, 1995). A castração ainda é
um método contraceptivo recomendado, em detrimento de métodos químicos, e executado
33
pela extração plena de útero e ovários ou testículos; não é comum considerar-se a
possibilidade de manutenção de ovários nas cadelas, que permitiria a continuidade dos ciclos
e preservação da carga hormonal. Nos machos é possível a realização de vasectomia
(JACKSON, 1984).
1.1.4 Trabalhando com os humanos
A integração homem-animal, principalmente com o cão, tem sido descrita como
benéfica, tanto para a saúde física, como para a saúde mental do ser humano. Esses benefícios
podem ser observados desde o momento em que se tem um animal de estimação em casa,
propiciando relaxamento e fornecendo carinho à pessoa, até a zooterapia e os serviços
prestados pelos cães aos deficientes físicos (KITAGAWA & COUTINHO, 2004).
Quando passou a fazer parte da comunidade humana, o cão passou a ser treinado para
aproveitar seu potencial na execução de atividades que pudessem auxiliar o homem. A maior
conseqüência deste fato é o grande número de raças existentes hoje. Cada uma delas foi
obtida através do controle e manipulação genética por seleção de indivíduos e cruzamentos
programados para obter destaque em características que se desejava enaltecer (WILSSON &
SUNDGREN, 1997).
No Brasil, essa importância funcional chega ser reconhecida por Lei. O Decreto Nº
4.998, de 27 de Fevereiro de 2004 (que Altera a redação do art. 2º do Regulamento da
Organização, Funcionamento e Execução dos Registros Genealógicos de Animais Domésticos
no País, aprovado pelo Decreto nº 58.984, de 3 de agosto de 1966), em seu artigo segundo,
afirma que “São considerados animais domésticos, para os efeitos deste Regulamento, as
seguintes espécies: asinina, bovina, bubalina, eqüina, suína, ovina, caprina, canina, leporina e
outras de interesse zootécnico e econômico, assim definidas pelo Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento” (PRESIDÊNCIA DA REPÚBLICA FEDERATIVA DO BRASIL,
2004)
As tribos que vivem nas áreas frias do hemisfério Norte, como no Alaska(EUA),
Sibéria(Rússia), Islândia, passaram a domar cães de raças como o Husky Siberiano (nome
alusivo à Sibéria) como cão de trabalho, especialmente para transporte. Povos como os
Esquimós têm toda uma cultura baseada no uso destes animais como força de trabalho e
companheiros das atividades cotidianas (GIPSON, 1983), além de aspetos culturais mais
fortes como a religiosidade.
34
Vários campos da saúde humana têm se aproveitado da afinidade entre homens e cães.
A percepção que o homem possui de que o cão é de fato um ser confiável, digno de ser
chamado de “melhor amigo”, e a sensibilidade dos cães para compreender o mundo à sua
volta, inclusive os sentimentos dos seres ao seu redor, permitem que os cães sejam candidatos
potenciais para trabalhos na reabilitação de pacientes. Animais selecionados e treinados para
este fins têm sido utilizados com sucesso surpreendente em hospitais, ambientes de terapia
ocupacional e em locais de moradia temporária ou permanente de crianças e idosos (ALLEN
& BLASCOVICH, 1996; PEREIRA et al., 2007).
Devido à mesma afinidade, cães são intensamente utilizados para acompanhar pessoas
com necessidades especiais. Em muitos países, inclusive no Brasil (através da Lei no 11.126,
de 27 de junho de 2005), é possível utilizar-se de cães com a função de guias para facilitar o
deslocamento de pessoas com deficiência visual severa ou total, evitando choques com
objetos e exposição a situações de perigo (MIZUKOSHIA et al., 2008). Porém muitas outras
funcionalidades lhes podem ser atribuídas. Desde a década de 70, inicialmente na Inglaterra,
cães são treinados para sinalizar de forma apropriada e diferenciada aos diversos estímulos
sonoros e com isso conseguem complementar as ações do deficiente auditivo (GUEST, 2006).
Para pessoas com deficiências motoras, cães são treinados para buscar objetos sem destruí-
los, ligar e desligar aparelhos elétricos, auxiliar na acomodação em cadeiras de roda,
mictórios, camas; auxiliar em episódios de queda, dentre outras tantas situações vividas pelos
portadores das deficiências (CAMP, 2001).
Graças à capacidade muito superior da detecção de odores que os cães possuem, eles
são constantemente indicados para atividades das mais diversas. Estudos recentes têm
indicado a possibilidade concreta de cães sentirem o odor específico de proteínas resultante da
ação de tumores malignos (câncer) antes mesmo que os testes laboratoriais indiquem a sua
existência (SAGE, 2008).
Em ambientes de grande circulação de pessoas e possibilidade concreta de transporte
de mercadorias ilegais, como nos aeroportos, o olfato dos cães torna-se essencial para
detecção de substâncias ilegais (como narcóticos), explosivos, substâncias orgânicas (como
animais silvestres ou frutas), sem que haja intervenção direta sobre a bagagem dos
passageiros (ROSS & BLOCK, 1988).
Em conjunto com outras características, como a audição aguçada e a capacidade de
infiltrar-se, cavar e vasculhar, cães são utilizados em equipes de busca e salvamento em todo
o mundo. Várias raças são utilizadas para este fim e equipes de bombeiros, salva-vidas e
polícia os utilizam em situações distintas. Possivelmente a ação mais heróica e divulgada da
35
ação destes animais tenha ocorrido em 11 de Setembro de 2001, quando a cidade de Nova
York sofreu o maior atentado terrorista até então praticado. Após a colisão de dois aviões
comerciais com as duas torres do World Trade Center e a queda inevitável dos dois prédios, a
ajuda dos cães de busca e salvamento foi essencial para encontrar pessoas vivas, corpos e
materiais combustíveis ou venenosos (OTTO et al., 2002).
As forças armadas de diversos países possuem agrupamentos especializados no uso de
animais em combate, ações táticas e salvamentos desde a 1ª Guerra mundial e permanecem a
treinar cães ainda hoje (HAVERBEKEA et al., 2008.).
Na zona rural, é comum encontrar animais que são verdadeiramente funcionários da
fazenda. Existem, em alguns países, linhagens de cães que são treinados para realizar o
manejo e o deslocamento de gado (bovino, ovino, caprino), suínos e até mesmo aves. Através
de comandos simples, ou mesmo de forma autônoma, os cães conseguem proezas através da
imposição de sua vontade, latidos e movimentos rápidos é possível ao animal movimentar,
agrupar, separar e conduzir (entre outras opções) grupos ou indivíduos, além de protegerem o
rebanho de animais selvagens (RIGG, 2002).
1.1.4 Considerações Finais
Ainda não é possível definir com plena certeza o momento e a forma que o cão deixou
seu habitat selvagem e tornou-se o animal que conhecemos hoje. Espera-se que mediante
novos estudos a origem dos cães domésticos seja por fim revelada, mas a importância real
destes estudos é permitir que o homem conheça melhor estes animais que se incorporaram tão
bem ao nosso estilo de vida.
Os cães assumiram um papel importante na evolução humana seja executando tarefas,
como até hoje o fazem, seja ocupando espaço entre as famílias humanas. Definir suas origens
ancestrais não somente satisfazem à curiosidade dos pesquisadores, mas principalmente pode
redefinir a forma como são tratados e utilizados.
Com seus sentidos aguçados, seu senso de responsabilidade com o espaço que
ocupam, sua disposição física para ações rápidas e contínuas, e uma fidelidade às vezes
incompreensível para os padrões do homem, os cães devem continuar a cativar as pessoas e
conhecê-los melhor permitirá que alguns dos inconvenientes de seu convívio entre humanos,
como as zoonoses, possam ser melhor estimados e corrigidos.
36
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1.2. Criopreservação do sêmen canino
Em 1776, Spallanzani observou que uma redução na temperatura diminuía
reversivelmente a atividade metabólica do espermatozóide, possibilitando assim a sua
armazenagem (ENGLAND, 1993). Com a descoberta da ação crioprotetora do glicerol por
Polge et al. (1949), iniciou-se uma era de extenso desenvolvimento de metodologias de
criopreservação de células espermáticas em diversas espécies, com o primeiro sucesso na
congelação do sêmen canino notificado por Rowson em 1954. Em 1969, Seager obteve a
primeira gestação canina, utilizando sêmen criopreservado (ENGLAND, 1993). No Brasil, a
primeira notificação de sucesso em inseminação artificial (IA) com sêmen canino congelado
foi realizada a pouco mais de 20 anos, tendo sido obtida uma ninhada de seis cães normais da
raça Boxer (VASKE et al., 1981).
O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência, reduzindo o metabolismo
e proporcionando uma diminuição nos gastos energéticos e na produção de catabólitos
tóxicos, contribuindo para a preservação celular. Da mesma maneira que a congelação pode
diminuir ou paralisar algumas reações bioquímicas celulares, ela pode, também, acelerar
outras, levando à danos ou mesmo à morte celular (MAZUR et al. 1972, WATSON, 1981;
WATSON, 1995; HOLT, 2000).
O termo “estresse térmico” ou “choque térmico” define um conjunto de alterações
ocorridas nos espermatozóides dos mamíferos quando resfriados rapidamente da temperatura
corpórea até temperaturas próximas a 5°C, que muitas vezes têm como conseqüência um
decréscimo irreversível da motilidade espermática, mudanças na bioquímica e no
funcionamento das células espermáticas incluindo: diminuição da taxa da glicólise, da
respiração celular e da frutólise, aumento na degeneração do ácido desoxirribonucléico e
liberação de material intracelular (AMANN e GRAHAM, 1993; HOLT, 2000; JASKO, 1994;
WATSON, 2000; ZÚCCARI, 1998). A maioria das alterações causada pelo estresse térmico
se inicia na membrana espermática (HOLT, 2000; JASKO, 1994).
As técnicas de preservação de sêmen em baixas temperaturas causam diminuição
da fertilidade, devido principalmente, às lesões estruturais e funcionais dos espermatozóides
advindas do estresse térmico (JASKO, 1994; MORTON e BRUCE, 1989). A redução de
temperatura de 37ºC a valores próximos de 4 - 5ºC pode levar ao rearranjo de alguns
fosfolipídios semelhantes dentro da bicamada. Com este rearranjo as propriedades básicas da
membrana biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral de proteínas, não são
43
mantidas, alterando a funcionalidade da membrana em questão (AMANN e GRAHAM, 1993;
GENNIS, 1989; HOLT, 2000; PARKS e GRAHAM, 1992; JASKO, 1994; WATSON, 1981;
WATSON, 1995; WATSON, 2000). Além da alteração da temperatura, alterações na
osmolaridade, pressão ou pH podem contribuir para mudanças na estrutura e organização da
bicamada de fosfolipídios (GENNIS, 1989).
Rotineiramente, o sêmen congelado é utilizado para a inseminação artificial em
outras espécies como a bovina, eqüina, ovina e caprina, e, na maioria delas, o sêmen
descongelado é depositado no útero, evitando desse modo, a barreira cervical, o que não
ocorre na espécie canina, onde o sêmen é normalmente depositado no fundo da vagina
(LINDE-FORSBERG e FORSBERG, 1989; MORTON e BRUCE, 1989). Estudos realizados
com sêmen congelado de cães demonstraram que o espermatozóide descongelado não
apresenta a mesma motilidade e vigor do sêmen fresco ou refrigerado, conseqüentemente, sua
sobrevivência no trato genital feminino é reduzida (ENGLAND e PONZIO, 1996; GABALDI
e LOPES, 1998; GILL et al., 1970; JOHNSTON et al., 2000; LINDE-FORSBERG e
FORSBERG, 1989; MORTON e BRUCE, 1989; PEÑA et al., 1998; ROTA et al., 1995).
A fim de minimizar esses danos, foram identificadas substâncias de vital
importância na tecnologia do sêmen designados de diluentes (RODRIGUES, 1997).
1.2.1 Diluentes
Os diluentes são utilizados com o intuito de proteger os espermatozóides de todos
os efeitos críticos do processo de congelação. Um bom diluente se caracteriza pela baixa
toxicidade à célula espermática; pela isotonicidade, poder nutritivo, por ser tampão eficaz;
pelos estabilizadores de membrana; pelo pH que favorece a sobrevivência espermática e, por
último por ser de fácil preparo e baixo custo (CONCANNON & BATISTA, 1989; MIES
FILHO, 1987). Johnston (2001) aponta ainda que um bom diluidor possui osmolaridade entre
300 e 325 mOsm e pH de 6,75 e 7,50.
A atividade vital das células espermáticas tem como conseqüência natural o
aumento de íons hidrogênio no meio, cujo aumento de concentração leva a alterações do pH,
que reduzem a longevidade dos espermatozóides, num ciclo de deterioração que somente
equilibra-se se os íons H forem retirados do meio (ENGLAND, 1993) , e as soluções tampão
são ideais para cumprir este papel, de onde parte a necessidade dos diluidores serem boas
soluções tampão.
44
Os primeiros experimentos para a preservação do sêmen canino por períodos
curtos ou longos iniciaram-se com uma adaptação empírica de diluentes usados para o
resfriamento e congelação do sêmen bovino, com o uso dos tampões à base de citrato
(HARROP, 1962), leite desnatado (MARTIN, 1963); cloreto de fosfato (WALES e WHITE,
1963), Tris (FOOTE, 1964; GILL et al., 1970) e lactose (SEAGER, 1969). A maioria dos
grupos de pesquisa da atualidade tem utilizado o diluente Tris, o qual tem se mostrado
superior a outros diluentes (FARSTAD, 1996; SILVA et al., 2000).
Os açúcares têm sido incluídos nos diluentes para a conservação de sêmen a baixas
temperaturas como substrato de energia endógena, como componente osmótico e como agente
crioprotetor (FARSTAD, 1996; PEÑA et al., 1998; HOLT, 2000; JOHNSTON et al., 2001).
Em adição, Phillips e Lardy, em 1940, descobriram os efeitos benéficos da gema de ovo na
conservação dos espermatozóides, sendo que o principal efeito protetor da gema parece
ocorrer pela diminuição dos efeitos negativos do choque frio estabilizando as membranas
espermáticas (HOLT, 2000).
O emprego do leite como meio diluente de sêmen foi primeiramente demonstrado por
Donne em 1837. Segundo Hoffman (1996), o leite é um líquido orgânico com importante
propriedade biológica para a conservação dos espermatozóides por possuir capacidade
tampão, ação bactericida, viscosidade adequada para a manutenção dos espermatozóides no
meio líquido com abundância de carboidratos que seriam utilizados pelos espermatozóides na
produção de energia. Em 1950, Koelliker comprovou a existência de duas substâncias
responsáveis por esta característica: a lactose, que age como elemento energético, e proteínas
que são substâncias capazes de potencializar a atividade cinética dos espermatozóides. Cunha
(1997) e Johnston et al. (2000) verificaram a possibilidade da utilização de um diluente a base
de leite desnatado e glicose, obtendo sucesso com seu uso em processos de refrigeração e
transporte.
O tris-hidroximetil-aminometano, ou simplesmente Tris [(HOCH2)3CNH2], funciona
como solução tampão para uma larga faixa de pH, coincidente com as condições ideais para
maior parte dos organismos viventes, motivo pelo qual é amplamente utilizado em diversos
procedimentos na bioquímica e biologia molecular (GOMORI, 1955). Tornou-se padrão
como diluidor no congelamento de sêmen canino ao longo dos anos, desde seu uso inicial
com Foote (1964), em especial quando combinado com outras substâncias como a gema de
ovo (ENGLAND, 1993).
45
1.2.2 Crioprotetores
A adição de algumas substâncias crioprotetoras ao meio diluente confere proteção
aos espermatozóides no processo de criopreservação. Em contrapartida oferece maior ou
menos grau de toxidade. Segundo Medeiros (2003), os crioprotetores estão subdivididos em
penetrantes, os quais desempenham seu mecanismo de ação no meio extracelular e
intracelular, e os crioprotetores não-penetrantes que atuam somente no meio extracelular.
Os não-penetrantes são representados por macromoléculas com alto peso
molecular, tais como os açúcares, lipoproteínas da gema do ovo, proteínas do leite e alguns
aminoácidos, que atuam através de um efeito osmótico, no qual induz a saída da água do
interior da célula, prevenindo a formação de cristais de gelo no meio intracelular (AMANN &
PICKETT, 1987).
Ashwood-Smith (1987) sumarizou diferentes componentes que podem ser usados
como agentes crioprotetores penetrantes para a criopreservação de sêmen, como os álcoois:
etanol, etilenoglicol, glicerol, metanol e poli-etilenoglicol; e também as amidas, incluindo a
acetamida, formamida, lactamida. Estes têm estruturas que promovem ligações de hidrogênio
com a molécula da água, estas ligações mudam a orientação da molécula da água nos cristais
de gelo criando um ambiente menos nocivo para as células espermáticas (DALIMATA e
GRAHAM, 1997). Os crioprotetores também interagem direta ou indiretamente com a
membrana celular, estabilizando a estrutura do complexo terciário água, lipídeo e proteína.
(ROWE, 1966).
As características físico-químicas ideais que um agente crioprotetor deve possuir
são: baixo peso molecular, alta solubilidade em meio aquoso e principalmente uma baixa
toxicidade celular (NASH, 1966). Esses agentes agem modificando as características da
molécula da água durante o processo de congelação, limitando a formação de cristais de gelo,
retardando o crescimento dos cristais e reduzindo as concentrações de soluto tanto no meio
extracelular, como no meio intracelular (DALIMATA & GRAHAM, 1997; NASH, 1966;
ROWE, 1966; WATSON, 1979).
1.2.2.1. Glicerol
O glicerol (CH3H8O3), um álcool polihídrico altamente permeável, é o crioprotetor
mais empregado na congelação de sêmen nas diferentes espécies (SILVA et al., 2003). Ele
46
ocasiona um estresse osmótico à célula espermática, impedindo a formação de grandes cristais
de gelo intracelulares (WATSON, 2000). Os efeitos protetores do glicerol são representados
por suas propriedades coligativas, pela diminuição do ponto de criopreservação e pela
conseqüente redução das concentrações de eletrólitos na fração não-congelada da amostra
(LOVELOCK e POLGE, 1954).
Uma outra hipótese do mecanismo de ação do glicerol é a ligação dos átomos de
hidrogênio dos grupos hidroxila do glicerol com os átomos de oxigênio dos grupos fosfatos
dos fosfolipídios da membrana plasmática dos espermatozóides promovendo assim, uma
estabilização da membrana durante o processo de congelação (JOHNSTON et al., 2000).
O glicerol reduz as injúrias causadas durante o criopreservação, embora tenha
demonstrado apresentar toxicidade para as células espermáticas durante a sua adição e durante
a própria crioconservação (ROTA et al., 2001). Fahy et al. (1990) relatam que esta toxicidade
pode resultar em desnaturação de proteínas, alteração de interações da actina e indução da
liberação das proteínas do seu local na membrana. Para Watson (1979), a concentração ideal
de glicerol no diluente seria aquela em que há uma predominância de seus efeitos protetores
sobre os efeitos tóxicos.
Hay et al. (1997), concluíram que a adição do glicerol no meio do criopreservação
de sêmen de cães não promove nenhuma mudança no status acrossomal ou na motilidade, mas
resulta em um declínio na ligação de espermatozóides em oócitos caninos.
1.2.2.2. Dimetilformamida
As amidas podem se ligar ao hidrogênio da água em três sítios de ligação, um
número menor de sítios se comparada ao glicerol. No entanto as amidas possuem uma menor
viscosidade e solubilidade à água em relação ao glicerol, permitindo-as uma maior penetração
na célua (NASH, 1966), diminuindo assim a possibilidade de danos celulares por estresse
osmótico causados pelos crioprotetores (BALL & VO, 2001). Keith (1998) relatou que a
adição de grupos metil nas moléculas de acetamida e formamida foi mais efetiva quanto à
capacidade crioprotetora, comparado às moléculas sem o grupo metil, sugerindo assim que a
estrutura da molécula das amidas determina parcialmente sua habilidade crioprotetora.
Keith (1998) estudou várias formas de amidas como agentes crioprotetores em
comparação com o glicerol em um meio usado para a congelação de sêmen de garanhões, e
encontrou que a metilformamida foi superior em manter o motilidade total dos
47
espermatozóides de garanhões no tempo imediatamente pós-descongelação em relação ao
glicerol e no tempo 20min pós-descongelação.
A dimetilformamida (C3H7NO) vem sendo usada como crioprotetor de sêmen de
várias espécies, como eqüinos (VIDAMENT et al., 2000), suínos (BIANCHI, 2008), caprinos
(SILVA, 2006), peixes (TIAN, 2008), aves (CHALAHA, 1999), inclusive caninos
(OLIVEIRA, 2003). Esta substância é um crioprotetor penetrante, que atua por meio de suas
propriedades coligativas, diminuindo o ponto crioscópico intracelular. Desta forma, maior
quantidade de água vai permanecer no estado líquido sob baixas temperaturas, diminuindo a
concentração intracelular de solutos, proporcionando, assim, um ambiente menos deletério à
célula espermática durante a congelação (WATSON, 1995).
Em sêmen de eqüídeos, a dimetilformamida (DMF) vem sendo testada em
diferentes protocolos e em combinação com diversos diluentes, inclusive comerciais, com
sucesso (MELO et al., 2007). Alguns destes estudos concentram-se em avaliar métodos, de
diluição por exemplo, em detrimento a considerar o uso de outras substâncias crioprotetoras
que não a dimetilformamida (ZIMMERMAN, 2007).
Em suínos, a dimetilformamida possui, em determinados protocolos, resultados de
motilidade e preservação da membrana espermática superiores a outras aminas e ao glicerol
(BIANCHI, 2008). Em caprinos, as biotécnicas reprodutivas têm ganhado espaço e algumas
pesquisas mostram que a dimetilformamida é no mínimo equivalente ao glicerol quando da
preservação do sêmen (SILVA, 2006)
Em espécies silvestres, em especial aquelas ameaças de extinção, a
dimetilformamida vêm sendo testada como agente crioprotetor, em geral com sucesso
satisfatório ou superior a outras substâncias (TIAN et al., 2008; CHALAHA et al., 1999).
Em cães, foi demonstrado que a dimetilformamida poderia ser utilizada na
criopreservação de sêmen associada aos diluentes lactose-gema (OLIVEIRA, 2003) ou tris-
gema (QUINTELA, 2005), apresentando resultados satisfatórios após a descongelação.
Zimmermann et al (2007) comprovaram que os meios tris-gema com 6% de glicerol e tris-
gema com 7% de dimetilformamida apresentam maior capacidade de preservar a qualidade do
sêmen, podendo ser indicados à criopreservação do sêmen canino. Oliveira (2006) em testes
in vitro, reafirma a viabilidade da dimetilformamida como criopreservador. Futino (2008) em
testes comparativos entre glicerol, metilformamida e dimetilformamida, avaliou que a DMF
em concentrações inferiores a 3% não são eficientes para preservar sêmen canino, mas viável
em concentrações maiores.
48
Apesar da existência de experimentos, ainda que em quantidade limitada, acerca
do uso da dimetilformamida, como crioprotetor para o sêmen do cão, ainda faz-se necessário
avaliá-lo sob o ponto de vista de outras metodologias, bem como fazer o uso de técnicas
laboratoriais avançadas, como a análise computadorizada, bem como a realização de testes in
vivo através de inseminações artificiais.
49
2. COMPARAÇÃO ENTRE O GLICEROL E A DIMETILFORMAMIDA PARA A
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES
Artigo 02: Comparison between glycerol and dimethylformamide for dog
semen cryopreservation
Kátia R.F. Lopes, Leonardo L.M. Costa, Gabriela L. Lima, Ana Liza P. Souza, Alexandre R.
Silva
Laboratório de Manipulação e Conservação de Germoplasma Animal, Universidade
Federal Rural do Semi-Árido / BR 110 - Km 47 Bairro Pres. Costa e Silva; 59.625-900 -
Mossoró – Rio Grande do Norte
Theriogenology (Artigo Submetido)
Resumo
O objetivo deste estudo foi comparar o efeito da dimetilformamida (DMF) e glicerol
para a criopreservação de sêmen cão. O sêmen foi diluído em duas etapas com o diluente Tris-
gema de ovo contendo uma concentração final de 6% glicerol ou ou 6% DMF, e congelado
em palhetas 0,25 mL, com o vapores de nitrogênio líquido. Imediatamente após o
descongelamento das amostras congeladas, motilidade espermática foi avaliada tanto sob um
microscópio ótico e com um sistema de análise de sêmen computadorizada. A Integridade
funcional da membrana espermática foi avaliada com teste de inchaço hipo-osmótico (água
destilada a 0mOsm). A morfologia espermática e percentagem de espermatozóides vivos
também foram avaliadas por microscopia de luz. Após o descongelamento, as células
espermáticas congeladas com glicerol (P <0,05) apresentaram maior percentual de células
vivas, mas não foram observadas diferenças nos parâmetros funcionais, tais como motilidade
total e progressiva, bem como não houve distinção entre DMF e glicerol quanto à integridade
da membrana, sugerindo que ambos podem igualmente ser utilizadas para criopreservação do
sêmen canino. O efeito de cada animal e as interações entre animais e crioprotetores foram
verificadas para diversas características sêmen (P <0,05) evidenciando uma acentuada
diferença entre o sêmen de cada um dos cães na sua tolerância à criopreservação. Em
50
conclusão, DMF pode ser utilizado como uma alternativa para crioprotector sêmen canino.
Também é sugerido que DMF poderia ter um efeito benéfico especialmente para aqueles
animais, que apresentam alta sensibilidade para o glicerol.
Palavras-chave: sêmen; cão; criopreservação; glicerol; Dimetilformamida.
Abstract
The aim of this study was to compare the effect of dimethylformamide (DMF) and
glycerol for cryopreservation of dog semen. The semen was diluted in two steps with an egg-
yolk Tris extender containing a final concentration of either 6% glycerol or 6% DMF, and
frozen in 0.25 mL straws, over nitrogen vapors. Immediately after thawing the frozen
samples, sperm motility was evaluated both under a light microscope and with a computer-
assisted sperm analyzer. Sperm membrane functional integrity was assessed with hypo-
osmotic swelling test (0mOsm distilled water). Sperm morphology and percentage of live
sperms were also evaluated by light microscopy. After thawing, a majority of sperm cells was
live with the use of glycerol (P < 0.05), but no differences were observed in functional
parameters such as subjective-, total- and progressive motility as well as functional membrane
integrity between it and DMF suggesting that both could similarly act on canine semen
cryopreservation. The effect of the individual animal and interactions between animals and
cryoprotectants were verified for various semen characteristics (P < 0.05) evidencing a
marked difference among the semen of individual dogs in their tolerance to cryopreservation.
In conclusion, DMF could be used as an alternative cryoprotectant for canine semen. It is also
suggested that DMF could have a beneficial effect especially for those individual animals that
present high sensitivity to glycerol.
Keywords: Semen; Dog; Cryopreservation; Glycerol; Dimethylformamide.
51
2.1 Introdução
Desde a descoberta da ação crioprotetora de glicerol (POLGE et al., 1949), uma era de
desenvolvimento de metodologias criopreservação de sêmen começou. O glicerol é o
crioprotetor mais freqüentemente utilizado para a preservação de sêmen de várias espécies,
incluindo o cão (SILVA et al., 2006ab; CARDOSO et al., 2007). No entanto, o glicerol induz
mudanças na estrutura lipídica da membrana espermática, e, consequentemente, a estabilidade
e a permeabilidade da água na membrana do espermatozóide pode sofrer alterações. Tais
alterações podem contribuir para reduzir a longevidade e acelerar a capacitação espermática
(WATSON, 1995).
Na busca de crioprotetores alternativos para o sêmen canino, a ação de outras
substâncias, como o etileno glicol (MARTINS-BESSA et al., 2006; ROTA et al., 2006) foi
recentemente relatada. Em equinos (ALVARENGA et al., 2005), coelhos (OKUDA et al.,
2007) e suínos (BIANCHI et al., 2008), as amidas foram sugeridas como agentes
crioprotetores alternativos para congelar o sêmen, principalmente para aqueles indivíduos que
são mais sensíveis para os efeitos tóxicos do glicerol. As amidas apresentam uma relativa
menor viscosidade e menor peso molecular que o glicerol. Este fato favorece uma maior
permeabilidade das amidas na membrana plasmática, resultando em menores danos osmóticos
à célula espermática (ALVARENGA et al., 2005).
Em cães, a dimetilformamida (DMF) foi combinada com lactose (OLIVEIRA et al.,
2006) ou Tris (FUTINO, 2008; ZIMMERMAN et al., 2007), como diluentes para
criopreservação de sêmen canino com resultados semelhantes aos do glicerol. Apesar da
importância destes estudos iniciais, eles estão focados apenas em análises subjetivas e novas
investigações objetivas são sugeridas. Atualmente, a análise auxiliada por computador
(CASA) foi incluída na avaliação de sêmen e seu uso é cada vez mais comum nos laboratórios
de andrologia (VERSTEGEN et al., 2002, Silva et al., 2006). O uso da CASA permite uma
avaliação objetiva das diferentes características celulares, como seu padrão de movimento e
velocidade, com alto nível de precisão e confiabilidade (VERSTEGEN et al., 2002).
O objetivo deste estudo foi comparar o efeito da DMF e glicerol na criopreservação de
sêmen de cães em relação aos parâmetros de motilidade pós-descongelação e velocidades
avaliadas pela CASA, como também sobre a motilidade progressiva subjetiva, morfologia
espermática, percentual de células vivas, e integridade funcional da membrana plasmática.
52
2.2. Materiais e Métodos
2.2.1. Animais
Cinco cães (três American Pit Bull Terriers, um Bull Terrier e um mestiço) de canis
particulares de Mossoró, Brasil, foram selecionados para este experimento. Os cães, com
idades entre 1 a 6 anos, foram mantidos em baias individuais e alimentados com ração
peletizada, uma vez por dia, com livre acesso à água.
2.2.2 Colheita e avaliação inicial do sêmen
Dois ejaculados foram coletados de cada cão por meio de manipulação digital em
intervalos de dez dias, e as frações ricas em espermatozóides foram analisadas. O volume
seminal e a coloração foram avaliados macroscopicamente e a concentração espermática foi
determinada por meio de contagem em câmara de Neubauer. O percentual de espermatozóides
em movimento progressivo foi avaliado subjetivamente utilizando-se um microscópio óptico
sob aumento de 100x e 400x. Esfregaços corados com Rosa-Bengala foram preparados para
avaliar a morfologia espermática usando microscopia óptica (1000X), contando 200 células
por lâmina. A porcentagem de espermatozóides vivos foi estabelecida por meio da análise de
esfregaço corado com azul de bromofenol sob um microscópio óptico (400x), contando 200
células por lâmina. Para a avaliação da funcionalidade da membrana espermática, as amostras
foram submetidas ao teste hipo-osmótico (HOS), com água destilada (0 mOsm / L) como a
solução hipo-osmótica (QUINTELA et al., 2004). Uma alíquota de sêmen (0,01 mL) foi
diluída em solução hipo-osmótica (0,09mL) e mantida em um banho-maria a 38 ºC por 45
min. As avaliações foram realizadas sob microscopia óptica (400x), contando 200 células.
Espermatozóides apresentando caudas enroladas e edemaciadas foram considerados como
apresentando um membrana plenamente funcional.
2.2.3 Processamento do Sêmen
Os reagentes utilizados neste estudo foram obtidos no laboratório Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA). Foi utilizado um diluente constituído por 3,028g Tris-hidroximetil-
aminometano, 1,78g de ácido cítrico mono-hidratado e 1,25g de D-frutose, dissolvidos em
53
100mL de água ultrapura (SILVA et al., 2002). A osmolaridade desta solução era de
295mOsm / L, e o pH, 6,6. Vinte por cento desta solução foi então substituída por gema de
ovo (v / v). Cada amostra foi inicialmente diluída na proporção de uma parte da fraçaõ
espermática para meia parte da solução de TRIS acrescida de gema de ovo (EYT), a 27 º C. O
sêmen foi armazenado em uma caixa térmica por 40min até que alcançasse uma temperatura
de 15 º C, a uma taxa de resfriamento de -0,30 °C/min. As amostras foram então transferidas
para um refrigerador por mais 30min, aonde atingiu 4ºC, a uma taxa de resfriamento de -
0,37°C/min. Depois do resfriamento, as amostras do sêmen foram divididas em duas alíquotas
e cada uma foi acrescentada à outra meia-parte do EYT acrescido de 12% de glicerol ou 12%
DMF, a uma temperatura de 4 ºC, o que culminou com uma concentração final de 6% de
crioprotetor no diluidor. A taxa de diluição final para ambas as alíquotas foi uma parte de
sêmen para uma parte de diluente (1:1). Nesta ocasião, a motilidade progressiva foi reavaliada
subjetivamente por microscopia de luz (100x). As amostras foram acondicionadas em
palhetas de plástico de 0,25ml, que foram colocados horizontalmente em uma caixa térmica
por 5min, posicionados 5 centímetros acima do nitrogênio líquido (N2), e chegaram a uma
temperatura próxima de -70ºC, sob a ação dos vapores do nitrogênio. Finalmente, as palhetas
foram imersas em N2 líquido para armazenamento. Após a passagem de um mês, as amostras
foram transferidas para o Laboratório de Reprodução de Carnívoros da Universidade Estadual
do Ceará (Fortaleza, Brasil) para a descongelação e posterior análise. As amostras foram
descongeladas em um banho-maria à taxa de 38ºC/1min, e posteriormente avaliadas quanto a
motilidade progressiva subjetiva, morfologia espermática, percentual de células vivas, teste
HOS e também pela CASA.
2.2.4. Análise computadorizada do sêmen (CASA)
A análise foi conduzida de acordo com Iguer-Ouada e Verstegen (2001). Depois de
descongeladas, as amostras de sêmen (10 µL) foram colocadas em uma câmara de Makler, e
aguardaram em repouso durante 1 min, mantidos a 38 ºC, e examinadas em microscopia de
contraste de fase com um sistema de iluminação estroboscópica acoplado a uma vídeo-câmera
adaptada para o Sperm Class Analyzer (SCA versão 3.2.0, Microptic SL, Barcelona,
Espanha). Três campos microscópicos diferentes, não consecutivos, selecionados
aleatoriamente foram digitalizados. Os dados foram informatizados e os valores de média ±
desvio padrão foram determinados. Os parâmetros analisados foram motilidade total (%),
54
motilidade progressiva (%), velocidade média no percurso (VAP, µm/seg), velocidade em
linha reta (VSL, µm/seg), velocidade curvilínea (VCL, µm / seg), amplitude lateral da cabeça
(ALH; µm), frequênca de batimento cruzado (BCF; Hz), índice de progressão (STR,%) e de
linearidade (LIN,%).
2.2.5 Análise estatística
Foram realizadas dez repetições para cada tratamento. Os resultados foram expressos
como média ± desvio padrão. Os dados percentuais foram transformados através de arco-
seno. Todos os dados foram submetidos à análise de variância utilizando o modelo linear
geral do Statview Software Pack (Statview 5,0, SAS Institute Inc., Cary, E.U.A.).
As diferenças entre sêmen fresco, diluído, resfriado e descongelado com relação à
motilidade avaliada subjetivamente foram detectados pelo teste t de Student. Os efeitos de
crioprotetores na pós-descongelação (avaliados pela CASA), bem como as comparações entre
sêmen fresco e congelado relativos à morfologia espermática, percentual de células vivas e
funcionalidade da membrana também foram realizados pelo teste t de Student. Os resultados
foram significativos quando P <0,05.
Para avaliar o efeito individual cão e suas interações com os efeitos de crioprotetores
sobre as variáveis estudadas, os dados foram analisados pelo teste PSLD de Fisher (P <0,05).
2.3. Resultados
O sêmen fresco dos cães apresentou coloração branco-leitosa. O volume da fração
espermática foi de 288 ± 21 µL, com uma concentração espermática de 788 ± 621 x 106
espermatozóides/mL. A avaliação subjetiva da motilidade progressiva está representada na
Tabela 1. Diferenças entre os crioprotetores foram apenas observadas imediatamente após sua
adição ao sêmen refrigerado (P<0,05)
O efeito dos crioprotetores sobre a morfologia espermática, a viabilidade das células
espermáticas e a integridade funcional da membrana estão apresentados na Tabela 2. As
diferenças estatísticas entre os crioprotetores foram verificadas apenas para a percentagem de
células vivas após a descongelação, que apresentava melhores valores quando da utilização de
glicerol (P <0,05).
55
Tabela 1: Motilidade espermática progressiva (%) no semen canino fresco, diluído,
adicionado de glycerol ou dimetilformamida (DMF) e congelado/descongelado (n=10
ejaculados de 05 cães).
Avaliação do sêmen Glicerol DMF
Fresco 96,5 ± 1,6A
Diluído 96,1 ± 3,3%A
Adicionado de crioprotetor 94,0 ± 4,6Aa 85,0 ± 11,6Bb
Congelado/descongelado 44,1 ± 23,7C 27,1 ± 11,1C a,b Letras minúsculas indicam diferença estatística entre colunas (P < 0,05); A,B,C Letras maiúsculas indicam diferenças estatísticas entre linhas (P < 0,05).
Tabela 2: Percentagem (%) da integridade funcional da membrana, espermatozóides vivos,
morfologia espermática normal e alterado em sêmen canino (n=10 ejaculados de 05 cães)
fresco e congelado/descongelado, acrescentado de glicerol ou dimetilformamida (DMF).
Fresco Resfriado
Glicerol DMF
Resposta osmótica 95,1 ± 5,5a 62,0 ± 12,1b 55,3 ± 11,9b
Porcentagem de vivos 91,0 ± 11,4a 55,5 ± 4,5b 47,5 ± 10,7b
Morfologia Normal 94,9 ± 4,4 96,1 ± 1,9 96,2 ± 1,6
Alterações Morfológicas
Primárias 1,2 ± 0,9 1,5 ± 1,0 1,5 ± 0,9
Secundárias 4,0 ± 3,7 2,5 ± 1,1 2,3 ± 0,9
Totais 5,2 ± 4,4 4,0 ± 1,9 3,8 ± 1,6
Os dados do CASA são apresentados na Tabela 3. A motilidade espermática total foi
de 64,3 ± 24,6% e 52,3 ± 23,6% para o glicerol e DMF, respectivamente, variando de 96,7 a
13,9% no glicerol, e de 86,5 a 20,1% para a DMF. A motilidade progressiva foi de 11,9 ±
9,0% e 7,2 ± 6,8% de glicerol e DMF, respectivamente, variando de 29,0 a 0,2% para o
glicerol e de 17,8 a 0,3% para a DMF. Nenhuma diferença estatisticamente significativa entre
os agentes crioprotetores foi observada relativa aos parâmetros de movimentos e velocidade
dos espermatozóides (P> 0,05).
56
Tabela 3: Parâmetros de motilidade espermática mensurados por análise espermática
assistida por computador no sêmen canino congelado/descongelado (n=10 ejaculados de 05
cães) usando glicerol ou dimetilformamida (DMF) como crioprotetores.
Glicerol Dimetilformamida
Motilidade total 64,3 ± 24,6 52,3 ± 23,6
Motilidade Progressiva 11,9 ± 9,0 07,2 ± 6,8
Velocidade curvilínea 46,2 ± 20,5 37,1 ± 12,8
Velocidade em linha reta 21,2 ± 10,0 15,8 ± 6,1
Velocidade média no percurso 33,4 ± 14,7 22,9 ± 8,4
Linearidade 45,9 ± 10,7 42,6 ± 5,5
Índice de progressão 69,5 ± 8,5 68,9 ± 8,2
Amplitude lateral da cabeça 03,5 ± 0,6 03,9 ± 0,6
Freqüência de batimento cruzado 07,9 ± 2,7 08,7 ± 2,1
P > 0,05
2.4 Discussão
Este estudo investigou o efeito de DMF como uma alternativa para crioproteção de
sêmen canino utilizando a CASA. Demonstrou-se que DMF é semelhante ao glicerol na
preservação do total de espermatozóides e sua motilidade progressiva após a descongelação.
Resultados da motilidade progressiva e total obtidos com o DMF também são semelhantes
aos relatados com o uso de etileno-glicol como um crioprotector de sêmen canino (ROTA et
al., 2006). Parâmetros de velocidade observados neste estudo foram inferiores aos reportados
em outros estudos sobre congelamento de sêmen canino (ROTA et al., 2006, SILVA et al.,
2006). O SCA, sistema adotado para os cálculos, estabelece parâmetros para definir se a
velocidade média é baixa, média ou rápida, mas a inclusão de um grande percentual de
espermatozóides lentos reduziu os valores.
As propriedades crioprotetoras do glicerol e amidas são alcançadas através de
diferentes mecanismos. O glicerol é um álcool que contém três grupos funcionais hidroxila,
que podem aceitar um hidrogênio a partir da molécula da água em seis sítios diferentes. Os
radicais hidroxila do glicerol podem, por vezes, ligar-se entre si diminuindo a probabilidade
de ligação com as moléculas da água, o que é indesejável por aumentar a viscosidade da
solução (DALIMATA & GRAHAM, 1997). Contrariamente, as amidas são formadas por
57
grupos funcionais que contêm nitrogênio (NH–C=O) e interagem com a água através da
ligação de seus constituintes nitrogênio e hidrogênio com os hidrogênios presentes na
molécula da água. A natureza altamente hidrofílica da molécula da amida permite uma maior
interação com a água, o que reduz a formação de cristais de gelo intracelular. Devido ao seu
menor peso molecular (73,09) e viscosidade, em comparação ao glicerol (peso molecular
92,05), as amidas apresentam maior permeabilidade na membrana, diminuindo assim a
possibilidade de danos celulares causados pelo estresse osmótico (BALL & VO, 2001). Além
disso, a adição de radical metil (CH3) na molécula amida aumenta a permeabilidade através da
membrana celular dos espermatozóides e melhora a eficiência da sua ação croprotetora
(BIANCHI et al., 2008)
O efeito do glicerol na criopreservação de sêmen canino tem sido amplamente
estudado. Sabe-se que a concentração glicerol (PEÑA et al., 1998), a forma de adição
(SILVA et al., 2003), e a temperatura de adição (SILVA et al., 2006) são fatores que podem
influenciar a qualidade da congelação/descongelação do sêmen canino. Entretanto, estudos
sobre a ação de amidas como crioprotetores para o sêmen de cães são poucos. Zimmerman et
al. (2007) estudaram diferentes concentrações de DMF em diluente Tris e constatou que 7%
de DMF promove melhores resultados pós-descongelação do que 3,5%. Oliveira et al. (2005)
sugeriram que 5% de DMF no diluidor à base de lactose poderia preservar a qualidade do
sêmen canino após a descongelação. Neste trabalho, optou-se por utilizar 6% de DMF que é
uma concentração similar ao usado atualmente para o glicerol em Tris (SILVA et al., 2006).
Chirinéia et al. (2006) relataram o uso combinado de ambos os crioprotetores. Eles
compararam os resultados obtidos com Tris adicionado de 8% de glicerol aos obtidos com um
diluente comercial acrescentado de glicerol a 3% e 2% de DMF, mas como nós, eles não
observaram diferenças na motilidade subjetiva, morfologia espermática e no teste HOS.
Estudos anteriores relatados para o uso do DMF sozinho mostraram valores médios de 46,7%
e 45,0% para a motilidade subjetiva com o uso de Tris (ZIMMERMAN et al., 2007) e lactose
(OLIVEIRA et al., 2005) como diluentes, respectivamente. Em nosso trabalho, valores
inferiores a 27% de motilidade progressiva avaliada subjetivamente foram encontrados para
DMF, mas nenhuma diferença estatística relacionada ao glicerol foi corroborada pelas
avaliações subjetivas ou computadorizadas.
A única diferença significativa entre os crioprotetores foi verificada após a
descongelação. Apesar de uma maioria de células espermáticas estarem vivas com o uso de
glicerol, não houve diferenças nos parâmetros funcionais como a mobilidade funcional e
integridade da membrana quando comparado com amostras congeladas com DMF. Embora a
58
motilidade seja apenas um dos muitos atributos importantes de um espermatozóide capaz de
fecundar, é o principal parâmetro e continua a ser o mais utilizado indicador da função
espermática. A motilidade é a manifestação da competência estrutural e funcional dos
espermatozóides; assim, a porcentagem de espermatozóides dotados de motilidade
progressiva geralmente é positivamente correlacionada com a integridade da membrana
plasmática (PEÑA-MARTINEZ, 2004). No entanto, uma relação entre a resposta ao teste
HOS e a capacidade de fertilização de espermatozóides caninos não foi estabelecida. Assim,
sugere-se que, ensaios de fertilidade in vitro ou in vivo devam ser conduzidos para avaliar o
desempenho da DMF.
Sabe-se que existe uma marcada diferença entre as amostras de sêmen de cada cão em
relação à sua tolerância à criopreservação (YU et al., 2002) e este fato também foi confirmado
pelos nossos dados. Nós verificamos a presença de diversas interações entre animais e os
crioprotetores, indicando que a congelabilidade com glicerol ou DMF não foi semelhante para
todos os animais. A análise com CASA detectou uma motilidade espermática total variando
de 96,7 a 13,9% com glicerol e de 86,5 a 20,1% com DMF. Essa variação foi verificada para
todos os parâmetros avaliados e poderiam ser responsáveis pelos grandes desvios padrões
encontrados nos resultados. Em garanhões, a utilização de amidas fornece uma alternativa
para a melhoria da motilidade pós-descongelação e integridade das células daqueles
garanhões chamado "bad freezers" cujo sêmen congelado apresentam maus resultados quando
é utilizado glicerol. Assim, é possível que a espécie canina também poderia possuir "good" e
"bad freezers" e a DMF deva ser investigados com maior profundidade como uma alternativa
para a criopreservação de sêmen de cães "bad freezers".
Em conclusão, uma análise objetiva realizada com CASA mostrou que o DMF poderia
ser utilizado como um crioprotetor alternativo para o sêmen canino. A possibilidade de que a
DMF poderia ter ação benéfica para aqueles indivíduos que apresentam alta sensibilidade ao
glicerol existe. Novos estudos precisam ser realizados para investigar melhor a ação
crioprotetora de DMF em diferentes concentrações e suas interações com diferentes
diluidores, fertilidade, sensibilidade individual dos cães a este crioprotetor.
Agradecimentos
Os autores agradecem os Laboratórios de Tecnologia do Sêmen de Caprinos e Ovinos
e de Reprodução de Carnívoros/UECE pelo apoio técnico.
59
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62
CONCLUSÃO
A dimetilformamida pode ser eficientemente utilizada como crioprotetor associado ao
diluente Tris para a criopreservação de sêmen canino com resultados semelhantes aos obtidos
com o processo tradicional utilizando glicerol.
63
PERSPECTIVAS
Novos estudos devem ser conduzidos a fim de aprimorar a utilização da DMF,
investigando melhor a ação crioprotetora da mesma, principalmente em relação a diferentes
concentrações e interações com diferentes diluidores. A DMF mostrou-se similar ao glicerol,
mas pode apresentar um desempenho diferenciado se alterada a metodologia ou a interação
com outros diluentes.
Uma vez que já é conhecido que os cães apresentam diferenças quanto à
congelabilidade do seu ejaculado frente a diferentes diluentes ou crioprotetores, a DMF pode
vir a assumir um papel de grande importância como substituto ao glicerol. Esta possibilidade
pode ser alvo de novas pesquisas e abrirá fronteiras para o desenvolvimentos de novas
técnicas e/ou metodologias de manipulação do sêmen canino.
64
ANEXOS
65
Anexo 01: Comparison between glycerol and dimethylformamide
for dog semen cryopreservation
Kátia R.F. Lopesa, Leonardo L.M. Costaa, Gabriela L. Limaa, Ana Liza P. Souzaa, Alexandre
R. Silvaa*
a Departamento de Ciências Animais, Universidade Federal Rural do Semi-Árido - UFERSA,
BR 110, Km 47, Costa e Silva, 59625-900, Mossoró, RN, Brazil.
Abstract
The aim of this study was to compare the effect of dimethylformamide (DMF) and
glycerol for cryopreservation of dog semen. The semen was diluted in two steps with an egg-
yolk Tris extender containing a final concentration of either 6% glycerol or 6%
dimethylformamide (DMF), and frozen in 0.25 mL straws, over nitrogen vapors. Immediately
after thawing the frozen samples, sperm motility was evaluated both under a light microscope
and with a computer-assisted sperm analyzer. Sperm membrane functional integrity was
assessed with hypo-osmotic swelling test (0mOsm distilled water). Sperm morphology and
percentage of live sperms were also evaluated by light microscopy. After thawing, a majority
of sperm was live with the use of glycerol (P < 0.05), but no differences were observed in
functional parameters such as subjective-, total- and progressive motility as well as functional
membrane integrity between glycerol and DMF suggesting that both could similarly act on
canine semen cryopreservation. The effect of the individual animal and interactions between
animals and cryoprotectants were verified for various semen characteristics (P < 0.05)
* Corresponding author: BR 110, Km 47, Presidente Costa e Silva, 59625-900, Mossoró, RN, Brazil. Tel: +55-84-88571964; fax: +55-84-33151778. E-mail adress: legio2000@yahoo.com (A.R. Silva)
66
evidencing a marked difference among the semen of individual dogs in their tolerance to
cryopreservation. In conclusion, DMF could be used as an alternative cyroprotectant for
canine semen. It is also suggested that DMF could have a beneficial effect especially for those
individual animals that present high sensitivity to glycerol.
Keywords: Semen; Dog; Cryopreservation; Glycerol; Dimethylformamide.
1. Introduction
From the discovery of the cryoprotective action of glycerol (Polge et al., 1949), an era
of extensive development of methodologies for semen cryopreservation began. Glycerol is the
cryoprotectant most frequently used for semen cryopreservation in several species, including
the dog (Silva et al., 2006ab). However, possibilities of glycerol-induced changes in the lipid
packing structure of the sperm membrane exist, and hence the stability and water permeability
of the sperm suffer alteration. Such changes can contribute to reduce sperm longevity and
accelerate capacitation (Watson, 1995).
In the search for alternative cryoprotectants for canine semen, the action of other
substances such as ethylene glycol (Martins-Bessa et al., 2006; Rota et al., 2006) was recently
reported. In stallions (Alvarenga et al., 2005), rabbits (Okuda et al., 2007) and boars (Bianchi
et al., 2008), amides were suggested as alternative cryoprotective agents for semen freezing,
mainly for those individuals who are more sensitive to the toxic effects of glycerol. Amides
present relatively lower viscosity and lower molecular weight than glycerol. This fact favors
an enhanced permeability of the amides into the plasma membrane, resulting in lower osmotic
damage to the sperm (Alvarenga et al., 2005).
In dogs, dimethylformamide (DMF) was combined with lactose (Oliveira et al., 2006)
or Tris (Zimmerman et al., 2007) extenders for freezing canine semen with results similar to
67
those of glycerol. Despite the importance of these initial studies, they are focused only on
subjective analysis and further objective investigations are suggested. Nowadays, computer-
assisted sperm analysis (CASA) has been included in the evaluation of semen and its use is
becoming more popular in andrological laboratories (Verstegen et al., 2002; Silva et al.,
2006). CASA allows an objective assessment of different cell characteristics such as motion
and velocity with high levels of precision and reliability (Verstegen et al., 2002).
The aim of this study was to compare the effect of DMF and glycerol for dog semen
cryopreservation on parameters of post-thaw motility and velocity evaluated by CASA, as
also on subjective progressive motility, sperm morphology, percentage of live cells, and
plasma membrane functional integrity.
2. Materials and methods
2.1. Animals
Five proven stud dogs (three American Pit Bull Terriers, one Bull Terrier and one
crossbreed) from private kennels of Mossoró, Brazil, were selected for this experiment. The
dogs, aged 1 to 6 years, were maintained in individual pens and fed dry food once daily, and
allowed free access to water.
2.2. Semen collection and initial evaluation
Two ejaculates were collected from each dog by manual stimulation at intervals of ten
days, and the sperm-rich fractions were analyzed. Semen volume and color were grossly
evaluated and sperm concentration was determined using a Neubauer counting chamber. The
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percentage of progressive motile sperms was assessed subjectively using a light microscope
under 100x and 400x magnification. Bengal Rose-stained smears were prepared to evaluate
sperm morphology using light microscopy (1000x), counting 200 cells per slide. Percentage
of live spermatozoa was established by analyzing a slide stained with Bromophenol Blue
under a light microscope (400x), counting 200 cells per slide. For the evaluation of sperm
membrane function, samples were subjected to hypo-osmotic swelling (HOS) tests using the
distilled water (0 mOsmL) as the hypo-osmotic solution (Quintela et al., 2004). An aliquot of
semen (0.01 mL) was diluted in 0.09mL hypo-osmotic solution and kept in a water bath at
38ºC for 45 min. Evaluations were conducted under light microscopy (x400), counting 200
cells. Spermatozoa presenting swollen coiled tails were considered as presenting a functional
membrane.
2.3. Semen processing
The reagents used in this study were obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
USA). An extender consisting of 3.028g Tris-hydroxymethyl-aminomethane (Tris), 1.78g
monohydrated citric acid and 1.25g D-fructose dissolved in 100mL ultrapure water (Silva et
al., 2002) was used. The osmosis of this solution was 295mOsm/L and the pH 6.6. Twenty
percent of this solution was then replaced by egg-yolk (v/v). Each sperm-rich fraction of the
semen was initially extended by one part semen to a half-part egg yolk-Tris (EYT) at 27 ºC.
Semen was stored in a thermal box for 40 min aimed at reaching a temperature of 15ºC, at a
cooling rate of -0.30°C/min. Samples were then transferred to a refrigerator for a further 30
min, where they reached 4ºC at a cooling rate of -0.37°C/min. After so cooling them, the
semen samples were divided in two aliquots and each one was added to the other half-part of
the EYT plus 12% glycerol or 12% DMF also at a temperature of 4ºC, which culminated in a
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final concentration of 6% cryoprotectant in the extender. The final dilution rate for both
aliquots was one part semen to one part extender (1:1). Progressive sperm were subjectively
reevaluated by light microscopy (100x) at this juncture. Samples were packed into 0.25mL
plastic straws, which were placed horizontally in a thermal box for 5 min, positioned 5cm
above the liquid nitrogen (N2) level, and reached a temperature close to -70ºC in the vapor.
Finally, the straws were immersed into liquid N2 for storage. After storage of one month,
samples were transferred to the Laboratory of Carnivore Reproduction of the State University
of Ceará (Fortaleza, Brazil) for thawing and further analysis. Samples were thawed in a water
bath at the rate of 38ºC/1 min and thereafter evaluated for subjective progressive sperm
motility, sperm morphology, percentage of live cells, HOS test and also by CASA.
2.4. Computer assisted semen analysis (CASA)
CASA was conducted according to Iguer-Ouada and Verstegen (2001). After thawing,
the semen samples (10 µL) were placed in a Makler chamber, allowed to settle for 1 min,
maintained at 38 ºC, and examined in a phase-contrast microcopy system with stroboscopic
illumination coupled to a video-camera adapted to the Sperm Class Analyzer (SCA version
3.2.0, Microptic S.L., Barcelona, Spain). Three different, non-consecutive, randomly selected
microscopic fields were scanned. The data were computerized and the mean value and
standard deviation (SD) determined. The parameters analyzed were total motility (%),
progressive motility (%), velocity average pathway (VAP, µm/sec), velocity straight line
(VSL, µm/sec), curvilinear velocity (VCL, µm/sec), amplitude of lateral head (ALH; µm),
beat cross frequency (BCF; Hz), straightness (STR, %) and linearity (LIN, %).
2.5 Statistical analysis
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Ten replicates were performed for each treatment. The results were expressed as mean
values ± SD. Percentage data were arcsine-transformed before analysis. All data were
subjected to analysis of variance using the general linear model of the Statview software
package (Statview 5.0, SAS Institute Inc., Cary, USA).
Differences among fresh-, diluted-, cooled- and thawed semen on subjective motility
were detected by the Student t test. The effects of cryoprotectants on post-thaw data from
CASA as well as comparisons among fresh and frozen semen relating to sperm morphology,
percentage of live cells and functional membrane were also conducted by the Student t test.
The results were significant when P < 0.05.
To evaluate the individual dog effect and its interactions with effects of
cryoprotectants on the variables studied, data were analyzed by Fisher’s PSLD test (P < 0.05).
3. Results
The fresh dog semen was white-milky in color. The volume of the sperm-rich fraction
was 288 ± 21 µL, with a sperm concentration of 788 ± 621 x 106 sperm/mL. Evaluation of
subjective progressive motility is shown in Table 1. Differences between cryoprotectants were
only observed immediately after their addition to the cooled semen (P > 0.05).
The effect of cryoprotectants on sperm morphology, livability of sperm and functional
membrane integrity are shown in Table 2. Statistical differences between cryoprotectants
were verified only for the percentage of live sperm that was better preserved by the use of
glycerol (P < 0.05).
CASA data are presented in Table 3. Total sperm motility was 64.3 ± 24.6% and 52.3
± 23.6% for glycerol and DMF, respectively, ranging from 96.7 to 13.9% for glycerol, and
from 86.5 to 20.1% for DMF. Progressive motility was 11.9 ± 9.0% and 7.2 ± 6.8 % for
71
glycerol and DMF, respectively, ranging from 29.0 to 0.2% for glycerol, and from 17.8
to0.3% for DMF. No statistical differences between cryoprotective agents were observed
relating to sperm motion and velocity parameters (P > 0.05).
The effect of the individual dog was significant on total motility, VCL, VSL, VAP,
STR, ALH and sperm morphology (P < 0.05). Interactions between individual dog and
cryoprotectors were obtained for total- and progressive motility, VCL, VSL, VAP, STR,
membrane function and sperm motility.
4. Discussion
This study investigated the effect of DMF as an alternative cryoprotectant for canine
semen using the CASA. We demonstrate that DMF is similar to glycerol in preserving sperm
total and progressive motility after thawing. Results of total and progressive motility obtained
with DMF are also similar to those reported with the use of ethylene glycol as a
cryoprotectant for canine semen (Rota et al., 2006). Velocity parameters observed in this
study were lower than those reported in other studies on canine semen freezing (Rota et al.,
2006; Silva et al., 2006). The SCA system we adopted calculates velocity parameters based on
an average for slow-, medium- and rapid progressive sperm and the inclusion of a large
percentage of slow sperm reduced the values.
The cryoprotectant properties of glycerol and amides are achieved by different
mechanisms. Glycerol is an alcohol that contains three functional hydroxyl groups, which can
accept one hydrogen from the water molecule at six different binding sites. Hydroxyl radicals
of glycerol may sometimes bind among themselves reducing the probability of binding with
water molecules, which is undesirable due to the higher viscosity of the solution (Dalimata e
Graham, 1997). Otherwise, amides are formed by functional groups that contain nitrogen
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(NH–C=O) and interact with the water by binding their nitrogen and hydrogen content to the
hydrogen present in the water molecule. The highly hydrophilic nature of the amide molecule
allows a higher interaction with the water, which reduces the formation of intracellular ice
crystals. Due to their lower molecular weight (73.09) and viscosity in comparison to glycerol
(molecular weight 92.05), amides have higher membrane permeability, thereby decreasing the
possibility of cellular damage caused by osmotic stress (Ball and Vo, 2001). Moreover,
addition of the methyl (CH3) radical into the amide molecule increases its permeability
through the sperm cell membrane and improves the efficiency of its croprotective action
(Bianchi et al., 2008).
The effect of glycerol on canine semen freezing has been widely studied. It is known
that the glycerol concentration (Peña et al., 1998), the form of addition (Silva et al., 2003),
and the temperature of addition (Silva et al., 2006) are factors that can influence the quality of
frozen-thawed canine sperm. However, studies on the action of amides as cryoprotectants for
dog semen are few. Zimmerman et al. (2006) studied different concentrations of DMF in Tris
extender and found that 7% DMF promotes better post-thaw results than 3.5%. By contrast,
Oliveira et al. (2005) suggested that 5% DMF in lactose extender could efficiently preserve
canine semen quality after thawing. We chose to use 6% DMF that is a concentration similar
to that currently used for glycerol in Tris extender (Silva et al., 2006).
Chirinéia et al. (2006) reported the combined use of both cryoprotectants. He
compared results obtained with Tris added 8% glycerol to those obtained with a commercial
extender added to 3% glycerol plus 2% DMF, but like us, he observed no differences in
subjective motility, sperm morphology, and the HOS test. Previous studies reported for the
use of DMF alone showed average values of 46.7% and 45.0% for subjective motility with
the use of Tris- (Zimmerman et al., 2006) and lactose (Oliveira et al., 2005) extenders,
respectively. In our work, lower values of 27% progressive motile sperm evaluated
73
subjectively were found for DMF, but no statistical differences related to glycerol were
substantiated by subjective- or computerized evaluation.
The unique statistical difference between cryoprotectants verified was in the post-thaw
livability of sperm. Despite a majority of sperm being live with the use of glycerol, there were
no differences in functional parameters such as motility and functional membrane integrity
when compared to samples frozen with DMF. Although motility is only one of the many
important attributes of a fertile sperm, it is the primary parameter and continues to be the most
widely used indicator of sperm function. Motility is the manifestation of structural- and
functional competence of the sperm; thus, the percentage of progressively motile sperm is
usually positively correlated with that of plasma membrane integrity (Peña-Martinez, 2004).
However, a relationship between the HOS test response and fertilizing capacity of dog sperm
has not been established. Thus, it is suggested that in vitro- or in vivo fertility assays should
be conducted to further evaluate DMF performance.
It is well known that there is a marked difference among the semen samples of
individual dogs in their tolerance to cryopreservation (Yu et al., 2002) and this was also
confirmed by our data. We verified the presence of interactions between individual animals
and the cryoprotectant indicating that the freezability with glycerol or DMF was not similar
for all animals. CASA detected a total sperm motility varying from 96 to 13% with glycerol
and from 86 to 20% with DMF. This variance was verified for all the parameters evaluated
and could account for the large standard deviations found in the results. In stallions, the use of
amides provides an alternative to improved post-thaw motility and cell integrity of those
stallions called “bad freezers” whose semen freezes poorly when glycerol is used. Thus, it is
possible that the canine species could also consist of “good” and “bad freezers” and DMF
should be investigated in greater depth as an alternative for semen cryopreservation of “bad
freezer” dogs.
74
In conclusion, objective analysis performed with CASA showed that DMF could be
used as an alternative cyroprotectant for canine semen. The possibility that DMF could have
beneficial action for those individuals that present high sensitivity to glycerol exists. Studies
need to be conducted to further investigate the cryoprotective action of DMF of different
concentrations and its interactions with various extenders, fertility assays, and individual
dogs’ sensitivity to it.
Acknowledgements
The authors thank Laboratory of Goat and Ram Semen Technology and Laboratory of
Carnivore Reproduction / UECE for technical assistance.
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