Post on 22-Apr-2015
Vera Luiza CapelozziDepartamento de PatologiaFaculdade de Medicina - Universidade de São Paulo – Brazil
e-mail: vcapelozzi@lim05.fm.usp.br
PATOLOGIA
O que é Imunohistoquímica: Impacto como Marcador Prognóstico
Imunofluorescência
• Técnica precursora IHQ: reações antígeno-anticorpo• Tecido fresco congelado, microscópio especial, pobre
definição morfológica • Anos 80-90: IHQ aplicação ampla na Patologia Cirúrgica• Detecção mais sensível: Acs monoclonais altamente
específicos, idênticos e em abundância • Cortes inicialmente congelados: fixação em formalina e
embebição em parafina
IHQ: Tipos de Anticorpos
• Monoclonais e policlonais– monoclonais: mais específicos– policlonais: reconhecem diversos epítopos
• injeção de um antígeno peptídico em animais• após a estimulação de resposta imune secundária• isolamento dos anticorpos a partir do soro
• Primários e secundários– primários: antígeno de interesse e são não-marcados– anticorpos secundários
• produzidos contra anticorpos primários • reconhecem IGs de uma espécie particular e
– são conjugados : biotina , fosfatase alcalina , peroxidase , Flúor Alexa ou Fluor DyLight
IHQ: Preparação das Amostras•Cortes:
• finos 4μm , micrótomo• lâminas
•Controles • padronização processamento e fixação
•“Controles internos”: • tecido (ou células) da mesma secção• secção do mesmo espécime da paciente
•“Controles externos”: • tecidos (ou linhas de células) de outras fontes •células negativas e outras positivas de expressão do antígeno em questão
IHQ: Direta e Indireta
• Direto (one-step)– anticorpo marcado (e.g.
Isotiocianato de Fluoresceína - FITC) conjugado
– reage diretamente com o antígeno no tecido
– simples e rápido– baixa sensibilidade: pequena
amplificação de sinal
• Ac primário não-marcado (primeira camada)– + Ag do tecido– + Ac secundário marcado (segunda camada)
• contra IgG da espécie animal na qual Ac primário foi produzido– segunda camada Ac marcada com corante fluorescente ou enzima
• Método mais sensível:– amplificação maior: reações Ac secundários com diferentes sítios
antigênicos do Ac primário– Número pequeno de Ac secundários conjugados (marcados) gerado
• Ex: Ac secundário marcado produzido contra IgG de coelho (comprado sem encomenda) reage com qualquer Ac primário produzido em coelhos
• Método direto: – produzir Acs marcados customizados contra cada antígeno de interesse
HE & IHQ
IHQ: Indicações na Patologia Cirúrgica
• tecido de origem de uma neoplasia indiferenciada• órgão de origem de uma neoplasia diferenciada• subtipagem de neoplasias (linfomas)• fatores prognósticos, terapêuticos e índices proliferativos
(por exemplo, hormônios)• identificação de estruturas, organismos e materiais
secretados pelas células• detecção de células neoplásicas metastáticas• diferenciação proliferação celular maligna e benigna
IHQ: Marcadores diagnósticos
• técnica excelente de detecção: local exato da proteína no tecido
• maior desvantagem – ao contrário do immunoblotting: coloração
checada contra um peso molecular – impossível mostrar que a coloração corresponde à
proteína de interesse – Acs primários devem validados por Western Blot
• Pan Citoqueratina: celulares epiteliais e todos carcinomas; alguns sarcomas• CD45 (LCA): marcador de leucócitos;• HMB45: marcador de melanoma e nevos azul, de Spitz e juncional, angiomiolipoma;• S100: células gliais e de Schwann, melanócitos, células de Langerhans e células reticulares interdigitantes• Vimentina: marcador de células de origem mesenquimal (sarcomas);• Actina: leiomiossarcoma (positivo), câncer papilar de mama (negativo) e outros;• Alfafetoproteína (AFP): tumores de células germinativas (seio endodérmico) e carcinoma hepatocelular;• BCL-2: linfoma folicular x hiperplasia reacional, subtipos de linfomas, carcinomas e sarcomas;• CA 125: ovário, vesícula seminal, colo uterino, endométrio, trato gastrintestinal, tireóide e mama;• Antígeno prostático específico (PSA): para câncer de próstata;• Receptores de estrogênio e progesterona: marcadores prognósticos em câncer de mama;• CD3 (Pan-T): linfomas de células T;• CK7: epitélios glandulares e transicional - subtipos de carcinomas, ductos biliares;• CD10 : células foliculares e linfoblastos, normais e neoplásicas, estroma endometrial e células renais;• CD15: granulócitos maduros, células de Hodgkin e de Reed-Sternberg e diversos adenocarcinomas• CD20 (Pan-B): linfomas de células B;• CD30 (Ki-1): linfoma de Hodgkin, linfoma de grandes células anaplásico e carcinoma embrionário;• CD117 (proto-oncogene c-KIT): estroma gastrointestinal (GIST), carcinomas e leucemias, mastócitos;• CK20: tumores gastrointestinais, carcinoma de células transicionais, tumor de células de Merkel;• Cromogranina A: diferenciação neuroendócrina;• Desmina: células musculares, estriadas ou lisas - tumores musculares lisos e estriados• E-caderina: carcinoma ductal x carcinoma lobular de mama• Erb-B2/Her-neu: mama, ovário e trato-gastrointestinal. Prognóstico e preditivo em carcinoma de mama;• KI-67: marcador de proliferação celular;• Proteína P53: produto do gene supressor tumoral marcador prognóstico• TTF-1: marcador de carcinomas de pulmão e tireóide e neoplasias neuroendócrinas.
CD56
CK-7
TTF1
Caspase-9
Bcl-2 MMP-9
P63 Vimentina IL-4 CD3
CD1a
CD68
AE1+AE3
Câncer de Pulmão: Tipos HistológicosClassificação WHO 2004 – Tipos Maiores1
SCLC13.0%
LCC5.0%
Adenocarcinoma38.3%
19.7%SqCC
Outros*24.0%
Percentual distribuido entre casos classificaveis, 2001-20042
1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), 1975-2004.
*Inclui CA adenoescamoso, CA sarcomatoides, Carcinoides, CA glândulas salivares, e Carcinomas inclassificáveis
Carcinoma Não-Pequenas Células (NSCLC): Tipos Histológicos
AdenocarcinomaCarc Cels EscamosasCarc Grandes CélulasNão Especificado (NOS)
14%
19%
38%
29%
1. Brambilla E, et al. Eur Respir J. 2001;18:1059-1068.2. SEER Database. Lung and Bronchus Cancer (Invasive), 1975-2004.
NSLCL: 70% Apresentação
como Doença Avançada
Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01
Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado
Análise molecular de adenocarcinomas
Sem mutaçãoKRAS22%
EGFR17%EML4-AKL
7%
DoubleMutants 3%
BRAF 2%PIK3CA 2%
HER2MET AMPMEK1NRASAKT1
Alvos emergentes “tratáveis” em Adenocarcinoma de pulmão
Outro(Indeterminado)
Gene Evento Frequencia, %
FGFR1 Amplificação 20-25
FGFR2 Mutação 5
PIK3CA Mutação 9
PTEN Mutação-deleção 18
CCND1 Amplificação 8
CDKN2A Deleção/mutação 45
PDGFRA Amplificacão-mutação
9
EGFR Amplificação 10
MCL1 Amplificação 10
BRAF Mutação 3
DDR2 Mutacão 4
ERBB2 Amplificação 2
Alvos emergentes “tratáveis” emCA Celulas Escamosas de pulmão
Bang Y, et al. ASCO 2010. Abstract 3.Hammerman P, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract PRS.1
Alvos moleculares potencialmente “tratáveis”
K-rasEGFRB-rafHER2PIK3CAALKMETOther
TTF1 p63
Travis WD; USCAP 2012
IHQ: Marcadores DiagnósticosAdenocarcinoma
Carc Cels Escamosas
HuberAmsterdam, 26. 9. 2011
IHQ, FISH, PCR: Marcadores Preditivos e Diagnósticos
Herbst RS, Hirsch FR. Lancet 373 (2009)
Gene copy number by FISH for epidermal growth factor receptor
Protein expression by immuno-histochemistry for epidermal growth factor receptor
Mutation in epidermal growthfactor receptor
Qual Material?
•O que o Tipo de Procedimento na Obtenção da Biópsia pode Oferecer?
- biópsia por agulha em múltiplos pontos ou “core” biópsia mínima : como definir histologia e análise molecular? - fatores que influenciam as análises moleculares
•Como Atender ao que o Patologista pode fazer?
Como Facilitar o que quer saber o Oncologista?
Patologia Cirúrgica: Rotina
Kevin L, USCAP 2012
Kevin L, USCAP 2012
Optimizando o Diagnóstico em Biópsias Pequenas
Histologia:• grupo de células incluso maligno • “não pequenas” células • não favorece adenocarcinoma pela morfologia
Recomendável IHC para confirmar origem pulmonarResultados: • TTF1 neg, CK7 pos• Tumor insuficiente recortes: Napsin A, CK20, sinaptofisina, cromogranina, e P40...
Laudo:• “carcinoma não pequenas células, NOS”, • clínico pergunta: tumor de uma paciente com antecedentes de câncer de mama...... se for, recomendável pesquisa de Her2neu
Se pensarmos:• mais a favor de adenocarcinoma• precisamos saber se trata de AIS
Se não:• como temos certeza da ausência de diferenciação escamosa• recomendamos pesquisa de EGFR e ALK
Mudanças na Histologia do Câncer de Pulmão
Pequenas Células (SCLC)-15% de todo câncer de pulmão- incidência em declínio
Não-Pequenas Células (NSCLC)- 80% de todo câncer de pulmão- tipos de NSCLC :
- células escamosas - adenocarcinoma - grandes células
Carcinoma não-pequenas células
Adenocarcinoma
- padrão glandular-mucina positiva (50%)
- CK7+/CK20-- TTF1+ Napsin A
Carcinoma células escamosas
-queratinização celular-pontes intercelulares-escamas córneas
- CK7-/CK20-- P63+ CK5/6+
WHO
Comum, mas não 100%
WHO
Comum, mas não 100%
NSCLC – NOS – MICROSCOPIA ÓPTICA
NSCLC – FAVORECE ADENOCARCINOMA
TTF1 TTF1
NSCLC- FAVORECE ADENOCARCINOMA CONFIRMADO PELA MOLECULAR
Travis W, USCAP 2012
NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICABIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA
Travis W, USCAP 2012
NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICABIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA
NSCLC- DIAGNÓSTICO MICROSCOPIA ÓPTICA-BIÓPSIAS PEQUENAS / CITOLOGIA
Travis W, USCAP 2012
MUTAÇÃO EGFR – ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE SINALIZAÇÃO
Travis W, USCAP 2012
EGFR – EXON 21 – L858R- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA
Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010
EGFR – EXON 19 – DELEÇÃO- ANTICORPO MUTAÇÃO ESPECÍFICA
Brevet M et al. J Mol Diagn 12: 169-76, 2010
Kris MG, et al. ASCO 2011. CRA7506. Johnson BE, et al. IASLC WCLC 2011. Abstract O16.01
Mutação presente em 54% (280/516) (95% CI: 50% to 59%) Referência para tratamento especifico direcionado ao alvo determinado
Análise molecular de adenocarcinomas
Sem mutaçãoKRAS22%
EGFR17%EML4-AKL
7%
DoubleMutants 3%
BRAF 2%PIK3CA 2%
HER2MET AMPMEK1NRASAKT1
Quantificação da Expressão do EGFR FLEX
Baixa EGFRIHC score <200
N=776; 69%
IHC score=112
Alta EGFRIHC score ≥200
N=345; 31%
IHC score=270IHC score=0*
Aproximadamente 1/3 pacientes estão no grupo EGFR alta expressão
*This field Pirker, WCLC 2011, Abst O01.06
Amsterdam, 26. 9. 2011Huber
EGFR-Anticorpo – FLEX
Chemotherapy (CT) Cetuximab
Cisplatin 80 mg/mCisplatin 80 mg/m22 day 1 day 1
Vinorelbine 25 (30) mg/mVinorelbine 25 (30) mg/m22 days 1, days 1, 8 8
Every 3 weeks, up to 6 cyclesEvery 3 weeks, up to 6 cycles
initial dose 400 initial dose 400 mg/mmg/m22
then 250 mg/mthen 250 mg/m22 weeklyweekly
Chemotherapy
Cetuximabuntil PD or intolerable toxicity
Chemotherapy + Cetuximab
NSCLCwet IIIB/IV
EGFR- expressing
MaintenanceMaintenance
Pirker R et al. J Clin Oncol 2008, 18S (abstract 3), Lancet 2009;373: 1525–31Amsterdam, 26. 9. 2011
HuberHuber
Median OS 1-year survival
CT + cetuximab(n=557) 11.3 mo 47%
CT(n=568)
10.1 mo 42%
Pirker R ea. ASCO 2008, Lancet 2009;373: 1525–31CT, chemotherapy; HR, hazard ratio; OS, overall survival
FLEX: sobrevida
No effect of kRAS-Mutation and EGFR-FISHO'Byrne P ea. ASCO 2009
Amsterdam, 26. 9. 2011Huber
Huber
Number of patients at riskCT + cetuximab 178 128 24 086 61
Ove
rall
surv
ival
(%)
Months
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
180 6 12 24 30
Sobrevida com Alta Expressão EGFR (N=345)
*When adjusted for prognostic factors: HR 0.67 [95% CI 0.52–0.87], p=0.002; †Logrank
CT 167 108 11 058 36
Survival
Median 1-year 2-year
CT + cetuximab
12.0 mo 50% 24%
CT 9.6 mo 37% 15%
HR*=0.73 [95% CI 0.58–0.93], p=0.011†
Number of patients at riskCT + cetuximab 178 128 24 086 61
CT 167 108 11 058 36
Number of patients at riskCT + cetuximab 178 128 24 086 61
Amsterdam, 26. 9. 2011Huber
Medicina Personalizada do PacienteCâncer de Pulmão Avançadodeve ser Direcionadapara Histologia e Genética (IHQ, ISH, PCR)
CONCLUSÃO
OBRIGADA!!