PLDLA-TMC COMO BIOMATERIAL PARA ENGENHARIA

TECIDUAL ÓSSEA

Diego D. Leonato1, André D. Messias2, Adriana C. Motta1, Marlon Moda1, Bruna A.

Más2, Silvia M. M. Cattani1, Maria L. P. Barbo1, Eliana A. R. Duek1,2

1Laboratório de Biomateriais, Faculdade de Ciências Médicas e da Saúde, Pontifícia Universidade Católica de São Paulo, Sorocaba (SP), Brasil

2Departamento de Engenharia de Materiais, Faculdade de Engenharia Mecânica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas (SP), BrasilE-mail: andre_messias@ymail.com

Resumo. A copolimerização é uma das técnicas mais comuns visando obter propriedades adequadas a uma dada aplicação. O estudo biológico desses materiais se faz necessário para qualificá-los como seguros para utilização em implantes. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a utilização de arcabouços de poli(L-co-D,L ácido láctico-co-trimetileno carbonato), PLDLA-TMC, como biomaterial para engenharia tecidual óssea. Assim, foram utilizados suportes tridimensionais porosos de PLDLA-TMC como preenchimento para regeneração de defeitos ósseos em ratos. Células osteoblásticas isoladas da calvária de ratos Wistar foram semeadas nesses arcabouços, os quais foram mantidos em condições de cultivo in vitro durante 72 h. Defeitos críticos unilaterais de 5 mm de diâmetro foram produzidos no osso parietal direito de ratos Wistar, os quais foram, num tratamento, preenchidos com arcabouços de PLDLA-TMC e, em outro tratamento, com arcabouços do mesmo polímero contendo células osteoblásticas alógenas cultivadas. Num terceiro grupo, considerado como controle, o defeito não foi preenchido. Após 8 e 12 semanas os implantes foram analisados histologicamente com H.E. e Tricrômico de Mallory. Os resultados demonstram a presença de formação óssea não apenas nas regiões periféricas dos defeitos, como também em regiões centrais, diferentemente do controle, nos quais ocorreu formação de tecido ósseo apenas nas bordas. O cultivo in vitro de células alógenas não interferiu na regeneração de tecido ósseo. Conclui-se que os arcabouços de PLDLA-TMC apresentaram adequada biocompatibilidade e favoreceram a regeneração de tecido ósseo, demonstrando potencial de aplicação na engenharia tecidual óssea.

Palavras-chave: PLDLA-TMC, Engenharia de Tecidos, Regeneração Óssea.

1. INTRODUÇÃO

O tecido ósseo é um tecido conjuntivo dos mais resistentes e rígidos do nosso corpo. Constituinte principal do esqueleto serve de suporte para partes moles, protege os órgãos vitais, aloja a medula óssea, além de proporcionar apoio aos músculos esqueléticos para a movimentação do organismo. Mesmo com uma capacidade regenerativa extremamente eficaz, muitas fraturas determinam uma perda de massa óssea incompatível com o processo de regeneração humano e é nesse contexto que a intervenção cirúrgica ganha destaque.

Diante os problemas conhecidos oriundos do uso de enxertos, os pesquisadores estudam estratégias baseadas no emprego de biomateriais biorreabsorvíveis, visando um suporte mecânico temporário, o qual degrada a medida que o tecido se regenera.

Dentre os polímeros sintéticos biorreabsorvíveis e biodegradáveis encontram-se os poli (α-hidroxi ácidos), representantes de uma classe de poliésteres alifáticos sintéticos, os quais fazem parte o poli(ácido glicólico) (PGA), poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli(ε-caprolactona) (PCL), seus copolímeros e outros. Originalmente usados como fios de sutura, atualmente os poli (α- hidroxi ácidos) podem ser encontrados em diversos produtos comerciais de fixação óssea [BARBANTI et al., 2005]. Estes são considerados uma das famílias de polímeros mais promissoras na área médica, sendo utilizados em um amplo número de aplicações no corpo humano, tais como, suturas cirúrgicas, sistemas para liberação controlada de drogas [WANG et al., 2002], peles artificiais [ZOPPI et al., 1999], na regeneração das lesões nervosas periféricas [GORALTCHOUK et al., 2005], veias e artérias artificiais e dispositivos ortopédicos [BARROWS, 1986].

Muitas das aplicações dos poli(α-hidróxi ácidos) na área médica têm sido possíveis através de membranas poliméricas. Um exemplo desta aplicação é a regeneração óssea guiada (ROG), um método efetivo na regeneração dos ligamentos periodontais, sendo um procedimento auxiliar na reconstrução dos defeitos ossos. Para a realização da técnica de ROG, é de suma importância a utilização de membranas, sendo que as mesmas servem de barreiras físicas, indispensáveis para a criação de espaço adequado e proteção contra células epiteliais [BUSER et al., 1996]. Inicialmente, as membranas servem como protetoras do coágulo sanguíneo que se forma em meio ao defeito, sendo este importante uma vez que atua como matriz, onde os osteoblastos se depositarão e promoverão a neoformação óssea [SPIEKERMANN, 1995].

O PLA é um polímero semicristalino, com temperatura de transição vítrea de 57 °C e ponto de fusão de 174-184 °C, o grupo metil do PLA faz com que ele seja hidrofóbico e, dessa forma, mais resistente à hidrólise em relação aos outros estereoisômeros. O PLA possui três estereoisômeros: poli(L-ácido láctico) (PLLA), poli(D-ácido láctico) (PDLA) e o poli(D,L-ácido láctico) (PDLLA) [TSUJI et al., 1991]. O PLLA, tem se destacado, pela sua excelente biocompatibilidade e boas propriedades mecânicas [BERGSMA et al., 1995; BESSHO et al., 1997; ROKKANEN et al., 1996]. Porém, o longo período requerido para a sua degradação total, associado à alta cristalinidade de seus fragmentos pode causar reações inflamatórias no corpo, o que restringe seu uso em algumas aplicações clínicas. Buscando diminuir essa cristalinidade do PLLA, uma combinação dos monômeros L-ácido láctico e D,L-ácido láctico resultam no copolímero poli(L-ácido láctico-co-D,L ácido láctico) (PLDLA), sendo que esse tem como característica ser rapidamente degradado e não gerar fragmentos cristalinos, aliando as particularidades mecânicas do PLLA sem o inconveniente do elevado tempo de degradação requerido por esse homopolímero decorrente de sua alta cristalinidade.

Como a aplicabilidade dos materiais poliméricos é frequentemente determinada por características como resistência ao impacto e tenacidade a fratura, uma maior flexibilidade do poli(L-co-D,L ácido lático) poderia aumentar seu campo de aplicações. A adição de segmentos com características elastoméricas ao longo da cadeia polimérica tem sido usada há alguns anos para melhorar as propriedades de alguns polímeros, e como o PLDLA faz parte da classe de polímeros, os quais tendem a apresentar fratura frágil, a presença de segmentos de trimetileno carbonato (TMC) ao longo da cadeia do terpolímero poderia sanar essa deficiência do material. O TMC é um policarbonato alifático elastomérico e sua eficiência na preparação de implantes biomédicos já foi

previamente confirmada [PÊGO et al., 2003]. Este é um dos motivos na escolha deste material para fazer parte da cadeia do copolímero PLDLA. No caso de copolímeros de TMC com L ou D,L-ácido lático, por meio de diferentes razões entre os monômeros, pode-se controlar a taxa da degradação do copolímero como também suas propriedades físicas [PÊGO et al., 2003]. Além disso, como o TMC apresenta valores baixos de módulo elástico, sua utilização é voltada para obtenção de blendas e copolímeros nos quais os materiais poliméricos apresentam como características elevados valores de módulo elástico.

O estudo dos polímeros biorreabsorvíveis in vitro e in vivo tem como intenção avaliar as respostas celulares, locais e sistêmicas, após sua interação com o biomaterial, visando quantificar o nível de segurança do biomaterial cultivado e correlacionar seu desempenho nas reações ocorridas às situações clínicas reais, como o que ocorre hoje com as próteses de metal [OREFICE et al., 2006].

Mesmo sendo considerados corpos estranhos para o organismo, os materiais biorreabsorvíveis originam resposta inflamatória tipicamente suave mostrando, então, ser uma classe de polímeros vantajosa para utilização como dispositivos médicos, tornando-se uma área de pesquisa promissora.

Muitos fatores determinam a resposta inflamatória e a taxa de degradação dos polímeros biorreabsorvíveis, entre eles: local de implante, solicitação mecânica, massa molar, distribuição da massa molar, composição química/esterioisométrica, cristalinidade, morfologia, envolvendo o tamanho e geometria do suporte desenvolvido, porosidade, rugosidade da superfície, energia livre de superfície, carga da superfície, pH, presença de aditivos e outros [DUEK et al., 1999].

Em estudos in vivo, o processo de biodegradação e biorreabsorção é um mecanismo complexo de eventos celulares e bioquímicos. Com o implante do material sintético o organismo promove uma típica resposta a uma reação inflamatória de corpo estranho. A influência na degradação pela presença de peróxidos, enzimas e células fagocitárias representa ainda hoje um importante enfoque nas pesquisas dos polímeros biorreabsorvíveis [LUCIANO et al., 2000; LOMBELLO et al., 2002].

Frente a essa importância no desenvolvimento de pesquisas que avaliam a biocompatibilidade de polímeros biorreabsorvíveis, pretendeu-se analisar a interação do tecido ósseo com membranas de PLDLA-TMC. Para tanto, este trabalho teve por objetivo analisar a histocompatibilidade de arcabouços de poli(L-ácido láctico-co-D,L ácido láctico) PLDLA-TMC, comparando as diferentes respostas do tecido ósseo frente aos suportes com e sem cultura prévia de células osteoblásticas, visando a aplicabilidade na Engenharia Tecidual Óssea.

2. MATERIAIS E MÉTODO

2.1 Obtenção dos arcabouços

A técnica usada para obteção dos arcabouços usada foi a de evaporação de solvente e, associada ao método de lixiviação de porógenos para a produção de poros. A partir do terpolímero na forma de pó, foram preparadas soluções de poli(L-co-D,L ácido lático-co-trimetileno carbonato) PLDLA-TMC nas proporções 54:16:30 (m/m) pela diluição em clorofórmio (Merck) (10% m/v). Após completa dissolução do termpolímero, foi adicionada sacarose (Synth) (70% m/v) com granulometria menor que 250 µm. Tal solução foi vertida em moldes cilíndricos de silicone medindo cerca de 0,7 cm de diâmetro e 1 cm de altura. Após evaporação do solvente em temperatura

ambiente, removeu-se a sacarose usando solução de álcool polivinílico (PVA – 1%) durante 24 h sob agitação, seguida de lavagem em água destilada também por 24 h sob agitação.

2.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)

Para a observação da morfologia superficial e interior dos arcabouços, as amostras foram imersas em nitrogênio líquido por cerca de 5 min para criofratura. Em seguida, foram recobertas por ouro (Balzers SCD 050) e observadas em microscópio eletrônico de varredura (JEOL JXA-840A).

2.3 Isolamento de células osteoblásticas

As células osteoblásticas foram obtidas a partir de explantes de calvárias de ratos Wistar com 20 dias de idade, de acordo com GÓES et al. (2006). Para isso, os ratos foram sacrificados, foi feita a tricotomia da região cranial, na qual se fez uma incisão que permita a retirada das calotas cranianas. Estas foram imersas em meio de cultura DMEM com concentrações maiores de antibiótico e antimicótico, 150 mg/L de gentamicina e 15 mg/L de anfotericina B. Em ambiente estéril, as calotas foram raspadas com bisturi, eliminando o máximo possível de tecido mole, para então serem fragmentadas (pedaços de cerca de 1 mm2) e colocadas em frascos de cultura T25 contendo 5 mL de DMEM com 10% de soro fetal bovino (SFB). Após 2 semanas, os fragmentos foram retirados. Os frascos foram mantidos em estufa úmida com atmosfera de 5% de CO2 a 37 °C. O meio de cultura foi trocado cerca de 2 vezes na semana e os subcultivos realizados com tripsina EDTA 0,25% quando a os frascos atingiram cerca de 80% de confluência.

2.4 Cultivo celular sobre o polímero

Para realização do cultivo celular, os arcabouços cilíndricos foram cortados em pequenos discos com cerca de 3 mm de altura. Estes discos foram imersos em solução de etanol 70% por 1 h e lavados em água ultra-pura. Em seguida, as amostras foram colocadas em placas de 96 cavidades, imersas em DMEM durante 24 h. Posteriormente, as células osteoblásticas foram coletadas dos frascos T25 usando solução tripsina/EDTA e 20.000 células foram semeadas por amostra, sendo mantidas em DMEM com 10% SFB. Após 24 e 72 h de cultivo, os arcabouços foram submetidos ao ensaio de viabilidade celular. Para realização dos implantes dos arcabouços colonizados de células utilizou-se o cultivo de 72 h.

2.5 Ensaio de viabilidade celular

Para o ensaio de viabilidade celular foi utilizado o método de oxidação metabólica do MTT. Os poços da própria placa de poliestireno foram usados como controle. Após o tempo de cultivo (24 e 72h) o meio foi retirado e os poços lavados de 3 a 4 vezes rapidamente com tampão PBS a 0,1M. Após a lavagem, foi adicionado a cada poço, 200 μL de uma solução de DMEM contendo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil brometo de tetrazólio, MTT (0,5 mg/mL), seguindo-se um período de incubação de 4 horas a 37 °C no escuro. Após esse tempo, a solução contendo MTT foi substituída por uma solução de 200 μL de dimetil sulfóxido (DMSO). Em seguida, 150 μL das soluções contidas nos poços foram transferidas para uma nova placa e a absorbância mensurada

em leitor de microplacas Elx-800-UV (Bio-Tek Instruments, EUA), com emprego de filtro com comprimento de onda de 570 nm. As mitocôndrias de células vivas, por meio da enzima succinato dehidrogenase, são capazes de reduzir a substância amarelada solúvel em água MTT convertendo-a em um composto insolúvel em água, o formazan, o qual é solubilizado pelo DMSO. A quantidade de formazan produzida, medida por espectrofotometria, é diretamente proporcional à atividade metabólica e ao número de células vivas. As médias das absorbâncias foram analisadas através do teste t de Student.

2.6 Estudo in vivo

No presente estudo, foram utilizados 24 ratos Wistar, divididos quanto ao tempo de implante de 8 e 12 semanas e subdivididos de acordo com o tratamento empregado: controle negativo (defeito ausente de implante), PLDLA-TMC sem o prévio cultivo de células osteoblásticas e PLDLA-TMC previamente cultivado com células alógenas (células provenientes de outros indivíduos da mesma espécie). Para cada tratamento foram utilizados 4 animais que foram submetidos ao procedimento cirúrgico, no qual realizou-se um defeito crítico unilateral sobre a calota craniana. Os ratos foram pesados e submetidos à anestesia geral administrada via intramuscular com uma solução de cloridrato de cetamina 10% (40 mg/kg) mais cloridrato de xilazina 2% (5 mg/kg) por peso corporal.

Após a anestesia, realizou-se a tricotomia da parte dorsal do crânio do rato. Uma incisão de aproximadamente 5 mm foi feita no escalpe do animal, seguindo o trajeto da sutura sagital. A musculatura e o periósteo foram descolados e rebatidos, expondo os ossos parietais. Um defeito ósseo crítico [LEVI et al., 2010; ARONIN et al., 2008] unilateral foi realizado, com o auxílio de uma broca trefina com 5 mm de diâmetro, montada em motor odontológico de baixa rotação elétrico (Beltec), sob irrigação constante com solução fisiológica estéril a fim de evitar superaquecimento das bordas do defeito. Os defeitos foram preenchidos com arcabouços com ou sem células osteoblásticas pré-cultivadas, ou não foram preenchidos (controle). A pele foi reposicionada e suturada em dois planos, seguida de anti-sepsia com solução de iodo-polvedine na região do ferimento (Fig. 1). A Figura 2 evidencia um desenho do crânio do rato visto de cima, com um defeito ósseo no lado direito do osso parietal dorsal, lateralmente a sutura medial.

Finalizado os períodos de 8 e 12 semanas pós-cirúrgicos, os animais foram sacrificados por aprofundamento de anestesia com solução de hidrato de cloral 10% na dose 400 mg/kg, seguida por deslocamento cervical. Uma vez sacrificado, a calvária de cada animal foi removida com o auxílio de uma serra cirúrgica. Em seguida, a mesma foi fixada em paraformaldeido 4%, para análise histológica.

2.7 Processamento do material e preparação das lâminas

O material foi submetido à descalcificação em solução descalcificadora contendo 0,7 g de EDTA tetrassódico, 8 g de tartarato de sódio, 0,14 g de tartarato de sódio e potássio, 120 mL de HCl e 900 mL de água destilada. As amostras foram preparadas para análise histológica de acordo com as técnicas utilizadas para Microscopia de Luz, utilizando-se parafina como meio de inclusão. Foram coradas pelo método H.E. (hematoxilina e eosina) e Tricrômico de Mallory (que cora de laranja forte o osso maduro e tons mais claros, o osso jovem). As lâminas foram analisadas e fotografadas em um microscópio óptico (NIKON – E 800).

Figura 1. Procedimento cirúrgico utilizado para o implante dos arcabouços de PLDLA-TMC. (A) defeito crítico unilateral na calota do animal; (B) implante do arcabouço com e sem célula, de acordo com o grupo tratamento; (C) sutura da mesma pele; (D) comparação entre o arcabouço de PLDLA-TMC produzido (à direira) e o tecido ósseo calvária retirada.

Figura 2. Representação esquemática do defeito crítico unilateral realizado na calota craniana dos ratos Wistar.

Os preparados em parafina foram seccionados com navalhas descartáveis em micrótomo Leica RM 2245 a uma espessura de 4 μm. Para tanto, os blocos de parafina foram colocados no congelador durante 30 minutos. A seguir foram colocados um a um no micrótomo e desbastados até que toda a superfície da amostra tenha sido atingida. As fitas obtidas foram colocadas no banho histológico, e pescados os cortes com o auxílio de lâminas. Então, as lâminas devidamente identificadas foram colocadas em um suporte de madeira para secar. As lâminas com o material histológico foram levadas para a estufa a 60 °C, onde permaneceram durante 15 minutos para aderir à lâmina. Finalizando, as lâminas foram coradas e montadas.

3. RESULTADOS

3.1 Microscopia Eletrônica de Varredura

As imagens obtidas através da microscopia eletrônica de varredura (Fig. 3) mostraram uma morfologia porosa, tanto na superfície dos arcabouços (Fig. 3A e B),

A B

C D

mas principalmente no interior, como observado nas fraturas (Fig. 3C e D). Os poros apresentaram-se com morfologia irregular e dimensões variadas, possuindo os maiores em torno de 250 a 500 µm, enquanto os menores, abaixo de 100 µm. É possível notar que existe interconexão entre os poros a medida em que se aumenta a magnificação, de maneira que os poros mostram-se conectados por outros cada vez menores.

Figura 3. Eletromicrografias de varredura dos arcabouços de PLDLA-TMC. (A e B) superfície do suporte; (C e D) região interior do arcabouço após criofratura. A e C, aumento de 100x; B, 50x; e E, 1000x.

Para a regeneração tecidual óssea é necessário arcabouços porosos tridimensionais e biocompatíveis, a fim de permitir fenômenos como migração celular, vascularização e difusão de nutrientes [DOBLARÉ et al., 2004]. Como pode-se observar na Figura 4, os poros acima de cerca de 200 µm, grandes o suficiente para suportarem invasão celular, possuem microporos que facilitariam a difusão de nutrientes e sub-produtos. Além disso, tal arcabouço tridimensional deve apresentar propriedades físicas, biológicas e mecânicas adequadas, incluindo a topografia da superfície, tamanho, estrutura e interconexão dos poros, com o objetivo de permitir osteogênese e formação de tecido ósseo novo através da totalidade do arcabouço e ao redor do tecido [KARAGEORGIOU & KAPLAN, 2005]. As altas taxas de relação entre superfície e volume é outro impotante fator buscado por favorecer a adesão celular sobre um dispositivo [KE et al., 2010].

Supõem-se que os poros maiores que 250 µm formaram-se graças a grânulos adjacentes de sacarose, visto que a granulometria do porógeno não ultrapassava dessas dimensões.

O método para a obtenção de arcabouços porosos através da evaporação de solventes com posterior lixiviação de partículas tem sido largamente empregado [IDRIS et al., 2010; ODELIUS et al., 2008; MOISENOVICH et al., 2010; SONG et al., 2010; LEE et al., 2010; LIM et al., 2010; WANG et al., 2010, MESSIAS et al., 2009], devido, principalmente, a facilidade no controle da morfologia, estrutura e tamanho dos poros [ZHANG et al., 2005].

3.2 Ensaio de viabilidade celular

De acordo com o teste realizado (Fig. 4) pode-se observar que os arcabouços de PLDLA-TMC sustentaram uma viabilidade menor que a do controle de poliestireno (p < 0,01) em ambos os tempos, embora os valores médios de absorbância do terpolímero medirem 78,5 ± 8,9% em 24 h de cultivo e 78,3 ± 5,5% após 72 h. Um material ou substância é considerado inadequado para o cultivo de determinada célula quando prejudica a viabilidade de forma a reduzir à valores menores que 50% em relação a um controle [ISO 10993-5, 1992]. E, embora uma substância tóxica não afete apenas uma estrutura molecular, mas sim várias funções celulares; considera-se que a imediata medição da atividade mitocondrial pode ser o suficiente para validar a viabilidade das células [LUCCHESI et al., 2008].

Figura 4. Viabilidade das células osteoblásticas sobre os arcabouços de PLDLA-TMC e controle de poliestireno (PS). Os valores de absorbâncias no gráfico foram apresentados na forma de média ± desvio padrão de n = 5 réplicas.

Embora a natureza hidrofóbica dos poliésteres alifáticos, como o PLDLA, favoreça a adsorção inespecífica de proteínas [TRESOHLAVÁ et al., 2010], normalmente acarreta em adesão e espraiamento celulares pobres [YU et al., 2006; QUIRK et al., 2001]. Somado a isso, esse caráter hidrofóbico pode representar um obstáculo importante para a acomodação celular em arcabouços tridimensionais [MANDOLI et al., 2010]. Por causa de sua natureza aquosa, os meios de cultura celular não podem permear espontaneamente os arcabouços de PLA. Além disso, a migração celular é dificultada pelas forças capilares exercidas pela porosidade do arcabouço. Por isso, soluções alternativas devem ser buscadas para conseguir-se a infiltração celular sem métodos de modificações do PLA. A obtenção de arcabouços altamente porosos e com poros interconectados que permitam a mobilidade celular seriam um exemplo de solução para esse obstáculo [MANDOLI et al., 2010].

Entretanto, os resultados demonstram aumento significativo (p < 0,01) de 60,3% na média das absorbâncias dos arcabouços entre 24 e 72 h, sugerindo proliferação celular, uma vez que o MTT é oxidado graças a enzimas mitocondriais e a quantidade de seu produto, o formazan, é proporcional ao número de células.

A B

C D

Devido a tais resultados, foi escolhido o tempo de 72 h de cultivo celular sobre os arcabouços para implantação.

Na regeneração óssea, a Engenharia Tecidual utiliza estruturas tridimensionais de grandes superfícies e alta porosidade como arcabouços, sobre os quais células com propriedades osteogênicas são semeadas e implantadas na área do defeito. Notadamente, o arcabouço mais adequado para Engenharia Tecidual deve atender a requisitos rigorosos. Além da escolha de correta dos materiais é de extrema importância que os mesmos não sejam mutagênicos, antigênicos, carcinogênicos, tóxicos, teratogênicos, possam tolerar a esterilização, possuam elevada da biocompatibilidade com células e tecidos vivos, e as propriedades de macro e microestrutura [LEONG et al., 2003].

3.3 Análise histológica

Foram produzidos defeitos críticos nas calotas cranianas dos ratos e analisados em 8 e 12 semanas. Utilizados, em cada tempo, 4 animais para cada experimento: controle negativo (defeito ausente de implante), PLDLA-TMC sem o prévio cultivo de células osteoblásticas e PLDLA-TMC previamente cultivado com células alógenas. O defeito após sua retirada foi cortado no meio, resultando em duas lâminas, direito e esquerdo.

A análise histológica do grupo controle negativo (Fig. 5) revela que em dois dos quatro casos avaliados não há evidência de formação de tecido ósseo, a não serem algumas espículas solitárias nas bordas, escassas células gigantes de corpo estranho e fibrose desorganizada. Nos outros dois casos avaliados foram observados a formação de tecido ósseo rodeado por fibrose, contendo vasos e sem medula propriamente dita (sem tecido hematopoiético).

Figura 5. Fotomicrografias do grupo controle negativo após 8 semanas: (A e B) Observa-se o não fechamento com tecido ósseo e áreas de fibrose entre as bordas do defeito, HE (A) e Tricrômico de Mallory (B), 20x; (C) Fibrose desorganizada, HE, 200x; (D) Formação de tecido ósseo rodeado por fibrose, escassas células gigantes e alguns vasos sanguíneos, HE, 200x.

A B

C D

Nos implantes de arcabouços de PLDLA-TMC (controle positivo) (Fig. 6), foi observada intensa reação do tipo corpo estranho e discreta neoformação óssea nas bordas, do tipo membranoso, com aspecto basofílico e lamelas distribuídas irregularmente.

Figura 6. Fotomicrografias do grupo com arcabouços de PLDLA-TMC após 8 semanas: (A e B) Observa-se discreta neoformação óssea nas bordas com processo fibrótico na área do tratamento, HE (A) e Tricrômico de Mallory (B), 20x; (C) Região central do tratamento onde é possível observar uma intensa reação do tipo corpo estranho, HE, 200x; (D) Neoformação óssea segmentada por trave de fibrose, HE, 200x.

A observação histológica dos implantes de arcabouços de PLDLA-TMC previamente cultivados com células osteoblásticas (Fig. 7) revela que ocorreu o fechamento parcial do defeito crítico com tecido ósseo compacto evidenciando-se lamelas irregulares e contendo abundantes células de aspecto osteoblástico, o que em algumas áreas sugere neoformação óssea de aspecto cartilaginoso. Dentre as traves de osso jovem há colágeno fibrilar e células osteoprogenitoras. Comparado aos controles positivos, parece haver maior neoformação óssea nas bordas, inclusive com focos de tecido ósseo sem relação com o tecido maduro das bordas do defeito. As trabéculas neoformadas não contêm, entre elas, tecido hematopoiético. Reconhece-se, em todos os casos, área cental rodeada por fibrose, mostrando o tecido de granulação, também com reação giganto celular do tipo corpo estranho, porém os granulomas são menores e mais organizados quando comparado ao grupo controle positivo.

A Figura 8 revela que ocorreu o fechamento parcial do defeito crítico ocasionados no grupo controle negativo, com presença de tecido ósseo maduro nas bordas do defeito, sem a presença de tecido hematopoiético entre as trabéculas. Em apenas um caso, nas bordas do tecido ósseo neoformado evidenciam-se grupos de células osteoblásticas.

A B

C D

A B

C D

Figura 7. Fotomicrografias do grupo com arcabouços de PLDLA-TMC com células após 8 semanas: (A) Observa-se fechamento parcial com tecido ósseo compacto evidenciando lamelas irregulares, HE, 20x; (B) Neoformação óssea distribuida ao por todo o local do tratamento, independentes das bordas, Tricrômico de Mallory, 20x; (C), Presença de neoformação óssea de aspecto cartilaginoso rodeada por colágeno fibrilar e células osteoprogenitoras, HE, 100x; (D) Área central evidenciando fibrose com tecido de granulação e reação giganto ceular do tipo corpo estranho, HE, 200x.

Figura 8. Fotomicrografias do grupo controle negativo após 12 semanas: (A e B) Observa-se o fechamento parcial com osso maduro, HE (A) e Tricrômico de Mallory (B), 20x; (C) Trabéculas irregulares com conteúdo fibroso, sem presença de tecido hematopoiético, HE, 100x; (D) Células osteoblásticas organizadas nas bordas da neoformação óssea, HE, 200x.

A B

C D

A análise histológica dos implantes de arcabouços de PLDLA-TMC (Fig. 9) revela fechamento total em um caso, mostrando persistência da reação giganto celular, porém menos acentuada e mais organizada do que no tempo anterior e a neoformação óssea como que contornando a cápsula formada ao redor do arcabouço. Nos outros casos houve fechamento parcial com formação de osso jovem nas bordas, contendo áreas bem organizadas e outras mais imaturas rodeadas por células progenitoras agrupadas na periferia. Evidenciou-se neoformação óssea tanto do tipo membranosa quanto do tipo endocondral. Há escassos focos de necrose óssea nas bordas.

Figura 9. Fotomicrografias do grupo com arcabouços de PLDLA-TMC após 12 semanas: (A e B) Observa-se fechamento total do defeito com osso neoformado, HE (A) e Tricrômico de Mallory (B), 20x; (C) Região central do tratamento onde é possível observar neoformação óssea tanto membranosa quanto endocondral, HE, 200x; (D) Reação giganto celular com foco de neoformação óssea, HE, 200x.

Na observação histológica dos implantes de arcabouços de PLDLA-TMC previamente cultivados com células osteoblásticas (Fig. 10) ocorreu o fechamento quase total e osso contendo traves de aspecto maduro, rodeadas por osteoblastos e, dentre elas, observam-se feixes colágenos espessos, contendo pequenas células fusiformes além de vasos proliferados. O aspecto é bem característico, porém persiste a inexistência de focos de tecido hematopoiético entre as traves de tecido ósseo neoformado. Mantêm-se as áreas com arcabouço encapsuladas, com reação gigante celular, contornada parcialmente pelo osso neoformado. No entanto, entre os granulomas há feixes de colágeno jovem, semelhantes aos observados entre as traves de tecido ósseo, contendo células pequenas e fusiformes, com aspecto de fibroblastos.

A B

C D

Figura 10. Fotomicrografias do grupo com arcabouços de PLDLA-TMC com células após 12 semanas: (A e B) Observa-se fechamento quase total do defeito, contendo traves de aspecto maduro, HE (A) e Tricrômico de Mallory (B), 20x; (C), Trabéculas com feixes colágenos espessos e células fusiformes, HE, 100x; (D) Osso neoformado, segmentado por trabécula contendo fibroblastos, HE, 200x.

4. DISCUSSÃO

O desafio da engenharia tecidual tem sido o de produzir e desenvolver dispositivos capazes de atuarem na interface com os tecidos receptores no organismo, interagindo com eles [KÖSE et al., 2003; BARBANTI et al., 2005]. Nesse sentido, diversos estudos envolvendo o emprego de materiais poliméricos hidroliticamente degradáveis têm demonstrado resultados promissores quanto à capacidade que os mesmos têm de estimular o processo de reparação tecidual [ESPOSITO et al., 2008; ESPOSITO et al., 2009].

Sabe-se que a boa integração do biomaterial com células ou tecidos está diretamente relacionado à própria estrutura do dispositivo produzido, como a porosidade, que é desenvolvida no intuito de permitir a fixação do implante no local de implantação, ancoramento mecânico do biomaterial no local e promover a proliferação celular e síntese de componentes da matriz extracelular [CIAPETTI et al., 2003; SANTOS JR. et al., 2004]. No entanto, o tamanho, a distribuição uniforme dos poros e suas respectivas interconexões são importantes para facilitar a formação de tecidos na forma de uma rede organizada, tendo grande aplicação na reconstrução tecidual [DECLERCQ et al., 2005].

Schmitz & Hollinger (1986) introduziram o conceito de defeito crítico como sendo o menor tamanho de lesão ocasionada a um tecido, particularmente ósseo, capaz de impedir que a regeneração do mesmo ocorra espontaneamente. No presente estudo, o defeito crítico realizado com 5mm de diâmetro está de acordo com os das literaturas [ZONG et al., 2010; USAS et al., 2009; UMOH et al., 2009] que utilizam roedores como modelo animal.

Em prévios estudos, arcabouços de PLDLA previamente cultivados com células osteoblásticas demonstraram exercer forte influência sobre a regeneração óssea de calotas cranianas de ratos. Defeitos críticos bilaterais de 5 mm de diâmetro apresentaram-se críticos para o grupo controle que não apresentou formação de tecido ósseo [FREIRE et al., 2010]. No entanto, no presente estudo defeitos críticos unilaterais foram realizados com o intuito de minimizar possíveis interferências que defeitos bilaterais possam ter um sobre o outro [LEVI et al., 2010; ARONIN et al., 2008].

O tecido ósseo é formado ou por um processo chamado de ossificação intramembranosa, que ocorre no interior de uma membrana conjuntiva, ou pelo processo de ossificação endocondral. Este último se inicia sobre um molde de cartilagem hialina, que gradualmente é destruído e substituído por tecido ósseo formado a partir de células do conjuntivo adjacente. Tanto na ossificação intramembranosa como na endocondral, o primeiro tecido ósseo formado é do tipo primário. Este é pouco a pouco substituído por tecido secundário ou lamelar. Portanto, durante o crescimento dos ossos podem-se ver, lado a lado, áreas de tecido primário, áreas de reabsorção e áreas de tecido secundário [JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2004].

Em processos de cicatrização óssea relacionados com o implante de materiais estranhos, um grupo especializado de células com diferentes capacidades pode ser encontrado. As primeiras células encontradas no material implantado são os fibroblastos, produtores de colágeno imaturo que é depositado na superfície do implante. Estas células são recrutadas a partir do tecido mesenquimal ao redor do material implantado após a liberação de moléculas de transdução de sinal do osso velho. Estes sinais também são responsáveis pelo início da cascata de formação e reabsorção óssea, no processo de remodelação ósseo [KATJA & RECHENBERG, 2008]. No presente estudo, o cultivo de células osteoblásticas primárias em meio de cultura não osteogênico pode estar associado a uma menor manutenção do fenótipo celular. Alguns autores propõem o uso de fatores de crescimento que propiciem a manutenção do fenótipo celular neste tipo de experimento.

O processo de resposta inflamatória à biomateriais é governado por um grupo de tipos celulares com diferentes habilidades e características. A magnitude e duração do processo inflamatório exercem influência direta sobre a estabilidade e biocompatibilidade dos dispositivos médicos implantáveis [KATJARA et al., 2008].

Diversos estudos têm demonstrado que o implante de biomateriais poliméricos biorreabssovíveis e hidroliticamente degradáveis, pertencentes à família dos poli(α-hidróxi ácidos), em defeitos críticos ósseos estão, frequentemente, associados a uma intensa resposta inflamatória proveniente da taxa de degradação do material, a qual resulta no aumento da concentração local de produtos ácidos [CAI et al., 2007]. No presente estudo, a análise histológica dos implantes de arcabouços de PLDLA-TMC e PLDLA-TMC previamente cultivados com células osteoblásticas revelam a presença e diminuição da mesma nos tempos de 8 e 12 semanas de implante. Resultado semelhante também foi relatado por Ekholm et al. (1999). Além disso, os suportes oclusivos propiciaram a regeneração parcial e/ou total dos defeitos sem provocar fenômenos de rejeição, tampouco toxicidade aos organismos. A regeneração a partir das bordas encontrada na análise histológica dos defeitos controle se mostrou bastante reduzida quando comparada à dos tratamentos. A presença de macrófagos e células gigantes incluindo o desenvolvimento de algum tecido de granulação já era considerada uma resposta normal. Para os materiais degradáveis a ação dessas células é necessária, caso contrário haveria a formação de uma espessa cápsula fibrosa em torno do material, gerando diversas consequências negativas [KATJA & RECHENBERG, 2008].

Esse tipo de resposta inflamatória acontece sempre que partículas não digeríveis e suficientemente grandes para impedir a fagocitose por um único macrófago são rodeadas por tecido de granulação, com macrófagos e células gigantes que envolvem e encapsulam os antígenos [ISHAUG-RILEY et al., 1999], neste caso o copolímero PLDLA-TMC.

Para os materiais permanentes, macrófagos e células gigantes são responsáveis pela remoção de resíduos de desgaste que, mesmo no melhor dos casos, não pode ser evitado completamente. No entanto, um material que permanece relativamente estável e não altere o tecido circunvizinho, junto a uma baixa quantidade de partículas de desgaste não induzirão uma resposta do tipo corpo estranho e não haverá rejeição do implante [KATJA & RECHENBERG, 2008].

5. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos a partir da análise histológica demonstram que os implantes de arcabouços de PLDLA-TMC puro e previamente cultivados com células osteoblásticas apresentaram adequada biocompatibilidade e foram capazes de estimular maior regeneração óssea nos defeitos críticos ocasionados na calota craniana de ratos após os tempos de 8 e 12 semanas em relação ao grupo que não recebeu tratamento. Este resultado sugere a necessidade de um estudo mais detalhado da aplicação do terpolímero, com tempos de tratamento maiores, bem como o potencial de sua aplicação na engenharia tecidual e medicina regenerativa.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Pesquisadora Claudenete Leal do Laboratório de Microscopia Eletrônica da FEM/UNICAMP.

REFERÊNCIAS

Aronin, C.E.P., Sadik, K.W., Lay, A.L., Rion, D.B., Tholpady, S.S., Ogle, R.C. e Botchwey, E.A. (2008), “Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds”, J. Biomed. Mater. Res. A, vol 89, 632-641.Barbanti, S.H., Zavaglia, C.A.C. e Duek, E.A.R. (2005), “Polímeros bioreabsorvíveis na engenharia de tecidos”, Polímeros, vol 15, 13-21.Barrows, T.H. (1986), “Degradable implant materials: A review of synthetic Absorbable Polymer and their applications”, Clin. Mat., vol 1, 233-257. Bergsma, J.E., Bruijn, W.C., Rozema, F.R., Bos, R.R. e Boering, G. (1995), “Late degradation tissue response to poly(L-lactide) bone plates and screws”, Biomaterials, vol 16, 25-31.Bessho, K., Iizuka, T. e Murakami, K. (1997), “A bioabsorbable poly-L-lactide miniplate and screw system for osteosynthesis in oral and maxillofacial surgery”, J. Oral Maxillofac. Surg., vol 55, 941-945.Buser, D., Dahlin, C. e Shenk, R.K. (1996), “Regeneração óssea guiada na implantodontia”, São Paulo, Quintessence.Cai, K, Yao, K, Yang, Z, Qu, Y e Li, X. (2007), “Histological study of surface modified three dimensional poly(D,L-lactic acid) scaffolds with chitosan in vivo”, J. Mater. Sci. Mater. Med., vol 18, 2017-2024.Ciapetti, G., Ambrosio, L., Savarino, L., Granchi, D., Cenni, E., Baldini, N., Pagani, S., Guizzardi, S., Causa, F. e Giunti, A. (2003), “Osteoblast growth and function in porous poly ε-caprolactone matrices for bone repair: a preliminary study”, Biomaterials, vol 24, 3815-3824.Declercq, H.A., Verbeeck, R.M.H., De Ridder, L.I.F.J.M., Schacht, E.H. e Cornelissen, M.J. (2005), “Calcification as an indicator of osteocoindutive capacity of biomaterials in osteoblastic cells cultures”, Biomaterials, vol 26, 4964-4974.

Doblaré, M., García, J.M. e Gómez, M.J. (2004), “Modelling bone tissue fracture and healing: A review”, Eng. Fract. Mec., vol 71, 1809-1840.Duek, E.A.R., Zavaglia, C.A.C., Belangero, W.D. (1999), “In vitro study of poly(lactic acid) pin degradation”, Polymer, vol 40, 6465-6473.Ekholm, M., Hitanen, J., Lindqvist, C., Rautavarori, J., Santavirta, S. e Suuronen, R. (1999), “Histological study of tissue reactions to ε-caprolactone-lactide copolymer in paste form”, Biomaterials, vol 20, 1257-1262.Esposito, A.R., Aragones A. e Duek, E.A.R. (2009), “Cellular behaviour of knee meniscal fibrochondrocytes-like cells culture on PLGA and PLDLA scaffolds”. In: Internacional Conference on Tissue Engineering (ICTE), Leiria, Proceedings of Internacional Conference on Tissue Engineering. Lisboa: IST Press, vol 1, 131-138.Esposito, A.R., Mas, B.A., Messias, A.D., Aragones, A. e Duek, E.A.R. (2008), “Cultura de Fibrocondrocitos sobre Arcabouços de PLDLA”. In: Congresso Brasileiro de Engenharia e Ciências dos Materiais, Porto de Galinhas: Anais do 18° CBeCiMat.Freire, D.C.L., Mas, B.A., Messias, A.D., Aragones, A, Barbo, M.L.P. e Duek, E.A.R. (2010), “Implante de arcabouços de PLDLA poli(L-co-D,L-ácido lático), previamente cultivados com osteoblastos, em calota craniana de ratos”, 6º Congresso Latino Americano de Órgãos Artificiais (COLAOB 2010), Gramado, Brasil.Góes, A.M., Lopes, M.T.P., Mara, R.M.T. e Salas, C.E. (2006), “Teste in vitro com biomateriais e citotecnia”. 285-297. In: Biomateriais: fundamentos e aplicações. Rio de Janeiro, Cultura Médica.Goraltchouk, A., Freier T. E Shoichet, M.S. (2005), “Synthesis of degradable poly(L-lactide-co-ethylene glycol) porous tubes by liquid-liquid centrifugal casting for use as nerve guidance channels”, Biomaterials, vol 26, 7555-7563.Idris, S.B., Arvidson, K., Plikk, P., Ibrahim, S., Finne-Wistrand, A, Albertsson, A.C., Bolstad, A.I. e Mustafa, K. (2010), “Polyester copolymer scaffolds enhance expression of bone markers in osteoblast-like cells”, J. Biomed. Mater. Res. A, v. 94A, 631-639.Ishaug-Riley, S.L., Okun, L.E., Prado, G., Applegate, M.A. e Ratcliffe, A.A. (1999), “Human Articular Chondrocyte Adhesion and Proliferation on Synthetic Biodegradable Polymer Films”, Biomaterials, vol 20, 2245-2256.ISO 10993-5, “(E) Biological Evaluation of Medical Devices – Part 5 – Tests for cytotoxicity: In vitro Methods”, 1992.Junqueira, L.C. e Carneiro, J. (2004), “Histologia Básica”, 10. ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 138.Karageorgiou, V. e Kaplan, D. (2005), “Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis”, Biomaterials, vol 26, 5474-5491.Katja, M.R. e von Rechenberg, B.V. (2008), “Biocompatibility Issues with Modern Implants in Bone - A Review for Clinical Orthopedics”, Open Orthop. J., vol 2, 66-78.Ke, Y., Wang, Y.J., Ren, L., Zhao, Q.C. e Huang, W. (2010), “Modified PHBV scaffolds by in situ UV polymerization: Structural characteristic, mechanical properties and bone mesenchymal stem cell compatibility”, Acta Biomater., vol 6, 1329-1336.Köse, G.T., Ber, S., Korkusuz, F. e Hasirci, V. (2003), “Poly(3-hydroxybutyric acid-co-3-ydroxyvaleric acid) based tissue engineering matrices”, J. Mater. Sci. Mater. Med., vol 14, 121-126.Lee, J.H., Oh, J.H., Lee, J.H., Kim, M.R. e Min, C.K. (2010), “Evaluation of in vitro spermatogenesis using poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA)-based macroporous biodegradable scaffolds”, J. Tissue Eng. Regen. Med., vol 5, 130-137.Leong, K.F., Cheah, C.M. e Chua, C.K. (2003), “Solid freeform fabrication of three-dimensional scaffolds for engineering replacement tissues and organs”, Biomaterials, vol 24, 2363-2378.Levi, B., James, A.W., Nelson, E.R., Vistnes, D., Wu, B., Lee, M., Grupta, A. e Longaker, M.T. (2010), “Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects”, Plos. One, vol 5, 11177.Lim, J.I., Lee, Y.K., Shin, J.S. e Lim, K.J. (2010), “Preparation of interconnected porous chitosan scaffolds by sodium acetate particulate leaching”. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., in print.Lombello, C.B., Santos Jr, A.R., Malmonge, S.M., Barbanti, S.H., Wada, M.L.F. e Duek, E.A.R. (2002), “Adhesion and morphology of fibroblastic cells cultured on different polymeric biomaterials”, J. Mater. Sci. Mater. Med., vol 13, 867-874.Lucchesi, C., Ferreira, B.M.P., Duek, E.A.R., Santos Jr., A.R. e Joazeiro, P.P. (2008), “Increased response of Vero cells to PHBV matrices treated by plasma”, J. Mater. Sci. Mater. Med., vol 19, 635-643.Luciano, R.M., Zavaglia, C.A.C. e Duek, E.A.R. (2000), “Preparation of bioabsorbable nerve guide tubes. Artificial Organs, vol 24, 206-208.

Mandoli, C., Mecheri, B., Forte, G., Pagliari, F., Pagliari, S., Carotenuto, F., Fiaccavento, R., Rinaldi, A., Di Nardo, P., Licoccia, S. e Traversa, E. (2010), “Thick soft tissue reconstruction on highly perfusive biodegradable scaffolds”. Macromol. Biosci., vol 10, 127-138.Messias, A.D., Aragones, A. e Duek, E.A. (2009), “PLGA-hydroxyapatite composite scaffolds for osteoblastic-like cells”, Key Engineering Materials, vol 396-398, 461-464.Moisenovich, M.M., Pustovalova, O.L., Yu Arhipova, A., Vasiljeva, T.V., Sokolova, O.S., Bogush, V.G., Debabov, V.G., Sevastianov, V.I., Kirpichnikov, M.P. e Agapov, I.I. (2010), “In vitro and in vivo biocompatibility studies of a recombinant analogue of spidroin 1 scaffolds”, J. Biomed. Mater. Res. A, vol 96, 125-131.Odelius, K., Plikk, P. e Albertsson, A.C. (2008), “The influence of composition of porous copolyester scaffolds on reactions induced by irradiation sterilization”, Biomaterials, vol 29, 129-140.Orefice, R.L., Pereira, M.M. e Mansur, H.S. (2006), “Biomateriais: fundamentos e aplicações”, 1ª ed., Rio de Janeiro, Cultura Médica.Pêgo, A.P., Poot, A.A., Grijpma, D.W. e Feijen, J. (2003), “Physical properties of high molecular weight 1,3-trimethylene carbonate and D,L-lactide copolymers”, J. Mater. Sci. Mater. Med., vol 14, 767-773.Quirk, R.A., Chan, W.C., Davies, M.C., Tendler, S.J.B. e Shakesheff, K.M. (2001), “Poly(L-lysine)-GRGDS as a biomimetic surface modifier for poly(lactic acid)”. Biomaterials, vol 22, 865-872.Rokkanen, P., Bostman, O., Vainionpaa, S., Makela, E.A., Hirvensalo, E., Partio, E.K, Vihtonen, K., Patiala, H. e Tormala, P. (1996), “Absorbable devices in the fixation of fractures”, J. Trauma, vol 40, 123-127, 1996.Santos, Jr. A.R., Ferreira, B.M.P., Duek, E.A.R., Dolder, H., Wada, R.S. e Wada, M.L.F. (2004), “Differentiation Patter of Vero Cells Cultured on Poly(L-lactic a poly(Hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) Blends”, Artif. Organs, vol 28, 381-389.Song, Y., Wennink, J.W., Kamphuis, M.M., Sterk, L.M., Vermes, I., Poot, A.A., Feijen, J. e Grijpma, D.W. (2010), “Dynamic culturing of smooth muscle cells in tubular poly(trimethylene carbonate) scaffolds for vascular tissue engineering”, Tissue Eng. Part A, vol 17, 381-387.Spiekermann, H. (1995), “Impantology”, New York, Thieme Medical Publishers.Tresohlavá, E., Popelka, S., Machová, L., Rypácek, F. (2010), “Modification of polylactide surfaces with lactide-ethylene oxide functional block copolymers: accessibility of functional groups”, Biomacromol., vol 11, 68-75.Tsuji, H., Horii, F., Hyon, S.H. e Ikada, Y. (1991), “Stereocomplex formation between enatiomeric poly(lactic acid)s. 2. Stereocomplex formation in concentrated solutions”, Macromolecules, vol 24, 2719-2724.Umoh, J.U., Sampaio, A.V., Welch, I., Pitelka, V., Goldberg, H.A., Underhill, T.M. e Holdsworth, D.W. (2009), “In vivo micro-CT analusis of bone remodeling in a rat calvarial defect model”, Phys. Med. Biol., vol 54, 2147-2161.Usas, A., Ho, A.N., Cooper, G.M., Olshanski, A., Peng, H. e Huard, J. (2009), “Bone Regeneration Mediated by BMP4-Expressing Muscle-Derived Stem Cells is Affected by Delivery System”, Tissue Eng. Part A, vol 15, 285-293.Wang, Y., Bella, E., Lee, C.S., Migliaresi, C, Pelcastre, L., Schwartz, Z., Boyan, B.D. e Motta, A. (2010), “The synergistic effects of 3-D porous silk fibroin matrix scaffold properties and hydrodynamic environment in cartilage tissue regeneration”, Biomaterials, vol 31, 4672-4681.Wang, Y., Bella, E., Lee, C.S., Migliaresi, C., Pelcastre, L., Schwartz, Z., Boyan, B.D. e Motta, A. (2010), “The synergistic effects of 3-D porous silk fibroin matrix scaffold properties and hydrodynamic environment in cartilage tissue regeneration”, Biomaterials, vol 31, 4672-4681.Yu, G., Ji, J., Zhu, H. e Shen, J. (2006), “Poly(D,L-lactic acid)-block-(ligand-tethered poly(ethylene glycol)) copolymers as surface additives for promoting chondrocyte attachment and growth”, J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater., vol 76B, 64-75.Zhang, J., Wu, L., Jing, D. e Ding, J. (2005), “A comparative study of porous scaffolds with cubic and spherical macropores”, Polymer, vol 46, 4979-4985.Zong, C., Xue, D., Yuan, W., Wang, W., Shen, D., Tong X., Shi, D., Liu, L., Zheng, Q., Gao, C. e Wang, J. (2010), “Reconstruction of Rat Calvarial Defects with Human Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast-Like Cells in Poli-Latic-Co-Glycolic Acid Scaffolds”, Eur. Cell Mater., vol 20, 109-120.Zoppi, R.A., Constant, S., Duek, E.A.R., Marques, F.R., Wada, M.L.F. e Nunes, S.P. (1999), “Porous poly (L-lactide) films obtained by immersion precipitation process: morphology, phase separation and culture of VERO cells”, Polymer, vol 40, 3275-3289.

PLDLA-TMC BIOMATERIAL FOR BONE TISSUE ENGINEERING

Diego D. Leonato1, André D. Messias2, Adriana C. Motta1, Marlon Moda1, Bruna A. Más2, Silvia M. M. Cattani1, Maria L. P. Barbo1, Eliana A. R. Duek1,2

1Laboratory of Biomaterials, Faculty of Medical and Health Science, Pontifical Catholic University of São Paulo, Sorocaba (SP), Brazil

2Departament of Material Engineering, University of Campinas, Campinas (SP), BrazilE-mail: andre_messias@ymail.com

Abstract. The copolymerization is the most common techniques in order to obtain properties suitable for a specific application. The biological study of these materials is necessary to qualify them as safe for use in implants. The objective of this study was to evaluate the use of scaffolds of poly (L-co-D,L lactide-co-trimethylene carbonate) PLDLA-TMC as a biomaterial for bone tissue engineering. Thus, three-dimensional porous scaffolds of PLDLA-TMC were applied for the regeneration of bone defects in rats. Osteoblastic cells isolated from calvaria of Wistar rats were seeded on these scaffolds, which were maintained in culture conditions in vitro for 72 h. Unilateral critical defects 5 mm in diameter were produced in the right parietal bone of Wistar rats, which were treated with PLDLA-TMC scaffolds or PLDLA-TMC scaffolds with allograft osteoblastic. In a third group, considered as a control, the defect was not treated. After 8 and 12 weeks the implants were analyzed histologically with hematoxylin and eosin and Mallory's trichrome stains. The results demonstrate the presence of bone formation not only in the peripheral regions of the defects, but also in central regions, unlike the control in which bone tissue formation occurred only at the periphery. The in vitro allograft cells did not affect the regeneration of bone tissue. It is concluded that the scaffolds of PLDLA-TMC showed adequate biocompatibility and favored the regeneration of bone tissue, showing potential application in bone tissue engineering.

Keywords: PLDLA-TMC, Tissue engineering, Bone regeneration.