UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁPRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período: agosto / 2014 a julho / 2015( ) PARCIAL( X ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Análise funcional de elementos cis-regulatórios do celacanto (Latimeria chalumnae) para o estudo da regulação de genes hoxd e evolução do autopódio em tetrápodes.

Nome do Orientador: Igor Schneider

Titulação do Orientador: DOUTOR

Faculdade: FACULDADE DE BIOTECNOLOGIA

Unidade: ICB

Laboratório: LABORATÓRIO DE EVOLUÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE VERTEBRADOS (LEDVERT)

Título do Plano de Trabalho: Estabelecimento de protocolo de Fertilização in vitro e descrição dos estádios de desenvolvimento embrionário do peixe sarcopterígio Lepidosiren paradoxa.

Nome do Bolsista: RODRIGO NOBRE MOREIRA

Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq( ) PIBIC/UFPA( ) PIBIC/INTERIOR( ) PIBIC/FAPESPA( ) PARD( ) PARD - renovação( ) PIBIC/PIAD( ) PIBIC/AF( ) PADRC

INTRODUÇÃO

A manipulação ambiental e hormonal da ovulação em peixes é de muita importância, principalmente por resolver os problemas de assincronia na desova das matrizes (Crim, L.W. e B.D. Glebe, 1984) e poder acelerar ou desacelerar a gametogênese para obtenção de ovos de alta qualidade (Lam, T.J, 1983). O uso de hormônios exógenos é uma maneira efetiva de induzir a maturação reprodutiva e produzir ovos fertilizados (Mylonas, C.C., A. Fostier and S. Zanuy, 2009).

Originalmente culturistas utilizavam extrato de hipófise de carpa para induzir a reprodução de peixes, e ainda hoje esse extrato ainda é bastante utilizado (Park, I.S., H.B. Kim., et al, 1994). Outro hormônio muito utilizado na reprodução de varias espécies de peixes é o HCG (gonadotrofina coriônica humana) (Kelly, A.M. and C.C. Kohler, 1994).

A utilização dos hormônios liberadores de gonadotrofinas (GnRH) para a indução a desova de peixes vem sendo utilizada com sucesso desde 1975 (Donaldson e Hunter, 1983). Esses hormônios são muito semelhantes entre os vertebrados superiores e inferiores, havendo pequenas alterações na estrutura molecular do decapeptídeo. Por essa razão, o hormônio liberador de gonadotrofina de mamífero e os seus análogos são efetivos para induzir a desova de várias espécies de peixes. Como se trata de uma molécula pequena e simples, a síntese desse hormônio foi possível, abrindo possibilidade para alteração da estrutura molecular e a síntese de análogos, possibilitando a produção de hormônios 50 a 100 vezes mais potentes (Harvey e Carolsfeld, 1993).

Três grandes vantagens destes hormônios liberadores são verificadas sobre a gonadotrofina na indução a maturação final e desova dos peixes. A primeira é que atuam no início da cadeia hormonal e estimulam o peixe a sintetizar a sua própria gonadotrofina, eliminando assim os problemas relacionados a utilização de gonadotrofina de outras espécies. A segunda é que a molécula não é altamente espécie-específica. Por último, são estruturas simples e facilmente fabricadas, apresentam grande estabilidade estrutural, são efetivas com pequenas dosagens de aplicação e o seu uso é economicamente vantajoso (Harvey e Carolsfeld, 1993).

Já foi possível a reprodução em cativeiro de varias espécies de peixes em que imitar o seu ambiente natural é quase impossível.

A piramboia (Lepidosiren paradoxa), peixe pulmonado sul americano, encontrado no rio Amazonas e nos sistemas do rio Paraná-Paraguai. Vive em aguas calmas como pântanos ou lagos que estão associados a vegetação e condições de pouco oxigênio (Lowe-McConnell, R.H, 1987).

A piramboia possui reprodução externa e se reproduz sazonalmente durante a época chuvosa. Pouco se sabe sobre os hábitos reprodutivos desse peixe além de que os machos cavam ninhos na lama e cuidam dos ovos e dos juvenis (Kerr, 1900).

A piramboia não apresenta nenhum valor comercial, entretanto, possui um valor inestimável para a ciência. Analises filogenéticas e em geral a maioria das evidências moleculares e morfológicas mostra que os peixes pulmonados são o grupo vivo mais próximo dos tetrápodes (Meyer; Zardoia, 2003). Sendo assim um dos mais importantes vertebrados vivos para se estudar a transição evolucionaria da água para terra (Almeida-Val; Nozawa, 2010).

JUSTIFICATIVA

O estudo comparativo do desenvolvimento de nadadeiras de peixes e membros de tetrápodes seria grandemente beneficiado pela existência de recursos genéticos e embriológicos de um organismo modelo de peixe sarcopterígio, que representa o grupo irmão dos tetrápodes. Neste projeto, propomos estabelecer um protocolo de produção de embriões do peixe sarcopterígio Lepidosiren paradoxa, popularmente conhecido como piramboia, a fim de viabilizar o estudo da genética do desenvolvimento embrionário deste peixe, que pode ajudar no entendimento da evolução de importantes adaptações à vida terrestre como pulmões e membros.

OBJETIVOS

Objetivo Geral

Produção de embriões de Lepidosiren paradoxa

Objetivos Específicos

Estabelecimento de protocolo de fertilização in vitro.

Descrição dos estágios de desenvolvimento.

MATERIAS E MÉTODOS

COLETA DE ESPÉCIMES

O local da coleta foi na cidade de Breves na ilha do Marajó que fica à 12 horas de navio saindo de Belém. A coleta foi feita nas épocas chuvosas, e nas épocas de seca. Os animais foram capturados utilizando anzol e linha nos alagados que ficam embaixo da casa dos moradores da rua bagre. As piramboias ficaram mantidas em tanques de 300 litros e foram alimentadas com pedaços de peixe, moluscos e camarão.

ANESTÉSICO

O anestésico utilizado foi a tricaína metano sulfonato, onde foi diluído 3 gramas de tricaína em 3 litros de agua para que fique na concentração de 1g/L. A anestesia foi utilizada na hora da injeção do hormônio e da extrusão, para evitar causar muito estresse no animal.

HORMÔNIO

Ovaprim

Análogos de GnRH junto com antagonistas de dopamina são opções mais seguras pois apresentam custo reduzido e estimulam uma menor resposta imune nos reprodutores. O produto usado será o Ovaprim (Syndel Laboratories Ltd) que contém um análogo de GnRH de salmão (sGnRHa) e um inibidor de dopamina (Doparimedona). O GnRH no Ovaprim induz a liberação dos hormônios gonadotróficos armazenados na hipófise. O inibidor de dopamina serve para remover qualquer outra inibição da liberação e efeito do GnRH. O resultado de usar Ovaprim é uma alta liberação de hormônios da hipófise que induz a maturação final dos gametas por meio dos hormônios esteroides gonadais.

A aplicação foi intraperitoneal nas concentrações de 1 ml/kg tanto nos machos quanto nas fêmeas. .

EXTRUSÃO

Após as aplicações do hormônio as fêmeas foram levadas para uma bacia com uma esponja para evitar que elas se machuquem. Assim foi pressionado o abdômen da fêmea no sentido do orifício genital. Os ovócitos seriam amparados por uma bacia menor. O mesmo procedimento é feito com os machos, e o esperma cai por cima dos ovócitos.

FERTILIZAÇÃO

Ovócitos e espermatozoides seriam retirados dos peixes, sem contato com a água, misturados e somente depois é adicionada a solução de ativação para que ocorra a ativação dos espermatozoides. Este procedimento é chamado de fertilização a seco, pois os gametas são misturados antes da adição da solução de ativação. Ele possibilita a vantagem de ampliar o tempo para o manejo dos gametas, permitindo assim, a separação e a quantificação da desova nas porções a serem estocadas em distintas incubadoras, além de aumentar a taxa de fertilização (Zaniboni Filho e Weingartner, 2007).

Seriam testados volumes de solução de ativação entre três a cinco vezes o volume de ovócitos. Decorridos 30 a 40 segundos do inicio da mistura

seria adicionado um volume aproximado de cinco vezes o volume inicial para garantir uma elevada taxa de fecundação (Weingartner e Zaniboni Filho, 2005).

MEIO MMR (MARC’S MODIFIED RINGER’S)

O meio MMR é utilizado para evitar a ativação precoce dos gametas em peixes e sapos. Pode ser utilizado também em uma concentração menor para melhorar as taxas de fertilização.

MMR (10X, pH 7,4): para 1 l;

NaCl: 58,440g;

KCL: 1,49g;

MgSO4: 1,204g;

CaCl2: 2,940g;

HEPES: 11,915g;

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram feitos dois experimentos utilizando o Ovaprim para indução hormonal nas piramboias coletadas na época de seca no mês de Outubro, fora do seu período reprodutivo natural. Os experimentos foram feitos uma semana após a coleta.

As piramboias foram divididas em dois grupos, onde um grupo de piramboias ficou em tanques separados e outro grupo em casais, onde cada casal ficava em um tanque, para testar se pode existir alguma diferença na ação do Ovaprim. A distinção entre macho e fêmea para formação dos casais é devido os machos apresentarem filamentos nas nadadeiras pélvicas, que são ausentes nas fêmeas.

Foram testados dois tempos de extrusão no grupo I, um tempo de 24h e 48h após a aplicação do Ovaprim, sincronizado com o tempo das fêmeas de 72h.

No grupo II o tempo de extrusão foi de 48h para os machos e 72h para as fêmeas.

No grupo I foram injetadas oito piramboias, sendo cinco machos e três fêmeas em tanques separados (tabela 1). Ao fim do experimento, não houve liberação de gametas quando realizada a extrusão nos machos e nas fêmeas.

Tabela 1: Dados do grupo I.Animal Sexo Peso

(Kg)Quantidade

(ml)Tempo de

Extrusão (h)Concentração

de Ovaprim (ml/kg)

LP-15 M 1,980 1,98 24 1LP-12 M 1,465 1,47 24 1LP-13 M 1,765 1,77 24 1LP-14 M 2,420 2,42 48 1LP-16 M 2,155 2,16 48 1LP-21 F 5,140 5,14 72 1LP-06 F 2,730 2,73 72 1LP-08 F 2,175 2,18 72 1

No grupo II foram formados três casais e colocados um casal em cada tanque (tabela 2)

Tabela 2: Dados do grupo II.

Animal Sexo Casal

Peso (Kg)

Quantidade (ml)

Tempo de Extrusão (h)

Concentração de Ovaprim

(ml/kg)LP-03 F 1 2,500 2,5 72 1LP-05 M 1 2,020 2 48 1LP-02 F 2 2,550 2,5 72 1LP-07 M 2 1,487 1,5 48 1LP-20 F 3 2,300 2,3 72 1LP-17 M 3 1,889 1,9 48 1

Assim como no grupo I, não houve liberação de gametas quando feita a extrusão tanto nos machos quanto nas fêmeas.

As piramboias coletadas no período chuvoso foram divididas em dois grupos, onde um grupo ficou em tanques separados e o outro foi colocado em 4 piscinas de 1000L, cada uma contendo 1 casal.

O tempo de extrusão foi de 72h para as fêmeas e 48h para os machos, sincronizado como tempo da extrusão das fêmeas.

No grupo com piramboias em tanques separados, foi utilizado 4 piramboias 2 machos e 2 fêmeas (tabela 3).

Animal Sexo Peso (Kg)

Quantidade (ml)

Tempo de Extrusão (h)

Concentração de Ovaprim

(ml/kg)LP-22 F 2,000 2 72 1LP-23 M 1,830 1,83 48 1LP-24 F 2,425 2,45 72 1LP-25 M 1,529 1,5 48 1

Tabela 3: Dados do grupo em tanques individuais.

No grupo que foi colocado nas piscinas foram utilizados 8 piramboias (tabela 4).

Tabela 4: Dados do grupo em casais.

Animal Sexo Casal

Peso (Kg)

Quantidade (ml)

Tempo de Extrusão (h)

Concentração de Ovaprim

(ml/kg)LP-26 F 1 2,300 2,3 72 1LP-27 M 1 2,000 2 48 1LP-28 F 2 2,600 2,6 72 1LP-29 M 2 1,684 1,7 48 1LP-30 F 3 1,745 1,7 72 1LP-31 M 3 1,435 1,4 48 1LP-32 F 4 2,115 2,1 72 1LP-33 M 4 1,620 1,6 48 1

Em nenhum dos grupos houve a liberação dos gametas esperada, apenas uma piramboia (LP-24) do experimento com animais coletados na época chuvosa que estava em um tanque individual liberou uma pequena quantidade de ovócitos na agua antes da extrusão (Fig. 1), foi tentada a extrusão após, mas sem sucesso.

Quatro piramboias (2 machos e 2 fêmeas) previamente injetadas com Ovaprim, foram sacrificadas para uma tentativa de coletar os gametas e colocar em meio MMR (1X) para evitar a ativação dos espermatozoides ou dos ovócitos ate o momento de serem colocados juntos. Os gametas foram colocados juntos em meio MMR (0,1X) e ficaram em uma estufa há 28ºC. Entretanto não houve fertilização.

Figura 1: Ovos coletados do tanque da piramboia LP-24.

Os tempos de extrusão (24h e 48h para os machos e 72h para fême) e a quantidade de Ovaprim injetada (1ml/kg em machos e fêmeas) nesses experimentos foram baseados em trabalhos passados onde eu testei diferentes concentrações e tempos de extrusão e obtive resultados melhores com esses parâmetros. Foi possível obter ovócitos e espermatozoides como mostrado nas figuras 2 e 3. Entretanto o numero de animais utilizados foi pequeno para afirmar os efeitos do Ovaprim.

Fig. 2: Ovócitos coletados do tanque.

Fig. 3: Espermatozoides de piramboia do sêmen coletado vistos no microscópio.

Outros hormônios como HCG e Hipofise de Carpa foram injetados nas piramboias, esses hormônios são muito comuns de serem usados na piscicultura, entretanto nas piramboias ele causou uma resposta imune muito forte.

Outro ponto que pode ter influenciado é que logo após a vitelogênese a atividade ovariana se torna mais reduzida e permanece em sintonia com a adequação das condições ambientais, garantindo assim, que a liberação dos ovócitos coincida com o período em que as características ambientais estejam mais adequadas, isso é chamado período de dormência. Esse período é muito afetado pelas condições em que os reprodutores são mantidos, tais como: qualidade de água, alimentação e a frequência de manejo. Caso as condições ambientais não tenham desencadeado a maturação final e a desova posterior, tem início o processo de atresia folicular ou reabsorção celular, seguido pelo rearranjo gonadal (Vazzoler, 1996). O estresse da captura e do transporte pode ter desencadeado esse processo fazendo com que Ovaprim não tivesse mais efeito.

CONCLUSÃO

A aquisição de gametas por indução hormonal da desova e espermiação com Ovaprim não surtiu efeito esperado tanto no grupo que estava com os animais separados quanto no grupo que estava com os animais em casais nos períodos de seca e chuvoso. Novos hormônios serão explorados em experimentos futuros na tentativa de obtenção de embriões.

O Ovaprim aparenta ter um efeito na maturação e liberação dos gametas, porem é necessário mais testes com doses e tempos diferentes além de para encontrar os valores corretos que levem a uma indução mais potente. Outro ponto são os corretos parâmetros da agua dos reprodutores e a diminuição do estresse causado nos animais para evitar atresia folicular.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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spermiation. Fish physiology. New York: Academic Press, 1983. v.9, pt.B,

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IDRC, 1993. p.144.

KELLY, A.M. AND C.C. KOHLER. Human chorionic gonadotropin injected in

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espermatogênese de Lepidosiren paradoxa (Pisces, Dipnoi) na Amazônia. Rev.

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MEYER AND R. ZARDOYA. Recent advances in the (molecular) phylogeny of

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MYLONAS, C.C., A. FOSTIER AND S. ZANUY. Broodstock management and

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PARK, I.S., H.B. KIM, H.J. CHOI, Y.D. LEE AND H.W. KANG. Artificial

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VAZZOLER, A. E. A. Biologia da reprodução de peixes teleósteos: teoria e

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WEINGARTNER M, ZANIBONI-FILHO E. DOURADO In: Baldisserotto B,

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ZANIBONI FILHO E WEINGARTNER. Técnicas de indução da reprodução de

peixes migradores. Rev. Brasileira Reprodução Animal 2007, v.31, n.3, p.367-

373.

DIFICULDADESA principal dificuldade é a obtenção dos animais.

PARECER DO ORIENTADOR:

Este foi um projeto exploratório de considerável risco de insucesso. O progresso obtido pode ser considerado satisfatório, tendo em vista que muito pouco se sabe sobre a reprodução deste peixe. O aluno desenvolveu o projeto com independência e iniciativa e os resultados obtidos refletem o empenho da aluna neste projeto.

INFORMAÇÕES ADICIONAIS:

DATA: ______/_________/________

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ASSINATURA DO ORIENTADOR

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ASSINATURA DO ALUNO