PREPARAÇÃO DE NANOFIBRAS DE ACETATO DE CELULOSE NA

PRESENÇA DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA PRODUZIDAS POR

ELETROFIAÇÃO

K. Segala1, S. V. G. Nista1, L. A. Steffen1, A. S. F. Silva1,2,

E. F. Martinez2, L. H. Innocentini Mei1

1Departamento de Engenharia de Materiais e Bioprocessos (DEMBio), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas (SP), Brasil

2Instituto e Centro de Pesquisas São Leopoldo Mandic, Campinas (SP), BrasilE-mail: ksegala@feq.unicamp.br

Resumo. A aplicação potencial de nanofibras biopoliméricas, nos últimos anos, tem atraído a atenção de muitos pesquisadores por serem biocompatíveis e biodegradáveis, apresentarem baixa toxicidade, propriedades antioxidantes e antimicrobianas quando funcionalizadas. Dentre os vários polissacarídeos eletrofiados, o acetato de celulose (AC) se mostra bastante interessante por ser um dos ésteres de celulose mais produzidos atualmente, com baixo custo e possibilidade de solubilização em vários solventes. Este trabalho teve como objetivo estudar a preparação de membranas nanoestruturadas de AC, na ausência e presença de nanopartículas de prata (NPs de Ag), usando o processo de eletrofiação, visando à obtenção de nanofibras com propriedades antissépticas. A incorporação das NPs de Ag nas nanofibras de AC foi feita seguindo diferentes metodologias de síntese. A dimensão nanométrica das partículas de Ag foi monitorada por UV-vis e confirmada por microscopia eletrônica de transmissão (MET); enquanto que a morfologia das mesmas foi observada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para avaliação da atividade antimicrobiana foram utilizadas as bactérias Gram positiva e Gram negativa, Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Escherichia coli (ATCC 25922), respectivamente, além do fungo Candida albicans (ATCC 10231). As nanofibras biopoliméricas de AC preparadas por eletrofiação e com NPs de Ag foram completamente caracterizadas e os resultados obtidos até o momento mostram-se bastante promissores.

Palavras-chave: Nanofibras biopoliméricas, Nanopartículas de prata, Eletrofiação.

1. INTRODUÇÃO

O uso de nanofibras eletrofiadas, utilizadas como agentes carreadores em sistema de liberação controlada de drogas, tem revelado um futuro promissor em estudos recentes encontrados na literatura (KENAWY et al 2002, TUNGPRAPA et al 2007, VERRECK et al 2003), principalmente em aplicações biomédicas. O diâmetro e a morfologia da fibra resultante, bem como a grande área de superfície, poros de pequenos tamanhos e estrutura em escala nanométrica, com uma vasta possibilidade de funcionalização, fazem das nanofibras eletrofiadas candidatas a uma grande variedade de áreas de interesse (RAMAKRISHNA et al, 2006).

A utilização de nanofibras polímericas, para sistemas de liberação, é bastante recente e se baseia no princípio de que a disponibilização da droga aumenta com o aumento da área

superficial da matriz (HUANG et al, 2003). Comparadas com outras formas de dosagem farmacêutica, existem várias vantagens em se usar nanofibras eletrofiadas. Substâncias podem ser convenientemente incorporadas aos polímeros de diversas formas, antes ou durante a eletrofiação, e mesmo após a produção da membrana; portanto, o perfil de liberação da substância pode ser projetado por uma modulação da morfologia, da porosidade e da composição da membrana de nanofibras (HUANG et al, 2006).

Por causa da quantidade excessiva de parâmetros envolvidos na obtenção de nanofibras, que possam suprir determinados necessidades específicas, o controle preciso destes vem sendo intensificamente estudado por pesquisadores do mundo todo.

O processo de eletrofiação para produção de nanofibras poliméricas se tornou muito atrativo devido a sua metodologia de baixo custo, produzindo nanofibras a partir de uma grande variedade de materiais, de um modo relativamente simples, repetitivo e de fácil construção, sendo o único método que pode ser desenvolvido para produção em larga escala. Basicamente, eletrofiação é um processo que permite produzir fibras em escala nanométrica por meio de um jato de uma solução de polímero, ou polímero fundido, induzido por uma carga elétrica (UYAR et al, 2009). A eletrofiação é aplicada a uma gama de polímeros que são convencionalmente fiados, tais como, polioleofinas, poliamidas, poliésteres, aramidas, acrílicos, e também biopolímeros como proteínas (MATTHEWS et al, 2002), DNA, polipeptídeos, polissacarídeos dentre outros.

Dentre muitos agentes bactericidas, os efeitos da prata iônica são conhecidos e aplicados desde a antiguidade. Prata (Ag) metálica e iônica tem sido amplamente utilizada em vários campos biomédicos, tais como dispositivos médicos e equipamentos cirúrgicos, tubos endotraqueais, materiais para obturação, ataduras, curativos médicos, cirúrgicos, malhas e cateteres, bem como em filtros antimicrobianos, dentre outros. Foi relatado que a prata inativa microrganismos com uma sequência de mecanismos; (1) Ag interage com enzimas e proteínas importantes para a respiração bacteriana e no transporte de substâncias importantes em toda a membrana da célula e no seu interior, (2) Ag interage com o ADN, inibindo assim a divisão celular, (3) os íons Ag se ligam na parede celular, alterando assim a funcionalidade da membrana. Foi ainda referido que os micro-organismos com resistência à atividade antimicrobiana de Ag são extremamente raros (HONG et al, 2007).

O desenvolvimento de membranas de AC eletrofiadas com características antissépticas, biocompatíveis e nanoestruturadas, e com a incorporação de nanopartículas de prata (NPs de Ag), se apresenta como uma opção interessante e promissora na área da saúde, por causa de seu baixo custo comparado às opções disponíveis atualmente.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Síntese das nanopartículas de prata (NPs de Ag) em meio aquoso.

As NPs de Ag foram sintetizadas por redução química, utilizando-se borohidreto de sódio (NaBH4) como agente redutor, e citrato de sódio como estabilizante. Todas as soluções foram preparadas com água ultrapura (grau Mili-Q), à temperatura de aproximadamente 4 °C, seguindo metodologia descrita por SEGALA, 2009.

Preparação das membranas nanoestruturadas de acetato de celulose (AC), recobertas e não-recobertas com NPs de Ag.

Membranas nanoestruturadas de AC foram previamente preparadas por eletrofiação e, em seguida sobre amostras de nanofibras de aproximadamente 5 mg em massa, foi depositada a solução aquosa das NPs de Ag, por gotejamento. Estas amostras foram deixadas na capela de

exaustão para a completa evaporação dos solventes (método ex-situ). Este procedimento foi repetido 3 vezes. A Figura 1 mostra as imagens feitas das membranas nanoestruturadas de AC na ausência (A), e na presença de NPs de Ag (B).

Figura 1. Amostras de membranas nanoestruturadas de acetato de celulose, na ausência (A) e presença de NPs de Ag em água (B), incorporadas pelo método ex-situ.

Testes microbiológicos (Método de disco difusão).

Foram realizados testes microbiológicos com os materiais preparados na ausência (branco ou controle negativo) e na presença de NPs de Ag. Foram utilizadas três cepas-padrão ATCC para o controle dos procedimentos nos testes de sensibilidade às membranas nanoestruturadas, com possível atividade antimicrobiana, sendo uma Gram-positiva, Staphylococcus aureus (ATCC 29213), uma Gram-negativa, Escherichia coli (ATCC 25992); e um fungo, Candida albicans (ATCC 10231). Antes do teste com as membranas poliméricas, os micro-organismos foram reativados em meio sólido ágar Nutriente e incubados a 37 °C por 24 h. Após este período, placas com meio sólido ágar Mueller Hinton foram estriadas com os micro-organismos para posterior colocação dos materiais a serem testados (Fig. 2).

Figura 2. Placas de microcultivo para realização dos testes microbiológicos com as nanofibras de AC e NPs de Ag.

As placas de Petri foram incubadas a 37 °C por 48 h. Após este período foram realizadas as leituras para se verificar a sensibilidade da cepa, pela presença ou ausência de halos de inibição ao redor das membranas.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Síntese e caracterização das NPs de Ag em meio aquoso.

Foram preparadas soluções contendo NPs de Ag em meio aquoso seguindo a metodologia descrita previamente, em uma concentração de 100 ppm. A formação das NPs de Ag foi monitorada por UV-vis, pelo acompanhamento do comportamento da banda característica destas partículas, em torno de 400 nm, devido ao efeito plasmon ressonante. A Figura 3 apresenta o espectro de UV-vis da suspensão coloidal destas partículas.

300 350 400 450 500 550 600 650 700

Abso

rbân

cia

(u.a

)

(nm)

Figura 3. Espectro de UV-vis das NPs de Ag a 100 ppm em meio aquoso.

O espectro UV-vis apresentado na Fig. 3 revelou uma banda, com máximo de absorção em 390 nm, correspondendo à banda característica de ressonância da superfície plasmônica (Surface Plasmon Ressonance, SPR) para partículas esféricas de prata. A verificação do tamanho das partículas de Ag foi feita por meio de uma imagem obtida por um microscópio eletrônico de alta resolução (MET), como mostrado nas Figuras 4, em diferentes magnitudes.

Figura 4. Imagens obtidas por MET das NPs de Ag preparadas em meio aquoso.

A análise da foto micrografia obtida por MET confirma a forma esférica das NPs de Ag em meio aquoso, sendo possível observar que o tamanho médio destas está entre 10 e 20 nm.

Caracterização morfológica das nanofibras de AC na ausência e presença de NPs de Ag.

Imagens de FEG foram realizadas para verificar a morfologia das nanofibras de AC na membrana nanoestruturada, antes e depois da incorporação das NPs de Ag pelo método ex- situ (Fig. 5).

Figura 5. Imagens obtidas por FEG para as membranas nanoestruturadas de AC na ausência (A) e na presença (B) de NPs de Ag.

Na Figura 5 (A) pode-se verificar pela imagem obtida que antes da adição das NPs de Ag, as nanofibras se apresentam com boa uniformidade e ausência de defeitos como gotas, que podem ocorrer durante o processo de eletrofiação, além da boa distribuição de diâmetro com tamanho médio de 356 nm.

Na Figura 5 (B), a imagem de FEG da membrana de AC, após a incorporação de NPs de Ag, apresenta um grande acúmulo destas na superfície das nanofibras, sugerindo que a incorporação das NPs foi bem sucedida.

Testes microbiológicos (Teste de disco difusão).

A Figura 6 apresenta as fotos das placas de microcultivo, após 48 h de incubação, contendo as amostras eletrofiadas de AC, na ausência e presença de NPs de Ag, testadas com três micro-organismos diferentes, conforme indicado nas próprias figuras.

Figura 6. Placas de microcultivo com as amostras eletrofiadas de AC, na ausência (1) e presença (2) de NPs de Ag, sintetizadas em meio aquoso.

Foi observado halo de inibição do crescimento microbiano apenas para as nanofibras de AC na presença de NPs de Ag, sintetizadas em meio aquoso, para o fungo C.albicans.

A Tabela 1 mostra todos os resultados microbiológicos obtidos, apresentando a dimensão do halo inibitório formado ao redor das amostras semeadas nas placas de microcultivo, em milímetros (mm).

Tabela 1. Formação de halo de inibição do crescimento microbiano para amostras de AC (branco), AC na presença de NPs de Ag.

Micro-organismosHalo de inibição (em mm)Branco(AC)

(AC) +NPs deAg

S. aureus0 00 00 0

E. coli0 00 00 0

C. albicans0 14,130 13,630 14,28

Os testes microbiológicos realizados com as nanofibras eletrofiadas de AC na ausência e presença de NPs de Ag incorporadas pelo método ex-situ, mostraram que não houve efeito inibitório para as bactérias, tanto Gram positiva, S. aureus, quanto Gram negativa, E. coli, testadas. No entanto, para o fungo C. albicans, os testes microbiológicos feitos em placa apresentaram halo de inibição com aproximadamente 14 mm de diâmetro, como visto na Tabela 1.

Estes estudos estão em andamento no nosso grupo de pesquisa para se compreender melhor o efeito antisséptico causado pela presença de NPs de Ag em materiais biopoliméricos, com grande possibilidade de aplicação e utilização destes materiais na área médica.

4. CONCLUSÕES

A síntese das NPs de Ag em meio aquoso foi bem sucedida e a caracterização morfológica das mesmas e as medidas de sua dimensão média foram feitas por MET e UV-vis, respectivamente. Imagens obtidas das NPs de Ag mostram que as mesmas apresentaram geometria aproximadamente esférica, com diâmetro médio de 20 nm. Membranas de AC eletrofiadas se mostraram bons carreadores de NPs de Ag. Testes microbiológicos realizados com as nanofibras de AC na ausência e presença de NPs de Ag, utilizando os micro-organismos, Gram-positivo, S. aureus (ATCC 29213), Gram-negativo, E. coli (ATCC 25992) e o fungo, C. albicans (ATCC 10231), apresentaram inibição do crescimento microbiano apenas para o fungo C.albicans. Dentre as diferentes metodologias de incorporação destas partículas em membranas biopoliméricas nanoestruturadas, produzidas por eletrofiação, a incorporação ex-situ foi eficiente, mas não teve resultados positivos contra bactérias, provavelmente porque outros parâmetros estão por trás da sua ação bactericida, os quais já estão sendo investigados pelos autores.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o suporte financeiro para a realização desta pesquisa e as bolsas concedidas. K.Segala (Capes-PNPD 02625/09-1), S.V.G. Nista (FAPESP 2009/11215-2). Os autores também agradecem ao LME/LNLS pelas imagens HR-TEM e FEG.

REFERÊNCIAS

Hong, K. H. Preparation and Properties of Electrospun Poly(vinyl alcohol)/Silver Fiber Web as Wound Dressings, Polym. Eng. Science, 2007, 47, 1 , 43-49

Huang, Z.; He, C.; Yang, A.; Zhang, Y.; Han, X.; Yin, J.; Wu, Q. “Encapsulating drugs in biodegradable ultrafine fibers through co-axial electrospinning”, J. Biomed Mater. Res A 2006, 77, 1, 169-179.

Huang, Z.; Zhang, Y.; Kotaki, M.; Ramakrishna, S. “A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites”, Comp. Sci. Technol. 2003, 63, 2223-2253.

Kenawy, E.; Bowlin, G. L.; Mansfield, K.; Layman, J.; Simpson, D. G.; Sanders, E. H.; Wnek, G. E. “Release of tetracycline hydrochloride from electrospun poly(ethylene-co-vinylacetate), poly(lactic acid), and a blend”, J. Control Release 2002, 81, 57-64.

Matthews, J. A.; Wnek, G. E.; Simpson, D. G.; Bowlin, G. L. " Electro-spinning of collagen nanofibers", Biomacromolecules 2002, 3, 232-238.

Nista, S. V. G., Peres, L., D'Ávila, M. A., Schmidt, F. L. and Innocentini Mei, L. H. “ Nanostructured membranes based on cellulose acetate obtained by electrospinning, part 1: Study of the best solvents and conditions by design of experiments.”, J. Appl. Polym. Sci. 2012, em impressão.

Ramakrishna, S.; Fujihara, K.; Teo, W.; Yong, T.; Ma, Z., Ramashesan, R. “Electrospun nanofibers: solving global issues”, Mater. Today 2006, 9, 3.

Segala, K. Síntese e caracterização de nanocompósitos funcionais. 2009. 210p. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, Brasil, 2009.

Tungprapa, S.; Jangchud, I.; Supaphol, P. “Release characteristics of four model drugs from drug-loaded electrospun cellulose acetate fiber mats”, Polymer 2007, 48, 5030-5041.

Uyar, T.; Besenbacher, F. “Electrospinning of cyclodextrin funcionalized polyethylene oxide (PEO), Eur. Polym. J. 2009, 45, 1032-1037.

Verreck, G.; Chun, I.; Rosenblatt, J.; Peeters, J.; Dijck, A. V.; Mensch, J.; Noppe, M.; Brewster, M. E. “ Incorporation of drugs in an amorphous state into electrospun nanofibers composed of a water-insoluble, nonbiodegradable polymer”, J. Control. Release 2003, 92, 349-360.

PREPARATION OF CELLULOSE ACETATE NANOFIBERS IN THE PRESENCE OF SILVER NANOPARTICLES PREPARED BY

ELECTROSPINNING

K. Segala1, S.V.G. Nista1, L. A. Steffen1, A. S. F. Silva1,2, E. F. Martinez2, L. H. I. Mei1

1Department of Materials Engineering and Bioprocess (DEMBio), State University of Campinas (UNICAMP), Campinas (SP), Brasil

2São Leopoldo Mandic Institute and Research Center, Campinas (SP), BrasilE-mail: ksegala@feq.unicamp.br

Abstract. The potential application of biopolymer nanofibers in recent years has attracted the attention of many researchers because they can be biocompatible and biodegradable, present low toxicity, and may have antioxidant and antimicrobial properties when functionalized. Among various electrospun polysaccharides cellulose acetate (CA) is a very interesting alternative to work , since it dissolves in various solvents and is one of most cellulose esters currently produced with low cost. In this line of research, this work proposes to study the preparation of nanostructured membranes of AC, in the absence and presence of silver nanoparticles (Ag NPs), using the electrospinning process. These studies aim to obtain nanofibers with antiseptic properties, by incorporating Ag NPs on the AC nanofibers following different methodologies. The size of the nano Ag particles was monitored by UV-vis and confirmed by transmission electron microscopy (TEM), while the morphology of the nanofibers was observed by scanning electron microscopy (SEM). To evaluate the antimicrobial activity, were used the Gram positive and Gram negative bacteria, Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Gram negative Escherichia coli (ATCC 25922), respectively, and the fungus Candida albicans (ATCC 10231). The nanofibers of AC biopolymer prepared by electrospinning and Ag NPs were fully characterized and the results obtained until now showed to be very promising.

Keywords: Biopolymer nanofibers, Silver nanoparticles, Electrospinning.