1. Identificação da Proposta

Título do Projeto Polissacarídeos de plantas da Caatinga: avaliação do potencial anti-inflamatório e antinociceptivo

Coordenador do Projeto Prof. Dr. Draulio Costa da Silva E-mail: draulio.costa@univasf.edu.br Telefone: (87) 8853 4448

Instituição Executora Universidade Federal Vale do São Francisco – UNIVASF Instituição Colaboradora Universidade Federal do Ceará – UFC

Universidade Federal do Piauí - UFPI Edital Edital Facepe 15/2012 - Auxílio a Projetos de Pesquisa

Apq – Facepe Temas Propriedades farmacológicas de polissacarídeos vegetais;

Química de macromoléculas

RESUMO

O presente projeto visa contribuir com o conhecimento sobre o potencial farmacológico de polissacarídeos pécticos isolados de frutos e sementes de plantas medicinais do Bioma Caatinga, um bioma exclusivamente brasileiro e pouco estudado quanto a suas características de fauna e flora. Considerando os aspectos e potencialidades terapêuticas de plantas nativas dessa região e a pequena atenção que vem sendo dada aos seus polissacarídeos constituintes, busca-se investigar inicialmente, as propriedades farmacológicas de duas espécies medicinais, Amburana cearensis

(Allemão) A.C. Sm (Fabaceae) e Caesalpinia férrea Mart. (Caesalpiniaceae), do ponto de vista dos efeitos anti-inflamatório e antinociceptivo de seus polissacarídeos de parede celular, além de conhecer os principais aspectos químicos e estruturais dessas macromoléulas.

Palavras-chave: Polissacarídeos vegetais, pectinas, efeito anti-inflamatório, efeito antinociceptivo.

2. Qualificação do principal problema a ser abordado

Durante eras as plantas têm fornecido ao homem uma ampla lista de itens que suprem as

suas necessidades mais básicas como a alimentação e combustível. Mais do que isso, os vegetais

têm formado a base de um sofisticado sistema medicinal, com uma grande variedade de

propriedades terapêuticas muitas vezes fortalecidas pelo conhecimento empírico ao longo do tempo.

Esse interesse vem sendo elaborado nas últimas décadas na forma de um processo contínuo de

procura e desenvolvimento de novos medicamentos sustentado pela credibilidade que a ciência tem

oferecido às novas drogas derivadas desses elementos naturais, a partir da constatação experimental

da pesquisa científica baseada nas observações, informações e costumes populares (HANDAM;

AFIFI, 2004; FABRICANT; FARNSWORTH 2001).

As plantas são fontes importantes de novas drogas com potencial efeito terapêutico.

Diversas novas moléculas com atividades biológicas interessantes derivadas de plantas medicinais

já foram identificadas (AMANLOU et al, 2005). São muitos os relatos de atividades farmacológicas

de extratos e frações de diferentes órgãos vegetais com registros na literatura científica e com uso

na medicina popular. As plantas têm se tornado fontes importantes de novas drogas de potencial

efeito analgésico com efeitos comparáveis aos da morfina (AMANLOU, et al, 2005). Metabólitos

secundários de plantas têm auxiliado no entendimento dos mecanismos e processos de transmissão

e tratamento da dor, uma vez que permitem caracterizar tipos de receptores e identificar os ligantes

envolvidos no mecanismo de nocicepção, e oferecem alternativas para diversos tratamentos de

desordens incluindo as de origem neuropática e neurogênica (CALIXTO et al, 2000; 2001). Sob

outro aspecto, um elevado número de componentes identificados e isolados de plantas

demonstraram efeito anti-inflamatório significativo e tem sido separados em grupos de acordo com

seus efeitos farmacológicos, o mecanismo de ação e outras propriedades importantes (SOUZA et al,

2011; PEREZ, 2001).

O Brasil apresenta uma das maiores biodiversidades de vegetais do planeta, e pelo

menos a metade das espécies pode possuir alguma propriedade terapêutica útil à população

(MATOS, 1994). A Caatinga é o bioma menos estudado do Brasil e um tipo vegetacional semi-

árido único, ocorrendo quase que exclusivamente na região Nordeste do país (ALBUQUERQUE;

ANDRADE, 2002). Estudos têm enfatizado o potencial bioativo e os benefícios terapêuticos de

plantas medicinais da Caatinga, como demonstrado na revisão de Silva et al (2012), corroborando

com o conhecimento e o uso popular.

Contudo, dentre esses estudos, há poucos relatos sobre carboidratos derivados de

plantas. A maioria enfatiza a ação terapêutica de compostos secundários derivados dos vegetais. Por

outro lado, é importante considerar o potencial terapêutico de polissacarídeos de plantas,

principalmente os de natureza péctica, os quais têm se revelado possuidores de uma variedade de

propriedades biológicas com interesse farmacológico. As pectinas compõem um grupo de

heteropolissacarídeos complexos e dotados de diferentes propriedades terapêuticas protegendo

contra doenças cardiovasculares, obesidade, diabetes e câncer (SILVA et al, 2011; JANEBRO et al,

2010; LYON, REICHERT, 2010; MELLO, LAAKSONEN, 2009; PROSKI, 2000; DANSB, 1998;

CHAU, HUANG, 2005). Além disso, são dotadas de atividade imunomoduladora via ativação do

sistema complemento, com ativação e indução de quimiotaxia de linfócitos que iniciam uma série

de eventos por parte das células imunológicas (LEUNG et al, 2006).

Polissacarídeos imunomoduladores possuem origens variadas, e podem ser encontrados

em bactérias, fungos, algas e plantas (LEUNG et al, 2006). De acordo com a composição, existem

três grandes grupos de polissacarídeos modificadores da resposta biológicas: β-(1→3)-D-glucanos,

α/β-(1→4)-mananos e os heteropolissacarídeos com alto grau de ramificação (LIU et al, 2006). Os

polissacarídeos de composição heterogênea são caracteristicamente derivados de pectinas de plantas

(GUO et al, 2000; YANEVA et al, 2002; EBRINGEROVA et al, 2003).

Pectinas são polissacarídeos com alto grau de solubilidade em água, ricos em ácido

galacturônico o que lhes confere um caráter ácido (LEUNG et al, 2006), desse modo, o conteúdo de

ácido urônico ou glucurônico pode ser usado como parâmetro para caracterização dessa classe de

molécula. São considerados polissacarídeos formados de hidrocolóides com ocorrência natural em

plantas superiores, sendo muito usadas na indústria de alimentos devido a sua capacidade de formar

géis e atuarem como estabilizante e emulsificante (WINNING et al, 2007). Na célula, as pectinas

estão relacionadas com proteção e com a manutenção do meio iônico, modificando a difusão de

íons pela parede celular e regulando sua porosidade (BUCKERIDGE, TINÉ, 2000).

Quimicamente, as pectinas são misturas de polissacarídeos complexos com a

predominância de homogalacturonanas que são polímeros lineares com unidades repetidas de ácido

galacturônico unidas por ligações glicosídicas α-(1→4), formando longas cadeias (CAPEL et al,

2006), nas quais grupos ácidos podem estar metil-esterificados ou O-acetiladas em C-2 e C-3.

Ramnogalacturonanas constituem a região ramificada das pectinas sendo divididas em dois tipos:

ramnogalacturonanas I (RG-I) e ramnogalacturonanas II (RG-II). RG-I consiste de uma cadeia

principal de unidades alternantes de ácido D-galacturônico ligadas por ligações glicosídicas α-

(1→4), e ramnose ligadas por α-(1→2), a qual se ligam cadeias laterais neutras tais como

arabinanas e arabinogalactanas (De VRIES, 1988). RG-II é o menor e mais complexo

polissacarídeo péctico das paredes celulares vegetais (VIDAL et al, 2000). Contém uma alta

proporção de unidades de ramnose ligadas (1→3) e (1→2,3,4) como unidades terminais

(VORAGEN et al, 1995).

As arabinanas são polissacarídeos que apresentam uma cadeia principal de unidades

furanosídicas de L-arabinose unidas por ligações glicosídicas α-(1→5), com ramificações ligadas a

várias unidades da cadeia principal na posição O-2 e/ou O-3 (PÉREZ, MAZEAU; Du PENHOAT,

2000).

As arabinogalactanas ocorrem em duas formas estruturalmente diferentes. As

arabinogalactanas do tipo I têm uma cadeia linear de unidades piranosídicas de D-galactose ligadas

β-(1→4) com 20-40% de unidades furanosídicas de L-arabinose ligadas α-(1→5) presentes em

cadeias laterais curtas conectadas na posição O-3 das unidades de galactose (PÉREZ et al, 2000;

VORAGEN et al, 1995). Já as arabinogalactanas do tipo II são polissacarídeos altamente

ramificados, com cadeias de unidades de β-D-galactopiranose unidas por ligações (1→3) e (1→6).

As ligações (1→3) predominam nas cadeias internas, enquanto que as ligações (1→6) ocorrem

principalmente nas cadeias externas, que são geralmente terminadas por unidades L-

arabinofuranosil e em algum grau por unidades L-arabinopiranosil (VORAGEN et al, 1995).

Essas moléculas são consideradas farmacologicamente ativas uma vez que modificam a

resposta biológica, inclusive melhorando a resposta imune (LEUNG et al, 2006), com efeitos

moduladores in vivo e in vitro (SILVA et al, 2012; PAULSEN, 2001; INNGJERDINGEN et al,

2005).

Uma vez agentes imunomoduladores e ativadores celulares os polissacarídeos pécticos

são capazes de auxiliar as reações de defesa imunológica, bem como, as respostas inflamatórias

(SILVA et al, 2011; 2012). A inflamação aguda é considerada um fenômeno fisiológico do corpo

aliado às componentes do processo imunológico, frente à invasão de algum agente estranho nocivo.

Pode ainda, ser desencadeada a partir de outros fatores, dentre os quais, lesões causadas por

substâncias químicas, ou fatores de caráter físico, como luz ultravioleta e calor, por exemplo. Em

outras palavras, trata-se de uma resposta natural de defesa, embora possam ocorrer casos em que a

resposta inflamatória se manifesta contra elementos inócuos, ou mesmo, contra os próprios tecidos

do corpo, como em doenças auto-imunes. Nesse caso, faz-se uso de agentes anti-inflamatórios ou

imunossupressores (RANG et al, 2004).

Apesar do recente progresso no desenvolvimento de novas drogas com fins

terapêuticos, ainda existe uma busca intensa por anti-inflamatórios potentes e com menores efeitos

colaterais. Nesse aspecto, os polissacarídeos de plantas representam uma boa alternativa como

novos agentes anti-inflamatórios, como demonstrado por Popov et al, (2007), aliado ao fato de que

nos vegetais a maioria dos polissacarídeos encontrados é relativamente não tóxica e apresenta

poucos efeitos colaterais, que é o maior problema associado a polissacarídeos imunomoduladores

bacterianos e compostos sintéticos (OVODOV, 1998; SHERENESHEVA et al, 1998).

Tais efeitos podem estar relacionados à ação imunomoduladora das pectinas (SILVA et

al, 2011; LEUNG et al, 2006), embora seu mecanismo ainda seja desconhecido (YE; LIM, 2010).

Um estudo sobre o efeito da pectina de Citrus na produção de citocinas por macrófagos humanos

mostrou a propriedade do polissacarídeo em inibir a secreção de interleucinas (IL-1 e IL-06)

(SALMAN et al, 2008).

Recentemente, mostrou-se que algumas pectinas são capazes de reduzir a secreção de

interleucinas pró-inflamatórias e também de TNF-alfa regulando a resposta inflamatória por

moderar a produção de citocinas e imunoglobulinas (YE; LIM, 2010), além de diminuírem a

atividade da enzima mieloperoxidase (SILVA et al, 2011) o que sugere a propriedade de inibição do

influxo celular como a migração de neutrófilos para o sítio de inflamação (FRODE, MEDEIROS,

2001). Há evidências que mediadores pró-inflamatórios como o próprio TNF-alfa e algumas

interleucinas ajudam a aumentar a extensão do local ou o processo inflamatório sistêmico

(MIZGERD et al, 2001).

Considerando os estudos sobre o potencial terapêutico de compostos isolados de

plantas, algumas espécies podem ser mencionadas a partir de trabalhos etnobotânicos, como o

desenvolvido por Gomes et al (2007) no Vale do São Francisco, com plantas medicinais

comercializadas em feiras livres na região do Pólo Petrolina-Juazeiro. Dentre as espécies

amostradas, Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. (umburana de cheiro) e Caesalpinia ferrea

(pau-ferro) foram encontradas em diversas feiras livres, e são espécies nativas consideradas de alto

potencial medicinal (GOMES et al, 2007), sendo a espécie A. cearensis (Allemão) A.C. Sm. bem

relatada em diversos estudos quanto ao efeito anti-inflamatório e antinociceptivo de diferentes

compostos secundários (OLIVEIRA et al, 2009; SILVA et al, 2012).

Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. (Fabaceae) é uma árvore que pode atingir até

9 metros de altura, apresenta casca do tronco lisa, folhas alternas e pequenas flores. Os frutos são

uma cápsula globosa com 1,5 cm de diâmetro liberando uma única semente rígida. Pela fenologia

desta espécie, seus frutos amadurecem 4-5 meses após o início da estação chuvosa (março-maio)

(MAIA, 2004). Essa planta é usada popularmente no tratamento de problemas respiratórios e como

expectorante, sendo as sementes usadas contra inflamações e dores reumáticas (ALBUQUERQUE

et al, 2010). Demonstrou-se que a casca e as sementes de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm. são

dotadas de efeitos anti-inflamatório, antitussivo e antiespasmódico (BRAGA, 1976; CORREA,

1984). Lotufo et al (2003) comprovaram a ação anti-inflamatória de IKPF, um flavonóide isolado

da casca dessa planta, frente ao TNF-alfa, além de efeito antitumoral in vitro. A ação anti-

inflamatória de IKPF também foi demonstrada em ratos por Leal et al (2009), além de outros

compostos secundários obtidos da casca de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm. com efeito anti-

inflamatório in vivo sendo capazes de inibir a migração de leucócitos e neutrófilos para a cavidade

peritoneal de ratos sob indução de diferentes agentes flogísticos como carragenina, serotonina,

histamina e N-formilmetil-leucil-fenilalanina (LEAL et al, 2003). Também foi demonstrado o

potencial antinociceptivo e anti-inflamatório do extrato etanólico da casca de A. cearensis

(Allemão) A.C. Sm. in vivo (OLIVEIRA et al, 2009; LEAL et al, 2011). Contudo, há uma escassez

de trabalhos que tratem de possíveis efeitos anti-inflamatório e antinociceptivo dos polissacarídeos

de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm.

A espécie Caesalpinia férrea Mart. (Caesalpiniaceae) é uma planta de porte arbóreo, de

frutos indeiscentes com elevada quantidade de sementes, que ocorre do Ceará à Bahia. Sua floração

acontece na época chuvosa e no período de transição chuvosa-seca, seguida pela produção dos

frutos (MAIA, 2004). Essa espécie tem sido ainda pouco relatada por suas propriedades medicinais,

contudo há registros de uso popular da entrecasca, frutos e raízes para o tratamento de diabetes e

como agente cicatrizante, antidiarréico e antitérmico (MAIA, 2004). Recentemente, demonstrou-se

que os polissacarídeos extraídos dos frutos de C. ferrea Mart. possuem ação anti-inflamatória em

ratos contra diferentes agentes flogísticos de natureza osmótica e celular, também relacionada à

imunomodulação, e que a atividade detectada possa estar ligada ao conteúdo de ácido urônico do

polissacarídeo isolado (PEREIRA et al, 2012).

Assim, mesmo considerando os polissacarídeos de plantas como agentes potencialmente

terapêuticos, seu estudo para essa aplicabilidade, em relação a alguns aspectos, como a atividade

anti-inflamatória, por exemplo, ainda é modesto (PEREIRA, 2011), ao se comparar com os

registros de outros compostos primários e secundários originados de vegetais.

Diante do exposto, é interessante investir nos estudos de aplicação de polissacarídeos

vegetais na busca de novas drogas anti-inflamatórias e antinociceptivas, sobretudo de espécies

comumente utilizadas na medicina popular.

Desse modo, e considerando as propriedades anti-inflamatórias para as espécies de

plantas medicinais aqui descritas, bem como, as diversas propriedades biológicas de interesse

terapêutico dos polissacarídeos vegetais, o presente projeto traz como proposta um estudo dos

aspectos químicos e das ações anti-inflamatória e antinociceptiva de amostras de polissacarídeos

obtidos das espécies Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. e Caesalpinia férrea Mart. de

maneira a evidenciar suas potencialidades farmacológicas, bem como proporcionar um melhor

conhecimento dos mecanismos de ação estudados por Pereira et al, (2012) em relação aos

polissacarídeos de C. férrea Mart., através da utilização de outros modelos de inflamação, de

maneira a melhor compreender o modo de ação dessas moléculas.

3. Objetivos e metas

3.1. Objetivo Geral

� Avaliar os aspectos químicos e o potencial bioativo em relação aos efeitos anti-inflamatório e

antinociceptivo dos polissacarídeos isolados de frutos e/ou sementes das espécies vegetais da

Caatinga Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. e Caesalpinia ferrea Mart. in vivo e in

vitro.

3.2. Objetivos específicos

� Isolar os polissacarídeos dos frutos e/ou sementes das espécies vegetais A. cearensis

(Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart.;

� Caracterizar quimicamente as amostras de polissacarídeos obtidas através da determinação do

teor de carboidratos, ácido urônico e proteínas solúveis;

� Realizar fracionamento das amostras obtidas através de cromatografia em coluna de troca

iônica;

� Estimar a massa molar das amostras de polissacarídeos isolados por meio de cromatografia de

exclusão molecular;

� Caracterizar estruturalmente os polissacarídeos isolados através de métodos espectroscópicos

(Espectrofotometria na Região do Infravermelho - FT-IR; Ressonância Magnética Nuclear-

RMN);

� Avaliar o efeito antinociceptivo dos polissacarídeos isolados através dos modelos de

contorções abdominais induzidas por ácido acético (writhing test), teste da placa quente (hot-

plate test) e teste da formalina;

� Avaliar o efeito anti-inflamatório dos polissacarídeos isolados através dos modelos de edema

de pata induzido por agentes flogísticos de natureza osmótica e celular;

� Avaliar o efeito anti-inflamatório dos polissacarídeos isolados através dos modelos de

inflamação in vivo e in vitro: efeito sobre a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal

induzida por agente quimiotático indireto (Cf) e direto (fMLP); Dosagem de citocinas; Ensaio

para mieloperoxidase (MPO);

� Avaliar a ação dos polissacarídeos sobre parâmetros macroscópicos, microscópicos e peso

úmido em animais com colite por ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS).

� Verificar a ação dos polissacarídeos sobre a atividade da MPO no colón de animais com colite

por TNBS.

� Verificar a influência do polissacarídeo sobre a produção de citocina IL-1β e TNF-α no cólon

de animais com colite induzida por TNBS.

� Verificar a influência dos polissacarídeos extraídos sobre a atividade de malondialdeido

(MDA) e glutationa reduzida (GSH) no colón de animais com colite por TNBS.

3.3. Metas

� Determinação de métodos de extração e fracionamento dos polissacarídeos de frutos e/ou

sementes da espécie Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm;

� Obtenção dos polissacarídeos dos frutos e/ou sementes da espécie Amburana cearensis

(Allemão) A.C. Sm;

� Obtenção dos polissacarídeos dos frutos e/ou sementes da espécie Caesalpinia ferrea Mart.;

� Determinação das características químicas das amostras de polissacarídeos isolados das

espécies A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart.

� Aplicação dos polissacarídeos isolados em modelos de estudo de atividade antinociceptiva e

anti-inflamatória in vivo e in vitro;

� Contribuir para o melhor entendimento do efeito anti-inflamatório dos polissacarídeos de C.

ferrea Mart. demonstrado por Pereira et al (2012), usando diferentes modelos de inflamação;

� Contribuir para o estudo de potencialidades terapêuticas de polissacarídeos de plantas

medicinais nativas da Caatinga.

4. Metodologia

4.1. Material vegetal

Os frutos das espécies A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart. serão

coletados no município de Petrolina-PE e áreas próximas. O material coletado será devidamente

identificado a nível de espécie e suas exsicatas confeccionadas serão depositadas em herbários

vinculados à instituições de ensino e pesquisa das Universidades Federal do Vale do São Francisco

(UNIVASF) e Federal do Ceará (UFC).

4.2. Animais

Ratos Wistar pesando entre 150 e 250 g e camundongos Swiss (20-25 g) provenientes

do Biotério Central da UNIVASF e da Universidade Federal do Piauí (UFPI) serão mantidos em

condições adequadas de luz e temperatura, recebendo água e ração ad libitum até a realização dos

experimentos. Todos os tratamentos e procedimentos cirúrgicos serão realizados de acordo com o

guia de cuidado em uso de animais de laboratório do National Institutes of Health (Bethesda, MD,

USA). Os protocolos utilizados nos trabalhos serão executados de acordo com os padrões éticos

estabelecidos pelos Comitês de Ética das referidas Universidades. O presente projeto foi

apresentado ao órgão CEUA (Comissão de Ética em Uso de Animais) que apresentará seu parecer

em reunião ordinária que ocorrerá em outubro de 2012, cujo documento de comprovação de

submissão consta no Anexo I.

4.3. Extração dos polissacarídeos de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart.

4.3.1 Extração dos polissacarídeos de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm

As vagens e sementes serão estudadas separadamente. O material será lavado com água

destilada e seco em estufa à 40 ºC. Protocolos de extração dos polissacarídeos dos frutos serão

testados de acordo com o proposto por Yapo e Kofi (2006) com algumas modificações. As amostras

serão trituradas em moinho analítico para obtenção de um pó, o qual será suspenso em metanol

absoluto (1:50, p/v), homogeneizado (76 ºC, 2 h) e filtrado em funil de placa sinterizada G3. O

resíduo será lavado com solução etanólica (etanol 80%) e acetona sucessivamente, até total

clarificação. Em seguida, será seco em estufa a 40 ºC e denominado sólidos insolúveis em álcool

(SIA).

Partindo do material obtido (SIA), serão realizadas extrações em água a 30 ºC e

acidificada a pH 4,0 com ácido nítrico 1M. Após etapas de filtração e centrifugação (3000 g/ 20

min, a 20 ºC), o material será mantido em contato com etanol absoluto (4 volumes) a 4 ºC por 24 h

para precipitação de pectinas presentes na solução. Após diálise e nova centrifugação, o material

será liofilizado e denominado pectina extraída em água (PEA). Procedimentos de extração em

ácidos diluídos poderão também ser empregados.

A extração dos polissacarídeos das sementes de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm será

conduzida de acordo com o método estabelecido por Pereira et al (2012). O tegumento será retirado

e triturado. O pó obtido será mantido em contato com metanol absoluto (1:50, p/v), homogeneizado

(76 ºC, 2 h) e filtrado em funil de placa sinterizada G4. A porção insolúvel será suspensa na mesma

proporção (1:50, p/v) em NaOH 0,1 M (97 °C, 2 h) e centrifugada (3000 x g, 15 min, 25 °C). O

sobrenadante alcalino será neutralizado com HCl 1 M, precipitado com quatro volumes de etanol

absoluto e centrifugado (3000 x g, 15 min, 25 °C). O precipitado será dialisado contra água

destilada, novamente centrifugado e o sobrenadante final, liofilizado e denominado Polissacarídeos

Totais (PLT).

4.3.2 Extração dos polissacarídeos de C. ferrea Mart.

A extração dos polissacarídeos das sementes de C. ferrea Mart. será conduzida como

apresentado no ítem 4.3.1 para as sementes de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm de acordo com

Pereira et al (2012).

4.3.3 Fracionamento dos polissacarídeos em cromatografia de troca iônica

Os PLT de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm C. ferrea Mart. serão dissolvidos em água

destilada (1:2, p/v) e aplicados em coluna cromatográfica de troca iônica previamente equilibrada

com água destilada. A eluição (60 mL/h) ocorrerá com concentrações crescentes de NaCl (0,1; 0,25;

0,5; 0,75; 1,0 e 1,25 M) para liberação dos polissacarídeos ácidos. As frações majoritárias serão

dialisadas, liofilizadas e utilizadas nas analises químicas.

4.3.4 Análises químicas dos PLT e das frações polissacarídicas de A. cearensis (Allemão)

A.C. Sm e C. ferrea Mart.

� Determinação de carboidratos totais:

O teor de açúcar total será avaliado pelo método do fenol-ácido sulfúrico (DUBOIS et

al, 1956) em espectrofotômetro a 490 nm. A concentração de carboidratos totais será estimada em

relação a uma curva padrão de D-galactose;

� Determinação de ácido urônico:

O conteúdo de acido urônico será determinado pelo método de Blumenkrantz e Asboe-

Hansen (1973) em espectrofotômetro a 520 nm. A concentração de acido urônico será estimada em

relação a uma curva padrão de ácido D-galacturônico;

� Dosagem de proteínas:

A quantidade de proteínas será mensurada pelo método de Bradford (1976) em

espectrofotômetro a 595 nm. A concentração de proteínas será estimada em relação a uma curva

padrão de albumina sérica bovina (BSA).

4.3.5 Métodos espectroscópicos das amostras polissacarídicas obtidas

� Cromatografia de Exclusão Molecular de Alta Performance (HPSEC):

O pico de massa molar das amostras será determinado por HPSEC usando cromatógrafo

Shimadzu LC-10AD com detectores de índice de refração (RID-6A) e ultravioleta (SPD-10AV;

ƛ=280 nm). A análise será realizada utilizando-se coluna Ultrahidrogel (7,8 x 300 mm), com fluxo

de 0,5 mL/min, solução de polissacarídeo de concentração 0,1% (p/v), água como solvente, NaNO3

0,1 M como eluente e temperatura ambiente. O volume injetado de amostra será de 50 µl. A massa

molar do polissacarídeo será estimada usando pululanas como padrão.

� Espectroscopia na Região do Infravermelho (FT-IR):

Os espectros FT-IR serão realizados com pastilhas KBr em espectrofotômetro FT-IR

Shimadzu 8300, com resolução de 2 cm-1.

� Ressonância Magnética Nuclear (RMN):

Espectros 1D (1H e 13C) de soluções de polissacarídeos a 3% (p/v) em D2O a 343 K

serão realizados em espectrômetro BRUKER, modelo AVANCE-DRX-500. 2,2-dimetilsilapentano-

5-sulfonato de sódio (DSS) será usado como padrão interno (0.00 ppm para 1H).

4.4. Testes de atividade biológica

4.4.1 Testes de atividade antinociceptiva:

� Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético (Writhing test):

Esse teste será conduzido de acordo com a metodologia de Koster et al (1959). As

soluções de polissacarídeos e respectivos controles serão administrados aos camundongos 30 min

(via intraperitoneal) ou 60 min (via oral) antes do início dos experimentos. Água destilada será

usada como controle negativo (0,1 mL/10g) e ácido acetilsalicílico (200 mg/kg, subcutâneo) ou

diclofenaco (25-50 mg/kg, via oral) como padrões positivos. Após o período pré-determinado os

animais receberão injeção intraperitoneal de ácido acético (0,6%, 0,1 mL/10g). Serão mantidos em

recipiente para observação e contagem do número de contorções abdominais (writhing) por um

período de 20 min após o qual se avaliará o possível efeito antinociceptivo.

� Teste da placa quente (Hot-plate test):

A metodologia seguirá o protocolo de Woolfe e MacDonald (1944). Camundongos

Swiss (20-25 g) serão selecionados para avaliação de suas reações ao estímulo termal (salto ou

lambedura das patas quando a temperatura da placa atingir os 55 ºC). O tempo de latência ao

estímulo nos animais será registrado imediatamente antes e 30, 60, 90 e 120 min. após a

administração das soluções de polissacarídeos e controles positivo e negativo por um período

máximo de 40 s. de modo a evitar lesões nas patas dos animais. Água destilada será usada como

controle negativo (0,1 mL/10g) e ácido acetilsalicílico (200 mg/kg, subcutâneo) ou diclofenaco (25-

50 mg/kg, via oral) como padrões positivos.

� Teste da formalina:

Esse teste será realizado segundo o método descrito por Dubuisson e Dennis (1977) e

modificado por Hunskaar et al (1985). Os animais serão tratados com as soluções de

polissacarídeos e respectivos controles 30 min (via intraperitoneal) ou 60 min (via oral) antes do

início dos experimentos. Água destilada será usada como controle negativo (0,1 mL/10g) e ácido

acetilsalicílico (200 mg/kg, subcutâneo) ou diclofenaco (25-50 mg/kg, via oral) como padrões

positivos. Cada camundongo será submetido a uma injeção subplantar de 40 µL de formalina 1%

(v/v), na pata traseira direita. O tempo gasto pelo animal lambendo a pata será registrado durante

dois períodos após a injeção de formalina: 0-5 minutos (fase inicial ou primeira fase) e de 20-25

min (fase tardia ou segunda fase). O teste será realizado à temperatura de 25 °C na ausência de

fatores estressantes, como sons, odores e alta luminosidade.

4.4.2 Testes de atividade antiedematogênica e anti-inflamatória:

� Modelo de edema de pata

O modelo de edema de pata será realizado segundo o método descrito por Winter et al

(1962). As patas direitas traseiras dos animais terão seus volumes medidos (mL) por meio de

pletismógrafo. Os animais serão tratados por via oral (v.o) ou intraperitoneal (i.p) com as soluções

de polissacarídeos ou volumes de 10 mL/kg de água destilada nos grupos controle negativo,

enquanto o grupo controle positivo será tratado com ácido acetilsalicílico (200 mg/kg, subcutâneo)

ou diclofenaco (25-50 mg/kg, v.o). Sessenta minutos após administração, os animais receberão uma

injeção subcutânea (s.c.) intraplantar (0,1 mL/pata) de diferentes agentes flogísticos e o volume das

patas mensurado por pletismometria imediatamente antes (tempo zero) e 30, 60, 120, 180, 240 e

300 min após o estimulo, sendo calculado como a diferença entre o volume (mL) deslocado pelas

patas nos tempos determinados após o estimulo (VF) e antes do estimulo (V0). No caso dos agentes

inflamatórios carragenina (Cg) e dextrano (Dx), amostras de tecidos das patas serão retiradas para

dosagem de atividade da enzima mieloperoxidase (MPO).

� Ensaio para mieloperoxidase (MPO):

Mieloperoxidase é uma enzima presente predominantemente nos grânulos azurófilos

dos neutrófilos e tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração de neutrófilos nos

processos inflamatórios em vários tecidos, entre eles o trato gastrintestinal. Para realização do

experimento, 50 a 100 mg de tecido subplantar dos animais tratados com os polissacarídeos, serão

colocados num tampão de potássio com 0,5% de brometo de hexadecitrimetilamônio (pH 6,0; 50

mg de tecido por mL) e posteriormente homogeneizados num Politron. A seguir, o homegenato será

centrifugado a 14000 rpm por 2 minutos. A atividade da MPO por mg de tecido será aferida através

da técnica descrita por Bradley et al (1982), utilizando 0,0005% de peróxido de nitrogênio como

substrato para a MPO. A unidade da atividade de MPO será definida como aquela capaz de

converter 1 mmol de peróxido de nitrogênio em água em 1 minuto.

� Avaliação do efeito dos polissacarídeos de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea

Mart. sobre a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal induzida por agente

quimiotático indireto (Cf) e direto (fMLP)

Os animais tratados com as soluções de polissacarídeos e controles positivo e negativo

receberão inicialmente os polissacarídeos (1, 3, 10 e 30 mg/kg) por via intraperitoneal. Após 1 h, os

estímulos inflamatórios carragenina (300 µg/cavidade) e fMLP (300 nmol/cavidade), dissolvidos

em 1 mL de salina estéril, serão administrados. Após 4 horas, será avaliada a migração de

neutrófilos. Para tanto, os animais serão sacrificados por deslocamento cervical e as células

presentes na cavidade peritoneal serão coletadas através da lavagem desta utilizando 5 mL de salina

contendo 5 Ul/mL de heparina. Os abdomens dos animais serão levemente massageados, e através

de uma incisão serão coletados cerca de 3 mL de fluido peritoneal.

As contagens total e diferencial dos leucócitos serão realizadas conforme metodologia

descrita previamente por Souza e Ferreira (1985). Neste procedimento, 20 µL do fluido coletado de

cada animal serão diluídos em 380 µL do reagente de Turk e posteriormente usados para a

contagem total de leucócitos em câmara de Neubauer. A contagem diferencial das células será

realizada através de esfregaços corados em lâminas. Para tanto, 50 µL do exsudato será

centrifugado em citocentrífuga a 400 x g, durante 10 minutos, e após este processo os esfregaços

serão corados pelo método de hematoxilina-eosina (HE) e as células contadas através de

microscopia óptica, sendo os resultados expressos como a média ± E.P.M. do número de células x

103/mL de fluido peritoneal. Parte do fluido peritoneal será utilizado para posterior dosagem de

citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β).

� Dosagem de citocinas:

As concentrações de TNF-α e IL-1β serão medidos do fluido peritoneal dos animais

usando a técnica de ELISA como descrito por Souza et al (2001). Segmentos da mucosa gástrica

serão obtidos e estocados em tampão para citocinas contendo anti-proteases em freezer -70 ºC. Os

tecidos serão homogeneizados com PBS, contendo anti-proteases. A amostra será centrifugada por

10 min em 3000 x g e o sobrenadante será imediatamente usado pelo ensaio de ELISA com

anticorpos específicos para interleucinas.

� Modelo de doença de Crohn induzido por ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e da colite

induzida por etanol a 50% em ratos.

Inicialmente, os animais passarão por um processo de preparação do cólon.

Permanecerão 16 a 18 hrs recebendo somente água ad libitum. Posteriormente, serão submetidos à

limpeza do cólon por enema com 20 mL de solução salina a 0,9%, 1 hora antes do procedimento.

As colites serão induzidas pela administração de TNBS (20%, 20 mg diluídas em álcool a 50%,

num volume de 0,8 ml), que simula experimentalmente a doença de Crohn, ou etanol (50%, num

volume de 0,4 mL), via transanal. O grupo controle receberá apenas salina (0,9%, num volume de

0,4 mL). Para a indução das colites ou não, os animais serão previamente anestesiados e

posicionados em decúbito lateral esquerdo. Onde será introduzido, por via retal, um catéter de

polietileno nº 6 até 8 cm da margem anal para a injeção das soluções. O animal permanecerá

suspenso pela cauda, de cabeça pra baixo, por 30 seg. para evitar o retorno da solução.

� Tratamentos dos animais com as frações polissacarídicas de A. cearensis (Allemão) A.C.

Sm e C. ferrea Mart.

Os ratos com colite induzida por etanol ou TNBS serão pré e pós-tratados durante três

dias com as soluções de polissacarídeos nas dosagens de 30, 60 e 90 mg/kg. Ao final do terceiro dia

de tratamento todos os animais serão sacrificados e retirados os seus colóns para posterior análise.

Os grupos experimentais serão compostos de grupo salina, grupo etanol, grupo etanol +

Polissacarídeo (30, 60 ou 90 mg/kg), grupo TNBS, grupo TNBS + Polissacarídeo (30, 60 ou 90

mg/kg).

� Avaliação do peso úmido dos colóns de animais com ou sem colite e tratados com os

polissacarídeos de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart.

Após o sacrifício dos animais e antes da análise macroscópica dos escores de lesão

dos cólons de animais com ou sem colite, serão retirados fragmentos medindo 1 cm de

comprimento cada um, dos cólons dos animais. Posteriormente, os fragmentos serão pesados e os

resultados expressos pela unidade peso úmido / cm de lesão.

� Avaliação dos escores macroscópicos e microscópicos de lesão

Os animais serão sacrificados 3 dias após a indução das colites por deslocamento

cervical. Nesse momento, será feita uma incisão mediana com abertura na cavidade peritoneal.

Após a identificação do reto e cólon, será isolada uma extensão de 5 cm. A peça será aberta

longitudinalmente, lavada com soro fisiológico e distendida sobre uma superfície plana para uma

avaliação do escore macroscópico seguindo a técnica descrita por Morris (1989) e do escore

microscópico seguindo a técnica descrita por Appleyard e Wallace (1995).

� Ensaio para mieloperoxidase no colon de animais com ou sem colite e tratados com os

polissacarídeos de A. Cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. Ferrea Mart.

Resumidamente, 50 a 100 mg de colón de animais com ou sem colite e tratados ou não

com PLS (30, 60 e 90 mg/kg), serão colocados num tampão 1 (NaCl 0,1 M + NaEDTA 0,015 M/L

de NaPO4 0,02 M em pH 4,7). Posteriormente, homogeneizados num Politron (13000 rpm). Sendo

centrifugados a 15 minutos (3000 rpm). Logo após, o sobrenadante será retirado e o precipitado,

novamente centrifugado no tampão 1 e colocado para centrifugar nas mesmas condições. O

sobrenadante será, mais uma vez, retirado e, então, o precipitado homogeneizado (Politron - 13000

rpm) em um tampão 2 [HTAB (0,05%)/200 ml de NaPO4 0,05M]. A próxima etapa será colocar

esse homogenato para congelar e descongelar em nitrogênio líquido (2X). Posteriormente, o

homegenato será centrifugado a 10000-20000 rpm por 15 minutos. Finalmente, o sobrenadante será

pipetado na placa (5-10 µl) + 45 µl de NaPO4 0,08M e mais a solução de leitura [TMB 25 µl (5

min) + H2O2 100 µl (5 min)]. A reação será finalizada com o acréscimo de H2SO4 50 µl (4M) e lida

em um leitor de placa a 450 nm. Assim, o infiltrado neutrofílico será obtido a partir de uma curva

padrão de neutrófilos.

� Dosagem de TNF- α, ILl-1β e IL-10:

Fragmentos do colón de animais com ou sem colite e tratados ou não com os

polissacarídeos (30, 60 e 90 mg/kg) serão retirados rapidamente para dosagem de TNF- α, IL-1β e

IL-10. Os fragmentos serão adicionados em um tampão inibidor de protease (500 µL de tampão

para cada 100 mg de tecido) e depois processados em um homogeneizador de tecido e centrifugados

a 3000 rpm a 4 ºC por 10 min. Posteriormente, o sobrenadante será coletado e incubado com 2

µg/ml de anticorpo (anticorpo de captura) diluído em tampão de bicarbonato (pH 8.2), 100 µL por

poço por 24 horas a 4 ºC. A placa será lavada com PBS -Tween 20 a 0,1%. A reação será bloqueada

com albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem, 100 µL por poço por 2 horas à

temperatura ambiente. Posteriormente, a placa será novamente lavada usando a mesma solução. A

placa será incubada com a curva padrão das citocinas (TNF- α, IL-1β e IL-10) diluídas em tampão

de lavagem e com as amostras de tecido do estômago a serem dosados, 100 µL por poço por 24

horas a 4 ºC. A placa será novamente lavada e depois incubada com o anticorpo biotinilado

(1:1000) diluído em tampão de lavagem contendo 1% de soro de carneiro por 1h à temperatura

ambiente. Novamente a placa será lavada e depois incubada com avidina peroxidase (DAKO)

diluída 1:5000 em tampão de lavagem, 100 µL por poço por 15 minutos à temperatura ambiente. A

placa será lavada e incubada com O-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão substrato, 100

µL por poço, no escuro à temperatura ambiente por um período que varia de 5 a 20 minutos

dependendo da citocina. A reação será parada com 150 µL por poço de H2SO4 1M. A intensidade

da coloração será medida em espectrofotômetro a 490 nm e os resultados serão expressos como

média ± EPM da quantidade de TNF-α, IL - 1β e IL-10 em pg/ml (TAVARES-MURTA, et al,

1998).

� Avaliação da glutationa reduzida (GSH):

A glutationa reduzida é um tripeptídeo composto de glutamato, glicina e cisteína,

existente em praticamente todas as células de mamíferos. Exibe um grande número de funções

essenciais para a célula, incluindo transporte de aminoácidos, catálise enzimática e proteção contra

os efeitos deletérios de radicais livres endógenos e metabólitos tóxicos (MEISTER, 1991). O

método de Sedlak e Lindsay (1968) será utilizado para análise de glutationa nas amostras de colóns

de animais com ou sem colite e tratados ou não com os polissacarídeos (30, 60 e 90 mg/kg). Para

determinação dos níveis de grupos sulfidrílicos não-protéicos, uma amostra de 50 a 100 mg da

mucosa intestinal dos animais será homogeneizada em 1 mL de EDTA 0.02 M para cada 100 mg de

tecido. Alíquotas de 400 µL do homogeneizado serão misturadas a 320 µL de água destilada e a 80

µL de ácido tricloroacético (TCA) a 50% para precipitação de proteínas. Os tubos serão

centrifugados por 15 minutos a 3000 rpm a 4º C. A um total de 400 µL do sobrenadante serão

adicionados 800 µL de tampão Tris 0,4 M (pH 8.9) e 20 µL de DTNB (reagente de Ellman) 0,01 M.

A mistura será então agitada por 3 minutos e a absorbância lida a 412 nm em espectrofotômetro. As

concentrações de grupos sulfidrílicos não-protéicos serão expressas em µg de NP-SH/g de tecido.

� Avaliação dos níveis de malondialdeido (MDA):

Os níveis de malondialdeído na mucosa intestinal de colóns de animais com ou sem

colite e tratados ou não com os polissacarídeos (30, 60 e 90 mg/kg) serão determinados pelo método

de Mihara e Uchiyama (1978). Fragmentos da mucosa intestinal (300 mg) serão homogeneizados

com KCl gelado 1.15% para preparar 10% de homogenato. Meio mililitro (0.5 mL) desse

homogenato será pipetado dentro de um tubo de centrífuga de 10 mL, 3 mL de H3PO4 (1%) e 1 mL

de uma solução aquosa de ácido tiobarbitúrico aquoso (0.6%) onde serão acrescentados. Os tubos

foram aquecidos por 45 min. em um banho de água fervente e a mistura reacional será então

resfriada em um banho de água gelada, seguida da adição de 4 mL de n-butanol. Os conteúdos serão

misturados por 40 segundos com um misturador "vortex", centrifugados a 1200 x g por 10 min. e a

absorbância da camada orgânica será mensurada em 520 e 535 nm. Os resultados serão expressos

em mmol/g de fragmentos umedecidos.

4.5. Análises Estatísticas

Os resultados obtidos serão analisados mediante análise estatística não paramétrica

utilizando o teste de Kruskal-Wallis e/ou Mann-Whitney (nível de significância da análise de 5% e

1%). Também será empregado o programa GraphPad PRISM 5.04 for Windows, onde os resultados

serão expressos como média ± erro padrão da média (EPM) utilizando ANOVA para comparações

entre grupos distintos e teste t pareado para comparação com o mesmo grupo. A significância será

considerada quando a possibilidade de ocorrência da hipótese nula foi igual ou inferior a 5% (p ≤

0,05).

5. Principais contribuições científicas ou tecnológicas da proposta

O projeto Polissacarídeos de plantas da Caatinga: avaliação do potencial anti-inflamatório

e antinociceptivo contribuirá cientificamente através da divulgação de resumos e artigos científicos

a serem publicados em periódicos com bom fator de impacto, fortificando a formação

interdisciplinar de discentes de iniciação científica e a consolidação de grupos de pesquisa.

Concomitantemente, auxiliará na estruturação da pesquisa na UNIVASF (e em outras Instituições

de Ensino Superior), a qual se encontra em expansão, ampliando a participação da citada

universidade no cenário científico, sendo de extrema relevância para o desenvolvimento da pesquisa

na região do semiárido nordestino. É importante considerar que um número ainda reduzido de

trabalhos que proporcionem um maior conhecimento e entendimento a respeito do potencial

terapêutico de polissacarídeos de espécies vegetais nativas do ambiente semiárido brasileiro, foram

realizados na região de estudo deste projeto. Além disso, o presente projeto proporcionará a

inclusão e o intercâmbio entre jovens e experientes pesquisadores com ampla experiência na área de

atuação proposta, além de expandir as possibilidades de conhecimento de jovens estudantes de

iniciação científica, os quais poderão futuramente ingressar em cursos de Pós-graduação com uma

experiência de atuação mais solidificada, contribuindo, desse modo, para o desenvolvimento

regional do semiárido nordestino.

6. Orçamento detalhado

Rubrica Valor total estimado (R$)

Detalhamento

(i) Capital

Equipamentos e material permanente

58.078,79 Centrífuga refrigerada de bancada rotação até 18.000

rpm; Rotor angular 30º com tampa, para 6 tubos de 50

mL, velocidade de 10.000 rpm; Bomba de vácuo ¼ HP;

Módulo isolador 220V.

JUSTIFICATIVA: Os itens apresentados são necessários

para os procedimentos de extração, fracionamento e

obtenção final das amostras de polissacarídeos a serem

empregados nos testes químicos e de atividade

biológica.

Pletismômetro para patas de ratos e camundongos;

Placa quente (hot-plate).

JUSTIFICATIVA: Os itens apresentados são necessários

para os ensaios de atividade antiedematogênica e

antinociceptiva em animais.

Atualmente, o laboratório destinado a essas atividades

não possui tais equipamentos.

(ii) Passagens 5.040,00 Terrestre: Petrolina-Teresina-Petrolina/Teresina-Parnaíba-Teresina; Petrolina-Fortaleza-Petrolina;

Aéreas: Petrolina-Recife-Petrolina/ Petrolina – a definir - Petrolina

JUSTIFICATIVA: o valor apresentado será utilizado nas visitas dos pesquisadores e estudantes de iniciação científica durante a execução do projeto na forma de intercâmbio e integração para discussão dos resultados e encaminhamentos a serem tomados pela equipe executora. Também será empregado no custo de deslocamentos durante eventos de divulgação científica como congressos, reuniões anuais e a jornada de iniciação científica FACEPE 2013/2014.

(iii) Diárias 3.944,43 JUSTIFICATIVA: o valor apresentado será utilizado nas visitas dos pesquisadores e estudantes de iniciação

científica durante a execução do projeto, além do custo de deslocamentos durante eventos de divulgação

científica.

(iv) Bolsas 8.640,00 JUSTIFICATIVA: concessão de duas cotas de BIC no valor de R$ 360,00 cada, por um período de 24 meses. Esse

recurso atenderá estudantes de graduação da UNIVASF durante a execução de suas atividades propostas no

projeto.

(v) Bens de custeio

Reagentes para extração, obtenção e

11.645,50 Ácido D-galacturônico, D-Galactose, Meta-hidroxifenil, DEAE Sephacel, Tetraborato de sódio, Ácido clorídrico,

análise química das amostras de

polissacarídeos.

Ácido sulfúrico, Ácido fosfórico, Acetona, Etanol absoluto, Metanol, Álcool Iso-propílico, Ácido tricloroacético, Folin- reagente de fenol, Fenol líquido, Tetraborato de sódio, Coomassie Blue G-250, Fosfato de sódio monobásico, Fosfato de potássio monobásico.

JUSTIFICATIVA: Esses itens de alto custo são

imprescindíveis à execução das atividades. Sua

aquisição permitirá desenvolver todas as etapas

necessárias à obtenção das amostras para avaliação de

seus atributos químicos, estruturais e funcionais.

Reagentes padrões para ensaios de

atividade antiedematogênica e antinociceptiva.

2.081,00 Reagentes químicos e padrões certificados (Carragenina, Dextrana, Zimosan, Histamina, Serotonina, Bradicinina,

Prostaglandina E2, L-arginina, Indometacina, entre outros).

JUSTIFICATIVA: Esses itens são imprescindíveis à execução das atividades de avaliação do efeito antiedematogênico e antinociceptivo nas diferentes amostras obtidas. Além disso, essa etapa fornecerá subsídio para a compreensão do modo de ação dos polissacarídeos estudados nos modelos testados.

Reagentes padrões para ensaios de atividade anti-

inflamatória in vivo e in vitro.

6.171,00 Reagentes químicos e padrões certificados: Brometo de

hexadecitrimetilamônio, Anticorpos anti-citocinas, substratos para reações enzimáticas (OPD, DNTB),

indutores de inflamação.

JUSTIFICATIVA: Esses são imprescindíveis à execução das atividades de avaliação do efeito anti-inflamatório in vivo e in vitro. Sua utilização permitirá avaliar o mecanismo de ação pelo qual as moléculas em estudo promovem um evento ou resposta anti-inflamatória nos modelos de estudo propostos.

Consumíveis para análises

espectroscópicas (RMN)

986,00 Tubos de RMN 5 mm 7 Lg 500 Mhz (5/Cx) Norell Dlm-4.100; Água Deuterada (D,99.9%) b(100g) Cil.

JUSTIFICATIVA: A técnica de ressonância magnética nuclear permitirá avaliar a natureza estrutural das amostras químicas de polissacarídeos. Sua realização será de grande contribuição para a obtenção dos objetivos deste projeto.

Consumíveis de uso geral

4.852,38 Reagentes de grau analítico, plásticos e vidrarias, seringas, membranas de diálise, clusters de membrana,

sistemas de filtração, membranas de filtração, cubetas de vidro, plástico e quartzo, mangueiras e conexões para

sistema de cromatografia líquida e gasosa.

JUSTIFICATIVA: tais itens serão adquiridos durante o

início e, se necessário, durante o andamento do projeto. Os materiais adquiridos serão repassados aos laboratórios participantes do projeto mediante solicitação do responsável.

Serviços de terceiros 3.990,00 Manutenção de equipamentos, serviços de impressão de pôsteres, correção de artigos na língua inglesa por

revisores especializados.

Total 105.429,10 JUSTIFICATIVA: esse valor será destinado ao pagamento de serviços para eventual conserto de aparelhos ou calibração dos mesmos. Também será empregado para a confecção de pôsteres para os eventos de divulgação científica. Alguns periódicos exigem para publicação a correção dos manuscritos por revisores especializados na língua inglesa, desse modo, parte do recurso será destinada a tal fim.

7. Cronograma 7.1 Cronograma Físico Trimestral

Etapas trimestrais Ano 01

(2012-2013) Ano 02

(2013-2014)

1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º

Levantamento bibliográfico. X X X X X X X

Aquisição de bens de capital e material de consumo. X X

Atividades de campo nas áreas de coleta do material vegetal. X X

Processamento e determinação dos protocolos de extração dos polissacarídeos dos frutos e/ou sementes.

X X X

Extração e fracionamento dos polissacarídeos das espécies de estudo. X X X X X

Análise das propriedades químicas das amostras polissacarídicas (teor de ácido urônico, proteína e carboidrato).

X X X

Ensaios de atividade biológica das frações polissacarídicas obtidas (atividades antiedematogênica e antinociceptiva).

X X X X X

Ensaios de atividade biológica das frações obtidas (atividade anti-inflamatória in vivo e in vitro).

X X X X X

Análises químicas e espectroscópicas das frações polissacarídicas obtidas (FT-IR, HPSEC, RMN).

X X X

Compilação de dados, confecção de resumos, divulgação de resultados em eventos, e preparação de manuscritos dos artigos.

X X X X

Confecção do relatório técnico final. X

X Considerar a fenologia das espécies propostas no estudo em relação ao período de frutificação das mesmas.

8 Identificação dos participantes do projeto Participante Cargo/ Instituição

Dr. Dráulio Costa da Silva - Coordenador

Professor Adjunto (Área de atuação: Bioquímica)/ Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), Petrolina,PE. Professor efetivo do Colegiado de Ciências Biológicas desde janeiro de 2009. Doutor em Bioquímica pela Universidade

Federal do Ceará com tese defendida e aprovada em agosto de 2011. Tem experiência na área de bioquímica de macromoléculas,

isolamento, caracterização e aplicação farmacológica de polissacarídeos vegetais.

http://lattes.cnpq.br/5694984173742159 Dr. André Luiz dos Reis Barbosa - Pesquisador

Professor Adjunto (Área de atuação: Farmacologia)/ Universidade Federal do Piauí (UFPI). Doutor em Farmacologia pela

Universidade Federal do Ceará. Desenvolve trabalhos na área de inflamação geral e do trato gastrintestinal além de estudar

mecanismos moleculares envolvidos na fisiopatologia da dor aguda de caráter inflamatório e dor crônica.

http://lattes.cnpq.br/4988298209243763 Dr. Jand-Venes Rolim Medeiros - Pesquisador

Professor Adjunto (Área de atuação: Farmacologia)/ Universidade Federal do Piauí (UFPI). Doutor em Farmacologia pela

Universidade Federal do Ceará. Tem experiência na área de Farmacologia, com ênfase em Farmacologia do Trato

Gastroinestinal e Inflamação, atuando principalmente nos temas inflamação, úlcera gástrica, mucosite.

http://lattes.cnpq.br/9633014722855515

Drª. Regina Célia Monteiro de Paula - Pesquisadora

Professora Associada (Área de atuação: Química de biopolímeros/Universidade Federal do Ceará (UFC). Tem

experiência na área de Química, com ênfase caracterização e modificação de polissacarídeos, nano- e micropartículas de

biopolímeros para liberação de fármacos.

http://lattes.cnpq.br/5685898279302235

Drª. Jeanny da Silva Maciel -Pesquisadora

Professora Adjunta (Área de atuação: Química de Biopolímeros)/ Universidade Federal do Ceará (UFC). Doutora em Química

Inorgânica pela Universidade Federal do Ceará. Atua principalmente nos seguintes temas: polissacarídeos regionais,

géis, sistema de liberação de fármacos e modificação de polissacarídeos.

http://lattes.cnpq.br/9484470414986626

A definir - estudante Estudante de graduação/ Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF)

A definir - estudante Estudante de graduação/ Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF)

9. Indicação de colaboração ou parceria já estabelecida com outros centros de pesquisa na área

Os procedimentos de extração, fracionamento, caracterização química (teor

de carboidratos, proteínas e ácido urônico) e determinação de algumas das atividades

biológicas propostas para as amostras de polissacarídeos obtidas serão realizadas no

Laboratório de Bioquímica/Ecologia Química (coordenado pelo Prof. Dr. Draulio Costa

da Silva) do Núcleo de Ecologia Molecular (NecMol) da Universidade Federal do Vale

do São Francisco (UNIVASF), em Petrolina, Pernambuco. Esse núcleo conta com

infraestrutura laboratorial para o desenvolvimento das análises biquímicas e químicas

além de aplicação das amostras em modelos de edema, inflamação e antinocicepção,

sendo necessária a aquisição de alguns equipamentos para a realização destes últimos.

Os procedimentos de caracterização química [métodos espectroscópicos

(FT-IR) e estimativa da massa molar (HPSEC)] das amostras obtidas serão realizados

no Laboratório de Polímeros do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da

Universidade Federal do Ceará (UFC), sob a supervisão da Professora Drª Regina C. M

de Paula. As análises de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) serão realizadas no

Centro Nordestino de Aplicação e Uso de Ressonância Magnética Nuclear

(CENAUREMN) na Universidade Federal do Ceará em Fortaleza, sob a supervisão da

Professora Drª. Jeanny da S. Maciel.

Os ensaios de atividade anti-inflamatória in vivo e in vitro descritos na

metodologia desta proposta serão realizados no Laboratório de Farmacologia do

Campus Ministro Reis Velloso da Universidade Federal do Piauí, Parnaíba, PI, sob a

supervisão dos Professores Doutores Jand-Venes Rolim Medeiros e André Luiz dos

Reis Barbosa.

10. Disponibilidade efetiva de infraestrutura e de apoio técnico para o desenvolvimento do projeto

O presente projeto contará com infraestrutura e logística do Núcleo de

Ecologia Molecular (NecMol), um setor da UNIVASF. Neste complexo de laboratórios

constam equipamentos e materiais que auxiliarão na execução das atividade propostas.

Estão disponíveis para uso equipamentos como sistema de purificação de água osmose

reversa, destilador, deionizador, estufas de esterilização e secagem e forno mufla, além

de vidrarias e uma certa quantidade de reagentes. Em relação ao Laboratório de

Bioquímica/Ecologia Química, o mesmo conta com sistema de cromatografia a baixa

pressão com coletor de frações e bomba peristáltica, bomba de vácuo, banho ultra-

termoestático, evaporador rotativo, liofilizador, refrigerador, espectrofotômetro,

balanças analítica e de precisão, potenciômetro, cubas e fonte para eletroforese, agitador

mecânico, chapa aquecedora, capela de exaustão de gases, agitador magnético e

agitador de tubos.

O Laboratório de Polímeros da Universidade Federal do Ceará conta com

ótima infraestrutura para execução das atividades relacionadas à caracterização química

e estrutural das moléculas em estudo. Estão disponíveis os equipamentos,

espectrofotômetro FT-IR Shimadzu 8300 e cromatógrafo Shimadzu LC-10AD, para

citar alguns. Para as análises de Ressonância Magnética Nuclear será utilizada a

infraestrutura do CENAUREMN através do espectrômetro BRUKER, modelo

AVANCE-DRX-500.

Para os ensaios de atividade anti-inflamatória, o Laboratório de

Farmacologia (UFPI) conta com todos os equipamentos necessários à sua execução,

como leitora de microplacas, freezer, refrigerador, centrífuga de bancada, microscópio,

espectrofotômetro e agitadores.

11. Referências Bibliográficas ALBUQUERQUE, U. P., MEDEIROS, P. M., ALMEIDA, A.L. S; MONTEIRO, J. M., LINS, FREITAS, E. M. N., MELO, J. G. SANTOS, J. P. Caatinga: biodiversidade e qualidade de vida - Bauru, SP: Canal 6, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Laboratório de Etnobotânica Aplicada, 2010.

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Anexo I – Comprovante da submissão para a Comissão de Ética no Uso de Animais