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1. Introdução

Nos últimos anos, o envelhecimento da população tem-se tornado alvo

de intensa preocupação dos órgãos de saúde. Nos países desenvolvidos, este

fenômeno ocorreu lentamente, em uma situação de evolução econômica, de

crescimento do nível de bem-estar e de redução das desigualdades sociais.

Mais recentemente, este processo ganhou maior importância nos países em

desenvolvimento, com o aumento acentuado da população idosa em relação à

população geral (GIATII & BARRETO, 2003; LIMA-COSTA & VERAS, 2003).

No Brasil, a população na faixa etária acima dos 60 anos é a que mais

cresce em termos proporcionais. De acordo com as projeções estatísticas da

Organização Mundial de Saúde (OMS), entre 1950 e 2025, a população de

idosos no país crescerá na ordem de 16 vezes enquanto que, no mesmo

período, o crescimento da população mundial será de não mais que 5 vezes, o

que colocará o Brasil, em termos absolutos, como a sexta população de idosos

do mundo (BRASIL, 1999). Em decorrência de tais mudanças na pirâmide

populacional, a prevalência de doenças crônicas não-transmissíveis, em

destaque a osteoporose, vem aumentando e colocando em risco o bem-estar

das populações idosas.

Segundo a OMS, a osteoporose é definida como “uma doença

caracterizada pela perda de massa óssea e deterioração microestrutural do

tecido ósseo, levando a uma maior fragilidade e a um conseqüente aumento no

risco de fraturas” (WHO, 1998). Em humanos, os sítios de maior incidência de

fratura são a região distal do antebraço (fraturas de Colles), as vértebras

torácicas e lombares e a região proximal do fêmur (colo femoral) (APM, 1995a;

HEGSTED, 2001).

Em 1993, o custo total para o tratamento de fraturas nos Estados Unidos

(EUA) foi de US$ 20 bilhões, sendo mais de um terço deste valor apenas com

as fraturas da região da bacia. Em 1998, pesquisas epidemiológicas indicavam

que cerca de 28 milhões de norte-americanos possuíam algum nível de redução

na densidade mineral óssea (APM, 1995a).

Dentre os fatores de risco (idade, estado hormonal, atividade física,

constituição genética, medicamentos, álcool, fumo) para o desenvolvimento da

osteoporose, a nutrição exerce um papel preponderante. Assim, uma adequada

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ingestão e absorção de cálcio (Ca) asseguram uma mineralização durante

períodos de rápido crescimento e mantêm a massa e a densidade óssea

durante períodos críticos do desenvolvimento (BALLABRIGA, 2000; LOUIE,

1996). Neste contexto, pesquisas têm sido realizadas com o objetivo de

otimizar a biodisponibilidade dos minerais nos alimentos. Desta forma, uma

atenção significativa tem sido dada ao papel de determinados componentes

dos alimentos no metabolismo mineral.

A influência das fibras alimentares (FA) na biodisponibilidade de minerais

tem sido alvo de muitos estudos, nos últimos 20 anos. Em especial, a presença

de fitatos e oxalatos nos alimentos, ou dietas com elevado teor em fibras,

prejudica a absorção dos minerais no intestino delgado, através da formação de

complexos insolúveis entre a fibra, os fitatos e/ou oxalatos, e os minerais.

Entretanto, tal efeito negativo tem sido reavaliado quando se leva em

consideração a passagem deste complexo para as porções distais do intestino.

Através da fermentação bacteriana, frutanos (frutooligossacarídeos e

inulina), galactooligossacarídeos, lactulose e outros oligossacarídeos

resistentes, bem como polióis e amidos resistentes à digestão no intestino

delgado são intensamente metabolizados, proporcionando, desta forma, um

ambiente favorável para a absorção destes minerais (BROMMAGE, 1993;

CUMMINGS & ENGLYST, 1995; YOUNES et al., 1996; LOPEZ et al., 2000).

Sabendo-se que a osteoporose é resultante de uma perda progressiva

da massa óssea, e considerando-se que esta pode ser reduzida com uma maior

absorção de Ca, principalmente durante a infância e a adolescência, verifica-se

a importância em se estimular o consumo de alimentos com teores elevados

destes componentes.

3

2. Revisão da literatura 2.1. Osteoporose: epidemiologia e fatores de risco

A partir da segunda metade do século vinte houve uma intensificação do

processo de envelhecimento populacional em praticamente todos os países do

mundo, conseqüência de um crescimento mais elevado da população idosa em

relação aos demais grupos etários (CAMARANO, 2002).

O Brasil apresenta um dos mais agudos processos de envelhecimento

populacional entre os países mais populosos. A proporção de pessoas idosas

com sessenta anos e mais aumentou de 6,1% (7.204.517 habitantes) em 1980,

para 8,6% (14.536.029 habitantes) em 2000, correspondendo a um aumento

absoluto de 7,3 milhões de indivíduos (IBGE, 1994, 2001). As projeções

mostram que esse segmento será responsável por 15% da população brasileira

no ano 2025, colocando o país entre as seis maiores populações do mundo, em

números absolutos (32 milhões), nesta faixa etária (BRASIL, 1999, 2003).

Este envelhecimento populacional tem ocorrido, principalmente, devido a

diminuições importantes dos coeficientes de mortalidade e das taxas de

fecundidade e natalidade. A queda da mortalidade em todas as faixas etárias

levou, inicialmente, ao aumento da expectativa de vida ao nascer e,

posteriormente, da expectativa de vida aos 60 anos [sobrevida]

(CAMARANO, 2002). Essa situação, conhecida como “transição demográfica”,

é acompanhada pela mudança da morbi-mortalidade, com aumento da

incidência e prevalência de doenças crônicas não-transmissíveis, levando ao

aumento do número de pessoas incapacitadas e dependentes de cuidados de

longa duração, um processo denominado “transição epidemiológica” (FRIES,

1980; KALACHE et al., 1987; TUCKER & BURANAPIN, 2001).

Entre estas doenças crônicas não-transmissíveis, pode-se destacar a

osteoporose, que é uma enfermidade crônica, multifatorial, relacionada à perda

progressiva da massa óssea, geralmente de progressão assintomática até a

ocorrência de fraturas. O envelhecimento no ser humano causa um declínio na

formação óssea, aumentando, como conseqüência, o risco de fraturas e de

pequenos traumas. Nos EUA, os recursos utilizados no tratamento de fraturas

por osteoporose representaram, em 1995, um total de 432 mil hospitalizações,

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aproximadamente 2,5 milhões de consultas médicas e 180 mil admissões em

casas de repouso (APM, 1995c; KOWALSKI et al., 2001).

A maior complicação da osteoporose encontra-se nas fraturas vertebrais,

no punho, no úmero e nas costelas. Entretanto, as do fêmur geralmente são de

maior morbidade, sendo que 50% destas evoluem para a incapacidade parcial

ou total. Cerca de 20 a 30% dos indivíduos com fratura de colo de fêmur por

osteoporose apresentam complicações circulatórias, respiratórias e

tromboembólicas, resultando em morte dentro dos dois primeiros anos após a

fratura (APM, 1995c).

A ocorrência da osteoporose está na dependência do pico de massa

óssea e da subseqüente velocidade de perda óssea (APM, 1995a; HEGSTED,

2001). Durante a infância e a adolescência a massa óssea se forma

progressivamente, com acréscimo de Ca durante a fase de consolidação

óssea, depois que a estatura adulta é alcançada. Ao término da consolidação,

quando a quantidade máxima de osso foi acumulada, diz-se que o adulto

atingiu sua massa óssea máxima (ou pico de massa óssea), embora a sua

cronologia possa variar com a idade do indivíduo e com a região do esqueleto

(CASHMAN, 2002; WEAVER & HEANEY, 2003).

Tem sido sugerido que cerca de 80% da variação da massa óssea é

predeterminada por fatores genéticos. Contudo, fatores étnicos, ambientais,

sociais e culturais constituem-se, também, em fatores associados à

possibilidade do desenvolvimento da osteoporose. Outras evidências relativas

de risco são atribuídas ao tabagismo, alcoolismo, cafeína em altas doses,

estresse emocional, doenças metabólicas (como o diabetes mellitus,

hipogonadismo e artrite reumatóide), baixa ingestão de Ca, além de condições

que alterem a sua absorção intestinal, como síndromes de má absorção,

pancreatite crônica e gastrectomias (APM, 1995c; CASHMAN, 2002).

A partir do conceito de que a osteoporose resulta de uma perda

progressiva de massa óssea, tanto em densidade quanto em qualidade, e

reconhecendo-se que esta perda é menor nos indivíduos que durante a infância

e a adolescência conseguiram formar mais massa óssea, é conveniente afirmar

que a prevenção da enfermidade deve ter início já na infância. Assim, durante

esse período, a importância de uma dieta e de programas de exercícios

adequados deve ser levada em consideração (APM, 1995a).

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Existem outras situações patológicas nas quais esta fragilidade encontra-

se aumentada, como ocorre na osteomalácia, no hiperparatireoidismo, na

osteogênese imperfeita, entre outras. Dentre estas, é a osteoporose a de maior

prevalência na população mundial e, portanto, a que tem recebido uma maior

atenção (SARAIVA & LAZARETTI-CASTRO, 2002). 2.2. O osso: estrutura e funções

O osso é um tecido extremamente complexo que, juntamente com a

cartilagem, constitui o sistema esquelético. Embora pareça um tecido rígido e

inerte, o osso é, na realidade, um tecido dinâmico e suprido por nervos e vasos

sangüíneos (GARNER et al., 1996). O tecido ósseo possui um alto grau de

rigidez e resistência à pressão, assim, suas principais funções estão

relacionadas à proteção e à sustentação. Além disso, também funciona como

alavanca e apoio para os músculos, aumentando a coordenação e a força do

movimento proporcionado pela contração do tecido muscular (SAHA, 1990;

HEANEY, 2003).

Cerca de 65% do osso é constituído por uma fase mineral ou inorgânica,

que é representada fundamentalmente pelos cristais de hidroxiapatita

[Ca10(PO4)6(OH)2], formados pelo Ca e pelo fósforo (P), circundados por íons

presentes em menor quantidade, como o bicarbonato, o magnésio, o potássio e

o sódio. Os cristais de hidroxiapatita encontram-se hidratados, existindo,

portanto, uma camada de água e íons em volta do cristal e do líquido intersticial

(APM, 1995b; GARNER et al., 1996). Além disso, os cristais encontram-se

depositados em uma fase orgânica de fibras colágenas, sendo 95% constituídas

pelo colágeno do tipo I (GARNER et al., 1996).

As células ósseas estão continuamente ativas, tanto na criança quanto

no adulto, alterando o tamanho longitudinal (crescimento) e a forma

(modelamento) do osso ou, simplesmente, renovando velhas estruturas sem

modificar a forma (remodelamento) (GARNER et al., 1996). Em geral, as células

ósseas podem ser divididas em dois tipos: os osteoblastos e os osteoclastos,

sendo que, dos primeiros, são derivadas as células de revestimento e os

osteócitos. Todas essas células são responsáveis tanto por manter as

propriedades mecânicas como por mediar a função homeostática do Ca nos

ossos, auxiliando o organismo a manter um nível constante do mineral nos

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fluidos circulantes, e um suprimento de reserva de fósforo, sendo essas funções

influenciadas por agentes hormonais sistêmicos e locais (GARNER et al., 1996;

HEANEY, 2003).

A atividade anabólica do osso (formação) é mediada pelos osteoblastos,

que derivam de células do estroma da medula, e são responsáveis pela síntese

dos constituintes orgânicos do osso (fibras colágenas e mucopolissacarídeos) e,

conseqüentemente, pela calcificação da matriz osteóide. Por sua vez, a

atividade catabólica (reabsorção) é mediada pelos osteoclastos, que são células

gigantes multinucleadas derivadas da linhagem monócito-macrófago e possuem

um grande número de enzimas (GARNER et al., 1996). Os osteócitos são

conhecidos como moduladores da atividade celular, já que são responsáveis

pelo monitoramento da tensão que ocorre nos seus domínios quando o osso é

mecanicamente carregado, e pela transmissão dessa informação às células de

revestimento nas superfícies anatômicas próximas do osso, o que pode então

iniciar a remodelação óssea nesse local (HEANEY, 2003).

No processo fisiológico normal, a reabsorção e a formação ósseas estão

intimamente relacionadas em tempo, grau e espaço, tanto que a formação

óssea só é ativada depois que estiver estabelecida uma área de absorção. O

balanço entre formação e reabsorção mineral é claramente desviado para a

formação óssea em períodos de crescimento ósseo, como durante a infância e

a adolescência. Após esse período, e em condições normais, a intensidade de

formação e reabsorção ósseas é semelhante, de modo que a massa total do

osso permanece constante. Em décadas posteriores da vida, o balanço é

desviado para a reabsorção óssea, principalmente em mulheres após a

menopausa (SAHA, 1990; APM, 1995b; GARNER et al., 1996). Além disso, o

mecanismo de remodelação óssea é relativamente rápido no osso trabecular e

mais lento no osso cortical (SAHA, 1990).

O osso consiste de uma densa camada externa, ou córtex, e de uma

camada interna, que é um sistema interligado de lâminas, bastões e espículas,

dispostas de acordo com as solicitações mecânicas, chamada de osso

trabecular ou esponjoso. Na diáfise dos ossos longos, como o fêmur e a tíbia, o

componente cortical predomina, gerando um tubo oco, enquanto que próximo

às articulações, o córtex se torna mais fino e do lado interno apresenta uma

extensa rede de osso esponjoso (SAHA, 1990; HEANEY, 2003).

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Os segmentos distais dos ossos são chamados de epífises (Figura 1).

As hastes dos ossos longos são chamadas de diáfises e a porção onde as

mesmas se expandem, que emerge da região da placa de crescimento, é

chamada de metáfise. As células de revestimento do lado externo do osso

formam uma película ou membrana resistente chamada periósteo, enquanto

que as células nas superfícies internas, tanto de osso cortical quanto trabecular,

são chamadas de endósteo (HEANEY, 2003).

Figura 1– Regiões de um osso longo em crescimento. Extraído de HEANEY (2003).

Os espaços entre as placas trabeculares e as espículas são preenchidos

por medula óssea. No osso cortical denso, a remodelação ao longo dos anos

produz uma série de estruturas internas chamadas de ósteons ou sistemas de

Havers, nos quais camadas cilíndricas e concêntricas de osso são depositadas

ao longo do percurso de um capilar (HEANEY, 2003).

2.2.1. Propriedades mecânicas dos ossos

As propriedades mecânicas definem o comportamento de um material

quando sujeito a esforços de natureza mecânica e correspondem à sua

capacidade em transmitir e resistir aos esforços aplicados, sem romper ou sem

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que se produzam deformações incontroláveis (CHIAVERINI, 19791, citado por

SHIMANO, 2001).

O comportamento mecânico do osso pode ser estudado através da

realização de ensaios mecânicos em corpos de prova de tecido ósseo, com

dimensões e geometria definidas, de acordo com o ensaio a ser realizado, ou

através do exame do comportamento mecânico como uma unidade anatômica

inteira (osso inteiro), determinando as contribuições das suas propriedades

estruturais (HOLANDA, 1999).

O osso apresenta um limite de deformação elástica e um ponto crítico

que delimita o alcance da deformação de uma variação elástica ou não-elástica.

O osso não é linear, nem inteiramente elástico na porção inicial da curva carga

X deformação (Figura 2), mas deforma-se lentamente. Portanto, o osso está

sujeito a uma deformação não recuperável, mas pode ceder sob tensão e

recuperar-se da deformação dentro do seu limite [porção elástica da curva

tensão X deformação] (HOLANDA, 1999).

Figura 2– Gráfico carga X deformação (deflexão), a partir do qual são obtidas as principais propriedades mecânicas do ensaio de flexão. Adaptado de EINHORN (1996).

1 CHIAVERINI, V. Tecnologia mecânica-Estrutura e propriedades: processos de fabricação. São Paulo, v. 1, McGraw-Hill do Brasil, 1979.

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Uma outra propriedade do osso é conhecida como viscoelasticidade. No

material viscoelástico as propriedades mecânicas diferem de acordo com a taxa

de carregamento. Uma elevação na taxa de carregamento (ou deformação)

aumenta o módulo de elasticidade e a resistência máxima do osso cortical,

enquanto há decréscimo da deformação máxima. Com pequenas taxas de

deformação o osso não exibe deformação elástica apreciável, mas flui como um

líquido viscoso sendo que, com altas taxas de deformação, o mesmo osso pode

comportar-se como um sólido frágil e elástico (EINHORN, 1996).

A determinação das propriedades mecânicas de um material é realizada

por meio de vários ensaios, que podem ser destrutivos, quando promovem a

ruptura ou inutilização do material, ou não-destrutivos, em caso contrário

(SEDLIN & HIRSCH, 1966).

A tração é produzida no material quando duas forças são aplicadas em

sentidos opostos na mesma linha de aplicação, alongando o material. A

resistência à tração provém das forças moleculares atrativas, que tendem a

dificultar a separação do material. A compressão é o resultado de duas forças

atuando na mesma linha, uma em direção a outra, achatando o material. A

resistência à compressão provém das forças moleculares repulsivas, que

mantém as mínimas distâncias interatômicas (EINHORN, 1996). Se forças

atuam sobre um material de modo que tendem a induzir tensões de compressão

(em um lado da secção transversal) e tensões de tração (na parte restante), diz-

se que o material está sob flexão (EINHORN, 1996; SHIMANO, 2001).

Com o registro das forças e deformações ocorridas durante o ensaio

mecânico pode-se construir a curva carga X deformação (Figura 2). A porção

linear da curva carga X deformação é conhecida como região elástica. No ponto

onde a curva torna-se não-linear, a região elástica cede lugar à região plástica e

a tensão neste ponto é conhecida como limite elástico. O ponto na curva onde

isto ocorre é conhecido como ponto de escoamento, sendo que o carregamento

adicional além do ponto de escoamento causa deformação permanente no

material. Esta propriedade é conhecida como plasticidade e indica a resistência

de um material à deformação permanente. Na região elástica, o material

deforma somente enquanto a carga é aplicada, retornando ao seu tamanho e

dimensões originais quando a carga é removida. Abaixo do limite elástico, a

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força aplicada ao material alonga, mas não rearranja suas ligações atômicas

(EINHORN, 1996).

A resistência de um osso ou corpo de prova de tecido ósseo é avaliada

através da carga máxima (limite máximo) aplicada no material até a ruptura. A

integração da curva fornece a área, e esta é a medida da energia de

deformação. A energia total de deformação absorvida pelo material até o ponto

de ruptura é chamada de tenacidade. A energia transferida para o material até o

ponto de escoamento pode ser recuperada após a remoção da carga. A energia

recuperada é conhecida como resiliência e é a medida da habilidade de

armazenar energia. Embora esta energia não seja recuperável na forma útil,

não será perdida, contanto que o material não atinja a deformação permanente

(EINHORN, 1996; HOLANDA, 1999).

2.3. Cálcio e magnésio: considerações gerais

O Ca é o quinto elemento mais abundante na biosfera, o principal

mineral do esqueleto e um dos cátions mais abundantes no corpo humano,

representando de 2 a 4% do peso corporal bruto, ou seja, cerca de 1.000 a

1.500 g no indivíduo adulto. Aproximadamente 99% desse total encontram-se

no esqueleto; o restante (1%) encontra-se nos dentes, tecidos moles e no fluido

extracelular. Cerca de 1% do Ca ósseo é livremente intercambiável com o Ca

do fluido extracelular (LOBAUGH, 1996; Dos REIS & JORGETTI, 2000;

CASHMAN, 2002; WEAVER & HEANEY, 2003).

Como um elemento funcional do fluido extracelular e do citosol, o Ca

possui um papel decisivo em uma variedade de processos bioquímicos e

fisiológicos, incluindo a liberação de neurotransmissores durante a transmissão

dos impulsos nervosos, formação do tecido de sustentação dos animais (tecido

ósseo) juntamente com o fósforo e, com proteínas e fosfolipídeos, desempenha

um papel essencial na manutenção da integridade das membranas celulares,

além de atuar no processo de coagulação sangüínea, de contração e

relaxamento muscular e na ativação de várias enzimas (entre as quais, a

amilase e a lipase) (LOBAUGH, 1996; LOUIE, 1996; JONES et al., 1998).

Em relação ao magnésio (Mg), sua real importância foi estabelecida, em

estudos realizados no início da década de 1930, a partir de observações

11

sistemáticas de sinais de deficiência em animais de experimentação (SHILS,

1988; SCHWARTZ, 1990). Mais recentemente, evidências cada vez maiores

têm indicado que a deficiência de Mg está associada com a etiologia de

diversas doenças metabólicas (SHILS, 1988; RUDE, 1998; RUDE et al., 2003;

TAM et al., 2003).

O Mg é o mais abundante cátion mineral divalente nas células, formando

complexos com uma variedade de moléculas orgânicas que apresentam

atividades biológicas, e suas concentrações extracelulares e intracelulares

relativamente altas, em comparação com outros eletrólitos, tendem a favorecer

sua ligação a essas moléculas (SHILS, 1988; SARIS, 2000; SHILS, 2003). O Mg

atua na regulação da atividade de mais de 300 reações enzimáticas, em geral,

de duas maneiras: ligando-se ao substrato, formando um complexo com o qual

a enzima interage, como na reação de cinases com o MgATP; ou ligando-se

diretamente à enzima, alterando sua estrutura ou servindo a um papel catalítico

(como exemplos, exonuclease, topoisomerase, e RNA e DNA isomerases).

Além disso, intervém, igualmente, na duplicação dos ácidos nucléicos, na

excitabilidade neural e na transmissão do influxo nervoso, agindo sobre as

trocas iônicas da membrana celular (RUDE, 1998; SARIS, 2000; SHILS, 2003).

Sua concentração corporal, em um indivíduo adulto e sadio, está entre

20 a 28 g, sendo que mais da metade do total encontra-se no osso e o restante

presente em tecidos moles (SARIS, 2000; SHILS, 2003). Embora o osso seja o

maior reservatório de Mg, grande parte encontra-se dentro da cápsula de

hidratação ou na superfície dos cristais de hidroxiapatita (SCHWARTZ, 1990;

SOJKA, 1995; GARNER et al., 1996). Assim, como o Mg neste compartimento

encontra-se prontamente intercambiável e, como as suas concentrações no

osso encontram-se reduzidas em situações de deficiência (RUDE, 1998;

CREEDON et al., 1999), tem sido sugerido que o osso serve como reservatório

para a manutenção do Mg extracelular. No plasma, 55% do Mg encontram-se

na forma ionizada ou livre, sendo 15% ligados a ânions e cerca de 30% ligados

a proteínas plasmáticas, em especial, a albumina (RUDE, 1998; SARIS, 2000).

12

2.3.1. Aspectos metabólicos e nutricionais do cálcio

Os indicadores que refletem o estado nutricional referente ao Ca estão

intimamente relacionados à sua concentração no esqueleto. O Ca é um dos

principais constituintes da matriz óssea mineralizada formando, juntamente com

o P, os cristais de hidroxiapatita sendo, deste modo, fundamental para a

manutenção de um tecido ósseo saudável e resistente. Através da remodelação

óssea, estes íons sofrem um processo de solubilização durante a reabsorção,

sendo transferidos para a circulação e retornando ao estado sólido através da

mineralização do tecido osteóide recém-formado. A taxa de deposição do Ca no

esqueleto é mais alta em recém-nascidos, diminuindo a um nível muito mais

baixo à medida que o crescimento tende a cessar (APM, 1995b; GARNER et al.,

1996; BRONNER & PANSU, 1999).

O nível sérico normal de Ca, em humanos adultos, varia de 8,7 a 10,2 mg/dL

e permanece rigorosamente controlado, oscilando não mais que 5% durante as

24 h do dia (LOUIE, 1996). Sua manutenção é regulada por um sistema de

fatores controladores e mecanismos de feedback (retroalimentação),

envolvendo a interação de hormônios calciotrópicos (paratormônio [PTH],

vitamina D [1,25(OH)2D3] e calcitonina) com órgãos como o intestino, os rins e o

osso (Figura 3). O PTH e a 1,25(OH)2D3 são secretados quando a

concentração plasmática de Ca encontra-se diminuída (LOBAUGH, 1996;

WEAVER & HEANEY, 2003). A secreção do PTH parece ser regulada por um

receptor sensível ao Ca, que também está envolvido no controle da absorção

de Ca ao longo do trato gastrintestinal (CHATTOPADHYAY et al., 1998).

Quando tal concentração eleva-se em resposta à absorção aumentada

de Ca, à reabsorção tubular aumentada e à reabsorção óssea, o limiar de

excreção renal altera-se e Ca extra é excretado na urina. Outro mecanismo que

é ativado quando a concentração plasmática de Ca encontra-se aumentada é a

liberação, pela tireóide, da calcitonina, que retarda a reabsorção osteoclástica,

diminuindo a liberação óssea de Ca (LOBAUGH, 1996; CASHMAN, 2002;

WEAVER & HEANEY, 2003).

Em condições de pH e temperatura normais, aproximadamente 50% do

Ca sérico encontram-se na forma ionizada, que é a fração fisiologicamente ativa

e importante no transporte e transmissão de sinais celulares. Outros 40% estão

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ligados às proteínas plasmáticas, sendo 36% ligados à albumina. Dessa forma,

alterações na concentração de albumina influenciam a concentração do Ca

sérico. Os 10% restantes formam complexos com outros componentes, como o

citrato e o P. Tanto a fração iônica quanto a complexada são ultrafiltradas pelo

rim, enquanto a ligada às proteínas é retida nos glomérulos (LOBAUGH, 1996;

LOUIE, 1996; JONES et al., 1998; Dos REIS & JORGETTI, 2000).

Em um adulto normal, existe um intercâmbio lento, mas contínuo, de Ca

entre o seu principal reservatório, o esqueleto, e o meio extracelular. Além

disso, há um balanço constante entre a absorção intestinal e a sua excreção

pelos rins (Figura 3). Se existe uma insuficiente ingestão de Ca, esse mineral é

removido do osso para que os níveis séricos permaneçam controlados.

Considerando que existem perdas diárias fixas pelas fezes e urina,

independentemente da quantidade ingerida, em dietas pobres o balanço de Ca

permanece negativo (APM, 1995b; LOUIE, 1996; Dos REIS & JORGETTI,

2000).

Dois mecanismos estão envolvidos na absorção intestinal do Ca: um

paracelular, passivo e não saturável, que é o principal responsável pela

absorção quando a quantidade de Ca ingerida é adequada ou elevada, sendo

diretamente influenciado pela quantidade de Ca presente no quimo; e um

transcelular, ativo e saturável, que envolve a participação de canais e proteínas

transportadoras de Ca encontrados no epitélio intestinal (BRONNER et al.,

1986; LOUIE, 1996; BRONNER, 1998; Dos REIS & JORGETTI, 2000; WEAVER

& HEANEY, 2003).

14

Filtração

Figura 3– Representação esquemática dos compartimentos e a regulação da homeostasia do cálcio no organismo.

O movimento transcelular de Ca envolve três etapas: a entrada através

do pólo apical da membrana celular, a difusão através do citoplasma e a saída

através da membrana basolateral. A entrada na célula ocorre sob um gradiente

eletroquímico através de canais de Ca, que não são dependentes de voltagem.

O principal regulador fisiológico da absorção intestinal de Ca é a 1,25(OH)2D3,

que pode aumentar o transporte ativo em até 30%. A 1,25(OH)2D3, que é

responsiva às concentrações séricas de Ca, regula a síntese da calbindina (9

kDa) por transcrição de DNA, no momento em que a vitamina se liga a

receptores nucleares. A calbindina atua ligando-se ao Ca2+ na superfície da

célula, internalizando-o através de vesículas endocitóticas que, provavelmente,

fundem-se aos lisossomos, aumentando a taxa de difusão intracelular do íon.

Depois da liberação do Ca ligado no interior do lisossomo ácido, a calbindina

Absorção intestinal

Excreção fecal

CÁLCIO EXTRACELULAR

Absorção

PTH

Reabsorção

Formação

1,25 (OH)2D3 Vit D

Ingestão

Excreção urinária

15

retorna à superfície da célula, e os íons Ca2+ saem da célula pela membrana

basolateral. A saída do Ca da célula é uma etapa que é mediada pela

CaATPase, ocorre contra um gradiente eletroquímico e também parece ser

modulada pela 1,25(OH)2D3 (BRONNER et al., 1986; LOUIE, 1996; BRONNER,

1998; JONES et al., 1998; BRONNER & PANSU, 1999; WEAVER & HEANEY,

2003). O segundo movimento intestinal de Ca responde pela rota paracelular de

absorção do mineral. O fluxo de Ca pode ocorrer da mucosa em direção à

serosa ou vice-versa, e predomina nas regiões do jejuno e do íleo. Este

processo é independente da presença da 1,25(OH)2D3 e da calbindina, sendo

determinado pela solubilidade do mineral, pela permeabilidade das junções

oclusivas (tight junctions) e pelo tempo de residência do mineral em

determinada região do intestino (BRONNER et al., 1986; LOUIE, 1996;

BRONNER, 1998; BRONNER & PANSU, 1999).

Em humanos, a quantidade de Ca absorvido depende de uma variedade

de fatores, incluindo o comprimento do segmento intestinal, tempo de residência

do quimo em um determinado segmento do intestino, a sua concentração no

lúmen intestinal e a biodisponibilidade do mineral no alimento (LOUIE, 1996;

BRONNER & PANSU, 1999). A eficiência absortiva, geralmente, varia

inversamente com a ingestão, mas a quantidade absoluta absorvida aumenta

com a ingestão. Além disso, quando as demandas do mineral encontram-se

aumentadas, como durante a gravidez, a lactação e o crescimento do

esqueleto, a eficiência do transporte de Ca encontra-se aumentada (BRONNER

& PANSU, 1999; WEAVER & HEANEY, 2003).

O jejuno absorve uma maior quantidade de Ca do que o duodeno devido,

principalmente, ao seu maior comprimento. O duodeno, entretanto, possui uma

melhor capacidade absortiva (transporte ativo) por unidade de comprimento.

Quanto maior o tempo no qual o quimo reside em uma determinada região do

intestino, maior a chance do movimento de íons através da camada estacionária

de água para a mucosa intestinal, e a conseqüente absorção. O íleo possui uma

menor capacidade de absorção por unidade de comprimento do que o jejuno.

Entretanto, devido ao comprimento ligeiramente maior do íleo e a sua

habilidade para absorver mais Ca através do movimento paracelular, o íleo

absorve uma maior quantidade do que os outros segmentos intestinais (LOUIE,

16

1996). Cerca de 11% do Ca absorvido pelo movimento paracelular, ao longo de

todo o intestino, é absorvido no intestino grosso. Quando a ingestão de Ca é

elevada, os transportadores de Ca nas regiões superiores do trato

gastrintestinal ficam saturados, permitindo, desse modo, que uma maior

quantidade de Ca seja absorvida pela rota paracelular, e que uma maior

quantidade do mineral se encontre disponível para absorção no intestino grosso

(BRONNER et al., 1986; DUFLOS et al., 1995; BRONNER, 1998). Além disso,

estudos realizados in vivo, têm evidenciado a presença de um sistema ativo,

dependente da vitamina D, no intestino grosso (AMMANN et al., 1986;

BRONNER & PANSU, 1999). De acordo com AMMANN et al. (1986), a injeção

de Ca radioativo (45CaCl2) diretamente no ceco de ratos resultou em um

aumento de 36% na absorção ativa do mineral. Entretanto, tal sistema mostrou-

se ineficaz quando o mineral foi oferecido através da dieta. De acordo com os

autores, houve uma provável transformação do Ca, ao longo do trato

gastrintestinal, para uma forma menos absorvível.

Neste contexto, estudos adicionais com animais e humanos têm

sugerido que o intestino grosso poderia ser o principal local de absorção de Ca,

à medida que a fermentação ocorresse (DEMIGNÉ et al., 1995; YOUNES et al.,

1996; OHTA et al., 1998; VAN DEN HEUVEL et al., 1999). No cólon, a

fermentação ocorre através da ação de enzimas específicas produzidas pela

microbiota intestinal sobre determinados substratos, dos quais os carboidratos

são os mais importantes (CUMMINGS & ENGLYST, 1995). Além disso, a

fermentação pode ser mantida, em uma certa extensão, por substratos

endógenos, tais como mucinas e células esfoliadas, o que poderia explicar, de

alguma forma, a absorção do Ca no intestino grosso em animais alimentados

com uma dieta isenta de fibra alimentar (FA) (SHIGA et al., 1998).

Durante a digestão, o Ca é desembaraçado de complexos na dieta e

liberado em uma forma solúvel e provavelmente ionizada para a absorção. Para

que isso ocorra é necessário a atuação de enzimas digestivas e um pH

relativamente ácido. Entretanto, complexos de baixo peso molecular, como o

oxalato de cálcio e o carbonato de cálcio, podem ser absorvidos intactos (APM,

1995b; LOUIE, 1996; WEAVER & HEANEY, 2003).

Existe uma seqüência de fatores que podem interferir na

biodisponibilidade do Ca, incluindo a forma química do mineral, a ligação

17

molecular, a quantidade ingerida e o estado nutricional do indivíduo. Além

desses, diversos componentes presentes na matriz do alimento podem

influenciar consideravelmente a utilização do Ca pelo organismo (LOUIE, 1996;

COZZOLINO, 1997; BROUNS & VERMEER, 2000). Desta forma, o

conhecimento das interações entre os fatores que afetam a biodisponibilidade e

os mecanismos envolvidos na absorção do Ca, pode permitir o desenvolvimento

de estratégias que visem um melhor aproveitamento do mineral pelo organismo

e a conseqüente diminuição do risco de doenças. 2.3.2. Aspectos metabólicos e nutricionais do magnésio

A homeostasia do indivíduo em relação a um mineral depende das

quantidades ingeridas, da eficiência da absorção e excreção intestinal e renal, e

da presença de componentes inibidores ou promotores na dieta (SHILS, 2003).

Em animais e humanos, o Mg absorvido pode variar entre 35 e 70% do Mg

ingerido (BRINK & BEYNEN, 1992; COUDRAY et al., 2003).

Os dados disponíveis na literatura, relacionados ao local e ao

mecanismo envolvido no transporte intestinal do Mg são, em geral,

controversos. A maioria dos estudos indica que a absorção do Mg ocorre

predominantemente no íleo, sendo que tal conclusão foi obtida

independentemente da metodologia experimental utilizada, bem como do tipo

de dieta, da idade ou do estado nutricional relativo ao magnésio estudado

(BRINK & BEYNEN, 1992; KAYNE & LEE, 1993; RUDE, 1998; COUDRAY et

al., 2003). Outros estudos têm evidenciado que a absorção intestinal do Mg em

função da sua ingestão obedece a um padrão curvilíneo, refletindo um processo

transcelular e saturável (COUDRAY et al., 2003; SHILS, 2003). Entretanto, tem

sido demonstrada, em ratos, a existência de uma correlação direta entre a

absorção de Mg e a sua concentração na dieta e no lúmen intestinal

(COUDRAY et al., 2002).

Em níveis usuais de ingestão, a absorção intestinal do Mg ocorre

principalmente por mecanismos de difusão e de arraste pelo solvente. Desta

forma, a solubilidade do Mg no lúmen intestinal é o principal fator no controle da

sua absorção (BRINK & BEYNEN, 1992; COUDRAY et al., 2003). Neste

contexto, tem sido verificada, em animais e humanos, uma contribuição

significativa de carboidratos fermentáveis para a absorção de Mg quando estes

18

são metabolizados pelas bactérias presentes no intestino grosso (OHTA et al.,

1994b; BABA et al., 1996; TAHIRI et al., 2001; COUDRAY et al., 2003). Com a

fermentação, é produzido um ambiente favorável para o aumento da

concentração de Mg na forma solúvel e, conseqüentemente, disponível para a

absorção. Além disso, outros componentes presentes na dieta, tais como fitatos,

oxalatos e fósforo, podem influenciar negativamente na absorção do Mg (RUDE,

1998).

O Mg absorvido é retido e utilizado ou para o crescimento tecidual

(incluindo os ossos) ou para demandas específicas dos demais sistemas no

organismo (SHILS, 1988; SHILS, 2003), sendo o restante excretado na urina.

Cerca de 10% (aproximadamente 2.400 mg) do Mg corporal total são filtrados

diariamente através dos glomérulos, em um indivíduo adulto e saudável. Desta

quantidade, cerca de 5% são excretados na urina. Aproximadamente 75% do

Mg sérico são ultrafiltráveis nos glomérulos, com 20 a 30% sendo reabsorvidos

no túbulo proximal (SHILS, 2003). O ramo ascendente espesso da alça de

Henle parece ser o principal sítio de controle da excreção do Mg, principalmente

na sua porção cortical. Cerca de 50 a 55% do Mg filtrado são reabsorvidos entre

o ramo descendente e o túbulo distal (SHILS, 1988; RUDE, 1998).

2.4. Frutanos e o conceito de fibra alimentar

A partir da década de 1950, estudos epidemiológicos passaram a

demonstrar a existência de uma forte correlação entre o aumento da incidência

de doenças crônicas não-transmissíveis com o consumo de alimentos

processados e refinados, o que levou a se estabelecer uma relação causal

entre o surgimento dessas doenças e a quantidade de FA presente na dieta

(BURKITT, 1973). Desde então, as pesquisas têm revelado inúmeros benefícios

das fibras na redução do risco de doenças e na manutenção da saúde,

enfatizando a importância do consumo de alimentos que contenham um teor

elevado destes componentes.

Neste contexto, tem-se verificado um crescente interesse por parte de

nutricionistas e órgãos oficiais de saúde em estabelecer recomendações para o

consumo de FAs. De acordo com MENEZES et al. (2001), a ingestão média de

FA pela população brasileira era, na década de 1970, de 19,3 g/dia, caindo

19

para 16,0 g/dia na década de 1980, e chegando a 12,4 g/dia na década de

1990. As recomendações nutricionais propostas para a população brasileira

sugerem que a dieta de uma família deva conter mais do que 8 g/1000 kcal de

FA ou, no mínimo, 20 g/dia para jovens e adultos (VANNUCCHI et al., 1990).

A FA foi originalmente definida como “polissacarídeos e lignina

encontrados na parede celular dos vegetais que não sofrem hidrólise pelas

enzimas do trato gastrintestinal em humanos e animais” (TROWELL, 1972;

TROWELL et al., 1976). Entretanto, essa definição torna-se inadequada a partir

do momento em que não inclui outros componentes que não fazem parte da

parede celular e que também não sofrem a ação das enzimas digestivas no

intestino delgado, tais como os frutanos (FOS e inulina), oligossacarídeos e

amido resistentes, entre outros. Assim, vários trabalhos foram publicados com o

objetivo de estabelecer uma classificação para os diferentes tipos de

carboidratos, levando-se em consideração critérios químicos e fisiológicos

(ASP, 1995; ASP, 1996; CUMMINGS et al., 1997).

Recentemente, a Associação Americana de Químicos de Cereais

(American Association of Cereal Chemists) definiu a fibra dos alimentos como:

“a parte comestível de vegetais ou carboidratos análogos que resistem à

digestão e absorção no intestino delgado do homem, sendo fermentada

completa ou parcialmente no intestino grosso. Incluem polissacarídeos,

oligossacarídeos, lignina e substâncias associadas aos vegetais, promovendo

efeitos fisiológicos benéficos incluindo laxação, e/ou atenuação do colesterol

sangüíneo e/ou atenuação da glicose sangüínea” (AACC, 2001). Deste modo, a

diversidade dos efeitos fisiológicos da FA deve basear-se na caracterização

química dos seus constituintes. A combinação das características químicas e

fisiológicas permitirá uma melhor visão sobre o papel das fibras na nutrição e na

saúde. Neste sentido, justifica-se o crescente interesse, por parte da

comunidade científica e da população em geral, em componentes específicos

(bioativos) dos alimentos que apresentem um papel na manutenção da saúde.

O termo “alimentos funcionais” refere-se a estes alimentos, os quais podem

proporcionar benefícios nutricionais e metabólicos específicos, contribundo para

o controle e redução do risco de doenças.

20

2.5. Frutanos e a sua importância na alimentação

Os frutanos são carboidratos de reserva constituídos de uma ou mais

(até 70) unidades de frutose, ligadas (GFn) ou não (Fn) a uma molécula terminal

de sacarose (DELZENNE & ROBERFROID, 1994; CUMMINGS et al., 1997;

ROBERFROID & DELZENNE, 1998). Podem apresentar uma estrutura linear ou

ramificada, com moléculas unidas por ligações frutosil-frutose do tipo β(2→6),

vistas em frutanos do tipo levano, ou ligações β(2→1), encontradas em frutanos

do tipo inulina (ROBERFROID & DELZENNE, 1998; CARABIN & FLAMM, 1999).

Por sua vez, os frutanos do tipo inulina se dividem em dois grupos de

componentes: a inulina e seus produtos de hidrólise (oligofrutose), e os FOS,

que são sintetizados a partir da sacarose. Em geral, estes carboidratos têm sido

diferenciados pelo seu grau de polimerização (GP). O GP da inulina pode variar

de 2 a 70 unidades monossacarídicas, com um valor médio de 10. A

oligofrutose e os FOS são termos sinônimos utilizados para descrever frutanos

com um GP menor do que 10 (CARABIN & FLAMM, 1999; ROBERFROID &

SLAVIN, 2001).

A fórmula estrutural dos frutanos do tipo inulina está representada na

Figura 4. De acordo com a União Internacional de Química Pura e Aplicada

(International Union of Pure and Applied Chemistry), um oligossacarídeo é

constituído por 2 até 10 unidades monossacarídicas (VAN LOO et al., 1999;

ROBERFROID & SLAVIN, 2001). No entanto, determinados carboidratos,

independentemente do seu GP, apresentam efeitos fisiológicos semelhantes.

Assim, um critério utilizado para distinguí-los quimicamente é a sua solubilidade

em etanol a 80% e a resistência, in vitro, às enzimas intestinais (CUMMINGS et

al., 2001).

Atualmente, os oligossacarídeos ou polissacarídeos que contêm frutose

(frutanos), como os FOS e a inulina, vêm sendo estudados e comercializados

(principalmente em mercados como Japão, EUA e Europa) como produtos para

a indústria de alimentos com teor calórico reduzido (NRC, 1989; OHYAMA et al.,

1990; ZARDINI, 1991; LOBO & LEMOS SILVA, 2003a). Estima-se que o consumo

diário de inulina e FOS nos EUA esteja em torno de 1 a 4 g, chegando a 11

g/dia na Europa (VAN LOO et al., 1995).

21

Figura 4– Representação da estrutura química geral dos frutanos. Extraído de OHTA et al. (1996).

Apesar do interesse crescente na produção e na utilização de alimentos

com teores elevados de frutanos, a determinação da ocorrência desses

açúcares em vegetais utilizados na alimentação ainda é escassa, e não se

compara à de vegetais que contêm amido (De CARVALHO & FIGUEIREDO-

RIBEIRO, 2001).

Cerca de 36 mil espécies vegetais apresentam frutanos como

carboidratos de reserva. Dentro da classe das dicotiledôneas, os frutanos são

encontrados em quase todas as espécies da família Asteraceae, muitas das

quais apresentando importância econômica, como o almeirão (Cichorium

intybus) e o tupinambo (Helianthus tuberosus) (FIGUEIREDO-RIBEIRO, 1993;

CARABIN & FLAMM, 1999; De CARVALHO & FIGUEIREDO-RIBEIRO, 2001).

O yacón (Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl.) é uma espécie da família

Asteraceae ou Compositae, originária da região dos Andes, estendendo-se da

Colômbia até o noroeste da Argentina. Suas raízes tuberosas são consumidas

cruas, cozidas ou fritas, apresentando sabor semelhante ao da pêra (Figura 5).

No Brasil, a espécie foi introduzida por volta de 1991 no Estado de São Paulo,

na região de Capão Bonito, pela colônia japonesa, que utilizava as raízes in

natura ou desidratadas no tratamento contra hipercolesterolemia e diabetes

(KAKIHARA et al., 1996).

22

Figura 5– Raízes tuberosas do yacón (Polymnia sonchifolia Poepp. & Endl.).

Suas raízes tuberosas destacam-se pelo elevado teor de umidade (cerca

de 90%) (CAPITO, 2001; YOSINO, 2001). Em base seca, apresentam entre 3 e

7% de cinzas, 3 e 7% de proteínas e 0,4 e 1,3% de lipídeos (NRC, 1989).

NIETO (1991), estudando a composição de raízes tuberosas de 10 linhagens de

yacón, encontrou valores médios de 3,7% de proteínas, 3,5% de cinzas, 1,5%

de lipídeos e 3,4% de fibras. Com relação à composição em minerais, em base

seca, o potássio encontra-se presente em maior quantidade (1,34%), seguido

23

pelo Ca (0,14%), magnésio (0,12%), fósforo (0,08%) e sódio (0,06%). Dentre os

microminerais, o ferro e o zinco se destacam com 87 e 36 µg/g,

respectivamente (INIAP, 1995-1996, citado por CAPITO, 2001). YOSINO (2001)

verificou, em raízes submetidas a autoclavagem, consideráveis teores de

potássio (195,29 mg/100 g), seguidos pelo sódio (27,51 mg/100 g) e pelo Ca

(10,73 mg/100 g).

Estudos recentes têm evidenciado um potencial antioxidante, tanto nas

raízes quanto no extrato obtido de suas folhas, demonstrado pela presença de

compostos fenólicos como os ácidos caféico (e derivados) e clorogênico, bem

como do triptofano (YAN et al., 1999; TAKENARA et al., 2003; VALENTOVA et

al., 2003). Além disso, atualmente, o yacón vem sendo considerado como

matéria-prima promissora para a produção de frutose e frutosil-sacarose, devido

ao seu elevado teor de frutose livre e de FOS (CAPITO & FILISETTI, 1999). De

acordo com o NATIONAL RESEARCH COUNCIL (1989), os tubérculos e raízes

tuberosas de yacón apresentam de 60 a 80% de FOS, em base seca. OHYAMA

et al. (1990) encontraram uma alta concentração de FOS, com 6% de 1-cestose

(GF2), 4,7% de nistose (GF3) e 3,36% de 1,1,1-cestopentaose (GF4). FUKAI et

al. (1993) reportaram uma concentração de 11% de GF2, 8% de GF3 e 4,0% de

GF4. CAPITO (2001), avaliando os teores de carboidratos em 10 raízes

tuberosas provenientes de uma única planta, colhida após 11 meses de plantio,

encontrou valores de 1,58 a 2,44% de frutose, de 0,55 a 1,15% de glicose, de

0,31 a 1,24% de sacarose e de 0,85 a 4,11% de frutanos com GP médio de

4,59, no vegetal in natura, evidenciando uma grande variação no teor dos

carboidratos entre as amostras analisadas.

2.6. Efeitos fisiológicos dos frutanos

A maior parte dos oligo – e polissacarídeos presentes na dieta são

quantitativamente hidrolisados nas regiões superiores do trato gastrintestinal.

Os monossacarídeos resultantes são absorvidos e transportados através da

circulação portal para o fígado e, subseqüentemente, para a circulação

sistêmica. Estes carboidratos servem como substratos e reguladores das

principais vias metabólicas, e atuam influenciando a liberação de diversos

hormônios gastrintestinais. Entretanto, determinadas propriedades físico-

químicas e a configuração das ligações entre os seus monossacarídeos podem

24

influenciar na digestibilidade destes carboidratos (DELZENNE &

ROBERFROID, 1994; CUMMINGS & ENGLYST, 1995; CUMMINGS &

MacFARLANE, 2002; LOBO & LEMOS SILVA, 2003b).

Como conseqüência, podem alcançar a região do intestino grosso onde

são, em uma maior ou menor extensão, hidrolisados e metabolizados pela

microbiota local. Nesse processo metabólico, conhecido como fermentação,

são produzidos gases (H2, CO2, CH4), ácidos orgânicos (como fumarato, lactato

e succinato), e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), como acetato,

propionato e butirato, que produzem variados efeitos para a saúde do

hospedeiro. Estes últimos são rapidamente absorvidos (de 90 a 95%) e, com

exceção do butirato, alcançam a circulação portal, sendo metabolizados no

fígado. Entretanto, uma parte do acetato (de 25 a 50%) pode escapar desta

rota metabólica e, via circulação sistêmica, alcançar os tecidos periféricos,

principalmente o muscular (DELZENNE & ROBERFROID, 1994;

ENGELHARDT, 1995; RÉMÉSY et al., 1995; CUMMINGS et al., 2001;

CHERBUT, 2002). O butirato, por sua vez, tem sido reconhecido como a

principal fonte de energia para a mucosa colônica, atuando na proliferação e na

regulação da diferenciação e da apoptose dos colonócitos (LIVESEY & ELIA,

1995; SAKATA, 1995; SMITH et al., 1998; CAVAGLIERI et al., 2002;

JOHNSON, 2002; PRYDE et al., 2002).

Neste contexto, um especial enfoque tem sido dado para os frutanos

(inulina e FOS), devido a sua capacidade de estimular seletivamente o

crescimento de determinadas espécies bacterianas, consideradas benéficas

para o hospedeiro. O conceito de prebiótico foi introduzido por GIBSON &

ROBERFROID (1995), e definido como “um componente presente nos

alimentos resistente à digestão pelas enzimas endógenas do trato

gastrintestinal, que afeta beneficamente o hospedeiro através da estimulação

seletiva do crescimento e/ou da atividade de uma ou de um limitado número de

bactérias no cólon proporcionando, desta forma, um estado de saúde para o

hospedeiro”. Assim, a fermentação bacteriana passa a ter significado clínico e

efeitos metabólicos importantes na fisiologia do intestino grosso. Estudos em

animais e humanos indicam que os frutanos, através de seus efeitos

gastrintestinais, podem afetar indiretamente o metabolismo de carboidratos, de

lipídeos e de minerais, bem como atuar na modulação da função imunológica

25

(WOLEVER, 1995; ROBERFROID & DELZENNE, 1998; DELZENNE et al.,

2002; SCHLEY & FIELD, 2002; SCHOLZ-AHRENS et al., 2001; SCHOLZ-

AHRENS & SCHREZENMEIER, 2002; LOBO & FILISETTI, 2003a; LOBO &

FILISETTI, 2003b).

2.6.1. Efeitos no trato gastrintestinal

As evidências relacionadas à resistência a digestão dos frutanos no

intestino delgado têm surgido de estudos in vitro e in vivo (TOKUNAGA et al.,

1989; ELLEGÅRD et al., 1997; CUMMINGS et al., 2001; CHERBUT, 2002).

TOKUNAGA et al. (1989) demonstraram que, em comparação à sacarose e à

lactose, a afinidade e atividade de enzimas intestinais purificadas são

negligenciáveis, após a incubação de FOS com homogenatos do conteúdo

intestinal de ratos. Em ensaios in vivo, têm sido utilizados indivíduos

ileostomizados permitindo, desta forma, a determinação direta e quantitativa do

material que sai do intestino delgado. Uma alternativa a essa metodologia é a

aspiração do conteúdo intestinal diretamente do íleo, através da intubação por

uma cânula. De acordo com CUMMINGS et al. (2001), a utilização de ambas

as técnicas tem resultado em uma taxa de recuperação média de 88%, tanto

para inulina quanto para oligofrutose.

Atravessando intactos o intestino delgado, os frutanos passam a

contribuir com o pool de substratos fermentáveis para a microbiota do intestino

grosso, que incluem ainda outros carboidratos fermentáveis (amidos e

oligossacarídeos resistentes, polissacarídeos diferentes do amido), proteínas e

material endógeno (mucinas, células esfoliadas). No intestino grosso normal

existem cerca de 1.500 g de bactérias em concentrações que atingem de 1011 a

1012 organismos por grama de fezes, sendo mais de 400 espécies de bactérias,

com predomínio dos organismos anaeróbios sobre os aeróbios da ordem de

1.000 para 1 (CUMMINGS & MacFARLANE, 1991; CUMMINGS, 1997; KUDO,

2003).

Segundo KUDO (2003), as bactérias intestinais podem ser classificadas

em 3 classes. Dentre os gêneros pertencentes à classe I encontram-se os

Bacteroides, Fusobacterium, Mitsuokella, Megamonas, Eubacterium,

Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Megashaera, entre outros, que são

encontrados em uma elevada concentração (109-11/ g de fezes). Os da classe II

26

incluem Lactobacillus, Escherichia coli (não patogênica), Streptococcus e

Veillonella. As bactérias pertencentes a esse grupo encontram-se em uma

concentração relativamente baixa (105-8/g fezes) e predominam durante o

período pós-nascimento, sendo substituídas pelas bactérias do grupo I dentro

de poucos dias. As bactérias presentes em menor concentração, como

Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E.

coli patogênica e Bacteroidaceae, pertencem à classe III.

Embora existam diferenças consideráveis entre indivíduos, em cada um

a composição da microbiota intestinal é estável por longo tempo. Sabe-se ainda

que a sua composição não é a mesma nos diferentes segmentos do intestino

grosso e que existem diferenças entre a microbiota da luz e a que está em

íntimo contato com a mucosa (CUMMINGS, 1997; KLEESSEN et al., 2003; Le

BLAY et al., 2003).

O processo fermentativo envolve a interação entre as diferentes espécies

de bactérias presentes no intestino grosso. O ecossistema bacteriano é

extremamente complexo, com os resíduos de uma espécie microbiana servindo

de substrato para outra. Além disso, as necessidades por fatores relacionados

ao crescimento bacteriano também são supridas de maneira sinérgica

(CUMMINGS & MacFARLANE, 1991; MacFARLANE & GIBSON, 1995;

CUMMINGS, 1997; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002). Desta forma, a

modulação da composição e da atividade metabólica da microbiota intestinal

através de intervenções dietéticas tem despertado um crescente interesse na

utilização de componentes que possam influenciar beneficamente na fisiologia

do intestino.

Em particular, o efeito prebiótico dos frutanos é proporcionado através da

estimulação seletiva da atividade e do crescimento de determinadas espécies

bacterianas, incluindo as dos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus, em

detrimento de espécies consideradas nocivas para o hospedeiro, e corroborado

por estudos realizados in vivo e in vitro (GIBSON & ROBERFROID; 1995;

CAMPBELL et al., 1997; ROBERFROID et al., 1998; Le BLAY et al., 1999a;

MENNE et al., 2000; CUMMINGS et al., 2001; KLEESSEN et al., 2001; Le

BLAY et al., 2003). Além disso, baseando-se na premissa maior de que as

propriedades físico-químicas das FA influenciam na cinética da fermentação,

estudos têm sido conduzidos com o objetivo de avaliar o efeito da interação

27

entre diferentes carboidratos fermentáveis na composição e na atividade

metabólica da microbiota intestinal (HENNINGSSON et al., 2002; Le BLAY et

al., 2003).

Os principais produtos do metabolismo bacteriano são gases, como H2,

CO2, e CH4, e os AGCC, dos quais os principais são o acetato (cerca de 60%

do total), o propionato e o butirato, produzidos em uma proporção molar de

60:25:15 mmol/L, respectivamente. Esta proporção, entretanto, não é constante

e depende do tipo de substrato fermentado. Em menores proporções, são

produzidos o fumarato, o lactato e o succinato. Os gases são utilizados pelas

bactérias ou absorvidos e excretados na respiração ou, ainda, excretados nas

fezes (STONE-DORSHOW & LEVITT, 1987; SCHEPPACH et al., 1995;

CAMPOS et al., 1998; CHERBUT, 2002; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002).

Da ação enzimática sobre os carboidratos, são liberados os

monossacarídeos na fase líquida, externamente às células microbianas. Uma

vez absorvidas por tais células, os monossacarídeos entram na via glicolítica,

ou de Embden-Meyerhof-Parnas, com exceção das células das bifidobactérias.

O catabolismo da pentose ou da hexose inicial, através dessa via, origina duas

moléculas de piruvato. No processo, duas moléculas de nicotinamida-adenina

dinucleotídeo oxidada (NAD+) são reduzidas a NADH, e duas de trifosfato de

adenosina (ATP) são formadas a partir do difosfato de adenosina (ADP). A

energia potencial representada pelo ATP, neste ponto e no ponto de

ramificação do acetil-CoA, é a principal fonte energética para a manutenção e

crescimento dos microorganismos (MacFARLANE & GIBSON, 1995;

CUMMINGS, 1997; CAMPOS et al., 1998).

Como muito dos AGCC formados apresentam pK inferior ao pH das

fezes, eles são mantidos na forma de ânions dissociados. Grande parte desses

ânions é responsável pela neutralização do bicarbonato (HCO3-) secretado pela

mucosa intestinal, com liberação de água (H2O) e gás carbônico (CO2). Os

ânions dos AGCC representam cerca de 75% dos ânions presentes na luz do

intestino grosso (ENGELHARDT, 1995; CUMMINGS, 1997).

Além de serem excretados nas fezes e, em parte, aproveitados pelas

próprias bactérias (biomassa), a maior parte dos AGCC é rapidamente

absorvida. O seu transporte envolve a combinação de uma difusão simples,

após protonação dos ânions na superfície da mucosa, com um processo de

28

troca de ânions com o HCO3-, mediado por carreadores (ENGELHARDT, 1995).

De acordo com ENGELHARDT (1995), a proporção da contribuição dos dois

mecanismos de transporte para a absorção dos AGCC parece variar nos

diferentes segmentos do intestino grosso. Além disso, a composição lipídica e a

fluidez da membrana apical e basolateral podem influenciar na cinética da

absorção dos AGCC. Este processo também contribui para a absorção de

sódio, potássio e água, e aumenta a concentração luminal de HCO3-

(CUMMINGS, 1997; CAMPOS et al., 1998).

Os AGCC podem ser metabolizados nas células intestinais, fígado e

tecidos periféricos. A maior parte do butirato é oxidada em CO2 ou convertida

em corpos cetônicos na mucosa do cólon durante o transporte para o sangue.

O restante é captado pelo fígado, onde é convertido pela enzima butiril-CoA

sintetase em butiril-CoA, que é rapidamente convertido em acetil-CoA, ácidos

graxos de cadeia longa ou corpos cetônicos (RÉMÉSY et al., 1995; ZHANG et

al., 1998; CAVAGLIERI et al., 2002; PRYDE et al., 2002). Sob condições

normais, o propionato é totalmente metabolizado no fígado onde, através da

enzima propionil-CoA sintetase, é convertido em propionil-CoA. Uma parte do

propionil-CoA pode ser metabolizada até succinil-CoA, entrando no ciclo do

ácido tricarboxílico onde é formado o oxaloacetato, em seguida o piruvato e,

finalmente, a glicose (através da gliconeogênese) (DEMIGNÉ et al., 1986;

RÉMÉSY et al., 1995; CAVAGLIERI et al., 2002). Uma pequena fração do

acetato é metabolizada no fígado, sendo inicialmente convertida em acetil-CoA,

através da enzima acetil-CoA sintetase, que será utilizada para a lipogênese

(RÉMÉSY et al., 1995; CAVAGLIERI et al., 2002). Aproximadamente 95% do

butirato produzido são transportados através do epitélio, sendo que sua

concentração no sangue portal é relativamente baixa, como resultado da sua

rápida utilização (PRYDE et al., 2002).

Além do seu papel como combustível, o butirato tem sido implicado na

diminuição do crescimento de linhagens celulares de câncer de cólon, através

da inibição da proliferação celular e da modificação da arquitetura das células,

induzindo-as à diferenciação e à apoptose (SCHEPPACH et al., 1995; SMITH

et al., 1998; Le BLAY et al., 2000; JOHNSON, 2002). Em células tumorais de

câncer colo-retal, o butirato inibe o crescimento e induz a diferenciação celular,

evidenciado pela expressão de proteínas marcadoras como a fosfatase alcalina

29

e o antígeno carcinoembriogênico. Outros estudos realizados in vitro têm

demonstrado que o butirato pode influenciar a expressão gênica através da

inibição das desacetilases de histonas, levando a uma hiperacetilação da

cromatina e culminando na interrupção do ciclo celular e na indução da

diferenciação celular (KRUH et al., 1995; SMITH et al., 1998; CAVAGLIERI et

al., 2002; HINNEBUSCH et al., 2002; PRYDE et al., 2002).

Deste modo, estudos com inulina e oligofrutose têm sido realizados

utilizando-se modelos animais para determinar os efeitos quimiopreventivos do

butirato em lesões pré-neoplásicas no cólon (HUGHES & ROWLAND, 2001;

POULSEN et al., 2002; VERGHESE et al., 2002a; VERGHESE et al., 2002b).

Em geral, a multiplicidade das chamadas criptas aberrantes (focos de criptas

aberrantes) - lesões microscópicas associadas à formação de neoplasias -

induzidas por compostos carcinogênicos como o azoximetano (AOM), um

derivado químico da dimetilhidrazina (DMH), é usualmente utilizada como

marcador biológico na investigação da carcinogênese no cólon de ratos

(PRETLOW et al., 1992; PEREIRA et al., 1994). Além disso, a modulação

nutricional de tumores no cólon também tem sido estudada utilizando-se

camundongos MIN (Multiple Intestinal Neoplasia), os quais apresentam uma

predisposição ao desenvolvimento de tumores intestinais. Tais animais detêm

uma mutação constitutiva no gene APC (Adenomatous Polyposis Coli), e

possuem fenótipo semelhante ao da síndrome da polipose adenomatosa

familiar (POOL-ZOBEL et al., 2002).

Entretanto, inserido neste contexto, um efeito paradoxal dos AGCC sobre

células epiteliais normais e neoplásicas tem sido documentado quando a

carcinogênese colônica é investigada. Enquanto o butirato e, em uma menor

extensão, o propionato, reduzem a proliferação de células tumorais in vitro,

todos os três principais AGCC estimulam a proliferação em células epiteliais

normais (SAKATA, 1995; SCHEPPACH et al., 1995). O propionato, por

exemplo, da mesma forma que o butirato, tem sido implicado na inibição da

proliferação celular em células tumorais e em linfócitos (CURI et al., 1993;

CAVAGLIERI et al., 2000). Tem sido observado que o efeito do propionato

ocorre via inibição da síntese de lipídeos, em uma etapa limitante da produção

de componentes da membrana, como fosfolipídeos e colesterol (CAVAGLIERI

et al., 2002). Ainda, em dietas ricas em fibras solúveis (farelo de aveia) e

30

insolúveis (farelo de trigo), foram verificadas alterações na composição de

lipídeos neutros e fosfolipídeos de macrófagos (CAVAGLIERI, 1997).

A presença do alimento no intestino é um fator preponderante para a

manutenção de uma massa celular funcional. As evidências relacionadas aos

efeitos tróficos de carboidratos fermentáveis no trato gastrintestinal surgiram de

estudos que demonstraram uma associação entre dietas enterais deficientes

em fibras e atrofia da mucosa intestinal (GOODLAD & WRIGHT, 1983;

SCHEPPACH et al., 1995). A magnitude destes efeitos, entretanto, depende da

fermentabilidade do carboidrato, isto é, do perfil de AGCC produzidos pela

fermentação bacteriana. Assim, de acordo com SCHEPPACH e colaboradores

(1995), é improvável que a estimulação de um padrão fisiológico de

proliferação esteja relacionado com o processo de carcinogênese.

A proliferação celular no intestino grosso ocorre na região basal (zona

proliferativa) das criptas intestinais. Nas regiões superiores, o processo de

divisão celular cessa e os colonócitos sofrem diferenciação antes de alcançar a

superfície da cripta. Na superfície, as células senescentes são esfoliadas no

lúmen intestinal antes de sofrerem apoptose (SCHEPPACH et al., 1995;

WONG & WRIGHT, 1999; JOHNSON, 2002). Este processo é conhecido como

anoikis, no qual as células perdem a sua propriedade de adesão o que, em

contrapartida, induz à apoptose. A habilidade da célula em sofrer apoptose é

determinada pela posição (ou hierarquia) da célula na cripta, e de possíveis

mudanças que tais células encontram no meio extracelular à medida que

alcançam o topo da cripta (POTTEN et al., 1997; POTTEN, 1997).

Além disso, a zona proliferativa da cripta também é responsável pela

ocorrência de apoptoses espontâneas, que funcionam como um mecanismo de

controle da expansão da população de células tronco nas criptas, embora tal

mecanismo ocorra em uma proporção significativamente menor (cerca de 10

vezes menos) no intestino grosso, quando comparado com o intestino delgado

(SCHEPPACH et al., 1995; POTTEN, 1997; POTTEN et al., 1997; JOHNSON,

2002). De acordo com POTTEN (1997), este processo não é fortemente

regulado no intestino grosso devido ao aumento da expressão do gene

antiapoptótico Bcl-2. Desta forma, as diferenças posicionais observadas na

incidência da apoptose nos intestinos delgado e grosso podem apresentar

importantes repercussões em termos de risco de carcinogênese. Considerando

31

que o intestino grosso possui uma menor capacidade de remover sua

população adicional de células tronco, o maior número dessas células resultaria

em um aumento da quantidade de criptas susceptíveis ao desenvolvimento de

mutações e, desta forma, na expansão clonal das células iniciadas (POTTEN et

al., 1997; McCULLOUGH et al., 2001; WONG & GIBSON, 2003).

Por outro lado, estudos têm sugerido que existe um limiar para o número

de células tronco que cada cripta é capaz de suportar (TOTAFURNO et al.,

1987; LOEFFLER et al., 1997). Se o número de células tronco excede esse

limiar, ocorre a bifurcação da cripta, resultando em um aumento no número

total de células tronco [Figura 6] (PARK et al., 1997; WONG & GIBSON, 2003).

Neste contexto, a quantidade de criptas pode atuar como um marcador

biológico para o número de células tronco no cólon (WONG & GIBSON, 2003).

Além disso, tem sido postulado que a taxa de bifurcação das criptas é também

estimulada pelo aumento no tamanho da cripta (TOTAFURNO et al., 1987),

embora um estudo (PARK et al., 1997) tenha demonstrado, no cólon de ratos,

que o efeito hipertrófico do fator de crescimento epidermal (EGF) não está

associado com o aumento da taxa de bifurcação das criptas. Ainda,

McCULLOUGH et al. (2001) verificaram um significativo aumento na

quantidade de criptas ramificadas no cólon proximal de animais convencionais

e de animais isentos de germe (‘germ-free’), sem evidências de um processo

hiperplásico.

Existe uma considerável discussão sobre o papel da proliferação celular

no desenvolvimento de neoplasias no cólon. Se, por um lado, existe um

número de estudos demonstrando que o consumo de FA previne o

desenvolvimento de tumores, por outro lado, um número equivalente tem

evidenciado um efeito contrário, isto é, que o consumo de fibras pode estimular

o processo carcinogênico. Existem diferenças marcantes na quantidade e na

resposta da bifurcação da cripta nos diferentes locais do intestino, sendo que a

significância destas diferenças ainda permanece obscura. Assim, se a

desregulação do processo de bifurcação da cripta pode apresentar um papel

importante na iniciação de tumores e na expansão neoplásica, cresce a

necessidade de estudos adicionais sobre o real papel da divisão das criptas na

fisiologia do intestino grosso (McCULLOUGH et al., 2001; WONG & GIBSON,

2003).

32

De acordo com LUPTON (2000, 2004), o efeito do butirato sobre a

carcinogênese colônica pode depender do momento de sua

produção/administração em relação ao estágio de desenvolvimento do

processo carcinogênico. Segundo o autor, as FA parecem ser protetoras nos

estágios recentes de formação de pólipos, sendo que tal efeito não ocorre na

transição de um pólipo para um carcinoma. Além disso, o local no qual a

fermentação ocorre pode influenciar no efeito biológico apresentado por cada

AGCC (ZORAN et al., 1997; HENNINGSSON et al., 2002; Le BLAY et al.,

2003).

Figura 6– Representação esquemática do ciclo da cripta. Extraído de PARK et al. (1997).

33

LUPTON (2000, 2004) relata ainda que o tipo de gordura oferecida na

dieta pode influenciar no efeito do butirato. Em estudos com ratos, nos quais

carboidratos fermentáveis foram oferecidos em suplementação a dietas nas

quais a fonte de lípideos era óleo de milho, ocorreu uma regulação positiva da

proliferação celular na região do cólon. Por outro lado, quando os mesmos

carboidratos eram suplementados em dietas nas quais a fonte lipídica era o

óleo de peixe, rico em ácidos graxos da família ω-3, foi observado um aumento

da apoptose em todos os estágios de desenvolvimento dos tumores, isto é, nas

fases de iniciação, promoção e progressão. De acordo com HONG et al.

(2002), um mecanismo envolvido na regulação positiva da apoptose após o

consumo de pectina, uma fibra fermentável, associado ao óleo de peixe, deve-

se a incorporação dos ácidos graxos ω-3 nos fosfolipídeos das mitocôndrias

(especialmente a cardiolipina) que aumenta, por sua vez, a susceptibilidade à

peroxidação e à liberação de espécies reativas de oxigênio o que, em

contrapartida, inicia a cascata de eventos envolvidos no processo apoptótico.

Além desses, os efeitos do butirato também estão associados a um

aumento no número de células caliciformes nas criptas intestinais e,

subseqüentemente, com a modificação e com o aumento na secreção de

mucinas (SHIMOTOYODOME et al., 2000; POOL-ZOBEL et al., 2002;

KLEESSEN et al., 2003). Assim, existe um interesse crescente em substratos

que produzam espectros específicos de AGCC, em particular, aqueles com

atividade butirogênica. Um estudo recente demonstrou que somente as fibras

que promoveram uma produção estável de butirato, ao longo do tempo, no

ecossistema colônico foram capazes de diminuir o desenvolvimento dos focos

de criptas aberrantes (PERRIN et al., 2001). Existem, ainda, estudos que

demonstram que a ingestão crônica de amido resistente e de frutanos promove

um aumento na concentração intracolônica de butirato, resultante de um lento

processo adaptativo da microbiota intestinal (Le BLAY et al., 1999a; Le BLAY et

al., 1999b).

Outros efeitos da fermentação de carboidratos no intestino grosso

incluem uma redução no pH em decorrência da produção dos AGCC, o que

favorece uma diminuição na concentração de amônia (NH3) no lúmen, sendo

produzido o íon amônio (NH4+), que é eliminado nas fezes. Como a NH3 que

ganha a circulação portal é utilizada no fígado para a ressíntese de uréia, a

34

diminuição na sua circulação êntero-hepática passa a ter repercussões

positivas na terapêutica da encefalopatia hepática (YOUNES et al., 1997).

Ainda, ocorre uma diminuição na solubilidade de ácidos biliares potencialmente

tóxicos para a mucosa intestinal; e uma redução na produção, dispersão e

atividade de algumas enzimas bacterianas (nitroredutases, 7-α-desidroxilases,

azoredutases), através do controle seletivo de linhagens da microbiota

intestinal (LEVRAT et al., 1991a; CAMPBELL et al., 1997; Le BLAY et al.,

1999b; HUGHES & ROWLAND, 2001; KLEESSEN et al., 2001; CHERBUT,

2002; GUDIEL-URBANO & GOÑI, 2002).

2.6.2. Efeitos na biodisponibilidade de minerais

O efeito das fibras em estudos envolvendo a biodisponibilidade de

minerais tem sido alvo de muitas controvérsias, ao longo dos anos. Embora

componentes da fração FA, como a pectina ou a celulose, não sejam

hidrolisados pelas enzimas endógenas do intestino delgado, da mesma forma

que os frutanos ou outros oligossacarídeos resistentes, algumas propriedades

físico-químicas, incluindo a dispersibilidade, a viscosidade e a capacidade de

adsorção de água, são fatores que podem explicar a variação nos efeitos

fisiológicos apresentados por diferentes carboidratos (SCHOLZ-AHRENS &

SCHREZENMEIER, 2002; JENKINS et al., 2003).

Outros fatores como o tempo de duração do estudo, o estado nutricional

do indivíduo, a forma química e a quantidade ingerida do mineral, além de

componentes presentes na matriz do alimento, podem influenciar na utilização

do mineral pelo organismo (LOUIE, 1996; COZZOLINO, 1997; BROUNS &

VERMEER, 2000). Neste contexto, a presença de fitatos e outros componentes

associados à fração FA pode prejudicar a absorção de minerais através da

formação de complexos insolúveis, embora tal efeito seja menos relevante em

ratos (LOPEZ et al., 2000).

Nas últimas décadas, os efeitos positivos do consumo de frutanos (FOS

e inulina) e de outros carboidratos fermentáveis na absorção de Ca, Mg e Fe

têm sido amplamente investigados e demonstrados através da utilização de

diferentes protocolos experimentais (OHTA et al., 1994a; OHTA et al., 1994b;

OHTA et al., 1995; BABA et al., 1996; OHTA et al., 1999; SAKAI et al., 2000;

35

YOUNES et al., 2001; SCHOLZ-AHRENS et al., 2002). O consumo de 5% de

oligofrutose em uma dieta suplementada com 1% de Ca reduziu de uma

maneira persistente o teor do mineral nas fezes de ratos ovariectomizados ao

longo de 4 a 8 semanas de experimento sendo que, após 16 semanas, tal efeito

se tornou significativo (SCHOLZ-AHRENS et al., 2002). BROMMAGE et al.

(1993) evidenciaram um significativo aumento na absorção de Ca (cerca de

65%) em ratos alimentados com dietas suplementadas com 5% de oligofrutose

e outros carboidratos não-digeríveis. YOUNES et al. (1993) verificaram um

aumento na absorção de Ca em ratos alimentados com uma dieta

suplementada com amido resistente e diferentes teores de Ca (3 e 6 g/kg),

sendo que este aumento foi 77% maior nas dietas com 6 g/kg de Ca do que nas

dietas com 3 g/kg.

MOROHASHI et al. (1998) evidenciaram, em ratos alimentados com

dietas suplementadas com 5% de FOS, um aumento significativo na absorção e

no balanço de cálcio, sugerindo que o seu consumo poderia melhorar a

calcificação dos ossos. Comprovando esta hipótese, ainda em 1998, OHTA e

colaboradores verificaram, em ratos submetidos à gastrectomia total, uma

densidade e um conteúdo mineral ósseo, no fêmur e na tíbia, significativamente

maiores nos animais que consumiram uma dieta suplementada com 7,5% de

FOS, em relação ao grupo controle. Este efeito foi corroborado em estudos

posteriores (MOROHASHI et al., 2000; HIRAMA et al., 2003), nos quais a

massa óssea e a estrutura do fêmur de ratos gastrectomizados, submetidos a

dietas suplementadas com 7,5% de FOS, foram avaliadas utilizando-se a

densitometria por tomografia computadorizada e análises histomorfométricas,

demonstrando a contribuição dos FOS na prevenção dos sintomas relacionados

à gastrectomia.

TAKAHARA et al. (2000) verificaram valores médios significativamente

maiores para o volume trabecular ósseo, da metáfise e do colo do fêmur, em

ratos em crescimento que consumiram uma dieta suplementada com 5% de

FOS (33,8 ± 5,91% e 78,3 ± 1,82%, respectivamente), em relação ao grupo

controle (25,3 ± 6,06% e 72,7 ± 5,17%, respectivamente). ROBERFROID et al.

(2002), através de absorção de dupla energia por raios X (dual energy x-ray

absorptiometry, DEXA), avaliaram a densidade mineral óssea do corpo total de

ratos em crescimento alimentados com dietas suplementadas com diferentes

36

teores de inulina (0, 5 e 10%) e Ca (0,2; 0,5 e 1%) ao longo de 22 semanas. De

acordo com os autores, os efeitos foram mais pronunciados quando o teor de

inulina na dieta aumentou de 0 para 5% (p<0,001) independente do teor de Ca

na dieta.

Em humanos, embora a quantidade de estudos ainda seja limitada, os

efeitos positivos na absorção de Ca parecem ocorrer sob condições nas quais o

requerimento do mineral é maior, como na adolescência e em mulheres no

período após a menopausa (COUDRAY et al., 1997; TAHIRI et al., 2003a).

Várias hipóteses têm sido sugeridas para explicar o aumento da

absorção de minerais no intestino grosso após o consumo destes carboidratos.

A fermentação dos FOS é acompanhada por uma intensa produção de AGCC,

que resulta em uma diminuição no pH luminal e em um aumento na

concentração de minerais ionizados (DEMIGNÉ et al., 1995). Como

conseqüência, ocorre um aumento na solubilidade do mineral e um

subseqüente estímulo a sua difusão passiva e ativa (LUTZ & SCHARRER,

1991; BOUGLÉ et al., 2002). Além disso, os AGCC podem influenciar

diretamente a absorção mineral modificando a difusão de íons (Ca-hidrogênio,

Mg-hidrogênio) pela membrana. TRINIDAD et al. (1996) demonstraram que o

acetato e o propionato aumentam a absorção de Ca, sendo que este último,

devido a sua maior solubilidade em lipídeos, é rapidamente absorvido por

difusão direta em uma forma protonada. Uma vez no meio intracelular, os íons

H+ se dissociariam dos AGCC e seriam secretados para o lúmen em troca de

uma absorção dos minerais.

Outra hipótese foi sugerida por MINEO et al. (2002) que, através de

estudos realizados in vitro, demonstraram que vários tipos de carboidratos

resistentes, incluindo polióis e oligossacarídeos, promovem a absorção de Ca

nos intestinos delgado e grosso através do aumento da permeabilidade das

junções oclusivas.

Ainda, a fermentação de carboidratos no ceco de animais também é

acompanhada por uma hipertrofia do ceco, um efeito que poderia aumentar a

superfície absortiva para os minerais (LEVRAT et al., 1991b; YOUNES et al.,

1993; DEMIGNÉ et al., 1995; ROBERFROID & DELZENNE, 1998; SCHOLZ-

AHRENS et al., 2001; LOBO & FILISETTI, 2003b). Tem sido sugerido que o

desenvolvimento na parede do ceco ocorre devido a uma combinação entre

37

hipertrofia e hiperplasia das células (RÉMÉSY et al., 1993). Além disso, tal

efeito é acompanhado por um aumento do fluxo sangüíneo e uma vasodilatação

das artérias do ceco (DEMIGNÉ et al., 1989; LEVRAT et al., 1991b; YOUNES et

al., 1993; YOUNES et al., 2001; AALKJÆR, 2002). Através da produção do

butirato, os FOS podem indiretamente influenciar no aumento da absorção de

Ca, em virtude do reconhecido efeito no crescimento e na proliferação celular

proporcionado pelo butirato (SMITH et al., 1998; Le BLAY et al., 1999a; PRYDE

et al., 2002). Além disso, os FOS poderiam estimular também o transporte ativo

de Ca, via produção de butirato. Foi demonstrado um aumento na atividade do

receptor para 1,25(OH)2D3 estimulada pelo butirato de sódio, em cultura

primária de células de rins de aves (ANITA & ANTHONY, 1992, citado por

SCHOLZ-AHRENS & SCHREZENMEIER, 2002). Estudos adicionais, realizados

em ratos, têm evidenciado que a absorção de Ca estimulada pelos FOS pode

ocorrer em resposta a um aumento na expressão da calbindina na mucosa do

intestino grosso, em um mecanismo independente da regulação pela

1,25(OH)2D3 (OHTA et al., 1998a; OHTA et al., 1998b; TAKASAKI et al., 2000).

Assim, muitos estudos têm confirmado os efeitos positivos dos

carboidratos fermentáveis, em especial os frutanos (FOS e inulina), na absorção

intestinal e na retenção óssea de Ca. Assim, neste estudo procurou-se avaliar o

possível efeito dos FOS, presentes nas raízes tuberosas do yacón e em um

produto disponível no mercado contendo FOS purificado (Raftilose®), sobre

parâmetros intestinais e ósseos de ratos em crescimento.

38

3 Objetivos 3.1 Geral

Estudar o efeito do consumo dos FOS, provenientes de duas fontes

distintas (Raftilose e raiz tuberosa do yacón) na mineralização óssea de ratos

em crescimento.

3.2 Específicos

Verificar a influência dos FOS na absorção intestinal e no balanço de Ca

e Mg nos animais;

Verificar a retenção de Ca e Mg nos ossos através de análises químicas

(espectrofotometria de absorção atômica) e físicas (densidade mineral

óssea e propriedades mecânicas);

Realizar exames histológicos em tecidos do intestino grosso, com a

finalidade de avaliar os prováveis mecanismos envolvidos com a

absorção mineral e a subseqüente mineralização óssea.

39

4. Material e métodos 4.1. Material 4.1.1. Amostras

O presente estudo foi constituído por 2 ensaios biológicos. Para o 1º, as

rações experimentais foram suplementadas com Raftilose® P95 (Orafti-Active

Food International, Tienen, Bélgica), produto fornecido pela Clariant S.A., São

Paulo, e constituído de 94,96% de FOS extraídos da raiz do almeirão. Neste

produto, os FOS são obtidos a partir da hidrólise enzimática parcial da inulina, e

são constituídos por moléculas (GFn) com um GP médio de 4 (COUDRAY et al.,

2003a). Para o 2º ensaio biológico, foi utilizado cerca de 70 Kg de raízes

tuberosas de yacón, provenientes do Sítio São Sebastião, Município de Ibiúna,

Estado de São Paulo, colhidas após oito meses de plantio.

4.1.2. Animais

Para ambos os ensaios foram utilizados ratos machos (Rattus

novergicus, var. albinus) da linhagem Wistar Hannover, heterogênicos, com

cerca de 4 semanas de idade, obtidos a partir de colônias mantidas no biotério

de produção e experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF)

e do Instituto de Química (IQ) da Universidade de São Paulo (USP). 4.2. Reagentes e equipamentos utilizados

Enzimas: amiloglicosidase de Rhizopus mold (Sigma A-7255); α-amilase

termoestável (Sigma A-3306); protease (Sigma P-3910); amiloglicosidase de

Aspergillus niger (Sigma A-9913); amiloglicosidase liofilizada de Aspergillus

niger (Sigma A-7420); frutanase (Frutanase Mixture, Megazyme, cat. E-

FRMXLQ).

Reagentes: MES, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico (Sigma M-8250); TRIS,

tris(hidroximetil)aminometano (Sigma T-1503); ácido nítrico 65% (HNO3, Merck,

cat. nº 1.00456.1000); ácido clorídrico fumegante 37% (HCl, Merck, cat. nº

1.00317.1000); peróxido de hidrogênio 30% (H2O2, Merck, cat. nº

1.07210.1000); óxido de lantânio III (La2O3, Merck, cat. nº 1.12220.0100);

40

solução alcoólica de Bouin [solução estoque: 80% de etanol, 750 mL;

formaldeído, 300 mL; ácido pícrico, 5 g. Solução de trabalho: solução estoque,

14 mL; ácido acético, 1 mL] (disponível em Pathology Laboratory: http://www-

medlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html).

Padrões e reagentes para a cromatografia e espectrofotometria de

absorção atômica: α-D-glicose (25,307-3); D-frutose (23,970-4); sacarose

(24,761-8) (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, EUA); solução de hidróxido

de sódio (NaOH) 50% (p/p), livre de carbonato (SS254-1, Fisher Scientific);

padrão de cálcio (Merck, cálcio 9943 titrisol); solução padrão de nitrato de

magnésio (Merck). Materiais especiais: lã de vidro (Merck, cat. nº 1.04086.0500); filtros de

microfibra de vidro GF/F, 25 mm ∅ (Whatman, cat. nº 1825 025), membranas

filtrantes de nylon, 0,2 µm, 25 mm ∅ (Whatman, cat. nº 7402 002) e unidade

filtrante GV Millex em polietileno com membrana Durapore, 0,22 µm, 13 mm ∅

(Millipore, cat nº JBR6 10268); coluna analítica com película de troca aniônica

CarboPac PA1 de 25 cm x 4 mm e pré-coluna analítica CarboPac PA1 de 5 cm x

4 mm (Dionex Corp., Califórnia, EUA); filme de 35 mm, Kodak Ultra 400.

Equipamentos: Cromatógrafo líquido de alta eficiência com coluna de troca

iônica, com bomba de gradiente (GP40) 3000 psi LC, equipado com módulo

degasificante de eluente, válvula microinjetora, detector de pulso eletroquímico

(ED40) do tipo PAD (Pulsed Amperometric Detector) e injetor manual e

automático de amostras AS50 (Dionex Corp.); espectrofotômetro de absorção

atômica (Polarized Zeeman AAS, Hitachi® Z-5000); pDEXA Sabre Bone

Densitometer e programa pDEXA Sabre versão 3.9.4 (Norland Medical

Systems, Wisconsin, EUA), ambos desenhados para animais de pequeno porte;

microscópio de luz e ocular integradora nº 2 (Carl Zeiss, Alemanha), analisador

de textura TA-XT2 (Texture Analyzer) e programa Texture Expert versão 1.2

(Stable Micro Systems Ltd., UK).

41

4.3. Métodos 4.3.1. Processamento das raízes tuberosas do yacón

As raízes tuberosas de yacón foram adquiridas diretamente do produtor

e imediatamente transportadas para o Laboratório de Tecnologia de Alimentos,

do Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica (FCF/USP), onde

foram mantidas armazenadas em caixas de madeira por dois dias, em

temperatura e umidade ambientes, sob baixa luminosidade. Posteriormente, foram

retiradas das caixas, lavadas cuidadosamente em água corrente, acondicionadas

em sacos de fibra de algodão e submetidas à autoclavagem (121oC) por 20

minutos. Em seguida, foram resfriadas em temperatura ambiente, descascadas,

cortadas no sentido transversal, acondicionadas em sacos plásticos vedados a

vácuo, e armazenadas em câmara frigorífica, com a temperatura variando entre

-15oC e -19oC.

Para a homogeneização das amostras autoclavadas, foi utilizado um

liquidificador industrial. Após esta etapa, foram novamente acondicionadas em

sacos plásticos vedados a vácuo e armazenadas em câmara frigorífica.

Posteriormente, as amostras foram submetidas à liofilização (Liotécnica Ind. e

Com. Ltda, Embu, São Paulo) sendo, em seguida, processadas em moinho para

a obtenção da farinha de yacón. Devido a característica demasiadamente

higroscópica dos FOS, a farinha de yacón foi acondicionada em potes plásticos

vedados e armazenada em refrigerador (cerca de 4°C) até o momento da

elaboração das rações. Segundo YUN (1996), os FOS são altamente estáveis

em temperaturas de refrigeração em períodos em torno de 1 ano. Da

quantidade total de farinha obtida, foram retiradas alíquotas para a

caracterização da composição química, sendo o restante destinado à

elaboração das rações experimentais.

4.3.2. Rações experimentais

Para o 1º ensaio biológico, as rações foram elaboradas nas

dependências do setor semi-industrial da FCF/USP e analisadas no Laboratório

de Química, Bioquímica e Biologia Molecular de Alimentos, do Departamento de

Alimentos e Nutrição Experimental da FCF/USP. Após o preparo, as rações

foram pesadas, divididas em pequenos lotes, separadas alíquotas para análise

42

da composição química e, o restante, foi acondicionado hermeticamente em

sacos plásticos, identificado e armazenado em refrigerador (cerca de 4°C), até o

momento da sua utilização.

Para o 2º ensaio biológico, as rações foram elaboradas na Universidade

Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina, acondicionadas em sacos

plásticos e, transportadas para o Laboratório de Química, Bioquímica e Biologia

Molecular de Alimentos da FCF/USP. As rações foram acondicionadas e

armazenadas da mesma forma que no 1º ensaio biológico. Todas as rações

experimentais foram elaboradas seguindo-se as recomendações do American

Institute of Nutrition (AIN-93G) (REEVES et al., 1993). Porém, para o preparo

das misturas salinas, foram utilizadas 7,5 g de Ca/kg de ração (Tabela 1), na

forma de carbonato de cálcio (CaCO3).

Para o 1º ensaio biológico, o teor de FOS utilizado na formulação da

ração (5%, p/p) foi descontado do teor de sacarose (10%, p/p, segundo a AIN-

93G). No 2º, os componentes presentes na farinha do yacón (FOS, glicose,

frutose, sacarose, proteínas, etc) foram descontados dos teores de sacarose e

de amido (Tabela 1). Para controlar a aceitação e a diferença na oferta

energética das rações experimentais, foi introduzido, no 1º ensaio, um grupo

pareado, cujo consumo da ração norteou a quantidade de ração oferecida para

os animais do grupo controle, no dia seguinte. Desta forma, pôde-se avaliar

possíveis diferenças no padrão de consumo de ração entre os grupos

experimentais.

O cálculo do valor energético das rações experimentais foi realizado

através da multiplicação dos fatores 4, para carboidratos disponíveis e

proteínas, 9 para lipídeos e 1 para os frutanos (ROBERFROID et al., 1993). Os

resultados foram expressos em kcal por 100 g de amostra.

43

Tabela 1: Distribuição dos ingredientes nas rações experimentais do 1º (Raftilose) e do 2º ensaio biológico (farinha de yacón)1

Raftilose Farinha de yacón

Ingredientes (%)

Controle Pareado FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%

Caseína (92% de proteína)† 20,00 20,00 20,00 20,24 20,24 20,24 Fibra 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 Óleo de soja 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 7,00 L-cistina 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 Bitartarato de colina2 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Mistura vitamínica3 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Mistura salina modificada4 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 Sacarose 10,00 10,00 5,00 10,00 1,76 - Amido de milho 52,95 52,95 52,95 52,71 51,61 48,70 Farinha de yacón5 - - - - 9,34 14,01 Raftilose® 6 - - 5,00 - - - Total 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 1 Conforme as especificações do AIN-93G, com algumas modificações (REEVES, P.G. et al. AIN-93 Purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition, Philadelphia, v.123, p. 1939-1951, 1993); † O teor de proteína da caseína (1º ensaio) foi determinado após a realização do ensaio, pelo método do microKjeldahl. O valor médio (n=3) encontrado foi de 92,94%. Neste sentido, a quantidade de proteína nas rações foi de 18,59%. 2 41,1% de colina; 3 Em ambos os ensaios, as misturas apresentaram, em g/kg de mistura: ácido pantotênico, 3,0; pantotenato de cálcio, 1,6; piridoxina-HCl, 0,7; tiamina-HCl, 0,6; riboflavina, 0,6; ácido fólico, 0,2; vitamina B12, 2,5; vitamina E, 15; vitamina A, 0,8; vitamina D3; vitamina K, 0,075; sacarose, 974,655; 4 A quantidade de Ca foi modificada de 0,5003 g para 0,7542 g /100 g de ração. Em ambos os ensaios, as misturas apresentaram, em g/kg de mistura: CaCO3, 538,18; KH2PO4, 196; NaCl, 74; K2SO4, 46,6; K3C6H5O7.H2O, 70,78; MgO, 24; citrato férrico, 6,06; ZnCO3, 1,65; MnCO3, 0,63; CuCO3, 0,3; KIO3, 0,01; Na2SeO4, 0,01025; paramolibdato de amônio, tetra-hidratado, 0,00795; Na2SiO3, 1,45; KCr(SO4)2.12H2O, 0,275; H3BO3, 0,0815; NaF, 0,0635; NiCO3, 0,0318; LiCl, 0,0174; NH4VO3, 0,0066; sacarose, 39,846. 5 A raiz tuberosa do yacón foi proveniente do Sítio São Sebastião, Ibiúna, São Paulo, colhida após 8 meses de plantio. GP médio de 2,65; 6 Fornecida pela Clariant S.A., São Paulo. GP médio de 4.

4.3.3. Determinação da composição química da farinha do yacón e das rações experimentais 4.3.3.1. Determinação da umidade, cinzas, proteínas e lipídeos

O teor de umidade foi determinado através da aferição da perda de peso

das amostras submetidas ao aquecimento em estufa a vácuo regulada a 70°C.

Para a determinação do teor de cinzas, utilizou-se a metodologia proposta pelo

Instituto Adolfo Lutz (1985), que se fundamenta na determinação do peso do

material restante, na amostra dessecada, após destruição da matéria orgânica a

550°C. Para a análise dos lipídeos, foi determinado o peso do material extraído,

por meio de éter etílico anidro, a partir da amostra dessecada (IAL, 1985). Para

a determinação do nitrogênio, foi empregado o método do microKjeldahl,

44

utilizando-se o fator de conversão 6,25 para obtenção do teor de proteína (AOAC,

1995).

4.3.3.2. Determinação da fração fibra alimentar

Para a análise da fibra alimentar solúvel (FAS) e insolúvel (FAI), utilizou-

se o método enzimático-gravimétrico com o tampão MES-TRIS (0,05M MES,

0,05M TRIS, pH 8,2, 24°C), de acordo com LEE et al. (1992), com algumas

modificações. O auxiliar de filtração proposto pelo método (Celite) foi substituído

pela lã de vidro, que foi tratada com HCl 1N. Este método consiste na

digestão enzimática da amostra com α-amilase termoestável, amiloglicosidase

(Sigma A-9913) e protease (para a remoção do amido e da proteína,

respectivamente), precipitação da fração solúvel com etanol a 98% (v/v) e

posterior filtração onde o resíduo é lavado com etanol a 78% e a 95%, e com

acetona, sendo posteriormente seco e pesado.

4.3.3.3. Determinação de cálcio e magnésio

As determinações de Ca e Mg foram realizadas no Laboratório de

Nutrição (Minerais) do Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental,

FCF/USP, seguindo-se a metodologia descrita por JULSHAMN et al. (1998).

Para as análises, as amostras foram previamente digeridas, em bloco digestor,

com HNO3 a 65% e H2O2 a 30% na proporção de 5:1, e a temperatura variando

entre 100 e 150ºC. Posteriormente, o material digerido foi adequadamente

diluído (1:100, para Mg e 1:2.000, para Ca, para as rações experimentais; e

1:100, para Ca e Mg, para a farinha do yacón) com água desmineralizada, na

presença de solução de La2O3 a 5% (p/v), com a finalidade de minimizar as

interferências causadas por outros minerais.

A leitura foi realizada em espectrofotômetro de absorção atômica,

utilizando-se uma lâmpada de catodo oco, calibrado na região ultravioleta, com

chama oxidante ar/acetileno, nas seguintes condições para Ca e Mg,

respectivamente: comprimento de onda, 422,7 e 202,6 nm, e fenda, 0,7 e 1,3

nm. Para o Ca, a curva de calibração foi preparada a partir da solução padrão

de Ca, após diluição com HNO3 a 1%, nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e

5,0 µg/mL. A curva de Mg foi preparada a partir da solução padrão de nitrato de

45

Mg, nas concentrações de 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,5 e 10,0 µg/mL. Para o controle

de qualidade de cada ensaio, amostras do padrão de referência secundário

[ração à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)] foram submetidas,

em duplicata, ao mesmo procedimento de digestão e diluição (1:100 para Mg e

1:1.000 para Ca). As concentrações médias de Ca e Mg encontradas,

expressas em base úmida e seca, foram de 4,39 ± 0,50 e 4,91 ± 0,57 mg de

Ca/g de ração, e de 0,26 ± 0,01 e 0,29 ± 0,01 mg de Mg/g de ração,

respectivamente. Os gráficos de controle de qualidade das determinações de

Ca e Mg no padrão de referência secundário encontram-se nos Anexos 1 a 6,

bem como as curvas de calibração médias e as suas linearidades. Todo o

material utilizado (vidraria, recipientes de plástico), para as análises de Ca e Mg,

foi submetido previamente à desmineralização em banho de HNO3 a 30% por,

no mínimo, 12 h.

4.3.3.4. Determinação dos frutanos, frutose, glicose e sacarose

Para a análise dos frutanos e dos açúcares contidos na farinha de yacón

e na ração, foi empregada a metodologia proposta por HOEBREGS (1997),

sendo que, para a análise da farinha de yacón, foram realizadas algumas

modificações. A tomada de ensaio inicial das amostras analisadas

correspondeu a aproximadamente 1 g de frutanos (Figura 7). Para a extração

dos frutanos, foi acrescentada água destilada em ebulição ao material a ser

analisado (M1), controlando-se o pH (entre 6,5 a 8,0) e a temperatura (85o ±

2oC). A solução foi transferida para um balão volumétrico de 100 mL (para a

farinha do yacón) ou 250 mL (para as rações experimentais), mantendo-se em

agitação durante 10 minutos e a temperatura em torno de 85o ± 2oC. Após

resfriar em temperatura ambiente, o volume do balão contendo o extrato foi

completado e o balão, pesado (M2). Nesta etapa do método, uma alíquota do

extrato (M3), que seria hidrolisada com a amiloglicosidase (Sigma A-7420), foi

pesada (M4) e descartada. Posteriormente, a amostra remanescente (M5) foi

tratada com frutanase (M6). Para a análise das rações experimentais, esta

alíquota do extrato (M3) foi hidrolisada com amiloglicosidase (M4) e,

posteriormente, uma parte deste hidrolisado (M5) foi tratada com frutanase (M6).

Da amostra integral (A0) e dos hidrolisados (A1 e A2), foram retiradas alíquotas

(M7, M8 e M9, respectivamente) que foram submetidas à purificação com hexano

46

e, em seguida, filtradas através de filtros de microfibra de vidro (GF/F), e de

filtros de membrana de nylon (0,2 µm), respectivamente. Os filtrados foram

adequadamente diluídos e analisados através de cromatografia líquida de alta

eficiência em coluna de troca aniônica, com detector de pulso amperométrico

(CLAE-DPA).

Para a análise dos açúcares presentes, as condições cromatográficas

incluíram temperatura de 25o ± 0,5oC, com fase móvel A, NaOH 300 mM (livre

de carbonato) e fase móvel B, NaOH 18 mM (livre de carbonato), com fluxo de

1,0 mL/min, e volume de injeção de 25 µL. As concentrações dos açúcares

foram determinadas a partir de uma curva padrão externa, nas concentrações

de 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 e 60,0 µg/mL.

Figura 7 - Fluxograma para a determinação dos frutanos. A tomada de ensaio inicial, para cada amostra, correspondeu a 1 g de frutanos. Para a determinação dos teores de frutanos, glicose, frutose e sacarose,

partiu-se do princípio de que na análise do A0 foram determinadas a frutose

livre (Fl), glicose livre (Gl) e a sacarose (S); na análise de A1, a frutose livre (Fl),

a sacarose (S) e a soma da glicose livre (Gl) e da glicose proveniente do amido

análise A0 M7

amostra inicial

extração (85 ± 2 °C, pH 6,5 a 8,0)

15 g do extrato + 15 g de tampão acetato pH 4,5amiloglicosidase 30 min, 60 ± 2°C

análise A1 M8

frutanase 30 min, 60 ± 2° C

análise A2 M4

solubilização (10 min, 85 ± 2 °C)

47

(Ga); e na análise de A2, o teor total de glicose (Gt) e o teor total de frutose (Ft).

Para a determinação da glicose (Gf) e da frutose (Ff) provenientes dos frutanos

utilizaram-se as seguintes expressões:

Para o cálculo do teor de frutanos (f) foi utilizada a seguinte expressão:

Onde: k = [180 + 162(n −1)]/180n e n = [(Ff/Gf) +1], sendo ‘n’ a média

do grau de polimerização.

4.3.4. Ensaio biológico

Para cada ensaio biológico, foram utilizados vinte e quatro animais

recém-desmamados. Para o 1º ensaio, os animais foram divididos em 3 grupos

de 8 ratos cada um, sendo denominados de controle, pareado e Raftilose. Para

o 2º ensaio, foram divididos em 3 grupos de 8 ratos cada um, sendo

denominados de controle, FOS 5% e FOS 7,5%. Durante os 5 primeiros dias

(período de adaptação), os animais receberam a ração controle na forma de

péletes e, a partir do 3º dia do período de adaptação, todos os animais foram

transferidos para gaiolas metabólicas individuais de aço inoxidável. No 6º dia de

experimento, foi iniciado o período experimental, quando os animais passaram a

receber as rações elaboradas com 5% (p/p) de FOS, como Raftilose (1º ensaio),

e com 5 e 7,5% de FOS (p/p), como farinha de yacón (2º ensaio).

O consumo de ração foi registrado diariamente e o controle de peso, a

cada dois dias. A ração e a água (desmineralizada, Milli-Q Gradient, Millipore

Corporation) foram fornecidas ad libitum. O coeficiente de eficácia alimentar

(CEA) foi determinado através da relação entre o ganho de peso e o consumo

de ração no final de cada ensaio. Durante todo o período de ensaio, os animais

foram mantidos em temperatura média de 22 ± 2°C, umidade relativa de 55 ±

10%, com ciclos alternados de claro/escuro de 12 h (das 7 às 19 h, claro e das

Gf = Gt − (S/1,9) − (Gl + Ga)

Ff = Ft − S/1,9 − Fl

f = k (Gf + Ff)

48

5 d

Ratos Wistar

5 d5 d 5 d

27º d 4º d 16º d1º d 10º d

Ração controle

2º ensaio

1º ensaio 23º d

Rações experimentais

29º d

19 às 7 h, escuro). A coleta das fezes (1º e 2º ensaios) e da urina (2º ensaio) foi

realizada em 3 períodos de balanço, constituídos por 5 dias cada um (4º, 10º e

16º dias do experimento) [Figura 8], sendo as fezes pesadas, acondicionadas

hermeticamente em sacos plásticos e armazenadas em congelador a –20ºC até

o momento das análises. A urina foi acondicionada em tubos eppendorfs e

também armazenada em congelador a –20ºC até o momento das análises.

Figura 8– Delineamento experimental do 1º (Raftilose) e 2º ensaio (farinha de yacón). As rações experimentais foram constituídas de 5% de FOS, para o 1º ensaio, e de 5 e 7,5% de FOS, para o 2º ensaio. Os animais, de ambos os ensaios, consumiram a ração controle por 5 dias antes do início do período experimental. Após o início dos experimentos, foram coletadas fezes (1º e 2º ensaios) e urina (2º ensaio) em 3 períodos de 5 dias (4º, 10º e 16º dias de experimento) para determinação de Ca e Mg. Os animais foram sacrificados após 23 dias (1º ensaio) e entre o 27º e o 29º dias de experimento (2º ensaio).

Cabe ressaltar que todos os animais foram mantidos em restrição

alimentar por 12 h antes do momento do sacrifício. No 1º ensaio, após 23 dias

de período experimental, todos os animais foram sacrificados após inalação de

éter etílico por tempo prolongado. No 2º ensaio, os animais foram anestesiados

com uma solução contendo xilazina (Virbaxil® 2%, Virbac, São Paulo, 25 mg/Kg

de peso corporal), um miorrelaxante, e quetamina (Vetaset, Fort Dodge®,

Campinas, 10 mg/Kg de peso corporal), um agente anestésico, na proporção de

1:2, respectivamente, através de injeção intraperitoneal. Em seguida, após a

laparotomia, os animais foram sacrificados através da secção do diafragma.

Nesse caso, os animais foram sacrificados entre o 27º e o 29º dias do período

49

experimental, sendo utilizados o mesmo número de animais de cada grupo em

um mesmo dia.

Em ambos os ensaios, o fígado, o baço e os rins foram removidos,

limpos com solução salina (NaCl, 0,85%, p/v) e pesados. O intestino foi removido

(5 cm do íleo terminal, o ceco e 5 cm do cólon proximal) e o ceco foi separado

na região adjacente à válvula íleo-cecal e à junção ceco-colônica. Em seguida,

o ceco foi pesado (total, com o conteúdo), imediatamente colocado em uma

placa de petri resfriada com gelo, e seccionado na região do corpo do órgão.

Após a coleta (e posterior congelamento, a -20ºC) de alíquotas, com peso

conhecido, do conteúdo do ceco para posteriores análises de umidade e

minerais, a sua parede foi lavada com solução salina e pesada. Da diferença

entre o ceco total e a sua parede, foi determinado o peso do seu conteúdo. Para

o 2º ensaio, o cólon proximal e uma porção (região do corpo do ceco) da parede

cecal foram cuidadosamente lavados com solução salina e fixados em solução

alcoólica de Bouin. Após um tempo adequado para a fixação (cerca de 12 h), os

tecidos foram transferidos para solução de etanol a 70%, para posteriores

análises histológicas. Para ambos os ensaios, os membros inferiores foram

desarticulados, acondicionados em gaze embebida em solução salina e

armazenados a -20ºC até o momento do descarne.

4.3.4.1. Análise dos parâmetros ósseos

Os membros inferiores foram descongelados em temperatura ambiente

e, após dissecção anatômica dos músculos e remoção completa dos tecidos

moles, as tíbias e os fêmures foram pesados, identificados e acondicionados

(-20ºC), até o momento das análises.

4.3.4.1.1. Densitometria óssea

Inicialmente, os ossos dos animais do 1º ensaio biológico foram

submetidos à análise da densidade mineral óssea (DMO) no Laboratório de

Densitometria Óptica Radiográfica, junto ao Departamento de Cirurgia da

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da USP, sendo tal

medida avaliada na região da metáfise e da diáfise da tíbia e do fêmur direitos

de cada animal. Os ossos foram dispostos em um cassete de acrílico

juntamente com uma escala de referência, confeccionada em alumínio, com

50

degraus de 0,5 mm de altura (Figura 9). Para a radiografia, foi utilizado um

aparelho de raios-X regulado para 42 kV, 50 mA e o tempo de exposição dos

ossos para 0,025 s. Em seguida, a imagem radiográfica dos ossos foi

digitalizada utilizando-se um scanner de mesa (Hawlett-Packard, HP, Scanjet

6300C), com um adaptador para transparência (HP). A análise das tonalidades

de cinza foi realizada através de um programa (ImageLab, Softium Sistemas de

Informática) e um computador (Pentium III, Infoway, Itautec), comparando-se a

densidade média das regiões do osso em estudo com a densidade média dos

degraus da escala de alumínio. Assim, foi determinada a equivalência em

milímetros de alumínio (mmAl) da densidade da região dos ossos em estudo.

Figura 9– Imagem radiográfica dos ossos (fêmures e tíbias) dos animais do 1º ensaio. A seta indica a escala de alumínio, que foi utilizada como parâmetro para a obtenção da densidade mineral dos ossos, em função das tonalidades de cinza.

Para uma melhor avaliação dos parâmetros densitométricos, foram

realizadas, posteriormente, análises (nos ossos dos animais de ambos os

ensaios) no Departamento de Anatomia do Instituto de Ciências Biomédicas

(ICB) da USP. Nesta oportunidade, a densidade (DMO) e conteúdo mineral

ósseo (CMO) foram avaliados no osso integral e nas regiões proximal, distal e

média, através do DEXA. Este método baseia-se na análise computadorizada

da atenuação de um feixe puntiforme de raios-X, emitido por uma fonte móvel,

constituído por fótons de duas energias distintas de 38 ou 70 KeV. Durante a

realização do exame, um detector, movendo-se juntamente com a fonte de

51

raios-X, faz a amostragem dos fótons que passam através de qualquer estrutura

colocada entre a fonte e o detector. Os resultados obtidos são comparados com

um padrão de densidade conhecida. As grandezas medidas pelo DEXA são a

área, expressa em cm2, e o CMO, expresso em gramas. A partir destes, é

calculada a DMO (DMO=CMO/área), expressa em g/cm2.

Para as análises, os ossos foram novamente descongelados em

temperatura ambiente e posicionados para o escaneamento na mesa do

aparelho. Para delimitar a área do osso integral, foi considerado o limite lateral

direito e esquerdo mais externo da imagem do osso escaneado. Os limites,

superior e inferior, desta área foram padronizados por 5 pontos para cima e

para baixo, respectivamente, através do recurso de deslocamento de margem

do aparelho. Para delimitar as áreas das regiões avaliadas (proximal, distal e

média), o comprimento de cada osso (dado pelo limite máximo dos lados

esquerdo e direito da imagem escaneada) foi dividido em 3 regiões iguais, no

sentido horizontal, sendo as regiões correspondentes predominantemente a

osso trabecular, representando 25% do comprimento em ambas as

extremidades (proximal e distal), e a correspondente a osso cortical (região

média), representando 50% da região intermediária do osso (Figura 10). Após

as análises, os ossos foram novamente armazenados a -20ºC, até o momento

da realização dos testes biomecânicos. Cabe destacar que alguns estudos têm

demonstrado que o armazenamento a -20ºC não altera as propriedades

biomecânicas dos ossos (ROSSI et al., 1986; MATTILA, 1999).

Figura 10– Representação esquemática das regiões analisadas nos ossos: proximal (P), medial (M) e distal (D).

52

4.3.4.1.2. Análise de cálcio e magnésio

Para a determinação de cálcio e magnésio, foi empregada a metodologia

descrita por JULSHAMN et al. (1998). As análises foram realizadas nos ossos

(fêmur e tíbia) esquerdos de cada animal. Em princípio, os ossos foram

dessecados em estufa regulada a 105°C, por 12 h. As amostras foram

previamente digeridas, em bloco digestor, com HNO3 a 65% e H2O2 a 30%, na

proporção de 5:1, e temperatura variando entre 100 e 150ºC. Posteriormente, o

material digerido foi adequadamente diluído (1:100.000, para Ca e 1:100, para

Mg) com água desmineralizada, na presença de solução de La2O3 a 5% (p/v). A

leitura foi realizada em espectrofotômetro de absorção atômica, seguindo-se os

mesmos parâmetros descritos para a leitura das amostras das rações

experimentais (item 4.3.3.3.).

4.3.4.1.3. Estudo das propriedades mecânicas

Os ensaios mecânicos foram realizados no Laboratório de Tecnologia de

Alimentos, junto ao Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da

USP. As propriedades mecânicas foram avaliadas na região média da diáfise

dos fêmures direitos, dos animais de ambos os ensaios, através do ensaio

destrutivo de flexão em três pontos (SHIMANO, 2001; SHIMANO et al., 2002;

ZAFAR et al., 2004), utilizando-se um analisador de textura TA-XT2 acoplado ao

programa Texture Expert versão 1.2 (Stable Micro Systems, UK). Para o ensaio,

os ossos foram descongelados em temperatura ambiente e reidratados em

solução salina (NaCl, 0,85%, p/v), até o momento dos testes.

O comprimento (medido da cabeça do fêmur ao côndilo) e o diâmetro

(medido na região média da diáfise) dos ossos foram determinados utilizando-

se um paquímetro. Em seguida, os ossos foram apoiados em sua face anterior,

nas regiões da metáfise, sobre um sistema de dois suportes separados em 16

mm (Figura 11), sendo suportados pela tuberosidade deltóide para permitir uma

máxima estabilidade e prevenir a rotação do osso durante o teste. A aplicação

da carga foi realizada por uma lâmina que comprimiu perpendicularmente os

ossos na sua superfície côncava, e na região média da diáfise a uma

velocidade constante de 0,2 mm/s.

53

B

Uma curva de carga-deformação (Figura 12) foi obtida para cada osso e

foram determinadas a carga máxima (N), a carga máxima no limite elástico (N),

a rigidez (dada pela inclinação da reta gerada pela curva, expressa em N/mm),

a resiliência (energia absorvida na região elástica, dada pela área sob a curva

até o limite elástico, expressa em N.mm) e a energia absorvida até o ponto de

fratura (dada pela área sob a curva até o ponto de fratura, expressa em N.mm).

Figura 11– Fotografia dos fêmures e da região onde ocorreu a fratura, após a compressão do osso (A). Em B, o acessório utilizado para o ensaio de flexão em três pontos.

A

54

Figura 12– Curva de carga X deformação gerada durante o teste de flexão em três pontos. x, região de quebra ou ruptura do osso; y, limite elástico; z, resiliência ou região elástica, onde o osso sofre deformação elástica. N = Newton.

4.3.4.2. Absorção intestinal e balanço de cálcio e magnésio

As determinações de cálcio e magnésio, nas fezes secas e na urina,

foram realizadas seguindo-se a metodologia descrita por JULSHAMN et al.

(1998). As amostras de urina de cada animal foram descongeladas em

temperatura ambiente, agrupadas por período de balanço em um pool, filtradas

(Whatman® nº 41) e, após medição do seu volume, foram acondicionadas em

recipientes plásticos herméticos, sendo armazenadas novamente em

temperatura de -20ºC. Para as análises, alíquotas foram diluídas (1:100, para

Ca, e 1:200, para Mg) com água desmineralizada e acrescidas de solução de

La2O3 a 5% (p/v). As amostras de fezes foram previamente digeridas, em bloco

digestor, com HNO3 a 65% e H2O2 a 30% na proporção de 5:1, e temperatura

variando entre 100 e 150ºC. Posteriormente, o material digerido foi

adequadamente diluído (1:10.000, para Ca, e 1:100, para Mg) com água

desmineralizada, na presença de solução de La2O3 a 5% (p/v). A leitura foi

realizada em espectrofotômetro de absorção atômica, seguindo-se os mesmos

x

y

z

55

parâmetros descritos para a leitura das amostras das rações experimentais

(item 4.3.3.3.).

O cálculo dos parâmetros de absorção aparente e do balanço mineral foi

realizado utilizando-se as seguintes expressões: absorção aparente fracional

(mg/dia) = ingestão – excreção fecal; absorção aparente (%) = (ingestão –

excreção fecal) ingestão-1 x 100; e balanço mineral (mg/dia) = [ingestão –

(excreção fecal + excreção urinária)].

4.3.4.3. Análise dos parâmetros intestinais

O teor de umidade das fezes e de uma alíquota do conteúdo do ceco

(após descongelamento em temperatura ambiente) foi determinado através da

perda de peso das amostras submetidas ao aquecimento em estufa regulada a

105°C. Após secagem, as fezes coletadas de cada animal foram moídas, com o

moinho (IKA® A10, Labortechnik, Alemanha) sendo acionado em intervalos de

40 s, para uma homogeneização mais adequada. Para a moagem, as amostras

de fezes de cada período de balanço foram agrupadas em um pool e, em

seguida, foram armazenadas a -20ºC até o momento das determinações de Ca

e Mg. Uma outra alíquota do conteúdo do ceco, após descongelamento em

temperatura ambiente, foi centrifugada (Hettich Zentrifugen, Tuttlingen, rotor nº

1412) em dois ciclos de 30 min, a 11000 g. O sobrenadante foi coletado e o pH

determinado com uma fita indicadora (Merck, Neutralit®, pH 5-10). Em seguida,

o resíduo foi armazenado a -20ºC para posterior determinação de Ca e Mg.

Para a determinação de Ca e Mg, o resíduo do conteúdo intestinal foi

descongelado em temperatura ambiente e homogeneizado com 1 (grupos

experimentais) ou 0,5 mL (grupos controle) de água desmineralizada. Foram

retiradas alíquotas do material homogeneizado para digestão com HNO3 a 65%

e H2O2 a 30% na proporção de 5:1, em bloco digestor, com temperatura

variando entre 100 e 150ºC. Posteriormente, o material digerido foi

adequadamente diluído (1:500, para Ca e 1:100, para Mg) com água

desmineralizada, na presença de solução de La2O3 a 5% (p/v). A leitura foi

realizada em espectrofotômetro de absorção atômica, seguindo-se os mesmos

parâmetros descritos para a leitura das amostras das rações experimentais

(item 4.3.3.3.).

56

Para o exame histológico dos tecidos, os fragmentos fixados foram

processados no Laboratório de Histopatologia, junto ao Departamento de

Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP, com

inclusão em parafina e obtenção de cortes de aproximadamente 5 µm de

espessura, seguido de coloração por hematoxilina e eosina (H & E). A análise

morfométrica dos cortes histológicos foi realizada no Laboratório de Biologia dos

Epitélios Digestivos, do Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de

Ciências Biomédicas, USP.

Para realizar a medida da profundidade das criptas do ceco, foram

selecionadas apenas aquelas que se apresentavam intactas e dispostas

longitudinalmente no corte histológico. Para cada campo selecionado, foi

contado um número mínimo de 3 criptas, considerando-se os critérios descritos

anteriormente. A profundidade das criptas foi determinada utilizando-se uma

ocular integradora, através da qual foi possível estabelecer o número de

espaços contidos em cada cripta, sendo que cada espaço correspondeu a uma

medida padrão. Para a determinação do índice de bifurcação das criptas no

ceco foram consideradas aquelas que se encontravam em todos os estágios de

bifurcação. O cálculo foi realizado utilizando-se a relação entre as criptas

bifurcadas e o número total de criptas, por campo microscópico, considerando

os mesmos critérios utilizados para a determinação da profundidade das criptas.

Para a estimativa do número total de criptas por campo microscópico, foram

consideradas também aquelas que se apresentavam de maneira oblíqua no

corte histológico.

Com o objetivo de avaliar a produção de muco pelas células caliciformes,

foram selecionados 4 blocos do intestino grosso (incluindo fragmentos do ceco

e do cólon proximal) de cada grupo experimental, do 2º ensaio biológico. Após

desparafinização, os cortes obtidos foram submetidos à reação com ácido

periódico–Schiff (PAS, periodic acid–Schiff), lavados em água destilada por 5 min e

tratados com o ácido periódico por 10 min. Posteriormente, o material foi lavado

com 3 volumes de água destilada e tratado com o reativo de Schiff por 20 min.

Em seguida, o material foi novamente lavado com água por 10 min e corado

com hematoxilina de Harris, por 5 min, lavado e desidratado.

O exame das lâminas foi realizado através de microscopia de luz (Carl

Zeiss, Alemanha), com a objetiva projetando um aumento de 40 vezes o

57

tamanho do material analisado, e uma ocular integradora de nº 2 (Carl Zeiss,

Alemanha). As fotografias foram tiradas utilizando-se um fotomicroscópio Nikon

AFX-II. 4.3.5. Análise estatística

A avaliação estatística dos resultados foi realizada com a assessoria do

Instituto de Matemática e Estatística da USP. Para as análises estudadas, foram

utilizados os seguintes procedimentos de análise inferencial: análise de

regressão clássica, análise de variância com 1 fator fixo (com 2 ou 3 níveis) e

análise de variância com modelos mistos. Em todas as análises realizadas, foi

considerado um nível de significância de 5% e os intervalos foram de 95% de

confiança. O programa computacional utilizado foi o SAS for Windows (versão

8.2).

Com o objetivo de avaliar o efeito das dietas nas variáveis medidas ao

final do experimento, foi utilizado um modelo de regressão linear (NETER et al.,

1996). Para o estudo das variáveis medidas ao longo do experimento, o modelo

utilizado foi o de análise de variância [ANOVA] (NETER et al., 1996), sob um

planejamento completamente cruzado, sendo os tratamentos definidos pela

combinação dos níveis dos fatores grupo (controle e Raftilose, para o 1º ensaio,

e controle, FOS 5% e FOS 7,5%, para o 2º ensaio) e período (1º, 2º e 3º

períodos), com medidas repetidas no fator período. Como os efeitos entre grupo

X período não foram significativos (p>0,05), foram ajustados novos modelos

sem interação. Para estudar as variáveis medidas ao final do experimento,

foram realizadas análises de variância [ANOVA] (NETER et al., 1996) com dois

níveis (1º ensaio) ou três níveis (2º ensaio) do fator grupo (controle e Raftilose,

para o 1º ensaio, e controle, FOS 5% e FOS 7,5%, para o 2º ensaio).

58

5. Resultados e discussão Existem evidências cada vez maiores de que o consumo de FA está

associado a benefícios para o organismo, especialmente para a fisiologia do

trato gastrintestinal. O termo “Fibra Alimentar (FA)” engloba uma variedade de

componentes que resistem, em uma menor ou maior extensão, a digestão e a

absorção no intestino delgado. Por sua vez, estes componentes passam a

contribuir com o pool de substratos disponíveis para o metabolismo bacteriano

no intestino grosso, de onde são produzidos gases (H2, CO2, CH4), ácidos

orgânicos como fumarato, lactato e succinato, e AGCC, como acetato,

propionato e butirato, que produzem variados efeitos para a saúde do

hospedeiro (DELZENNE & ROBERFROID, 1994; ASP, 1995; CUMMINGS &

ENGLYST, 1995).

Uma especial atenção tem sido dada ao resultado que a fermentação

bacteriana destes carboidratos resistentes produz sobre a absorção de minerais

no intestino grosso. Estudos realizados em animais e humanos têm

demonstrado que os frutanos (FOS e inulina) são intensamente fermentados no

intestino grosso proporcionando, desta forma, um ambiente favorável para a

absorção dos minerais (ROBERFROID & DELZENNE, 1998; SCHOLZ-

AHRENS et al., 2001; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002). Neste sentido, no

presente estudo, que consistiu de dois ensaios biológicos, foram avaliados os

efeitos dos FOS provenientes de duas fontes distintas, a Raftilose (um produto

industrializado obtido a partir da raiz do almeirão) e a raiz tuberosa do yacón, sobre

a biodisponibilidade do Ca e do Mg em ratos em crescimento.

5.1. Caracterização química da Raftilose e da farinha de yacón

Em princípio, foram caracterizados os teores de Ca, Mg e de frutanos na

Raftilose e a composição química do yacón, para que fosse possível a

formulação das rações experimentais. Os teores de Ca e Mg analisados na

Raftilose foram negligenciáveis, a ponto de não interferirem no cômputo destes

minerais nas rações. Os teores de frutanos determinados na Raftilose (95,26 ±

1,60%) confirmam os valores descritos no certificado de análise do produto

fornecido pelo fabricante (Orafti-Active Food International). Além disso, o GP

médio (n=4), calculado de acordo com HOEBREGS (1997), foi de 4,5,

59

corroborando o valor fornecido pelo fabricante e os valores reportados na

literatura (ROBERFROID & DELZENNE, 1998; CARABIN & FLAMM, 1999,

COUDRAY et al., 2003a).

As amostras de yacón in natura foram submetidas à autoclavagem

(121°C, 20 min) para inativação das enzimas (polifenoloxidase e inulinase)

presentes nas raízes (MODLER et al., 1993). Posteriormente, o material

autoclavado foi submetido à liofilização e, da farinha obtida, foi determinada a

composição química do produto. Na Tabela 2 encontra-se a caracterização

química das raízes de yacón utilizadas no presente estudo. Como já era

esperado, foi verificado um elevado teor em umidade (87,13 ± 0,36%) nas

raízes autoclavadas, valor semelhante ao encontrado por CAPITO (2001) e

YOSINO (2003) em amostras submetidas a diferentes tratamentos térmicos.

Para a análise dos frutanos, a etapa da hidrólise com a amiloglicosidase,

segundo o método de HOEBREGS (HOEBREGS, 1997), foi suprimida em

virtude dos reduzidos teores de amido, verificados na literatura, em raízes

tuberosas de yacón. De acordo com CAPITO (2001), os teores de amido e de

frutanos no yacón podem sofrer variações em função da época de colheita e da

variedade da planta, dentre outros fatores. OHYAMA et al. (1990) observaram

uma flutuação no conteúdo de frutanos em raízes tuberosas de yacón durante o

seu desenvolvimento e armazenamento. De acordo com os autores, o GP

médio dos frutanos aumentou linearmente durante o desenvolvimento do yacón

e diminuiu após a colheita, sendo que neste último período, os teores de

frutose, sacarose e glicose aumentaram. NIETO (1991) relata que as raízes do

yacón apresentam, em média, um período vegetativo de 7 meses. No presente

estudo, as raízes utilizadas foram colhidas após 8 meses de plantio.

Os valores médios obtidos para os açúcares (glicose, frutose e sacarose)

e para os frutanos na farinha de yacón, foram utilizados para o cálculo dos

ingredientes na formulação das rações do 2º ensaio. Como foram verificados

consideráveis teores de açúcares livres na farinha de yacón, estes foram

descontados da sacarose (FOS 5 e 7,5%) e de parte do amido (FOS 7,5%) que

seriam adicionados às rações, na proporção preconizada pela AIN-93G

(REEVES et al., 1993).

O valor médio calculado para o GP dos frutanos da farinha de yacón foi

de 2,65. YOSINO (2003) encontrou um GP médio de 3,02, para amostras

60

também colhidas após 8 meses de cultivo. De acordo com FUKAI et al. (1993),

os frutanos encontrados no yacón são constituídos, em sua maioria, por

moléculas do tipo GF2, GF3 e GF4. Além disso, os frutanos do tipo inulina com

um GP menor que 10 possuem uma elevada solubilidade em água (cerca de

85%) e são considerados bifidogênicos, ou seja, são completamente utilizados

pela microbiota intestinal e favorecem o crescimento de espécies bacterianas

benéficas ao hospedeiro (GIBSON & ROBERFROID, 1995; CAMPBELL et al.,

1997; COUDRAY et al., 2003a). Desta forma, a amostra utilizada no presente

estudo pode ter contribuído para uma rápida e intensa atividade fermentativa na

região proximal do intestino grosso dos animais.

Tabela 2: Caracterização química da raiz tuberosa do yacón1

Amostras Determinações

Autoclavada Liofilizada2 Seca

(%) Umidade 87,13 ± 0,36 3,25 ± 0,09 ---- Cinzas 0,50 ± 0,01 3,73 ± 0,05 3,85 ± 0,06 Proteína (N x 6,25) 0,13 ± 0,04 2,56 ± 0,06 2,64 ± 0,07 Extrato etéreo 0,34 ± 0,01 0,59 ± 0,02 0,61 ± 0,02 Fibra insolúvel3 0,43 ± 0,01 7,59 ± 0,16 7,85 ± 0,17 Fibra solúvel3 1,01 ± 0,02 3,25 ± 0,04 3,36 ± 0,04 Fibra total3 1,44 ± 0,02 10,84 ± 0,13 11,21 ± 0,13 Frutanos4 7,12 ± 0,26 53,53 ± 1,95 55,33 ± 2,01 Glicose4 1,15 ± 0,06 8,68 ± 0,42 8,97 ± 0,43 Frutose4 1,74 ± 0,08 13,07 ± 0,61 13,51 ± 0,63 Sacarose4 1,73 ± 0,09 12,98 ± 0,64 13,42 ± 0,66 (mg/g) Cálcio 0,11 ± 0,01 0,80 ± 0,01 0,83 ± 0,01 Magnésio 0,08 ± 0,01 0,60 ± 0,06 0,62 ± 0,09 1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n = 3; 2 Para fins didáticos, a amostra liofilizada foi denominada como farinha de yacón; 3 Para a análise da fração FA, foi utilizado n = 4. 4 Para a análise dos frutanos e dos açúcares, foi utilizado n = 6.

61

5.2. Caracterização química das rações experimentais

Foram elaboradas rações semipurificadas, para animais em crescimento,

de acordo com o AIN-93 (REEVES et al., 1993), com algumas modificações

quantitativas nos teores de Ca e amido. A Tabela 3 apresenta a caracterização

química das rações experimentais do 1º e do 2º ensaios. Não foi possível, até o

momento, calcular o teor de frutanos, de amido e de açúcares (glicose, frutose e

sacarose) nas rações experimentais. Deste modo, o cálculo do valor energético

baseou-se nos valores teóricos (Tabela 1) dos nutrientes adicionados no

momento da formulação das rações e correspondeu a cerca de 395 kcal/100 g

para as rações controles (1º e 2º ensaios), 380 kcal/100 g para a ração do

grupo Raftilose (5% de FOS), 367 kcal/100 g para a ração do grupo farinha de

yacón (5% de FOS) e 356 kcal/100 g para a ração do grupo farinha de yacón

(7,5% de FOS).

Tabela 3: Caracterização química das rações experimentais do 1º (Raftilose) e do2º ensaios (farinha de yacón)1

Raftilose Farinha de yacón

Determinações Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%

(%) Umidade 3,36 ± 0,14 3,20 ± 0,09 4,02 ± 0,06 4,91 ± 0,30 6,36 ± 0,04 Cinzas 3,23 ± 0,10 3,24 ± 0,15 3,24 ± 0,06 3,42 ± 0,04 3,67 ± 0,04 Proteína (N x 6,25) 21,77 ± 0,33 22,96 ± 1,17 23,28 ± 0,23 21,98 ± 1,41 21,26 ± 1,03 Extrato etéreo 6,74 ± 0,38 7,58 ± 0,07 7,66 ± 0,30 7,41 ± 0,05 7,40 ± 0,06 Fibra insolúvel2 5,28 ± 0,12 6,08 ± 0,33 5,93 ± 0,28 5,15 ± 0,49 5,52 ± 0,34 Fibra solúvel2 0,30 ± 0,16 0,37 ± 0,03 0,33 ± 0,03 0,87 ± 0,04 0,99 ± 0,05

Fibra total2 5,59 ± 0,15 6,45 ± 0,32 6,26 ± 0,25 6,02 ± 0,50 6,51 ± 0,38 (mg/g) Cálcio 11,08 ± 0,20 12,40 ± 0,38 12,17 ± 1,17 11,78 ± 0,75 12,70 ± 0,28 Magnésio 0,50 ± 0,002 0,49 ± 0,01 0,48 ± 0,004 0,52 ± 0,004 0,59 ± 0,0041 Resultados em base úmida, expressos como média e desvio-padrão, n=3; 2 Para as análises de FA, n=4. As rações experimentais foram elaboradas de acordo com as especificações do AIN-93G, com algumas modificações [ver item 4.3.2. Rações experimentais] (REEVES, P.G. et al. AIN-93 Purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on reformulation of theAIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition, Philadelphia, v.123, p. 939-1951, 1993).

As rações foram suplementadas em 2,5 g de Ca/kg de ração além do

teor recomendado pelo AIN-93G resultando, desta forma, em um valor teórico

de 7,5 g de Ca/kg de ração. Entretanto, os valores determinados para o mineral

62

variaram entre 11,1 e 12,7 g de Ca/kg nas rações dos dois ensaios biológicos.

Com o objetivo de encontrar o ingrediente que poderia estar contribuindo para

esta diferença entre os valores teóricos de Ca e os analisados, o mineral

também foi determinado na caseína utilizada na formulação das rações, tendo

sido encontrado um valor médio (n=3) de 1,35 mg de Ca/g de caseína.

Considerando que a caseína foi utilizada em uma concentração de 20% nas

rações, sua contribuição para a concentração de Ca total foi de apenas 0,27 g

de Ca/kg de ração. Com relação ao Mg, as análises químicas das rações

oferecidas aos animais confirmam o seu conteúdo esperado nas rações (480-

595 mg/kg), ou seja, a quantidade adicionada para a sua formulação.

5.3. Ensaio biológico 5.3.1. Parâmetros nutricionais dos animais controle e alimentados com Raftilose e farinha de yacón

O peso corporal e o consumo da ração, nos dois ensaios biológicos, são

apresentados na Figura 13 e na Tabela 4. Para o 1º ensaio, foi introduzido um

grupo pareado, com o objetivo de ajustar possíveis diferenças no consumo de

ração entre os grupos experimentais. Neste sentido, o efeito da interação entre

os grupos e o consumo total de ração não mostrou-se significativo a um nível de

5%. Além disso, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas

(p<0,05) para o ganho de peso e para o consumo de ração, refletindo-se, deste

modo, em um coeficiente de eficácia alimentar (CEA) médio semelhante entre

todos os grupos experimentais. Com esses resultados, e já conhecendo a

composição em frutanos e açúcares da farinha de yacón, o grupo pareado não

foi utilizado no 2º ensaio. Como já era esperado, o consumo da farinha de

yacón não afetou o crescimento e o desenvolvimento (p>0,10) dos animais ao

longo do período experimental, o que também foi refletido em um CEA médio

semelhante entre os grupos.

63

50,0

90,0

130,0

170,0

210,0

250,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

tempo (dias)

Peso

(g)

controleFOS 5%Pareado

Figura 13- Evolução do peso, ao longo do período experimental, em animais submetidos a dietas controle e suplementadas com Raftilose (1º ensaio) e com farinha de yacón (2º ensaio). Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio farinha de yacón, a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão, n = 8.

50,0

90,0

130,0

170,0

210,0

250,0

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

tempo (dias)

Peso

(g)

controle

FOS 5%

FOS 7,5%

Raftilose

Farinha de yacón

64

Tabela 4: Parâmetros nutricionais em ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (1º ensaio) e farinha de yacón (2º ensaio)1

Raftilose Farinha de yacón

Determinações Controle Pareado2 FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%

Peso inicial (g) 73,86±7,49a 70,06±6,56 71,24±8,4a 94,02±10,2a 88,92±12,02a 84,56±6,21a

Peso final (g) 216,07±17,02 a 204,75±17,20 222,99±10,7a 231,92±24,40a 234,24±18,92a 225,06±24,27a

Ganho de peso (g) 157,40±17,23 a 139,65±19,32 167,16±10,36a 146,88±19,34a 154,35±18,13a 147,68±22,47a

Consumo da ração (g) 373,69±32,20 a 322,35±22,05 382,28±17,86a 410,18±42,72a 430,75±27,53a 422,98±32,41a

CEA3 0,42±0,02 a 0,43±0,05 0,44±0,01a 0,36±0,02a 0,36±0,03a 0,35±0,03a 1 Resultados expressos como média e desvio padrão, n=8. 2 O grupo pareado recebeu a ração controle por todo o período experimental; 3 CEA (coeficiente de eficácia alimentar), que corresponde à relação entre o ganho de peso e o consumo de ração; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio farinha de yacón, a 27 dias; Letras iguais, em uma mesma linha, e em diferentes ensaios, não indicam diferenças significativas (p<0,05).

5.3.2. Peso dos órgãos dos animais controle e alimentados com Raftilose e farinha de yacón

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas (p<0,05)

no peso relativo médio dos órgãos (baço, rins e fígado), bem como no peso

relativo médio do fêmur e da tíbia entre os grupos experimentais, em ambos os

ensaios (Tabela 5). No 1º ensaio, no momento da necropsia, foi verificado, ao

exame macroscópico, um aumento unilateral no rim de um dos animais do

grupo Raftilose, sendo o órgão, desta forma, desconsiderado no momento do

cálculo do peso médio. Casos isolados e semelhantes foram verificados em

estudos envolvendo o consumo de diferentes fibras, como os FOS e o farelo de

trigo (WALTER et al., 1986; CARABIN & FLAMM, 1999). Por outro lado, segundo

CARABIN & FLAMM (1999), não foram observados sinais de anormalidades, em

nível macroscópico e microscópico, em órgãos como fígado, pâncreas, rins,

baço e coração, em ratos alimentados com rações suplementadas com FOS

(GP médio de 3,5) em doses que variaram de 5 a 10% na dieta. A deposição

patológica de minerais e sais de Ca pode ocorrer em tecidos não-osteóides

devido a uma hipercalcemia. No entanto, CHONAN et al. (1996) vericaram, em

ratos, que o consumo de 5% de galactooligossacarídeos (GOS), um carboidrato

fermentável derivado da hidrólise bacteriana da lactose, preveniu os sintomas

relacionados a calcificação dos rins, em resposta a uma dieta com elevados

teores de Ca.

65

Tabela 5: Peso relativo dos órgãos de ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón1

Raftilose Farinha de yacón Órgãos (g/100g)

Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%

Fígado 3,16 ± 0,06a 3,23 ± 0,15a 3,15 ± 0,63a 3,51 ± 0,56a 3,29 ± 0,18a Baço 0,26 ± 0,03a 0,25 ± 0,03a 0,23 ± 0,05a 0,25 ± 0,04a 0,25 ± 0,04a Rins2 0,90 ± 0,13a 0,83 ± 0,06a 0,88 ± 0,10a 1,02 ± 0,06a 0,82 ± 0,09a Fêmur

Direito Esquerdo

0,28 ± 0,02a 0,27 ± 0,01a

0,28 ± 0,01a 0,27 ± 0,01a

0,29 ± 0,02a

0,30 ± 0,02a

0,30 ± 0,02a 0,30 ± 0,03a

0,30 ± 0,02a 0,30 ± 0,01a

Tíbia Direita Esquerda

0,23 ± 0,02a 0,22 ± 0,02a

0,23 ± 0,01a 0,22 ± 0,01a

0,23 ± 0,02a

0,24 ± 0,01a

0,24 ± 0,02a 0,24 ± 0,02a

0,23 ± 0,01a 0,24 ± 0,01a

1Resultados em base úmida, expressos como média e desvio padrão, n=8; 2Valores médios do peso dos rins esquerdo e direito. Para o ensaio Raftilose, o grupo FOS 5% apresentou n=7; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio farinha de yacón, a 27 dias; Letras iguais, em uma mesma linha, e em diferentes ensaios indicam diferenças significativas (p<0,05).

5.3.3. Parâmetros intestinais dos animais controle e alimentados com Raftilose e farinha de yacón

Não foram observados distúrbios gastrintestinais nos animais que

receberam as rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón. Os

carboidratos resistentes à digestão no intestino delgado alcançam o intestino

grosso, onde são metabolizados pela microbiota intestinal, em uma menor ou

maior extensão, resultando na produção de gases e AGCC (CAMPOS et al.,

1998; CHERBUT, 2002; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002). Quando a

disponibilidade de substratos é maior do que a capacidade de fermentação da

microbiota, podem ocorrer sintomas de diarréia (STONE-DORSHOW & LEVITT,

1987; BRIET et al., 1995). Desta forma, o consumo destes carboidratos após

um período de adaptação contribui para uma redução nos sinais de intolerância.

Neste sentido, a coleta das fezes foi primeiramente realizada após 4 dias de

consumo dos FOS. Na Tabela 6 e nas Figuras 14 e 15 são apresentados os

resultados para o peso seco médio e o teor de umidade médio das fezes

coletadas ao longo dos 3 períodos experimentais de balanço mineral (4º, 10º e

16º dias de experimento), constituídos de 5 dias, em ambos os ensaios. Os

dados obtidos no 1º ensaio biológico demonstram que a evolução do peso seco

das fezes em relação ao tempo foi similar para os dois grupos experimentais.

66

No entanto, no 2º ensaio, foi verificado um aumento significativo (p<0,01) no

peso seco médio das fezes dos animais que consumiram a farinha de yacón em

relação ao dos animais do grupo controle, embora tais valores tenham sido

similares entre os dois grupos que consumiram FOS.

Por outro lado, tanto o consumo de Raftilose quanto o da farinha de

yacón resultou em um considerável aumento no teor de umidade das fezes

(p<0,05), sendo esse aumento progressivamente maior e de uma maneira dose-

dependente em relação aos animais que consumiram a dieta controle, nos três

períodos pré-determinados ao longo do experimento.

Tabela 6: Peso seco e teor de umidade das fezes, de 3 períodos experimentais1, de ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón2

Raftilose Farinha de yacón

Fezes Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%

Peso seco (g) 1º período 2º período 3º período

4,31 ± 0,75a 6,13 ± 0,60a 6,56 ± 0,78a

4,42 ± 0,59a 6,42 ± 0,64a 7,02 ± 0,92a

4,95 ± 0,61a 5,43 ± 0,81a

5,97 ± 0,56a

5,53 ± 0,66b 6,42 ± 1,21b 7,34 ± 1,12b

5,94 ± 0,47b 7,48 ± 1,00b 7,89 ± 1,07b

Umidade (%) 1º período 2º período 3º período

14,44 ± 1,81a 15,76 ± 1,79a 19,84 ± 2,93a

27,36 ± 7,78b 30,68 ± 8,11b 41,04 ± 4,48b

12,95 ± 2,25a 15,63 ± 2,53a 21,82 ± 6,83a

18,52 ± 3,41b 19,73 ± 1,69b 23,38 ± 3,54b

20,36 ± 3,66c 23,84 ± 4,26c 28,40 ± 6,36c

1Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) corresponde a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio padrão, n=8; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).

Os FOS permanecem em solução no quimo e contribuem para o

aumento da pressão osmótica, resultando em um aumento no fluxo de água

para o lúmen intestinal. Após alcançar o intestino grosso, a microbiota utiliza

estes carboidratos para o seu metabolismo e, como resultado, são produzidos

AGCC que, reconhecidamente, afetam a motilidade intestinal (VAN LOO et al.,

1999). Além disso, a fermentação de carboidratos proporciona um incremento

na biomassa que, por sua vez, aumenta o volume fecal (VAN LOO et al., 1999;

CHERBUT, 2002). Estudos em animais e humanos têm demonstrado que a

capacidade de aumentar o volume fecal da inulina e da oligofrutose está entre

67

1,2 e 1,5 g de fezes/g de substrato ingerido (GIBSON et al., 1995; CASTIGLIA-

DELAVAUD et al., 1998; NYMAN, 2002).

Figura 14– Peso seco (g) e teor de umidade (%) das fezes, em 3 períodos experimentais (4º, 10º e 16º dias), de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 23 dias. Valores expressos como média e desvio padrão, n = 8. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1º período 2º período 3º período

Peso

sec

o (g

)

ControleFOS 5%

a a

a a aa Raftilose

05

101520253035404550

1º período 2º período 3º período

Teor

de

umid

ade

(%)

ControleFOS 5%a a

a

bb

b Raftilose

68

Figura 15– Peso seco (g) e teor de umidade (%) das fezes, em 3 períodos experimentais (4º, 10º e 16º dias), de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão, n = 8. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

Na Tabela 7 são apresentados alguns parâmetros intestinais, na região

do ceco, indicativos de fermentação bacteriana (também representados na

Figura 16), em ambos os ensaios. A região do ceco foi escolhida para a

avaliação dos parâmetros intestinais pelo fato dos ratos serem animais nos

quais a fermentação bacteriana ocorre predominantemente nesta região do

intestino grosso (CAMPBELL et al., 1997; LE BLAY et al., 1999a, 1999b;

YOUNES et al., 2001). O pH significativamente mais ácido (p<0,01), verificado

no conteúdo do ceco dos animais que consumiram Raftilose (1º ensaio), pode

ser considerado como um resultado indireto da produção de AGCC pelo

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1º período 2º período 3º período

Teor

de

umid

ade

(%)

ControleFOS 5%FOS 7,5%a

a

a

b bb

cc

c

0123456789

10

1º período 2º período 3º período

Peso

sec

o (g

)

ControleFOS 5%FOS 7,5%

aa

ab

bb

b

bb

Farinha de yacón

Farinha de yacón

69

metabolismo microbiano (CAMPBELL et al., 1997; KLEESSEN et al., 2001).

Entretanto, os valores de pH, encontrados no presente estudo, foram mais

elevados do que os reportados na literatura em resposta à fermentação

bacteriana dos FOS e de outros carboidratos fermentáveis (LEVRAT et al.,

1991a; CAMPBELL et al., 1997; LU et al., 2000). Esta tendência foi mantida no

2º ensaio, embora não tenham sido observadas diferenças significativas

(p<0,05) nos valores de pH entre os grupos experimentais.

Tabela 7: Parâmetros intestinais no ceco de ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón1

Raftilose Farinha de yacón

Determinações Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%

Peso úmido do ceco (g/100g rato)

Total Parede Conteúdo

1,22 ± 0,35a 0,24 ± 0,06a

0,98 ± 0,30a

2,72 ± 0,38b 0,43 ± 0,07b

2,29 ± 0,83b

0,95 ± 0,29a 0,22 ± 0,02a 0,73 ± 0,29a

1,78 ± 0,30b 0,33 ± 0,03b 1,46 ± 0,30b

2,09 ± 0,39b 0,42 ± 0,06c 1,67 ± 0,34b

Conteúdo do ceco pH Umidade (%) Resíduo (g) Resíduo (g/100 g rato) Sobrenadante (g) Sobrenadante(g/100g rato) Resíduo/Sobrenadante (R/S)

8,33 ± 0,32a 72,65 ± 2,37a 1,57 ± 0,29a

0,73 ± 0,12a

0,66 ± 0,41a 0,31 ± 0,19a

3,07 ± 1,49a

7,20 ± 0,48b 83,46 ± 3,89b

3,86 ± 0,42b

1,73 ± 0,20b

1,25 ± 0,63a 0,56 ± 0,27a 3,19 ± 1,37a

8,5 ± 0,23a 73,43 ± 3,38a

1,19 ± 0,54a 0,54 ± 0,18a

0,47 ± 0,28a

0,19 ± 0,12a 2,74 ± 0,89a

8,4 ± 0,52a 77,93 ± 7,64ab

1,87 ± 0,38b 0,88 ± 0,16b

1,24 ± 0,50b

0,58 ± 0,21b 1,76 ± 0,84a

8,4 ± 0,32a 80,12 ± 3,37b

2,00 ± 0,29b 0,97 ± 0,11b

1,45 ± 0,61b

0,70 ± 0,28b 1,66 ± 0,87a

Minerais no resíduo do conteúdo do ceco Cálcio Conteúdo (mg) Concentração (mg/g) Magnésio Conteúdo (mg) Concentração (mg/g)

55,57 ± 12,52a

25,48 ± 4,23a

0,98 ± 0,29a 0,44 ± 0,10a

109,56 ± 30,76b

21,16 ± 3,96a

1,65 ± 0,42b 0,33 ± 0,11a

25,02 ± 5,75a 15,83 ± 6,00a

0,67 ± 0,50a 0,37 ± 0,13a

27,42 ± 8,20a 8,95 ± 2,10b

0,82 ± 0,40a 0,26 ± 0,11a

30,07 ± 8,36a 8,75 ± 1,72b

1,16 ± 0,46a 0,34 ± 0,10a

1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).

70

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

total conteúdo parede

Peso

úm

ido

do c

eco

(g/1

00 g

)Controle

FOS 5%

b b

b

aa

a

Figura 16– Peso úmido do ceco, do conteúdo e da parede cecal de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (5% de FOS) e farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias. Valores expressos, em base úmida, como média e desvio padrão, n = 8. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

total conteúdo parede

Peso

úm

ido

do c

eco

(g/1

00 g

)

ControleFOS 5%FOS 7,5%

a

b

b

a

bc

ab b

Farinha de yacón

Raftilose

71

Os animais, de ambos os ensaios, foram mantidos sob restrição

alimentar (jejum) por um período de 12 h antes do momento do sacrifício. De

acordo com Le BLAY et al. (2003), a concentração dos AGCC pode variar

consideravelmente dependendo do intervalo entre a última refeição e o

momento no qual as amostras são coletadas, podendo explicar, deste modo, os

elevados valores de pH encontrados no presente estudo. Além disso, o pH foi

determinado na fração sobrenadante do conteúdo do ceco após a sua

centrifugação, embora no momento do sacrifício dos animais o material tenha

sido coletado sobre uma placa de petri resfriada com gelo, com a finalidade de

minimizar possíveis perdas ocasionadas pela volatilização dos AGCC presentes

nas amostras (LU et al., 2000). Assim, a centrifugação do conteúdo do ceco

pode ter contribuído para esta volatilização, permitindo que ocorresse uma

elevação nos valores de pH. Ainda, WOLF et al. (1998) atribuíram os valores

elevados de pH encontrados em seu estudo à elevada capacidade tamponante

da ração AIN-93G.

YOUNES et al. (1996) demonstraram que a fermentação do amido

resistente (pH do conteúdo do ceco variando entre 5,05 e 5,72) afetou de uma

maneira positiva a absorção mineral (Ca e Mg), especialmente quando a

concentração de Ca nas rações era baixa (2,5 g/kg). Quando a fermentação

bacteriana de carboidratos ocorre na presença de uma reduzida concentração

luminal de Ca (3g/kg), o pH do meio torna-se demasiadamente ácido, com

predomínio para a produção de ácido láctico em prejuízo da produção de AGCC

(DEMIGNÉ et al., 1995). Por outro lado, quando a ingestão de Ca é elevada

(7,5 g/kg), uma quantidade considerável deste mineral alcança a região do

intestino grosso (encontrando-se, principalmente, em valores fisiológicos de pH)

na forma de um complexo insolúvel com o fósforo (RÉMÉSY et al., 1993;

DEMIGNÉ et al., 1995; YOUNES et al., 1996).

A presença de um sistema tampão no ceco envolvendo este complexo

entre o Ca e o fósforo tem sido descrita em ratos alimentados com rações

suplementadas com inulina e FOS (RÉMÉSY et al., 1993; TEN

BRUGGENCATE et al., 2004) e com amido resistente (YOUNES et al., 1996).

Uma elevada concentração de Ca no conteúdo do ceco pode prevenir os efeitos

negativos proporcionados por uma excessiva diminuição do pH luminal. No

presente estudo, o aumento significativo (p<0,05) do teor de Ca (expresso em

72

mg) no conteúdo do ceco (em especial, no 1º ensaio) e os valores de pH

elevados associados ao consumo dos FOS, observados no presente estudo

(Tabela 7), podem ter contribuído para contrabalançar tais efeitos, resultantes

da rápida fermentação destes carboidratos. No 2º ensaio, embora tenham sido

verificados valores mais altos para o conteúdo de Ca no ceco dos animais que

consumiram a farinha de yacón em relação aos animais do grupo controle, tais

valores não foram estatisticamente diferentes. Assim, os efeitos da fermentação

bacteriana sobre o pH do conteúdo do ceco poderiam ser, de alguma forma,

sobrepujados em virtude da elevada concentração de Ca oferecida nas rações

experimentais do presente estudo (Tabela 3), em ambos os ensaios realizados.

O consumo de FOS (Tabela 7) provocou uma considerável elevação no

peso relativo do conteúdo do ceco (g/100 g de rato), em ambos os ensaios

(p<0,01), em relação aos grupos controle, embora não tenham sido observadas

diferenças significativas nos pesos entre os grupos que consumiram a farinha

do yacón [5 e 7,5% de FOS] (Figura 16). O aumento no peso úmido do

conteúdo do ceco foi acompanhado por uma considerável elevação no peso do

resíduo (p<0,05), obtido após a centrifugação do conteúdo cecal, em ambos os

ensaios.

As médias dos valores do peso úmido do ceco total, do conteúdo e da

sua parede mostraram-se significativamente maiores (p<0,01) nos grupos que

consumiram FOS em comparação às dos grupos controle, em ambos os

ensaios (Tabela 7 e Figura 16). O aumento no peso do ceco (parede e

conteúdo) em resposta ao consumo de carboidratos fermentáveis tem sido

freqüentemente demonstrado por diferentes grupos de pesquisa (LEVRAT et al.,

1991; RÉMÉSY et al., 1993; LE BLAY et al., 1999a; YOUNES et al., 1993, 1996,

2001; LOBO & FILISETTI, 2002). Segundo YOUNES et al. (1996), tal efeito

tende a ser proporcional à fermentabilidade destes carboidratos no ceco. Desta

forma, o perfil de produtos da fermentação bacteriana (AGCC) pode estar

estreitamente envolvido com o efeito trófico dos FOS no ceco dos animais. No

presente estudo, ocorreu um aumento pronunciado (p<0,01) no peso do

conteúdo e na parede do ceco em resposta ao consumo de FOS, sugerindo um

provável aumento da biomassa (ou da ‘massa’ bacteriana). Este efeito pode ter

proporcionado um subseqüente aumento na atividade metabólica bacteriana

73

resultando, desta maneira, em uma alteração na estrutura da parede do ceco,

evidenciada através das análises histológicas realizadas no 2º ensaio.

5.3.3.1. Análises histológicas: produção de muco no ceco e no cólon proximal de animais controle e alimentados com farinha de yacón

A análise histológica das regiões do ceco e do cólon proximal dos

animais do 2º ensaio demonstrou uma coloração pelo PAS mais acentuada, no

grupo que recebeu a farinha de yacón (FOS 5 e 7,5%) em relação ao grupo

controle, demonstrando um maior estímulo para produção de muco pelas

células caliciformes (Figura 17 e 18).

Figura 17– Cortes histológicos do ceco de ratos alimentados com rações controle (A) e suplementadas com farinha de yacón [5 e 7,5% de FOS] (B e C, respectivamente). Notar o aumento na intensidade da coloração proporcionada pelo ácido periódico – Schiff (PAS), na região basal das criptas (setas), demonstrando o aumento da quantidade de muco produzido pelas células caliciformes, nos cortes B e C. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. PAS, ampliações de 200x.

A camada de muco é um componente estrutural do intestino, atuando na

proteção, na lubrificação e no transporte entre o conteúdo luminal e o epitélio

(DePLANCKE & GASKINS, 2001). As propriedades viscoelásticas do muco são

derivadas de glicoproteínas denominadas mucinas, que consistem de domínios

glicosilados e não-glicosilados. As mucinas são secretadas na superfície apical

de células colunares altamente especializadas, as chamadas células

caliciformes. Estas células podem ser originadas a partir das células-tronco

situadas na região basal das criptas intestinais, ou a partir de células pouco

A B C

74

diferenciadas referidas como células oligomucosas, também situadas na

região basal da cripta (SPECIAN & OLIVER, 1991).

As mucinas são classificadas em neutras e ácidas, sendo estas últimas

divididas em sulfatadas (sulfomucinas) e não-sulfatadas (sialomucinas).

Enquanto as mucinas neutras predominam na mucosa gástrica, as ácidas são

expressas ao longo de todo o epitélio intestinal, com predomínio no intestino

grosso. Segundo DePLANCKE & GASKINS (2001), as mucinas ácidas possuem

uma maior capacidade de proteção contra a translocação bacteriana, uma vez

que este tipo de mucina é mais resistente às glicosidases bacterianas e às

proteases do hospedeiro.

Figura 18– Cortes histológicos do cólon proximal de ratos alimentados com rações suplementadas com farinha de yacón (7,5% de FOS). O aumento na intensidade da coloração também ocorreu no cólon, principalmente na região basal das criptas (setas), demonstrando o aumento da quantidade de muco produzido pelas células caliciformes. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. PAS, ampliações de 400x.

Os efeitos relacionados à fermentação dos frutanos (FOS e inulina) têm

sido amplamente investigados (GIBSON & ROBERFROID, 1995; CAMPBELL et

al., 1997; LE BLAY et al., 1999; KLEESSEN et al., 2003). Sabe-se que estes

substratos são rapidamente metabolizados pelas bactérias intestinais,

resultando na produção de ácidos orgânicos, tais como os AGCC e o lactato

(CHERBUT, 2002; CUMMINGS & MacFARLANE, 2002; Le BLAY et al., 1999a).

Como conseqüência, ocorre uma diminuição no pH luminal que, por sua vez,

pode inibir o crescimento de espécies bacterianas patogênicas. Neste sentido,

75

estes componentes têm sido considerados como prebióticos, devido a sua

capacidade de estimular seletivamente o crescimento e a atividade metabólica

de espécies bacterianas consideradas benéficas para o hospedeiro, tais como

as bifidobactérias e lactobacilos (GIBSON & ROBERFROID, 1995; Le BLAY et

al., 1999a; KLEESSEN et al., 2003). Estas bactérias podem reduzir a

colonização de patógenos intestinais pela produção dos ácidos orgânicos ou,

ainda, através da competição por nutrientes ou por sítios de adesão

(CAMPBELL et al., 1997; ROBERFROID et al., 1998).

Por outro lado, a pronunciada diminuição do pH em resposta a uma

intensa atividade fermentativa pode ser nociva para a integridade da mucosa

intestinal (RÉMÉSY et al., 1993; DEMIGNÉ et al., 1995), possibilitando uma

maior susceptibilidade da barreira mucosa contra agentes patogênicos (TEN-

BRUGGENCATE et al., 2003; BOVEE-OUDENHOVEN et al., 2003). Assim,

como conseqüência a esta condição ácida, as células da mucosa são

estimuladas a produzir muco (BOVEE-OUDENHOVEN et al., 2003).

O muco aderente forma uma fina camada sobre o epitélio que mantém o

pH diferente do reinante na luz intestinal, com uma mínima faixa de variação.

Desta forma, o muco pode apresentar efeito protetor contra a colonização e

liberação de toxinas por bactérias patogênicas (DePLANCKE & GASKINS,

2001). A secreção de muco pode ainda estar sendo estimulada diretamente

pela presença de AGCC (em especial, o butirato), por um mecanismo

envolvendo receptores quimiossensíveis e nervos colinérgicos, responsáveis

pela liberação de muco a partir das células caliciformes presentes na região do

cólon (SHIMOTOYODOME et al., 2000).

A quantidade e a composição da camada de muco refletem um equilíbrio

entre a sua secreção e a erosão e degradação pelas bactérias intestinais

(DePLANCKE & GASKINS, 2001). De acordo com SHARMA et al. (1995), a

dieta e a microbiota também podem alterar a distribuição e a composição das

mucinas no intestino. Estudos têm evidenciado um aumento na secreção de

mucina e no número relativo de células caliciformes em resposta a dietas com

elevados teores de FA (SUBRAMANIAM et al., 1990; SCHMIDT-WITTIG et al.,

1996; KLEESSEN et al., 2003). KIM (2002) observou um maior número de

células caliciformes nas regiões do jejuno e do íleo em animais que consumiram

rações suplementadas com pectina (10%) e inulina (5%) em comparação aos

76

animais do grupo controle. KLEESSEN et al. (2003) observaram um aumento

significativo na espessura da camada de muco, além de uma maior quantidade

de células caliciformes e de mucinas ácidas, com predomínio para as

sulfomucinas, nas regiões do jejuno e do cólon distal em resposta ao consumo

de oligofrutose e inulina.

5.3.3.2. Análises histológicas: morfometria da mucosa intestinal de animais controle e alimentados com farinha de yacón

A Figura 19 demonstra que o consumo de 7,5% de FOS estimulou, de

uma maneira significativa (p<0,05), o aumento no número de criptas no ceco.

Além disso, a suplementação de 7,5% de FOS resultou em um comprimento

das criptas significativamente maior (p<0,05) em comparação ao grupo controle

(Figura 20). HOWARD et al. (1995) demonstraram, em ratos, que fibras inertes

ou pobremente fermentáveis contribuíram para a manutenção do peso normal

do cólon através da prevenção da atrofia da camada muscular, considerando

que para a manutenção da integridade da camada mucosa foi requerida a

presença de um substrato fermentável.

A manutenção da integridade da mucosa necessita da presença do

alimento no intestino (GOODLAD & WRIGHT, 1983; SCHEPPACH et al., 1995).

De acordo com WONG & WRIGHT (1999), quando o controle do crescimento da

mucosa é avaliado, os conceitos de nutrição luminal e demanda funcional da mucosa devem ser distinguidos. A redução na produção de células na cripta

está associada a uma ausência de nutrição luminal ou a uma alterada demanda

funcional. Assim, estudos têm demonstrado que existe uma profunda atrofia da

mucosa em situações de nutrição parenteral total ou de ingestão de dietas

isentas de fibra (GOODLAD & WRIGHT, 1983; SCHEPPACH et al., 1995;

WONG & WRIGHT, 1999). Por outro lado, evidências indicam uma redução na

atrofia da mucosa e um estímulo na síntese de DNA no intestino grosso após a

suplementação, com FA, com dietas isentas de fibras (GOODLAD & WRIGHT,

1983).

77

Figura 19– Número de criptas do ceco por campo microscópico de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

Figura 20- Profundidade das criptas no ceco de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

No intestino grosso, o efeito trófico das FA tem sido atribuído aos AGCC

produzidos a partir da fermentação bacteriana destes carboidratos (LIVESEY &

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

controle FOS 5% FOS 7,5%

nº d

e cr

ipta

s/ca

mpo

aa

b

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

controle FOS 5% FOS 7,5%

Prof

undi

dade

das

crip

tas

(nº d

e es

paço

s co

ntad

os)

aab

b

78

ELIA, 1995; SAKATA, 1995; GEE et al., 1996). Sob tais circunstâncias,

RÉMÉSY et al. (1993) reportaram um aumento na profundidade e no número de

células por cripta em ratos alimentados com rações suplementadas com 15% de

inulina. Outros estudos têm evidenciado uma alteração no comprimento e na

densidade das criptas após o consumo de outros carboidratos fermentáveis

(JOHNSON & GEE, 1986; HOWARD et al., 1995; SCHMIDT-WITTIG et al.,

1996; CAVAGLIERI-FELIPPE et al., 1997). Dentre os AGGC produzidos, o

butirato tem sido reconhecido como a principal fonte de energia para a mucosa

colônica, apresentando um papel importante no estímulo da divisão celular na

mucosa do intestino (SAKATA, 1995; CAMPBELL et al., 1997; LE BLAY et al.,

1999). Além disso, tem sido sugerido que os efeitos tróficos dos AGCC podem

estar sendo mediados por hormônios e fatores de crescimento (LEVRAT et al.,

1991b; KLURFELD, 1992; FRANKEL et al., 1994; GEE et al., 1996;

MASSIMINO et al., 1998; KLEESSEN et al., 2001).

O aumento no número de criptas no ceco (Figura 21) em resposta à

ingestão dos FOS, verificado no presente estudo, foi substanciado por um

número de criptas em bifurcação significativamente maior (p<0,05) observado

no ceco dos animais que consumiram a farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS) em

relação ao grupo controle (Figuras 21, 22, 23 e 24). Além disso, esta tendência

também foi intensamente verificada na região do cólon proximal, conforme

ilustram as Figuras 25 e 26. Segundo McCULLOUGH et al. (1998), embora tal

processo ainda seja pouco conhecido, a produção de novas criptas através do

mecanismo de bifurcação (ou fissão) pode ser considerada como uma maneira

alternativa ou complementar para o controle do aumento da massa tecidual no

intestino.

79

Figura 21– Cortes histológicos da região do ceco de ratos alimentados com rações controle (A) e suplementadas com farinha de yacón [5 e 7,5% de FOS] (B e C, respectivamente), demonstrando o aumento no número de criptas por campo, estimulado pelo consumo dos FOS. Em B, as setas indicam criptas em processo de bifurcação. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. H.E., ampliações de 200x.

B

C

A

80

Figura 22– Corte histológico do ceco de um animal alimentado com ração suplementada com farinha de yacón (7,5% de FOS). A seta indica uma cripta em bifurcação. H.E., ampliação de 200x.

Figura 23– Número de criptas bifurcadas no ceco, por campo microscópico, de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão.

0,000,200,400,600,801,001,201,401,601,802,00

controle FOS 5% FOS 7,5%

nº d

e cr

ipta

s bi

furc

adas

/cam

po

a

b

b

81

Figura 24– Número total de criptas bifurcadas pelo total de criptas no ceco de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

Figura 25– Corte histológico do cólon proximal de um animal alimentado com ração suplementada com farinha de yacón (5% de FOS). As setas indicam criptas em processo de bifurcação. H.E., ampliação de 400x.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

controle FOS 5% FOS 7,5%

nº c

ripta

s bi

furc

adas

/tota

l de

crip

tas

a

ab

b

82

Figura 26– Corte histológico do cólon proximal de um animal alimentado com ração suplementada com farinha de yacón (7,5% de FOS). As setas indicam criptas em processo de bifurcação. H.E., ampliação de 400x.

5.3.4. Absorção intestinal e balanço de cálcio e magnésio

Nas Tabelas 8 e 9 são apresentados os valores obtidos para os

parâmetros relacionados à absorção intestinal de Ca e Mg, respectivamente,

para o 1º ensaio. Foi verificada uma forte tendência para um maior conteúdo

fecal de Ca nos animais do grupo controle. Além disso, os dados demonstram

que os animais que consumiram FOS apresentaram, em média, maior absorção

aparente de Ca em comparação aos animais que consumiram a ração controle,

em todos os períodos experimentais, sendo esta diferença aumentada em cerca

de 35% no 1º período para estáveis 43-44% no 2º e 3º períodos (Figura 27).

Com relação ao Mg, o conteúdo fecal médio (Tabela 9) foi levemente

menor no grupo que consumiu os FOS em comparação ao grupo que consumiu

a ração controle. Para os animais do grupo controle, a quantidade excretada

variou entre 1,59 mg/dia, no 1º período, e 2,59 mg/dia, no último período

experimental, enquanto que no grupo que consumiu os FOS, os valores

variaram entre 0,9 mg/dia, no 1º período, e 1,45 mg/dia, no 3º período. Sendo

assim, o consumo dos FOS provocou um aumento na absorção intestinal

aparente que variou entre 13%, no 1º período, e 17%, no último período

experimental (Figura 27).

83

Tabela 8: Absorção de cálcio, em 3 períodos experimentais1, em ratos alimentados com dietas controle e dietas suplementadas com Raftilose (FOS 5%)2 Determinações Controle FOS 5% Ingestão, mg/dia

1º período 2º período 3º período

154,19 ± 15,93 189,98 ± 25,51 207,23 ± 20,91

179,77 ± 11,47 221,40 ± 8,18 243,12 ± 5,79

Excreção fecal, mg/dia 1º período 2º período 3º período

70,21 ± 15,53

108,22 ± 18,07 119,06 ± 20,25

47,80 ± 7,71 82,53 ± 10,12 93,60 ± 11,10

Conteúdo fecal, mg/g 1º período 2º período 3º período

80,96 ± 4,98 87,85 ± 8,40 90,47 ± 7,51

54,00 ± 4,15 64,20 ± 2,16 67,05 ± 5,63

Absorção aparente fracional, mg/dia 1º período 2º período 3º período

83,98 ± 18,49a 82,35 ± 16,61a 87,77 ± 19,15a

131,97 ± 14,57b 135,77 ± 7,49b 144,47 ± 7,76b

Absorção aparente, % 1º período 2º período 3º período

54,34 ± 10,03a 43,17 ± 6,31a 42,41 ± 8,23a

73,29 ± 4,95b 62,27 ± 3,31b 60,84 ± 2,99b

1 Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio padrão, n=8; O tempo de experimento correspondeu a 23 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).

84

Tabela 9: Absorção de magnésio, em 3 períodos experimentais1, em ratos alimentados com dietas controle e dietas suplementadas com Raftilose (FOS 5%)2

Determinações Controle FOS 5% Ingestão, mg/dia

1º período 2º período 3º período

6,89 ± 0,71 8,51 ± 1,06 9,24 ± 0,87

7,16 ± 0,46 8,70 ± 0,46 9,50 ± 0,57

Excreção fecal, mg/dia 1º período 2º período 3º período

1,59 ± 0,40 2,28 ± 0,54 2,59 ± 0,70

0,90 ± 0,18 1,40 ± 0,25 1,45 ± 0,32

Conteúdo fecal, mg/g 1º período 2º período 3º período

1,83 ± 0,24 1,85 ± 0,32 1,95 ± 0,35

1,01 ± 0,11 1,10 ± 0,19 1,03 ± 0,16

Absorção aparente fracional, mg/dia 1º período 2º período 3º período

5,31 ± 0,56a 6,23 ± 0,76a 6,65 ± 0,58a

6,26 ± 0,55b 7,29 ± 0,40b 8,06 ± 0,45b

Absorção aparente, % 1º período 2º período 3º período

77,13 ± 4,66a 73,36 ± 4,13a 72,23 ± 5,48a

87,34 ± 2,79b 83,39 ± 2,50b 84,91 ± 3,00b

1 Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio padrão, n=8; O tempo de experimento correspondeu a 23 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).

85

Figura 27– Absorção aparente de Ca e Mg de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (5% de FOS). Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias. O tempo de experimento correspondeu a 23 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

Nas Tabelas 10 e 11 são apresentados os dados referentes à absorção

intestinal e ao balanço mineral de Ca e Mg, para o 2º ensaio. Conforme foi

observado no 1º ensaio, ocorreu uma diminuição estatisticamente significativa

(p<0,05) no conteúdo de Ca e Mg nas fezes, ao longo dos 3 períodos

experimentais, sendo que não foram verificadas evidências demonstrando que

esta diminuição ocorreu de uma maneira dose-dependente nos animais que

consumiram os FOS. Tanto os valores de absorção intestinal aparente (Figura 28) quanto os de balanço de Ca (Figura 29) foram estatisticamente diferentes

entre os 3 grupos experimentais (p<0,05), sendo que os valores médios foram

maiores para o grupo que consumiu 7,5% de FOS e os menores para o grupo

0102030405060708090

100

1º período 2º período 3º período

Abs

orçã

o ap

aren

te (%

)..

ControleFOS 5%

a a a

bb b

0

10

20

30

4050

60

70

80

90

1º período 2º período 3º período

Abs

orçã

o ap

aren

te (%

)..ControleFOS 5%

a

b

a a

b b

Ca

Mg

86

controle. Por outro lado, a absorção aparente do Mg (Figura 28) não foi afetada

pelo consumo dos FOS, embora o grupo que consumiu 7,5% de FOS tenha

apresentado um balanço de Mg significativamente maior (p<0,05) em relação ao

grupo controle (Figura 29).

Tabela 10: Absorção intestinal aparente e balanço de cálcio, em 3 períodosexperimentais1, em ratos alimentados com dietas controle e dietas suplementadascom farinha de yacón2 Determinações Controle FOS 5% FOS 7,5% Ingestão, mg/dia

1º período 2º período 3º período

175,20 ± 23,05 200,70 ± 27,62 213,70 ± 26,86

177,27 ± 15,73 200,09 ± 22,46 219,72 ± 13,46

214,95 ± 15,01 256,89 ± 29,35 269,73 ± 31,58

Excreção urinária, mg/dia 1º período 2º período 3º período

8,77 ± 2,06 8,60 ± 2,16

11,45 ± 4,30

11,73 ± 2,17 9,92 ± 3,52 3,29 ± 1,13

8,25 ± 2,31 8,58 ± 3,32 5,44 ± 1,15

Conteúdo urinário, mg/L 1º período 2º período 3º período

270,98 ± 120,11 245,67 ± 107,08 253,41 ± 107,56

269,97 ± 81,13 243,70 ± 83,13

292,55 ± 166,16

260,77 ± 143,55 293,0 ± 206,35 122,99 ± 30,52

Excreção fecal, mg/dia 1º período 2º período 3º período

87,76 ± 15,42a

108,88 ± 17,55a 113,91 ± 15,53a

54,03 ± 9,76b 76,42 ± 20,20b 80,86 ± 9,24b

52,12 ± 8,25b 68,57 ± 9,64b 76,25 ± 7,71b

Conteúdo fecal, mg/g 1º período 2º período 3º período

88,59 ± 9,50a 97,87 ± 6,08a 95,85 ± 9,68a

54,49 ± 6,33b 68,42 ± 8,68b 67,74 ± 5,24b

52,56 ± 4,05b 62,28 ± 5,52b 63,92 ± 4,15b

Absorção aparente fracional, mg/dia1º período 2º período 3º período

87,44 ± 12,93a 91,24 ± 27,10a 97,31 ± 22,97a

123,23 ± 19,76b 123,67 ± 26,24b 138,86 ± 15,08b

162,83 ± 15,40c 188,32 ± 28,65c 193,47 ± 31,63c

Absorção aparente, % 1º período 2º período 3º período

49,99 ± 4,56a 45,07 ± 9,66a 45,72 ± 6,94a

69,26 ± 6,38b 61,69 ± 9,77b 63,12 ± 4,52b

75,70 ± 3,72c 73,08 ± 4,43c 71,39 ± 4,53c

Balanço mineral, mg/dia 1º período 2º período 3º período

78,67 ± 13,91a 82,64 ± 27,97a 85,86 ± 22,61a

111,50 ± 18,10b 113,76 ± 25,31b 135,58 ± 15,23b

154,58 ± 13,46c 179,75 ± 30,37c 188,37 ± 31,39c

1Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; O tempo total de experimento correspondeu a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).

87

Tabela 11: Absorção intestinal aparente e balanço de magnésio, em 3 períodos experimentais1, em ratos alimentados com dietas controle e dietassuplementadas com farinha de yacón2

Determinações Controle FOS 5% FOS 7,5% Ingestão, mg/dia

1º período 2º período 3º período

6,91 ± 0,91 7,89 ± 1,01 8,33 ± 1,02

7,49 ± 0,98 8,55 ± 1,09 9,02 ± 1,10

8,49 ± 1,12 9,70 ± 1,24 10,24 ± 1,25

Excreção urinária, mg/dia 1º período 2º período 3º período

1,55 ± 0,33 1,64 ± 0,35 1,68 ± 0,44

1,72 ± 0,51 1,66 ± 0,94 1,24 ± 0,59

1,31 ± 0,29 1,60 ± 0,67 1,32 ± 0,88

Conteúdo urinário, mg/L 1º período 2º período 3º período

47,78 ± 20,54 46,54 ± 19,30 37,53 ± 13,95

39,04 ± 12,76 41,15 ± 24,39 33,10 ± 9,73

49,28 ± 34,48 56,96 ± 48,05 31,97 ± 24,42

Excreção fecal, mg/dia

1º período 2º período 3º período

1,86 ± 0,46 2,30 ± 0,51 2,33 ± 0,42

1,70 ± 0,36 2,11 ± 0,40 2,28 ± 0,30

1,98 ± 0,35 2,62 ± 0,60 2,62 ± 0,44

Conteúdo fecal, mg/g 1º período 2º período 3º período

1,87 ± 0,29a 2,11 ± 0,37a 1,95 ± 0,21a

1,52 ± 0,20b 1,62 ± 0,12b 1,57 ± 0,18b

1,66 ± 0,18b 1,74 ± 0,23b 1,66 ± 0,15b

Absorção aparente fracional, mg/dia 1º período 2º período 3º período

5,05 ± 0,56a 5,77 ± 0,79a 6,00 ± 0,86a

5,79 ± 1,11a 6,44 ± 1,24a 6,74 ± 1,22a

6,51 ± 0,90a 7,08 ± 1,25a 7,69 ± 1,08a

Absorção aparente, % 1º período 2º período 3º período

73,29 ± 3,67a 71,50 ± 5,17a 71,88 ± 3,99a

76,87 ± 6,53a 74,90 ± 6,06a 74,25 ± 5,31a

76,63 ± 2,88a 72,77 ± 6,26a 74,50 ± 4,35a

Balanço mineral, mg/dia 1º período 2º período 3º período

3,50 ± 0,64a 4,11 ± 1,07a 4,32 ± 1,01a

4,07 ± 1,39ab 4,78 ± 1,70ab 5,51 ± 1,41ab

5,20 ± 1,02b 5,48 ± 1,20b 6,36 ± 1,00b

1 Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias; 2 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; O tempo total de experimento correspondeu a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).

88

Figura 28– Absorção aparente de Ca e Mg de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón. Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

Outros estudos têm demonstrado os efeitos positivos dos frutanos (FOS

e inulina) na absorção mineral, embora os resultados apresentados dependam

da relação entre a concentração do mineral e a do carboidrato oferecido na

dieta. LEVRAT et al. (1991c) avaliaram, em ratos, os efeitos de diferentes

concentrações de inulina (5, 10 e 20% na ração) na absorção aparente de Ca e

Mg. Os autores observaram que o aumento na absorção de Ca ocorreu em uma

maneira dose-dependente, fato que não foi verificado para o Mg. Por outro lado,

WOLF et al. (1998) estudaram o efeito dos FOS (1, 3 e 5% na ração) na

absorção aparente e no balanço de diversos minerais, incluindo Ca, P, Mg, Fe e

0102030405060708090

1º período 2º período 3º período

Abs

orçã

o ap

aren

te (%

).

ControleFOS 5%FOS 7,5%

aa a a

a a a a a

010

20

30

4050

60

70

8090

1º período 2º período 3º período

Abs

orçã

o ap

aren

te (%

).

ControleFOS 5%FOS 7,5%

a

bc

a

bc

a

bc Ca

Mg

89

Zn, e verificaram que somente a absorção de Mg, no grupo que recebeu 5% de

FOS na ração, foi significativamente maior do que a do grupo controle.

Figura 29– Balanço de Ca e Mg em ratos alimentados com rações controle e suplementadas com farinha de yacón. Cada período (4º, 10º e 16º dias de experimento) correspondeu a 5 dias. O tempo de experimento correspondeu a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1º período 2º período 3º período

Bal

anço

min

eral

(mg/

dia)

.

ControleFOS 5%FOS 7,5%

a

a aab

abab

b bb

0

50

100

150

200

250

1ºperíodo

2ºperíodo

3ºperíodo

Bal

anço

min

eral

(mg/

dia)

.ControleFOS 5%FOS 7,5%

aa a

b bbc

c c Ca

Mg

90

Utilizando 5% de FOS nas rações experimentais, o grupo de OHTA

verificou efeitos positivos na absorção de Ca e Mg no intestino grosso,

utilizando animais sadios, deficientes em Mg ou submetidos à cirurgia para

retirada do ceco (OHTA et al., 1994a; OHTA et al., 1994b, OHTA et al., 1995;

BABA et al., 1996). Em outro estudo, o consumo de amido resistente, associado

a diferentes concentrações de Ca na ração (3 e 6 g/kg), resultou em um

aumento considerável na absorção do Ca, sendo que este aumento foi 77%

maior nas dietas com 6 g/kg de Ca (YOUNES et al., 1993). KRUGER et al.

(2003) verificaram um conteúdo (mg/g) de Ca nas fezes, coletadas em um

período de 3 dias, significativamente maior em animais que consumiram rações

suplementadas com 5% de inulina, em relação aos do grupo controle.

Os mecanimos e locais de absorção intestinal de Ca e Mg apresentam

algumas diferenças podendo, em parte, explicar os diferentes efeitos na

absorção destes dois minerais no presente estudo. O mecanismo de transporte

intestinal de Ca envolve dois processos, um paracelular e outro transcelular. O

mecanismo transcelular ocorre principalmente no duodeno e é regulado pela

1,25(OH)2D3. O transporte paracelular envolve o movimento do Ca entre as

junções intercelulares e ocorre ao longo de todo o intestino (BRONNER, 1998;

BRONNER & PANSU, 1999; SARIS et al., 2000; COUDRAY et al., 2003). Os

mecanismos de absorção intestinal de Mg envolvem um processo saturável

(difusão facilitada ou absorção ativa) e uma difusão passiva, dependente de um

arraste pelo solvente (movimento paracelular), o qual ocorre principalmente no

íleo (COUDRAY et al., 2003).

CHONAN et al. (1995) verificaram que a suplementação da ração com

5% de galactooligossacarídeos (GOS) aumentou inicialmente (9 dias) a

absorção de Ca em ratos ovariectomizados sendo que, após 28 dias de

experimento, tal efeito não foi observado. OHTA et al. (1998c) verificaram uma

menor absorção de Ca no 24º dia de experimento em comparação ao 10º dia

sendo que, para o Mg, o efeito foi similar em ambos os períodos. Estes efeitos

foram justificados pela presença de uma regulação negativa (down-regulation)

da absorção transcelular de Ca no intestino delgado após algumas semanas de

ingestão de FOS (COUDRAY et al., 2003a; TAHIRI et al., 2003a). Embora, no

presente estudo, os valores percentuais para a absorção aparente de Ca

91

tenham diminuído ao longo dos períodos experimentais, principalmente para o

grupo que recebeu 7,5% de FOS, este mecanismo parece não ter ocorrido de

uma maneira significativa.

Em relação ao Mg, estudos em animais e humanos têm evidenciado um

efeito positivo considerável na sua absorção, após a ingestão de carboidratos

fermentáveis (BABA et al., 1996; WOLF et al., 1998; COUDRAY et al., 2003a).

Entretanto, no presente estudo, esta tendência não foi observada. De acordo

com COUZY et al. (1993) uma elevada ingestão de Ca pode afetar de uma

maneira negativa a absorção de Mg. MIURA et al. (1999) observaram uma

significativa (p<0,05) redução na absorção aparente de Mg e nas suas

concentrações séricas e no fêmur, após o consumo de 1,5% de Ca, em ratos

em crescimento. O efeito inibitório de elevadas concentrações de Ca na ração,

sobre a absorção de Mg, foi documentado por BRINK et al. (1992), que

verificaram a ocorrência da formação de um complexo insolúvel entre o Ca, o

Mg e o fósforo no intestino de ratos. No presente estudo, a elevada

concentração de Ca presente nas rações pode ter influenciado ligeiramente na

absorção de Mg, especialmente no 2º ensaio.

Alguns mecanismos têm sido sugeridos para explicar o aumento na

absorção dos minerais no intestino grosso em decorrência da fermentação de

carboidratos. Tal processo é acompanhado por uma intensa produção de

AGCC, que resulta em uma diminuição no pH luminal e em um conseqüente

aumento na solubilização dos minerais favorecendo, deste modo, a sua

absorção intestinal (DEMIGNÉ et al., 1995). Além disso, no presente estudo, a

hipertrofia no ceco (Figura 16), evidenciada pelo pronunciado aumento na

quantidade e no comprimento de suas criptas no ceco (Figuras 19 e 20,

respectivamente), bem como no maior número de criptas em bifurcação

(Figuras 23 e 24) verificado nos animais que consumiram os FOS, poderia, em

princípio, explicar a maior absorção intestinal dos minerais, devido ao aumento

na superfície de absorção no intestino dos animais.

5.3.5. Efeito dos frutooligossacarídeos nos parâmetros ósseos

Na Tabela 12 são apresentados os valores correspondentes aos

parâmetros estudados (peso, conteúdo e concentração de Ca e Mg) no fêmur e

92

na tíbia dos animais de ambos os ensaios. Não foram observadas diferenças

significativas no peso dos ossos (fêmur e tíbia) entre os grupos experimentais,

em ambos os ensaios. Por outro lado, o consumo de Raftilose (5% de FOS)

proporcionou um aumento estatisticamente significativo (p<0,05) na

concentração de Ca, tanto no fêmur quanto na tíbia, quando comparado com os

ossos dos animais do grupo controle. Além disso, no 2º ensaio, somente o

grupo que recebeu 7,5% dos FOS, provenientes da farinha de yacón,

apresentou um significativo aumento na concentração deste mineral nos ossos

(fêmur e tíbia) em relação ao grupo controle (Figura 30).

Alguns estudos envolvendo os efeitos de carboidratos fermentáveis na

absorção intestinal de minerais têm sido conduzidos com a finalidade de avaliar

a extensão da sua contribuição para a mineralização óssea. Em ratos

gastrectomizados, OHTA et al. (1998c) verificaram uma concentração de Ca

significativamente maior no fêmur dos animais que consumiram rações

suplementadas com 7,5% de oligofrutose, em relação aos que consumiram a

ração controle. Uma similar tendência foi observada no fêmur de animais

ovariectomizados que consumiram oligofrutose em rações suplementadas com

1% de Ca após 8 semanas de experimento sendo que, após 16 semanas, tal

efeito perdeu significância estatística (SCHOLZ-AHRENS et al., 2002).

93

Tabela 12: Parâmetros ósseos em ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón1

Raftilose Farinha de yacón

Determinações Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5% Peso Peso úmido(g)

Fêmur direito Fêmur esquerdo

Tíbia Direita Tíbia esquerda

Peso seco (g)

Fêmur direito Fêmur esquerdo

Tíbia Direita Tíbia esquerda

Conteúdo mineral2 Ca (mg) osso úmido

Fêmur Tíbia

Mg (mg) osso úmido

Fêmur Tíbia

Concentração mineral2 Ca (mg/g peso seco)

Fêmur Tíbia

Mg (mg/g peso seco)

Fêmur Tíbia

0,61 ± 0,03a 0,58 ± 0,04a

0,50 ± 0,03a 0,47 ± 0,04a

0,33 ± 0,02a 0,31 ± 0,02a

0,31 ± 0,03a 0,29 ± 0,02a

191,54 ± 14,70203,47 ± 24,08

1,64 ± 0,18 1,78 ± 0,10

367,1 ± 25,7a 364,0 ± 39,9a

3,38 ± 0,32a 3,02 ± 0,32a

0,63 ± 0,03a 0,61 ± 0,04a

0,52 ± 0,02a 0,50 ± 0,02a

0,35 ± 0,03a 0,33 ± 0,02a

0,30 ± 0,02a 0,28 ± 0,01a

228,45 ± 20,51 231,13 ± 22,13

1,66 ± 0,13 1,66 ± 0,11

437,7 ± 30,6b 427,2 ± 38,8b

3,18 ± 0,23a 3,06 ± 0,21a

0,62 ± 0,07a 0,63 ± 0,07a

0,49 ± 0,06a 0,50 ± 0,05a

0,37 ± 0,02a 0,38 ± 0,03a

0,30 ± 0,03a 0,31 ± 0,03a

226,57 ± 33,59220,74 ± 21,46

1,66 ± 0,35 1,77 ± 0,29

388,5 ± 41,9a 366,0 ± 27,5a

2,85 ± 0,57a 2,94 ± 0,41a

0,64 ± 0,04a 0,64 ± 0,04a

0,51 ± 0,02a 0,51 ± 0,03a

0,40 ± 0,03a 0,40 ± 0,02a

0,32 ± 0,02a 0,32 ± 0,01a

336,17 ± 26,91 220,72 ± 29,99

2,03 ± 0,17 1,59 ± 0,20

431,0 ± 43,0ab 364,3 ± 42,3ab

2,60 ± 0,18a 2,62 ± 0,27a

0,60 ± 0,06a 0,61 ± 0,06a

0,50 ± 0,04a 0,49 ± 0,05a

0,38 ± 0,03a 0,39 ± 0,04a

0,31 ± 0,02a 0,31 ± 0,03a

293,62 ± 31,56290,53 ± 21,67

1,65 ± 0,14 1,68 ± 0,14

475,1 ± 45,7b 466,3 ± 31,7b

2,70 ± 0,20a 2,66 ± 0,21a

1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; 2 As análises de Ca e Mg foram realizadas nos ossos (fêmur e tíbia) esquerdos; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).

94

Figura 30 – Concentração de cálcio no fêmur e na tíbia de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (5% de FOS) e farinha de yacón (5 e 7,5% de FOS). Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias. Valores expressos como média e desvio padrão. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0,05).

Em 1998, OHTA e colaboradores (OHTA et al., 1998c) verificaram, em

ratos submetidos à gastrectomia total, uma densidade e um conteúdo mineral

ósseo, no fêmur e na tíbia, significativamente maiores nos animais que

consumiram uma dieta suplementada com 7,5% de FOS, em relação ao grupo

controle. Este efeito foi corroborado em estudos posteriores (MOROHASHI et

al., 2000; HIRAMA et al., 2003), nos quais a massa óssea e a estrutura do

fêmur de ratos gastrectomizados, submetidos a dietas suplementadas com

0

100

200

300

400

500

600

Fêmur Tíbia

mg

Ca/

g pe

so s

eco.

.

ControleFOS 5%FOS 7,5%

aab

a

b

ab

b

0

100

200

300

400

500

600

Fêmur Tíbia

mg

Ca/

g pe

so s

eco

ControleFOS 5%

a a

b bRaftilose

Farinha de yacón

95

7,5% de FOS, foram avaliadas utilizando-se a densitometria por tomografia

computadorizada e análises histomorfométricas, demonstrando a contribuição

dos FOS na prevenção dos sintomas relacionados à gastrectomia.

CHONAN & WATANUKI (1995) demonstraram que o consumo de 5% de

GOS resultou em um significativo aumento no conteúdo de Ca no fêmur e na

tíbia de ratos sadios alimentados com rações suplementadas com 0,5% de Ca.

Em animais ovariectomizados, o mesmo grupo (CHONAN et al., 1995) verificou

que o conteúdo de Ca na tíbia e o peso das cinzas do fêmur foram

significativamente maiores nos animais que consumiram os GOS em relação ao

animais controle, prevenindo, desta forma, a perda óssea ocasionada pela

ovariectomia.

5.3.5.1. Propriedades mecânicas

No presente estudo, foram avaliadas algumas propriedades mecânicas

(carga máxima, carga máxima no limite elástico, rigidez, resiliência e

tenacidade) no fêmur dos animais de ambos os ensaios. A resistência de um

material composto como o osso pode ser estimada através da determinação da

curva carga X deformação, sendo que a maior parte da carga aplicada ao osso

é suportada pela fase mineral (HOLANDA, 1999; SHIMANO, 2001; SHIMANO et

al., 2002). Por outro lado, mudanças na orientação das fibras de colágeno

presentes na matriz óssea podem reduzir a quantidade de energia absorvida

necessária para causar a fratura no osso (HOLANDA, 1999; BURR, 2002).

Assim, conforme apresentado na Tabela 13, o consumo dos FOS proporcionou

um aumento numérico nos valores de todas as propriedades estudadas,

indicando que tanto o componente orgânico quanto o mineral podem ter sido

afetados (BURR, 2002), ainda que diferenças estatisticamente significativas

(p<0,05) tenham sido visualizadas somente nas variáveis carga máxima e carga

no limite elástico, no 1º ensaio, e carga máxima e rigidez, no 2º ensaio. O

ensaio destrutivo de flexão em três pontos avaliou a resistência na região média

da diáfise do osso, uma região constituída essencialmente por osso cortical.

Assim, estes resultados, associados a uma maior concentração mineral (Tabela 12), indicam que a resistência do fêmur, na região de osso cortical, foi

positivamente afetada pelo consumo dos FOS.

96

Outros trabalhos têm demonstrado resultados similares nos ossos de

ratos, em resposta ao consumo de carboidratos fermentáveis. A absorção

intestinal de Ca, o conteúdo de Ca e a resistência óssea foram avaliadas no

fêmur de ratos alimentados com rações suplementadas com maltitol (GODA et

al., 1998). Os autores observaram que a carga máxima necessária para a

fratura do fêmur, medida através do ensaio de flexão em três pontos, foi 13%

maior nos animais que consumiram o poliol do que a dos animais do grupo

controle. As propriedades mecânicas também foram avaliadas no fêmur de

ratos idosos alimentados com rações suplementadas com 10% de xilitol

(MATTILA et al., 2002). Outro estudo avaliou, em ratos, o efeito do consumo de

difrutose anidrido III, um dissacarídeo obtido a partir da hidrólise da inulina,

associado a exercícios voluntários de corrida, na densidade e na resistência do

fêmur e da tíbia (SHIGA et al., 2003). Os autores observaram que a combinação

do exercício físico com o consumo dos carboidratos fermentáveis aumentou

aditivamente todos os parâmetros estudados.

Tabela 13: Propriedades mecânicas no fêmur de ratos alimentados com rações controle e rações suplementadas com Raftilose e farinha de yacón1

Raftilose Farinha de yacón Determinações2

Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5%

Comprimento (mm)

Diâmetro (mm)

Carga máxima (N)

Carga no limite elástico (N)

Rigidez (N/mm)

Resiliência (Nmm)

Energia absorvida (Nmm)

30,31 ± 0,67a

2,96 ± 0,17a

64,22 ± 6,02a

51,70 ± 8,43a

79,19 ± 8,14a

16,66 ± 4,98a

45,62 ± 12,66a

30,56 ± 0,57a

2,88 ± 0,21a

72,73 ± 8,94b

62,80 ± 9,98b

83,06 ± 7,54a

20,30 ± 8,26a

51,69 ± 14,89a

31,45 ± 1,24a

3,79 ± 0,43a

67,22 ± 8,34a

56,86 ± 6,35a

95,63 ± 3,24a

15,51 ± 2,92a

57,13 ± 22,42a

31,56 ± 0,39a

3,80 ± 0,20a

76,62 ± 8,84ab

59,85 ± 9,46a

109,73 ± 7,99b

15,97 ± 6,12a

58,88 ± 24,00a

31,26 ± 0,69a

3,58 ± 0,21a

83,36 ± 8,66b

68,40 ± 10,97a

112,76 ± 9,03b

18,08 ± 8,95a

59,04 ± 9,47a 1 As propriedades mecânicas foram avaliadas no fêmur direito; 2 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).

97

5.3.5.2. Densitometria óssea

Para o 1º ensaio, a densidade mineral óssea (DMO) foi avaliada, ex vivo,

através da comparação da densidade do osso (fêmur e tíbia) com a densidade

de uma escala de alumínio, permitindo que a equivalência dos ossos, avaliada

em milímetros de alumínio (mmAl), fosse estabelecida. Além deste método, os

ossos dos animais de ambos os ensaios também foram submetidos à análise da

DMO, através da absorção de dupla energia por raios X (DEXA). De acordo

com as Tabelas 14 e 15, os animais que consumiram FOS, em ambos os

ensaios, apresentaram uma maior DMO em comparação aos que consumiram a

ração controle embora, em nenhuma situação avaliada (tipo de osso, região do

osso analisada ou metodologia utilizada), tenham sido observadas diferenças

estatisticamente significativas (p<0,05).

Tabela 14: Densidade mineral óssea (DMO) nas regiões da metáfise ediáfise no fêmur e na tíbia de ratos alimentados com rações controle esuplementadas com Raftilose1

Determinações Controle FOS 5%

DMO (mmAl) Metáfise

Fêmur Tíbia

1,36 ± 0,06a 1,35 ± 0,07a

1,41 ± 0,07a 1,40 ± 0,08a

Diáfise Fêmur Tíbia

1,11 ± 0,09a 1,07 ± 0,08a

1,17 ± 0,05a 1,12 ± 0,04a

1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; 2 As análises foram realizadas utilizando-se a densitometria óssea radiográfica, de acordo com o item4.3.4.1.1.; O tempo de experimento correspondeu a 23 dias; Letras diferentes em uma mesma linha indicam diferenças significativas (p<0,05).

Os efeitos dos frutanos na densidade e no conteúdo mineral ósseo

também têm sido observados em outros estudos, através da utilização de

diferentes protocolos experimentais (OHTA et al., 2002; SCHOLZ-AHRENS et

al., 2002; ROBERFROID et al., 2002; KRUGER et al., 2003; ZAFAR et al.,

2004). OHTA et al. (1996) verificaram um aumento significativo na DMO nas

regiões proximal e distal do fêmur de animais ovariectomizados, suplementados

com rações contendo 5% de FOS. Utilizando ratos sadios e em crescimento,

KRUGER et al. (2003) observaram um aumento significativo (p<0,05) na DMO

98

no fêmur, por um período de 4 semanas, após a ingestão de inulina (GP>23),

embora tal efeito não tenha sido observado após o consumo de oligofrutose

(GP entre 2 e 8). Em outro estudo, a suplementação da dieta com 5% de FOS e

0,5% de Ca não alterou a estrutura do osso trabecular de ratos

ovariectomizados (SCHOLZ-AHRENS & SCHREZENMEIR, 2002) sendo que,

em ratos sadios e em crescimento alimentados com dietas suplementadas com

5 e 10% de inulina e 0,2; 0,5 ou 1% de Ca, a DMO do corpo total foi alterada

somente após 22 semanas de experimento (ROBERFROID et al., 2002).

Tabela 15: Densidade mineral óssea (DMO) no fêmur e na tíbia de ratos alimentados com rações controle e suplementadas com Raftilose (A) e farinha de yacón (B)1

Raftilose Farinha de yacón

Determinações2 Controle FOS 5% Controle FOS 5% FOS 7,5% DMO (g/cm2)

Osso total Fêmur Tíbia

0,0810 ± 0,003a 0,0674 ± 0,003a

0,0854 ± 0,005a

0,0685 ± 0,004a

0,0946 ± 0,006a 0,0761 ± 0,002a

0,0994 ± 0,008a 0,0795 ± 0,002a

0,0971 ± 0,008a 0,0767 ± 0,004a

Região proximal Fêmur Tíbia

0,0833 ± 0,005a 0,0738 ± 0,003a

0,0877 ± 0,008a

0,0763 ± 0,005a

0,0984 ± 0,008a 0,0841 ± 0,004a

0,1023 ± 0,009a 0,0894 ± 0,003a

0,1002 ± 0,008a 0,0862 ± 0,006a

Região distal Fêmur Tíbia

0,0897 ± 0,004a 0,0646 ± 0,003a

0,0931 ± 0,004a

0,0661 ± 0,005a

0,1053 ± 0,007a 0,0747 ± 0,005a

0,1122 ± 0,006a 0,0776 ± 0,003a

0,1096 ±0,009a 0,0747 ± 0,003a

Região média Fêmur Tíbia

0,0618 ± 0,004a 0,0691 ± 0,005a

0,0819 ± 0,013a

0,0606 ± 0,004a

0,0777 ± 0,008a 0,0691 ± 0,005a

0,0819 ± 0,013a 0,0690 ± 0,005a

0,0792 ± 0,008a 0,0667 ± 0,006a

1 Resultados expressos como média e desvio-padrão, n=8; 2 As análises foram realizadas utilizando-se o DEXA; A DMO corresponde à relação entre o conteúdo mineral ósseo e a área óssea; Para o ensaio Raftilose, o tempo de experimento correspondeu a 23 dias e, para o ensaio Farinha de yacón, a 27 dias; Letras diferentes em uma mesma linha, e em ensaios diferentes, indicam diferenças significativas (p<0,05).

Os mecanismos envolvidos no aumento da absorção de Ca e o seu

metabolismo no osso, após a suplementação com carboidratos fermentáveis

(em especial, os frutanos) têm sido amplamente discutidos. ZAFAR et al. (2004)

verificaram, em ratos, que o significativo aumento na absorção intestinal de Ca,

nos animais que consumiram os frutanos, diminuiu o turnover ósseo através da

supressão da reabsorção osteoclástica. KRUGER et al. (2003) observaram, em

ratos em crescimento, uma diminuição significativa na excreção urinária de

fragmentos do colágeno tipo I, um marcador bioquímico de reabsorção óssea,

com o consumo de inulina, após 4 semanas de experimento.

99

Desta forma, os efeitos positivos na absorção intestinal, na retenção

mineral e no comportamento mecânico do osso, observados no presente

estudo, devem ser avaliados em um tempo de experimento maior com a

utilização de outros protocolos experimentais (diferentes estágios do

desenvolvimento do animal, diferentes teores de Ca, FOS e outros tipos de FA

na ração, métodos de avaliação da retenção mineral e da arquitetura do osso,

tipo de osso estudado), com a finalidade de verificar a real extensão do efeito

dos FOS e da contribuição de outros componentes da dieta neste efeito.

Os resultados obtidos também devem ser extendidos em (mais) estudos

envolvendo humanos, com o objetivo de confirmar os efeitos observados nos

animais após o consumo dos FOS. Deste modo, a utilização da farinha de

yacón como ingrediente para o desenvolvimento de alimentos funcionais poderá

ser justificada de forma que o seu consumo passe a contribuir para a redução

do risco de doenças ósseas.

100

6. Conclusões O consumo dos FOS estimulou significativamente a absorção intestinal e o

balanço de cálcio, sendo que tal efeito foi menos pronunciado para o Mg;

O aumento no balanço de cálcio foi refletido em uma maior retenção mineral

nos ossos, confirmado pelas análises por espectrofotometria de absorção

atômica;

Foi observado um efeito positivo nas propriedades mecânicas nos fêmures

dos animais que consumiram FOS, em ambos os ensaios, em relação aos

que consumiram a ração controle;

A ingestão da Raftilose provocou uma ligeira, porém significativa, absorção

intestinal de magnésio, o que não foi observado nos animais que

consumiram a farinha de yacón. Por outro lado, o balanço deste mineral foi

positivamente favorecido nos animais que consumiram a farinha de yacón

(7,5% de FOS);

Não foram observadas diferenças significativas no conteúdo de magnésio

nos ossos, entre os grupos experimentais, em ambos os ensaios;

Não foram observadas diferenças significativas na densidade mineral óssea

entre os grupos, em ambos os ensaios, nas condições experimentais do

presente estudo;

O consumo dos FOS provocou um pronunciado aumento na quantidade e

no comprimento das criptas no ceco, evidenciado pelo maior número de

criptas em bifurcação.

101

7. Referências bibliográficas2

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127

8. Anexos

Anexo 1: Gráfico de controle de qualidade das determinações de Ca total, em base úmida, nas amostras de padrão de referência secundário [rações à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)].

Anexo 2: Gráfico de controle de qualidade das determinações de Ca total, em base seca, nas amostras de padrão de referência secundário [rações à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)].

2500,00

3000,00

3500,00

4000,00

4500,00

5000,00

5500,00

6000,00

0 2 4 6 8 10 12

ensaios

ugC

a/g

média

+1s+2s+3s

-1s

-2s-3s

300035004000450050005500600065007000

0 2 4 6 8 10 12

ensaios

ugC

a/g

média+1s

+2s+3s

-1s

-2s-3s

128

Anexo 3: Gráfico de controle de qualidade das determinações de Mg total, em base úmida, nas amostras de padrão de referência secundário [rações à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)].

Anexo 4: Gráfico de controle de qualidade das determinações de Mg total, em base seca, nas amostras de padrão de referência secundário [rações à base de caseína AIN-93G (REEVES et al., 1993)].

220,00230,00240,00250,00260,00270,00280,00290,00300,00

0 2 4 6 8 10 12 14

ensaios

ugM

g/g

média

+1s

+2s

+3s

-1s

-2s

-3s

240250260270280290300310320330

0 5 10 15ensaios

ugM

g/g

média

+1s

+2s

+3s

-1s

-2s

-3s

129

Anexo 5: Intervalo de linearidade da curva de calibração de Ca, n=16. A curva de calibração foi preparada a partir da solução padrão de Ca, após diluição com HNO3 a 1%, nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 e 5,0 µg/mL.

Anexo 6: Intervalo de linearidade da curva de calibração de Mg, n=16. A curva de Mg foi preparada a partir da solução padrão de nitrato de Mg, nas concentrações de 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,5 e 10,0 µg/mL.

y = 0,045x + 0,0024R2 = 1

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0

ug Ca/mL

abs

y = 0,026x + 0,0022R2 = 0,9999

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0

ug Mg/mL

abs

130

Anexo 7: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias das variáveis nos grupos do 1º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

pH Controle - Raftilose 1,13 0,69 1,56peso da parede do ceco Raftilose - Controle 0,19 0,12 0,27

peso do conteúdo do ceco Raftilose - Controle 1,31 0,96 1,67

EstimativaDiferençaVariável

Anexo 8: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do teor de umidade nas fezes, por período experimental, no 1º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

1 Raftilose - Controle 12,92 7,29 18,552 Raftilose - Controle 14,92 9,06 20,773 Raftilose - Controle 21,20 17,43 24,98

Diferença EstimativaPeríodo

Anexo 9: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias das variáveis nos grupos do 2º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

5% - Controle 0,11 0,06 0,157,5% - Controle 0,20 0,16 0,25

7,5% - 5% 0,09 0,05 0,145% - Controle 0,73 0,41 1,05

7,5% - Controle 0,95 0,63 1,277,5% - 5% 0,22 -0,10 0,54

Variável Diferença Estimativa

peso da parede do ceco

peso do conteúdo do ceco

131

Anexo 10: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do conteúdo urinário de Ca, por período experimental, no 2º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

Controle - 5% 1,01 -113,15 115,17Controle - 7,5% 10,20 -103,95 124,37

5% - 7,5% 9,20 -104,97 123,36Controle - 5% 1,97 -136,29 140,23

7,5% - Controle 47,33 -90,93 185,607,5% - 5% 49,30 -88,96 187,57

5% - Controle 30,14 -73,02 151,29Controle - 7,5% 130,42 18,26 242,58

5% - 7,5% 169,56 57,40 281,713

EstimativaPeríodo Diferença

2

1

Anexo 11: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso seco das fezes, no 2º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

5% - Controle 0,68 0,13 1,237,5% - Controle 1,06 0,51 1,61

7,5% - 5% 0,38 -0,17 0,92

Diferença Estimativa

Anexo 12: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do teor de umidade das fezes, no 2º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

5% - Controle 4,40 2,15 6,657,5% - Controle 7,69 5,44 9,94

7,5% - 5% 3,29 1,04 5,54

Diferença Estimativa

132

Anexo 13: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do teor de Ca e Mg nas fezes, no 2º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

Controle - 5% 30,40 25,42 35,37Controle - 7,5% 34,43 29,46 39,41

7,5% - 5% 4,03 -0,94 9,01Controle - 5% 0,37 0,19 0,54

Controle - 7,5% 0,28 0,10 0,455% - 7,5% 0,08 -0,10 0,26

Cálcio

Magnésio

EstimativaMineral Diferença

Anexo 14: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do balanço de Ca e Mg, no 2º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

5% - Controle 0,19 0,15 0,237,5% - Controle 0,28 0,24 0,32

7,5% - 5% 0,09 0,05 0,135% - Controle 0,06 -0,20 0,13

7,5% - Controle 0,09 0,02 0,177,5% - 5% 0,03 -0,04 0,11

Estimativa

Cálcio

Magnésio

Mineral Diferença

Anexo 15: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da absorção aparente de Ca, no 2º ensaio.

Limite LimiteInferior Superior

5% - Controle 0,18 0,14 0,227,5% - Controle 0,26 0,22 0,30

7,5% - 5% 0,08 0,04 0,12

Diferença Estimativa

133

Anexo 16: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias dos grupos controle e Raftilose.

Variável Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Absorção aparente fracional de Mg Controle - Raftilose -1,14* -1,67 -0,61 Absorção aparente absoluta de Mg Controle - Raftilose -11,14* -14,85 -7,43 Absorção aparente fracional de Ca Controle - Raftilose -52,84* -65,44 -40,23Absorção aparente absoluta de Ca Controle - Raftilose -18,82* -24,21 -13,44L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 17: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias dos grupos controle e Raftilose.

Variável Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Conteúdo cecal de Mg Controle - Raftilose -0,63* -1,02 -0,24 Concentração cecal de Mg Controle - Raftilose 0,10 -0,01 0,21 Conteúdo cecal de Ca Controle - Raftilose -50,39* -76,49 -24,30 Concentração cecal de Ca Controle - Raftilose 4,03 -0,24 8,30 R/S Controle - Raftilose -0,10 -1,53 1,32 Resíduo (g/cit) Controle - Raftilose -2,1376* -2,6400 -1,6353Resíduo (g/ 100 g) Controle - Raftilose -0,9387* -1,1621 -0,7152Sobrenadante (g/cit) Controle - Raftilose -0,5467 -1,1087 0,0153 Sobrenadante (g/ 100 g) Controle - Raftilose -0,2343 -0,4832 0,0146 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 18: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias das propriedades mecânicas no fêmur dos animais do 1º ensaio.

Variável Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Carga máxima Controle - Raftilose -8,51* -16,69 -0,34 Carga máxima elástica Controle - Raftilose -11,10* -21,01 -1,19 Rigidez Controle - Raftilose -3,87 -12,28 4,54 Resiliência Controle - Raftilose -3,64 -10,96 3,67 Energia absorvida Controle - Raftilose -6,07 -20,89 8,75 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

134

Anexo 19: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do conteúdo cecal de Mg, do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Controle - 5% -0,14 -0,72 0,43

Controle – 7,5% -0,49 -1,07 0,09 5% - 7,5% -0,35 -0,92 0,23

L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 20: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da concentração cecal de Mg, do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% 0,11 -0,04 0,25 Controle – 7,5% 0,03 -0,12 0,17

5% - 7,5% -0,08 -0,22 0,07 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 21: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do conteúdo cecal de Ca, do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -2,41 -16,91 12,10 Controle – 7,5% -5,05 -19,55 9,46

5% - 7,5% -2,64 -17,15 11,87 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 22: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da concentração cecal de Ca, do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.* Controle - 5% 6,88* 2,08 11,67

Controle – 7,5% 7,08* 2,28 11,87 5% - 7,5% 0,20 -4,60 4,99

L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

135

Anexo 23: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da relação R/S, do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% 0,89 -0,19 1,97 Controle – 7,5% 0,99 -0,09 2,07

5% - 7,5% 0,10 -0,98 1,18 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 24: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso do resíduo (g/cit), do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -0,6207* -1,0522 -0,1893 Controle – 7,5% -0,7487* -1,1801 -0,3172

5% - 7,5% -0,1279 -0,5594 0,3035 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 25: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso do resíduo (g/100 g de animal), do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -0,3388* -0,5006 -0,1769 Controle – 7,5% -0,4340* -0,5959 -0,2722

5% - 7,5% -0,0953 -0,2571 0,0666 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 26: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso do sobrenadante (g/cit), do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -0,6981* -1,2132 -0,1829 Controle – 7,5% -0,9014* -1,4166 -0,3862

5% - 7,5% -0,2034 -0,7185 0,3118 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

136

Anexo 27: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do peso do sobrenadante (g/100 g de animal), do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -0,3852* -0,6093 -0,1612 Controle – 7,5% -0,5065* -0,7305 -0,2824

5% - 7,5% -0,1213 -0,3453 0,1028 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 28: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do índice de bifurcação de criptas.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -0,54* -0,94 -0,14 Controle – 7,5% -0,87* -1,27 -0,47

5% - 7,5% -0,34 -0,73 0,06 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 29: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da porcentagem do índice de bifurcação de criptas.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -14,27 -32,66 4,11 Controle – 7,5% -31,20* -49,58 -12,81

5% - 7,5% -16,92 -35,31 1,46 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 30: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da comprimento das criptas.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -0,44 -1,38 0,51 Controle – 7,5% -1,16* -2,10 -0,21

5% - 7,5% -0,72 -1,66 0,23 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

137

Anexo 31: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias do número total de criptas.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -1,00 -2,49 0,49 Controle – 7,5% -3,25* -4,74 -1,76

5% - 7,5% -2,25* -3,74 -0,76 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 32: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da carga máxima medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -8,2235 -18,8017 2,3547 Controle – 7,5% -15,0349* -25,6131 -4,4566

5% - 7,5% -6,8114 -17,3896 3,7669 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 33: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da carga máxima elástica medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -1,9426 -13,0448 9,1596 Controle – 7,5% -10,1919 -21,2941 0,9103

5% - 7,5% -8,2493 -19,3515 2,8530 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 34: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da rigidez medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -12,3383* -21,5692 -3,1073 Controle – 7,5% -15,7849* -25,0158 -6,5540

5% - 7,5% -3,4466 -12,6775 5,7843 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

138

Anexo 35: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da resiliência medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -0,26 -8,19 7,66 Controle – 7,5% -2,29 -10,22 5,63

5% - 7,5% -2,02 -9,95 5,90 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.

Anexo 36: Estimativas pontuais e intervalos de confiança a 95% para as diferenças entre as médias da energia absorvida medida no fêmur dos animais do 2º ensaio.

Diferença Estimativa L. I.* L. S.*

Controle - 5% -1,53 -24,71 21,65 Controle – 7,5% -1,75 -24,93 21,43

5% - 7,5% -0,22 -23,40 22,96 L.I. Limite Inferior. L.S. Limite Superior. *Significativo a 95%.