EXTRAO E PURIFICAO DOS ACIDOS NUCLEICOS Retirada de DNA de tecidos, urina, fezes, pelo, sangue e etc. Extrai sangue procedimento qumico- isolamento do DNA eletroforese conhecimento sobre o DNA Isolar ou extrair DNA significa separa-lo das outras estruturas celulares. No entanto, mais correto dizer que se isola cido nucleico, pois se tem DNA e RNA juntos escolhendo-se o que ser utilizado Deve-se separar tambm as protenas que compe os cromossomos (DNA+ protenas) So destrudos todos os complexos de membranas

Consideraes gerais o o o o o o o o o Natureza do cido nucleico: DNA ou RNA, eucarioto ou procarioto, mitocondrial ou cloroplasto, plasmidial, fgico, viral Quantidade e grau de pureza Escolha da fonte Natureza do tecido Armazenamento do tecido tecido retirado morre Mtodos para verificar o grau de pureza Estratgia para o processo de purificao manter a integridade da amostra Mtodos: congelamento das amostras e uso do etanol 95% - agentes que preservam a integridade fsica do DNA SED tampo de EDTA

Estratgias: 1. Desintegrao do tecido separar as clulas 2. Homogeneizao e extrao solubilizao dos cidos nucleicos 3. Processos de purificao I. Fracionamento celular II. Extrao com fenol III. Precipitao ultracentrifugao, processos cromatogrficos troca inica, filtrao em gel Detergentes: Destri quimicamente protenas e lipdeos Desintegra a bicamada lipdica e inicia o processo de denaturao de protenas Utilizam-se principalmente SDS regio hidroflica e regio hidrofbica Agem dissociando as protenas dos cidos nucleicos dissolvendo as lipdeos proteases Aumenta a eficincia do detergente Proteinase K alta efetividade, baixa especificidade/afinidade (extrada da bactria Tritirachium lbum) Outras: proteinase E

Inibidores de nucleases Isolamento de DNA ou RNA do extrato Desoxirribunucleases(DNAases) destri DNA Ribonuclease (RNAases) destri RNA

Extrao com fenol Solvente orgnico que se adere a protena, interagindo com ela e tornando-a mais pesada Centrifugao faz com que a protena desnaturada se separe (fica mais pesada, precipita) Cria um complexo feno l- protena desnaturada Clorofrmio retira resqucio de fenol que ficaram na amostra O material esta purificado, ou seja, tem-se apenas cido nucleico (DNA ou RNA) Precipitao de cidos nucleicos Utiliza-se acetato de amnia para diminuir a repulso eletrosttica das molculas de DNA Utilizao de lcool, que muda as condies hidrodinmicas Precipitao das molculas de DNA