13.pdf

163

BIOLOGIA MOLECULAR COMO INSTRUMENTAL MDICO

Captulo13

Cap. 13

H pouca dvida que a PCR (polymerasechain reaction; reao em cadeia de polimerase) uma das tcnicas que mais revolucionou amedicina nos ltimos tempos, tornando a medi-cina molecular um verdadeiro ramo da clnicamdica. A maior parte deste captulo ser devo-tada a esta ferramenta, embora outras tcnicasindispensveis sero abordadas.

PCR

Esta tcnica possui grande utilidade porque:

Permite que o cido nuclico-alvo seja espe-cificamente selecionado.

Amplifica por milhares de vezes o alvo sele-cionado.

realizada em poucas horas, levando a re-sultados rpidos.

A especificidade da PCR obtida atravs douso de um par de primers (iniciadores) compos-to de oligonucleotdeos que, por terem um com-primento mnimo ( 21 bases) de uma seqnciade bases nica, seguramente anelaro no DNA-alvo somente em um dado ponto, visto que ascondies de temperatura e fora inica da so-luo estejam apropriadas.

A amplificao da PCR exponencial e obtida pelo emprego de polimerases de DNAtermoestveis que, a partir do par de primers,copiam as regies do DNA-alvo mltiplas vezes

Biologia Molecular comoInstrumental Mdico

numa srie de ciclos. Estes princpios so ilus-trados na Fig. 13.1.

Supondo que se deseje amplificar uma re-gio especfica de DNA com comprimento de400bp no genoma de uma nica clula humana.Comea-se com duas cpias iniciais pois a clu-la diplide e realizamos 40 ciclos de reao; ofator de amplificao 240 = 1,1 1012 e, assu-mindo um eficincia de 80%, a massa do produ-to da PCR produzida ser de 0,38 m g de DNA, aqual facilmente visualizada em um gel de aga-rose corado com brometo de etdio.

Usando as condies-padro de PCR, man-tendo as concentraes de Mg2+, desoxinucleo-tdeos, DNA-alvo e primers dentro de limitestpicos, a maioria das PCRs funciona bem. Naausncia de produto final, ou se mais de um pro-duto for gerado, os seguintes fatores devem serconsiderados:

O desenho dos primers e suas temperaturasde anelamento; atualmente programas decomputador auxiliam na escolha dos primers.

O uso de polimerases termoestveis diferen-tes.

A concentrao de Mg2+ e a fora inica nareao.

Anelamento no-especfico ocorrendo du-rante o preparo da reao, que pode ser evi-tado usando manobras como polimerasesrecombinantes termoativadas, anticorpos

Martin R. Whittle

164

VOL. 1 BASES MOLECULARES DA BIOLOGIA, DA GENTICA E DA FARMACOLOGIA

Cap. 13

contra a polimerase, preparo no frio, seqes-trantes de Mg2+, as quais travam a enzimanesta fase inativa antes da amplificao.

A presena de inibidores da polimerase nareao, especialmente se a fonte do DNA-alvo estiver suja.

Na PCR, o cido nuclico-alvo o DNA. Asfontes de DNA so vrias; no caso de DNA ge-nmico humano, elas atualmente incluem: Leuccitos obtidos de uma amostra de san-

gue. Clulas bucais obtidas usando uma escova

e/ou saliva. Bipsia, especialmente no caso de tumor.

Tecido em bloco parafinado.

Blastmeros ou glbulos polares isolados noscasos de fertilizao in vitro.

Amostras forenses tal como osso cadavri-co, esperma, ponta de cigarro usado.

Lembramos que o DNA mitocondrial(mtDNA) tambm estudado, tanto em funodas doenas causadas por mutaes que ocor-rem nos genes mitocondriais, quanto pelas infe-rncias feitas em relao ao vnculo genticomatrilinear.

Atualmente possvel purificar DNA de pra-ticamente qualquer fonte biolgica, e o mesmodever estar ntegro e limpo para uso na biolo-gia molecular. Todavia, atualmente simplesutilizar RNA como objeto de estudo, transfor-mando-lo em cDNA por transcrio reversa ediretamente usando este alvo, em um procedi-mento denominado RT-PCR. Isso obrigatrionas anlises de vrus de RNA, como HCV e HIV;em outros casos existe a opo entre usar os ti-pos de cido nuclico. Alm de requerer um pas-so enzimtico adicional, o manuseio de RNA mais difcil e necessrio trabalhar com amos-tras clnicas frescas. Por outro lado, toda ou amaioria da parte codificadora do gene exami-nada numa s PCR. Mesmo assim, comum quemutaes em um gene levem a transcritos maisinstveis do que o normal, que refletir na habili-dade da RT-PCR amplificar esses alelos (convmlembrar que estimado que 15% das mutaesclinicamente relevantes ocorrem nos ntrons eoutras regies no-codificadoras dos genes).

Um outro ponto pertinente se refere s ob-servaes de transcritos ilegtimos: foi a PCR que

Fig. 13.1 Amplificao exponencial de DNA-alvo. Otrecho a ser amplificado especificamente definido por umpar de primers, cada um sendo incorporado no produto dePCR resultante. As duas fitas de DNA original so estendi-das alm do primer oposto, mas, aps alguns ciclos, o pro-duto da reao predomina. H sempre um excesso deprimers em relao o DNA-alvo. Note que na Figura estmostrado uma molcula de DNA-alvo dupla fita, enquantonuma reao normal, haveria milhares de molculas-alvo.

DNA-alvo

Ciclo 1desnaturar e

anelar primers

Estender a partirdos primers

Ciclo 2desnaturar e

anelar primers


Ciclo 3desnaturar e

anelar primers


165


Captulo13

Cap. 13

possibilitou a descoberta destas molculas. Aconcluso que, na maioria dos tecidos, h ex-presso gnica da maioria dos genes, emboraem nveis baixssimos. A relevncia deste fen-meno para fisiologia humana permanece des-conhecida. Porm, esses transcritos fornecem umacesso anlise dos seus respectivos genes, in-dependentemente do tecido estudado. Em algunscasos esses transcritos ilegtimos foram amplifi-cados por RT-PCR para se obter informaessobre mutaes nos genes em questo. Todaviano foi estabelecido se esses transcritos fielmenterefletem a situao dos genes mutados.

O produto da PCR pode ser submetido avrios procedimentos e usado em diversas ma-neiras na medicina molecular, como mostradona Fig. 13.2.

Confirmao da Presena/Ausncia doProduto da PCR

O produto da PCR normalmente possui umcomprimento esperado que visualizado aps

amplificao atravs de eletroforese em gel. Apresena da banda no gel indica a existncia doDNA-alvo na amostra clnica original, enquantosua ausncia confirma a no-existncia do DNA-alvo. As seguintes situaes exemplificam a gran-de utilidade deste procedimento na microbiologiaclnica e na oncologia:

O diagnstico de tuberculose confirmadopela cultura da bactria responsvel, Myco-bacterium tuberculose, que normalmente levade quatro a seis semanas para crescer emcultura in vitro. A PCR permite que este pas-so seja realizado em poucas horas.

O diagnstico de encefalite devido ao vrusherpes simplex deve ser feito o mais rpidopossvel para poder tratar com os antiviraise evitar a possvel morte do paciente. Antesda PCR, esse diagnstico era de difcil reali-zao, tanto clinicamente quanto nos labo-ratrios.

A deteco e o rastreamento de alguns tiposde tumores pelos genes, os quais so por eles

Fig. 13.2 Os usos da PCR. As fontes de DNA-alvo para PCR so diversas, bem como as manipulaes posteriores doproduto resultante. Se desoxinucleotdeos marcados (com radioistopo ou com grupos fluorescentes) forem usados durantea amplificao, o produto resultante tambm ficar marcado. RT significa transcrio reversa. As outras siglas so defini-das no texto que segue.

RNA(mRNA de tecido,

RNA de vrus)

Purificar Purifi

car, R

T

PCR

Presena ouausncia do

produto

Comprimentodo produto

Uso do produtocomo sonda

Anlise do produto usando: digesto ASO hybridization extenso de primer OLA e LCR ensaio de nuclease 5 SSCP anlise de heterodplex DGGE PTT seqenciamento direto

DNA(genmico, mitocondrial,

produto de PCR)

166


Cap. 13

expressos. O fentipo tumoral associadocom a ativao e desativao anormal demuitos genes. Melanoma e adenocarcinomada prstata so cnceres nas quais so ati-vados genes que normalmente permanecemsilenciosos que ento produzem transcritose produtos proticos em quantidade aumen-tada e portanto detectvel; esses so a tiro-sinase e a PSA (prostate-specific antigen),respectivamente. Esses transcritos podem serdetectados no sangue aps RT-PCR e usadostanto para confirmar o diagnstico, quantopara o seguimento dos pacientes aps a ci-rurgia e/ou radioterapia realizadas para ex-tirpar o tumor primrio.

RT-PCR usada rotineiramente para ampli-ficar o produto de fuso entre o gene ABL eparte do gene BCR quando h a transloca-o cromossmica t(9:22) em leucemiamielide crnica. Desta maneira uma clulaleucmica pode ser detectada entre 106 c-lulas normais da medula ssea. Esta meto-dologia til no acompanhamento depacientes que fizeram transplante da medu-la ssea para detectar uma recorrncia dasclulas neoplsticas ps-operatria.

A exfoliao de clulas tumorais em urina(no caso de cncer de bexiga) e em fezes(no caso de cncer do pncreas e do colointestinal) pode ser acompanhada por PCR.Nessas situaes, o nmero de clulas tu-morais representa uma frao pequena detodas as clulas presentes e a PCR realiza-da de um modo para seletivamente enrique-cer o DNA mutante. Para isso, primers soutilizados para que introduzam um stio derestrio quando uma seqncia normal am-plificada, mas no quando a seqncia mu-tante; a base deste princpio discutida noitem Digesto com enzima de restrio. ApsPCR, os amplicons so tratados com arespectiva enzima de restrio; um enrique-cimento de duas ordens de magnitude con-seguido dessa maneira. Os produtos de PCRsobrando so novamente submetidos a umasegunda amplificao para aumentar o sinal.Obviamente, esta abordagem pressupe co-nhecimento da mutao em questo, e foiaplicada a mutaes no gene K-ras em cn-ceres do trato digestivo.

A utilizao de rigorosos controles em to-dos os passos laboratoriais imprescindvel neste

tipo de ensaio, a fim de que sejam evitados re-sultados falso-positivos ou falso-negativos. Nolaboratrio, vrios cuidados devem ser adota-dos para evitar a contaminao das PCRs: nomnimo, o espao onde as amostras so recebi-das e preparadas deve ser fisicamente separadodaquele onde a amplificao feita. O uso deponteiras que no permite que um aerossol dasoluo que est sendo manipulado entre nospipetadores, em si, recomendado. Alm disso, possvel utilizar dUTP em vez de dTTP na PCR,cujo produto resultante pode ser clonado e ana-lisado normalmente. Porm, DNA de fita sim-ples ou dupla contendo esta base degradadopela enzima uracil N-glicosilase (UNG) e ospolinucleotdeos resultantes no conseguem maisparticipar da amplificao. Sendo assim, UNGest presente na fase pr-PCR para remover qual-quer produto sobrando de amplificaes ante-riores; ao iniciar a PCR, UNG desativada peloaumento na temperatura e a PCR prossegue nor-malmente.

Uma variante mais moderna deste ensaio con-siste no monitoramento em tempo real do apareci-mento do produto da PCR durante a amplificao,dispensando sua eletroforese posterior. Se um dosprimers for fluorescente, o produto resultante tam-bm ser fluorescente e o aumento desta fluores-cncia pode ser monitorado durante a ciclagem.Este princpio ser discutido posteriormente noitem Monitoramento do aparecimento do produtoda PCR em tempo real.

Uma extenso deste ensaio leva PCR quan-titativa que se utiliza da natureza exponencial daamplificao, tal que o grau da amplificao sejaproporcional quantidade do DNA-alvo presentena amostra inicial. Usando DNA-alvo controlede quantidade conhecida, possvel construiruma curva-padro que permite inferir a quanti-dade de DNA-alvo nas amostras clnicas. Estetipo de ensaio usado rotineiramente na quan-tificao do vrus HIV no sangue dos pacientesinfectados por ele. A PCR monitorada em tem-po real facilita ainda mais esta quantificao,como descrito no item Monitoramento do apa-recimento do produto da PCR em tempo real.

A visualizao da presena ou ausncia doproduto da PCR tambm usada para revelar aexistncia de mutaes especficas na DNA-alvo.O princpio desta metodologia se baseia no fatode que, se a ltima base do primer no seu extre-

167


Captulo13

Cap. 13

mo 3 no estiver pareada com a base comple-mentar no DNA-alvo, no ocorrer extenso pelapolimerase. Portanto pode-se utilizar um pri-mer cuja sua ltima base 3 hibridiza com umabase do alvo, sofrendo uma mutao pontual co-nhecida. Neste caso, a amplificao no prosse-guir, como ilustrado na Fig. 13.3.

costume usar dois pares de primers nes-te tipo de ensaio para aumentar a certeza doresultado: um par que permite a amplificaoda seqncia normal, mas no da mutao, eum outro em que um dos primers anela na mu-tao, permitindo sua amplificao, mas noa amplificao da seqncia normal. Na prti-ca, um dos primers dos dois pares o mesmo.Existem kits comerciais que utilizam esta es-tratgia, denominada ARMS (amplification re-fractory mutation system) ou PASA (PCR

amplification of specific alleles), para detec-tar uma srie de mutaes conhecidas em ge-nes causadores de doenas genticas maisfreqentes.

Nestes kits, vrios produtos de PCR so ne-cessrios para realizar esta genotipagem, e co-mum amplificar mais de um produto na mesmaPCR. Nesta PCR multiplex, existem exemplosem que 15 produtos diferentes so amplificadossimultaneamente no mesmo tubo, para serem se-parados por eletroforese posteriormente. Noobstante, montar uma PCR multiplex dessa com-plexidade requer bastante tentativa e erro, pois,alm de todas as temperaturas de anelamentodos primers precisarem ser semelhantes, a con-centrao de cada primer tem que ser alteradaindividualmente quando um novo par de primersfor introduzido na reao.

Fig. 13.3 PCR alelo-especfico. O painel superior mostra a competncia da DNA polimerase estender a partir doprimer quando suas bases 3 forem parcialmente pareadas. O painel inferior mostra como isto aproveitado para seletiva-mente amplificar, em PCR alelo-especfico, regies contendo variantes usando trs primers diferentes. Primer 1 comum nasduas reaes. Primer 2 anela completamente na seqncia normal mas no na seqncia variante pela sua base 3, enquantoo inverso o caso para o primer 3. Aps PCR, os produtos so visualisados em gel aps eletroforese. Vrios alvos podem seramplificados simultaneamente em PCR multiplex.

Pareamentocompleto Extenso mxima

Extenso mnima

Nenhuma extenso

Extenso razovel

ltima base 3no-pareada

5 3

ltimas duas bases 3no-pareadas

Penltima base 3no-pareada

1

1

1

1

2 2

3 3

REAO PARA O ALELO VARIANTE

Base normal

Base normal

Base variante

Base variante

Amplificao por PCR

Amplificao por PCR

No h amplificao

No h amplificao

REAO PARA O ALELONORMAL

168


Cap. 13

Anlise do Produto da PCR pelo seuComprimento

H situaes em que pacientes possuem lo-cos no seu DNA genmico que so menores oumaiores do que normal. Alm disso, todos indiv-duos possuem locos polimrficos onde o polimor-fismo devido a uma srie de repeties de bases,exemplificado pelos microssatlites (STRs: shorttandem repeats) e os minissatlites (VNTRs: va-riable number of tandem repeats); veja o Captulo11. Estes locos so analisveis usando PCR paraamplificar os locos em questo e medir o compri-mento dos produtos resultantes.

Mutaes causadas por pequenas deleesou inseres no DNA so detectveis por PCR.A mutao DF508 no gene CFTR compe umadeleo de 3bp e a principal mutao causa-dora da doena gentica recessiva fibrose csti-ca, presente aproximadamente em 70% dospacientes no norte da Europa, e em 40% dosafetados no Brasil. O ensaio mais usado paraidentificar essa leso envolve uma PCR da re-gio genmica contendo a mutao que normal-mente resulta em um produto de 98bp. Napresena da deleo o produto possui 95bp. Asduas possveis bandas so visualizadas aps ele-troforese em gel de poliacrilamida, onde sempre aconselhvel incluir um indivduo heterozigo-to para interpretar os resultados com maior se-gurana.

H vrias doenas neurolgicas e neuro-musculares causadas pela expanso de trincasde bases dentro dos genes e quando a expansoultrapassa um determinado limite, a funo dogene perdida (Tabela 13.1).

A PCR a ferramenta ideal para investigaressas doenas, bastando somente fazer uma am-plificao da regio genmica contendo as trin-

cas e observando se o tamanho do produto re-sultante anormalmente maior que esperado.Porm, a expanso de CGG no gene FMR1 exem-plifica bem algumas das limitaes da PCR e al-gumas das solues usadas para contorn-las.

Indivduos normais possuem em mdia 29repeties de CGG no gene FMR1, enquantopacientes com a sndrome podem ter milharesdessas repeties e, nestes casos, o alvo no amplificvel. Mesmo assim, regies contendo umalto contedo de G e C como essas so difceisde amplificar devido tendncia das fitas de DNAse reanelarem nas temperaturas usadas. Para re-produtivelmente amplificar esses alelos (CGG)15a (CGG)300, as seguintes modificaes so in-troduzidas na PCR:

Assegurar a desnaturao das fitas de DNA,aquecendo-as a 95C durante 10 minutos einiciando a amplificao neste ponto.

Utilizar DMSO 50% na reao (outros com-postos incluem betaine e trimetil cloreto deamnia).

Utilizar o desoxinucleotdeo modificado 7-deaza-2-dGTP na razo para dGTP de0,75:0,25, em vez de 100% dGTP.

Utilizar Pfu polimerase em vez da conven-cional Taq polimerase.

Isso mostra que as polimerases so capazesde introduzir bases modificadas durante a sntesede DNA. Desta maneira possvel gerar produ-tos da PCR marcados com grupos moleculares,os quais permitem que os produtos sejam usa-dos em outras situaes, como descrito posteri-ormente.

A amplificao de locos polimrficos se tor-nou rotineira na identificao humana e animal,bem como na investigao de vnculo gentico

Tabela 13.1Doenas Causadas pela Expanso de Trincas de Bases

Doena Gene e sua Localizao Trinca queCromossmica Expande

Sndrome de X-frgil FMR1: Xq27 CGG

Doena de Huntington Huntingtina: 4p16 CAG

Ataxia espinho-cerebelar tipo I SCA1: 6p22 CAG

Distrofia miotnica Miotonina: 19q13 CTG

169


Captulo13

Cap. 13

nessas espcies. As STRs so os locos genticosmais usados atualmente. Estes locos tambm soextremamente importantes para o mapeamentode genes defeituosos nas famlias que os trans-mitem, bem como nos projetos-genoma, ondemapas dos genomas so gerados atravs de es-tudos de ligao gentica. Alm disso, em algunstipos de cnceres (por exemplo, cncer no-poli-pose do colo intestinal) esses locos demonstraminstabilidade no tumor, o que j indica a presen-a de genes defeituosos (hMLH1, hMSH2), queso responsveis pelo reparo de DNA na clula.Quando ocorre perda de heterozigose no tumor,esses locos so ideais para expor esse fato, com-parando os alelos de alguns locos de uma regiocromossmica no tumor e em tecido normal.Existem milhares desses locos de STRs ao longodo genoma humano, que podem ser emprega-dos desta maneira.

Nestes casos, os alelos dos locos so comu-mente amplificados usando um par de primersonde um deles marcado com um grupo fluo-rescente no seu trmino 5. Os alelos amplifica-dos so fluorescentes e so fracionados duranteeletroforese em gis desnaturantes de poliacrili-maida. Os alelos podem ser visualizados por ins-trumentos que varrem o gel para detectar afluorescncia durante ou aps a eletroforese.Com a disponibilidade de quatro grupos fluo-rescentes diferentes, que foram desenvolvidospara os seqenciadores automticos de DNA, possvel visualizar alelos de locos genticos dis-tintos, embora com tamanhos iguais na mesmaposio do gel. Por esse motivo, esses mesmosseqenciadores de DNA so usados para ler osgentipos dos indivduos estudados.

Quando os alelos a serem distinguidos dife-rem por duas ou trs bases em tamanho entreum e os outros, necessrio ficar atento paraum fenmeno que pode atrapalhar a leitura cor-reta dos tamanhos: comum a polimerase acres-centar um nucleotdeo adicional (quase sempreum A) no trmino 3 do produto a ser geradoembora no exista esta base no alvo. No exis-tem regras claras que permitem a predio destaocorrncia, mas possvel minimiz-la:

Prolongando o ltimo passo de extenso a72C para 30-60 minutos.

Acoplando uma molcula especial no trmi-no 5 do outro primer do par para impediresta adio.

Anlise do Produto da PCR por OutrasMetodologias

Crescentemente um dos objetivos na medi-cina molecular a caracterizao de mutaesou polimorfismos no DNA genmico (ou emmRNA) e sua correlao com prognsticos. Isso realizado em trs nveis: No nvel populacional com objetivo de en-

contrar mutaes ou polimorfismos paraefeitos de screening gentico, para preveniras doenas genticas mais comuns.

No nvel de famlias transmitindo doenashereditrias, para definir a mutao respon-svel e prestar aconselhamento gentico, bemcomo o diagnstico pr-natal ou mesmo pr-implantao, como discutido no item PCRno diagnstico gentico pr-implantao(DGP), de doenas monognicas.

No nvel de tumores onde as mutaes nosoncogenes ou genes supressores de tumor socaracterizadas. Essa uma rea promissora,dado que os primeiros estudos, realizadoscom o gene p53 e cncer de mama, tm de-monstrado que existe correlaes entre a po-sio no gene de algumas mutaes e ocomportamento do tumor nos pacientes; issoinflui no tratamento que as pacientes deve-ro receber, por exemplo, se radioterapia ouquimoterapia mais indicada. Alm disso, osestudos moleculares complementam as an-lises histopatolgicas do tecido tumoral; nocaso da p53, que quantificada por imuno-histologia, os estudos moleculares forneceminformaes adicionais quando o primeirotem resultado negativo.

A anlise de produto de PCR para esse fimtem se desenvolvido muito nos ltimos tempos,tal que existem vrias opes. No entanto, im-portante distinguir entre metodologias que bus-cam alteraes definidas, que ento fazem odiagnstico, e aqueles que varrem o produto bus-cando alteraes desconhecidas; nessa ltima, oproduto ter de ser analisado mais para caracte-rizar a alterao especificamente. Em virtude domaior volume de exames efetuado, ensaios di-agnsticos devero:

Ser rpidos e baratos. Ser realizadas por automao. Ser 100% eficazes. Evitar o uso de radioistopos e reagentes

txicos.

170


Cap. 13

Mtodos Diagnsticos

DIGESTO COM ENZIMA DE RESTRIO

Se um polimorfismo ou mutao altera oDNA-alvo e cria ou destri um stio de restri-o, essa alterao pode ser detectada usando aenzima de restrio em questo. Portanto esteensaio consiste em amplificar por PCR a regiodo DNA-alvo que contm a alterao, digerin-do-a com a enzima e analisando os fragmentosresultantes por eletroforese em gel. bastantedesejvel que o alvo amplificado inclua um stiode restrio constante que sirva como controleda ao da enzima, se no um outro tipo de con-trole ter de ser usado. Uma outra desvantagemdesta abordagem que, freqentemente, a alte-rao no modifica stios de restrio e, por essemotivo, as estratgias da ARMS (vide supra) ede ARIP (vide infra) so mais versteis.

AN`LISE DE RESTRIO INTRODUZIDA PORPRIMER (ARIP)

Aqui uma base que no pareia incorpora-da no primer, sendo situada prximo ao stio damutao. A regio incluindo a mutao ampli-ficada por PCR e o produto resultante digeri-do por uma enzima de restrio apropriada. Acombinao da alterao no primer e daquela nostio da mutao cria um novo stio de restrio,como mostrado na Fig. 13.4.

Esta abordagem pode ser utilizada para criarum novo stio de restrio, tanto no alelo nor-mal quanto no alelo mutado. Em alguns casosno possvel criar um novo stio de restrioperto da mutao. Alm disso, uma outra des-vantagem que a diferena em tamanho entre oproduto de PCR no digerido e digerido pe-quena, sendo em torno do tamanho do primer e,por esse motivo, o tamanho do produto ter deser inferior a 300bp.

HIBRIDIZAO COM OLIGONUCLEOTDEOSALELO-ESPECFICOS (ASO: ALLELE SPECIFICOLIGONUCLEOTIDE HYBRIDIZATION OUDOT-BLOT)

O produto de PCR fixado numa membranae hibridizado com oligonucleotdeos marcadosque anelaro somente se a seqncia comple-mentar estiver presente nas condies da hibri-

dizao. Oligonucleotdeos que detectam a se-qncia normal e a seqncia mutante so usa-dos. Para cada mutao diferente umahibridizao nova necessria. A dificuldade ex-perimental acertar as condies de hibridiza-o e lavagem para cada oligonucleotdeo, porm uma metodologia til para procurar um nme-ro pequeno de mutaes definidas em um gran-de nmero de amostras.

No sistema inverso (reverse dot blot) quan-do o produto de PCR marcado usado comosonda para hibridizar com oligonucleotdeoscontendo as seqncias de interesse fixadosnuma membrana, vrias mutaes ou polimor-fismos conhecidos podem ser buscados simul-taneamente a partir de um produto de PCR. Isso utilizado para procurar as mutaes mais co-muns causadoras de fibrose cstica e para realizara tipagem dos alelos no sistema HLA humano.Um exemplo mostrado na Fig. 13.5. Obvia-mente o produto de PCR deve hibridar com to-dos os oligonucleotdeos com igual eficincianas mesmas condies, a fim de se obter umresultado confivel.

EXTENSO DO PRIMER POR NUCLEOTDEO NICO

Um primer anelado em um produto dePCR, adjacente posio de uma mutao oupolimorfismo conhecida: a DNA polimerase utilizada para acrescentar um nucleotdeo adi-cional no trmino 3 do primer, dependendo dapresena ou no da alterao. O nucleotdeo adi-cionado marcado com radioatividade ou comfluorescncia e, portanto, a reao pode ser quan-tificada em termos da incorporao da marca-o, no necessitando eletroforese em gel.Normalmente duas reaes paralelas so feitas:uma com nucleotdeo marcado que seja com-plementar base normal, e outra onde ele sejacomplementar base presente na alterao. Ho-mozigotos so identificados por incorporao emsomente uma das reaes, enquanto heterozigo-tos tm incorporao nas duas reaes. con-veniente realizar os passos em fase slida: oproduto da PCR contendo a regio de interesse acoplado, via uma das fitas que possui o grupobiotina, a uma superfcie de estreptavidina, co-mumente em placas de microtitulao. A fitacomplementar removida e o primer a ser es-tendido anelado. O nucleotdeo marcado in-troduzido junto com a DNA polimerase para

171


Captulo13

Cap. 13Fig. 13.4 Anlise de restrio introduzida por primer. Um dos primers usados na PCR contm uma base alterada emrelao a seqncia do DNA-alvo complementar. O produto resultante da amplificao da seqncia variante possui umstio de restrio, enquanto aquele resultante da seqncia normal no possui este stio. Esta a abordagem inicial descritapara detectar o polimorfismo G20210A no gene da protrombina que leva a efeitos clnicos.

Fig. 13.5 Reverse dot-blot. Cinco mutaes no gene CFTR causadoras da fibrose cstica so detectadas neste exemplo.Produtos de PCR diferentes e marcados (normalmente com radioistopo ou com biotina), correspondendo s posies dasmutaes no gene, so gerados e hibridizados aos oligonucleotdeos fixados na membrana. Para assegurar a hibridizaohomognea de todos os produtos com todos os oligonucleotdeos, necessrio utilizar tetrametil cloreto de amnia (TMAC)na soluo. Os oligonucleotdeos so fixados na membrana atravs de caudas de poli-dT para que eles sejam maisdisponveis para anelamento. comum ter que variar a quantidade de cada oligonucleotdeo fixado na membrana para seobter sinais de hibridizao uniformes no fim do procedimento. Este sistema um precursor dos chips de hibridizaodescritos no item Chips e seqenciamento por hibridizao.

SEQNCIA NORMAL SEQNCIA VARIANTE

Amplificar por PCR

No hdigesto

Digerir com enzimade restrio

Hind III

Produtos dedigesto

5 53 3

Oligonucleotdeo mutante

Oligonucleotdeo normal

D

F508

G551D

N1303K

G542X

R117H

Oligonucleotdeos fixados em membrana de nilonHibridizados comprodutos de PCR

Normal

Heterozigoto compostoN1303K/ D F508

Heterozigotonormal/G542X

Homozigoto D F508

172


Cap. 13

efetuar a extenso, sendo tal a incorporaomedida posteriormente. Estes passos so diagra-mados na Fig. 13.6. Esta tcnica permite a de-teco de alelos que esto presentes comfreqncias menores que 50%; como exemplo,foi utilizado com sucesso para detectar mutaes(no cdon 12 de K-ras) presentes em tumoresonde clulas mutantes ocorrem numa frao de0.05% em relao s clulas normais.

OLA (OLIGONUCLEOTIDE LIGATION ASSAY:ENSAIO DE LIGAO DEOLIGONUCLEOTDEO) E LCR (LIGASE CHAINREACTION: REAO EM CADEIA DE LIGASE)

O princpio do OLA tem por base a obser-vao de que, quando dois oligonucleotdeosesto anelados na mesma fita de DNA e perfei-tamente justapostos, eles podem ser ligados pelaenzima DNA-ligase. Uma base no-pareada najuno entre os dois oligonucleotdeos sufi-ciente para impedir essa ligao. Na prtica, oensaio utiliza dois oligonucleotdeos marcadose mede a formao de uma molcula nicacriada pela ao da ligase. As duas molculashibridizam em um produto de PCR produzidopara fornecer a regio de interesse. Como ilus-trado num exemplo da Fig. 13.7, um dos oligo-nucleotdeos marcado com um fluorforo noseu trmino 3 enquanto o outro possui no bio-tina seu extremo 5.

Se os dois oligonucleotdeos forem ligadospela ligase, uma nica molcula fluorescente gerada, a qual pode ser captada por uma su-perfcie de estreptavidina (em um poo de umaplaca de microtitulao). Caso contrrio, o oli-gonucleotdeo fluorescente removido por la-vagem. Quando dois fluorforos diferentes sousados, um acoplado no oligonucleotdeo com-plementar seqncia normal e o outro com-plementar seqncia mutante, somente umareao feita e um controle interno da reaoest presente. Sendo assim, OLA uma meto-dologia ideal para lidar com grandes volumesde testes com sistemas automatizados.

LCR representa uma modificao do OLA.Aqui h amplificao dos oligonucleotdeos li-gados devido a ciclos repetidos de desnatura-o, anelamento dos oligonucleotdeos e ligaousando uma DNA ligase termoestvel. Ao con-trrio da PCR, no h sntese nova de DNA.

Na LCR, seis oligonucleotdeos so necess-rios: dois para cada fita-alvo e mais dois quedetectam a seqncia variante, como mostradona Fig. 13.8.

O aumento do produto da LCR exponen-cial, como na PCR. Portanto, na LCR h am-plificao e anlise combinadas em um passo,enquanto na PCR seguido de OLA, dois passosso necessrios. Alm disso, LCR exibe algu-mas dificuldades especficas: a principal a li-gao alvo-independente que pode servir comoalvo nos ciclos seguintes, resultando em umresultado falso-positivo. Este fenmeno de-terminado mais pela concentrao dos oligo-nucleotdeos presentes.

SEQENCIAMENTO DO PRODUTO DE PCR

Veja item Seqenciamento de DNA na me-dicina nuclear.

MONITORAMENTO DO APARECIMENTO DOPRODUTO DA PCR EM TEMPO REAL

Duas metodologias semelhantes so usadas:

Ensaio de Nuclease 5

A atividade 5fi 3 exonuclease da Taq poli-merase aproveitada para remover um oligonu-cleotdeo especial, ou sonda, situado entre os doisprimers de amplificao. A sonda marcada comdois grupos fluorescentes diferentes: um deles(quencher) oculta a fluorescncia do segundo(reporter) pela proximidade entre ambos. A son-da tambm possui seu trmino 3 fosforilado, oque impede que ela atua como primer. Quandoos dois grupos na sonda so separados pela ao5 fi 3 exonuclease da polimerase, a fluorescn-cia do reporter desmascarada, o que reflete aamplificao ocorrida especificamente do pro-duto em questo, como mostra a Fig. 13.9.

A fluorescncia estimulada (por laser) emedida durante a amplificao, necessitandoum termociclador modificado para tal. O gran-de impacto dessa metodologia na medicinamolecular ser na rea de PCR quantitativa, eo nmero de molculas de DNA-alvo no in-cio da amplificao poder ser determinadosem a realizao de outros procedimentos ps-

173


Captulo13

Cap. 13

PCR e que, portanto, idealmente apropriadopara automao. Alm disso, a disponibilida-de de vrios grupos fluorescentes permite arealizao de PCR multiplex e, dessa forma, apossibilidade de incluir controles internos.Porm essa metodologia pode ser adaptadapara deteco de mutaes conhecidas, ba-seando-se nas tcnicas descritas aqui, comoARMS, por exemplo. Ou seja, no seria ne-cessrio realizar eletroforese aps a PCR, e osdois possveis alelos numa amostra podem serdetectados simultaneamente com o uso de fluo-rforos diferentes.

FARIS MOLECULARES (MOLECULAR BEACONS)

Este ensaio semelhante ao anterior em-bora ele no utilize a atividade exonuclease dapolimerase; ele requer um termociclador modi-ficado. As sondas nesse caso tambm possuem

um grupo quencher e reporter em cada extremodo oligonucleotdeo, mas este, no incio do en-saio, dobrado sobre si, formando um lao comuma haste, aproximando os dois grupos que,conseqentemente, no emitem fluorescncia.Durante a PCR, a sonda abre-se e hibridiza-seespecificamente com o produto que est sendogerado, e passa a emitir fluorescncia propor-cional ao nmero de amplicons presentes, comoapresentado na Fig. 13.10. Se no houver am-plicons suficientes, os faris moleculares reas-sumem sua conformao original rapidamentequando a temperatura diminui durante a cicla-gem, at o ciclo seguinte. Esta tcnica foi maisaplicada a genotipagem em tempo real em vezda quantificao da amplificao da PCR. O usosimultneo de vrios fluorforos numa PCR mul-tiplex permite a genotipagem de diferentes va-riantes ao mesmo tempo, de uma maneira sujeita automatizao.

Fig. 13.6 Extenso do primer por nucleotdeo nico. Esta metodologia tambm denominada minisseqenciamento.O produto de PCR biotinilado transferido para uma placa de microtitulao cujos poos possuem uma camada deestreptavidina para captar a molcula amplificada. Esta molcula desnaturada usando hidrxido de sdio e a fita nopresa removida por lavagem. Um terceiro primer anela na fita restante e Taq polimerase usada para acrescentar umanica base se existir pareamento da ltima base 3 do primer. Lavagem feita para remover o nucleotdeo no-incorpora-do e o primer desligado usando hidrxido de sdio e quantificado. Para cada variante sendo analisada, duas extensescorrespondentes so realizadas.

Amplificao por PCRusando um primer biotinilado

Estenso pela polimeraseincorporando nucleotdeo marcado

Captao por estreptavidina

Remoo de uma fita

Anelamento do terceiro primer

Desligamento equantificaodo primer marcado

A

A

174


Cap. 13Fig. 13.7 OLA (oligonucleotide ligation assay). Os oligonucleotdeos marcados so anelados no produto de PCR. Ooligonucleotdeo do lado direito possui um fluorforo no seu trmino 3 e comum para as duas situaes mostradas; esteoligonucleotdeo fosforilado no seu trmino 5. O oligonucleotdeo do lado esquerdo, que biotinilado no seu extremo5, ou anela completamente com o alvo, ou anela incompletamente, tendo seu trmino 3 no pareado. Na primeirasituao, a enzima DNA ligase capaz de ligar de maneira covalente (usando ATP como substrato) as duas molculas,criando uma nova molcula, enquanto na segunda isto no ocorrer. Aps desnaturao, a nova molcula capturadanuma superfcie de estreptavidina e quantificada atravs do fluorforo presente nela.

Fig. 13.8 LCR (ligase chain reaction). Os oligonucleotdeos assinalados por asteriscos so aqueles em comum, enquan-to os quatro restantes detectam a seqncia normal e a seqncia variante. Somente quando um par de oligonucleotdeosestiver completamente anelados ao alvo que ocorrer a ligao cclica com aumento exponencial do produto da LCR.

OLIGONUCLEOTDEO NOPAREADO NO TRMINO 3

OLIGONUCLEOTDEO PAREADO

Usar DNA ligase

Capturar com estreptavidina

Sinal ausente Sinal presenteBiotinaFluorforo

OLIGONUCLEOTDEOSCOMPLETAMENTE ANELADOS

OLIGONUCLEOTDEOSINCOMPLETAMENTE ANELADOS

Ligar e repetir25 a 30 vezes

Anelamentoao alvo

desnaturado

Ligasetermoestvel

Desnaturar e anelaroligonucleotdeos

175


Captulo13

Cap. 13

simplicidade de implantao. Porm, ela possuiduas desvantagens importantes: o produto da PCRno deve ultrapassar uns 250bp, e a sua sensibili-dade em torno de 50-95% para detectar as alte-raes comumente vistas no DNA genmico. Oproduto da PCR em questo ter de ser seqen-ciado posteriormente para identificar a alterao.

HA (HETERODUPLEX ANALYSIS)

Tambm uma tcnica de varredura para de-tectar alteraes desconhecidas que existem emheterozigose nas regies estudadas. Aqui, o prin-cpio da tcnica se baseia no fato de que fitas sim-ples de DNA com seqncias diferentes sere-anelam aps desnaturao, e fitas duplas deDNA hbridas formadas migram com velocida-des anmalas durante eletroforese em gis no-desnaturantes, como ilustrado na Fig. 13.12.

Apesar de sua simplicidade, estudos recen-tes tm demonstrado que esta metodologia superior SSCP em detectar alteraes desco-nhecidas no DNA-alvo, com uma sensibilidadede 80% a 100%. O produto da PCR deve ficarinferior a 1.000bp. O produto da PCR em ques-to ter de ser seqenciado posteriormente paradefinir a alterao.

DGGE (GENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS)

uma tcnica de varredura para detectar al-teraes no DNA-alvo, com uma sensibilidadede quase 100% para produtos de PCR de tama-nho entre 100 e 500bp. A tcnica permite a se-parao de fragmentos de DNA que se diferempor um par de bases entre si. Esta separaoocorre por causa das diferenas nas temperatu-ras de separao das fitas das molculas nor-mais e mutantes. Quando esses fragmentosmigram no gel por eletroforese, eles encontramuma concentrao crescente de desnaturante(uria, formamida); ao serem expostos a um n-vel crtico de desnaturante, a fitas comeam a seseparar, ento reduzindo significativamente suamobilidade. O ponto no qual a mobilidade dimi-nui ser diferente para a molcula normal e amutante, como indicado na Fig. 13.13.

O comportamento de molculas de DNA emgis DGGE pode ser modelado em computado-res e, portanto, a identificao de mutaes emum dado fragmento pode ser prevista com con-

Fig. 13.9 Ensaio de nuclease 5. Na PCR est presenteuma sonda composta de um oligonucleotdeo contendo umfluorforo R (reporter) no seu trmino 5 e um grupo apa-gador Q (quencher). Nesta situao o grupo Q impede queo fluorforo R emita fluorescncia. Esta sonda anela entreos dois primers de amplificao em uma das duas fitas deDNA e deslocada e digerida pela ao 5fi 3 exonucle-oltica da Taq polimerase que se aproxima. O fluorforopassa a fluorescer quando for afastado do grupo Q, refle-tindo o progresso da amplificao.

Mtodos de Varredura

SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATIONANALYSIS)

Ao contrrio das metodologias anteriores, estano pressupe a existncia de uma alterao es-pecfica no produto amplificado e, portanto, umatcnica de varredura para detectar alteraes des-conhecidas que existem em heterozigose nas re-gies estudadas. O princpio da tcnica se baseiano fato de que fitas simples de DNA com seqn-cias diferentes enovelam de maneiras diferentes emigram com velocidades distintas em condiesapropriadas de eletroforese. Os dois produtos daPCR, um deles contendo uma alterao, so des-naturados e submetidos eletroforese em gisno-desnaturantes, como ilustrado na Fig. 13.11.Essa metodologia bastante usada devido sua

Digesto da sonda

Extenso a partirdo primer pelaTaq polimerase

Deslocamento dafita da sonda

Clivagem da sonda

176


Cap. 13

fiana. No entanto, por esse mesmo motivo, ascondies so diferentes para cada produto sen-do estudado, o que impede uma implantaopadronizada no laboratrio clnico. Alteraesem DNA homodplex e heterodplex so detec-tadas nessa metodologia. Porm, alguns equi-pamentos especializados so necessrios pararealizar este procedimento. O produto da PCRem questo ter de ser seqenciado posterior-mente para determinar a alterao.

CLIVAGEM DE MISMATCH POR RIBONUCLEASE

Um local numa fita dupla de RNARNA ouRNADNA onde existe uma base ou bases no-pareadas suscetvel a clivagem pela enzimaRNase A. Isso forma a base de um ensaio paradetectar variantes no produto de PCR quandohibridizado com uma fita de RNA complemen-tar, com seqncia normal, marcada radioativa-mente ou com fluorescncia. Os produtos daclivagem so ento fracionados por eletrofore-se, dando uma indicao da posio da discre-

pncia no produto de PCR. Mutaes em mRNApodem ser identificadas usando o mesmo prin-cpio quando hibridizados com um produto dePCR normal. Produtos de PCR tendo kilobasesem tamanho podem ser examinados desta ma-neira e a taxa de deteco em torno de 75%.As desvantagens incluem a dificuldade em pre-parar o RNA marcado e a manipulao da amos-tra aps tratamento com RNase. O produto daPCR em questo ter de ser seqenciado poste-riormente para estabelecer a alterao.

CLIVAGEM QUMICA DE MISMATCH

Este mtodo depende do uso de dois com-postos qumicos em duas amostras do hetero-duplex formado entre o DNA mutante e o DNAnormal. Um deles, hidroxilamino, reage combases C no-pareadas, enquanto o outro, tetr-xido de smio, reage com bases T no-parea-das. As duas fitas do DNA normal devem estarpresentes para fornecer as bases A e G que for-mam as molculas heteroduplex quando houver

Fig. 13.10 Faris moleculares. O painel superior mostra como o farol molecular passa a emitir fluorescncia quando elehibridiza com o DNA-alvo que o produto de PCR sendo gerado. Quando fechado, o fluorforo R (reporter) est adjacenteao grupo apagador Q (quencher) e no fluoresce, mas ao abrir para hibridizar, os dois grupos se afastam, permitindo queo fluorforo irradie. Durante a PCR, o farol molecular no digerido pela ao 5fi 3 exonucleoltica da polimerase; istose deve ao fato que a molcula construda de ribonucleotdeos ou porque, assim que a polimerase comea a deslocar ofarol molecular, ele cai do alvo, escapando da digesto. O painel inferior mostra dois faris moleculares diferentes, cadaum possuindo um fluorforo distinto e que reconhecem seqncias-alvo diferentes, por exemplo, uma normal e umavariante. Durante a PCR fcil distinguir estes dois alelos claramente e os trs possveis gentipos resultantes: dois homo-zigotos e um heterozigoto.

1,00,80,60,40,2

DNA-alvo Farol molecular Hbrido

Fluo

resc

ncia

Ciclos trmicos

1,00,80,60,40,2

1,00,80,60,40,2

010 20 30 40

0 10 20 30 40 10 20 30 400

177


Captulo13

Cap. 13

bases T e C, devido a mutaes nas fitas de DNAmutadas. Por esse motivo, a chance de detectaras mutaes dobrada. A piperadina utilizadapara clivar o DNA nas posies das bases modi-ficadas, como mostrado na Fig. 13.14. A PCR usada para gerar os fragmentos de DNA emquesto; neste passo, se um dos primers foremmarcados (com fluorescncia, por exemplo), osprodutos da clivagem sero visualizados apseletroforese e uma boa estimativa da localizaoda mutao ser obtida. O produto da PCR emquesto ter de ser seqenciado posteriormentepara identificar a alterao. As vantagens dessemtodo incluem uma taxa de deteco de alte-raes na seqncia de 100% e a possibilidadede examinar comprimentos de kilobases de DNA.Por outro lado, o mtodo requer o emprego decompostos nocivos e uma srie de manipulaesdas amostras.

TESTE DE PROTENA TRUNCADA (TPT)

Alguns genes precisam sofrer mutaes se-veras, como delees, inseres e mutaes

Fig. 13.11 SSCP: Embora os dois amplicons mostradosdiferem em somente uma base, as quatro fitas simples pos-suem seqncias distintas. Em gis no-desnaturantes asquatro molculas assumem conformaes diferentes e, por-tanto, migram com velocidades diferentes durante a eletro-forese. As conformaes adotadas dependem de vriosfatores no gel, tal que a mobilidade de um dado fragmentomuda de um gel para outro mesmo em condies aparente-mente idnticas. A eletroforese comumente realizada a 4Cpara acentuar as diferenas nas conformaes.

Fig. 13.12 HA (heteroduplex analysis). Os dois ampli-cons mostrados diferem em somente uma base. Quandoeles so desnaturados e permitidos a reanelar, quatro mo-lculas so geradas em propores iguais: dois homod-plex como existia inicialmente e dois heterodplex. Osheterodplex so molculas possuindo uma dobra ou umafrouxamento no ponto onde as seqncias diferem. Du-rante eletroforese em gis no-desnaturantes as duas mo-lculas homodplex migram com velocidades iguais; as duasmolculas heterodplex migram mais lentamente, ou comouma banda s, ou como duas. Essa eletroforese normal-mente realizada em gis de MDE que uma acrilamidamodificada.

nonsense, para resultar em um fentipo anor-mal; os transcritos desses genes mutados sotraduzidos para gerar protenas menores queas normais e que provavelmente sero no-fun-cionais. Mutaes pontuais do tipo missense noclaramente levam a conseqncias deletrias epodem at ser consideradas como polimorfis-mos. Genes de importncia clnica que aparen-temente precisam sofrer tais mutaes severasincluem: BRCA1 e BRCA2, envolvidos em cn-cer de mama e de ovrio hereditrio; APC, en-volvido em cncer de clon hereditrio; NF1,mutado em neurofibromatose; e DMD, que cau-sa distrofia muscular de Duchenne quando mu-tado. O TPT foi desenvolvido para detectaressas mutaes severas diretamente. Ele con-siste em amplificar a regio de interesse porPCR, mas um dos primers usados contm um

Amplicon comseqncia normal

Eletroforese em gelno-desnaturantepara separar as

quatro fitas simples

Amplicon comseqncia variante

Desnaturare esfriar

Amplicon comseqncia varianteAmplicon comseqncia normal

Desnaturare re-anelar

OU

E

Eletroforese em gelno-desnaturante para

separar as quatromolculas (dois

homodplex e doisheterodplex)

178


Cap. 13

Fig. 13.13 DGGE. O painel superior mostra o que acontece quando uma amostra de DNA dupla fita aplicadalinearmente ao longo do incio de gel e submetido a eletroforese num gel que possui um gradiente horizontal de desnatu-rante. As duas fitas permanecem aneladas e migram rapidamente onde h pouco desnaturante, comparadas com fitasdesnaturadas que se encontram em regies de alta concentrao de desnaturante. Na fita dupla, a desnaturao comeaem domnios distintos que refletem a seqncia local; esses domnios crescem medida que a desnaturao progride. Umadiferena de uma base entre dois fragmentos de DNA altera o ponto de desnaturao desses domnios. O painel inferiormostra a migrao diferencial de duas molculas homodplex e duas heterodplex durante a eletroforese. Quando opaciente for sabidamente heterozigoto, uma quantidade suficiente de molculas heterodplex gerada na PCR durante aciclagem para ser visto na DGGE; porm se o paciente for homozigoto para a variante, molculas heterodplex tm que serformadas misturando produtos de PCR do paciente com aqueles normais.

promotor da RNA polimerase T7 e um sinal deiniciao de traduo eucaritico incorporado,como mostra a Fig. 13.15.

O produto da PCR submetido a um siste-ma comercial de transcrio/traduo in vitrojunto com 35S-metionina; dessa maneira a pro-

tena produzida isotopicamente marcada e podeser visualizada aps eletroforese em gis de SDS-poliacrilamida. Protenas prematuramente trun-cadas devido a uma mutao severa, que geramcdons de parada anormais, migraro mais ra-pidamente durante eletroforese, e o tamanho

Amostra aplicada linearmente aqui

Gradiente de desnaturante

Fitasdesnaturadas

Fitasparcialmentedesnaturadas

Fitaspermanecem

aneladas

MximoMnimo

Elet

rofo

rese

Mximo

Mnimo

Elet

rofo

rese

Amostrasaplicadas

Fitasheterodplex

Fitashomodplexnormais evariantesG

radi

ente

de

desn

atur

ante

179


Captulo13

Cap. 13

Fig. 13.14 Clivagem qumica de mismatch: A qumica desta tcnica tem por base o mtodo Maxam-Gilbert paraseqenciar DNA. Na reao, as duas fitas de DNA contendo a seqncia normal (colorido) so marcados (com radioisto-po ou grupo fluorescente) e usados como sonda. Este DNA anelado com a amostra de DNA sendo testado para gerarmolculas heterodplex. No painel superior uma variante G fi T detectada pela ao de hidroxilamina (H) e de tetrxidode smio (OT) em somente uma das molculas heterodplex. No painel inferior uma variante C fi T detectada pela aode H e de OT nas duas molculas heterodplex. Porm, importante perceber que o ensaio visualiza somente as fitasmarcadas, aps sua eletroforese em gel. Todas as possveis mudanas de bases so detectveis utilizando este mtodo.

observado da molcula encurtada fornece um in-dcio da posio da mutao no DNA original,embora a mutao responsvel pode estar longeno lado 5 desse cdon. A vantagem deste m-todo em relao alguns outros que segmentosbastante compridos de um gene (maiores que1kb) podem ser analisados em um ensaio. Poresse motivo conveniente que o cDNA, produzi-do por RT-PCR, seja analisado, uma vez que elecontm vrios trechos contguos de seqnciacodificadora (o tamanho mediano de xons hu-manos 200bp). Para assegurar sucesso no casode produtos de PCR compridos, gerados a par-tir de RNA, talvez seja necessrio realizar duasamplificaes por PCR consecutivas. O produtoda PCR em questo ter de ser seqenciado pos-teriormente para definir a alterao.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Nessa tcnica, utiliza-se uma concentraoalta de somente um primer especfico, e a PCR realizada em condies de baixa temperatura ealta concentrao de Taq polimerase. Isso faz

com que produtos de PCR sejam gerados aps ahibridizao do primer no alvo complementar,bem como em locais no-especficos. Quandofeito com DNA genmico, o resultado uma sriede produtos randmicos, porm reprodutveis,que so visualizados em gel aps eletroforese,denominados impresso digital. Na rea mdi-ca essa tcnica tem sido empregada no rastrea-mento de cepas de bactrias e protozorios,especialmente no contexto do surgimento decepas resistentes a antibiticos no ambiente hos-pitalar; cepas diferentes levam a padres de ban-das distintas quando submetidas a RAPD. Estatcnica foi adaptada para detectar mudanasnuma nica base, em um trecho de um dado genehumano: o padro pode mudar dramaticamentenesses casos, mas a adaptao ter de ser maisestudada a fim de definir a taxa de deteco demutaes em qualquer segmento do DNA-alvo.

PCR no Diagnstico Gentico Pr-Implantao(DGP) de Doenas Monognicas

A PCR e tcnicas de fertilizao in vitro tmsido combinadas para oferecer uma alternativa

180


Cap. 13

ao diagnstico pr-natal tradicional que utilizaamniocentese ou anlise do vilo corial. O objeti-vo do DGP o de transferir, aps fertilizao,somente zigotos sadios para o tero, em casosem que o casal sabidamente possui mutaescausadoras de uma doena gentica. H duasabordagens, como ilustrado na Fig. 13.16.

Uma envolve a retirada e anlise por PCR(para as mutaes em questo) de um ou doisblastmeros do embrio composto de oito clu-las; se for afetado, o embrio no ser transferi-do para o tero, caso contrrio ser implantado.Na segunda abordagem, o primeiro e o segundoglbulo polar so removidos dos ocitos e anali-sados seqencialmente por PCR; somente zigo-tos que no possuem mutaes maternas sotransferidos (possveis mutaes paternas noso procuradas nesta situao). A anlise do pro-duto da PCR segue os mtodos j descritos aqui;porm DGP representa um caso extremo do usodessa ferramenta, porque o DNA-alvo est pre-sente em, no mximo, duas cpias no incio daPCR. Questes de contaminao so priorit-rias, e o DNA do pessoal do laboratrio no podeser permitido a ser amplificado em vez do DNA

da amostra. Alm disso, um dos problemas maisimportantes na anlise de blastmeros a falhade amplificao alelo-especfico, que j levou aodiagnstico errado nesse campo. Todos essescasos ocorreram com heterozigotos compostos,e, provavelmente, somente um dos alelos mu-tantes foi amplificado. Esse fenmeno ocorreentre 7% e 30% das anlises, dependendo daclula a ser estudada. A anlise seqencial dosdois glbulos polares evita esse problema. Por-tanto, na anlise de blastmeros, necessrioamplificar outros locos que sejam polimrficos(normalmente STRs) simultaneamente, paraexcluir a falha de amplificao alelo-especfico.Todavia para parcialmente contornar a dificul-dade de analisar o DNA de uma nica clula, possvel efetuar uma pr-amplificao do geno-ma inteiro utilizando uma coleo de primersmenos especficos, em um procedimento deno-minado PEP (primer extension preamplification).Aqui, primers de 15-mer so usados que socompostos de todas as possveis combinaes debases; ou seja, h primers que contm 415 se-qncias. Estudos preliminares mostram que essamanobra auxilia a anlise, embora no seja usa-da na rotina clnica atualmente.

Fig. 13.15 Teste de protena truncada. Neste ensaio, o DNA-alvo recomendado cDNA que composto de um trechocontguo de DNA que codifica para um produto protico; xons nicos so, na maioria, pequenos demais para seremusados nesta metodologia. A PCR realizada usando um primer (para a fita forward) que contm a seqncia de promotorda T7 RNA polimerase no seu lado 5; na parte 3 gene-especfico, o cdon ATG de iniciao deve estar em fase com afase de leitura da seqncia codificadora. Convm lembrar que, se o DNA-alvo for cDNA gerado a partir de mRNA portranscrio reversa, um alelo mutante poder no ser detectado por causa de instabilidade do mRNA.

181


Captulo13

Cap. 13

Novidades na PCR

Duas sero mencionadas: a primeira refere-se a novos termocicladores que esto disponveispara alguns setores, notavelmente na rea mili-tar. Atualmente, possvel realizar os ciclos de am-plificao muito rapidamente, com um volume dereao reduzido e com mudanas de temperaturaque podem ser transmitidas quase que instantane-amente. Dessa maneira, amplificaes so com-pletadas em menos de 10 minutos, em vez dos 120minutos tpicos. As amplificaes podem seracompanhadas em tempo real, como descrito. Ostermocicladores disponveis so levados ao campopara confirmar o diagnstico de doenas infeccio-sas in loco.

A segunda est mais distante, mas j expe-rimental e se refere PCR realizada em chipsminiaturizados com volumes de reao menorque 5ml. Tanto a amplificao quanto a detec-o dos produtos resultantes podem ser feitasnesses dispositivos.

SEQENCIAMENTO DE DNA NA MEDICINAMOLECULAR

At recentemente, seqenciamento era con-siderado oneroso e difcil demais para ser rea-lizado rotineiramente na medicina molecular.Todavia, com a disponibilidade de seqencia-dores automticos mais baratos, de kits que per-mitem seqenciar DNA preparado de vriasfontes com alta reprodutibilidade e confiabili-dade sem o uso de radioistopos e sem a obri-gatoriedade de clonar o DNA a ser seqenciado,e de programas que facilitam a fcil manipula-o das seqncias geradas, esta tcnica tor-nou-se indispensvel nesta rea. Alm disso, oseqenciamento considerado o mtodo maisconfivel de deteco de mutaes, esperadase inesperadas, no DNA-alvo. Qualquer varian-te encontrada usando os mtodos de varreduraj descritos aqui, ter de ser seqenciada paraidentificar a origem da variao.

Normalmente na medicina molecular oDNA-alvo de interesse especificamente ampli-ficado por PCR e seqenciado diretamente, ob-viando a necessidade de clonar o alvo. Isso quaseelimina dois problemas vistos no passo da clo-nagem, erros de seqncia causados pela Taqpolimerase e aquele da heterozigose, alm dadificuldade relativa de praticar a clonagem. A Taq

polimerase incorpora bases erroneamente coma freqncia mdia de uma em cada 2.000 (ou-tras DNA-polimerases termoestveis, por exem-plo, Pfu polimerase, so mais fiis ao realizar ascpias). Se um produto da amplificao quecontiver um desses erros for clonado, todos osplasmdeos provenientes dessa molcula teroesse erro e, ao serem seqenciados, levaro concluso de que h uma mutao ou polimor-fismo. Quando o produto de PCR seqencia-do diretamente, esse tipo de erro artificialminoritrio escondido pela maioria das mol-culas-cpia normais, como se fossem uma ni-ca molcula.

Se o DNA genmico for amplificado, e, nocaso de DNA humano, existem duas cpias doalvo, se faz necessrio que o seqenciamentodetecte variaes (por exemplo, mutaes pon-tuais) presentes em heterozigose. Nos pontos deheterozigose, o sinal de cada base no seqencia-mento cai pela metade e sobreposto pelo sinaldado pela base da outra fita, como demonstradona Fig. 13.17.

At h pouco tempo, seqenciamentos dealta qualidade e difceis de se realizar eram ne-cessrios para garantir a deteco destes hete-rozigotos, mas atualmente isso se tornou maissimples e reprodutvel. Porm, quando os pro-dutos so clonados antes de serem seqencia-dos, possvel que somente um dos alelos sejaseqenciado, pelas mesmas razes discutidasacima. Por esse motivo, nessas situaes ne-cessrio seqenciar no mnimo seis clones inde-pendentes para minimizar a chance de noobservao de heterozigotos.

Embora o seqenciamento direto de produ-tos de PCR tenha se tornado quase que rotinei-ro na medicina molecular, h algumas situaesque se faz necessrio a obrigatoriedade do seqen-ciamento de produtos clonados para detectarvariantes. Essas so aquelas em que a seqnciavariante sabidamente existir em minoria com-parada com a seqncia normal, por exemploem um tumor pequeno, ou quando clulas tu-morais esto sendo procuradas em urina ou fe-zes. A purificao e o seqenciamento do DNAtotal nesses casos no revelaro mutaes, queestaro sub-representadas e escondidas na se-qncia normal. Na PCR os dois alelos seroamplificados com igual eficincia correspondente razo das clulas normais para aquelas cance-

182


Cap. 13

Fig. 13.16 Diagnstico gentico pr-implantao. Anlise de blastmero mostrada no painel superior no caso deuma doena hereditria recessiva. As quatro possveis fertilizaes entre espermatozides e ocitos so consideradas, emque N e M significam os alelos normais e mutantes, respectivamente. Na etapa de oito clulas, uma bipsia do embrio feita para remover um ou dois dos blastmeros; isto no afeta o futuro desenvolvimento do embrio. O DNA do blastmero submetido PCR para determinar a presena ou no dos dois alelos; a ausncia do alelo normal implica que o blastme-ro homozigoto para o alelo mutante e que o embrio no deveria ser implantado para evitar o desenvolvimento de umindivduo afetado. O painel inferior considera a anlise (por PCR) dos glbulos polares, que so formados durante ameiose do ocito, em que a mulher heterozigoto para a doena. MI e MII so a primeira e a segunda diviso meitica,respectivamente do ocito. Neste caso existem trs possibilidades em relao ao primeiro glbulo polar: se recombinaono ocorrer, ele ser homozigoto normal ou homozigoto afetado. Se recombinao ocorrer, o primeiro glbulo polar serheterozigoto. Se o primeiro glbulo polar for homozigoto para o alelo normal, o ocito possui duas cpias do alelo mutantee o futuro embrio certamente ter este alelo se fertilizao acontecer. No caso inverso, o resultado oposto ser obtido. Nocaso de recombinao, o segundo glbulo polar ter de ser analisado para predizer qual alelo materno estar presente noocito maduro. As vantagens da anlise dos glbulos polares sobre a dos blastmeros incluem o fato que somente materialextra-embrinico manipulado e que problemas de mosaicismo em embries so evitados. Por outro lado, esta abordagemno aplicvel nas doenas autossmicas dominantes em que o pai afetado, e na identificao de sexo, em que acontribuio paterna tem que ser conhecida.

Aps anlise doblastmero, no

implantar o embrio

Aps anlise doblastmero,

implantar o embrioNo-afetado

Afetado

183


Captulo13

Cap. 13

rosas; quando a amostra tiver

184


Cap. 13

NASBA

O alvo inicial DNA ou RNA, o que j limi-ta sua aplicabilidade. A esse, anelado um pri-mer hbrido (primer 1), contendo um promotorde RNA polimerase no seu trmino 5, e entoum cDNA gerado usando transcriptase re-versa (RT). A enzima RNase H usada paradigerir a fita de RNA nessa fita dplex deRNADNA, liberando uma fita simples de DNA.Essa fita simples copiada por RT atravs deum segundo primer (primer 2) que tambmcontm um promotor de RNA polimerase noseu trmino 5, gerando uma fita dupla deDNADNA. Esses passos representam a faseinicial no-cclica, como mostra a Fig. 13.18.

A segunda fase cclica durante a qual a am-plificao ocorre: cada fita do dplex DNADNAserve como molde para T7 RNA polimerase (aterceira enzima usada nessa metodologia), quegera transcritos mltiplos de RNA. Cada um des-ses, por sua vez, so transcritos pela RT a partirdo primer 2, gerando mais cpias de DNA na for-ma de fitas dplex de RNADNA. Aps a aode RNase H, a RT atua novamente, a partir doprimer 1, encerrando o ciclo. Todos os passos soefetuados a uma temperatura constante. Diferenteda PCR, cada ciclo de amplificao por transcri-o produz 40-100 cpias de RNA: uma amplifi-cao maior que um milho de vezes do produtode RNA atingida dentro de uma hora. Esse pro-duto detectado aps hibridizao com duas son-das (oligonucleotdeos) especficas que atuamsimultaneamente: uma sonda contm biotina paracaptar o produto, enquanto a outra marcadacom um composto que inicia uma reao eletro-quimoluminescente, atravs da qual medido ograu da reao. Essa tecnologia tem sido aplica-da quantificao de RNA de HIV1 em pacien-tes infectados.

TMA

semelhante a NASBA, mas difere na me-dida que a RT especial por possuir atividadede RNase H inerente. O mtodo de deteco dosamplicons de RNA tambm diferente. Essametodologia usada para detectar Mycobacte-rium tuberculose.

BDNA

Somente o sinal amplificado nessa meto-dologia, o que significa que resultados falso-po-

sitivos por contaminao local so mais raros.Sondas especficas que possuem estruturas pa-recidas com pentes (fornecidos pelo manufatu-rador) ligam-se no cido nuclico-alvo. Cadapente fornece stios para a hibridizao de at3.000 sondas acopladas a uma enzima, comofosfatase alcalina. O consumo de um substratoquimoluminescente pela enzima gera um sinalproporcional ao nmero de molculas-alvo pre-sentes, como diagramado na Fig. 13.19. Essesistema usado na quantificao de DNA deHBV e RNA de HCV e HIV.

HIBRIDIZAO

A maioria dos mtodos descritos aqui, usa-dos na rea clnica para caracterizar variantesmoleculares em cido nuclico, refere-se a peque-nas mudanas, sejam mutaes pontuais ou pe-quenas inseres, delees ou rearranjos. importante lembrar que defeitos no DNA incluemleses drsticas, exemplificadas pela perda ou gan-ho de um cromossomo inteiro. Essas aberraescromossmicas ocorrem em 0,6% dos nascimen-tos vivos humanos e em at 5% dos natimortos. Amutao mais comum em humanos a no-disjuno em meiose do cromossomo 21 que leva sndrome de Down.

Aberraes cromossmicas so tradicional-mente visualizadas realizando bandeamento doscromossomos e caritipo. Leses mais sutis po-dem ser vistas com o uso de FISH (fluorescent insitu hybridization) onde uma sonda de DNA (clo-nado em plasmdeo, bacterifago ou cosmdeo)marcado (com biotina ou digoxigenina) hibri-dizado com os cromossomos comumente em me-tfase. A sonda observada posteriormente porfluorescncia. O limite de resoluo em tornode 1Mb nesses casos, mas quando cromossomosem interfase so o alvo, duas sondas coradas emcores diferentes, e separadas por somente 50kbpodem ser distinguidas. Leses menores devemser detectadas pelo uso de Southern blotting e hi-bridizao, que separam fragmentos de DNA de500bp a 20kb em tamanho. Assim sendo, essametodologia continua sendo usada para detectar,por exemplo, os rearranjos que ocorrem na leu-cemia mielide crnica (t[9:22]), cromossomoPhiladelphia) e no linfoma folicular (t[14:18]),bem como as expanses de trincas observadas nasndrome de X-frgil (vide supra). Se a possibili-dade desse tipo de leso maior no for levada em

185


Captulo13

Cap. 13

Fig. 13.18 NASBA. Essa metodologia possui duas fases: a no-cclica e a cclica, e utiliza dois primers hbridos, 1 e 2,cada um contendo um promotor de RNA polimerase no seu segmento 5. A fase no-cclica usa RNA ou DNA como alvo etem como objetivo a produo de vrias cpias de DNA dupla fita, onde cada fita contm o promotor de RNA polimerase.Esta fase depende das enzimas transcriptase reversa (RT), e RNase H que remove a fita de RNA de uma molcula hbridaRNADNA. Amplificao por transcrio ocorre durante a fase cclica quando um nmero grande de fitas de RNA geradopela ao das enzimas T7 RNA polimerase, RT e RNase H, e o consumo dos primers 1 e 2. As cpias de RNA so quantifi-cadas por uma reao eletroquimoluminescente.

considerao, um diagnstico atravs de PCR eda anlise do produto resultante ser incorreto.Por exemplo, estimado que 35% das mutaesno gene BRCA1 so devidos a delees grandes(510bp a 14kb): porm essas no sero reconhe-cidas ao realizar PCR e seqenciamento do pro-duto gerado.

CHIPS E SEQENCIAMENTO PORHIBRIDIZAO

Com a tecnologia importada do uso de fotoli-tografia em chips de silcio na fabricao de semi-condutores, possvel sintetizar oligonucleotdeos,por exemplo, de 8-mer, numa superfcie que nor-malmente de vidro. As bases so acrescentadasseqencial e controladamente, e a posio de cadaoligonucleotdeo, na pequena placa de vidro, comsua seqncia, conhecida. Trinta e dois ciclos deadies especficas (ou seja, oito adies de cadaum dos quatro nucleotdeos) permitem a produ-o de todos os 65.536 possveis oligonucleot-

deos de 8-mer. O conceito original dessa tecnolo-gia (25 anos atrs) baseia-se no blot de Southern,e molculas de cido nuclico marcadas poderiamser usadas para interrogar molculas de cido nu-clico fixadas em um suporte slido, inicialmentemembranas de nitrocelulose. O uso de um suportecomo vidro, que impermevel e rgido, faz comque as sondas encontrem e hibridizem com seusalvos mais rapidamente, sem entrar em poros demembranas. As lavagens so mais rpidas pelosmesmos motivos. Alm disso, a planura, transpa-rncia e rigidez do vidro permitem uma melhoraquisio e processamento de imagens, e as posi-es dos oligonucleotdeos ficam mais bem defini-das do que numa superfcie flexvel. Portanto,atualmente so produzidos agrupamentos conten-do 400.000 oligonucleotdeos diferentes, cada umno seu espao de 20 m m2.

Um produto de PCR, comumente marcadocom um fluorforo, hibridizado com esse chip,que lavado posteriormente para remover oproduto no-anelado. Aps estmulo com la-ser, as posies de fluorescncia so lidas e in-

Primer 1

RNA (+)

DNA (+)

FASE NO-CCLICA

RT

RT

RT

DNA-DNA

RNA-DNA

Desnaturar

RNase H

DNA ()

Primer 2DNA-DNA

DNA (+)

T7 RNA polimerase

T7 RNA polimerase

RT

RNA () n

RNA-DNA

FASE CCLICA

RNase H

Primer 2

Primer 1

RT

186


Cap. 13

Fig. 13.19 bDNA. O cido-nuclico-alvo capturado numa fase slida usando sondas. Outras sondas de extensotambm so hibridizadas ao alvo que, por sua vez, hibridizam ao bDNA. O bDNA possui formato de pente e o multmerode amplificao; esta molcula fornecida pr-construda pelo fabricante. No prximo passo, outras sondas marcadascom uma enzima (comumente fosfatase alcalina) so hibridizadas ao bDNA. A enzima atua sobre um substrato (porexemplo, dioxetano), produzindo quimoluminescncia que quantificada.

terpretadas por computador, a partir da qual aseqncia no produto de PCR inferida. Produ-tos contendo variaes na seqncia anelaro emposies sutilmente diferentes, e produtos ob-tidos de heterozigotos hibridizam em no mni-mo duas posies simultaneamente. Essatecnologia est avanando rapidamente, tantopelo aumento na densidade de oligonucleot-deos colocados numa dada rea do chip, quan-to na habilidade de ler os sinais de fluorescnciamais compactados. Os problemas encontrados,como o auto-anelamento do produto nas con-dies de hibridizao usadas, esto sendo so-lucionados.

Se os oligonucleotdeos que forem fixadosno chip possuem seqncias de cDNAs, esseschips podem ser usados para acompanhar a ex-

presso de genes atravs do mRNA obtido, porexemplo, de um tecido em estudo. A expressode genes de interesse em dois tecidos diferentes,ou em duas amostras de um tecido, uma sendoneoplstica, pode ser comparada. O tempo dirse essa tecnologia ser adotada nos laboratriosde medicina molecular.

BIBLIOGRAFIA1. Arnheim N, Erlich H. Polymerase chain reaction strategy.

Annu Rev Biochem, 61:131-156, 1992.2. Belgrader P et al. PCR detection of bacteria in seven

minutes. Science, 284:449-450, 1999.3. Cotton RGH. Mutation detection. Oxford University

Press, 1997.4. Kostrikis LG et al. Spectral genotyping of human alleles.

Science, 279:1228-1229, 1998.

Hibridizar sondas aocido nuclico-alvo

e fase slida

Sonda decaptura

Hibridizar bDNA(multmero deamplificao)

Hibridizar sondasmarcadas com

enzima ao bDNA

cido nuclicodesnaturado

Sonda deextenso

Acrescentar substrato emedir quimoluminescncia

187


Captulo13

Cap. 13

5. Nollau P, Wagener C. Methods for detection of pointmutations: performance and quality assessment. ClinChem, 43:1114-1128, 1997.

6. Tang YW, Procop GW, Persing DH. Moleculardiagnostics of infectious diseases. Clin Chem,43:2021-2038, 1997.

7. The chipping forecast. Suplemento a Nat.Genetics 21,janeiro 1999.

8. Williams C et al. Assessment of sequence-based p53gene analysis in human breast cancer: mRNA incomparison with genomic DNA targets. Clin Chem,44:455-462, 1998.

9. Winn-Deen ES. Automation of molecular genetic methods Part 2: DNA amplification techniques. J Clin LigandAssay, 19:21-32, 1996.

13.pdf

Documents

Transcript of 13.pdf