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Amostragem

Amostragemconjunto de operações com as quais se obtém, do material

em estudo, uma porção relativamente pequena, detamanho apropriado para o trabalho no laboratório, masque ao mesmo tempo represente correctamente todo oconjunto da amostra

maior ou menor dificuldade na amostragem depende dahomogeneidade da amostra

processo de amostragemsérie sucessiva de etapas operacionais especificadas

para assegurar que a amostra seja obtida com a necessária condição de representatividade

3 etapas principais:colheita da amostra brutapreparação da amostra de laboratóriopreparação da amostra para análise

1

Amostragem

colheita da amostra brutaamostra bruta deve ser uma réplica, em

ponto reduzido, do universo considerado, tanto no que diz respeito à composiçãocomo à distribuição do tamanho dapartícula

amostras fluidas homogéneas – recolhidasa partir do topo, meio e fundo do recipiente, após agitação ehomogeneização

amostras sólidas – previamente moídas emisturadas

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2

Amostragem

fórmula geral para determinar qual aamostra bruta a colher

N – nº de unidades colhidasc – factor ligado ao grau de precisão e

homogeneidade da amostra (c < 1 parapopulação homogénea e c > 1 parapopulação heterogénea)

n - população

N c n

3

Amostragem

preparação da amostra de laboratórioamostra bruta frequentemente grande

demais para ser convenientementetrabalhada no laboratório

reduzidaalimentos secos – redução manual ou por

equipamentosalimentos líquidos – líquido bem

homogeneizado no recipiente; retirarporções de diversas zonas e misturá-lasno final

alimentos semi-sólidos – amostras raladas, procedendo de seguida de modo análogo ao das amostras sólidas

queijos duros, chocolates

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Amostragem

alimentos húmidos – amostra picada oumoída e misturada; retirar uma alíquotasuficiente para a análise

armazenar sob refrigeraçãocarnes, peixes, vegetais

alimentos semi-viscosos e pastosos e líquidos contendo sólidos – amostraspicadas em liquidificador, misturadas e alíquotas retiradas para análise

pudins, molhos, compotas, produtosenlatados

alimentos com emulsão – amostrasaquecidas a 35 ºC num frasco comtampa e depois agitado para homogeneização. Retiradas as alíquotasnecessárias para análise

manteiga, margarina

5

Amostragem

frutasfrutas grandes cortadas ao meio nos

sentidos longitudinal e transversal de modo a obter 4 partes. 2 partes opostas sãojuntas e homogeneizadas numliquidificador

frutas pequenas homogeneizadas inteiras no liquidificador

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4

Amostragem

preparação da amostra para análisedepende da natureza da amostra e do

método analítico envolvido

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Amostragem

conservação da amostraquando não é possível analisar as amostras em

frescoinactivação enzimáticadiminuição das alterações lipídicascontrolo do ataque oxidativocontrolo do ataque microbiológico

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Amostragem

variabilidade da amostraalimentos têm composição muito variada

alimentos frescos de origem vegetal têmcomposição mais variada que os deorigem animal

frutas e vegetais da mesma variedadepodem ter composições diferentes ou acomposição pode variar após a colheita

9

Amostragem

factores que influenciam a composição dosalimentos de origem vegetal:

constituição genética; variedadecondições de crescimentoestádio de maturaçãotempo e condições de armazenamentoparte do alimento a ser analisada

factores que influenciam a composição dosalimentos de origem animal:

teor em gorduraparte do animalalimentação do animalidade do animalraça

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Amostragem

factores que influenciam a composição dosalimentos após a colheita:

perca ou absorção de humidadeperca de constituintes voláteisdecomposição química e enzimáticaoxidação provocada pelo arejamento

durante a homogeneizaçãoremoção de materiais estranhosataque microbianocontaminações (metais, …)

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Técnicas Analíticas

Química analíticaanálise qualitativa

identificação dos componentes de uma amostraanálise quantitativa

determinação da quantidade de material presente numa amostra

alguns métodos mais adequados para análise qualitativa, outros para análise quantitativa. Existem métodosadequados para ambas

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tipos de métodos:gravimétricos

métodos baseados na medida do pesopor titulação

métodos baseados na medição de um volumeelectroquímicos

medição do potencial, intensidade, resistência, carga, …

espectroscópicosinteracção de um analito com radiação

electromagnéticacromatográficos

separação de um material devido à sua interacçãocom 2 fases diferentes

quimiométricostratamento estatístico dos dados

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calibração do métodoresposta medida é proporcional à concentração do

analitoestabelecer uma relação entre a resposta medida e a

concentração do analitoutilizam-se padrões para calibrar essa relação

padrões devem ser preparados do mesmo modo que a amostra

padrões devem ter uma composição semelhante à da amostra

padrões devem ser preparados na gama de concentrações esperada para a amostra

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análises gravimétricasmétodos baseados na precipitação de compostos

insolúveismétodos baseados na volatilização de um analito

depois de volatilizado, é pesado e determina-se quanto perdeu

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começa-se por pesar a amostraconverte-se a amostra num precipitado mensurávelse a forma mensurável for o analito

% analito = (peso analito/ peso amostra) x 100

normalmente, a forma mensurável contém o analito juntamente com outros materiais

peso do analito determinado através do factorgravimétrico

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características desejáveis num precipitado:baixa solubilidadefácil de recuperar por filtraçãonão reagir com o ar, água, …analito seja apenas uma pequena parte do

precipitadofacilita cálculo da estequiometria

mecanismos de precipitação:nucleação

quando há união inicial de um pequeno nº de iões, átomos ou moléculas

espontânea ou induzidacrescimento de partículas

crescimento tridimensional de uma partícula, originando um cristal

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Técnicas Analíticas18

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nucleação e crescimento de partículas são processos competitivos

desejável que o crescimento de partículas seja o factor preponderante na formação de precipitados

resulta em precipitados cristalinos e não em suspensões coloidais

formação de precipitados cristalinos favorecida por:

temperatura elevadacontrolo do pHutilização de soluções diluídasadição lenta de reagentesagitação da solução

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problemas encontrados durante a precipitação:coprecipitação de materiais que normalmente são

solúveisabsorção à superfície

contra-iões absorvem à superfícieoclusão

se o crescimento do cristal for muito rápido, alguns contra-iões não têm tempo para escapar da superfície

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formação de cristais mistosse estiverem presentes iões semelhantes,

estes podem substituir parcialmente o analito

aprisionamento mecânicoquando crescimento rápido aprisiona parte

da solução

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após filtração do precipitado, este é seco até se obter um peso constante

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vantagens e desvantagens dos métodos gravimétricoslentos; longos tempos de esperarequerem pouco equipamento; balança, fornonão requerem calibraçãoexactidão de 1 – 2 ppmsensibilidade limitada a concentrações do analito

> 1 %razoavelmente selectivos

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Densimetriausada sobretudo em amostras líquidas, embora

também possa ser utilizada em sólidospicnometria

método mais comum de medição da densidademede o peso de um volume conhecido de líquido

num frasco, cujo volume é calibrado em termos do peso de água pura no mesmo frasco

métodos por flutuaçãoum corpo total ou parcialmente imerso num líquido

flutua por uma força igual ao peso do líquido deslocado

flutuação de um corpo mergulhadorflutuação de um corpo flutuante (hidrometria)

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hidrometria baseia-se no princípio de que o mesmo corpo desloca pesos iguais de qualquer líquido em que flutue

volumes de diferentes líquidos deslocados pelo mesmo corpo flutuante sãoinversamente proporcionais às densidades dos líquidos

1 2

2 1

d V

d V

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Refractometriaíndice de refracção

razão entre a velocidade de radiação de umafrequência no vácuo e a velocidade de radiaçãoda mesma frequência no meio considerado

índice de refracção no ar e no vácuo diferem de apenas 0.03 %

usa-se o ar como referênciamagnitude da refracção é uma característica de

cada substânciadesignada índice de refracção (hD)

sen

sen D

i

rh

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http://nl.wikipedia.org/wiki/Afbeelding:Hydrometer.png

http://nl.wikipedia.org/wiki/Afbeelding:Hydrometer.png

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índice de refracção padrão dado pela linha D daluz de sódio monocromática a 589 nm e a uma dada temperatura

análise qualitativacada átomo, ligação e grupo funcional contribui

para o índice de refracção total de umcomposto

índice de refracção específico – soma das diversas contribuições

refractividade molar – índice de refracçãoespecífico multiplicado pelo pesomolecular

específica de cada composto

2

2

1

2x

MR

d

h

h

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análise quantitativaíndice de refracção de uma solução varia com a

concentração do solutovaria linearmente quando concentração

expressa em peso do soluto por volume de solução

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Medida de pHpH = -log aH+

em soluções diluídas (alimentos) considera-seactividade igual a [H+]

medido por eléctrodosum de medida e outro de referência,

geralmente combinados

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eléctrodo de vidro é o eléctrodo de medidamais usado

em solução aquosa, os catiões damembrana de vidro permutam com H+

formação de uma camada de sílicahidratada

funciona como uma membrana de permuta catiónica, sensível a H+

eléctrodo de Calomelanos geralmente usadocomo eléctrodo de referência

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determinação da acidezacidez nos alimentos pode provir de:

compostos naturais dos alimentosresultado de fermentações ou outro tipo de

processamentoácidos adicionados durante o processamentodeterioração do alimento

principais ácidos encontrados nos alimentoscítrico, málico, oxálico, succínico e tartárico

outros ácidosisocítrico, fumárico, oxalacético e cetoglutárico

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acidez total tituláveltitulação usando um indicador ou um medidor de

pHacidez volátil

determinação pela separação dos ácidos voláteispresentes, principalmente ácido acético e traçosde ácido fórmico

separação feita por evaporação em banho--maria, destilação directa e destilação a vapor

destilado ou resíduo titulados com uma base padrão até o ponto final, usando um indicador (fenolftaleína)

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Cromatografia“escrever com cores”introduzida em 1906 por Tswett

E:\Bromatologia I\article Tswett.pdf

componentes da amostra são distribuídos entre 2 fases, uma das quais estacionária, enquanto a outra fluiatravés dessa

cada componente da amostra será diferentementeretido pela fase estacionária devido a diversas interacções com esta

adsorção à superfíciesolubilidade relativacarga

33


tipos de cromatografia

CP – cromatografia em papelCCD – cromatografia em camada fina (TLC)CGL – cromatografia gasosa líquidaCGS – cromatografia gasosa sólidaCSS – cromatografia supercrítica sólidaCSFL – cromatografia supercrítica de fase ligada

CLL – cromatografia líquida líquidaCLS – cromatografia líquida sólidaCE – cromatografia de exclusãoCLFL – cromatografia líquida de fasse ligadaCTI – cromatografia de permuta iónicaCB – cromatografia de bioafinidade

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em função da polaridade das 2 fases, cromatografia pode ser de:

fase normalfase estacionária polar e fase móvel apolar

fase reversafase estacionária apolar e fase móvel polar

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transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária depende de:

adsorção na superfície das partículas sólidas da fase estacionária

partição entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionária que fica nos poros de um suporte sólido inerte

formação de ligações heteropolares com componentes iónicos da fase estacionária

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separação dos componentes de uma mistura baseia-se no facto de que a velocidade de passagem de um soluto individual na fase estacionária depende da partição da molécula entre as 2 fases

K – coeficiente de partiçãoCS - concentração do soluto na fase estacionáriaCm – concentração do soluto na fase móvel

K elevado significa que o soluto tem maior afinidade com a fase estacionária

maior tempo de retenção

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razão de retenção (R)dá a migração de uma substância em relação à

fase móvel

fracção de tempo que as moléculas do soluto gastam na fase móvel em relação à fase estacionária

cromatografia em papel e TLC usam-se distâncias de deslocamento

Rf – factor de retenção

velo. soluto

velo. fase móvelR

distância percorrida pelo centro da zona do soluto

distância percorrida pela frente do solventefR

•R e Rf não são constantes cromatográficas; dependem das condições cromatográficas

•impossível reproduzir valores obtidos por outros autores

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tipos de desenvolvimento do cromatogramaeluição

mais utilizado em análiseamostra introduzida numa extremidade do

sistemaadiciona-se um eluentecomponentes da mistura arrastados com

diferentes velocidadesfunção da afinidade relativa com as 2 fases

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má separação pode dever-se a:coeficientes de partição muito próximos e

pequenoscomponentes eluem todos ao mesmo

tempo, praticamente junto como eluente

coeficiente de partição muito grandecompostos ficam retidos muito tempo e

separam malseparação pode melhorar por uso de

gradientesvariar tipo e concentração da fase

móvelvariar a pressão da fase móvelvariar a temperatura da coluna

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deslocamentoutilizado em cromatografia preparativa

deseja-se recuperar componentes damistura

componentes da amostra eliminados da faseestacionária usando uma fase móvel queé mais atraída por ela

fase móvel liga-se à fase estacionária e desloca os componentes da mistura para seguirem livremente

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análise frontalpouco utilizadapassagem da amostra dissolvida num solvente

através da fase estacionária sem aplicação de eluente

componentes da amostra descem a colunapor gravidade

usada para separação de um componenteindesejável na amostra, que ficaria retidona fase estacionária, enquanto os outroscomponentes sairiam todos misturados

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mecanismos de separaçãoprocessos físicos

processos de adsorção e absorção (partição)baseados principalmente em atracções

electrostáticas ou dipolares (forças deVan der Waals), incluindo formação depontes de H

adsorção dá-se quando fase estacionária éum sólido e fase móvel gás ou líquidos

em TLC, adsorção dá-se na interface entre sólido e fase móvel

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absorção ou partição dá-se quando faseestacionária é um líquido espalhado nasuperfície de um suporte sólido inerte, ou aderido às paredes do tubo cromatográfico

baseia-se nas diferentes solubilidadesdos componentes da amostra na fase estacionária líquida e nafase móvel também líquida

dá-se na cromatografia em papel, nalíquida-gasosa e na líquida-líquida

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mecanismo misto entre a partição e a adsorção

fase estacionária tem partes que actuam como adsorvente e outras como líquidos

dá-se na cromatografia líquida de fasereversa

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processo químicoprocesso de permuta iónicafase estacionária constituída por uma matriz

onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis

permutadores aniónicos possuem sítiosactivos carregados positivamente, retendo aniões

permutadores catiónicos possuem sítioscarregados negativamente, retendocatiões

fase móvel geralmente uma solução iónicatampão

se a fase estacionária retém catiões, fase móvel deve conter catiõescapazes de os substituirpreferencialmente

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processo mecânicocromatografia por exclusãofase estacionária é uma matriz inerte, com

partículas de forma, tamanho e porosidade uniformes

moléculas da amostra separadas por tamanhomenores penetram facilmente os poros da

fase estacionáriamaiores excluídas de todos os porosmoléculas intermédias penetram

selectivamente nos poros, entrando em apenas alguns, saindo da coluna em ordem relacionada com o seu tamanho efectivo

moléculas maiores saem primeiro da coluna

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nomenclaturacromatograma

gráfico demonstrativo da separação obtidacromatografia planarcromatografia em coluna

áreas dos picos proporcionais às concentrações

tempo de retenção efectivo - tempo em que as moléculas ficam retidasna fase estacionária

tM (tempo morto) – tempo gasto pelosoluto não retido a atravessar a coluna

volume da fase móvel necessário paraeluir um componenteF – fluxo da fase móvel

VM (volume morto) – volume de fasemóvel gasto para eluir um componente não retido

Volume total dentro da colunaVe – volume da fase estacionária

'

r r Mt t t

r rV t F

M MV t F

t M eV V V

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na cromatografia em coluna, a retenção de um componente é dada pelo factor de retenção (k)

quantificação feita por medida das áreasdos picos

'

r

m

tk

t

tm– tempo em que as moléculas percorrem a coluna na fase móvel

49


eficiência da separaçãoseparação entre 2 picos adjacentes medida por:

factor de separação (a)

razão entre os respectivos factores deretenção

resolução (R)razão entre a diferença dos tempos de

retenção entre 2 picos adjacentes e a média das suas larguras na linha de base

2

1

k

ka

2 1

1 2

2r r

S

b b

t tR

l l

medida da largura na linha de base faz-se traçando tangentes nos lados dos picos

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eficiência de uma coluna cromatográficanº de pratos teóricos (N)

prato teórico é o equilíbrio de distribuição do soluto entre a fase móvel e a estacionária

quanto maior o nº de pratos teóricos, mais eficaz a separação, devidoa maior número de equilíbrios

2 2

/ 2

16 5.545r r

b h

d dn

l l

n – nº de pratos teóricoslh/2 – largura do pico a meia-altura

usa-se quando pico mal definido e não se podem traçar as tangentes

Afase móvel Ý Afase estacionária

51


descontando a distância do tempo mortoobtém-se o nº de pratos teóricosefectivos (N)

N varia com:tempo de retençãocomprimento e diâmetro da colunatipo de solutofluxo da fase móveltamanho da amostratécnica de injecçãotemperatura…

2 2' '

/ 2

16 5.545r r

b h

d dN

l l

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altura equivalente de um prato teórico (H)

razão entre o comprimento total da coluna (L) e o nº equivalente de pratos teóricos

quanto maior o valor de N e menor ode H, maior a eficácia da coluna

LH

N

53


equação de van Deemter (teoria da velocidade)relaciona o valor da altura equivalente do

prato teórico com a velocidade linear (m)

da fase móvel e factores que causamalargamento das bandas dos compostos ou dos picos dos cromatogramas

alargamento dá-se porque as moléculas do soluto não se deslocam simultaneamente na fase estacionária

BH A Cm

m

A – efeito dos múltiplos caminhosrelacionado com o empacotamento da coluna

B – difusão molecular do soluto na fase móvelapenas relevante em GC

C – resistência à transferência de massa das moléculasdo soluto da fase estacionária para a móvelmais importante na LC

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A

B

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pretende-se encontrar Hmin para umaeficácia óptima da coluna

A é uma constante, B diminui e C aumenta com o aumento dofluxo da fase móvel

utilização de colunas de diâmetro interno pequeno esuportes sólidos de tamanho pequeno euniforme diminui A

aumentar densidade do gás de arrastodiminui B

diminuir espessura e viscosidade do filme líquido da fase estacionáriadiminui C

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curvas de van Deemter

Colunas capilares

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análise qualitativacromatografia não permite identificar um composto

indica a presença de uma substância mas não a identifica

em certas condições, é possível comparartempo de retenção com o de um padrão

padrão deve ser uma parte da amostra ouadicionado a ela (padrão interno)

deve eluir aproximadamente a meio daanálise

amostra deve ser pequenavalores razoavelmente constantes ao longo

de diversas “corridas”

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análise quantitativadetectores produzem uma resposta por unidade de

concentraçãodependente da substância, pelo que deve

sempre usar-se um padrãorequer picos razoavelmente bem resolvidosárea do pico proporcional à concentração

59


método do padrão externosolução padrão contendo todos os analitos a

quantificarpadrões devem ter concentrações semelhantes

às dos componentes da amostrapadrão e matriz da amostra devem ser

semelhantescondições analíticas devem ser idênticas

desconhecida

desconhecida padrão

padrão

áreaconc = conc

área

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método do padrão internosubstância conhecida adicionada em

concentração constante a todas as amostras

tem em conta variações durante a análisedeve ser estável e mensurável nas

condições analíticas utilizadasnão deve interferir na análise nem coeluir

com componentes da amostra

padrão int.1 desconhecido

desconhecida padrão

padrão int.2 padrão

área áreaconc = conc

área área

61


Cromatografia em papelcromatografia líquido-líquidoseparação ocorre por partição do soluto entre 2

líquidoscomponentes menos solúveis na fase estacionária

movem-se mais rapidamente ao longo do papel, mais solúveis retidos no papel, movendo-se mais lentamente

simples e baratapequena quantidade de amostraboa capacidade de resoluçãoprática

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mecanismo de separaçãolíquidos polares (como H2O) têm grande

afinidade pelos grupos OH da celulose do papel, formando pontes de H

líquido retido funciona como fase estacionária

líquidos menos polares (solventes orgânicos) são repelidos

funcionam como fase móvel

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aplicação da amostraamostra preferencialmente dissolvida num

líquido volátilaplicada com um capilar

mancha pode ser detectada por:métodos químicos

reveladores químicos que tornam as manchas coloridas

métodos físicosfluorescência de algumas substâncias

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análise/identificaçãomede-se a distância percorrida pelo soluto num

tempo determinado, desde o ponto de aplicação da amostra até ao centro da mancha

mede-se a distância percorrida pela fase móvel, desde o ponto de partida até à linha de chegada

pode fazer-se a extracção dos componentes separados no papel com um solvente adequado

método instrumental para quantificar o componente isolado

espectrofotometria

distância percorrida pela substância

distância percorrida pela frente da fase móvelfR

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tipos de desenvolvimentoascendente

mais simples e comumdescendente

manchas colocadas na parte de cima do papel

papel colocado numa cuba com solventesolvente desce por capilaridade e gravidade

mais rápida, mas necessita de equipamento mais complexo

horizontal (circular)solvente colocado no centro do papel e a

amostra em voltaseparação dá-se de modo circular

bidimensionalfase móvel desloca-se ascendentementede seguida roda-se o papel 90º e faz-se

novo deslocamento ascendente

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eficiência de separaçãoconcentrações muito elevadas provocam

formação de cauda, devido a movimentação do soluto de regiões de maior concentração para regiões demenor concentração

se solutos e fase móvel percorrem distâncias diferentes – difusão lateral

se o fluxo for muito rápido, não há um tempo ideal de contacto entre a fase móvel e afase estacionária

depende da composição da fase móvel

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Cromatografia em camada fina (TLC)separação dos componentes de uma mistura por

migração diferencial sobre uma camada fina deadsorvente preso sobre uma superfície plana

superfície de vidro ou alumínio

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vantagens:fácil execuçãorapidezversatilidadegrande reprodutibilidadebaixo custo, embora mais cara que

cromatografia em papelaplicação analítica ou preparativaseparação mais rápida e eficaz que na

cromatografia em papelpermite utilização de agentes de revelação

corrosivosmais sensível e requer menor quantidade de

amostra que cromatografia em papelmais versátil em relação à fase estacionária que

cromatografia em papel

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desvantagens:maior dificuldade de retirar as manchas da

placa para análise por outros métodos que na cromatografia em papel

menor uniformidade para fazer a camada fina

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separação baseada na adsorçãosoluto separado entre fase estacionária sólida e

fase móvel líquidapodem existir fases estacionárias que

permitem separação por partição oupermuta iónica

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detecção feita com reagentes cromogénicos convencionais ou por uso de radiação UV

“identificação” feita com padrõesquantificação feita por raspagem da placa, seguida

por dissolução em solvente e análise em espectrofotómetro

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Cromatografia em camada fina de alta eficiência (HPTLC)

diferentes adsorventes utilizados como fase estacionária

aumento da eficiência de separação relativamente à TLC clássica

Parâmetros TLC HPTLC

Tamanho habitual da placa 20x20 cm 10x10 cm

Volume aplicado de cada amostra 1 – 5 mL 0.1 – 0.2 mL

Nº de amostras por placa 7 – 10 10 - 20

Diâmetro da mancha 3 – 6 mm 1 mm

Distância de migração do solvente 10 – 15 cm 3 – 6 cm

Tempo de corrida 30 -200 min 3 – 20 min

Diâmetro médio da partícula de sílica gel 20 mm 5 mm

Limites de detecção

por absorção de luz ~5 ng ~0.5 ng

por fluorescência ~0.1 ng ~0.1 ng

Pratos teóricos até 600 até 5000

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Cromatografia líquida em coluna abertadividida em 4 partes de acordo com o mecanismo

de separaçãocromatografia de adsorçãocromatografia de partiçãocromatografia de exclusão molecular

filtraçãopermeação em gel

cromatografia de permuta iónica

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column_chromatography.rm

column_chromatography.rm

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cromatografia de adsorção (líquida-sólida)fase estacionária é um sólido de superfície

activasílica gel, alumina, celulose, ...sólido empacotado dentro da coluna de

vidro ou de açofase móvel é um solvente composto de um ou

mais líquidos orgânicoselui os componentes da amostra através da

colunafase normal – fase estacionária é polar; fase

móvel apolarfase reversa – fase estacionária é apolar; fase

móvel polar

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separação resulta da diferente adsorção dos componentes da amostra sobre a superfície do sólido (fase estacionária)

solutos fracamente adsorvidos caminham mais rapidamente

solutos mais fortemente adsorvidos são retardados

interacções moleculares envolvidas na adsorção:

pontes de Hforças electrostáticas (van der Waals)forças de transferência de carga...

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funções dos eluentes:dissolver componentes da amostraeluir componentes da amostra pela coluna

desvantagem da técnica:produz cauda (tailing) ou alargamento da

banda (efeito de difusão)prejudica separação

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2 tipos de cromatografia de adsorção em coluna:

convencional, à pressão atmosféricacoluna de vidroamostra colocada no topo de uma

coluna de vidro empacotada com um adsorvente

eluição com um solvente, à pressão atmosférica

recolha na saída da coluna, a tempos ou volumes constantes

fracções recolhidas analisadas por:métodos físicos – fluorescência,

absorção electrónica, pH, actividade óptica, índice de refracção, ...

métodos químicos – adição de um reagente que produza um composto colorido ou fluorescente

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HPLC, a pressão elevadacoluna de aço estreitaseparação mais rápidaalém da separação, permite a

identificação e quantificação através de detectores e processadores

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cromatografia de partição (líquida-líquida)coluna empacotada com um suporte sólido de

grande área superficial embebido com uma fase líquida

amostra aplicada no topo da colunaeluída com fase móvel líquida imiscível com a

fase estacionáriaseparação devida a migração mais lenta de

solutos relativamente mais solúveis na fase líquida estacionária, relativamente à dos solutos com maior solubilidade relativa na fase móvel líquida

solutos são sempre mais solúveis na fase estacionária que na fase móvel

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cromatografia de partição normal (ex.)para separar uma mistura polar, usa-se um

líquido polar (H2O) como fase estacionária e um líquido menos polar (solvente orgânico) como fase móvel

cromatografia de partição de fase reversa (ex.)solutos não polares separados numa fase

estacionária menos polar (óleo mineral) com uma fase móvel mais polar (metanol)

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forças intermoleculares envolvidas na partição:pontes de Hforças de dipolos induzidosforças de dispersãoforças de interacção específica

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cromatografia líquida de permuta iónicacoluna empacotada com uma fase estacionária

sólida contendo grupos iónicosgrupos iónicos podem trocar

reversivelmente catiões ou aniões com uma solução iónica

separação dá-se por troca de iões entre os solutos da amostra e os componentes iónicos das fases móvel e estacionária

83


amostra colocada no topo da coluna e eluída com uma fase líquida iónica

iões da amostra são atraídos para a fase estacionária por forças electrostáticas

arrastados pelo eluente, por troca de lugarvelocidades de arrastamento dependem da

sua afinidade relativa para com a resinaos mais atraídos pela resina movem-se

mais devagarregras de selectividade do permutador iónico:

prefere iões com maior cargaprefere iões de menor tamanhoprefere iões altamente polarizáveisprefere iões com fracas interacções com a

fase móvel

84

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fase móvel é um líquido ou mistura de líquidos com cargas iónicas do mesmo sinal que os solutos da amostra, mas com maior força iónica

solução ácida, básica ou tampãofase estacionária é um material poroso, inerte,

insolúvel em água e em solventes orgânicos

possui grupos permutadores iónicos ligados covalentemente

natural ou sintéticaorgânica ou inorgânica

também existe a cromatografia de permuta iónica de alta eficiência

fase móvel a pressão elevada

85


cromatografia líquida de exclusão molecular (permeação em gel)

componentes da amostra não possuem afinidade nem com a fase móvel nem com a estacionária

separados por selecção de tamanho das moléculas, através da fase estacionária

fase móvel apenas dissolve e arrasta os componentes da amostra

moléculas menores penetram no interior da fase estacionária, sendo retardadas relativamente às moléculas maiores, as quais percorrem trajectos mais curtos (pelo exterior das partículas da fase estacionária)

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vantagens:simplicidade técnicainsensibilidade a solventes e temperaturacondições suavesversatilidade

87


fase estacionária pode ser um gel hidrofílico e a fase móvel um solvente aquoso salino

alternativamente, um gel hidrofóbico e um solvente orgânico

características da fase estacionária:inércia química

evitar ligação irreversível entre fase estacionária e componentes da amostra

estabilidadepermitir uso contínuo quando mantida

em condições moderadas de pH e temperatura

88

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cromatografia líquida de bioafinidademais utilizada na área da farmácia que na dos

alimentosmacromoléculas biológicas ligam-se

reversivelmente a ligantes específicosfase estacionária constituída por um suporte

sólido inerte onde estão presos os ligantes

fase móvel formada por soluções com diversos valores de pH ou força iónica (tornam instável ligação por bioafinidade) ou com substâncias que possuem maior afinidade pelo ligante do que o componente da amostra

89


escolha do solvente em LC1º - determinar se vamos trabalhar em fase normal

ou fase reversase a amostra for não polar ou insolúvel em

água – usar fase normalse a amostra for solúvel em água ou não

solúvel mas polar – usar fase reversafrequentemente tem que se usar uma mistura de

solventestirar partido de diferentes polaridades e

propriedades de solventepolaridade determina tempo de

retenção dos eluentesselectividade do solvente determina a

retenção relativa; pode afectar forma dos picos

90

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alguns solventes não podem ser usados por:não serem quimicamente inertespossuirem absorção no UV ou viscosidade

elevadasserem tóxicos ou inflamáveispossuirem pressão de vapor elevadaserem demasiado carosserem pouco miscíveis

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eluição com gradientes permite variar a polaridade e melhorar a separação

redução no tempo de análisepicos melhor formadosmaior sensibilidadepode provocar deriva na linha de base

93


tipos de cromatografia líquida compatíveis comuso de gradientes:

permuta iónicafase ligadaadsorção

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Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)optimização da cromatografia em coluna

solvente atravessa a coluna a pressão elevadaseparação mais rápida e eficiente

fase móvel é um líquidofase estacionária pode ser sólida (mais comum) ou

líquida

Coluna clássica HPLC

Depende da experiência do analistaMaiores resolução, sensibilidade e

reprodutibilidade

Fase estacionária menos durável

Detecção demorada e manual Maior rapidez e automação

BarataEquipamento, operação e manutenção mais caras

95


GC HPLC

Técnica e equipamento maisbaratos

Analisa amostras não voláteis e termicamente instáveis

Menor tempo de análiseAmostras com maior variedade de

peso molecular

Maior sensibilidade (10-12 g) Maior variedade de aplicação

Maior capacidade analítica (podeseparar até 200 componentes)

Ambas as fases têm afinidade comos componentes da amostra

Menor tempo de formação técnica Maior versatilidade

Maior diversidade de mecanismosde separação

vantagens de HPLC em comparação com GC

96

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componentes de um equipamento de HPLCreservatório da fase móvel

resistente aos líquidos usados como fasemóvel

aço, vidro, plástico inertefase móvel deve ser filtrada e

desgaseificadaevitar entupimento e entrada de gases

no equipamentogases provocam aparecimento de

picos no cromatograma e podem alterar a fase móvel e degradar afase estacionária

desgaseificação feita por:ultra-sons, aquecimento, vácuo,

refluxo

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componentes de um equipamento de HPLCbombas de pressão elevada

garantem fluxo constantereprodutibilidade, sensibilidade e

resoluçãomedidores de pressão

permitem verificar existência de problemasentupimento – aumenta pressãovazamento – baixa pressão

pressão influenciada por:viscosidade da fase móveldimensões da colunadiâmetro das partículas da fase

estacionáriaempacotamento da coluna

99


componentes de um equipamento de HPLCinjectores

devem ser:reprodutíveispermitir diversos volumes de injecção

10 – 100 mL

tipos de injector:micro-seringaválvula rotatória

gira de modo a que a fase móvel se ligue com o “loop” da amostra, arrastando-a para dentro da coluna a pressão elevada

100

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componentes de um equipamento de HPLCcolunas

3 tipospré-colunas

colocadas entre a bomba e oinjector para:

reter impurezas da fase móvel e preservar a coluna analítica

saturar a fase móvel com olíquido da fase estacionária em cromatografia líquida-líquida (evitar que se misturem, destruindo o enchimento da colunaanalítica)

actualmente pouco utilizadas, poisfase móvel é filtrada e fasesestacionárias mais resistentes

101


componentes de um equipamento de HPLCcolunas de guarda

colocadas entre o injector e acoluna analítica

mais curtas mas com mesmo diâmetro e fase estacionária queas colunas analíticas

retêm impurezas da amostrarenovação frequente necessária

colunas analíticasresponsáveis pela separaçãofeitas de materiais inertes

aço, vidro reforçado, sílicafundida

diâmetro interno uniformeresistentes à fase móvel e pressão

elevada

102

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componentes de um equipamento de HPLCdetectores

medem, de forma contínua, umapropriedade física dos componentes da amostra

enviam um sinal eléctrico que seráregistado como um pico

tipo de detector usado depende doscompostos a analisar

requisitos:alta sensibilidadeeficiente detecção mínimabaixo nível de ruídolargo intervalo de linearidadeelevada estabilidadeboa repetibilidade

103


componentes de um equipamento de HPLCsensibilidade

relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gerao sinal

alta sensibilidade – grande resposta para um dado componente daamostra

detecção mínimamínima quantidade do composto

que pode ser detectadaquantidade que gera um sinal 2

vezes superior ao ruído de fundo

ruído de fundovariação do sinal do detector,

devida a variações eléctricas, defluxo, de temperatura, bolhas de ar, …

104

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componentes de um equipamento de HPLClinearidade

proporcionalidade entre a respostaquantitativa do detector e a concentração do compostodetectado

verificada através de uma recta padrão que relaciona área dopico com diversas concentraçõesde um composto padrão

estabilidaderelativamente a variações de fluxo

e composição da fase móvel

105


componentes de um equipamento de HPLCrepetibilidade

capacidade do detector manteruma resposta constante paramais que uma injecção da mesma amostra, tantoqualitativa comoquantitativamente

106

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componentes de um equipamento de HPLCtipos de detector

universalresponde a qualquer tipo de

amostra (índice de refracção)selectivo

responde a uma propriedade do soluto (absorção electrónica)

específicoresponde a um único tipo de

amostra (fluorescência)

107


componentes de um equipamento de HPLCdetector de absorção electrónica

sensível e capaz de detectar grandenº de compostos

detector de absorção electrónica por vector de díodos

permite obtenção do espectro de absorção do composto a serseparado

ajuda à identificaçãodetector por índice de refracção

mais universalsensibilidade e reprodutibilidade

muito baixasvariação com composição da

fase móvel, temperaturae pressão

não permite utilização degradientes

108

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componentes de um equipamento de HPLCdetector de absorção no infravermelho

pouco utilizado, devido à baixasensibilidade

apenas eficaz em cromatografia de exclusão molecular (maior quantidade deamostra)

detector de fluorescêncialimitado a compostos com

capacidade de fluorescer, ou que foram derivatizados para tal

elevadas sensibilidade e especificidade

109


componentes de um equipamento de HPLCdetectores electroquímicos

constante dieléctricamede variação de polaridade

na fase móvelamperométricos

medem capacidade de oxidarou reduzir um composto

mais usado dos detectoreselectroquímicos

condutimétricosmedem condutividade do

solventeusados em soluções de iões

polarográficospotenciométricos

110

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componentes de um equipamento de HPLCregistadores

integrador ou computadoridentificação e quantificação de cada pico

111


tipos de fase móvel em HPLCescolha baseada na afinidade entre os

componentes da amostra e os solventespolaridade

requisitosalto grau de purezadissolver a amostra sem decompor os seus

componentesnão dissolver ou decompor a fase

estacionáriater baixa viscosidadeser compatível com o detector utilizadoter disponibilidade e baixo custonão ser tóxica nem inflamável

112

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tipos de fase estacionária em HPLCcaracterísticas:

elevada resolução entre os componentes daamostra

fácil introdução na colunapequena queda de pressãodiâmetro uniformepartículas porosas ou peliculares

quanto menor a partícula, maior a eficiência da separação

melhor difusão dos componentes da amostra

eficiência aumenta com regularidade das partículas

113


Cromatografia gasosa (GC)fase móvel é um gás

inerte, apenas serve para transportar componentes da amostra através dacoluna

fase estacionária pode ser um sólido (cromatografia sólido-gasosa) ou um líquido (cromatografia líquido-gasosa)

separação dá-se por adsorção no sólido na GSC e por partição na GLC

na GSC, fase estacionária é um sólido de grandeárea superficial

na GLC, fase estacionária é um líquido que ficapreso na coluna através de um suporte sólidoinerte ou por capilaridade

114

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Vantagens GC Desvantagens GC

Rapidez – fase móvel gasosa tem maior

velocidade; equilíbrio entre solutos e as 2 fases

mais rápido

Analisa apenas componentes voláteis, ou que

se tornam voláteis após derivatizados

Alto poder de resolução e separação – fase

móvel tem baixa resistência ao fluxo (colunas

longas, com grande nº de pratos teóricos)

Preparação da amostra pode ser trabalhosa –

aumenta o tempo de análise

Elevada sensibilidadeNecessita de técnicas complementares para

identificação de componentes

Requer pequenas quantidades de amostra Não é uma boa técnica preparativa

115


amostra pode ser um gás ou líquido volátilinjectada através de micro-seringa ou injector

automáticoaquecida e vaporizada no injector do

cromatógrafoarrastada pela fase móvel para a coluna que

contém a fase estacionáriacoluna aquecida para manter amostra

vaporizada

116

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componentes da amostra selectivamenteretardados pela fase estacionária

componentes em equilíbrio com ambas as fasesequilíbrio curto devido à chegada de mais

gás de arrastocomponentes dissolvidos deixam a fase líquida

para restaurar o equilíbriocomponente completamente removido da

secção da fase estacionáriamais moléculas do componente deixam a fase

gasosa dissolvendo-se na fase líquidaatinge novo equilíbrio

fase gasosa puxa novamente os componentes, destruindo o equilíbrio

processo repetido muitas vezes

117


velocidade de movimentação dos componentes na coluna depende de:

solubilidade na fase estacionáriavolatilidade para a fase móvel

separação dada pela maior ou menor retenção na fase estacionária

adsorção pelo suporte sólido também podeinfluenciar separação

após separação, componentes da amostraentram num detector

registador capta sinais do detectorcromatograma

118

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60


características de um cromatograma:primeiros picos mais agudos e simétricos

que os últimosquanto maior o tempo de retenção,

maior o alargamento da bandapodem aparecer picos não completamente

separadosseparação melhora por aumento do

comprimento da colunapicos podem ter assimetria frontal ou

caudalfrontal causada por injecção de

amostra em excesso ou temperatura da coluna inferior à ideal

caudal aparece devido a defeito na injecção ou a adsorção excessiva da amostra na fase estacionária ou suporte sólido

119


análise pode ser isotérmica ou por gradiente de temperatura

gradiente melhora a separação e reduz tempo de análise

picos melhor separadosredução do tempo de retenção dos

compostos com maior ponto de ebuliçãopicos mais simétricoslinha de base tende a subir com aumento

de temperatura

120

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61


características do gás de arrasteinerte

não interagir nem com a fase estacionária nem com amostra

compatível com o detectormínima difusão gasosadisponível, barato e seguropureza elevada

coloca-se um filtro entre o cilindro de gás e o aparelho

peneira molecular que retira água e hidrocarbonetos

gases mais utilizados:azoto (mais barato)hélio (elevada condutividade térmica)hidrogénio (inflamável)

121


fluxo do gás de arraste tem que ser controlado e mantido constante durante a análise

reprodutibilidade dos tempos de retenção e quantificação

122

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injectorvaporização rápida e completa da amostra

(geralmente líquida)não decompor nem fraccionar a amostra

tipos de injector:por seringade splitde splitlesscold-on column

123


tipos de injectorpor seringa

usada em colunas empacotadasvolume de injecção entre 0.1 – 2.0 mL

em amostras voláteis, solvente e compostos mais voláteis podem sair da seringa antes dos menos voláteis

modifica composição original da amostra

124

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tipos de injectorde split

usada em colunas capilares e de sílica fundida

pequenos diâmetros e longasinjector faz a vaporização da amostra,

enquanto ela é misturada com o gás de arrasto

apenas uma pequena fracção da amostra entra na coluna (split)

restante sai para fora do equipamento

125


requisitos:mínimo alargamento da banda fora

da colunainertelarga faixa de operação nas razões

do splitmínima contaminaçãodivisão da amostra linear e

reprodutíveloperação em larga gama de

temperaturasselecção da temperatura do injector,

velocidade de injecção e razão do split dependem do tipo de amostra

126

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tipos de injectorde splitless

possui uma válvula que pode ser fechada por um período de tempo (30 – 90 s) quando a amostra está a ser injectada, vaporizada e transferida para a coluna

cerca de 95 % da amostra entra na coluna durante esse período

restante eliminado pelo splitaplica-se a:

soluções muito diluídascomponentes que saem na cauda

do solventecompostos termolábeis

127


amostra injectada em grande volume e lentamente

temperatura da coluna cerca de 20 ºC inferior ao ponto de ebulição do solvente da amostra

solvente condensa no início da coluna, retendo os componentes da amostra

gás de arrasto vai evaporando o solvente (mais volátil) e concentrando a amostra

programa de temperatura vaporiza imediatamente o solvente

componentes da amostra concentrados para a análise

128

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tipos de injectorcold-on column

amostra directamente injectada na coluna por uma seringa

sem pré-aquecimento nem mistura com o gás de arrasto

agulha da seringa tem diâmetro muito estreito, para poder entrar na coluna capilar, através de um septo

vantagens:maior exactidão com compostos

muito voláteisexcelente quantificação de

componentes individuais da amostra

diminuição da decomposição térmica da amostra

129


coluna2 tipos de coluna:

empacotadatipos de empacotamento:

adsorvente sólido (GSC)fase líquida adsorvida num suporte

sólido (GLC)fase líquida ligada quimicamente a

um suporte sólido (GLC)metálica ou de vidrocaracterísticas do suporte sólido:

grande área superficialdiâmetro uniforme dos porosinércia químicaforma regularresistência mecânicapreço acessível

130

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características das fases estacionáriaslíquidas:

apolares, polaridades altas oubaixas

dissolver bem os solutos da amostra

grande resolução dos solutos da amostra nas condições de tempoe temperatura seleccionadas

não ser volátil na temperatura máxima de utilização

termicamente estávelquimicamente inerte

131


características das fases estacionáriaslíquidas:

pode ocorrer sangramento se forultrapassado o limite máximo da temperatura

fase estacionária vai contaminar o detector(diminui sensibilidade)

subida na linha de basefase estacionária perde solubilidade

se temperatura estiver abaixo do mínimo

sangramento – parte da faseestacionária arrastada com afase móvel

132

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colunacapilar

maiores e com maior nº de pratos teóricos

não têm suporte sólidofase estacionária líquida adere às

paredes da coluna por capilaridade

tubo externo de níquel, aço, vidro ou sílica fundida

inerteelevada purezamuito flexível

133


colunaproblemas comuns:

alta velocidade do gás de arrasto pode deslocar filme da coluna

perda de fase estacionária por volatilizaçãosangramentopresença de impurezas

oxigénio e água na fase móvel podem decompor a fase estacionária

134

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detectorescaracterísticas:

rapidezdetecção deve ser feita em alguns

segundosalta sensibilidade

quantidade mínima detectável deve ser 2 vezes o ruído de fundo

baixo nível de ruídolinha de base deve ser constante

ampla faixa de resposta linearlinearmente proporcional à

concentração de solutosó ocorre a baixas

concentraçõesselectividade

detectores universaisdetectores selectivos (mais sensíveis)

não destrutivoalguns detectores destroem a amostra

137


detectorestipos de detectores:

condutividade térmica (TCD)mede a capacidade de remover calor

de um objecto quenteresponde à condutividade térmica do

gás que o atravessa

Vantagens Desvantagens

Universal Menos sensível que os outros

Não destrói a amostraRequer temperatura e velocidade do

gás de arrasto constantes – nãopode ser usado com gradiente

138

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detectoresionização de chama (FID)

responde a qualquer substância que aoqueimar forme um compostocom carga eléctrica

maioria dos compostos orgânicos; não o gás de arrasto


Mais sensível que TCD Destrói a amostra

Não sensível a variações de temperatura nem de velocidade do

gás de arrasto – permite uso degradiente

Resposta diferencial – 2 compostoscom mesma concentração podem

dar respostas diferentes(requer factor de correcção, para

quantificar)

Ampla faixa linear (adequado para análise quantitativa)

139


detectorescaptura electrónica (ECD)

baseado na capacidade de certos compostos em capturar electrões livres


Muito sensível a compostos capazes de capturar electrões – compostoscom átomos electronegativos [O2, N2, S2 e halogénios (pesticidas)]

Destrói a amostra

Altamente selectivo – não detecta hidrocarbonetos, álcoois, cetonas,

…

Necessita limpeza constante –facilmente contaminado pela

amostra

Faixa linear limitada – problemas na análise quantitativa

140

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termostatoscontrolam as temperaturas no injector, detector

e colunatemperatura de injecção

ideal para vaporizar totalmente a amostra sem causar reacções indesejáveis

temperatura do detectorsuficientemente alta para evitar

condensação da amostra, dafase líquida proveniente desangramento e de impurezas no gás de arrasto

141


termostatostemperatura na coluna

não deve exceder o limite da fase estacionária líquida (podeocorrer sangramento)

se temperatura muito alta, compostosnão interagem com faseestacionária (má separação)

se temperatura muito baixa, aumentainteracção com fase estacionária, mas análise muito longa

142

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registadoressimples

registam apenas o cromatogramaintegradores

registam e quantificam os picoscomputador

registam e quantificam de modo automatizado

143


identificaçãobaseada no tempo de retenção

tr depende de:tamanho da coluna% da fase estacionáriatemperatura da colunavelocidade do gás de arrasto

tempo de retenção efectivo

'

0r rt t t

t0 – tempo morto

144

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identificaçãotempo de retenção relativo

retenção do composto em relação a um composto de referência

composto de referência injectadoseparadamente da amostra

tira-se o tempo de retenção relativo dos componentes da amostra e dos padrões

co-cromatografia (spiking)misturar um composto padrão

à amostra antes dainjecção

identificação não é conclusiva, mas permite excluir

confirmação por outros métodos analíticos

padrãodesconhecido

referência referência

rr

rr

r r

ttt

t t

145


quantificaçãocálculo da área do pico por triangulação

triangulação com altura totaltriangulação a meia altura

método mais exactoelimina erro da largura de picos

assimétricos

2

xbl h

A

/ 2x

hA h l

146

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quantificaçãonormalização interna

percentagem relativa de cada pico emrelação à composição total da amostra

todos os componentes da amostra devem ser eluídos e ter a mesmaresposta no detector

% 100área A

xárea total

A

148

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quantificaçãonormalização da área corrigida com o factor de

respostaquando compostos não têm mesma

resposta no detectorcorrigir com factor de resposta

injectar uma mistura deconcentração conhecida nas substâncias cujos factores se quer determinar

relacionar a percentagem conhecida e observada

calcular % da substância presentena amostra multiplicando áreaobtida pelo factor de resposta edividindo pelo somatório detodas as áreas multiplicadaspelos respectivos factores deresposta

conhecida

observada

% A

% AA

f

149


quantificaçãopadrão externo

compara área da substância de concentração desconhecida com área damesma substância em soluções padrão com concentração conhecida

amostra e mistura de padrões injectadas separadamente

possibilidade de erro na injecção das soluções e preparação dospadrões

150

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quantificaçãopadrão interno

adição de concentrações conhecidas de uma substância padrão à amostra, antesda injecção

área de cada pico da amostrarelacionada com área dasubstância padrão

padrão interno deve ser:similar à substância analisada e ter

um tr próximo (mas diferente)inertenão fazer parte da composição da

amostramétodo menos sensível a erros de

injecção

151


quantificaçãoadição de padrão

adição de quantidades conhecidas do padrão da substância a ser analisada aquantidades conhecidas da amostra

traça-se um gráfico com a melhor recta que passe pelos pontos experimentais, prolongando-seaté ao eixo dos x

concentração de cada pico da amostramedido desde a intersecção até ao ponto x=0

método utilizado em amostras que aindacontenham interferentes

interferentes estarão presentes tantona amostra como no padrão

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derivatizaçãonecessária para tornar amostras analisáveis em

GCalquilaçãoesterificação

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Cromatografia com fluídos supercríticos (SFC)técnica complementar das cromatografias líquida e

gasosautiliza fluídos supercríticos

gás aquecido a uma temperatura superior à crítica e comprimido a uma pressão superior à crítica

fluído densoviscosidade similar aos gases e 100

vezes menor que líquidoscoeficiente de difusão maior que

líquidos e menor que gasespoder de solubilidade maior que gases

e semelhante a líquidos

155


usada para separar:amostras termicamente instáveisamostras de mais elevado peso molecular que

em GCmais eficiente e rápido que HPLCprincipal desvantagem

poucos equipamentos e caros

156

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Métodos hifenadoscombinação de métodos cromatográficos com

espectrométricosGC-MSGC-FTIRGC-AESLC-MS

157


Espectrometria de massa (MS)interface é um dos pontos críticos

transferência quantitativa do analitoredução do fluxo/pressão proveniente do

cromatógrafo para um nível compatívelcom espectrómetro

preço acessívelnenhuma interface obedece a todos os

requisitos

158

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Espectrometria de massa (MS)opção mais simples é a divisão do fluxo

permite entrada no MS mas perde-se amostra

mais fácil interface em GC que em LCtipos de interface

separador moleculardivisão aberta (open split)capilaridade directa

159


Espectrometria de massa (MS)separador molecular

mais usado com colunas de empacotamento

moléculas maiores difundem mais lentamente eentram em maior nº no MS

open splitusado com colunas capilares e

fluxos ~1 mL/minMS puxa ~1 mL/min através do

restritor

160

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Espectrometria de massa (MS)capilaridade directa

funciona com colunas capilaressimples, barato e não selectivonão há volume mortolimita a gama de fluxos usada

pela colunalimita diâmetro interno da

colunaparte da coluna é “perdida”

(usada como restritor de fluxo)

161


Espectrometria de massa (MS)GC-MS

2 possibilidades de operaçãovarrimento

recolha de dados numa dada gamainformação qualitativa

monitorização de ião individual (SIM)valores de massa pré-determinadosinformação quantitativa

162

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Espectrometria de massa (MS)GC-MS

para maximizar informação quantitativa e qualitativa:

fazer várias “corridas”procurar compostos alvo

163


Espectrometria de massa (MS)procurar compostos alvo

funciona melhor se se estiver a analisar um nº limitado decompostos

requer um padrão interno marcado com um isótopo

para cada composto identificam--se,pelo menos, 3 linhas do espectro

maior – quantificação2 ou mais iões qualificadores,

bem resolvidosadiciona-se padrão interno à

amostraanálise SIM às 6 linhas

qualificação baseada em:•tempo de retenção•iões encontrados•razões entre iões•padrão interno

164

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Espectrometria de massa (MS)LC-MS

principais tipos de interface:nebulização térmica (thermospray)

amostra aquecida e rapidamenteexpandida em vácuo

formam-se gotículas carregadas docomposto, livres de solvente, que entram no MS

ionização electrónica (electrospray)carga transferida para as gotículasnebulizadas para uma câmara de

vácuo, onde perdem o solventeiões ejectados da gota para o MS

165



sequência de ionização

166

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interpretação de dados é mais difícil que em GC-MS

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Infra-vermelho (FTIR)interface directaGC-FTIR

quantidade de espectros de referência élimitada

maioria dos dados de IV são de amostras líquidas ou sólidas

espectros na fase gasosa são diferentes

168

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Emissão atómica (AES)funciona por emissão de plasma pela amostrarelativamente caroGC-AES

espectro de emissão específico de cadaelemento

por vezes usa-se um reagente gasosoassegura atomização e excitação

adequadas

169


Emissão atómica (AES)devido a limitações do fotodíodo, só se

consegue analisar um nº limitado de linhas

permite obter análise elementar e fórmulaempírica

170

16/09/2015 - pfigueiredo.org · acidez total titulável titulação usando um indicador ou um...

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