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2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Reagentes

o-nitrofenol-β-ᴅ-galactosideo (o-npg) Fluka Biochemika®

Alginato de sódio de algas castanhas Fluka Biochemika®

Carbonato de sódio (Na2CO3) Merck®

Cloreto de cálcio (CaCl2) dihidratado Merck®

Di-hidrogeno fosfato de potássio (KH2PO4) Merck®

Hidrogeno fosfato de potássio (K2HPO4) Merck®

Ácido clorídrico (HCl), 37 % Merck®

Tris(hidroximetil)aminometano ((HOCH2)3CNH2) Merck®

o-nitrofenol (o-np) Fluka Biochemika ®

Ácido súlfúrico (H2SO4) 95-97% Merck®

Reagente de Bradford Coomassie G-250 BIO-RAD Protein Assay

Ácido dinitrosalicilico (Reagente DNS) Merck®

Glucose monoidratada Merck®

Reagente glucose oxidase/peroxidase Sigma-Aldrich®

Reagente o-Dianisidina Sigma-Aldrich®

Solução padrão de glucose Sigma-Aldrich®

Leite UHT Gordo MIMOSA adquirido no Hipermercado

Continente do Seixal

Leite UHT Meio Gordo MIMOSA adquirido no Hipermercado

Continente do Seixal

Leite UHT Magro MIMOSA adquirido no Hipermercado

Continente do Seixal

2.2. Enzimas

Lactozym 2600 L® Sigma-Aldrich®

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imibond galactosidase SPRIN®

2.3. Equipamento

Espectrofotómetro HITACHI U2000 UV-VIS de feixe duplo e com

uma gama de comprimento de onda que se situa entre os 220 e

os 850 nm.

Fotómetro Eppendorf, BioPhotometer

Bomba-seringa automática da New Era Pump Systems, Inc.

Banho de água termostatizado com agitação Julabo SW 21

Agitador orbital termostatizado Aralab Agitorb 160E

Potenciómetro Metrohm® 744

Placa de aquecimento com agitação Arex

Balança analítica Mettler AE 200

Microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico

Vortex Retsch Mixer

Seringa de 10 mL PIC Indolor®

Agulha Terumo Neolus de 0,6 mm

Microfiltros para agulhas

Micropipeta P1000, P200 e P100

Macropipeta Transferpettor de 10 mL

Pipeta de vidro de 20 mL

Pipeta de vidro de 1 mL

Eppendorfs de 1 mL e de 1,5 mL

Microplaca NuclonTM Delta Surface

Cuvete de plástico Eppendorf

Cuvete de plástico

Cuvete de vidro

Falcon de 10 mL

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Frascos de 7 mL

Frascos de 50 mL

Tubos de ensaio de vidro

Eppendorfs de 1,5 mL

2.4. Preparação de soluções

Preparação de Solução Tampão de Fosfato de Potássio 0,1 M, pH 6,8: Preparar

25 mL de solução aquosa de K2HPO4 a (1 M) e 25 mL de solução aquosa de

KH2PO4 (1 M); numa placa com agitação, colocar um copo de vidro de

500 mL com uma barra magnética no interior e misturar, no copo de vidro,

24,85 mL da solução aquosa de K2HPO4 (1 M) com 25 mL da solução aquosa de

KH2PO4 (1 M); acrescentar 400 mL de água destilada, sempre com agitação, e

confirmar o pH da solução com o potenciómetro devidamente calibrado. Passar

a solução para um balão de 500 mL e perfazer o volume com água destilada. A

solução deverá ser guardada em refrigeração (2 a 5°C).

Preparação de Solução Tampão de Fosfato de Potássio 20 mM, pH 6,8: Retirar

20 mL da solução tampão de fosfato de potássio 0,1 M, pH 6,8 para um balão de

100 mL e perfazer o volume com água destilada. A solução deverá ser guardada

em refrigeração (2 a 5°C).

Preparação de Solução Tampão de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0: Preparar 100 mL de

solução aquosa de (HOCH2)3CNH2 (0,1 M) e 100 mL de solução aquosa de HCl

(0,1 M). Numa placa com agitação, colocar um copo de vidro de 200 mL com um

barra magnética no interior e misturar 100 mL da solução aquosa de

(HOCH2)3CNH2 (0,1 M) com 93,2 mL da solução aquosa de HCl

(0,1 M), sempre com agitação; confirmar o pH da solução com o potenciómetro

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devidamente calibrado. Colocar a solução num balão de 200 mL, perfazer o

volume do balão com água destilada e armazenar em refrigeração (2 a 5°C).

Preparação de Solução de Carbonato de Sódio 1 M: Pesar 10,6 g de carbonato

de sódio para um de 100 mL. Adicionar um pouco de água destilada até a

dissolução do composto e depois perfazer o volume com água destilada.

Armazenar a solução em refrigeração (2 a 5°C).

Preparação de Solução Cloreto de Cálcio a 1%: Pesar 1 g de cloreto de cálcio

para um balão de 100 mL. Adicionar um pouco de água destilada até a

dissolução do composto e perfazer o volume com água destilada. Armazenar a

solução em refrigeração (2 a 5°C).

Preparação de Solução de Alginato de Sódio a 2%: Pesar 0,2 g de alginato de

sódio directamente para o copo de vidro e adicionar 10 mL de água destilada.

Colocar a solução a aquecer em banho-maria e com agitação, até à completa

dissolução do composto verificar a temperatura do banho-maria com

termómetro de modo a que não ultrapasse os 70°C. Após dissolução do

composto, desligar o aquecimento mas manter a agitação até que a solução seja

utilizada.

Preparação da enzima imibond galactosidase SPRIN® para utilização em

ensaios: Colocar a quantidade de enzima a utilizar dentro de um copo de vidro,

retirar com a ajuda de uma seringa com filtro a solução de glicerol onde a

enzima se encontra armazenada. Proceder a três lavagens com o volume de

solução tampão de fosfato de potássio a 20 mM, 6,8 necessário, sendo que 1g

de preparação enzimática necessita 4 mL de solução tampão em cada lavagem.

Retirar a solução tampão no final de cada lavagem com a seringa com filtro. A

enzima está pronta para ser utilizada nos diferentes ensaios.

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Preparação das soluções de o-npg: Pesar 0,0075; 0,0151; 0,0226; 0,0301;

0,0376; 0,0452 g de o-npg para balões de vidro de 10 mL e dissolver em solução

tampão de fosfato de postássio 0,1M, pH 6,8 ou em Tris-HCL 0,1 M, pH 7,0.

Perfazer o volume com solução tampão de modo a que se obtenham soluções

de concentração 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15 mM.

Preparação das soluções padrão de o-np: Pesar 0,0139 g de o-npg para um

copo de vidro e dissolver em solução tampão de fosfato de postássio 0,1M, pH

6,8 ou em Tris-HCL 0,1 M, pH 7.0. Transferir a solução para um balão de 100 mL

e perfazer o volume com solução tampão correspondente. Retirar os seguintes

volumes de solução para balões de 10 mL: 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30;

0,35; 0,40; 0,45; 0,50.Perfazer com solução tampão o volume dos balões e

homogeneizar de modo a obter-se padrões de concentração: 5, 10, 15, 20, 25,

30, 35, 40, 45 e 50 µM.

Preparação das soluções padrão de glucose : Pesar 0,45 g de glucose para um

copo de vidro e dissolver em solução tampão de fosfato de postássio 0,1M, pH

6,8 e transferir para um balão de 50 mL, prefazendo o volume com a mesma

solução tampão de modo a que se obtenha uma solução de glucose de

concentração 50 mM. Retirar os seguintes volumes da solução anteriormente

para balões de 10 mL: 0,05; 0,10; 0,15; 0,18; 0,2; 0,25; 0,30; 0,35; 0,38; 0,40.

Perfazer com solução tampão o volume dos balões e homogeneizar de modo a

obter-se padrões de concentração:0,25; 0,5; 0,75; 0,9; 1; 1,25;1,5;1,75;1,9 e 2

mM.

Preparação das soluções padrão de Lactozym 2600 L® para o ensaio de

Bradford: Pipetar 0,1 mL de preparação enzimática Lactozym 2600 L® para um

eppendorf de 1 mL e e adicionar 0,9 mL de solução tampão de fosfato de

postássio 0,1M, pH 6,8. Retirar os volumes da solução mãe de 2, 5, 10, 15, 20,

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25, 30, 40, 50 e 60 µL eppendorfs de 1 mL e adicionar volumes de solução

tampão de 998, 995, 990, 985, 980, 975, 970, 960, 950, 940 µL,

respectivamente, a cada eppendorf, de modo a obter soluções padrão de

concentração 0,230; 0,575; 1,150; 1,725; 2,300; 2,875, 3,450; 4,600; 5,750;

6,900 µg/mL. Homogeneizar no vortex.

Preparação das diluições de Lactozym 2600 L® utilizadas paras os ensaios com

enzima livre: Retirar os seguintes volumes da preparação enzimática: 0,02; 0,01;

0,008; 0,005; 0,004; para balões de vidro de 10 mL e perfazer o volume com

solução tampão fosfato de postássio 0,1M, pH 6,8. e homogeneizar de modo a

se obter soluções de concentração 2,300; 1,150; 0,920; 0,575; 0,460 mg/mL.

Preparação de Solução de Ácido Sulfúrico 12N: Pipetar 16 mL de solução de

ácido sulfúrico 95-97 % para um balão de vidro com água desionizada. Esta

operação tem que ser realizada na hote. Adicionar água desionizada,

lentamente através de uma pipeta de plástico até perfazer o volume do balão, e

homogeneizar.

Preparação do reagente de ensaio para a quantificação da glucose: Transferir o

conteúdo da cápsula contendo o reagente glucose oxidase/peroxidase

fornecido no Kit de Ensaio Glucose Oxidase Sigma-Aldrich ® para um frasco

âmbar e adicionar 39,2 mL de água desionizada, homogeneizando. Reconstituir

os 5 mg de reagente o-dianisidina, fornecidos no Kit de Ensaio Glucose Oxidase

Sigma-Aldrich®, com 1 mL de água desionizada, invertendo várias vezes até total

dissolução do seu conteúdo. Adicionar 0,8 mL de reagente o-dianisidina

reconstituído anteriormente ao frasco âmbar onde se encontra o reagente

glucose oxidase/peroxidase, homogeneizando. A solução é estável por um mês

e deverá ser armazenada entre 2 e 8 °C.

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2.5. Métodos analíticos

2.5.1. Ensaio para a quantificação de açúcares redutores: Método DNS

Um dos métodos empregados na quantificação de açúcares redutores é o

método do DNS. É um método rápido e prático na determinação de açúcares

redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. Como exemplo de

aplicação temos: controle de qualidade na caracterização das matérias-

primas para fins de processamento, e verificação se determinado produto

está dentro dos parâmetros e padrões exigidos pela legislação; indústria

açucareira, no acompanhamento do processo de fermentação, que permite

verificar as taxas de consumo de açúcar pelo microorganismo.

A determinação de açúcares redutores pelo método do DNS baseia-se na

redução, em meio alcalino, do 3,5-dinitrosalicilico (de coloração amarela). O

produto formado, 3-amino 5-nitrosalicilato, é estável e apresenta coloração

laranja-avermelhado (3-amino-5-nitro-salicilato) e máxima absorção da luz

visível no comprimento de onda de 535 nm (34).

Figura 5 – Redução do reagente 3,5-dinitrosalicilico (35)

2.5.1.1. Técnica

Em cada poço da microplaca NuclonTM Delta Surface colocar 250 µL de

amostra ou de solução padrão de glucose e adicionar 250 µL de ácido

dinitrosalícilico. Tapar a microplaca e colocar em banho de água a 100°C

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durante cinco minutos. A absorvância das amostras foi medida a 563 nm, numa

cuvete Eppendorf num fotómetro Eppendorf, BioPhotometer.

Curva de calibração

Para a realização da curva de calibração foram utilizadas soluções padrão de

glucose com concentrações entre 0,25 e 2 mM.

Gráfico 1. Curva de calibração da glucose (Método DNS)

2.5.2. Método de Bradford para determinação da proteína

O ensaio de Bradford engloba várias preparações do corante Coomassie azul

brilhante usado com o objectivo de quantificar proteínas, e foi descrito pela

primeira vez por Bradford (1976).

No método de Bradford, o analito é colocado em contacto com uma solução

do corante Coomassie G-250 azul brilhante e é permitida a sua incubação por

um curto período de tempo. O corante ir-se-á ligar aos aminoácidos básicos ou

aromáticos. Em consequência da ligação à proteína uma alteração

metacromática, para uma cor avermelhada, de 465 para 595 nm é observada

devido à estabilização da forma aniónica do corante. A maioria do sinal

y = 0,2605x - 0,0438 R² = 0,9969

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25

Ab

sorv

ânci

a 56

3 n

m

Concentração de glucose (mM)

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31

observado deve-se à interacção com os resíduos de arginina. A absorvância é

lida espectrofotometricamente e, através da aplicação de uma curva de

calibração e da Lei de Lambert-Beer, a concentração de proteína pode ser

calculada a partir da absorvância (35).

As vantagens do ensaio de Bradford incluem a fácil execução, a elevada

sensibilidade e o baixo custo dos reagentes (36).

O ensaio de Bradford é sensível a interferências de vários reagentes, onde

estão incluídas a maioria dos detergentes iónicos e não-iónicos, hidratos de

carbono, sais e proteínas glicosiladas (35).

2.5.2.1. Técnica

Em cada poço da microplaca NuclonTM Delta Surface colocar 100 µL de

amostra ou de solução padrão e adicionar 25 µL de reagente Bradford. A

absorvância das amostras foi medida a 595 nm, numa cuvete Eppendorf num

fotómetro Eppendorf, BioPhotometer entre 2 a 5 minutos após o início da

reacção.

Curva de calibração

Para a realização da curva de calibração foram utilizadas soluções padrão de

enzima (Lactozym 2600 L) com concentrações entre 0,2 e 6,9 µg/mL.

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Gráfico 2. Curva de calibração de proteína (Método Bradford)

2.5.3. Doseamento da hidrólise enzimática de o-npg: método colorimétrico

Medidas de absorção da radiação ultravioleta e visível têm uma vasta

aplicação na determinação quantitativa numa grande variedade de espécies

orgânicas e inorgânicas. Esta técnica baseia-se na medida da transmitância T ou

absorvância A de soluções contidas em células transparentes, tendo um

caminho óptico de b em centímetros. Deste modo a concentração c de um

analito absorvente está relacionada linearmente à absorvância, conforme

representado pela equação e explicado pela lei de Lambert-Beer.

Equação 1. Lei de Lambert-Beer

y = 0,3109x + 0,1761 R² = 0,9943

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

Ab

sorv

ânci

a 5

95

nm

Concentração de Lactozym (ug/mL)

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Apesar da lei de Lambert-Beer possuir algumas limitações, existem poucas

excepções para a generalização de que a absorvância está relacionada

linearmente com o caminho óptico. No entanto, desvios de proporcionalidade

entre a absorvância medida e a concentração quando b é constante, são

encontrados frequentemente. Outros desvios ocorrem em consequência do

modo como as medidas de absorvância são feitas ou em resultado de mudanças

químicas associadas com variações de concentração. Estas duas últimas são

conhecidas, respectivamente, como desvios instrumentais e desvios químicos.

A lei de Lambert-Beer é bem sucedida ao descrever o comportamento da

absorção de meios contendo concentrações de analito relativamente baixas. Em

altas concentrações (> 0.01M) a distância média entre as moléculas

responsáveis pela absorção diminui a ponto de cada molécula afectar a

distribuição de carga das moléculas vizinhas. Esta interacção poderá alterar a

capacidade das moléculas de absorver um determinado comprimento de onda

da radiação. Como extensão da interacção depende da concentração, a

ocorrência deste fenómeno causa um desvio da relação linear entre a

absorvância e a concentração.

Desvios da lei de Lambert-Beer também aparecem porque (coeficiente

molar de extinção) depende do índice de refracção do meio. Ou seja, se as

variações de concentração causam alterações significativas no índice de

refracção n de uma solução, desvios da lei de Beer são observados (36).

Neste estudo, a actividade enzimática foi medida usando o-nitrofenol-β-

ᴅ-galactosideo (o-npg) como substrato. Os produtos da hidrólise deste substrato

são a galactose e o-nitrofenol e o mecanismo enzimático é semelhante ao da

hidrólise da lactose (24,27). A reacção foi parada pela adição de carbonato de

sódio que para além de alterar o pH do meio para 11, desnaturando a enzima,

também faz exacerbar a cor amarela do o-nitrofenol (13,7). Esta cor é medida

por espectrofotometria de absorção molecular no comprimento de onda de 410

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nm contra um branco. Para isso, foi utilizado um espectrofotómetro HITACHI

U2000 UV-VIS.

Figura 6. Reacção de hidrólise do o-npg pela β-galactosidase (37)

O espectrofotómetro utilizado tem feixe duplo e uma gama de

comprimento de onda que se situa entre os 220 e os 850 nm e opera com uma

lâmpada de deutério.

2.5.3.1. Curva de calibração de o-np

Para a realização da curva de calibração foram retirados 500 µL de soluções

padrão de o-np com concentrações entre 5 e 50 µM para eppendorfs contendo

500 µL de carbonato de sódio. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à

leitura dos valores de absorvância a 410 nm.

Gráfico 3. Curva de Calibração de o-np

y = 0,0017x + 0,0671 R² = 0,9831

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0 10 20 30 40 50 60

Ab

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ânci

a 41

0 n

m

Concentração de o-np (uM)

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35

2.5.4. Kit Glucose-Oxidase Sigma-Aldrich® para determinação da glucose

Este ensaio tem como objectivo a quantificação da glucose através de

métodos enzimáticos em alimentos e outros materiais. Devido à alta

especificidade e sensibilidade das enzimas, ensaios quantitativos podem ser

realizados em materiais em bruto com pouca ou mesmo nenhuma

preparação. No entanto, as amostras poderão ter que ser diluídas em água

desionizada e filtradas ou desproteinizadas se for necessário para clarificar a

solução. Amostras carbonatadas ou fermentadas necessitam ser

desgaseificadas.

Neste ensaio, a glucose existente na amostra é oxidada a ácido glucónico

e a peróxido de hidrogénio pela enzima glucose oxidase. O peróxido de

hidrogénio reage com a o-dianisidina na presença da enzima peroxidase e

forma um produto de cor castanha. A o-dianisidina oxidada reage depois com

o ácido sulfúrico e forma um produto mais estável e de cor rosa. A

intensidade da cor do produto final é depois medida a 540 nm e é

proporcional à concentração de glucose existente na amostra.

Glucose Oxidase ᴅ-Glucose + H2O + O2 Ácido ᴅ-Gluconico + H2O2

Reduzido Peroxidase Oxidado H2O2 + o-Dianisidina o-Dianisidina (sem cor) (castanho)

H2SO4 o-Dianisidina Oxidado o-Dianisidina Oxidado (castanho) (cor-de-rosa)

Figura 7. Esquema da reacção de determinação da glucose pelo teste da glucose/oxidase (38)

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2.5.4.1. Técnica

Foram colocados volumes de leite UHT magro, meio gordo e gordo

MIMOSA e das preparações enzimáticas, nas proporções indicadas na tabela 4.,

em tubos falcon de 50 mL, a 20 °C e 37 °C e a 200 rpm no agitador orbital Aralab

Agitorb 160E. Foram retiradas alíquotas de 500 µL de todas as amostras para

eppendorfs de 1 mL aos 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos, e colocados em

gelo. No final do ensaio, as amostras e a solução padrão de glucose fornecida

com o kit de ensaio foram transferidas para tubos de ensaio de vidro e

colocadas em banho de água a 99° C durante 5 minutos. As amostras foram

arrefecidas à temperatura ambiente e foi adicionado, a cada tubo e com um

intervalo de 30 segundos entre tubos, 1 mL de reagente de ensaio. As amostras

foram colocadas em banho de água a 37 °C durante 30 minutos. Após decorrido

este período de tempo, os tubos de ensaio contendo as amostras foram

retirados do banho e foi colocado 1 mL de ácido súlfúrico 12 N em cada tubo,

com um intervalo de 30 segundos entre tubos, para parar a reacção. Foi

colocado 1,5 mL de cada amostra em eppendorfs de 1,5 mL e centrifugadas a

10000 rpm durante 5 minutos numa microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico

Foram lidas as absorvâncias a 540 nm, num espectrofotómetro Hitachi

U2000 UV-VIS em cuvetes de vidro.

Tabela 4. Quantidades de leite e de preparações enzimáticas utilizadas nos ensaios.

Preparação enzimática Volume de leite (mL) Quantidade de preparação

enzimática

SPRIN® 5 50 mg

Esferas de Alginato 5 2,5 mL

Lactozym® 2600 L 9,5 0,5 mL

A quantificação da glucose na amostra é depois realizada através da

aplicação da equação seguinte:

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Equação 2. Quantificação da glucose de acordo com o teste glucose/oxidase

2.6. Métodos experimentais

2.6.1. Imobilização

Apesar da muitas indústrias ainda utilizarem a enzima livre para a hidrólise da

lactose, a imobilização da β-galactosidase é uma área que tem vindo a ganhar

importância devido aos seus potenciais benefícios. A utilização de tecnologia de

imobilização é de importância significativa do ponto de vista económico pois

torna possível a reutilização enzimática e o uso das enzimas em processos

contínuos. Pode, também, ajudar a melhorar a estabilidade enzimática.

A utilização de β-galactosidase imobilizadas tem sido, intensivamente,

empregue na hidrólise de leite e de soro de queijo.

Como foi referido anteriormente, existem várias técnicas de imobilização e

vários suportes onde a imobilização pode ser realizada. A escolha da técnica de

imobilização e do suporte depende da enzima e do objectivo do estudo.

Neste estudo, a técnica de imobilização utilizada foi a de encapsulamento, e

o suporte escolhido foi o alginato de cálcio.

O alginato é, de longe, o polímero mais utilizado para técnicas de

imobilização e microencapsulação. O alginato é um extracto de uma alga

marinha composta por cadeias de ácido α-L-glucorónico e de ácido β-ᴅ-

manurónico, alternados. O seu uso em alimentos é considerado seguro (39). Os

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suportes em alginato são, geralmente, conseguidos, através do cross-linking do

grupo carboxil do α-L-glucorónico com a solução contendo um catião tal como o

cloreto de cálcio, cloreto de bário ou poli(L-lisina). Matrizes de alginato em cross

link com Ca2+ são, contudo, instáveis em ambientes fisiológicos ou em soluções

tampão comuns com grandes concentrações de iões fosfato ou citrato pois

podem extrair o Ca2+ do alginato e liquefazer o sistema (31).

2.6.1.1 Técnica

Adicionou-se a 10 mL de solução aquosa de alginato de sódio (2%)

Lactozym® 2600L Sigma-Aldrich de 150, 250, 350 e 500 µL e deixou-se 10

minutos numa placa de agitação. Após decorrido este período de tempo,

colocou-se a solução mistura de polímero e enzima numa seringa de 5 mL com

uma agulha de 0,6 mm seringa da bomba-seringa automática da New Era Pump

Systems, Inc. e gotejou-se com um caudal 900 µL por minuto para a solução de

extrusão de cloreto de cálcio a 1%, que se encontrava numa tina com gelo, na

placa com agitação. No final da extrusão, as esferas foram deixadas 5 minutos

na solução de Cloreto de Cálcio ainda em gelo, com agitação, para consolidação

das mesmas. Decorrido este período de tempo, as esferas foram retiradas da

solução de extrusão e lavadas duas vezes com 20 mL de solução tampão. As

esferas ficaram armazenadas no frigorífico (2 a 5°C) em solução tampão de Tris-

HCl, durante 24 horas antes de serem utilizadas em ensaio.

Cada esfera possuía um volume 10 µL e um diâmetro de 2 mm.

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Figura 8. Esferas de alginato de cálcio (2%)

2.6.2. Avaliação da Influência da Concentração de Enzima

Para avaliar a influência da concentração de enzima foram realizados

ensaios a 37 °C, utilizando-se uma solução de substrato de concentração 15

mM de o-npg em solução tampão de fosfato de potássio, pH 6,8 a 0,1 M para

os ensaios com Lactozym® 2600L Sigma-Aldrich e para os ensaios com

imibond galactosidase SPRIN® e uma solução de o-npg da mesma

concentração mas realizada em solução tampão de Tris-HCl, pH 7,0 a 0,1M

para os ensaios com a enzima imobilizada em alginato de cálcio.

2.6.2.1. Técnica

Com Lactozym® 2600L Sigma-Aldrich: Colocou-se 9,5 mL de solução de

substrato em tubos falcon de 10 mL com 0,5 mL de enzima com

concentrações de 2,300; 1,150; 0,920; 0,575; 0,460 mg/mL, em banho de

água Julabo SW 21 termostatizado e com agitação de 80 rpm. Foram

retiradas alíquotas de 500 µL para eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL

de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120,

150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura

dos valores de absorvância a 410 nm.

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Com SPRIN® imibond galactosidase: Colocou-se 5 mL de solução de

substrato em frascos de 7 mL com 20, 30, 40, 50 e 60 mg de enzima, no

agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitação de 200 rpm. Foram

retiradas alíquotas de 500 µL para eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL

de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180

minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores

de absorvância a 410 nm.

Com esferas de alginato de cálcio (2%) contendo Lactozym® 2600L

imobilizada: Colocou-se 5 mL de solução de substrato em frascos de 50

mL com 2,5 mL de esferas de alginato com concentrações de enzima de

17,25; 28,75; 40,25; 57,5 µg/mL no agitador orbital Aralab Agitorb 160E

com agitação de 200 rpm. Foram retiradas alíquotas de 500 µL para

eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL de solução de carbonato de sódio a

1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram

mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm.

2.6.3. Avaliação da Influência da Concentração de Substrato

Para avaliar a influência da concentração de substrato foram realizados

ensaios a 37 °C, utilizando-se concentrações das preparações enzimáticas

fixas. Foram utilizadas soluções de substrato de concentrações 2,5; 5; 7,5; 10

e 15 mM em solução tampão de fosfato de potássio, pH 6,8 a 0,1 M para os

ensaios com Lactozym® 2600L Sigma-Aldrich e para os ensaios com imibond

galactosidase SPRIN® e soluções de o-npg das mesmas concentrações mas

realizada em solução tampão de Tris-HCl, pH 7,0 a 0,1M para os ensaios com

a enzima imobilizada em alginato de cálcio.

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2.6.3.1. Técnica

Com Lactozym® 2600L Sigma-Aldrich: Colocaram-se 9,5 mL de cada

solução de substrato em tubos falcon de 10 mL com 0,5 mL de enzima

com concentração de 0,920 mg/mL, em banho de água Julabo SW 21

termostatizado e com agitação de 80 rpm. Foram retiradas alíquotas de

500 µL para eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL de solução de

carbonato de sódio a 1 M aos 0, 5, 10, 15,20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,

60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo

até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm.

Com imibond galactosidase SPRIN®: Colocaram-se 5 mL de cada

solução de substrato em frascos de 7 mL com 50 mg de enzima, no

agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitação de 200 rpm. Foram

retiradas alíquotas de 500 µL para eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL

de solução de carbonato de sódio a 1M aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180

minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores

de absorvância a 410 nm.

Com esferas de alginato de cálcio (2%) contendo Lactozym® 2600L

imobilizada: Colocaram-se 5 mL de cada solução de substrato em frascos

de 50 mL com 2,5 mL de esferas de alginato com uma concentração de

enzima de 40,25 µg/mL no agitador orbital Aralab Agitorb 160E com

agitação de 200 RPM. Foram retiradas alíquotas de 500 µL para

eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL de solução de carbonato de sódio a

1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram

mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm.

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2.6.4. Estudo do Efeito da Temperatura

Para estudar o efeito da temperatura sobre a reacção de hidrólise

enzimática do o-npg foram realizados ensaios a várias temperaturas

mantendo com uma concentração fixa de cada enzima e uma concentração

fixa de substrato, o-npg, de 15 mM em solução tampão de fosfato de

potassio, pH 6,8 a 0,1 M para os ensaios com Lactozym® 2600L Sigma-Aldrich

e para os ensaios com imibond galactosidase SPRIN®e solução de o-npg da

mesma concentração mas realizada em solução tampão de Tris-HCl, pH 7,0 a

0,1 M para os ensaios com a enzima imobilizada em alginato de cálcio.

2.6.4.1. Técnica

Com Lactozym® 2600L Sigma-Aldrich: Colocou-se 9,5 mL de solução de

substrato em tubos falcon de 10 mL com 0,5 mL de enzima com

concentração de 0,920 mg/mL, em banho de água Julabo SW 21

termostatizado a 15, 20, 30, 37, 50, 60 °. Foram retiradas alíquotas de

500 µL para eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL de solução de

carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 5, 10, 15,20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,

60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo

até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm.

Com imibond galactosidase SPRIN®: Colocou-se 5 mL de solução de

substrato em frascos de 7 mL com 50 mg de enzima, no agitador orbital

Aralab Agitorb 160E com agitação de 200 rpm, a temperaturas de 20, 30,

37, 50, 60 °C. Foram retiradas alíquotas de 500 µL para eppendorfs de 1

mL contendo 500 µL de solução de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 30,

60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo

até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm.

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Com esferas de alginato de cálcio (2%) contendo Lactozym® 2600L

imobilizada: Colocaram-se 5 mL de cada solução de substrato em frascos

de 50 mL com 2,5 mL de esferas de alginato com concentração de enzima

de 40,25 µg/mL no agitador orbital ABALAB Agitorb 160E com agitação

de 200 rpm, a temperaturas de 20, 30, 37 e 50 °C. Foram retiradas

alíquotas de 500 µL para eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL de solução

de carbonato de sódio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os

eppendorfs foram mantidos em gelo até à leitura dos valores de

absorvância a 410 nm.

2.6.5. Ensaios de Reutilização

Com as preparações de enzima imobilizadas, imibond galactosidase SPRIN® e

esferas de alginato contendo Lactozym® 2600L imobilizada foram realizados

ensaios de reutilização com o objectivo de avaliar a hidrólise enzimática do o-

npg em contínuo. Nestes ensaios, foi utilizada uma solução de o-npg de 15 mM

em solução tampão de fosfato de potássio, pH 6,8 a 0,1 M para os ensaios com

imibond galactosidase SPRIN® e solução de o-npg da mesma concentração mas

realizada em solução tampão de Tris-HCl, pH 7,0 a 0,1 M para os ensaios com a

enzima imobilizada em alginato de cálcio.

2.6.5.1. Técnica

Com imibond galactosidase SPRIN®: Colocou-se 5 mL de solução de

substrato em frascos de 7 mL com 50 mg de enzima no agitador orbital a

37 ° C, com agitação de 200 rpm. Foram retiradas alíquotas de 500 µL

para eppendorfs de 1 mL contendo 500 µL de solução de carbonato de

sódio a 1M ao final de 0, 30 e 60 minutos de ensaio. Os eppendorfs foram

mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. Aos

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60 minutos a solução de substrato era substituída por uma nova solução

de igual concentração.

Com esferas de alginato de cálcio (2%) contendo Lactozym® 2600L

imobilizada: Colocou-se 5 mL de soluções de substrato frascos de 50 mL

com 2,5 mL de esferas de Alginato com a concentração de enzima de

40,25 µg/mL , no agitador orbital a temperaturas de 37° C, com agitação

de 200 RPM. Foram retiradas alíquotas de 500 µL para eppendorfs de 1

mL contendo 500 µL de solução de carbonato de sódio a 1M ao final de 0,

30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos de ensaio. Os eppendorfs foram

mantidos em gelo até à leitura dos valores de absorvância a 410 nm. A

cada 180 minutos de ensaio a solução de substrato era substituída por

outra de igual concentração.

2.6.6. Ensaios de bioconversão da lactose em leite

2.6.6.1. Técnica

Foram colocados 5 mL de leite UHT meio-gordo MIMOSA em frascos de 7

mL com as concentrações de enzima imibond galactosidase SPRIN® indicadas

na tabela 5, às temperaturas indicadas na tabela 5 a 200 rpm no agitador

orbital. Foram retiradas alíquotas de 500 µL de todas as amostras para

eppendorfs de 1 mL aos nos tempos indicados na tabela 5, e colocados em gelo.

No final do ensaio, as amostras e a solução padrão de glucose fornecida com o

kit de ensaio foram transferidas para tubos de ensaio de vidro e colocadas em

banho de água a 99° C durante 5 minutos. As amostras foram arrefecidas à

temperatura ambiente e foi adicionado, a cada tubo e com um intervalo de 30

segundos entre tubos, 1 mL de reagente de ensaio. As amostras foram

colocadas em banho de água a 37 °C durante 30 minutos. Após decorrido este

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período de tempo, os tubos de ensaio contendo as amostras foram retirados do

banho e foi colocado 1 mL de ácido súlfúrico 12 N em cada tubo, com um

intervalo de 30 segundos entre tubos, para parar a reacção. Foi colocado 1,5 mL

de cada amostra em eppendorfs de 1,5 mL e centrifugadas a 10000 rpm durante

5 minutos numa microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico

Foram lidas as absorvâncias a 540 nm, num espectrofotómetro Hitachi

U2000 UV-VIS em cuvetes de vidro.

2.6.6.2. Delineamento experimental para modelação da bioconversão da lactose

A influência da concentração da enzima imibond galactosidase SPRIN®,

da temperatura e do tempo de reacção na bioconversão da lactose em leite

meio-gordo foi avaliada utilizando um delineamento experimental baseado no

método das superfícies de resposta, designado por RSM (Response Surface

Methodology). Esta modelação permite testar várias variáveis em simultâneo,

com um número reduzido de ensaios, e diminuir o tempo e os custos da

experimentação.

A metodologia das superfícies de resposta (RSM) consiste num conjunto

de métodos matemáticos e estatísticos que utilizam os dados quantitativos,

obtidos a partir de condições experimentais apropriadas, na determinação e

resolução de equações multivariadas, na modelação do fenómeno em causa e

no estabelecimento de combinações entre vários factores experimentais

(variáveis) que na globalidade vão originar a resposta óptima. As equações

podem ser representadas graficamente de forma a originar a superfície de

resposta de três formas diferentes: (i) descrever como as variáveis afectam a

resposta; (ii) determinar como as variáveis se interrelacionam e (iii) descrever o

efeito combinado de todas as variáveis na resposta (40).

As principais etapas a considerar na aplicação da Metodologia das

Superfícies de Resposta, incluem (40): (i) escolha das variáveis mais

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importantes, (e.g. concentração de enzima, concentração substrato, tempo,

temperatura); (ii) definição da respectiva gama de trabalho (com base nas

informações obtidas em ensaios preliminares); (iii) determinação dos ensaios a

realizar através de um delineamento experimental adequado; (iv) análise e

interpretação dos resultados.

Um dos métodos mais utilizados na metodologia das superfícies de

resposta com a finalidade de se ajustar a uma resposta de superfície de segunda

ordem é o delineamento central compósito rotativo (CCRD -“Central Composite

Rotatable Desgn”). Este, tem como base p variáveis e baseia-se na escolha de 3

conjuntos de pontos experimentais. O primeiro conjunto com 2p pontos

representa os vértices de um cubo centrado na origem do sistema codificado de

referência apresentando esses pontos um número de código de + 1 ou – 1. O

segundo conjunto toma a forma de uma estrela de 2p pontos nos eixos do

sistema de referência a uma distância de 2 p/4 da origem. O terceiro conjunto é

constituído pelos pontos da origem (pontos centrais) (41).

A análise dos resultados experimentais permite o desenvolvimento de

curvas de regressão que descrevem matematicamente o sistema e permitem

retirar conclusões relativamente ao seu comportamento.

As equações polinomiais podem gerar as chamadas respostas de

superfície que permitem visualizar o grau de dependência, a interacção entre as

variáveis e nalguns casos identificar as condições reaccionais óptimas (41).

Para a modelação da bioconversão da lactose no leite pela enzima

imibond galactosidase SPRIN®, pela metodologia das superfícies de resposta foi

utilizado o delineamento central compósito rotativo, testando em simultâneo as

variáveis: concentração de biocatalisador, tempo e temperatura. O

delineamento experimental foi efectuado com recurso ao software

“StatisticaTM” (versão 9 da Statsoft, USA) que seleccionou os valores das três

variáveis em estudo (concentração biocatalisador, temperatura e tempo), a

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utilizar nos ensaios em leite, com base nos resultados obtidos em soluções

modelo (Tabela 5.)

Tabela 5. Valores experimentais das duas variáveis testadas em simultâneo e

respectivos níveis codificados por aplicação do CCRD.

Níveis

codificados

imibond

galactosidase

SPRIN® (mg/mL)

Tempo

(min)

Temperatura

(ºC)

(-1,-1, -1) 4,00 15,00 23,00

(-1,-1, 1) 4,00 15,00 37,00

(-1, 1, -1) 4,00 45,00 23,00

(-1, 1, 1) 4,00 45,00 37,00

(1,-1, -1) 12,00 15,00 23,00

(1,-1, 1) 12,00 15,00 37,00

(1, 1, -1) 12,00 45,00 23,00

(1, 1, 1) 12,00 45,00 37,00

(-1,68, 0, 0) 1,27 30,00 30,00

(1,68, 0, 0) 14,73 30,00 30,00

(0, -1,68, 0) 8,00 4,77 30,00

(0, 1,68, 0) 8,00 55,23 30,00

(0, 0, -1,68) 8,00 30,00 18,23

(0, 0, 1,68) 8,00 30,00 41,77

(0, 0, 0) 8,00 30,00 30,00

(0, 0, 0) 8,00 30,00 30,00