Mtodos para el diagnstico de

EMS/AHPND en camarones

Dr. Jorge Cullar-Anjel

Guatemala, junio 4-7 de 2014

Pasos para el Diagnstico

Anamnesis (historial, informacin local)

Examen clnico

Diagnstico presuntivo

Exmenes complementarios (histologa y PCR)

Diagnstico definitivo (confirmatorio)

Plan de manejo (tratamiento, profilaxis, control,

erradicacin, despoblacin)

Tamao de muestra al azar Poblacin Tamao de muestra requerida segn la prevalencia esperada

2% 5% 10% 20% 30% 40% 50%

50 50 35 20 10 7 5 2

100 75 45 23 11 9 7 6

250 110 50 25 10 9 8 7

500 130 55 26 10 9 8 7

1,000 140 55 27 10 9 9 8

1,500 140 55 27 10 9 9 8

2,000 145 60 27 10 9 9 8

4,000 145 60 27 10 9 9 8

10,000 145 60 27 10 9 9 8

>/=100,000 150 60 30 10 9 9 8

Modificado de Amos, 1985.

Tamao de muestra

seleccionando enfermos

Modificado de Amos, 1985.

5 a 10 camarones mnimo,

con signos clnicos evidentes!

EXAMEN CLNICO

Visita de campo

Historial (anamnesis)

Chequeo poblacional representativo

Examen fsico

Examen del entorno intra y extra-acutico

Remisin de muestras al laboratorio

HISTOLOGA

Estudio de tejidos mediante cortes de 3 micras

de espesor

Tincin con Hematoxilina y Eosina

Diagnstico confirmatorio

Complementario con PCR para EMS/AHPND

Muestreo de camarones

para histopatologa

Los camarones deben estar vivos antes de la fijacin: un

camarn muerto no sirve para estudio histopatolgico

Es preferible llevar Davidson y elementos de fijacin al

estanque y hacer el procedimiento in situ

Si es necesario, mantener los camarones en cubos con

aireacin en el laboratorio antes de la fijacin

Nunca mantener en hielo o congelar camarones antes de fijar

Fijador para histopatologa

Davidson AFA (Alcohol Formalina - cido

actico): solucin fijadora de rutina

Ventajas

Penetra rpidamente

La fijacin es rpida

Descalcifica el exoesqueleto

Desventajas

Produce algunos artefactos

Interfiere con las propiedades de tincin de algunas

sustancias

Fijador Davidson AFA

Etanol 95% 330 mL

Fornaldehdo 37% * 220 mL

cido actico glacial ** 115 mL

Agua corriente 335 mL

________________________________

_____ * No usar formalina al 10%

** No usar otros cidos ya que interfieren con el

procesamiento de los tejidos, tincin y con algunas

pruebas moleculares

Preparacin para hacer una

correcta fijacin Preparar anteriormente la solucin de Davidson

Tener jeringas y agujas de tamao apropiado

Disponer de lpiz y etiquetas apropiadas

Utilizar gafas protectoras

Utilizar siempre guantes desechables y

reemplazarlos si se rompen durante la fijacin;

descartar guantes ya utilizados

Contar con buena ventilacin

Disponer de recipientes de tamao apropiado

Pasos para fijar camarones

adultos y juveniles (>0.5 g)

Elegir camarones vivos moribundos con signos de

enfermedad

Inyectar y sumergir en Davidson utilizando aprox.

10X el volumen del animal (proporcin 10:1)

La fijacin rpida del hepatopncreas es crtica

para minimizar la autolisis

La inyeccin de Davidson causar un rpido

cambio de color (naranja) indicando que se estn

fijando los tejidos

Pasos para fijar camarones

adultos y juveniles (>0.5 g)

Sumergir la muestra fijada en Davidson (10:1)

Preparar etiqueta con papel y lpiz (no pluma) que

incluya: fecha, estanque, especie, signos clnicos,

edad, finca, zona y pas

Dejar el camarn en Davidson entre 24 y 72 h

segn talla

Pasar luego la muestra a etanol 70%, cambiarla a

las 24 h y a los 15 das en caso de que no se haya

procesado antes

Duracin de la fijacin

Duracin en Davidson AFA:

12-24 h Pls

24 h Juveniles y subadultos

48 h Adultos

72 h - Reproductores

Despus de cumplido el tiempo de fijacin en

AFA:

Pasar a etanol 70%

Reemplazar el etanol 70% a las 24 h

Reemplazar el etanol 70% a los 15 d

PCR (reaccin en cadena de la polimerasa)

Deteccin genmica

Requiere extraccin de DNA

Amplificacin con primers especficos

Determinacin de bandas positivas

Confirmacin de Dx junto con histologa

Muestreo de camarones en

los estanques

Muestreo para PCR:

Llevar etanol 95% y elementos de fijacin al estanque y

hacer el procedimiento in situ

Mantener los camarones en cubos con aireacin en el

laboratorio antes de la fijacin

Los camarones se pueden enhielar o congelar a la orilla

del estanque para su transporte hasta el laboratorio

Amplificacin

Termocicladores

Electroforesis

Transiluminador

de UV

Gel de agarosa con bandas positivas

MICROBIOLOGA

Aislamiento y recuento bacteriano del HP

Identificacin bioqumica o molecular de la

cepa causante del EMS/AHPND

Antibiograma

Concentracin mnima inhibitoria (MIC)

Pruebas de patogenicidad (bioensayos)

V. parahaemolyticus

Janice Carr - Centers for Disease Control and Prevention's Public Health

Dra. Trinidad Sabalete

MIC en agar

Meller Hinton

MIC en

agar TSA

BIOENSAYOS

Microscopa electrnica de

transmisin

(TEM)

Fijacin con

Glutaraldehdo El Glutaraldehdo es el fijador de rutina

para TEM

Ventajas:

No produce distorcin de los tejidos

Desventajas:

Penetra lentamente los tejidos

No descalcifica el exoesqueleto

TEM El Glutaraldehdo es el fijador de rutina para TEM

Se usa TEM para determinar ultraestructura de

microorganismos

Hay muchos fijadores y amortiguadores para TEM

segn el agente de inters

Variables que determinan la calidad de la fijacin:

temperatura, pH y tiempo de fijacin

Ejemplos de fijadores para TEM: Glutaraldehdo,

paraformaldehdo-glutaraldehdo, Zamboni (cido

pcrico - paraformaldehdo), Tetraxido de Osmio

(fijador secundario)

TEM

Empaque de muestras para envo

al laboratorio

La seguridad debe ser una prioridad

Los requerimientos varan segn el servicio de

mensajera del pas

Los requerimientos oficiales son definidos por la

International Air Transport Association (IATA)

Los lineamientos cambian con cierta frecuencia,

por lo que se deben confirmar con la empresa de

mensajera

Reglamentos actuales de la IATA

Las muestras de camarn se consideran exentas

(Exempt Animal Specimens = EAS)

Debern ser empacadas en contenbedores con tapas

antifuga

Los contenedores debern ser empacados en un

segundo contenedor con sistema antiderrames

Debe incluirse suficiente material absorbente entre el

contenedir primario y el secundario capaz de retener el

total de un posible derrame

Deben tener proteccin externa de tamao y resistencia

adecuados

Envo de muestras para histologa

Luego de 1 h en etanol 70%, envolver los

camarones en papel toalla haciendo un rollo

Poner los rollos en una bolsa plstica sellable con

etanol 70% para mantener hmedo el papel toalla

Ubicar etiqueta de papel anotando a lpiz #ID e

historia dentro de la bolsa plstica

Sellar la primera bolsa y meterla en una segunda

bolsa sellable, esta a su vez en una tercera bolsa

Poner el paquete en una caja maciza, slida y fuerte

Enviar por sistema certificado de mensajera

IMPORTANTE!!

NUNCA enviar muestras en frascos de vidrio

No enviar grandes volmenes de lquido ($ y peligroso)

Preparar las etiquetas utilizando papel fuerte y un lpiz

Incluir una carta suministrando informacin sobre la

muestra: fecha de fijacin, tipo de fijador usado, tipo de

anlisis requerido (histologa, hibridacin in situ),

especie, origen, historial del estanque y datos de

contacto para enviar el informe y la factura

Muchas gracias!!